Адаптация к действию повышенных концентраций меди и цинка и возможность использования в фиторемедиации растений Mesembryanthemum crystallinum L.

Волков, Кирилл Сергеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Адаптация к действию повышенных концентраций меди и цинка и возможность использования в фиторемедиации растений Mesembryanthemum crystallinum L.
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Адаптация к действию повышенных концентраций меди и цинка и возможность использования в фиторемедиации растений Mesembryanthemum crystallinum L."

ръ I

*и

, ( ; На правах рукописи

ВОЛКОВ Кирилл Сергеевич

АДАПТАЦИЯ К ДЕЙСТВИЮ ПОВЫШЕННЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ МЕДИ И ЦИНКА И ВОЗМОЖНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ФИТОРЕМЕДИАЦИИ РАСТЕНИЙ МеяетЬтуаМНетит сгуяшШпит I,.

03.00.12. — физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 2006

Работа выполнена в Лаборатории физиологических и молекулярных механизмов адаптации Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН

Научный руководитель:

кандидат биологических наук

Холодова Валентина Павловна

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор

Кондратьев Михаил Николаевич

Кандидат биологических наук

Серегин Илья Владимирович

Ведущее учреждение - Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет.

Защита диссертации состоится 30 мая 2006 г. в 15.00 часов на заседании диссертационного совета К 002.210.01 при Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН по адресу: 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35 Факс (495) 977 8018, email: ifr@ippras.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН.

Автореферат разослан « -¿' » апреля 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

М.И. Азаркович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Проблема повышенного содержания тяжелых металлов (ТМ) в окружающей среде с каждым годом приобретает все большую актуальность. В настоящее время проблемными с точки зрения превышения допустимых концентраций различных ТМ являются не только участки, прилежащие к крупным магистралям, но и рекреационные территории в крупных мегаполисах, а также сельскохозяйственные угодья. В связи с этим представляется крайне необходимым проведение исследований, направленных на изучение влияния высоких концентраций ТМ на растения и формирование у последних адаптационных механизмов, позволяющих выживать в экстремальных условиях.

Полученные в таких исследованиях данные представляют большой интерес как для понимания общих механизмов устойчивости к экстремальным воздействиям, так и с практической точки зрения, поскольку устойчивые виды, способные не только расти в присутствии повышенных концентраций ТМ, но и накапливать их в надземных органах, могут в дальнейшем использоваться в целях фиторемедиации, - одной из наиболее перспективных стратегий очистки контаминированных территорий от полютантов (Cunningham and Ow, 1996; Gleba et al., 1999; Lasat, 2002).

Факультативный галофит Mesembryanthemum crystaïïinum L. (хрустальная травка) уже длительное время используется в качестве модели для изучения механизмов адаптации к экстремальным условиям, однако, к настоящему времени не проведено систематического изучения адаптации растений хрустальной травки к действию ТМ. В исследованиях Н.И. Шевяковой с соавт. (2003) было показано, что относительная устойчивость растений M. crystaïïinum к кадмию сопряжена со слабым поступлением этого ТМ в надземные органы. Напротив, в исследовании Thomas et al. (1998) была установлена возможность роста растений хрустальной травки при чрезвычайно высоких концентрациях солей меди в среде (до 8 мМ), что сопровождалось накоплением ионов меди в

листьях. Однако, несмотря на то, что авторы ограничились лишь кратковременными опытами, это не помешало им заявить о возможности использования М. сгу$1аШпит в целях фиторемедиации загрязненных медью территорий.

В последнее время немало внимания уделяется изучению механизмов адаптации растений к комплексному действию стрессорных факторов и явлению так называемой кросс-адаптации - способности растений повышать устойчивость к данному фактору в результате адаптации к фактору иной природы. Однако, вопрос о том, сопровождается ли адаптация растений к засолению увеличением толерантности к ТМ, остается в настоящее время открытым. Вместе с тем, понимание механизмов адаптации растений к комбинированному действию хлоридного засоления и ТМ представляет помимо теоретического и немалый практический интерес, - зачастую загрязнение ТМ сопровождается и повышенным уровнем солей в почве. В особенности это характерно для территорий, прилежащих к магистралям — одного из главнейших объектов фиторемедиации в крупных мегаполисах.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение воздействия на растения хрустальной травки солей меди и цинка, а также комплекса стрессорных факторов, в частности меди и хлоридного засоления, изучение механизмов адаптации к данным стрессорам, оценка возможности использования растений в фиторемедиации.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Выяснить диапазоны концентраций сернокислых солей меди и цинка, в которых растения хрустальной травки сохраняют способность к нормальному прохождению онтогенетического цикла.

2. Исследовать изменение основных параметров водного статуса растений при действии меди и цинка, а также выяснить, сопровождаются ли такие изменения стресс-индуцированным формированием важного водосберегающего механизма М. сгуйгаШпит - САМ-типа фотосинтеза.

3. Оценить интенсивность индуцируемого солями меди и цинка у растений М. сгушгаШпит окислительного стресса.

4. Выяснить, приводит ли воздействие на растения хрустальной травки солей меди и цинка к активации экспрессии генов металлотионеинов — основной группы хелатирующих данные ТМ пептидов растений.

5. Исследовать особенности адаптации растений М. crystallinum к совместному действию меди и хлористого натрия.

6. Проследить изменение основных физиологических параметров растений М. сгузгаШпит при комплексном действии солей меди и засоления и дать ответ на вопрос, является ли хрустальная травка пригодной для фиторемедиации территорий, подвергнутых одновременно засолению и загрязнению ТМ.

Научная новизна. Впервые показана высокая степень устойчивости растений М. сгуз1аШпит к солям цинка на стадии проростков. Впервые показана возможность функционирования САМ-типа фотосинтеза у растений хрустальной травки при действии ТМ. Экспериментально доказано, что ТМ-индуцированный окислительный стресс у растений М. сгуйгаШпит не сопровождается нарушением барьерных свойств основных клеточных мембран. Впервые обнаружена индукция ионами меди и цинка экспрессии генов металлотионеинов у растений М. сгузшШпит. Впервые проведено изучение особенностей формирования адаптации растений хрустальной травки к меди при совместном действии с хлористым натрием. Установлено, что адаптация растений к избыточному засолению сопровождается снижением токсического эффекта меди и что важную роль в этом процессе играет способность растений к повышенной аккумуляции пролина.

Практическая значимость. Полученные в работе теоретические данные об особенностях действия солей цинка и меди на изменение параметров водного статуса, формирование САМ и окислительного стресса у растений, а также о механизмах устойчивости как к ТМ, так и к комплексному действию факторов, имеют существенное значение для выяснения хода формирования адаптивных процессов у галофитов и при разработке технологии создания трансгенных растений с повышенной устойчивостью. Растения М. сгузХаШпит могут быть рекомендованы для фиторемедиации территорий с комплексным загрязнением. Теоретические обобщения и совокупность полученных

экспериментальных данных может использоваться в курсах лекций для студентов биологических факультетов ВУЗов страны.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на международной конференции «Aral Sea Basin Conference» (Бухара, 2003), на V Съезде общества физиологов растений России и Международной конференции «Физиология растений — основа фитобиотехнологии» (Пенза, 2003), на годичном собрании физиологов растений России и Международной научной конференции «Проблемы физиологии растений севера» (Петрозаводск, 2004), на международной конференции «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия» (Вологда, 2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследований, изложения полученных результатов, обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на страницах машинописного текста, включая ¿ таблиц, рисунков; библиография содержит ///названий, в т.ч./^на иностранных языках.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследований являлись растения М. crystallinum L. -дикорастущего факультативного галофита семейства Mesembryanthemaceae, происходящего из намибийской пустыни Южной Африки.

Растения хрустальной травки выращивали в водной культуре в камере фитотрона при дневной и ночной температурах 23-25°С и 18-20°С соответственно. Продолжительность фотопериода составляла 12 часов при интенсивности освещения 350 мкмоль/м2с натриевыми лампами ДНаЗ (фирма Reflux, Россия). Посев семян производили в кюветы с перлитом. В возрасте 4-5 недель по 3 растения высаживали в стеклянные сосуды емкостью 2 литра на модифицированную питательную среду Johnson (Winter, 1973) с железом в нитратной форме. Соли меди (10-100 мкМ) или цинка (50-800 мкМ) вносили в

питательную среду по достижении растениями стадии 3 — 4 пар первичных листьев.

Для определения влияния ТМ на прорастание семена хрустальной травки, предварительно обработанные 0,1% раствором марганцовокислого калия, по 100 штук помещали на фильтровальную бумагу в стерильные чашки Петри, содержавшие питательный раствор Johnson. В чашки Петри вносили сернокислые соли меди или цинка в концентрациях до 200 мкМ и 6000 мкМ, соответственно. Проращивание проводили в тех же условиях, которые использовали для роста опытных растений; всхожесть оценивали на 7-й день.

Измерение свежей и сухой массы отдельных органов растения (листьев и стеблей) и содержания в них воды проводили стандартным весовым методом. Интенсивность транспирации оценивали гравитационным методом и выражали ее в мг • г"'св. массы • ч"1 или мг • дм"2 • ч"1. Для определения осмотического потенциала клеточного сока гомогенат листьев центрифугировали при 5000g в течение 15 минут на центрифуге КМ-15200 фирмы "Kubota" (Япония) и измеряли осмотический потенциал на осмометре Osmomat 030 фирмы «Gonotac». О переходе на САМ-тип фотосинтеза и его интесивности судили по величине титруемой кислотности клеточного сока листьев. Содержание свободного пролина определяли с помощью кислого нингидринового реактива (Bates et al., 1973). Интенсивность окраски измеряли при 520 нм на спектрофотометре СФ-46 (фирма «ЛОМО», Россия). Для калибровки использовали пролин фирмы «Sigma» (США). Барьерные свойства мембран оценивали по степени выхода (утечки) электролитов после тестирующего высокотемпературного воздействия.

Содержание хлорофилла в листьях хрустальной травки определяли после

экстракции пигментов этиловым спиртом по Шлыку (1971). Приготовление

проб для определения содержания меди и цинка в тканях растений

проводили путем мокрого озоления по методу Голубкиной (1995).

