Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Осморегуляция в процессе формирования САМ у растений MESEMBRYANTHEMUM CRYSTALUNUM L. при засолении

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Осморегуляция в процессе формирования САМ у растений MESEMBRYANTHEMUM CRYSTALUNUM L. при засолении"

РТ5 Ой

На правах рукописи

НЭТО Дом ингуш да Силва

ОСМОРЕГУЛЯЦИЯ В ПРОЦЕССЕ ФОРМИРОВАНИЯ САМ У РАСТЕНИЙ МЕБЕМВКУАЫТНЕМиМ СЯУЗТАШЫиМ ПРИ ЗАСОЛЕНИИ

Специальность 03.00.12. - «физиология растений»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1998

Работа выполнена в Институте физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Вл.В. Кузнецов, кандидат биологических наук В.П. Холодова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В.Н. Жолкевнч кандидат биологических наук, доцент Л.Г. Косулина

Ведущее учреждение — Московская сельскохозяйственная академия им. К.А.Тимирязева

Зашита состоится «26» мая 1998 г. в 13°° часов на заседании диссертационного совета К 002.45.01 в Институте физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН

Адрес: 127276 Москва, Ботаническая улица, 35.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН.

Автореферат разослан «25» апреля 1998 г.

Ученый секретарь диссертационно-----—

кандидат биологических наук

Общая характеристика работы

Актуальность. В последнее время достигнуты значительные успехи в изучении олекулярных реакций растений на водный дефицит (Bray, 1993). Однако 1Изиологические закономерности формирования адаптационного процесса и природа игнальных факторов, воспринимаемых клетками корня при стрессе и ранслоцируемых в надземные органы, остаются неисследованными.

С этой точки зрения особый интерес представляет адаптация растений к юолению, которое может вызывать быстрое и глубокое «обезвоживание» клеток астений и инициировать формирование генетически детерминированных эдосберегающих специализированных механизмов адаптации, таких, например, ■ как АМ-метаболизм (САМ).

Изучение адаптации растений к засолению весьма актуально, оно имеет не >лько теоретическое, но и большое социальное значение. Последнее связано с ¡благоприятными глобальными изменениями климата, которые характеризуются эвышением температуры воздуха на планете, увеличением продолжительности сушливого периода в ранее благоприятных для произрастания растений регионах, мвлением пустынных и засоленных территорий (Богатырёв и др., 1988; Лосева, етров-Спиридонов, 1993; Dupriez, De Leneer, 1990.). Эта тенденция усугубляется хногенным давлением человека на окружающую среду.

Адаптация растений к неблагоприятным условиям состоит из стресс-реакции и :ециализированной (долговременной) адаптации. Если на первом этапе шкционируют преимущественно защитные системы, обеспечивающие атковременное выживание организма в условиях повреждающего действия рессора, то на втором этапе формируются долговременные механизмы ециализированной адаптации, ответственные за повышение устойчивости растения к нному конкретному фактору и за нормальное протекание онтогенеза в изменившихся повиях (Кузнецов Вл.В., 1992). В настоящее время неизвестна природа сигналов дукции и недостаточно исследованы механизмы формирования систем лговремениой адаптации при засолении.

При изучении формирования САМ в условиях засоления особое внимание ивлекает процесс аккумуляции осмопротекгоров в клетках растений при

пониженном водном потенциале почвенного раствора. Вместе с тем проблем осморегуляции в процессе долговременной адаптации слабо изучена. Остаетс открытым и вопрос о предельном адаптационном потенциале растений при засолени] несмотря на то, что САМ рассматривается в качестве одного из механизмов выживани. при водном дефиците (Bohnert et al., 1988; Sayed, Hegazy,1991), в том числе и npi засолении (Luttge, 1993).

Цели и задачи исследования. Все сказанное выше делало целесообразны! выяснение причинной последовательности физиологических процессог предшествующих и сопутствующих включению генетической программ! формирования водосберегающей стратегии адаптации растений CAM-типа, в качеств которого был взят факультативный галофит Mesembryanthemum crystallinum I (хрустальная травка).

В этой связи были поставлены следующие задачи:

Оптимизировать условия выращивания растений хрустальной травки и на е основе создать модельную систему для изучения механизмов специализированно адаптации.

• Исследовать предельный адаптационный потенциал растений хрустально травки при водном дефиците для поиска физиологических процессов, лимитирующи ее выживание в условиях повреждающего действия стрессора.

• Изучить изменения водного статуса растений в процессе индукции САМ, также участие минеральных ионов и органических осмолитов в регуляци осмотического давления на различных стадиях адаптационного процесса.

• Исследовать возможную природу сигналов, индуцирующих формирован« САМ в растениях хрустальной травки при засолении.

Научная новизна. Впервые проведена оценка уровня адаптационног потенциала растений хрустальной травки в условиях засоления, которая формирус эффективный водосберегающий путь фиксации углекислоты CAM-типа и развива« несвойственное растениям экстремально высокое осмотическое давление (до 4,62 MPi за счет аккумуляции неорганических ионов и совместимых осмолито: Корреляционный анализ позволил продемонстрировать осморегуляторную рох пролина в растениях хрустальной травки при солевом стрессе. Установлен

существование онтогенетической регуляции формирования САМ в ходе нормального развития. Впервые обнаружены суточные флуктуации уровня пролина, которые носят транзитный характер, контролируются онтогенетическими и стрессорными регуляторными сигналами и предшествуют индукции САМ. Исследование показателей водного статуса растений при стрессе позволило высказать идею о том, что понижение водного потенциала почвы при засолении инициирует изменения водного статусса клеток и суточные колебания уровня пролина, которые, в свою очередь, и индуцируют формирование механизмов специализированной долговременной адаптации.

Практическая значимость. Полученные в работе теоретические данные о механизмах индукции САМ при засолении и регуляции этого процесса сигналами онтогенетической и стрессорной природы имеют существенное значение при разработке технологии создания трансгенных стресс-толерантных растений важных сельскохозяйственных и технических культур. Оценка адаптационного потенциала CAM-типа фотосинтеза у растений хрустальной травки в условиях интенсивного засоления и установление количественных взаимосвязей различных физиологических процессов с формированием систем специализированной адаптации имеет важное значение при поиске и идентификации стресс-толерантных генов в интересах агробиотехнологии. Вся совокупность полученных результатов и теоретические обобщения по адаптации растений к засолению могут использоваться в курсах лекций для студентов биологических факультетов университетов и вузов страны.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на International Symponsium on «Stress and Inorganic Nitrogen Assimilation and the 2 04 Fohs Biostress Symposium» (17 111 - 21a September, 1996), Moscow, на семинарах лаборатории молекулярных и физиологических механизмов адаптации, на межлабораторном :еминаре Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН (1997 г.), на Международном симпозиуме по стрессу (Польша, 1997).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работы и 1 сдана в течать.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора гатературы, описания объекта и методов исследований, изложения полученных >езультатов, заключения, выводов и приложения. Работа изложена на 132 страницах

машинописного текста, включая 9 таблиц, 26 рисунков; библиография содержит 234 названий, в т. ч. 150 на иностранных языках.

Объект и методы исследований Объект исследований. Объектом исследований служила хрустальная травка (Mesembryanthemum crystallinum L.) — эфемерное суккулентное галофитное растение семейства аизовые (Aizoaceae), происходящее из намибийской пустыни Южной Африки (Bohnert et al., 1995) и обитающее в засушливых регионах планеты. Она является удобной ' моделью для исследования начальных (быстрых) этапов долговременной адаптации при засолении за счет переключения С3 - типа фотосинтеза на САМ - одной из эффективных водосберегающих стратегий адаптации (Winter et al., 1978; Bohnert et al., 1988,1994).

Условия выращивания растений и постановки экспериментов. Экспериментальная работа выполнена в лаборатории молекулярных и физиологических механизмов адаптации ИФР РАН. Растения выращивали в сосудах Митчерлиха в оранжерее при естественном освещении и дополнительном искусственном освещении лампами накаливания. Ряд экспериментов проводили в камере фитотрона при температуре 23—25°С и влажности воздуха около 55% днём, 15—17°С и 70% ночью при длине фотопериода 12—14 часов и освещенности 14000 Lx. Для опытов отбирали однородные по внешним показателям растения в возрасте 5—7 недель; растения опытных вариантов поливали растворами NaCl по 100 мл на сосуд через день; контрольные растения поливали водой в таком же режиме. В экспериментах использовали NaCl в концентрациях от 0,05 до 3 М. Определение изученных параметров проводили при 3—5 (или более) биологических повторностях.

Аккумуляция биомассы. Для измерения свежей и сухой массы отдельных органов растений и содержания в них воды использовали стандартный весовой метод (Пустовой и др., 1995).

Содержание хлорофилла. Пигменты экстрагировали из свежих высечек 96%-м этанолом. Концентрацию хлорофиллов а и b измеряли при 649 и 665 нм на спектрофотометре СФ-46 и рассчитывали по формуле Вернона (Третьяков и др., 1990), выражая в мг на 1 дм2 площади листа.

Определение относительного содержания воды (ОСВ) проводили по Chu et al., 1990; Rodriguez et al., 1997.

Определение интенсивности транспирации. Интенсивность начальной транспирации (1т) (мг ■ дм'2 • час') определяли методом, предложенным Л.А.Ивановым (Викторов, 1991).

Определение осмотического давления. Клеточный сок после размораживания пробы экстрагировали механическим отжиманием с помощью ручного пресса. Осмотическое давление клеточного сока определяли по теплоте испарения водяных паров с помощью выпаривающего осмометра «Vapour Osmometre» фирмы Knauer (ФРГ).

Определение содержания ионов в тканях растений и почвенном субстрате.

Навеску свежей ткани из листьев экстрагировали кипящей дистиллированной водой при соотношении воды и растительной ткани до 20:1 в течение 10 минут. После остывания пробы доводили объём дистиллированной водой до исходной величины. Для определения концентрации ионов натрия и хлора в почвенном субстрате пробу почвы отбирали по всей высоте сосуда с помощью цилиндрической трубки. Экстракцию ионов проводили по И.В. Пустовому и др., 1993 и измеряли их содержание с помощью ионоселективных электродов на ионаналайзере «Orion ЕА 940» фирмы Orion (США).