Концентрацию ТМ измеряли на атомно-абсорбционном спектрофотометре

Hitachi-207 фирмы «Hitachi» (Япония). Перекисное окисление липидов

оценивали по концентрации малонового диальдегида (МДА) (Heath and Parker,

1968). Определение активности растворимой и ион-связанной пероксндаз

проводили по Ridge and Osborne (1971), используя в качестве субстрата Н2О2, а в качестве донора водорода - гваякол ('Fluka", Швейцария). Содержание белка определяли по методу Bradford (1976), используя для калибровки бычий сывороточный альбумин фирмы «Sigma» (США).

Оценку уровня экспрессии генов металлотионеннов проводили методом обратной транскрипции — полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). Тотальную РНК из образцов выделяли фенольным методом, препарат РНК обрабатывали ДНКазой, после чего проводили фенольную депротеинизацию. Обратную транскрипцию проводили в соответствии с инструкцией фирмы "Fermentas", применив oligo(dT)21VN в качестве затравки. ПЦР осуществляли с использованием Tag-ДНК-полимеразы. Последовательность нуклеотидов генов металлотионеннов и контрольного гена актина были взяты на сайте www.tigr.org (The Institute for Genomic Research).

Каждый опыт проводили не менее 3-4 раз. Анализы выполняли в 3-х биологических повторностях. В таблицах представлены средние величины и значения НСР при 95% уровне вероятности. Бары на рисунках обозначают стандартные отклонения от среднего.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Адаптация растений хрустальной травки к действию меди и цинка.

Оценка влияния солей меди и цинка на прорастание семян М crystallinum показала их довольно высокую устойчивость к действию этих ТМ не только на стадии прорастания, но и в процессе роста проростка в течение семи дней. CUSO4 в диапазоне концентраций от 10 до 50 мкМ не только не ингибировала прорастание, но оказывала некоторое стимулирующее действие (при 25 мкМ). Достоверное снижение всхожести семян наблюдалось при 100 мкМ и более высоких концентрациях CUSO4. Значительно большую устойчивость показала хрустальная травка по отношению к ZnSOí, негативное действие которого проявилось лишь при концентрации 6000 мкМ.

Иная картина была обнаружена при длительном выращивании растений в присутствии ТМ. Оказалось, что растения хрустальной травки не были способны адаптироваться к концентрациям меди выше 100 мкМ, а цинка -выше 1000 мкМ, погибая через несколько дней действия ТМ. В дальнейшей работе соли меди вносили в питательный раствор в концентрациях 10 - 100 мкМ, а цинка — 150 - 800 мкМ.

Рис. 1. Влияние 2х-недельного воздействия меди (А) и цинка (Б) на рост растений

М.сгуйШШпит.

1,2 — контрольный вариант, 1 - начало опыта, 2 - на 14-е сутки, (А) 3-6 - Си304,3-10 мкМ, 4-25 мкМ, 5-50 мкМ, 6-100 мкМ, (Б) 3-6 - гпБСЬ, 3-100 мкМ, 4 - 250 мкМ, 5 - 500 мкМ, 6 - 800 мкМ. а - листья и стебель, б - боковые побеги, в - корня.

Данные по росту растений хрустальной травки в присутствии сернокислых солей меди и цинка представлены на рис. 1. Растения контрольного варианта за 14 суток эксперимента не только увеличили биомассу первичных листьев с 4,1 г до 23 г, но и начали формировать боковые побеги. В то же время только при минимальной из использованных концентраций меди (10 мкМ) рост и развитие растений были близки к контрольному варианту. Напротив, уже в присутствии 25 мкМ меди рост растений был очень слабым, при более высоких концентрациях биомасса растений была даже ниже исходной величины.

Хрустальная травка обнаружила способность адаптироваться к действию значительно более высоких концентраций цинка: 100 мкМ ZnS04 лишь слегка снижал скорость роста, а 800 мкМ сильно тормозил накопление биомассы, но не блокировал развития боковых побегов.

Важно было оценить аккумуляцию ионов меди и цинка в надземных органах растений. Данные одного из типичных опытов по динамике поступления ТМ в листья представлены в таблице 1. Они показывают, что в контрольных растениях содержание меди составляло 15,3 мкг, цинка 30,7 мина 1 г сухой массы листьев. Но уже через три дня роста содержание меди увеличилось до 174 мкг, на 7-й день эксперимента достигло 215 мкг/г сухой массы листьев при максимальной использованной концентрации CuSOi (200 мкМ). Значительно выше было накопление цинка, концентрация которого на 7-й день эксперимента превысила 1700 мкг/г сухой массы листьев (при 800 мкМ ZnS04 в среде). При этом практически не было обнаружено достоверной разницы в аккумуляции меди и цинка при использовании в качестве аниона сульфата или хлорида (табл. 1).

Таблица 1. Накопление меди и цинка листьями растений хрустальной травки, мкг/г

сухой массы

Концентрация солей, мкМ 3 дня 7 дней

Контроль * 15.3

C11S04 50 84 125

100 130 185

200 174 215

СиС12 50 85 107

100 119 147

200 199 191

Контроль * 30.7

ZnS04 250 181 304

500 410 1248

800 913 1710

ZnCfo 250 210 317

500 395 1312

800 1023 1405

НСРо.05 23 31

* Культуральная среда содержала 0.25 мкМ CuS04h 1 мкМ ZnSO*.

Для выяснения причин сильного негативного действия ТМ на рост растений

было решено исследовать влияние ТМ на некоторые физиологические

параметры. Принимая во внимание тот факт, что при внесении в питательный раствор солей ТМ (особенно меди) визуально обнаруживалось подвядание растений (падение тургора) и снижение пигментации листьев, работа была начата с оценки показателей водного статуса и содержания пигментов.

Оказалось, что рост растений на среде с ТМ, включая даже самые низкие из использованных концентраций меди, приводил к сильному снижению содержания воды в листьях (табл. 2). Падение оводненности происходило уже на ранних этапах действия меди; со временем ее негативный эффект заметно усиливался. Приведенный в табл. 2 пересчет содержания воды на сухую массу особенно отчетливо свидетельствует о нарушении водного статуса растений в присутствии меди. В отличие от меди негативное действие цинка было значительно менее выраженным.

Таблица 2. Содержание воды в листьях растений хрустальной травки

Концентрация 3 дня 10 дней 3 дня 10 дней

солей, мкМ % от свежей массы г HjO/r сухой массы

Контроль 97.11 96.83 33.60 30.64

CuS04 15 96.43 94.97 27.01 18.95

25 96.12 92.11 24.77 11.72

50 94.28 89.49 16.48 8.81

ZnS04 150 96.81 95.18 30.35 19.76

250 96.36 95.12 26.47 19.62

500 96.12 94.35 24.77 16.70

НСРо,о5 0.45 0.53 1.5 1.2

Сернокислые соли как меди, так и, в меньшей степени, цинка вызывали

резкое ингибирование транспирации, причем такой эффект отмечался уже при

действии на растения минимальной из использованных концентраций меди. В

то время как уровень транспирации контрольных растений достигал 320

мг/дм2-ч, действие 15 мкМ сернокислой меди снижало к седьмым суткам

эксперимента транспирацию до 118 мг/дм2-ч. В самой высокой (50 мкМ) из

использованных в данном случае концентраций, медь еще более сильно

ингибировала транспирацию, которая на четырнадцатые сутки снижалась

практически в пять раз по сравнению с контрольными растениями. Действие цинка на транспирацию было менее выражено.

12 3 4 12 3 4

-1,6 -I .1,6

Рис. 2 Осмотический потенциал листьев растений М. сгуНаШпит при действии меди (А) и цинка (Б) в течение 3 (а), 7 (б) и 14 (в) дней. А -1 - контроль, 2-4 - СиБО^, 2-25 мкМ, 3-50 мкМ, 4—100 мкМ Б - 1 - контроль, 2-4 - гп304,2 - 250 мкМ, 3 - 500 мкМ, 4 - 800 мкМ

Более точно состояние водного статуса растений отражает такой показатель, как осмотический потенциал клеточного сока (рис. 2). Сульфат меди в концентрации 25 мкМ в течение трех дней вызывал снижение осмотического потенциала до -0,68 МПа, а к седьмым суткам эксперимента он опускался до значений ниже единицы, т.е. более чем в два раза по сравнению с контрольными показателями. К самому значительному, практически трехкратному по сравнению с контролем, падению осмотического потенциала (до -1,58 МПа в отдельных случаях) приводил семидневный рост растений на среде с сернокислой медью в концентрации 100 мкМ. Несколько слабее было выражено влияние на осмотический потенциал сернокислого цинка. Максимальное падение осмотического потенциала наблюдалось при действии высшей из использованных концентраций цинка (800 мкМ) - до -1,4 МПа к

четырнадцатым суткам эксперимента, что однако же было ниже падения, вызванного семидневным действием меди в концентрации 100 мкМ.

Вслед за падением оводненности и осмотического потенциала происходила индукция ТМ аккумуляции пролина, одного из основных осмопротекторов у хрустальной травки. На 14-й день опыта концентрация пролина увеличилась в 3 раза в присутствии 25 мкМ Си304 и в 8 раз на фоне 50 мкМ Си504. В вариантах с цинком было достигнуто 7-кратное превышение уровня пролина в листьях по сравнению с контрольными растениями (рис. 3).

Рис. 3 Аккумуляция пролина в листьях растений М. сгу$1аШпит при действии меди и цинка в течение 14 дней. 1 - контроль,

2,3 - СиБО), 2-25 мкМ, 3 -50 мкМ,

4, 5 - гпБОд, 4 — 250 мкМ, 5 -500 мкМ

Одним из основных ответов хрустальной травки на действие стрессоров различной природы является переключение фиксации СОг с С] - типа фотосинтеза на САМ. Являясь эффективной водосберегающей стратегией, САМ-фотосинтез способствует поддержанию водного статуса растений в жестких условиях.

Об индукции САМ и его интенсивности судили по концентрации протона в листьях (рис. 4), которая повышалась при действие меди и цинка уже на третьи сутки эксперимента, достоверно превышая концентрацию протона в листьях как контрольных растений, так и подвергнутых действию 400 мМ №С1. Значительно возрастала концентрация протона к 14-м суткам эксперимента, в максимальном случае составляя почти 140 мкэкв Н7г свежей массы, что достоверно превосходило интенсивность САМ, вызванного ЫаС1.