Измерение рН и титруемой кислотности. При определении буферной емкости проводили титрование до рН = 7,0 ± 0,05 10—200 мМ NaOH. Для расчета содержания протона [Н+] мкэв . г"1 учитывали объем используемых пипеток и концентрации NaOH, а также массу свежей ткани. А[Н*] = [Натечной —[1Г]„.Т. Согласно Chu et al., 1990 основной вклад в концентрацию протона принадлежит малату —70-80%. Это позволяет нам рассматривать [Н+] как прямое отражение накопления этой органической кислоты. Измерения рН, буферной емкости и содержания протона в клеточном соке производили с помощью рН-метра «Orion Research» (США).

Определение содержания свободного пролина. Содержание свободного пролина (мкмоль . г-1 свежей массы.) определяли в кислой среде с помощью нингидринового реактива по методу Bates et al. (1973), используя для калибровки пролин фирмы «Serva». При изучении суточной динамики содержания пролина в пробы

вводили внутренний стандарт, в качестве которого использовали пролин (фирмы «Serva») известной концентрации.

Определение активности фосфоенолнируваткарбокснлазы (ФЕПКазы). Фиксацию проб проводили за 2—3 часа до конца светового периода, когда уровень в клетках малата, ингибирующего активность ФЕПКазы, минимален. Измерение активности ФЕПКазы (ключевого фермента САМ) (мкмоль ФЕП ■ мг белка'1 ■ мин'1) производили по Ostrem et al., 1987. Реакцию запускали добавлением в среду раствора ФЕП, которая протекала при 30°С в термостатированной кювете регистрирующего спектрофотометра при 340 нм с самописцем «SPECORD М-40» фирмы Карл Цейсс Йена (ГДР) в течение 6 минут.

Определение содержания белка. Содержание белка в определяли с помощью кумаси (Brilliant blue G— 250) по Бредфорду (Bradford, 1976).

Математическая обработка данных. Результаты обрабатывали статистически и выражали как средняя арифметическая и ошибка репрезентативности среднего квадратического отклонения (Доспехов, 1989), рассчитывая на ЭВМ. Коэффициента корреляции (г) и детерминации (Г2) меячзу изученными параметрами рассчшывали с помощью пакета прикладных программ STAGRAPHICS.

Результаты исследований и обсуждение.

1. Характеристика адаптационного потенциала хрустальной травки в условиях засоления в связи с индукцией САМ

Прежде чем изучить механизм адаптации к долговременному засолению при переходе на САМ-тип фотосинтеза была поставлена серия опытов по исследованию концентрационной зависимости действия NaCl, чтобы тем самым выявить предельней адаптационный потенциал растений в условиях наших экспериментов. Общая продолжительность воздействия засоления была ограничена двумя неделями из-за довольно быстро развивающегося повреждающего эффекта высоких концентраций NaCl.

Индукция САМ. Активность ФЕПКазы в контрольном варианте была невысока—0,046 мкмоль ФЕП . мг белка - мин"1. На 10-й день опыта при 0,5—1,0 М NaCl она составляла около 450% от контроля (рис.1). Однако как при более высоких,

так и при более низких концентрациях №С1 уровень активности фермента был значительно ниже.

500 г

0 0,05 0,13 0,25 0,5 0,75 1 1,25 1,5 1,75 2 N801, М

Рис.1. Индукция активности ФЕПказы при различных концентрациях КаС!

(10-й день засоления)

Рост активности ФЕПКазы сопровождался синтезом органических кислот в темновой период, поэтому об индукции САМ при засолении судили также по сдвигу рН и величине титруемой кислотности клеточного сока. Максимальное накопление органических кислот в темновой период было обнаружено при 0,5 М ЫаС1 и составляло от 470% до 800% по сравнению с контролем, что также свидетельствовало о переходе растений на САМ при засолении.

Аккумуляция биомассы при засолении. Засоление заметно ингибировало рост растений. На 12-й день эксперимента достоверное торможение накопления биомассы 4-го листа — на 30-56% от контроля — зарегистрировано только при концентрациях №0 1,0—2,0 М. Во всех опытных вариантах отсутствовало ингибирование накопления биомассы стебля. 12 дневное засоление растений и последующее их восстановление обнаружило летальное действие №С1 в концентрациях выше 1,0 М, действие более низких концентраций соли оказалось «обратимым» и не приводило растения к гибели. Однако более длительное (до 1 месяца) воздействие 1,0 М КаС1 также оказалось летальным.

Содержание хлорофилла в четвертом листе растений М. сгу$1аШпит (10-ый день после начала засоления)

Вариант Содержание пигментов

хл. а хл. Ь хл.а+хл. Ь хл. а/хл. Ь

М мг■дм : % мг•дм 2 % мг • дм-*

0 1,99±0,03 100,0 0,70±0,02 100,0 2,69±0,04 2,85±0,08

0,05 2,04±0,01 102,5 ,0,69±0,02 98,6 2,74+0,04 2,98+0,09

0,125 2,0б±0,04 103,5 0,70±0,04- 100,0 2,76±0,08 2,97±0,10

0,25 2,13±0,02 107,0 0,66±0,05 ; 94,3 2,79±0,07 3,22±0,19

0,5 2,09±0,02 105,0 0,62±0,06 89,0 2,71 ±0,06 3,37+0,29

0,75 2,06±0,02 103,5 0,60+0,04 85,7 2,67±0,04 3,45±0,21

1,00 2,06±0,02 103,5 0,56±0,04 80,0 2,62±0,04 3,69+0,25

1,25 1,86±0,05 93,5 0,30±0,06 42,9 2,16±0,12 6,46+1,14

1,5 1,36+0,02 68,3 0,22+0,03 31,4 1,58±0,04 6,36±0,91

1,75 1,20±0,04 60,3 0,11±0,04 15,7 1,31 ±0,08 12,24±4,12

2,0 1,05±0,05 52,8 0,03±0,02 4,3 1,07±0,07 58,33139,88

Изменение содержания хлорофилла (хл.) при солевом стрессе. На 10-й день после начала засоления раствором 1,25 М №С1 суммарное содержание хл. снижалось— до 80,3%, при этом падение хл. а "составляло менее 7%, тогда как хл. Ъ составлял всего около 43% от контроля (таблица). Достоверное снижение уровня хлорофилла Ь начиналось уже при концентрациях КаС1 0,5—0,75 М. Появление хлоротических пятен визуально было зарегистрировано на 3—5 день засоления.

Изменение параметров водного баланса при засолении. Характерной особенностью растений М. сгухшШпит является высокая оводненность листовых тканей, составлявшая в начале эксперимента 96—97% от свежей массы. Полив растений ЫаС1 снижал оводненность тканей листа максимально на 4% по сравнению с контрольным вариантом. Более надежно уровень оводненности тканей характеризует относительное содержание в них воды (ОСВ). На 10-й день при всех использованных нами режимах засоления возникал значительный водный дефицит, минимальное

значение ОСВ при этом составляло 66,5%, тогда как у контрольных растений сохранялось на уровне 98%.

Характеристика некоторых параметров осморегуляции. В течение 10 дней эксперимента концентрация осмотически активных веществ клеточного сока листьев контрольных растений удерживалась на уровне 350—420м0смоль . кг'1 ткани, что соответствует осмотическому давлению (ОД) 0,87—1,04МПа (рис.2). Концентрации 0,5—2,0 М №С1 стимулировали увеличение ОД, которое к 3-му дню эксперимента в 1,7—2,8 раза превышало величину ОД контрольных растений. При 1,5—3,0 М МаС1 ОД достигало 3,00-3,30 МПа, что было в 2,9—3,2 раза выше по сравнению с контрольными растениями (рис.2).

4 :

I

о о N301, М т--

Рис.2. Осмотическое давление клеточного сока д 3-й день засоления а 10-й день засоления

Столь значительное повышение осмотического давления в клетках М. сгу$1аШпит при засолении обусловлено прежде всего аккумуляцией в них ионов натрия и хлора. Это сопряжено с одновременным накоплением пролина (рис.3 ). В течение всего опыта в листьях растений контроля уровень пролина составлял около 0,2 мкмоль • г"1 свежей массы. На 3-й день засоления 0,5—2,0 М №С1 уровень пролина в опытных растениях в 1,7—5,4 раза превышал контрольный, тогда как эффект более низких концентраций был очень слаб. На 10-й день действие соли на синтез пролина достоверно проявлялось, начиная с 0,25 М К'аС1, и достигало при высоких концентрациях соли 2,7-3,3 мкмоль • г"1 свежей массы ткани, т.е. уровень пролина был в 13—16 раз выше, чем в контроле.

4 12

3 о о я * 3 «

и 1

У 2 'и

л к 1 1 X II II II Iе ¡с

2 п I

О 0,05 0.125 0,25 0,5 0,75 1 1,25 1,5 1,75 2 N801, М

Рис. 3. Аккумуляция пролина в листьях □ 3-й день засоления ■ 10-й день засоления

Представленные выше результаты показали, что максимальная индукция САМ в растениях хрустальной травки наблюдалась в интервале концентраций КаС1 от 0,5 до 1,0 М. При этом низкие концентрации №С1 0,05—0,25 М оказались неиндуцирующими, а более высокие концентрации (больше 1,0 М) — ингибируюшими переход растений на САМ.

2. Долговременная адаптация хрустальной травки к хлоридному засолению

Основываясь на полученных результатах, в последующих долговременных экспериментах нами был использован 0,5 М КаС] . При этом опыты (в течение 45 недель) начинали с ювенильными растениями и заканчивали на этапе перехода к генеративному развитию.

Влияние №С1 на аккумуляцию биомассы разных органов и генеративную продуктивность. Засоление достоверно ингибировало рост корня (рис.4), биомасса которого к концу эксперимента составляла 45,7 и 38,8% от контроля на 4 и 5 неделю от начала опыта, соответственно. Динамика суммарной массы целого растения (с учетом парного расположения всех листьев и боковых побегов, а также верхушки) показала, что на пятую неделю засоления ингибирование аккумуляции сухой и сырой биомассы у опытных растений по сравнению с контрольными составляло 35,4% и 58,2%, соответственно, что явилось отражением более позднего появления боковых побегов, отсутствием развития 7-го листа и сильным торможением роста корня.