3 160,0 -|

и и я 140,0 -

£ зП 120,0 -

В 100,0 -

« и 80,0 •

и + 60,0 ■

К Ч 40,0 -

3 20,0 -

35 0,0 -

3 160,0 £ 140,0 ■

я 120,0

1 юо.о

Рис. 4 Действие меди (А) и цинка (Б) на интенсивность САМ у растений хрустальной травки на третьи (а), седьмые (б) и четырнадцатые (в) сутки эксперимента.

А - 1 - контроль, 2 - №С1 (400 мМ),

3-5 - Си804, 3-25 мкМ, 4-50 мкМ, 5 - 100 мкМ Б -1 - контроль, 2 - КаС1 (400 мМ),

3-5 - гп804,3 - 250 мкМ, 4 -500 мкМ, 5 - 800 мкМ

Среди негативных эффектов, вызванных высокими концентрациями меди и цинка на растения М. crystallinum, необходимо отметить действие на хлорофилл, причем реакции ранее сформированных и молодых, развивающихся листьев, были различны. На старых листьях появлялись обесцвеченные некротические пятна размером до 1 см, тогда как сформировавшиеся в присутствии ТМ листья обнаруживали признаки хлороза. Количественная оценка содержания хлорофилла в листьях, выросших на среде с ТМ, показала, что существенное действие сернокислого цинка проявилось только при высшей из использованных концентраций: не влияя достоверно на содержание хлорофилла, 500 мкМ 2п804 изменяли соотношение хл я/хл Ь. Медь в низких концентрациях оказала слабое действие, однако уже при росте растений на среде с 50 мкМ СиБ04 наблюдалось не только изменение соотношения хл а/хл Ъ, но также и сильное снижение содержания хлорофилла.

Одной из причин обнаруженной деградации хлорофилла и нарушения его синтеза в листьях хрустальной травки мог быть окислительный стресс, индуцируемый ТМ. Одной из основных мишеней действия активных форм кислорода (АФК) часто являются липидные компоненты мембран. Об интенсивности перекисного окисления липидов можно судить по концентрации малонового диальдегида — основного продукта этого процесса.

Рис. 5. Влияние меди и цинка на интенсивность перекисного окисления липидов (14 дней). 1 — контроль,

2,3-СивО.,, 2-25 мкМ.З - 50 мкМ,

3, 5 - гпБСи, 3 - 250 мкМ, 4 - 500 мкМ.

Как свидетельствуют полученные данные (рис. 5), высокие концентрации солей меди и цинка вызывали достоверное, практически одинаковое по размеру, на 70% превышающее значения контрольного варианта, повышение активности липоксигеназы, тогда как эффект низких концентраций ТМ отсутствовал.

Часто мишенью повреждающего действия АФК оказываются основные мембраны клетки, плазмалемма и тонопласт. Для оценки их состояния и возможного влияния ТМ на целостность мембран использовали такой интегральный показатель как утечка электролитов из клеток листьев. Однако не было выявлено какого-либо эффекта солей меди и цинка на барьерные свойства мембран ни в стандартных условиях, не при провоцирующем действии высоких температур. Такие данные вместе с сильным влиянием ТМ на хлорофилл позволяют высказать предположение, что основной мишенью

действия АФК у растений хрустальной травки являются мембраны хлоропластов.

Рве. 6. Изменение активности свободной (а) и ион-связанной (б)

пероксидазы при действии меди и цинка в течение 14 дней.

1 - контроль, 2,3 - СиБОч, 2-25 мкМ, 3-50 мкМ, 4,5 -гп804,4 - 250 мкМ, 5 - 500 мкМ.

Важную роль в системе защиты от активных форм кислорода (АФК) играет пероксидаза, предотвращающая избыточное накопление пероксида водорода. Особенно сильную активацию свободной формы пероксидазы (более чем в 2,5 раза в сравнении с контрольными растениями) вызывали 50 мкМ Си504. Сопоставимый эффект сульфата цинка наблюдался лишь при 10-кратно увеличенной его концентрации (500 мкМ). Необходимо также отметить, что медь и цинк не вызывали повышения активности ион-связанной формы пероксидазы в листьях растений (рис. 6). Характерно, что все признаки окислительного стресса значительно сильнее развивались в присутствии солей меди, что вполне отвечает ее химической природе как металлу с переходной валентностью.

Воздействие на растения хрустальной травки сернокислыми солями меди и цинка приводило к активации экспрессии генов низкомолекулярных специфических белков хелаторов этих ТМ — металлотионеинов. Было показано, что исследуемые гены - МТ6273 и МТ6331 наиболее активно экспрессируются при обработке растений сернокислой медью (рис. 7). Так, к седьмым суткам эксперимента уровень транскриптов обоих генов металлотионеинов значительно увеличивался по сравнению с контролем уже при росте растений на среде с 25 мкМ Си804. Еще более значительный уровень

0,30

8 0,15

«0,10

л 0,05 ч ■

£ 0,00

4 5

мРНК МТ6273 и МТ6331 наблюдался при использовании 50 мкМ Си804. Таким образом, обнаруживалась выраженная концентрационная зависимость уровня экспрессии обоих генов.

Рис 7. Уровень матричной РНК двух генов металлотионеинов -МГ6273 и МТ6331, седьмые сутки эксперимента. 1-контроль, ■ 2 - СиБ04 25 мкМ, 3 - Си304 50 мкМ,

4 - 2п804 250 мкМ, 5 - 2л804 500 мкМ

Действие сернокислого цинка вызывало достоверное увеличение экспрессии МТ6273 и МТ6331 лишь в высшей из использованных концентраций - 800 мкМ. Однако даже в данном случае уровень накопления матричной РНК исследуемых генов был ниже такового при использовании 50 мкМ сульфата меди.

Совместное действие меди и засоления

Поскольку М. сгухгаШпит является галофитом, заселяющим в естественных условиях почвы с высоким содержанием солей, представлялось необходимым изучить особенности формирования адаптационного процесса при одновременном действии двух факторов - №С1 и ТМ.

Для изучения характера взаимодействия двух стрессоров, прежде всего, сравнивали общее состояние и накопление биомассы растений при раздельном действии сернокислой меди и хлористого натрия или их совместном действии. Полученные данные показали, что за семь суток эксперимента растения, подвергнутые совместному действию двух изучаемых факторов, не обнаруживали таких характерных признаков токсического действия солей меди как резкое замедление и полное ингибирование аккумуляции биомассы, появление некротических пятен и потеря тургора. В

целом следует отметить, что по уровню развития растения, подвергнутые совместному действию №С1 и СиБС^, были вполне сопоставимы с растениями, выращиваемыми в присутствии одного лишь ЫаС1 (400 мМ) в питательной среде.

Представлялось весьма вероятным, что снятие хлористым натрием токсического действия сернокислой меди было сопряжено с ингибированием поступления ионов меди в растения хрустальной травки. Однако не было обнаружено достоверных различий в уровне накопления меди первичными листьями растений, росших в течение 7 дней на среде в присутствии только СиБ04 или совместно с 400 мМ №0 (рис. 7), хотя внесение Си804 в среду вызывало увеличение концентрации меди в листьях в 7-8 раз в сравнении с контролем. Следовательно, защитный эффект хлористого натрия не был связан с торможением аккумуляции меди в листьях хрустальной травки.

1 - контроль, 2 -КаС1,400 мМ,

3-4 - СивСи, 3-25 мкМ, 4-50 мкМ,

5-6 - ЫаС1,400 мМ + Си804,

5 - ЫаС1 + СиЭ04 - 25 мкМ,

6 - ШС1 + Си504 - 50 мкМ.

Рис. 8. Аккумуляция меди в листьях растений хрустальной травки за 7 суток.

Важной адаптационной стратегией растений хрустальной травки является их переход с Сз-типа фотосинтеза на водосберегающий САМ-тип. В связи с этим нельзя было исключать, что позитивный эффект адаптации растений к ЫаС1 на их устойчивость к меди связан со стресс-индуцированным формированием САМ-типа фотосинтеза. Полученные результаты показали, что к концу эксперимента (7 суток) величина титруемой кислотности для растений

контрольного варианта составила 23 мкэкв/г свежей массы, что свидетельствует об инициации функционирования САМ. Через 7 суток после внесения в питательную среду 400 мМ №С1 концентрация протона доходила до 52 мкэкв/г свежей массы, что соответствует САМ средней интенсивности. Действие сернокислой меди вызывало значительное увеличение интенсивности САМ, концентрация протона в этом случае составляла 83 мкэкв/г свежей массы. Близкой была интенсивность САМ у растений обоих вариантов совместного действия Си804 и КаС1, составляя в среднем 72 мкэкв/г свежей массы. Существенно, что различия интенсивности протекания САМ между этими вариантами и вариантами с действием одной лишь сернокислой меди недостоверны. Это означает, что защитный эффект ЫаС1 в случае совместного с СиБ04 действия, не был связан с дополнительной активацией САМ-фотосинтеза. Также не было обнаружено и снижения хлористым натрием при совместном действии с медью частичного обезвоживания листьев растений.

1 — контроль,

2-N801,400 мМ,

3-4-СивО«, 3-25мкМ, 4 - 50 мкМ,

5-6 -№С1, 400 мМ + Си804,5 - КаС1 + Сив04 -25 мкМ, 6 - №С1 + СиБ04 -50 мкМ.

Рис. 9. Осмотический потенциал клеточного сока листьев растений хрустально травки за 7 суток.

Выше приводились данные о действие цинка и в большей степени меди на снижение осмотического потенциала клеточного сока листьев растений М сгуьЫИпит (см. рис. 2). Еще большее влияние оказывало воздействие хлористого натрия, снижая осмотический потенциал до —2МПа от -0,8МПа у

контроля. Промежуточные значения занимали показатели осмотического потенциала растений при действии сернокислой меди. Однако совместное действие факторов приводило к неожиданно резкому падению анализируемого показателя, в 3,8 раз по сравнению с контролем у растений варианта №С1 + СиБ04 - 25 мкМ и почти в шесть раз при действии на растения №С1 + СиБО^ -50 мкМ (рис. 9).

Напрямую с параметрами водного статуса связан такой показатель как аккумуляция совместимых осмолитов, среди которых пролин играет особую роль при адаптации растений к засолению (Кузнецов, Шевякова, 1999). При относительно невысоком содержании в листьях контрольных растений (рис. 10) пролин быстро синтезировался при внесении в питательную среду ЫаС1. Так, на седьмые сутки эксперимента растения хрустальной травки при действии 400 мМ ИаС1 накапливали в листьях до 10 мкмоль пролина на 1 г свежей массы. Более слабую — менее 3 мкмоль/г свежей массы — аккумуляцию пролина вызывала сернокислая медь в концентрации 25 мкМ, однако при 50 мкМ СиБ04 на седьмые сутки концентрация пролина возрастала до 8 мкмоль/г свежей массы. Однако, самая высокая концентрация пролина, значительно превосходящая все другие варианты, - 15-16 мкмоль/г - обнаруживалась в листьях растений при совместном действии обоих изучаемых факторов.

Рис. 4. Аккумуляция пролина в листьях растений хрустальной травки, 7-е сутки эксперимента. 1 - контроль, 2 - ШС1,400 мМ, 3-4 - СивС^,3-25 мкМ, 4-50 мкМ, 5-6 - №С1,400 мМ + Си304,5 — ШС1 + СивО* - 25 мкМ, 6 -КаС1 + Си§04 - 50 мкМ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Как медь, так и цинк являются эссенциальными элементами для растений. Так, известно, что медь является ключевым компонентом, обеспечивающим функционирование ряда ферментов (цитохромоксидазы, аскорбатоксидазы и др.) и белков неферментативной природы (например, пластоцианина). Среди функций цинка в последние годы особое внимание привлекает его участие в работе транскрипционных факторов. Незаменимостью этих элементов, в частности, объясняется то обстоятельство, что при выращивании растений в водной культуре соли меди и цинка являются обязательными компонентами питательных смесей. Так, среда, использованная в опытах с хрустальной травкой, содержала 0,25 мкМ CuSC>4 и 1 мкМ ZnSC>4.

На уровне прорастания семян и начальной стадии роста проростков растения хрустальной травки проявляли высокую устойчивость к солям ТМ, поскольку всхожесть не снижалась при 200 мкМ C11SO4 и 1000 мкМ ZnSCV Однако при длительном выращивании растения М. crystallinum обнаружили способность адаптироваться лишь к более низким концентрациям (до 100 мМ C11SO4 и 800 мМ ZnS04), что, тем не менее, было в 200 и 800 в раз выше, чем содержание этих соединений в стандартной питательной среде.

Как и для большинства изученных растений, для хрустальной травки соли меди оказались значительно более токсичными, чем соли цинка. Этому выводу вполне соответствуют существенно меньшие концентрации меди в сравнении с цинком, обычно обнаруживаемые в тканях растений в норме (Си - 1-10 мкг.г'1, Zn - 10-100 мкг.г'1 сухой массы), а также минимальные токсические концентрации этих ТМ (Си — 20-30 мкг.г"1, Zn - 300-500 мкг.г"1 сухой массы).

Результаты наших экспериментов не позволяют пока отнести хрустальную травку к гипераккумуляторам изученных нами ТМ. Действительно, несмотря на то, что при выращивании растений на среде с 800 мкМ ZnS04 содержание цинка в листьях достигало почти 2 мг на г сухой массы, эта величина все же

существенно ниже концентрации, характерной для гипераккумуляторов цинка (более 10 мг на г сухой массы листьев). Что же касается отношения хрустальной травки к меди, прежде всего, обращает на себя внимание ее высокая токсичность.

Помимо нарушения водного статуса, отчетливым признаком негативного действия солей меди и в меньшей степени цинка является окислительный стресс. К его проявлениям в первую очередь следует отнести заметную деградацию хлорофилла и торможение его синтеза, а также активацию пероксидазы и липоксигеназы. Вместе с тем, существенно, что окислительный стресс не сопровождался нарушениями барьерных функций основных клеточных мембран. Полученные нами данные подтверждают вывод, сделанный при изучении действия меди на растения Silene cucubalus о критической роли поддержания барьерных свойств мембран в реализации устойчивости к этому ТМ (De Vos et al., 1991). Характер защитных реакций хрустальной травки - активизация свободной формы пероксидазы, аккумуляция пролина - также может служить подтверждением внутриклеточных, возможно, хлоропластных повреждений, вызываемых АФК, но не затрагивающих в существенной степени функционирование тонопласта и плазмалеммы.

В целом, полученные данные позволяют сделать заключение об относительно высокой устойчивости растений хрустальной травки к солям меди и особенно цинка. Хотя соли меди заметно тормозили рост уже в концентрации 25 мкМ, растения могли завершать онтогенез и формировать полноценные семена даже при 100 мкМ CuS04 в среде. Однако необходимо отметить, что эта концентрация почти на 2 порядка ниже той, что была заявлена как пригодная для роста хрустальной травки в работе Thomas et al.(1998) на основании 3-7-дневных опытов. Вместе с тем, в пользу сравнительно высокой устойчивости хрустальной травки к меди свидетельствует тот факт, что длительное выращивание при относительно

невысоких концентрациях C11SO4 приводило к аккумулированию в листьях более 100 мкг меди на 1 г сухой массы, что в несколько раз превышает токсический уровень этого ТМ для большинства растений.

Несомненный вклад в устойчивость растений к действию меди вносит хелатирование ионов данного металла специфическими низкомолекулярными белками-хелаторами — металлотионеинами, значительная активация экспрессии генов которых была обнаружена нами у растений M. crystallinum. Таким образом, можно предположить, что в детоксикации меди у М. crystallinum функционирует преимущественно механизм хелатирования, в то время как устойчивость к цинку, скорее всего, реализуется посредством механизма его компартментации в вакуоль, активное участие в этом процессе по некоторым данным принимают транспортные ZAT белки (Hall and Williams, 2003).

Значительно лучшая адаптивная способность растений хрустальной травки в условиях совместного действия меди и засоления может объясняться, с одной стороны, улучшением водного статуса растений, с другой - повышенной аккумуляцией пролина, сопряженной с резким снижением осмотического потенциала растений. Известно, что пролин обладает значительным антиоксидантным действием, а соли меди как металла с переходной валентностью инициируют возникновение активных форм кислорода. Можно на этом основании заключить, что адаптация растений к хлористому натрию (400 мМ) сопровождается снижением токсического эффекта меди, важную роль в этом играет способность растений в ответ на совместное действие двух исследованных факторов к суперпродукции пролина, обладающего множественным стресс-протекторным действием.

ВЫВОДЫ

1. Растения хрустальной травки показали довольно высокую устойчивость к действию солей меди и особенно цинка. Полностью завершая онтогенетический цикл при концентрациях CuS04 до 100 мкМ и ZnS04 до 800

мкМ, растения накапливали в надземных органах значительные количества ТМ, хотя недостаточные для отнесения данного растения к гипераккумуляторам этих ТМ. Вместе с тем хрустальная травка обнаруживала максимальную устойчивость на стадии проростков, что весьма полезно при использовании растения в целях фиторемедиации.

2. Действие ТМ проявлялось в резком снижении аккумуляции биомассы, падении оводненности, нарушении синтеза хлорофилла, а также в активной аккумуляции АФК, что приводило к проявлению на листьях некрозов и интенсификации перекисного окисления липидов.

3. Такое действие ТМ инициировало реализацию ряда адаптивных стратегий, среди которых - стресс-индуцированное формирование САМ; осморегуляция, включающая активный синтез пролина; активация защитных ферментов окислительного стресса, что позволяло поддерживать нормальное функционирование основных мембран клетки.

4. В ответ на действие солей меди и в меньшей степени цинка происходила активация экспрессии двух генов металлотионеинов (МТ6273 и МТ6331) -специфических хелаторов ТМ, установленная на уровне кодируемых этими генами мРНК. Основную роль в детоксикации цинка, по-видимому, играет активный транспорт этого ТМ в вакуоль 21АТ транспортерами.

5. Совместное действие хлористого натрия и ТМ значительно увеличивало адаптационный потенциал растений хрустальной травки, в основе чего может лежать их способность к суперпродукции пролина, обладающего множественным стресс-протекторным действием.

6. Накопление значительных количеств ТМ в надземных органах хрустальной травки вместе с довольно коротким вегетационным циклом и высокой устойчивостью к одновременному действию ТМ и засоления позволяет рассматривать данное растение как перспективное для фиторемедиации, особенно территорий с комплексным загрязнением.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Волков К.С., Холодова В.П. Возможность использования растений хрустальной травки в целях фиторемедиации // Тезисы докладов, V Съезд общества физиологов растений России и Международная конференция «Физиология растений — основа фитобиотехнологии». Пенза, 2003 г. С.260.

2. Холодова В.П., Аканов Э.Н., Волков К.С., Малиновский A.B., Кузнецов Вл.В. Ответ хрустальной травки на повышенную концентрацию углекислоты // Тезисы докладов, V Съезд общества физиологов растений России и Международная конференция . «Физиология растений - основа фитобиотехнологии». Пенза, 2003 г. С.349.

3. Волков К.С., Холодова В.П. Изменение водного статуса и активности антиоксидантных ферментов при адаптации хрустальной травки к повышенным концентрациям меди и цинка // Тезисы докладов, Годичное собрание Общества физиологов растений России и Международная научная конференция «Проблемы физиологии растений севера». Петрозаводск, 2004. С.43.

4. Холодова В.П., Волков К.С., Кузнецов Вл.В. Адаптация к высоким концентрациям солей меди и цинка растений хрустальной травки и возможность их использования в целях фиторемедиации. Физиология растений, 2005, Т. 52, № 6. С.848 - 858.

5. Волков К.С., Холодова В.П. Формирование окислительного стресса у растений хрустальной травки при действии меди и цинка // Тезисы докладов, Международная конференция «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия». Вологда, 2005. С.31.

6. Холодова В.П., Абдеева А.Р., Волков К.С., Кузнецов Вас. В., Кузнецов Вл. В. Экспрессия генов аквапоринов при адаптации растений к хлоридному засолению и солям тяжелых металлов // Тезисы докладов, Международная конференция «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия». Вологда, 2005. С.175.