стебель

стебель

0 1 2 3 4 5 недели после начала засоления —о— Контроль ■ - N80

98 95 92 89 86 33 80

корень

X

* -I - "5

0 1 2 3 4 5 недели после начала засоления --о—-Контроль - -л- - №С!

Рис.4.1. Аккумуляция биомассы

Рис.4.2. Содержание воды

Воздействие на параметры водного баланса. Хрустальная травка

характеризуется высокой оводненностью тканей листьев 96-97%, стебля — 93-94%, и корня — 82-83%. На вторую неделю засоления №С1 надземные органы достоверно были обезвожены на 4,65% по сравнению с контролем, а корень — на 6,74% (рис. 4.2).

Одновременно наблюдали снижение интенсивности транспирации опытных растений, которое достигало 60-80% от контроля, хотя в более продолжительном эксперименте (4 недели) к концу опыта эта разница сокращалась до 33%, в основном за счёт снижения транспирации контрольных растений.

При долговременной адатации к 0,5 М №С1 (рис.5,1) осмотическое давление клеточного сока достигало 4,5—4,62МПа ( ~ в 4 раза больше, чем в контроле). Существенно, что накопление биомассы прямо коррелировало с величиной ОД (г(ц= 0,980), хотя в условиях интенсивного засоления обнаруживалась обратная корреляция (г01= —0,860). Очевидно, быстрое увеличение осмотического давления в условиях экстремального засоления препятствует развитию адаптационного процесса и аккумуляции биомассы.

4-й лист

4-й лист

„ л

4 3 2 1 0

0 1 2 3 4 5 недели после начала засоления

Рис.5.1 .Осмотическое давление

—О—Контроль - - NaCl

Л

0 1 2 3 4 5 недели после начала засоления

Рис.5.2. Содержание пролина

—о—Контроль - -A- -NaCl

Накопление Неорганических ионов и совместимых осмолитов в условиях засоления. Внесение NaCl в субстрат приводило к сильному накоплению в тканях Na+ и СГ, которое проявлялось через неделю после начала засоления. К концу эксперимента концентрация этих ионов достигала 330-390 мэкв ■ кг'1 свежей массы в 3-м листе, и — 486 мэкв в 4-м, при достоверном снижении в последнем концентрации К+ на 30-40 мэкв ■ кг"1 свежей массы по сравнению с контролем. При определениях содержания ионов в листьях в течение первых дней достоверного различия между контролем и опытом установить не удалось.

Концентрация ионов Na+ и Cl" в почве достигала 300-500 мкэкв . кг"1, причем нами показана прямая корреляция между содержанием ионов натрия и хлора в субстрате и в тканях листа при долговременной адаптации растений (roi= 0,992 для Na+

и го1= 0,990 для СГ). Это может быть обусловлено наличием у растений М. crystallinum желёзок, накапливающих избыточное содержание соли (Васильев, 1977).

Засоление индуцировало также аккумуляцию в растениях пролина. В листьях контрольных растений уровень пролина составлял 0,2—0,4 ммоль • кг"' свежей массы, который оставался постоянным в течение 2—5 недель эксперимента, хотя иногда наблюдалась тенденция к увеличению его концентрации до 0,6-0,8 мкмоль • г'1. На 3-й день после начала засоления 0,5 М NaCl содержание пролина в листьях увеличивалось в 2,5—5 раз и, начиная с 7-го дня (рис.5.2), оно удерживалось практически на постоянном уровне 4-5 мкмоль • г"' свежей массы, существенно повышаясь лишь на 5 неделю засоления до 7,4 мкмоль • г"1 свежей массы (в 22—28 раз больше, чем в контроле).

Оценка вклада осмолитов в ОД при долговременной адаптации показывает, что ведущая роль при этом принадлежит неорганическим ионам СР, К+ и N03~, вклад суммы которых в ОД в ходе онтогенеза достигал 49 и 65% в листьях 4-го яруса контрольных и опытных растений, соответственно. Несмотря на то, что уровень содержания пролина при долговременной адаптации возрос в 28 раз по сравнению с контролем (рис.5,2), его доля в ОД не превышала 0,6%. Столь незначительный вклад пролина в ОД объясняется тем, что он был рассчитан нами для клетки в целом, хотя, как известно, пролин локализуется в основном в цитоплазме (Taylor, 1996), где его вклад в ОД значительно выше, чем для суммарного клеточного сока. Тем более, что нами показана высокая корреляция между показателем осмотического давления и содержанием пролина в листьях в течение 5 недель (ros- 0,843). Нельзя также исключать и вклада других органических соединений в ОД, таких как полиолы, сахара, аминокислоты, амиды (Шевякова и др., 1994; Jensen et al., 1994).