7. Волков К.С., Холодова В.П., Кузнецов Вл.В. Адаптация растений к засолению снижает токсический эффект меди // Доклады Академии наук, 2006 (в печати).

8. Volkov K.S., Kholodova V.P., Kuznetsov Vl.V. Protective action of sodium chloride against deleterious effect of copper in Mesembryanthemum crystallinum II Abstracts of the 15th FESPB Congress, Lyon, France, 2006 (in press).

к исполнению 26/04/2006 Исполнено 27/04/2006

Заказ №329 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 (495) 747-64-70 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Волков, Кирилл Сергеевич

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 9 1.1.Общие представления о цинке и меди, как эсенциальных элементах и потенциальных загрязнителях окружающей среды

1.1.1. Медь и цинк в почве и растениях

1.1.1.1. Медь и цинк в почве

1.1.1.2. Медь и цинк в растении - поглощение, транспорт, биологическая роль

1.1.2. Фиторемедиация

1.1.2.1. Экологические группы растений по отношению к ТМ. Аккумуляторы и гипераккумуляторы

1.1.2.2. Виды и механизмы фиторемедиации

1.2.Механизмы адаптации растений к высоким концентрациям ТМ

1.2.1. Барьерные механизмы

1.2.2. Хелатирование

1.2.2.1. Фитохелатины

1.2.2.2. Металлотионеины

1.2.3. Компартментация

1.2.3.1. Цитоплазматическая мембрана

1.2.3.2. Вакуоль

1.3.САМ-фотосинтез как путь адаптации растений к абиотическим стрессорным факторам.

ГЛАВА 2. Объект и методы исследования.

2.1. Объект исследования

2.2. Выращивание хрустальной травки в водной культуре

2.3. Условия проведения опытов

2.4. Измерение биомассы

2.5. Определение общего содержания воды в листьях

2.6. Определение интенсивности транспирации

2.7. Определение осмотического потенциала

2.8. Определение содержания свободного пролина

2.9. Измерение рН и буферной емкости

2.10. Определение концентрации хлорофилла

2.11. Оценка утечки электролитов

2.12. Определение содержания ионов в ткани растений

2.13. Определение активности пероксидазы

2.14. Определение интенсивности перикисного окисления липидов (ПОЛ)

2.15. Определение содержания белка 65 2.1 б.Оценка интенсивности экспрессии генов металлотионеинов 65 2.17. Математическая обработка данных

ГЛАВА 3. Экспериментальная часть

3.1. Адаптация растений к действию токсических концентраций меди и цинка

3.1.1. Влияние меди и цинка на прорастание

3.1.2. Влияние меди и цинка на растения при длительном выращивании

3.1.2.1. Рост и развитие растений при действии высоких концентраций меди и цинка

3.1.2.2. Аккумуляция меди и цинка

3.1.2.3. Изменение водного статуса растений при действии высоких концентраций меди и цинка. Индукция САМ.

3.1.2.4. Формирование окислительного стресса при действии высоких концентраций меди и цинка.

3.1.2.5. Индукция медью и цинком экспрессии генов металлотионеинов.

3.2. Адаптация растений к совместному действию засоления и меди. 101 3.2.1. Рост и развитие растений при одновременном действии высоких концентраций меди и засоления.

3.2.2. Аккумуляция меди в условиях совместного с засолением ее действия.

3.2.3. Изменение водного статуса при одновременном действии засоления и меди. Аккумуляция пролина.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Адаптация к действию повышенных концентраций меди и цинка и возможность использования в фиторемедиации растений Mesembryanthemum crystallinum L."

Проблема повышенного содержания тяжелых металлов (ТМ) в окружающей среде с каждым годом приобретает все большую актуальность. В настоящее время проблемными с точки зрения превышения допустимых концентраций различных ТМ являются не только участки, прилежащие к крупным магистралям, но и рекреационные территории в крупных мегаполисах, а также сельскохозяйственные угодья. В связи с этим представляется крайне необходимым проведение исследований, направленных на изучение влияния высоких концентраций ТМ на растения и формирование у последних адаптационных механизмов, позволяющих выживать в экстремальных условиях.

Факультативный галофит Mesembryanthemum crystallinum L. (хрустальная травка) уже длительное время используется в качестве модели для изучения механизмов адаптации к экстремальным условиям, однако, к настоящему времени не проведено систематического изучения адаптации растений хрустальной травки к действию ТМ. В исследованиях Н.И. Шевяковой с соавт. (2003) было показано, что относительная устойчивость растений М. crystallinum к кадмию сопряжена со слабым поступлением этого ТМ в надземные органы. Напротив, в исследовании Thomas et al. (1998) была установлена возможность роста растений хрустальной травки при чрезвычайно высоких концентрациях солей меди в среде (до 8 мМ), что сопровождалось накоплением ионов меди в листьях. Однако, несмотря на то, что авторы ограничились лишь кратковременными опытами, это не помешало им заявить о возможности использования М. crystallinum в целях фиторемедиации загрязненных медью территорий.

В последнее время немало внимания уделяется изучению механизмов адаптации растений к комплексному действию стрессорных факторов и явлению так называемой кросс-адаптации - способности растений повышать устойчивость к данному фактору в результате адаптации к фактору иной природы. Однако, вопрос о том, сопровождается ли адаптация растений к засолению увеличением толерантности к ТМ, остается в настоящее время открытым. Вместе с тем, понимание механизмов адаптации растений к комбинированному действию хлоридного засоления и ТМ представляет помимо теоретического и немалый практический интерес, - зачастую загрязнение ТМ сопровождается и повышенным уровнем солей в почве. В особенности это характерно для территорий, прилежащих к магистралям -одного из главнейших объектов фиторемедиации в крупных мегаполисах.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

2. Исследовать изменение основных параметров водного статуса растений при действии меди и цинка, а также выяснить, сопровождаются ли такие изменения стресс-индуцированным формированием важного водосберегающего механизма М. crystallinum - САМ-типа фотосинтеза.

3. Оценить интенсивность индуцируемого солями меди и цинка у растений М. crystallinum окислительного стресса.

4. Выяснить, приводит ли воздействие на растения хрустальной травки солей меди и цинка к активации экспрессии генов металлотионеинов -основной группы хелатирующих данные ТМ пептидов растений.

5. Исследовать особенности адаптации растений М. crystallinum к совместному действию меди и хлористого натрия.

6. Проследить изменение основных физиологических параметров растений М. crystallinum при комплексном действии солей меди и засоления и дать ответ на вопрос, является ли хрустальная травка пригодной для фиторемедиации территорий, подвергнутых одновременно засолению и загрязнению ТМ.

Научная новизна. Впервые показана высокая степень устойчивости растений М. crystallinum к солям цинка на стадии проростков. Впервые показана возможность функционирования САМ-типа фотосинтеза у растений хрустальной травки при действии ТМ. Экспериментально доказано, что ТМ-индуцированный окислительный стресс у растений М. crystallinum не сопровождается нарушением барьерных свойств основных клеточных мембран. Впервые обнаружена индукция ионами меди и цинка экспрессии генов металлотионеинов у растений М. crystallinum. Впервые проведено изучение особенностей формирования адаптации растений хрустальной травки к меди при совместном действии с хлористым натрием. Установлено, что адаптация растений к избыточному засолению сопровождается снижением токсического эффекта меди и что важную роль в этом процессе играет способность растений к повышенной аккумуляции пролина.

Практическая значимость. Полученные в работе теоретические данные об особенностях действия солей цинка и меди на изменение параметров водного статуса, формирование САМ и окислительного стресса у растений, а также о механизмах устойчивости как к ТМ, так и к комплексному действию факторов, имеют существенное значение для выяснения хода формирования адаптивных процессов у галофитов и при разработке технологии создания трансгенных растений с повышенной устойчивостью. Растения М. crystallinum могут быть рекомендованы для фиторемедиации территорий с комплексным загрязнением. Теоретические обобщения и совокупность полученных экспериментальных данных может использоваться в курсах лекций для студентов биологических факультетов ВУЗов страны.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на международной конференции «Aral Sea Basin Conference» (Бухара, 2003), на V Съезде общества физиологов растений России и Международной конференции «Физиология растений - основа фитобиотехнологии» (Пенза, 2003), на годичном собрании физиологов растений России и Международной научной конференции «Проблемы физиологии растений севера» (Петрозаводск, 2004), на международной конференции «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия» (Вологда, 2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследований, изложения полученных результатов, обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на 132 страницах машинописного текста, включая 6 таблиц, 28 рисунков; библиография содержит 131 название, в т.ч. 111 на иностранных языках.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Волков, Кирилл Сергеевич

выводы

1. Растения хрустальной травки показали довольно высокую устойчивость к действию солей меди и особенно цинка. Полностью завершая онтогенетический цикл при концентрациях C11SO4 до 100 мкМ и ZnS04 до 800 мкМ, растения накапливали в надземных органах значительные количества ТМ, хотя недостаточные для отнесения данного растения к гипераккумуляторам этих ТМ. Вместе с тем хрустальная травка обнаруживала максимальную устойчивость на стадии проростков, что весьма полезно при использовании растения в целях фиторемедиации.

4. В ответ на действие солей меди и в меньшей степени цинка происходила активация экспрессии двух генов металлотионеинов (МТ6273 и МТ6331) - специфических хелаторов ТМ, установленная на уровне кодируемых этими генами мРНК. Основную роль в детоксикации цинка, по-видимому, играет активный транспорт этого ТМ в вакуоль ZAT транспортерами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На уровне прорастания семян и начальной стадии роста проростков растения хрустальной травки проявляли высокую устойчивость к солям ТМ, поскольку всхожесть не снижалась при 200 мкМ CuS04 и 1000 мкМ ZnS04. Однако при длительном выращивании растения М. crystallinum обнаружили способность адаптироваться лишь к более низким концентрациям (до 100 мМ CuS04 и 800 мМ ZnS04), что, тем не менее, было в 200 и 800 в раз выше, чем содержание этих соединений в стандартной питательной среде.

Как и для большинства изученных растений, для хрустальной травки соли меди оказались значительно более токсичными, чем соли цинка. Этому выводу вполне соответствуют существенно меньшие концентрации меди в сравнении с цинком, обычно обнаруживаемые в тканях растений в норме (Си - 1-10 мкг.г"1 , Zn - 10-100 мкг.г"1 сухой массы), а также минимальные токсические концентрации этих ТМ (Си - 20-30 мкг.г"1, Zn - 300-500 мкг.г"1 сухой массы).

800 мкМ ZnSC>4 содержание цинка в листьях достигало почти 2 мг на г сухой массы, эта величина все же существенно ниже концентрации, характерной для гипераккумуляторов цинка (более 10 мг на г сухой массы листьев). Что же касается отношения хрустальной травки к меди, прежде всего, обращает на себя внимание ее высокая токсичность.

Помимо нарушения водного статуса, отчетливым признаком негативного действия солей меди и в меньшей степени цинка является окислительный стресс. К его проявлениям в первую очередь следует отнести заметную деградацию хлорофилла и торможение его синтеза, а также активацию пероксидазы и липоксигеназы. Вместе с тем, существенно, что окислительный стресс не сопровождался нарушениями барьерных функций основных клеточных мембран. Полученные нами данные подтверждают вывод, сделанный при изучении действия меди на растения Silene cucubalus о критической роли поддержания барьерных свойств мембран в реализации устойчивости к этому ТМ (De Vos et al., 1991). Характер защитных реакций хрустальной травки — активизация свободной формы пероксидазы, аккумуляция пролина - также может служить подтверждением внутриклеточных, возможно, хлоропластных повреждений, вызываемых АФК, но не затрагивающих в существенной степени функционирование тонопласта и плазмалеммы.

В целом, полученные данные позволяют сделать заключение об относительно высокой устойчивости растений хрустальной травки к солям меди и особенно цинка. Хотя соли меди заметно тормозили рост уже в концентрации 25 мкМ, растения могли завершать онтогенез и формировать полноценные семена даже при 100 мкМ C11SO4 в среде. Однако необходимо отметить, что эта концентрация почти на 2 порядка ниже той, что была заявлена как пригодная для роста хрустальной травки в работе Thomas et al.(1998) на основании 3-7-дневных опытов. Вместе с тем, в пользу сравнительно высокой устойчивости хрустальной травки к меди свидетельствует тот факт, что длительное выращивание при относительно невысоких концентрациях C11SO4 приводило к аккумулированию в листьях более 100 мкг меди на 1 г сухой массы, что в несколько раз превышает токсический уровень этого ТМ для большинства растений.

Несомненный вклад в устойчивость растений к действию меди вносит хелатирование ионов данного металла специфическими низкомолекулярными белками-хелаторами - металлотионеинами, значительная активация экспрессии генов которых была обнаружена нами у растений М. crystallinum. Таким образом, можно предположить, что в детоксикации меди у М. crystallinum функционирует преимущественно механизм хелатирования, в то время как устойчивость к цинку, скорее всего, реализуется посредством механизма его компартментации в вакуоль, активное участие в этом процессе по некоторым данным принимают транспортные ZAT белки (Hall and Williams, 2003).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Волков, Кирилл Сергеевич, Москва

1. Барабой В.А. Петрина Л.Г. (2003) Металлотионеины: структура и механизмы действия. Укр. биохим. журн. Т.75. С.28-36.

2. Важенина Е.А. (1983) Химические и минералогические исследования почв в окрестностях металлургических предприятий. Бюл. Почв, ин-та им.

3. B.В.Докучаева. Вып.35. С.32-36.

4. Виноградов А.П. (1962) Среднее содержание химических элементов в главных типах изверженных горных пород земной коры. Геохимия. №7.1. C.555-571.

5. Голубкина Н.А. (1995) Флуорометрический метод определения селена. Журнал аналитической химии. Т.50. С.492-497.

6. Евсеева Т., Юранева И., Храмова Е. (2003) Механизмы поступления, распределения и детоксикации тяжелых металлов у растений. http://ib.komisc.rU/t/ru/ir/vt/03-69/01 .html

7. Иванов В.Б., Быстрова Е.И., Серегин И.В. (2003) Сравнение влияния тяжелых металлов на рост корня в связи с проблемой специфичности и избирательности их действия. Физиология растений. Т.50. С.445-454.

8. Ильин В.Б. (1991) Тяжелые металлы в системе почва растение. Новосибирск. Изд. Наука. 150 с.

9. Кабата-Пендиас А., Пендиас Х.(1989) Микроэлементы в почвах и растениях. М. Изд. Мир, 312с.

10. Калинкина Л.Г., Наумова Т.Г. (1993) Роль фотодыхания в накоплении свободного пролина в клетках Chlorella Stigmatophora при засолении. Физиол. растений. Т. 40. № 4. С. 577-583.

11. Кузнецов Вл. В., Нето Д.С., Борисова Н.Н., Дам З.Б., Ракитин В.Ю., Александрова С.Н., Холодова В.П. (2000) Стресс-индуцируемое формирование САМ и предельный адаптационный потенциал растений118

12. Mesembryanthemum crystallinum в экстремальных условиях. Физиология растений. Т.47. С. 190-198.

13. Кузнецов Вл. В., Шевякова Н. И. (1999) Пролин при стрессе: биологическая роль, метаболизм, регуляция. Физиол. растений. Т. 46. Вып. 2. С. 305320.

14. Лукаткин А.С., Башмаков Д.И., Кипайкина Н.В.(2000) Протекторная роль обработки тиидиазуроном проростков огурца при действии тяжелых металлов и охлаждения // Физиология растений. Т.50 С.346-348.

15. Максимович А.Е. (1968) Химия сахарной свеклы в первый год жизни. Физиология сельскохозяйственных растений. М.: МГУ. Т. 7. С. 366.

16. Пустовой И.В., Филин В.И., Корольков А.В.(1995) Практикум по агрохимии. М.: Колос. 336с.

17. Серегин И.В. (2001) Фитохелатины и их роль в детоксикации кадмия у высших растений. Успехи биологической химии. Т.41. С.283-300.

18. Хендерсон П. (1985) Неорганическая геохимия. М.: Мир. 339с.

19. Холодова В.П., Волков К.С., Кузнецов Вл. В. (2005) Адаптация к высоким концентрациям солей меди и цинка растений хрустальной травки и возможность их использования в целях фиторемедиации. Физиология Растений. Т. 52, №6, С. 848 858.

20. Шевякова Н. И., Нетронина И.А., Аронова Е.Е., Кузнецов Вл.В. (2003) Распределение Cd и Fe в растениях Mesembryanthemum crystallinum при адаптации к Cd-стрессу. Физиология растений. Т.50. СП56-1 вЪ.

21. Шлык А.А. (1971) Определение хлорофиллов и каротиноидов в экстрактах зеленых листьев //Биохимические методы в физиологии растений. М., Наука. С. 154-170.

22. Эдварде Дж., Уокер Д. (1986) Фотосинтез С3 и С4 растений: механизмы и регуляция. М.: Мир. 598 с.

23. Adams P., Nelson D.E., Yamada S., Chmara W., Jensen R.G., Bohnert H.J. and Griffiths H. (1998) Tansley Review No. 97. Growth and development of Mesembryanthemum crystallinum (Aizoaceae). New Physiologist. V. 138. P. 171-190.

24. Alonso J.M., Hirayama Т., Roamn G., Nourizadeh S., Ecker J.R. (1999) EIN2, a bifunctional transducer of ethylene and stress response in Arabidopsis. Science, V. 284, P. 2148-2152.

25. Ambler J.E., Brown J.C., Gauch H.G. (1970) Effect of zinc on translocation of iron in soybean plants. Plant Physiol. V.46. P.320-323.

26. Arazi Т., Sunkar R., Kaplan В., Fromm H. (1999) A tobacco plasma membrane calmodulin-binding transporter confers Ni2+ tolerance and Pb2+ hypersensitivity in transgenic plants. The Plant Journal. V.20. P. 171-182.

27. Aro E.M., McCaffery S., Anderson J.M. (1993) Photoinhibition and D1 protein degradation in peas acclimated to different growth irradiances. Plant Physiol. V. 103, P. 835-843.

28. Baker A.J.M. (1981). Accumulators and excluders-strategies in the response of plants to heavy metals. J. Plant Nutr. V.3. P.643-654.

29. Baker A.J.M., Brooks R.R. (1989) Terrestrial higher plants which hyperaccumulate metal elements A review of their distribution, ecology and phytochemistry. Biorecovery. V.l. P.81-126.

30. Balandin Т., Castresana C. (2002) AtCOX17, an Arabidopsis homolog of the yeast copper chaperone COX 17. Plant Physiol., V. 129, P. 1852-1857.

31. Baron M., Arellano J.B., Lopez-Gorge J. (1995) Copper and photosystem II: A controversial relationship. Physiol. Plant. V. 94, P. 174-180.

32. Baron M., Lopez-Gorge J., Lachica M., Sadmann G. (1992) Changes in carotenoids and fatty acids in photosysyem II of Cu-deficient pea plants. Physiol. Plant. V. 84, P. 1-5.

33. Baszynski Т., Tukendorf A., Ruszkowska M., Skorzynska E., Maksymiec W. (1988) Characteristics of the photosynthetic apparatus of copper non-tolerant spinach exposed to excess copper. J. Plant Physiol. V. 132, P. 708-713.

34. Bates L.S., Waldren R.P. and Teare I.D. (1973) Rapid determination of free praline for water-stress studies. Plant and Soil. V. 39. № 1. P. 205-207.

35. Bizily S.P., Rugh C.L., Summers A.O., Meagher R.B. (1999) Phytoremediation of methylmercury pollution: merB expression in Arabidopsis thaliana confers resistance to organomercurials. Proc Natl Acad Sci USA. V. 96. P.808-813.

36. Bohert H.J., Nelson D.E., Jensen R.G. (1995) Adaptation to enviromental stresses. Plant Cell. V.7. P.1099-1111.

37. Bowen, J.E. (1969). Adsorption of Copper, Zinc, and Manganese by Sugar Cane Tissue. Plant Physiology, 44, 255-261.

38. Boyd R.S. and Martens S.N. (1998) The significance of metal hyperaccumulation for biotic interactions. Chemoecology. V.8. V.l-7.