Переход растений на САМ при стрессе и в ходе онтогенеза. В длительных экспериментах наблюдалось сильное увеличение активности ФЕПКазы в листьях контрольных растений (рис.б.А), которая через 2 недели превышала начальный вровень (0,050—0,060 мкмоль ФЕП . мг белка . мин"1) в 1,7 раза, а через 3 недели — точти в 2,5 раза. Засоление в течение 7 дней приводило к превышению активности фермента над исходным уровнем в 2,5 раза, в дальнейшем активность превышала юходные значения до 5,5 раза.

Прямым показателем «работы» ферментов ОШ-фотосинтеза является биосинтез органических кислот (малата) в ночное время суток и их использование в течение светового периода .НегрркЬ е[ а1., 1992 и Ь^е й а1., 1995). По степени

подкисления клеточного сока в конце темнового периода, достигавшего на 2-3 неделю засоления 1.72-1.83 ед.рН, можно было судить о значительном накоплении кислот в клетках листьев опытного варианта. Прямое измерение содержания органических кислот путем титрования показало, что их небольшая аккумуляция в ночное время наблюдалась уже на 3-й день после начала засоления — Д [Н+] была равна 11 мкэкв ■ г" 1 свежей массы (рис.б.Б). Максимальная величина титруемой кислотности в конце темпового периода, равная 136 мкэкв, а максимальное значение Д [Н*] — 125 мкэкв • г"1 свежей массы было обнаружено через 3 недели засоления. В свою очередь, начиная со второй недели опыта, титруемая кислотность у контрольных растений превышала исходные значения (3-5 мкэкв) и составила 24,3 мкэкв(при сильном подкислении кле 1 очного сока — до рН = 4,91) в конце темнового периода. На четвертой неделе

О 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 дни после начала засоления — о— Контроль--ЫаС!

140

_ 120 и

| 100 (В

г" ВО

8 60 з,

Е. 40 20

0

(Б)

.Ш

1 а! 5

3 7 14 21 28

дни после начала засоления

■ Конец темнового периода (контроль) :; Конец светового периода (контроль) И Конец темнового периода (ЫаС1) □ Конец светового периода (ЫаС!)

Рис.6. Активность ФЕПКазы (А) и титруемая кислотность (Б) клеточного сок^ листьев М. сгуьюШпит в течение онтогенеза

эксперимента в конце темнового периода [Н+] достигла 33 мкэкв • г"1 свежей массы контрольных листьев при Д[Н+] равной 27 мкэкв.

Эти данные свидетельствуют о переходе на САМ растений хрустальной травки не только опытного, но и контрольного варианта. Важно отметить, что переход на САМ в условиях нормального водного режима выражен не так ярко, как при 0,5 М №С1. Переход контрольных растений на САМ с возрастом может объяснить уменьшение разницы (до 33%) в интенсивности транспирации между опытными и контрольными растениями при длительных экспериментах. Нами было установлено, что контрольные растения переходили на САМ на 2-3 недели позже растений, подвергнутых засолению.

3. Аккумуляция пролина при засолении и его возможная физиологическая роль

Ранние ответные реакции листьев на воздействие №аС1 и суточный цикл содержания пролина.

Для изучения механизма переключения генетической программы с С3- на САМ-тип фотосинтеза важно исследовать последовательность ранних ответных реакций растения на стрессор. Для этого в работе были подробно проанализированы изменения ряда показателей в течение первых 1,5 суток засоления 0,5 М КаС1.

Как показано на рис. 7.1, у растений контрольного и опытного (засоленного) вариантов оводненность листовых тканей заметао изменялась в течение суточного цикла, снижаясь к концу дневного периода и вновь поднимаясь в течение темнового периода. При этом у опытных растений было обнаружено некоторое понижение содержания воды в тканях по сравнению с контрольными уже через 6 часов. Эта разница уменьшалась в ночное время на фоне постепенного восстановления оводненности тканей растений. Однако к началу светового периода, когда листья контрольных растений достигали максимальной оводненности, опытные растения не восстанавливали водный статус, зтставая от контрольных почти на 0,57 абсолютных процентов (21 час засоления). В течение дневного периода эта разница еще более усилилась и достигши 0,72 %.

Через 6 после начала засоления превышение осмотического давления в листьях шытных растений над контрольными составляло более 20% (рис. 7.2). В течение вторых ;уток осмотическое давление опытных растений непрерывно повышалось и к 36 часу от гачала засоления превышение составляло 49,3% над контролем.

Рис.7. Ранние ответные реакции растений на воздействие КаС1 1— содержание воды; 2— осмотическое давление; 3— интенсивность транспирации; 4— содержание пролина

— темновой период )/ — начало засоления

Несколько менее четким оказалось влияние №С1 на интенсивность транспйрашш (рис.7.3) при том, что колебания интенсивности транспирации наблюдались как у контрольных, так и засоленных растений.

В этом же опыте было решено оценить, насколько быстро инициируется аккумуляция пролина при засолении. Через 6 после начала засоления содержание пролина в опытных растениях было в 1,2 раза выше, чем в контроле (рис. 7.4), а через 30—36 часов —в 1,7—2,9 раза. При этом оказалось, что содержание пролина в листьях как контрольных, так и опытных растений претерпевало существенные суточные изменения. В течение светового периода содержание пролина выходило на максимальный уровень, а в темповой период - сильно падало. В обоих вариантах максимальный уровень превышал минимальный в 7—8 раз.

Чтобы оценить реальный размер флуктуаций содержания пролина, дополнительно был проведен его пересчет на сухое вещество. Оказалось, что максимальное содержание пролина днём составляло 1,49—2,00 мг . г'1 сухой массы, понижаясь ночью до 0,28—0,29 мг, т.е. в 5,2—7,1 раз. Таким образом, эффект разбавления за счет некоторого улучшение водного статуса в ночное время лишь незначительно уменьшает размер сильных суточных флуктуаций содержания пролина в растениях.

Светозависимость процесса аккумуляции пролина в различных органах хрустальной травки при засолении. Суточные флуктуации содержания пролина делали целесообразным исследование зависимости его аккумуляции от света. С этой целью были проведены опыты по сравнительному анализу содержания пролина в растениях, длительно находившихся темноте или при непрерывном освещении.

При естественном освещении (рис.8.1) наблюдали ту же суточную цикличность удержания пролина в листьях и стебеле, как на рис.7.4, а также повышение его уровня в эпыте через б час после начала засоления (в 2,3 раза выше, чем в контроле). Для темновых вариантов (рис.8.2) характерным оказалось очень сильное — в 4-8 раз — уменьшение удержания пролина, причем у контрольных (т.е. без засоления) растений снижение 1роис.\одило до окончания опыта, тогда как у засоленных растений через 24 часа после ¡несения №С1 наблюдался достоверный рост его содержания. В результате содержание фолина в опытных растениях превышало его уровень в контрольных в 1,5 раза в листьях, I стебле — в 2,1 раза и в корне— в 3,9 раза. Следует отметить, что содержание пролина в

корне хрустальной травки было значительно выше, чем в в стебеле и тем более в листьях, и в отличие от надземных органов содержание пролина в корне практически не менялось в течение суток в растениях как контрольного, так и опытного вариантов.

(1)

(2)

время суток (часы) -О Контроль--— ANaC!

10 00

Рис.8. Светозависимость суточной динамики содержания пролина в листьях растений M. crystallinum под воздействием NaCl

1- обычный режим освещения; 2- постоянная темнота

/ начала опыта н^н темновой период

В опытах по влиянию непрерывного освещения (рис.9) использовали контрольные растения, находившиеся при обычном режиме освещения (свет \ темнота, 12час \ 12час), а также растения, подвергнутые ( + NaCl) постоянному освещению. Растения двух последних вариантов были поставлены в условия постоянного освещения за 4 суток до начала опыта. Было показано, что в растениях контрольного варианта обычного режима освещения (рис.9) суточная динамика содержания пролина была такая же, как и в предыдущих опытах (рис.7,4 и 8.1), т.е. максимум наблюдался днём и минимум — ночью. Пребывание растений других двух вариантов в условиях постоянного освещения

(рис. 9) снимало суточную флуктуацию пролина, содержание которого стабильно сохранялось на более высоком уровне до конца опыта. На фоне непрерывного 24-час освещения действие засоления практически не вызывало дополнительной аккумуляции пролина во всех органах.

А Б В

• □ 10 00 18 00 и 3 00

Рис. 9. Светозависимость суточной динамики содержания пролина А— контроль при обычном режим освещения (—КаС1) Б— контроль при постоянном освещении (—№С1) В— опыт при постоянном освещении (+ИаС1) ——« —темновой период; 10 00,18 00,3 00 — время суток (часы)

Суточный цикл пролина в онтогенезе. Изучение суточной динамики пролина в ;вязи с изменениями параметров водного статуса растений в условиях долговременной щаптации к засолению показало, что в течение трех недель от начала опыта суточные голебания содержания пролина по-прежнему сохранялись у контрольных растений. В то ке время в опытных растениях уровень содержания пролина в течение суток выходил на юстоянный уровень. При этом исследованные показатели водного статуса также не □менялись в течение суток.

Использование более молодых растений показало, что з течение первой недели пыта у контрольных растений суточных флуктуаций пролина не обнаруживалось, но они

проявлялись на 2—3 неделе опыта (рис.10). При сильном росте содержания пролина значительные суточные флуктуации у опытных растений начинались уже с начала засоления. К концу опыта суточные флуктуации пролина исчезали как в контрольных, так и в опытных растениях (рис.10).

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 3. дни после начала засоления

Рис.10. Суточная динамика содержания пролина в листьях растений М. с^аШпит в течение онтогенеза

-Контроль (2 часа до конца тёмнового периода) - тА - иаС1 (2 часа до конца тёмнового периода) -Контроль (2 часа до конца светового периода) ■ МаС! (2 часа до конца светового периода)

Полученные данные позволяют высказать предположение, что суточные флуктуации пролина, предшествующие индукции САМ (рис.11), являются следствием изменения водного статуса организма и могут рассматриваться в качестве процесса, существенного для перехода хрустальной травки на водосберегающий путь фиксации углекислоты. Ключевую роль в данном случае могут играть интермедиаты окисления пролина, накопление которых до определенного порогового уровня (в процессе онтогенеза в нормальных или в стрессорных условиях) является сигналом для запуска специализированных механизмов адаптации к водному дефициту по типу САМ.

Переход на САМ

(индуцированный)

+ NaCl

Увеличение

1) активности ФЕПКазы в 2,5•—5,5 раза

2) А[1Г] в 30—255 раз

■NaCl

Увеличение

1) активности ФЕПКазы в 1,7—2,5 раза

2) Д[РГ] в 17—55 раз

—NaCl

1 2 3

недели после начала засоления

Рис. 11. Схема суточной динамики содержания пролина у растений М. ауШаШпит Ь. в течение онтогенеза а —ночь —день

Выводы

1. Специализированная адаптация растений М. сгуНаШпит Ь. в условиях засоления проявляется в формировании эффективного водосберегающего пути фиксации углекислоты САМ-типа фотосинтеза и характеризуется высоким адаптационным потенциалом, который выражается в способности растений осуществлять онтогенетический цикл развития в присутствии 0,5—0,75 М хлористого натрия. При этом активность ключевого фермента САМ фосфоенолпируваткарбоксилазы увеличивается в 3,0—5,5 раза, а суточный диапазон изменений титруемой кислотности достигает 125 мкэкв Н\г"' свежей массы. Дальнейшее повышение концентрации соли в субстрате до 1,5—3,0 М блокирует формирование протекторных механизмов и механизмов долговременной адаптации, вызывает интенсивные необратимые повреждения растений и их быструю гибель.

2. Адаптация растений хрустальной травки к условиям засоления сопровождается сильной аккумуляцией осмолитов и развитием чрезвычайно высокого осмотического давления клеточного сока, которое к 5—6 неделе эксперимента увеличивается в 3,8—4,0 раза и достигает 4,50—4,62 МПа. Установлена высокая степень корреляции между содержанием ионов и СГ в почве и в тканях растений, что однозначно указывает на функционирование солеаккумулирующего механизма устойчивости.

3. Высокое содержание неорганических ионов уравновешивается аккумуляцией пролииа - основного совместимого осмолита хрустальной травки. Показана осморегуляторная роль пролина в данном объекте при засолении, о чем свидетельствует близкое к единице значение коэффициента корреляции между величиной осмотического давления клеточного сока и уровнем пролина, начиная с 36 час действия стрессорного фактора.

4. Впервые обнаружены суточные флуктуации уровня клеточного пролина, которые контролируются онтогенетическими и стрессорными регуляторными сигналами, получены доводы в пользу полифункциональной роли пролина в процессе адаптации

5. Показано, что понижение водного потенциала почвенного раствора в условиях засоления инициирует быстрые изменения комплекса параметров водного статуса

растений, которые проявляются в снижении оводненности тканей, усилении водного дефицита, кратковременной потере тургора, быстром и стабильном падении интенсивности транспирации. Изменение водного статуса хрустальной травки при засолении инициирует суточные колебания уровня пролина в тканях, которые носят транзитный характер, предшествуют индукции САМ-типа фотосинтеза при стрессе, а также в ходе нормального развития и, очевидно, индуцируют формирование генетически детерминированной водосберегающей стратегии адаптации в условиях засоления.

1. Kholodova V.P., Neto D.S., Meshcheiyakov A.B., Borisova N.N., Dam D.B., Kuznetsov VI.V. (1996) Physiological Aspects of Crassulacean Acid Metabolism Induction in Mesembryanthemum crystallinum L. under NaCl Salinity. Abst. Intern. Symp. «Stress and Inorganic Nitrogen Assimilation and the 2 — Fohs Biostress Symposium» (17 ^ - 21a September, 1996), Moscow. P.42.

2. Rakitin V.Yu., Neto D.S., Dam D.B., Borisova N.N., Kuznetsov Vl.V. (1996) Ethylene Evolution under Salinity and High Temperature and Expression of Crassulacean Acid Metabolism (CAM) in Common Ice Plant. Abst. Intern. Symp. «Stress and Inorganic Nitrogen Assimilation and the 2 - Fohs Biostress Symposium» (17 ^ - 21- September, 1996), Moscow. P.85.

3. Kholodova V.P., Dam D.B., Neto D.S., Rakitin V.Yu., and Kuznetsov Vl.V. (1997) Light-Dark Fluctuations of Proline Levels in Mesembryanthemum crystallinum L. under Salt Stress. Biological Bulletin of Poznan. Ser.-D. Biological Scienses, V. 34. P.30.

4. Kuznetsov Vl.V., Meshcheiyakov A.B., Neto D.S., Borisova N.N., Dam D.B., Alexandrova S.N. and Kholodova V.P. (1997) Short-Term Stress Responses of Mesembryanthemum crystallinum L. Plants to Salinity. Biological Bulletin of Poznan. Ser. D. Biological Scienses, V. 34. P.30.

5. Kuznetsov Vl.V., Dam D.B., Neto D.S., Rakitin V.Yu., Shevyakova N.I. and Kholodova V.P. (1998) Heat Shock Modifies Accumulation of Proline, Polyamines and Evolution of Ethylene in Mesembryanthemum crystallinum L. under Salinity. Plant Physiol., (In press).

Список работ, опубликованных по теме диссертации