39. Boyd R.S. Shaw J., Martens S.N. (1994) Nickel hyperaccumulation defends Streptanthus polygaloides (Brassicaceae) against pathogens. American Journal of Botany. V.81. P. 194-300.

40. Boyd R.S., Martens S.N. (1999) Aphids are unaffected by the elemental defense of the nickel hyperaccumulator Streptanthus polygaloides (Brassicaceae). Chemoecology. V.9. P. 1-7.

41. Boyd, R.S. 2004. Ecology of metal hyperaccumulation. New Phytologist 162:563567

42. Bradford M.M. (1976) A Rapid and Sensitive Method for the Quantification of Microgram Quantities of Proteins Utilizing the Principle of Protein-Dye-Binding. Anal. Biochem. V. 72. P. 248-254.

43. Brewer, E.P., Saunders J.A., Angle J.S., Chaney R.L., Mcintosh M.S. (1999) Somatic hybridization between the zinc accumulator Thlaspi caerulescens and Brassica napus. Theor. Appl. Genet. V.99. P.761-771.

44. Bringezu K., Lichtenberger O., Leopold I., Neumann D. (1999) Heavy metal tolerance of Silene vulgaris. Journal of Plant Physiology. V.154. P.536-546.

45. Brooks, R.R. (1977) Copper and cobalt uptake be Haumaniastrum species. Plant Soil. V.48. P.541-544.

46. Brown S., Chaney R., Angle J.S., Baker A.J.M. (1994) Phytoremediation potential of Thlaspi caerulescens and bladder campion for zinc-contaminated and cadmium-contaminated soil. J. Environ. Qual. V.23. P.l 151-1157.

47. Brown, S.L., Chaney R.L., Angle J.S., Baker A.J.M. (1995) Zinc and cadmium uptake by hyperaccumulator Thlaspi caerulescens and metal tolerant Silene vulgaris grown on sludge-amended soils. Environ. Sci. Technol. V.29. P.1581-1585.

48. Brune A., Urbach W., Dietz K-J. (1994) Compartmentation and transport of zinc in barley primary leaves as basic mechanisms involved in zinc tolerance. Plant Cell and Environment. V.17. P. 153-162.

49. Chaney R.L., Malik M., Li Y.M., Brown S.L., Brewer E.P., Angle J.S., Baker A.J.M. (1997) Phytoremediation of Soil Metals. Current Opinions in Biotechnology. V.8. P.279-284.

50. Chu C., Dai Z., Ku M. S. В., and Edwards G. E. (1990) Induction of Crassulacean acid metabolism in the facultative halophyte Mesembryanthemum crystallinum by abscisic acid. Plant Physiol. V. 93. P. 1253-126.

51. Clemens S. (2001) Molecular mechanisms of plant metal tolerance and homeostasis. Planta. V.212. P.475-486.

52. Clijsters H., VanAssche F. (1985) Inhibition of photosynthesis by heavy metals, Photosynth. Res. V.7. P.31-40.

53. Cobbett C.S. (2000) Phytochelatins and their roles in heavy metal detoxification // Plant physiol. V.123. P.825-832.

54. Colpaert J., van Assche J. (1992) Zinc toxicity in ectomycorrhizal Pinus sylvestris. Plant and Soil. V.143. P.201-211.

55. Colpaert J.V., Vanassche J.A. (1992) Zinc toxicity in ectomycorrhizal Pinus sylvestris L. New Phytol. V.123. P.325-333.

56. Crusberg T.C. (1998) Biomineralization of heavy metals within fungal mycelia. A new technology for bioremediation of hazardous wastes. U.S. EPA STAR Grant R823341. http://es.epa.gov/ncer abstracts/grants/95/engineering/engcrusb.html.

57. Cunningham, S.D., Ow D.W. (1996) Promises and prospects of phytoremediation. Plant Physiol. V.l 10. P.715-719.

58. Cushman J.C. and Bohnert H.J. (1997) Molecular genetics of Crassulacean Acid Metabolism. Plant Physiol. V.l 13. P.667-676.

59. Cuypers A., Vangronsveld J., Clijsters H. Peroxidases in Roots and Primary Leaves of Phaseolus vulgaris Copper and Zink Phytotoxicity: a Comparison // J.Plant Physiology. 2002. V.l59. P.869-876.

60. Dan Т., Raj S.K., Saxena P.K. (1999) Physiology of Heavy Metal Uptake and Tolerance in Plants. Agro's Rev. Plant Physiol. (India). V.IV. P. 195-213.

61. Davies K.L., Davies M.S., Francis D. (1991) Zinc-induced vacuolation in root meristematic cells of Festuca rubra L. Plant, Cell and Environment. V.14. P.399-406.

62. Davis M.A., Boyd R.S., Cane J.H. (2001) Host-switching does not circumvent the Ni-based defence of the Ni hyperaccumulator Streptanthus polygaloides (Brassicaceae). South African Journal of Science, V.97. P.554-557.

63. De Rocher E.J. & Bohner H.J. (1993) Development and Environmental Stress Employ different mechanism in the expression of a plant Gene Family. The Plan Cel. V.5;№11. P. 1611 1625.

64. De Vos C.H.R., Schat H., De Waal M.A.M., Vooijs R., Ernst W.H.O. (1991) Increased resistance to copper-induced damage of the root cell plasmalemma in copper tolerant Silene cucubalus. Physiologia Plantarum. V.82. P.523-528.

65. Droppa M., Horvath G. (1990) The role of copper in photosynthesis. Plant Sci. V. 9, P. 111-123.

66. Ellis D.R., Lypez-Millon A.F., Grusak M.A. (2003) Metal Physiology and Accumulation in a Medicago truncatula Mutant Exhibiting an Elevated Requirement for Zinc. New Phytologist. V. 158. P. 207 218.

67. Ernst W.H.O. (1996) Bioavailability of heavy metals and decontamination of soil by plants. Appl. Geochem. V.ll. P. 163-167.

68. Frerot H., Petit C., Lefebvre C., Gruber W., Collin C., Escarre L. (2002) Zinc and Cadmium Accumulation in Controlled Crosses Between Metallicolous and Nonmetallicolous of Thlaspi caerulescens. New Phytologist. V. 157. P. 643648.

69. Garcia-Hernandes M., Murphy A., Taiz L. (1998) Metallothioneins 1 and 2 have distinct but overlapping expression patterns in Arabidopsis. Plant Physiol. V.118. P.387-397.

70. Garty J., Karary Y., Harel J. (1992) Effect of low pH, heavy metals and anions on chlorophyll degradation in the lichen Ramalina duriaei (De Not) Bagl. Environ. Exp. Bot. V.32. P.229-241.

71. Gebhart E. (1984) Chromosome damage in individuals exposed to heavy metals, Toxicol. Environ. Chem. V.8. P.253-266.

72. Giritch A., Ganal M., Stephan U.W., Baumlein H. (1998) Structure, expression and chromosomal localization of the metallothionein-like gene family of tomato. Plant Molecular Biology. V.37. P.701-714.

73. Gleba D., Borisjuk N.V., Borisjuk L.G., Rneer R., Poulev A., Skarzhinskaya M., Dushenkov S., Logendra S., Gleba Y.Y., Raskin I. (1999) Use of plant roots for phytoremediation and molecular farming. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 96. P. 5973-5977.

74. Grotz N., Fox Т., Connolly E., Park W., Guerinot M., Eide D. (1998) Identification of a family of zinc transporter genes from Arabidopsis that respond to zinc deficiency. Proc. Natl. Acad. Sci, V. 95, № 12, P. 7220-7224.

75. Grotz N., Fox Т., Connolly E., Park W., Guerinot M.L., Eide D. (1998) Identification of a family of zinc transporter genes from Arabidopsis that respond to zinc deficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. V.95. P.7220-7224.

76. Guerinot M.L. (2000) The ZIP family of metal transporters. Biochimica et Biophysica Acta. V.1465. P. 190-198.

77. Gupta M., Cuypers A., Vangronsveld J., Clijsters H. (1999) Copper affects the enzymes of the ascorbate-glutathione cycle and its related metabolites in the roots of Phaseolus vulgaris. Physiol. Plant. V. 106, P. 262-267.

78. Hall J., Williams E. (2003) Transition metal transporters in plants. J. Exp. Botany, V. 54, № 393, P. 2601-2613

79. Hall J.L. (2002) Cellular Mechanisms for Heavy Metal Detoxification and Tolerance. J. Exp. Botany. V. 53. P. 1-11.

80. Halliwell В., Gutteridge J.M.C. (1984) Oxygen toxicity, oxygen radicals, transition metals and disease. Biochem. J. V. 219, P. 1-14.

81. Hartley J., Cairney J.W.G., Meharg A.A. (1997) Do ectomycorrhizal fungi exhibit adaptive tolerance to potentially toxic metals in the environment? Plant and Soil. V.189. P.303-319.

82. Heath R.L., Packer L. (1968). Photoperoxidation in isolated chloroplasts. Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation. Arch. Biochem. Biophysics. V. 125 P. 189-198.

83. Himelblau E., Mira H., Lin S., Culotta V., Penarrubia L., Amasino R. (1998) Identification of a functional homolog of the yeast copper homeostasis gene ATX1 from Arabidopsis. Plant Physiol., V. 117, P. 1227-1234.

84. Hirschi K.D., Zhen R.G., Cunningham K.W., Rea P.A., Fink G.R. (1996) CAXI, an H /Ca antiporter from Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. V.93. P.8782-8786.

85. Kluge M. (1979) The Flow of Carbon in CAM . Encyclopedia of Plant Physiology. Photosinthesis II. New series, Berlin: "Springer-Verlang". V.6. P.113 -125.

86. Mahalingam R., Federoff N. (2003) Stress response, cell death and signaling: the many faces of reactive oxygen species. Physiologia Plantarum. V.l 19. P.56-68.

87. Maksymiec W, Baszynski T. (1999) The role of Ca2+ ions in modulating changes induced in bean plants by an excess of Cu ions. Chlorophyll fluorescence measurements. Physiol. Plant. V. 105, P. 562-568.

88. Maksymiec W. (1997) Effect of copper on cellular processes in higher plants. Photosynthetica, V. 34, P. 132 342.

89. Maksymiec W., Russa R., Urbanik-Sypniewska Т., Baszynski T. (1994) Effect of excess Cu on the photosynthetic apparatus of runner bean leaves treated at two different growth stages. Physiol. Plant. V. 91, P. 715-721.

90. Martens S.N. and Boyd R.S. (2002) The defensive role of Ni hyperaccumulation by plants: a field experiment. American Journal of Botany. V.89. P.998-1003.

91. Maser P., Thomine S., Schroeder J.I., (2001) Phylogenetic relationships within cation transporter families of Arabidopsis. Plant Physiology. V. 126. P. 16461667.

92. Maslenkova L.T., Zanev Y., Popova L.P. (1990) Oxygen-evolving activity of thylakoids from barley plants cultivated on different concentrtion of jasmonic acid. Plant Physiol. V. 93, P. 1316-1320.

93. Meharg A.A. (1993) The role of the plasmalemma in metal tolerance in angiosperms. Physiologia Plantarum. V.88. P. 191-198.

94. Meharg A.A. (1994) Integrated tolerance mechanisms: constitutive and adaptive plant responses to elevated metal concentrations in the environment. Plant, Cell and Environment. V.17. P.989-993.

95. Meharg A.A., Macnair M.R. (1990) An altered phosphate uptake system in arsenate-tolerant Holcus lanatus. New Phytologist. V.l 16. P.29-35.

96. Murphy A., Taiz L. (1995) Comparison of Metallothionein Gene Expression and Nonprotein Thiols in Ten Arabidopsis Ecotypes. Plant Physiol. V. 109. P. 945-954.

97. Murphy A., Zhou J., Goldsbrough В., Taiz L. (1997) Purification and imunological identification of Metallothioneins 1 and 2 from Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. V.l 13. P.1293-1301.

98. Nelson N. (1999) Metal ion transporters and homeostasis. EMBO J. V.l8, P. 43614371

99. Palmier R.D. (1994) Regulation of metallothionein genes by heavy metals appears to be mediated by a zinc-sensitive inhibitor that interact with a constitutively active transcription factor, MTF-1. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. V. 91. P. 12191223.

100. Patsikka E., Aro E.-M., Tyystjarvi E. (1998) Increase in the quantum yield of photoinhibition contributes to copper toxicity in vivo. Plant Physiol. V. 117, P. 619-627.

101. Patsikka E., Kairavuo M., Sersen F., Aro E. M., Tyystjarvi E. (2002) Excess copper predisposes photosystem II to photoinhibition in vivo by outcompetingiron and causing decrease in leaf chlorophyll. Plant Physiol. V. 129,P. 13591367.

102. Paulsen I.T., Saier Jr. M.H. (1997) A novel family of ubiquitous heavy metal ion transport proteins. Journal of Membrane Biology. V. 156 P. 99-103.

103. Pence N. S., Larsen P.B., Ebbs S.D., Letham D.L.D., Lasat M.M., Garvin D.F., Eide D., Kochian L.V. (2000) The Molecular Physiology of Heavy Metal Transport in the Zn/Cd Hyperaccumulator Thlaspi caerulescens. Proc.Natl.Adad.Sci.USA. V.97. P.4956-4960.

104. Persans M.W., Yan X., Patnoe J-M.M.L., Kramer U., Salt D.E. (1999) Molecular dissection of the role of histidine in nickel hyperaccumulation in Thlaspi goesingense (Halacsy). Plant Physiology. V.121. P.l 117-1126.

105. Quartacci M.F., Pinzino C., Sgherri C.L.M., Dalla Vecchia F., Navari-Izzo F. (2000) Growth in excess copper induces changes in the lipid composition and fluidity of PSII-enriched membranes in wheat. Physiol. Plant. V. 108, P. 8793.

106. Rauser W.E. (1995) Phytochelatins and related peptides. Structure, biosynthesis and function. Plant Physiology. V.109. P.l 141-1149.

107. Rauser W.E. (1999) Structure and function of metal chelators produced by plants -the case for organic acids, amino acids, phytin and metallothioneins. Cell Biochemistry and Biophysics. V.31. P. 19-48.

108. Raven J. A., Evans M., Korb R.E. (1999) The role of trace metals in photosynthetic electron transport in C^-evolving organisms. Photosynth. Res. V. 60, P. 111149.

109. Rebeiz C.A., Castelfranco P.A. (1973) Protochlorophyll and chlorophyll biosynthesis in cell-free systems from higher plants. Annu. Rev. Plant Physiol. V. 24, P. 129-172.

110. Reeves R.D., Baker AJ.M. (2000) Metal-accumulating plants. In: Raskin I., Ensley, B.D. Phytoremediation of Toxic Metals. John Wiley and Sons Inc., New York, P.231-246.

111. Ridge I., Osborne D.J. (1971) Role of Peroxidase when Hydroxyproline-Rich Protein in Plant Cell Wall is Increased by Ethylene. Nature (New Biol.) V.229.P.205-208.

112. Rodriguez F.I., Esch J.J., Hall A.E., Binder B.M., Schaller G.E., Bleecker A.B. (1999) A copper cofactor for the ethylene receptor ETR1 from Arabidopsis. Science V. 283, P. 996-998.

113. Rout G.R., Das P. (2003) Effect of metal toxicity on plant growth and metabolism: I. Zinc. Agronomie V.23, P. 3-11.

114. Salt D.E., Kramer U. (2000) Mechanisms of metal hyperaccumulation in plants. In: Raskin I, Ensley В (eds) Phytoremediation of Toxic Metals. John Wiley and Sons Inc., New York, P.231 -246.

115. Salt D.E., Rauser W.E. (1995) MgATP-dependent transport of phytochelatins across the tonoplast of oat roots. Plant Physiology. V.107. P. 1293-1301.

116. Salt, D.E., Prince R.C., Baker A.J.M., Raskin I., Pickering I.J. (1999) Zinc ligands in the metal hyperaccumulator Thlaspi caerulescens as determined using X-ray absorption spectroscopy. Environ. Sci. Technol. V.33. P.713-717.

117. Sancenon V., Puig S., Mira H., Thiele D., Penarrubia L. (2003) Identification of a copper transporter family in Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol., V. 51, P. 577-587.

118. Schuetzenduebel A., Polle A. (2002) Plant Responses to Abiotic Stresses: Heavy Metal-Induced Oxidative Stress and Protection by Mycorrhization // J.Exptl.Bot. V.53.P.1351-1365.

119. Shetty K.G., Hetrick B.A.D., Figge D.A.H., Schwab A.P. (1994) Effects of mycorrhizae and other soil microbes on revegetation of heavy metal contaminated mine spoil. Environ. Pollut. V.86. P. 181-188.

120. Shier W.T. (1994) Metals as toxins in plants, J. Toxicol.-Toxin Rev. V.13, P. 205216.

121. Shikanai Т., Mtiller-Moule P., Munekage Y., Niyogi K., Pilon M. (2003) PPA1, a P-type ATPase of Arabidopsis, functions in copper transport in chloroplasts. Plant Cell, V. 15, P. 1333-1346.

122. Silver S. (1996) Bacterial resistance to toxic metal ions—a review. Gene. V.179. P.9-19.

123. Solioz M, Vulpe (1996) CPx-type ATPases: a class of P-type ATPases that pump heavy metals. Trends Biochem. Sci. V. 21, P. 237-241.

124. Sresty T.V.S., Madhava Rao K.V. (1999) Ultrastructural alterations in response to zinc and nickel stress in the root cells of pigeonpea. Environ. Exp. Bot. V.41. P.3-13.

125. Steffens J.C. (1990) The heavy metal-binding peptides of plants. Annu. Rev. Plant Mol. Biol. V.41. P.553-575.

126. Thomas J. C., Malik F.K., Endreszl C., Davis E.C., Murray K.S. (1998) Distinct Responses to Copper Stress in the Halophyte Mesembryanthemum crystallinum //Physiologia Plantarum. V.102. P. 360-368.

127. Thomas J. C., McElwain E. F., Bohnert H. J. (1992) Convergent induction of Osmotic Stress-Responses: ABA and cytokinin and the effects of NaCl. Plant Physiol. V. 100. P. 416-423.

128. Tomos A.D., Leigh R.A., Shaw C.A., Wyn Jones R.G. (1984) A Comparison ofmethods for measuring turgor pressures and osmotic pressures of cells of red beet storage tissue. J. Exp. Bot. V. 35. P. 1675.

129. Trindade L.M., Horvath B.M., Bergervoet M.J.E., Visser R.G.F. (2003) Isolation of a gene encoding a copper chaperone for copper/zinc superoxide dismutase and characterization of its promoter in potato. Plant Physiol., V. 133,P. 618629.

130. Tripathy B.C., Mohanty P. (1980) Zinc inhibited electron transport of photosynthesis isolated barley chloroplasts, Plant Physiol. V.66. P. 1174-1178.

131. Ueda J., Shimazu Y., Ozawa T. (1994) Oxidative damage induced by Cu(II)-oligopeptide complexes an hydrogen peroxide. Biochem. mol. Biol. int. V.34, P. 801-808.

132. Van Assche F., Clijsters H. (1986) Inhibition of photosynthesis in Phaseolus vulgaris by treatment with toxic concentration of zinc: effect on ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase, J. Plant Physiol. V.125. P.355-360.

133. Winter К. (1973) Zum Problem der Ausbildung des Crassulaceensaurestoffwechsels bei Mesembryanthemum crystallinum unter NaCl-Einfluss. Planta. Bd.109. S. 135-145.

134. Xiang C., Oliver D.J. (1998) Glutathione metabolic genes coordinately respond to heavy metals and jasmonic acid in Arabidopsis. The Plant Cell. V.10. P.1539-1550.

135. Yruela I. (2005) Copper in plants. Braz. J. Plant Physiol., V.17, P. 145-156

136. Zenk M.H. (1996) Heavy metal detoxification in higher plants—a review. Gene. V.179. P.21-30.

Информация о работе

Волков, Кирилл Сергеевич
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.12

Диссертация

Адаптация к действию повышенных концентраций меди и цинка и возможность использования в фиторемедиации растений Mesembryanthemum crystallinum L. - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы