Влияние дефицита и избытка железа на активность антиоксидантных ферментов и образование ферритина у растений хрустальной травки

Ешинимаева, Бэлигма Цыденжаповна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние дефицита и избытка железа на активность антиоксидантных ферментов и образование ферритина у растений хрустальной травки
ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Влияние дефицита и избытка железа на активность антиоксидантных ферментов и образование ферритина у растений хрустальной травки"

На правах рукописи

004605239 МГ'

ЕШИНИМАЕВА Бэлигма Цыденжаповна

ВЛИЯНИЕ ДЕФИЦИТА И ИЗБЫТКА ЖЕЛЕЗА НА АКТИВНОСТЬ АНТИОКСИДАНТНЫХ ФЕРМЕНТОВ И ОБРАЗОВАНИЕ ФЕРРИТИНА У РАСТЕНИЙ ХРУСТАЛЬНОЙ ТРАВКИ

03.01.05 - Физиология и биохимия растений

"-1

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва-2010

1 7 ПЮН 2010

004605239

Работа выполнена в лаборатории физиологических и молекулярных механизмов адаптации Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Шевякова Нина Ивановна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор доктор биологических наук

Тараканов Иван Германович Трофимова Марина Сергеевна

Ведущая организация:

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет

Защита состоится «08» июня 2010 г. в II00 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002.210.01 при Учреждении Российской академии наук Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН по адресу: 127276, г. Москва, ул. Ботаническая, 35.

Факс: (495) 977-80-18, e-mail: ifr@ippras.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН

Автореферат разослан « О » мая 2010 г.

Учёный секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций, кандидат биологических наук

М.И. Азаркович

Общая характеристика работы Актуальность проблемы. Fe - эссенциальный элемент для растений. Fe необходимо растениям для функционирования фотосинтеза и дыхания, в которых в качестве переносчиков электронов участвуют железосодержащие и железосерные белки такие как, ферредоксин, цитохромы и другие. Как кофактор Fe входит в состав многих антиоксидантных ферментов (Fe-супероксиддисмутаза, пероксидазы, каталаза) и участвует в образовании предшественника хлорофилла.

Однако, ярко выраженная способность этого металла в восстановленной форме (Fe2+) вступать в реакции с кислородом с образованием гидроксил радикала (ОН°) -самого токсичного из АФК, создает необходимость у всех аэробных организмов, в том числе и у растений, поддерживать в клетках гомеостаз железа, не допускающий накопления его "каталитической" формы (Fe2+). Такое нарушение гомеостаза железа у растений может возникать в стрессорных условиях, индуцирующих окислительный стресс (Hemandes et al., 2001).

Одним из уникальных механизмов, препятствующих проявлению токсичности Fe2+ при его избыточном образовании в клетках, может являться функционирование у всех живых организмов, за исключением дрожжей, железосодержащего белка негеминовой природы ферритина, запасающего Fe в окисленной нетоксичной форме (Fe3+). К настоящему времени гены, ответственные за биосинтез ферритина, клонированы и охарактеризованы у ряда видов растений: кукурузы, гороха, сои, люпина, риса и арабидопсиса. У растений ферритин локализован в хлоропластах (Perrin, 1970; Парамонова и др., 2004; 2007), реже в митохондриях (Zancani et al., 2004) и отсутствует в цитоплазме. Структура ферритина в пластидах растений отличается от ферритина животных и бактерий наличием в минеральном ядре не только железа, но и фосфора в соотношении P:Fe (1:3) (Waldo et al., 1995). Главное отличие ферритинов растений от животных состоит в том, что синтез ферритина у животных регулируется на трансляционном уровне в ответ на избыток железа, а у растений - на транскрипционном уровне (Briat et al., 2009). В поддержании гомеостаза Fe у растений участвует множество генов (42 гена у риса), включая гены транспорта ZIP (транспотер Fe и Zn) и гены FRO, кодирующие Ре+3-хелат редуктазы оксидазы (Vert et al., 2002).

Долгое время образование отложений ферритина в пластидах растений рассматривали как запасную форму железа (Hyde et al., 1963). В последнее время изучение функций ферритина рассматривается в связи с защитой от окислительного стресса, как у растений, так и у животных (Андреев, 2004; Theil and Briat, 2004).

Однако до сих пор отсутствуют исследования по изучению взаимосвязи образования ферритина у растений, испытывающих окислительный стресс при действии абиотических факторов.

Цель исследования. Цель настоящей работы - исследовать зависимость накопления ферритина в листьях факультативного галофита ШзетЬгуап&етит сгуя/аНтит от содержания железа в питательном растворе и интенсивности окислительного стресса.

Задачи исследования:

1. Определить дозовую зависимость поглощения железа растениями М. сгу51аШпит

в контрольных условиях культивирования и в присутствии 300 мМ №С1.

2. Исследовать основные биохимические параметры: активность антиоксидантных ферментов (супероксиддисмутаза, пероксидаза), содержание пролина, хлорофилла и интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ), характеризующие взаимосвязь между состоянием окислительного стресса и гомеостазом железа у галофита М. сгув/аШпит, в зависимости от статуса железа, засоления и их совместного действия.

3. Изучить зависимость отложения ферритина и его ультраструктурные особенности в пластидах мезофилла листьев от статуса железа в контрольных условиях и при засолении с помощью электронной микроскопии.

4. Идентифицировать мРНК генов ферритина у хрустальной травки с помощью метода ОТ-ПЦР и секвенировать продукты ПЦР.

5. Оценить уровень экспрессии генов ферритина в листьях методом ОТ-ПЦР и Вестерн-блоттингом в зависимости от статуса железа и развития окислительного стресса.

6. Исследовать влияние про-оксиданта метилвиологена (параквата - Р<3) - индуктора окислительного стресса в пластидах, и антиоксиданта полиамина спермидина (Спд) на экспрессию генов ферритина и содержание белка в листьях.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное изучение образования ферритина у факультативного галофита МаетЬгуап/Иетит сгуьЬаШпит Ь. (хрустальная травка) в зависимости от уровня железа в питательной среде и интенсивности окислительного стресса.

Показано, что внесение К'аСЛ (300 мМ) в питательную среду резко снижало поступление железа (Ре3*-ЭДТА) в растения и предотвращало появление симптомов токсичности при его избытке (750-1000 мкМ). Впервые установлено, что адаптация растений М. сгу$1аШпит к засолению сопровождала повышение устойчивости к

избытку железа, что свидетельствует о проявлении кросс-адаптации к двум стресс-факторам. Впервые с помощью электронно-микроскопического анализа продемонстрирована прямая зависимость уровня отложений ферритина в мезофилле листьев от содержания в них железа и интенсивности окислительного стресса. В листьях М. сг)а1аШпит впервые установлена экспрессия не менее двух генов ферритина (МсРег), один из которых является ортологом гена А1Рег1 арабидопсиса и проявляет сходство по уровню экспрессии на окислительный стресс и избыток Ре.

Показано, что индукция паракватом (Р<2) образования супероксид-радикала и перекиси водорода в листьях хрустальной травки повышала уровень мРНК генов ферритина и содержание белка. Напротив, спермидин, обладающий антиоксидантным свойством, тормозил экспрессию генов ферритина. Впервые экспериментально показано, что окислительный стресс индуцировал образование отложений ферритина в листьях хрустальной травки. Это указывает на антиокидантную роль ферритина, связывающего восстановленную форму железа (Ре2+) - катализатора образования ОН°.

Теоретическая и практическая значимость. Детекция ферритина в листьях галофита М. сгу$1а11тит и способов регуляции его содержания может использоваться при создании трансгенных растений со сверхэкспрессией ферритина. Теоретические обобщения и совокупность экспериментальных данных работы могут использоваться в курсах лекций для студентов биологических факультетов ВУЗов страны.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на годичном собрании общества физиологов растений России, Международной конференции «Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений», Екатеринбург (2008 г); годичном собрании общества физиологов растений России, Международной конференции «Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях крайнего Севера», Апатиты, Мурманская область (2009 г); Всероссийской конференции «Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды», Иркутск (2009 г).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, из которых 1 - статья в журнале «Физиология растений».

Структура н объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста и содержит таблиц, и ^С

рисунков. Список цитируемой литературы включает'¡j I наименований, в т.ч. иностранных.

Объекты и методы исследования Объект исследования - факультативный галофит Mesembryanthemum crystallinum L. (хрустальная травка) семейства Aizoaceae, способная на поздних этапах онтогенеза формировать стресс-индуцируемый водосберегающий механизм фотосинтеза САМ - типа (Adams et al., 1998; Kuznetsov et al., 1997; Winter, Holtum, 2007).

Растения выращивали в условиях водной культуры в камере фитотрона при 122

часовом световом периоде и мощности освещения 37,6 Вт/м люминесцентных ламп Philips (F36W/54). Температура воздуха - 23±1°С/15±1 °С, относительная влажность воздуха - 55/70% день/ночь. Условия проведения опытов. Семена хрустальной травки были использованы из коллекции Лаборатории физиологических и молекулярных механизмов адаптации ИФР РАН. Опытные растения М. crystallinum составляли две возрастные группы: молодые (4-5 недель, фотосинтез Сз -типа) и взрослые (8-9 недель, в фазе перехода на CAM-тип фотосинтеза). Молодые растения после образования 2-пар первичных листьев переносили на питательную среду с различным содержанием Fe - Fe^SO^SflTA (рН=6.0)): контроль (2 мкМ Fe3+-ЭДТА), дефицит Fe (без внесения

Fe3+-3flTA), 3 -я доза Fe (6 мкМ Fe^-ЭДТА) Через две недели проводили отбор проб. Растения, составившие группу взрослых растений (8-9 недель), получали рассаживанием двухнедельных проростков сначала на питательную среду, содержащую 6 мкМ Ре3+-ЭДТА (контроль), на которой они произрастали в течение 14 д. до достижения 4-х недельного возраста. Затем растения культивировали по следующей схеме: контрольные растения (6 мкМ Fe3+-3flTA), дефицит Fe (без внесения

условный «избыток» (18 мкМ Fe3+-3,QTA). Те же варианты с различным содержанием Fe создавали на фоне засоления (300 мМ NaCl), который присутствовал в последние 8 дней: (контроль + NaCl), (дефицит Fe + NaCI) и (избыток Fe + NaCl). В вариантах с действием засоления NaCl вносили в среду в течение 3 д. порциями по 100 мМ до конечной концентрации 300 мМ.

Для исследования дозовой зависимости действия железа на жизнедеятельность растений и характер изменения в листьях ответных реакций антиоксидантных ферментов, содержание железа, хлорофилла и уровня ПОЛ растения предварительно выращивали в течение 2 нед. на питательной среде (рН=6.0) в присутствии 6 мкМ Ре3+-ЭДТА. Затем растения разделяли на две части: одну часть переносили на

засоление до конечной концентрации 300 мМ NaCl на две недели, а другую часть оставляли в исходных условиях. Далее все растения культивировали с различным содержанием железа (6, 18, 50, 100, 150, 200 и 750 мкМ) в контрольных условиях или в условиях засолении в течение 2-3 нед. (общий возраст растений - 8-9 нед.).

Для биохимических анализов отобранные образцы растений фиксировали жидким азотом и хранили при - 70°С. В те же сроки проводили фиксацию проб для электронной микроскопии по стандартной методике (Парамонова и др., 2004).

Содержание малонового диальдегида (МДА) определяли методом, описанным Heath and Packer (1968). Содержание Н202 определяли методом с использованием сульфата титана (Brennan and Frenkel, 1977). Содержание свободного пролина определяли по методу Bates с соавторами (1973). Активность СОД определяли по методу Beauchamp and Fridovich (1971). Активность гваякол-зависимых пероксидаз проводили по методу Ridge and Osborn (1971). Концентрацию белка в полученных ферментных препаратах измеряли по методу Esen(1978).

Экстракцию из растительного материала валового Fe проводили по методу Голубкиной (1995), а содержание определяли с помощью атомно-абсорбционного спектрофотометра ЛабИст-400 (Россия).

Оценку уровня экспрессии генов ферритнна проводили методом обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). Тотальную РНК выделяли из растительного материала кислым фенол-хлороформом (Krapp et al., 1993). Очистку от примесей ДНК, синтез кДНК проводили с использованием ферментов и реактивов фирмы «Fermentas» по протоколу производителя. ПЦР проводили в амплификаторах модели РТС1160 («BioRad», США) или Mastercycler personal («Eppendorf», Германия). Для оценки результатов ПЦР проводили электрофорез нуклеиновых кислот в 1% агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Специфические праймеры для генов ферритнна хрустальной травки конструировали с помощью филогенетических дендрограмм кДНК последовательностей соответствующих генов других растений с использованием базы данных Национальной медицинской библиотеки (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov) в среде Vector NTI 9.0.0. Секвенирование кДНК последовательностей было проведено в ЦКП «Геном» института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта.

Электрофорез белковой фракции в денатурирующих условиях проводили в 15% полиакриламидном геле по стандартной методике (Laemmli U.K., 1970) на приборе Bio-Rad «Mini protein 3», США.

Вестерн-блоттинг проводили по Towin (1979) с использованием первичных поликлональных антител к ферритину гороха, которые были любезно предоставлены проф. Бриат (Монпелье, Франция). Вторичные антитела были коньюгированы пероксидазой хрена (Goat Anti-Rabbit IgG:HRP) производства «Stressgen», Канада.

Идентификацию ферритина и определение числа и размера пластоглобул в пластидах 6-ой пары первичных листьев проводили с помощью электронной микроскопии (электронный микроскоп JEM — lOOCXIl(JEOL) по стандартной методике (Парамонова и др., 2004, 2007) в совместных исследованиях с Н.В. Парамоновой, которой автор выражает глубокую благодарность.

Результаты получены в трех биологических и трех аналитических повторностях. Обработку данных проводили общепринятыми методами математической статистики. Бары на рисунках обозначают стандартные отклонения от среднего.

Результаты и обсуждение Ответная реакция растений на изменение содержания Fe3+ в питательной среде Влияние дефицита и избытка железа на молодые растения. Как видно из рисунка 2а молодые растения, произраставшие при различном содержании Fe3+, различались по общему содержанию Fe в листьях, уровень которого коррелировал с содержанием данного элемента в питательной среде. При этом в присутствии в среде 6 мкМ Fe3+-ЭДТА корни аккумулировали его в десятки раз больше по сравнению с листьями (рис. 26). Судя по образованию МДА, конечного продукта ПОЛ, интенсивность окислительного повреждения мембран листьев была наиболее высокой при дефиците железа особенно в корнях (рис. 2в). Для растений дефицитных по железу было характерно наименьшее содержание хлорофилла в листьях, что визуально проявилось в виде хлороза (рис. 2г). По полученным данным (рис. 1) и внешнему виду растений (рис. 1) концентрация Fe3+ 6 мкМ для хрустальной травки оказалась наиболее оптимальной для роста и развития. В дальнейших экспериментах эта концентрация была использована в качестве контроля.

_Fe(lll)-3flTA

2 мкМ 6 мкМ 0 мкМ

Рис. 1. Внешний вид молодых растений.

(а) Содержание железа в листьях

(б) Содержание железа в корнях

50 40 30 . 20 10 о

I—I

400 300 ' 200 100 0

контроль без Ре 3 дозы (2мкМ) Ре(бмкМ)

(в) Содержание МДА

50 40 30 20 10 0

(г) Содержание хлорофилла (а+Ь)

0,4 0,3 0.2 ! 0,1 0,0

контроль без Ре 3 дозы (2м кМ) Ре(бмкМ)

Концентрация (-е-Э ДТ А

контроль без Ре 3 дозы (2мкМ) Ре(бмкМ)

Коцентрация Ре-ЭДТА

Рис. 2. Влияние статуса железа в питательной среде на содержание общего железа и перекисное окисление липидов в листьях и корнях молодых растений хрустальной травки: контроль (2 мкМ Ре3+-ЭДТА); без Ре (дефицит); 3 дозы Ре (6 мкМ Ре -ЭДТА).

Ответная реакция взрослых растений на изменение статуса Ре3+ в среде выращивания в присутствии и отсутствии ИаС1. По внешнему виду растений наибольшая биомасса первичных и вторичных листьев образовывалась при повышенной дозе железа (18 мкМ) как в присутствии, так и в отсутствии в среде №С1 (рис. Зв, Зе). Однако признаки дефицита железа в виде пожелтения листьев ярче проявились на среде без железа в присутствии засоления (рис. 36, Зд).

Различия в ростовой активности растений и содержании в листьях хлорофилла (рис. 46) были обусловлены изменением содержания Ре^+ в последние 15 д. их культивирования. До этого растения в длительное время (в течение 21 дня)

Рис. 3. Внешний вид взрослых растений хрустальной травки, произраставших на питательной среде с различным статусом Ре на контрольной среде (а - контроль (6 мкМ Ре-ЭДТА); б - без Ре (дефицит); в - «избыток» Ре (18 мкМ Ре3+-ЭДТА)) и последние 8 дней на среде с внесением 300 мМ ИаС1 (г - контроль (6 мкМ Ре3+-ЭДТА)+№С1; д - без Ре (дефицит)+ЫаС1; е - «избыток» Ре (18 мкМ Ре3+-ЭДТА)+МаС1).

11 ш

рл 1 / ■ . - Лг I р

произрастали на среде с достаточным количеством железа (6 мкМ Ре3+). По этой причине у взрослых растений дефицит Ре не проявился в полной мере при культивировании на среде без железа, поскольку запасный пул Ие, возможно, не успевал израсходоваться. Тем не менее, самое яркое проявление хлороза наблюдалось у вторичных листьев взрослых растений, также произраставших предварительно на среде с 6 мкМ Ре3+, а затем в течение 15 д. на среде без Ре, но в условиях засоления (рис. Зд и 4а), что положительно коррелировало с резким падением в них содержания хлорофилла (рис. 4а). В основе этого явления может лежать снижение поступления запасенного ранее Ре из стареющих в молодые растущие листья в условиях засоления. Вместе с тем, низкое содержание хлорофилла в листьях в условиях дефицита и даже "избытка" Ре могло иметь общую причину, связанную с развитием в условиях засоления окислительного стресса, поскольку хлоропласта являются главным источником генерации АФК в стрессорных условиях. Одним из свидетельств развития повреждений в клеточных мембранах, вызванное накоплением АФК, является повышение ПОЛ.

В листьях растений, произраставших в течение 15 д. на фоне избыточного содержания Ре (18 мкМ), интенсивность ПОЛ была выше контрольного уровня (рис. 46), тогда как в присутствии №С1 при дефиците Ре и, особенно, при его "избытке" уровень МДА снижался (рис. 46).

Обращает на себя внимание тот факт, что уровень Ре в питательной среде, не содержавшей ЫаС1, практически не влиял на количество в листьях пролина - важного стресс - индуцируемого метаболита, в то время как в корнях, его содержание было наибольшим при дефиците Ре в среде (рис. 4в).

В присутствии КаС1 при дефиците Ре на фоне стресс-индуцируемой аккумуляции пролина наиболее высокое его содержание отмечено в листьях (рис. 4в), что могло быть связано также с дефицитом железа.

Общая активность СОД в листьях в отсутствие №С1 в питательной среде повышалась как в варианте с дефицитом, гак и с «избытком» Ре. В условиях засоления самая низкая активность этого фермента была в листьях в контроле (6 мкМ Ре3*), а самая высокая активность обнаруживалась в отсутствие в среде Ре (рис. 5а). В полном соответствии с уровнем активности СОД в листьях изменялась активность свободной гваяколовой ПО в листьях в контрольных условиях и на засолении (рис. 5а, 56), тогда как активность ПО в корнях на засолении снижалась (рис. 5г).

(а) Содержание хлорофилла (а+б) 0,6

[*1

(б) Содержание МДА

□ лист ■ корень

6 мкМ без Ре 18мкМ 6 мкМ без Ре 18мкМ

Контроль

МаС! (300 мМ)

6 мкМ без Яе 18 мкМ 6 мкМ без Ре 18 мкМ Контроль ЫаС! (300 мМ)

(в) Содержание пролина □ лист ■ корень

Рис. 4. Влияние различного содержания Ре на содержание хлорофилла, МДА и пролина у взрослых растений: контроль (6 мкМ); дефицит (Без Ре); «избыток» Ре (18 мкМ), и последние 8 дн на среде с внесением 300 мМ ЫаС1: контроль (6 мкМ)+ЫаС1; дефицит (без Ре)+№С1; «избыток» Ре (18 мкМ)+№С1).

6 мкМ без Ре 18 мкМ 6 мкМ без Ре 18мкМ Контроль МаС1 (300 мМ)

Содержание перекиси водорода - продукта реакции дисмутации, катализируемой СОД, не коррелировало с изменениями активностей СОД и ПО (рис. 5в). Можно предположить, что при дефиците железа Н2О2, образовавшийся в пластидах как продукт функционирования СОД, транспортировался в корневую систему, на что указывает его повышенное содержание в корнях (рис. 5в).

1800 1500

§1200

2 900 | 600

300

(а) Активность С ОД

□ лист ■ корень

(б ) Активность пероксидазы в листьях

3 "] о своб.ПО ■ ионсв.ПО 2.5 -] ы ковалсв.ПО

6 мкМ без Ре 18мкМ бмкМ без Яе 18 мкМ

(в)

Контроль №С1 (300 мМ)

Содержание перекиси водорода

(г^

80 -,

73 70 1

§ 1 X 60 1 50

го с ГО 40 |

л 1 30 -

§ V» 20

5 * 10

5 о!

6 мкМ без Ре 18мкМ 6 мкМ без Ре 18 мкМ

6 мкМ без Ре 18мкМ 6 мкМ без Ре 18мкМ Контроль №С1 (ЗООмМ)

Активность пероксидазы в корнях

□ своб.ПО ■ ионсв.ПО _ нковалсв.ПО

А [к.ОИ

6 мкМ без Ре 18 мкМ 6 мкМ без Ре 18мкМ

Контроль ЫаС! (ЗООмМ)

Рис. 5. Влияние изменения содержания Ре в условиях засоления на активность антиоксидантных ферментов (СОД, гваяколовой ПО) и содержание Н2О2 в листьях и корнях взрослых растений хрустальной травки: контроль (6 мкМ); дефицит (без Ре), «избыток» Ре (18 мкМ), и последние 8 дн на среде с внесением 300 мМ ЫаС1: контроль (6 мкМ)+ЫаС1; дефицит (без Ре)+ЫаС1; «избыток» Ре (18 мкМ)+№С1).

Дозовая зависимость изменения содержания железа и состояния окислительного стресса в контрольных условиях и в присутствии ЫаС1 в листьях хрустальной травки. Засоление в значительной степени изменяло ответные реакции растений на присутствие в среде относительно невысоких доз железа. Можно предположить, что такая реакция связана с тем, что хрустальная травка является факультативным галофитом В связи с этим возникла необходимость провести специальный опыт, где была сделана попытка сравнить 1) дозовую зависимость поступления железа в листья хрустальной травки на контрольной среде (без засоления) и в присутствии 300 мМ ЫаС1 и 2) проследить в листьях характер изменения окислительного статуса.

У взрослых растений дозовая зависимость изменения содержания железа в листьях в области высоких концентраций 150-750 мкМ хелата железа в среде показала наличие корреляции в контрольных условиях (в отсутствии засоления). При более низких концентрациях железа (6-100 мкМ) отсутствовала корреляция между содержанием этого металла в среде и в листьях, что указывало на возможность регуляции поступления железа в этом диапазоне (рис.6). Однако, в присутствии ЫаС1 (300 мМ) в диапазоне высоких концентраций железа в среде поступление его в листья было резко ограничено по сравнению с контрольными условиями. При этом растения меньше всего страдали от избытка железа, чем в контрольных условиях. Это наблюдалось как по внешнему виду растений (рис. 9), так и по содержанию МДА (рис. 6).

Общее содержание железа в листьях

< 20 О

% - 45 « 5

^ о 10 ^ 5 ^

о э г

х о

Содержание МДА Ш контроль ы №С1

6 18 100 150 200 750

Коцентрация Ре-ЭДТА, мкМ

6 18 100 150 750

Концентрация Ре-ЭДТА, мкМ

О контроль □ №С1

Рис. 6. Содержание общего железа и 1МДА в листьях взрослых растений при различной концентрации железа (Ре3+-ЭДТА) в питательном растворе в контрольных условиях (контроль) и при засолении (ЫаС1, 300 мМ).

Повышение перекисного окисления липидов (ПОЛ) с увеличением в листьях

содержания железа в контрольных условиях указывало на усиление в них

окислительных процессов. Вместе с тем, активность СОД - первого звена в каскаде антиоксидантной защиты, и свободной пероксидазы, практически не изменялись в листьях растений, культивируемых в пресных условиях (рис. 7).

Активность сод

И контроль В №С1

Активность свободной пероксидазы

6 18 100 150 200 750 Коцентрация Ре-ЭДТА, мкМ

е 18 100 150 200 750 Коцентрация Ре-ЭДТА, мкМ

Рис. 7. Активность супероксиддисмутазы и свободной пероксидазы в листьях взрослых растений при различной концентрации железа (Ре3+-ЭДТА) в питательном растворе в контрольных условиях (контроль) и при засолении (№С1, 300 мМ)

Некоторое увеличение в активности СОД проявилось при токсичной

концентрации железа (750 мкМ). При этом в листьях при токсичных дозах железа

заметно повысилось содержание пролина (рис. 8), который мог выполнять

антиоксидантную роль в этих условиях (Шевякова и др. 2009).

При совместном действии повышенных концентраций железа в среде и

засоления (300 мМ ЫаС1) содержание хлорофилла (а+б) было уже на порядок ниже,

чем в контрольных условиях, что проявлялось также в изменении внешнего вида

растений, а именно в обесцвечивании листьев. Тогда как уровень пролина резко

повышался по мере увеличения концентрации железа в среде на фоне засоления (рис.

8).

Содержание хлорофилла (а+б)

0.7

рЕ] о контроль ■ №С1

18 100 150 200 750 Концентрация Ре-ЕРТА, мкМ

18 100 концентраци:

Рис. 8. Содержание хлорофилла (а+б) и пролина в листьях взрослых растений при различной концентрации железа (Ре3+-ЭДТА) в питательном растворе в контрольных условиях (контроль) и при засолении (ЫаС1, 300 мМ).

Ре^-ЭДТА

Рис. 9. Внешний вид растений хрустальной травки в конце культивирования.

Концентрации 750 и 1000 мкМ хелата железа (Ие +-ЭДТА) в контрольной среде (без засоления) были летальными. Наиболее приемлемой концентрацией, при которой происходили изменения в биохимических показателях у растений, не сопровождавшихся появлением внешних признаков повреждения на листьях, можно считать 18 мкМ хелата железа в питательной среде (рис. 9).

В условиях засоления на фоне снижения поступления железа в растения изменение в листьях активности СОД, пероксидазы, которые |+КаС1могли бы свидетельствовать о состоянии окислительного стресса, были не столь значительны, но в то, же время в них резко повысилась аккумуляция пролина как ^возможного антиоксиданта и понизилось содержание МДА, в том числе при высокой дозе железа в среде (750 мкМ) (рис. 6). При этом у растений, произраставших в условиях

засоления (300 мМ ЫаС1), отсутствовали внешние отравления железом, которые присутствовали в контроле (рис. 9).

Таким образом, можно сделать вывод, что в условиях засоления происходило снижение поступления в растения железа, что способствовало нормализации метаболических процессов, что в конечном итоге препятствовало проявлению токсичности железа.

Влияние дефицита и "избытка" Ре3+ на состояние мембран, запасные включения и образование ферритина в пластидах в присутствии и в отсутствии в среде ЫаС1. Сравнение состояния мембранной системы и пластоглобул в двух контрольных вариантах (на фоне засоления и без него) показало, что при действии №С1 в некоторых пластидах наблюдалось набухание гран (рис. 106, 10в, 116, 11 в) и появлялись отдельные включения ферритина (рис. 11г).

Парциальная площадь пластоглобул на срезе хлоропласта при засолении (рис. 116) уменьшалась приблизительно в 2-3 раза по сравнению с контролем (рис. 10а, 106). Уменьшение пластоглобул, очевидно, обусловлено их лизисом в присутствии ЫаС1. Так на рис.11а (увеличенный фрагмент из 116) видны две пластоглобулы: с нормальной электронной плотностью и электроннопрозрачная, лизированная.

г - • , ■ .р*-"

■ . ь

; ч . ■ *

Рис. 10. Хлоропласта в листе хрустальной травки : а, б - в контроле, в, г - в варианте с дефицитом железа; д, е, ж, з, и - в варианте с избытком железа, а, б — хлоропласты содержат средних размеров пластоглобулы и крахмальные зерна (увел. 15000); в, г — в хлоропластах отмечается уменьшение объема

пластоглобул (стрелки) (увел. 15000,); д - увеличенный фрагмент из «е», скопление гранул ферритина (стрелка) около пластоглобул (увел. 42000); е, ж - в хлоропластах увеличивается число и размеры пластоглобул и исчезает крахмал (увел. 20000), з, и - при избытке железа наблюдаются гранулы ферритина (стрелки),

пластоглобулы в рис. «з» имеют различную электронную

плотность в центральной части и на периферии (увел. 60000, 29000). Р - ферритин, Pg -пластоглобулы

Сходные изменения в парциальном объеме пластоглобул на срез хлоропласта отмечались и при дефиците Ре на контрольной среде без ЫаС1 (рис. 10в, Юг). В этом варианте в пластидах значительно уменьшались размеры пластоглобул, и они были более светлыми.

При дефиците Ре, но в условиях засоления (рис. 11д, 11е), число пластоглобул возрастало. Кроме того, в некоторых хлоропластах наблюдались набухшие тилакоиды гран (рис. 11е). При повышенной дозе Ре3+ (18 мкМ Ре3+-ЭДТА) в отсутствии ЫаС1 в питательной среде пластоглобулы были наиболее крупными, темной окраски (рис. 10д—10ж), нередко двуслойные с электронно-плотной центральной частью и более светлые на периферии (рис. Юз). В этом варианте был обильно представлен ферритин в виде групп гранул, которые часто контактировали с пластоглобулами (рис. 10д, Юз).

■¡■г

1 | Рис. 11. Хлоропласты в вариантах

' " {с ЫаС1: а-г в контроле; д, е в " 1 варианте с дефицитом железа; ж, 1 з - в варианте с избытком железа. * а - увеличенный фрагмент из «Ь», стрелкой показана пластоглобулы, одна из которых лизирована (увеличение 94000); б - в хлоропласте стрелками показаны мелкие пластоглобулы, отмечаются крупные

| крахмальные зерна, (увеличение | 27000); в - другой увеличенный 1 фрагмент из «б», в тилакоидах гран отмечается набухание ;; (увеличение 94000); г - в ' •, хлоропласте показана группа . гранул ферритина (увеличение % 90000); д - в хлоропластах стрелкой показаны пластоглобулы, "*г. ' . крахмальные зерна отсутствуют, Ш' (увеличение 16000); е - в

хлоропластах стрелками показаны ЩЯи "'сильно набухшие тилакоиды фан ■т.«. ■ (увеличение 60000); ж, з - в л. [ хлоропластах при избытке железа на фоне засоления отмечались пластоглобулы (светлые стрелки), крахмальные зерна, темные стрелки

¿¡»А

ш * *

указывают на липидные глобулы в цитоплазме, тилакоиды гран в нормальном состоянии

(увеличение 15000).

У растений, произраставших в присутствии в 3 раза более низкой дозы Ре (6 мкмоль Ре3+) в контрольных условиях отложения ферритина в пластидах были обнаружены (рис. 11г), а пластоглобулы присутствовали в меньшем количестве, чем в случае совместного действия засоления и более высокой дозы железа (18 мкМ Ре3+-ЭДТА). Таким образом, в условиях засоления проявляется регуляция как поступления железа в листья (рис. 6), так и регуляция интенсивности образования ферритина (рис. 10, 11).

Влияние окислительного стресса на экспрессию генов и содержание белка

ферритина

Идентификация мРНК генов ферритина в листьях Ме$гтЬг[дп1кетит сгуНаШпит Ь. Гены ферритина у галофита М. сгу$1аШпит не были секвенированы.

Поэтому на первом этапе был проведен анализ (с помощью метода ОТ-ПЦР) транскриптов мРНК генов ферритина в листьях М. crystallinum. Для этой цели были подобраны праймеры по консервативным участкам генов ферритинов других растений. После оптимизации ПЦР, необходимо было удостовериться в том, что мы действительно работаем с этими генами. Для решения этой задачи, было проведено секвенирование нуклеотидной последовательности синтезируемого ампликона.

Для сравнения секвенированного ампликона с консервативными участками

других генов использовали нуклеотидные последовательности генов ферритина

следующих растений из базы данных NCBI:

BnFer U68217 (Brassicaceae; Brassica napus)

CbFerB DQ234389 (Brassicaceae; Chorispora. Chorispora bungeana)

BjFer ACM47495 (Brassicaceae; Brassica juncea)

AtFerl AT5G01600 (Brassicaceae; Arabidopsis thaliana)

AtFer2 AT3G11050 (Brassicaceae; Arabidopsis thaliana)

AtFer3 AT3G56090 (Brassicaceae; Arabidopsis thaliana)

AlFer4 AT2G40300 (Brassicaceae; Arabidopsis thaliana)

Анализ секвенированных последовательностей показал идентичность

исследуемого ампликона с консервативными участками генов ферритинов других растений 67%, в листьях хрустальной травки экспрессируются пе менее двух генов ферритина (McFer) и наибольшее сходство одного из генов наблюдается с геном AtFerl A.thaliana, экспрессия которого было также обнаружено в листьях.

Изменение экспрессии генов в листьях при дефиците железа и его избытке. Так как, железо необходимо для образования ферритина, была изучена экспрессия мРНК и содержание белка в зависимости от уровня железа в среде культивирования.

Двухнедельный дефицит железа в питании растений приводил к задержке роста и развития, что наблюдалось по внешнему виду растений (пожелтение листьев, хлороз). Содержание железа в таких растениях уменьшилось. Как и предполагалось, дефицит железа в питании приводил к тому, что синтеза мРНК в листьях не происходило (рис. 12) и содержание белка было незначительным (в следовых количествах).

Время (ч) 0 4 8 12 24 48 Рис 12' 0тсУтствие экспрессии

генов ферритина в листьях при McFerдефиците железа в питательном

растворе.

A clin

В листьях хрустальной травки после переноса растений из Fe-дефицитных условий на среду с 18 мкМ Fe^-ЭДТА уровень мРНК возрастал уже в первые часы экспозиции растений. Максимальное количество наблюдалось к 8 ч.

Время, ч О 4

12 24

Mcl-'er

Aclin

Рис. 13. Экспрессия генов МсРег и содержание ферритина при экспозиции листьев после перенесения Ре-дефицитных растений на питательную среду с 18 мкМ Ре+3-ЭДТА

Ferriíins

тт ШВ

Coomassie Ыие staining

3 SBS5 * * в®

После 12 ч уровень мРНК снижался к 24 ч, к концу эксперимента. Увеличение в содержании ферритина происходило к 8ч и в 24ч наблюдалось наибольшее количество (рис. 13).

Таким образом, после переноса из дефицитных условий на 18 мкМ Fe в листьях хрустальной травки происходило увеличение уровня мРНК генов ферритина. Содержание самого белка увеличивалось в более поздние временные рамки. Механизмы регуляции биосинтеза ферритина интенсивно исследуются. Главным фактором, влияющим на метаболизм ферритина, является количество железа в организме. У животных и человека основным является посттранскрипционный механизм контроля. Судя по полученным нами данным, можно предположить, что регуляция образования ферритина в листьях хрустальной травки происходила на транскрипционном уровне.

Влияние про-оксиданта параквата на экспрессию генов ферритина. Исходя из роли ферритина не только как запасного пула железа в клетке, но и как «ловушки» токсичной формы железа (Fe2+) необходимо было изучить сигнальную роль АФК в регуляции образования ферритина. Нами были проведены опыты с обработкой листьев хрустальной травки паракватом-индуктором супероксидного стресса в пластидах (Радюкина и др., 2008; Шевякова и др., 2009).

Механизм развития окислительного стресса при действии параквата заключается во взаимодействии на свету фотосистемы 1 с ди-катионом параквата и образованием моно-катион радикала, который, в свою очередь, вызывает восстановление молекулярного кислорода до супероксид радикала (О2). Листья взрослых растений в возрасте 8-9 недель после наступления темпового периода обрабатывали раствором PQ (100 мкМ) в Твине-80 (0,05%). После наступления светового дня проводили отбор проб с интервалом в 4 ч. Известно, что PQ, распределяясь в клетке, окисляется на свету именно в пластидах с образованием супероксид аниона, который дисмутируег в присутствии СОД в перекись водорода. Как следует из рисунка 146 активность СОД,

в обработанных Р(2 листьях, увеличивалась к 8ч экспозиции, что соответствовало максимуму экспрессии генов (рис. 14а). В последующем активность СОД снижалась и стабилизировалась после 12 ч, но на более высоком по сравнению с контролем уровне.

- РО

+ р<3

(а)

Время (ч)

МсРег

АсНп

Реойте

Соотдззйе Ыие síaining

0 4 8 12 24 48 Время, ч 0 4 * ! 12 48

ШЩ §ё ' щш- МсРег ННП МНР ШЩЯЯШЩ

АсЧп Вий ^ РИ11 щШ щщ

ГеггШт

в в Соопш$$1е Ыие зшт^ Ш 2£

Активность сод

Активность свободной ПО

(б)

!з 2

§ гоЗОО-

8 12 16 20 24 28 32 36 40 Время, ч

в? Г

2 9 2

- контроль+пкв-

Соде ржанке хпорофис

0.1 -

—контроль - КОН7рОЛЬ+ПКВ

□ 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 4[ Время, ч

Рис. 14. Влияние обработки листьев Р<3 (100 мкМ) на экспрессию генов МсГег (а), активность антиоксидантных ферментов и содержание хлорофилла (а+Ь) в листьях (б), обработанных Р(Э при экспозиции на свету

О 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48

Время, ч

Активность свободной пероксидазы, которая является вторым звеном в каскаде реакций по детоксикации АФК увеличивалась к 12 часам действия света, а затем выходила на плато, сохраняя при этом более высокий уровень по сравнению с контролем. Эти данные демонстрировали динамику продуцирования паракватом Ог'и Н2О2, которая совпадала с динамикой активации экспрессии мРНК генов (рис. 14а). Содержание белка увеличивалось после 8 ч экспозиции и наибольшее содержание наблюдалось к концу эксперимента.

Что касается снижения содержания хлорофилла в течение первых 8 часов света, а затем стабилизации к концу экспозиции, то в данном случае эти изменения следует объяснить разрушением хлорофилла (Магу81к и а1., 2002).

Таким образом, действие параквата, который повышает в клетках окислительный статус, индуцировало усиленный синтез мРНК и увеличивало содержание ферритина в листьях.

Поскольку хрустальная травка является солеустойчивым растением, предстояло выяснить, какие происходят изменения в экспрессии генов ферритина при действии параквата на растения, адаптированных к засолению. В связи с этим растения до обработки паракватом в течение 2-х недель выращивали в условиях засоления (300 мМ МаС1). Отбор проб проводили, как и в предыдущем опыте.

18 мкМ Ре(Ш)-ЭДТА,-ИМаС1 + Р<2

Время (ч) 0 4 8 12 24

Мсрег

Актин ИеггШпз

Рис. 15. Влияние обработки Р<2 листьев растений хрустальной травки, адаптированных к засолению, на экспрессию генов и содержание белка ферритина (а) и активность антиоксидантных ферментов (б).

Соошаше ;

(б)

Активность свободной ПО

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 Время, ч

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 Время, ч

Как видно из рисунка 15а изменения в экспрессии мРНК, наблюдаемые при действии параквата в условиях предварительной адаптации к хлоридному засолению демонстрировали увеличение ее уровня уже к 4 ч экспозиции на свету. Причем, наибольшее накопление наблюдалось к 8 ч. Можно предположить, что к этому времени происходили более быстрые изменения в ответной реакции листьев на индуцируемый паракватом окислительный стресс, но они были выражены в меньшей степени, чем в контрольных условиях. На это указывает изменения в активности антиоксидантных ферментов (рис. 156). Общей тенденцией в изменении активности СОД и свободной гваяколовой пероксидазы было временное совпадение максимумов

с наибольшим уровнем экспрессии генов ферритина. При этом содержание ферритина повышалось после индукции синтеза мРНК и наибольшее его содержание было найдено в 24 ч экспозиции на свету.

Таким образом, индукция синтеза мРНК при действии параквата на растения хрустальной травки, предварительно произраставшие в условиях засоления, происходила в более ранние временные сроки.

Влияние обработки листьев спермидином на экспрессию генов ферритина. Одним из косвенных доказательств действия АФК как индуктора включения биосинтеза ферритина может служить снижение экспрессии генов ферритина при обработке листьев антиоксидантами. Одним из таких антиоксидантов являются полиамины (КиглеГБОУ, БЬеууакоуа, 2007; 2010).

В опытах применялась обработка листьев спермидином, как наиболее эффективного антиоксиданта из семьи полиаминов. На рис. 16а представлен характер изменения экспрессии генов ферритина в листьях хрустальной травки, предварительно выращенных в условиях различного снабжения железом, а затем обработанных 1мМ спермидином в 0,05% водном растворе Твин-80 перед наступлением ночного периода. Взятие проб для молекулярных и биохимических анализов осуществлялось на следующий день.

(а) Ре (6 мкМ) Дефицит (-Ре)

Контроль +Ре (бмкМ) +Ре,+СПД

Ре,+СПД

МсГег АсНп —

(б)

,.1600

1 1400

я 1200

81000

? 800

I 600

£ 400

5 200

г^ П

Активность СОД

12 10 8 е

2 О

Содержание МДА

<Ь

Рис 16. Влияние спермидина на экспрессию генов ферритина (а) и состояние окислительного стресса (б) в листьях хрустальной травки с различным статусом железа.

Как видно из рисунка 16а в отсутствии железа экспрессия мРНК ферритина была минимальна. В то же время у растений, перенесенных на 2-е недели с Ре-дефицитных условий на норму Ре, уровень матриц мРНК был максимальным. Обработка спермидином растений, произраставших как в условиях дефицита, так и после переноса на нормальное снабжение железом, экспрессия генов ферритина резко снижалась. Данные биохимических анализов, представленные на рисунке 166, показали, что обработка листьев спермидином понизила в них степень окислительных повреждений (ПОЛ) и активность СОД, что указывало на снижение уровня окислительных реакций.

Полученные результаты по торможению экспрессии мРНК ферритина при действии спермидина как "ловушки" АФК свидетельствуют о том, что у хрустальной травки окислительный стресс служит сигналом для ускорения образования в листьях отложений ферритина. Исходя из этих данных, можно считать, в условиях окислительного стресса ферритин может выступать защитным фактором, предотвращая накопление в клетках восстановленной формы железа (Ре2+)-катализатора образования ОН'.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Способность Ре, важного для жизнедеятельности растений эссенциального металла, в восстановленной форме (Ре2+) вступать в реакции с кислородом с образованием гидроксил радикала (ОН0), создает необходимость, поддерживать в клетках гомеостаз железа, не допускающий накопления этой формы. Такое нарушение гомеостаза железа у растений может возникать в стрессорных условиях, индуцирующих окислительный стресс, и в условиях загрязнения железом.

Одним из уникальных механизмов, препятствующих проявлению токсичности Ре2+ при его избыточном образовании в клетках, может являться функционирование желесодержащего белка негеминовой природы ферритина, запасающего Ре в окисленной нетоксичной форме (Ре3+).

В проведенных исследованиях изучали зависимость накопления ферритина в листьях галофита ИезетЬгуапвлетит сгуяклШпит Ь. от содержания железа, развития окислительного стресса у растений в условиях засоления и моделирования интенсивности окислительного стресса с помощью про-оксиданта параквата (РС2) и антиоксиданта спермидина.

Установили, что усиление образования супероксид-радикала и перекиси водорода при обработке листьев Ж} повышало экспрессию мРНК генов и содержание белка ферритина, а "тушение" АФК обработкой спермидином подавляло. Впервые

установлено, что ферритин, связывая токсичную форму железа в условиях активации в растениях окислительного стресса и поступления избыточного железа, препятствует накоплению в клетках Ре2+ - катализатора образования ОН°, т.е. выступает как защитный фактор.

Впервые показано также, что внесение ЫаС1 (300 мМ) в питательную среду резко снижало поступление железа (Ре3+-ЭДТА) в растения и предотвращало появление симптомов токсичности при его избытке (750-1000 мкМ). Этот эффект можно рассматривать как проявление механизма кросс-адаптации, обнаруженного ранее (Кузнецов, 1990). В данном случае этот эффект проявился как адаптация галофита хрустальной травки к двум отрицательным факторам: засолению и высокой концентрации железа.

ВЫВОДЫ

1. Различное количество доступной формы ре3+ в питательной среде положительно коррелировало с содержанием железа в листьях и корнях молодых растений МезетЬгуашИетит сгу$1аШпит Ь. и изменяло в них интенсивность окислительного стресса, о чем судили по активности СОД, гваяколовой ПО, содержанию МДА, Н2О2, хлорофилла и пролина.

2. Предварительное засоление №С1 (300 мМ) в течение двух недель повышало устойчивость взрослых растений к действию высоких концентраций железа (2001000 мкМ Ре3+-ЭДТА) путем ингибирования поступления ре в листья, что свидетельствует о проявлении кросс-адаптации к двум стресс-факторам.

3. Установлено, что в листьях М сгу!1аШпит экспрессируется не менее двух генов ферритина, один из них, вероятно, является ортологом гена А1Еег1 арабидопсиса.

4. Установлено, что уровень мРНК генов ферритина в листьях снижается при дефиците Ре и резко увеличивается при восстановлении питания растений железом. Увеличение содержания белка прямо пропорционально увеличению уровня мРНК, но сдвинуто по времени на несколько часов.

5. Обработка листьев паракватом (100 мкМ) повышала экспрессию генов ферритина и содержание белка, а обработка спермидином (1 мМ) снижала уровень мРНК как на фоне дефицита Ре, так и при возобновлении питания растений Ре.

6. Полученные результаты по действию параквата, как индуктора окислительного стресса, на экспрессию генов ферритина и спермидина, как антиоксиданта, свидетельствуют в пользу проявления ферритином свойств "ловушки" токсичной формы железа.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Шевякова НИ., Ешшшмаева Б.Ц., Парамонова Н.В. (2008). «Уровень ферритина в пластидах хрустальной травки определяется содержанием железа и интенсивностью окислительного стресса» // Материалы Международной конференции «Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений» (Екатеринбург, 06-11 октября 2008г.), Екатеринбург. 2008. С. 437-439.

2. Парамонова Н.В., Ешшшмаева Б.Ц. (2008). «Электронно-микроскопическое исследование пластоглобул в хлоротастах МезетЬгуашЬетит сгу51аШпит £. при различном статусе железа в условиях засоления» // Материалы Международной конференции «Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений» (Екатеринбург, 06-11 октября 2008г.), Екатеринбург. 2008. С. 322-323.

3. Шевякова Н.И., Ешшшмаева Б.Ц., Парамонова Н.В., Кузнецов Вл.В. (2009). «Влияние различных доз железа на развитие окислительного стресса и образование ферритина у растений МезетЬгуап/Иетит сгувШИтит // Физиология растений, 2009 г., том 56, №4, стр.518-529.

4. Ешшшмаева Б.Ц., Шевякова Н.И., Кузнецов Вл.В. (2009). «Исследование взаимосвязи экспрессии гена ферритина и окислительного стресса у МезетЬгуашЬетит сгузшШпит Ь.» // Международная конференция «Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях крайнего Севера», Апатиты, Мурманская область, 7-11 июня 2009 г., стр. 122-123.

5. Парамонова Н.В., Ешшшмаева Б.Ц., Шевякова Н.И. (2009). «Влияние ЫаС1 на содержание крахмала в хлоротастах МеяетЬгуапЛетит сгуяШИтит при различном статусе железа» // Международная конференция «Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях крайнего Севера», Апатиты, Мурманская область, 7-11 июня 2009 г., стр. 259-260.

6. Ешшшмаева Б.Ц., Шевякова Н.И., Парамонова Н.В., Кузнецов Вл.В. (2009) «Развитие окислительного стресса и образование ферритина у МезетЬгуапЛетит сгузшШпит Ь. при действии засоления и различных доз железа» // Всероссийская конференция «Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды», Иркутск, 24-28- августа 2009 г., стр. 154-157.

Подписано в печать:

04.05.2010

Заказ № 3 686 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 VAVw.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ешинимаева, Бэлигма Цыденжаповна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Роль железа в жизнедеятельности растений.

1.2 Содержание и формы Fe в почвах и механизмы поступления в растения

1.3. Возможные последствия излишнего накопления Fe в растениях и механизмы поддержания его гомеостаза.

1.4. Ферритин: ультраструктурные особенности и функции в живых организмах.

1.4.1. Ферритины прокариот.

1.4.2. Ферритины животных.

1.4.3. Ферритины растений.

1.4.3.1. Особенности строения ферритина у растений по данным молекулярных исследований.

1.4.3.2. Биосинтез ферритина у растений.

1.4.3.3. Компартментация ферритина в клетках и тканях растений и регуляция образования ферритина по данным электронной микроскопии

1.4.3.4. Молекулярные механизмы регуляции биосинтеза ферритина.

1.4.3.5. Влияние избытка и дефицита железа на биосинтез ферритина.

1.4.3.6. Исследование биосинтеза и деградации ферритина в связи с развитием окислительного стресса.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Объект и условия выращивания растений в водной культуре.

2.2. Методы биохимических анализов.

2.2.1. Определение содержания МДА.

2.2.2. Определение содержания перекиси водорода.

2.2.3. Определение активности СОД.

2.2.4. Определение активности пероксидазы.

2.2.5. Определение активности каталазы.

2.2.6. Определение содержания пролина.

2.2.7. Определение содержания белка в ферментных препаратах.

2.2.8. Приготовление проб для определения содержания общего железа.

2.2.9. Содержание хлорофилла (а + Ь).

2.2.10. Фиксация проб для электронно-микроскопических исследований

2.2.11. Проведение молекулярных анализов.

2.2.11.1. Выделение тотальной РНК фенол-хлороформным методом.

2.2.11.2. Очистка тотальной РНК от примесей ДНК.

2.2.11.3. Обратная транскрипция.

2.2.11.4. Подбор праймеров для проведения обратной полимеразной цепной реакции (ПЦР).

2.2.11.5. Условия проведения ПЦР-анализа.

2.2.11.6. Подготовка проб для секвенирования нуклеотидных последовательностей генов ферритина.

2.2.12. Проведение Вестерн-блоттинга для иммунодетекции ферритина.

2.2.12.1. Экстракция белков из тканей растения.

2.2.12.2. Проведение электрофореза в полиакриламидном геле.

2.2.13. Математическая обработка данных.

ГЛАВА 3. РАЗВИТИЕ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА И ОБРАЗОВАНИЕ ОТЛОЖЕНИЙ ФЕРРИТИНА В ЛИСТЬЯХ ХРУСТАЛЬНОЙ ТРАВКИ ПРИ ДЕЙСТВИИ ЗАСОЛЕНИЯ И РАЗЛИЧНЫХ ДОЗ ЖЕЛЕЗА.

3.1. Ответная реакция молодых растений на изменение содержания

Fe в питательной среде.

3.2. Ответная реакция взрослых растений на изменение содержания Fe3+ в среде выращивания в контрольных условиях и при засолении NaCl.

3.3. Дозовая зависимость изменения в листьях содержания железа и состояния окислительного стресса в пресных условиях и в присутствии NaCl.

3.4. Влияние дефицита и "избытка" Fe на состояние мембран, запасные включения и образование ферритина в пластидах в присутствии и в отсутствии в среде NaCl.

ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА НА ЭКСПРЕССИЮ

ГЕНОВ И СОДЕРЖАНИЕ БЕЛКА ФЕРРИТИНА.

4.1 Идентификация генов ферритина, экспрессирующихся в листьях Mesembrianthemum crystallinum L.

4.2. Состояние экспрессии генов в листьях при дефиците железа и его избытке.

4.3. Влияние про-оксиданта параквата на экспрессию генов ферритина.

4.4. Влияние обработки листьев спермидином на экспрессию генов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние дефицита и избытка железа на активность антиоксидантных ферментов и образование ферритина у растений хрустальной травки"

Нарушение физиологических процессов у растений в условиях действия абиотических стрессов в значительной степени связано с повышенной генерацией активных форм кислорода (АФК). Неблагоприятные последствия развития окислительного стресса в данной работе рассматриваются в связи с нарушением в клетках гомеостаза Fe. В этих условиях в клетках может накапливаться в свободной форме каталитически активное двухвалентное Fe, которое в присутствии перекиси водорода может образовать самую токсичную форму АФК гидроксил радикал (ОН0). Нарушение гомеостаза Fe можно ожидать у растений, накапливающих в клетках избыточное количество этого металла или при его дефиците, а также в условиях активации окислительных реакций при действии абиотических факторов.

В настоящее время функциональная связь между нарушением гомеостаза Fe и окислительным стрессом рассматривается как новое направление при изучении биосинтеза и защитной роли Fe-содержащего белка ферритина (Briat et al., 2009). Настоящая диссертация посвящена исследованию состояния окислительного стресса при избытке и дефиците железа на фоне засоления и в контрольных условиях, а также влиянию этих факторов на ультраструктурные особенности ферритина и его содержание.

Актуальность проблемы. Fe — эссенциальный элемент для растений. Fe необходимо растениям для функционирования фотосинтеза и дыхания, в которых в качестве переносчиков электронов участвуют железосодержащие и железосерные белки такие как ферредоксин, цитохромы и другие. Как кофактор Fe входит в состав многих антиоксидантных ферментов (Fe-супероксиддисмутаза, пероксидазы, каталаза) и участвует в образовании предшественника хлорофилла.

Однако, ярко выраженная способность этого металла в восстановленной форме (Fe2+) вступать в реакции с кислородом с образованием гидроксил радикала (ОН°) — самого токсичного из всех форм АФК, создает необходимость у всех аэробных организмов, в том числе и у растений, поддерживать в клетках гомеостаз железа, не допускающий накопления его "каталитической" формы. Такое нарушение гомеостаза железа у растений может возникать в стрессорных условиях, индуцирующих окислительный стресс (Hernandes et al., 2001).

Одним из уникальных механизмов, препятствующих проявлению токсичности Fe2+ при его избыточном образовании в клетках, может быть функционирование у всех живых организмов, за исключением дрожжей, желесо-держащего белка негеминовой природы ферритина, запасающего Fe в

Л I окисленной нетоксичной форме (Fe ). К настоящему времени гены, кодирующие белок ферритин, клонированы и охарактеризованы у ряда видов растений: кукурузы, гороха, сои, люпина, риса и арабидопсиса. У растений, отложения ферритины локализованы в пластидах (Парамонова и др., 2004, 2007), реже в митохондриях (Zancani et al., 2004) и отсутствует в цитоплазме. Структура ферритина в пластидах растений отличается от ферритинов животных и бактерий присутствием в минеральном ядре не только железа, но и фосфора в соотношении P:Fe (1:3) (Waldo et al., 1995). Главное отличие ферритина растений от животных состоит в том, что синтез ферритина у животных регулируется на трансляционном уровне, а у растений регуляция происходит на транскрипционном уровне в ответ на избыточное поступление железа в клетку (Arnaud et al., 2006; Briat et al., 2009). В поддержании гомеостаза Fe у растений участвует множество генов (43 гена у риса), включая гены

11 транспорта ZIP (транспортер Fe и Zn) и гены FRO, кодирующие Fe - хелат редуктазы оксидазы (Briat, 2008; Lemanceau et al., 2009). Исследование роли ферритина в детоксикации избытка Fe2+, катализирующего при накоплении в клетках супероксид-радикала и пероксида, образование самого токсичного АФК (гидроксил-радикала, ОН0), приобретает особую важность для поддержания гомеостаза железа у растений, в том числе подвергающихся стрессор-ному воздействию.

В природных условиях доступность Fe для растений в значительной степени зависит от рН почвенного раствора. Растения, произрастающие на известковых и засоленных почвах со значением рН>7, страдают от дефицита Fe, который визуально проявляется в виде хлороза у молодых листьев (Маг-schner and Romfeld, 1994). Избыток Fe чаще всего проявляется на почвах или водоемах, загрязненных различными производными железа (Domingues et al., 2009). В этом случае, растения страдают от избытка Fe и его токсичности, что проявляется в образовании некрозов на листьях (Peng et al., 1993; Kampfenkel et al., 1995; Liphadzi and Kirkham, 2006)

Однако долгое время образование отложений ферритина у растений в пластидах объясняли его ролью как запасного хранилища железа (Hyde et al., 1963). В последнее время изучение функций ферритина как у растений, так и животных, а также регуляции его синтеза указывает на существование возможной связи между этим белком и защитой от активных форм кислорода (АФК) (Briat et al., 2009; Ravet et al., 2009), что в равной степени затрагивает как устойчивость растений, произрастающих в стрессорных условиях, так и проявление болезни дефицита Fe у человека (Андреев, 2004; Theil et al., 2004). Такой подход рассматривается как новый взгляд на защитную роль ферритина при окислительном стрессе и значение этого белка в адаптивном ответе растений на абиотические стрессы.

Совокупность имеющихся в литературе данных позволяет предполагать, что в условиях действия абиотических факторов ферритин у растений может выполнять двоякую роль. Его образование в пластидах и других орга-неллах может служить запасным источником доступного железа для обеспечения жизнедеятельности растений в изменяющихся условиях питания растений железом, а с другой стороны, ферритин необходим для поддержания гомеостаза железа и защиты клеток от образования самого токсичного АФК (ОН° - гидроксил-радикала) при развитии окислительного стресса в условиях действия абиотических факторов.

Цель исследования. Цель настоящей работы - исследовать зависимость накопления ферритина в листьях факультативного галофита Mesembryanthe-тит crystallinum L. от содержания железа в питательном растворе и интенсивности окислительного стресса.

Задачи исследования:

1. Определить дозовую зависимость поглощения железа растениями М. crystallinum L. в контрольных условиях культивирования и в присутствии 300 мМ NaCl.

2. Исследовать основные биохимические параметры: активность антиокси-дантных ферментов (супероксидцисмутаза, пероксидаза), содержание пролина, хлорофилла и интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ), характеризующие взаимосвязь между состоянием окислительного стресса и гомеостазом железа у галофита М. crystallinum, в зависимости от содержания железа, засоления и их совместного действия.

3. Изучить зависимость отложения ферритина и его ультраструктурные особенности в пластидах мезофилла листьев от содержания железа в контрольных условиях и при засолении с помощью электронной микроскопии.

5. Оценить уровень экспрессии генов ферритина в листьях методом ОТ-ПЦР и Вестерн-блоттингом в зависимости от содержания железа и развития окислительного стресса.

6. Исследовать влияние про-оксиданта метилвиологена (параквата - PQ) — индуктора окислительного стресса в пластидах, и антиоксиданта полиамина спермидина (Спд) на экспрессию генов ферритина и содержание белка в листьях.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное изучение образования ферритина у факультативного галофита Mesembryanthemum crystallinum L. (хрустальная травка) в зависимости от уровня железа в питательной среде и интенсивности окислительного стресса.

Показано, что внесение NaCl (300 мМ) в питательную среду резко сни

О I жало поступление железа (Fe -ЭДТА) в растения и предотвращало появление симптомов токсичности при его избытке (750-1000 мкМ). Впервые установлено, что адаптация растений М. crystallinum к засолению приводила к повышению устойчивости к избытку железа, что свидетельствует о проявлении кросс-адаптации к двум стресс-факторам. Впервые с помощью электронно-микроскопического анализа продемонстрирована прямая зависимость уровня отложений ферритина в мезофилле листьев от содержания в них железа и интенсивности окислительного стресса. В листьях М. crystallinum впервые установлена экспрессия не менее двух генов ферритина (McFerj, один из которых является ортологом гена AtFerl арабидопсиса и проявляет сходство по уровню экспрессии на окислительный стресс и избыток Fe.

Показано, что индукция паракватом (PQ) образования супероксид-радикала и перекиси водорода в листьях хрустальной травки повышала уровень мРНК генов ферритина и содержание белка. Напротив, спермидин (Спд), обладающий антиоксидантным свойством, тормозил экспрессию генов ферритина. Впервые экспериментально показано, что окислительный стресс индуцировал образование отложений ферритина в листьях хрустальной травки. Это указывает на антиокидантную роль ферритина, связывающего восстановленную форму железа (Fe24) — катализатора образования ОН0.

Теоретическая и практическая значимость. Детекция ферритина в листьях галофита М. crystallinum и способы регуляции его содержания могут использоваться при создании трансгенных растений со сверхэкспрессией ферритина. Теоретические обобщения и совокупность экспериментальных данных работы могут использоваться в курсах лекций для студентов биологических факультетов ВУЗов страны.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано и направлено в печать 6 печатных работ, из которых 1 — статья в журнале «Физиология растений».

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 122 страницах машинописного текста и содержат 2 таблицы и 30 рисунков. Список цитируемой литературы включает 191 наименований, в т.ч. 172 иностранных.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Ешинимаева, Бэлигма Цыденжаповна

выводы

1. Различное количество доступной формы Fe в питательной среде положительно коррелировало с содержанием железа в листьях и корнях молодых растений Mesembryanthemum crystallinum L. и изменяло в них интенсивность окислительного стресса, о чем судили по активности СОД, гваяколовой ПО, содержанию МДА, Н202 , хлорофилла и пролина.

2. Предварительное засоление NaCl (300 мМ) в течение двух недель повышало устойчивость взрослых растений к действию высоких концентраций железа (200- 1000 мкМ Fe -ЭДТА) путем ингибирования поступления Fe в листья, что свидетельствует о проявлении кросс-адаптации к двум стресс-факторам.

3. Установлено, что в листьях М. crystallinum экспрессируется не менее двух генов ферритина, один из них, вероятно, является ортологом гена AtFerl арабидопсиса.

4. Установлено, что уровень мРНК генов ферритина в листьях снижается при дефиците Fe и резко увеличивается при восстановлении питания растений железом. Увеличение содержания белка прямо пропорционально увеличению уровня мРНК, но сдвинуто по времени на несколько часов.

5. Обработка листьев паракватом (100 мкМ) повышала экспрессию генов ферритина и содержание белка, а обработка спермидином (1 мМ) снижала уровень мРНК как на фоне дефицита Fe, так и при возобновлении питания растений Fe.

6. Полученные результаты по действию параквата, как индуктора окислительного стресса, на экспрессию генов ферритина и спермидина, как антиок-сиданта, свидетельствуют в пользу проявления ферритином свойств "ловушки" токсичной формы железа.

Автор выражает благодарность к.б.н. Наталье Васильевне Парамоновой за совместную работу по электронной микроскопии; профессору J-F. Briat (Монпелье, Франция) за любезно предоставленные антитела.

Особую благодарность автор выражает своему научному руководителю, доктору биологических наук, профессору Нине Ивановне Шевяковой за научное руководство и помощь, оказанную при работе над диссертацией; искреннюю благодарность и глубокую признательность зав. лаборатории физиологических и молекулярных механизмов адаптации, член-корреспонденту РАН Владимиру Васильевичу Кузнецову за помощь в решении экспериментальных и других важных вопросов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования показали, что у растений хрустальной травки различный статус доступной формы железа в питательной среде (комплекс Ре3+-ЭДТА) резко изменял интенсивность ПОЛ и активность антиоксидантных ферментов. В листьях онтогенетически взрослых растений, находящихся в фазе перехода на САМ-тип фотосинтеза, судя по активностям СОД, свободной формы гваяколовой ПО и содержанию пролина как "ловушки" АФК, окислительный стресс был наиболее интенсивным при совместном действии засоления и дефицита Fe. Об активации окислительного стресса свидетельствует также нарушение биосинтеза хлорофилла.

Гораздо менее выраженные изменения окислительного метаболизма в листьях хрустальной травки наблюдались при совместном действии засоления и Fe (18 мкМ Fe -ЭДТА). Однако в присутствии в среде NaCl в этих условиях снижение содержания хлорофилла в листьях было более выражено, чем при дефиците Fe, что можно объяснить торможением поступления железа в растения в условиях засоления и более активной тратой глутамата в биосинтезе пролина. Активность СОД - индикатора образования супероксид аниона, также понизилась в листьях в присутствии Fe по сравнению с условиями дефицита Fe.

Изменение содержания в листьях Н2О2 — продукта дисмутации супероксида, катализируемого СОД, и возможного регуляторного сигнала для экспрессии одного из генов ферритина, в значительной степени зависит от его транспорта на уровне организма.

Найденные с помощью электронной микроскопии скопления ферритина, контактирующие с крупными пластоглобулами в пластидах в варианте с 18 мкмоль Ре3+-ЭДТА в питательной среде свидетельствуют о стимулирующем действии этого металла на образование ферритина в условиях активного проявления окислительного стресса. Наряду с этим скопление крупных пластог-лобул, служащих резервом липидов и белков и контактирующих с феррити-новыми глобулами, может указывать на необходимость повышенного уровня

Fe в листьях для поддержания синтеза липидов в пластидах. О том, что экзогенная Н2О2 способна повышать экспрессию гена ферритина на уровне мРНК у растений, имеются данные литературы (Petit et al., 2001а). Следует подчеркнуть, что уровень накопления Н202у хрустальной травки (0.13 мкмоль/г сырой массы) в варианте 6 мкмоль Fe на фоне засоления отвечает гипотезе о ее сигнальной роли. Как недавно показано в нашей лаборатории (Kuznetsov et al., 2009) в корнях взрослых растений хрустальной травки в экстремальных условиях, вызвавших окислительный взрыв при введении экзогенного кадаверина, ингибирующее действие Н202 достигалось при содержании 40-80 мкмоль/г сырой массы.

Одной из NaCl-индуцируемых ответных реакций хрустальной травки является аккумуляция пролина, что долгое время связывалось с действием пролина в основном как осморегулятора. Однако высокое содержание пролина в корнях этого растения, обнаруженное нами при дефиците железа в отсутствие засоления, нельзя объяснить осморегуляторным действием этого защитного метаболита. Высокое содержание пролина в листьях и корнях при развитии окислительного стресса в варианте "контроль + NaCl", а также в листьях в варианте "дефицит Fe+NaCl" могла свидетельствовать в пользу выполнения им антиоксидантной функции, которая проявляется в стрессовых условиях у галофитов (Шевякова и др., 2009).

Слабо выраженные повреждения в пластидах, вызванные АФК, были также обнаружены у растений, произраставших в условиях дефицита Fe и в отсутствии засоления. При этом в обоих отмеченных выше случаях в пластидах не были обнаружены какие-либо скопления отложений ферритина. На этом основании можно высказать предположение, что при дефиците Fe, сопровождаемом окислительным стрессом, ферритин, образовавшийся при о I культивировании растений в течение 16 дней в присутствии Fe (6 мкМ Fe -ЭДТА), мог деградировать с освобождением каталитически активной "свободной" формы Fe . Тем более ранее (Парамонова и др., 2007) была обнаружена частичная деградация ферритина даже при нормальном содержании

Fe в среде и превращение его в фитосидерин в хлоропластах клеток обкладки, в сопровождающих клетках флоэмы и других паренхимных клетках тонких окончаний листьев хрустальной травки в условиях засоления, индуцирующего окислительный стресс. В этих исследованиях ферритин и фитосидерин обнаруживались также в ситовидных трубках, что могло свидетельствовать о способности Fe транспортироваться по растению в составе белкового комплекса. Из литературы по механизмам деградации ферритина в патологических случаях у человека следует, что ферритин в условиях повышенного образования супероксид аниона освобождал до 70% "свободного" Fe и становился источником "каталитического" Fe (Theil and Hase, 1993). В этом случае Fe усиливал супероксид-зависимую пероксидацию липидов, фосфо-липидов и окисление белков, что характерно при склерозе сосудов у человека (Connoly and Guerinot, 2002). То, что дефицит Fe ведет к повышению окислительного стресса в клетках, в результате снижения активности Fe-содержащих форм ПО и значительному увеличению в них содержания Н2О2, показано на примере растений подсолнечника (Ranieri et al., 2001).

В этой связи образование в пластидах ферритина при повышенном поступлении в растения железа может указывать на проявление им функции "скавенджера" образующегося в пластидах излишка железа. Роль ферритина в запасании Fe и поддержании его гомеостаза в растениях, не допускающих аккумуляции в клетках его токсической формы, рассматривается во многих работах (Gross et al.,2003).

При исследовании дозовой зависимости действия железа в диапазоне 6о I

1000 мкМ Fe -ЭДТА в составе хелатного комплекса было показано, что резкое неконтролируемое повышение эндогенного уровня железа происходило в листьях в контрольных условиях, начиная со 150 мкМ Fe, что повлекло нарушение проницаемости мембран из-за повышения интенсивности ПОЛ и появление признаков токсикоза железа. В то же время в условиях засоления (300 мМ NaCl) поступление Fe в растения ингибировалось во всем диапазоне его концентраций в питательной среде, что создавало более оптимальные условия для жизнедеятельности растений.

Совокупность полученных данных показала, что избыток железа, даже если оно интенсивно поступает в растения в доступной форме, может привести к сильным повреждениям. Впервые показано, что внесение NaCl (300 о ■ мМ) в питательную среду резко снижало поступление железа (Fe -ЭДТА) в растения и предотвращало появление симптомов токсичности при его избытке (750-1000 мкмоль). Этот эффект можно квалифицировать как проявление механизма кросс-адаптации, обнаруженного ранее (Кузнецов, 1990; Волков и др., 20066).

Вместе с тем, для получения более полной информации о взаимосвязи между накоплением ферритина и развитием окислительного стресса в стрес-сорных условиях необходимо было провести исследования по идентификации генов, отвечающих за синтез ферритина, и изучить изменения, происходящие на уровне мРНК и содержании белка в зависимости от окислительного стресса и содержания железа.

Способность Fe, важного для жизнедеятельности растений эссенциаль-ного металла, в восстановленной форме (Fe ) вступать в реакции с кислородом с образованием гидроксил радикала (ОН°), создает необходимость, поддерживать в клетках гомеостаз железа, не допускающий накопления этой формы. Такое нарушение гомеостаза железа у растений может возникать в стрессорных условиях, индуцирующих окислительный стресс, и в условиях загрязнения железом.

Одним из уникальных механизмов, препятствующих проявлению токсичности Fe2+ при его избыточном образовании в клетках, может являться функционирование желесодержащего белка негеминовой природы

Л I ферритина, запасающего Fe в окисленной нетоксичной форме (Fe ).

В проведенных исследованиях изучали зависимость накопления ферритина в листьях галофита Mesembryanthemum crystallinum L. от содержания железа, развития окислительного стресса у растений в условиях засоления и моделирования интенсивности окислительного стресса с помощью про-оксиданта параквата (PQ) и антиоксиданта спермидина.

Установлено, что усиление образования супероксид-радикала и перекиси водорода при обработке листьев PQ повышало экспрессию мРНК генов и содержание белка ферритина, а "тушение" АФК обработкой спермидином подавляло. Впервые установлено, что ферритин, связывая токсичную форму железа в условиях активации в растениях окислительного стресса и поступления избыточного железа, препятствует накоплению в клетках Fe24— катализатора образования ОН°, т.е. выступает как защитный фактор.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ешинимаева, Бэлигма Цыденжаповна, Москва

1. Андреев Г.И. Ферритин как макер железодефицитной анемии и опухолевый маркер // Интернет-журнал Коммерческая биотехнология (www.chio.ru., публикация от 24.03.2004 г.)

2. Волков К. С. Адаптация к действию повышенных концентраций меди и цинка и возможность использования в фиторемедиации растений Mesembryanthemum crystallinum L. // Дисс. канд. биол. наук. Москва, 2006а.

3. Волков КС., Холодова В.П., Кузнецов Вл.В. Адаптация растений к засолению снижает токсический эффект меди // Доклады Академии наук. 20066. Т. 411. С.479-481

4. Голубкина Н.А. Флуорометрический метод определения селена // Журн. аналит. химии. 1995. Т. 50. С. 492-497.

5. Добровольский В.В. Биосферные циклы тяжелых металлов и регуля-торная роль почвы //Почвоведение. 1997. №4. С. 442-449.

6. Зайцев Г.Н. Математическая статистика в экспериментальной ботанике // Издательство «Наука». 1984.

7. Кузнецов Вл.В., Ракитин В.Ю., Садомов Н.Г., Дам Д.В., Стеценко Л.А., Шевякова Н.И. Участвуют ли полиамины в дистанционной передаче стрессорного сигнала у растений? // Физиология растений. 2002. 49: 136-147.

8. Кузнецов Вл.В., Рощупкин Б.В., Хыдыров Б. Т., Борисова Н.Н. Взаимодействие исходной и адаптивной устойчивости растений при засолении//ДАН АН СССР. 1990. 314: 509-512.

9. Кузнецов Вл.В., Шевякова Н.И. Пролин при стрессе: биологическая роль, метаболизм, регуляция // Физиология растений. 1999. 46: 321— 336.

10. Маджугина Ю.Г., Кузнецов Вл.В., Шевякова Н.И. Растения полигонов захоронения бытовых отходов мегаполисов как перспективные виды для фиторемедиации // Физиология растений. 2008. Т. 55. С. 1—11.

11. Никандров В. В. Неорганические полупроводники в биологических и биохимических системах: биосинтез, свойства и фотохимическая активность // Успехи биологической химии. 2000. Т.40. С. 357-396.

12. Парамонова Н.В., Шевякова Н.И., Кузнецов Вл.В. Ультраструктура хлоропластов и их запасных включений в первичных листьях Mesem-bryanthemum crystallinum при воздействии путресцина и NaCl // Физиология растений. 2004. Т. 51. с.99-109

13. Парамонова Н.В., Шевякова Н.И., Кузнецов Вл.В. Ультраструктурные особенности ферритина в листьях Mesembryanthemum crystallinum при стрессе // Физиология растений. 2007. Т.54.С.275-289

14. Радюкина Н. Я., Шашукова А. ВШевякова Н. И., Кузнецов Вл. В. Участие пролина в системе антиоксидантной защиты у шалфея при действии NaCl и параквата // Физиология растений. 2008. Т.55. №5. С. 721-730.

15. Радюкина H.JI., Карташов А.В., Иванов Ю.В., Шевякова Н.И., Кузне-ifoe Вл.В. Сравнительный анализ функционирования защитных систем у представителей галофитной и гликофитнй флоры в условиях прогрессирующкго засоления // 2007. Т.54. С. 902-912.

16. Шевякова Н.И., Бакулина Е.А., Кузнецов Вл.В. Антиоксидантная роль пролина у галофита хрустальной травки при действии засоления и параквата, инициирующих окислительный стресс // Физиология растений. 2009. Т.56. С. 736-742.

17. Шевякова Н.И., Ильина Е.Н., Кузнецов В.В. Полиамины повышают фиторемедиационный потенциал растений при очистке почв, загрязненных тяжелыми металлами // Докл. АН. 2008. 423: 714-717.

18. Шевякова Н.И., Рощупкин Б.В., Парамонова Н.В., Кузнецов Вл.В. Стрессорный ответ клеток Nicotiana sylvestris L. На засоление и высокую температуру. 1. Аккумуляция пролина, полиаминов, бетаинов и Сахаров. // Физиология растений. 1994. Т.41 С. 558-565.

19. Шлык А.А. Определение хлорофиллов и каратиноидов в экстрактах зеленых листьев // Биохимические методы в физиологии растений. М.: Наука. 1971. С. 154-171.

20. Andrews SC, Arosio Р, Bottke Н, et al. Structure, function and evolution of ferritins // Journal of Inorganic Biochemistry. 1992.47: 161-174.

21. Andrews SC, Le Brun NE, Barynin V, Thomson A J, Moore GR., Guest JR., Harrison PM. Site-directed replacement of the coaxial heme ligands of bacterioferritin generates heme-free variants // The Journal of Biological Chemistry. 1995.270: 23268-23274.

22. Andrews SC, Robinson AK, Rodriguez-Quinones F. Bacterial iron homeostasis // FEMS Microbiology Reviews. 2003. 27: 215-237.

23. Arosio P, Ingrassia R, Cavadini P. Ferritins: a family of molecules for iron storage, antioxidation and more // Biochimica et Biophysica Acta. 2009. 1790(7):589-599.

24. Bates L.S., Waldren R.P., Teare I.D. Rapid Determination of Free Proline for Water Stress Studies I I Plant Soil. 1973. V. 39. P. 205-207.

25. Bauer P, Thiel T, Klatte M, Bereczky Z, Brumbarova T, Hell R, Grosse /. Analysis of sequence, map position, and gene expression reveals conserved essential genes for iron uptake in Arabidopsis and tomato // Plant Physiol. 2004. 136:4169^1183.

26. Beauchamp Ch., Fridovich I. Superoxide dismutase improved assays and an assay applicable to acrylamide gels // Analytical Biochemistry. 1971. 44: 276-287.

27. Bereczky Z, Wang HY, Schubert V, Ganal M, Bauer P. Differential regulation of Nramp and irt metal transporter genes in wild type and iron uptake mutants of tomato // J Biol Chem. 2003. 278: 24697-24704.

28. Blokhina O., Virolainen E., Fagerstedt K.V. Antioxidants, oxidative damage and oxygen deprivation stress: a review // Annals of Botany. 2003. 91: 179-194.

29. Blokhina O., Virolainen E., Fagerstedt К. V. Antioxidants. Oxidative Damage and Oxigen Deprivation Stress: Review // Ann. Bot. 2003. 91: 179194.

30. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitations of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding // Analytical Biochemistry. 1976. 72: 248-254.

31. Brennan Т., Frenkel C. Involvement of hydrogen peroxide in the regulation of senescence in pear // Plant Physiol. 1997. 59: 411-416.

32. Briat JF, Fobis-Loisy I, Grignon N. Cellular and molecular aspects of iron metabolism in plants // Biology of the Cell. 1995. 84: 69-81.

33. Briat JF, Lobre'awc S, Grignon N, Vansuyt G. Regulation of plant ferritin synthesis: how and why // Cellular and Molecular Life Sciences. 1999. 56: 155-166.

34. Briat JF. Iron dynamics in plants // Advances in Botanical Research. 2008. 46: 137-180.

35. Саго A, Puntarulo S. Effect of in vivo iron supplementation on oxygen radical production by soybean roots // Biochimica et Biophysica Acta 1996. 1291:245-251.

36. Carrondo MA. Ferritins, iron uptake and storage from the bacterioferritin viewpoint // EMBO Journal. 2003.22: 1959-1968.

37. Cassanelli S, Moulis J. Sulfide is an efficient iron releasing agent for mammalian ferritins // Biochimica et Biophysica Acta. 2001. 1547: 74— 182.

38. Cassin G, Mari S, Curie C, Briat JF, Czernic P. Increased sensitivity to iron deficiency in Arabidopsis thaliana overaccumulating nicotianamine Journal of Experimental Botany. 2009 Vol. 60, № 4, pp. 1249-1259.

39. Chasteen ND. Ferritin: uptake, storage and release of iron // Metal Ions in Biological Systems. 1998. 35: 479-514.

40. Cheesman MR, Le Brun NE, Kadir FHA, et al. Haem and non-haem iron sites in Escherichia coli bacterioferritin: spectroscopic and model building studies // The Biochemical Journal. 1993. 292: 47-56.

41. Cheesman MR, Thomson AJ, Greenwood C, Moore GR, Kadir F. Bis-methionine axial ligation of haem in bacterioferritin from Pseudomonas aeruginosa//Nature. 1990. 346: 771-773.

42. Clarke SL, Vasanthakumar A, Anderson SA, et al. Iron-responsive degradation of iron-regulatory protein 1 does not require the Fe-S cluster // EMBO Journal. 2006. 25: 544-55з.

43. Cohen CK, Fox TC, Garvin DF, Kochian LV. The role of iron-deficiency stress responses in stimulating heavy-metal transport in plants // Plant Physiol. 1998. 116:1063-1072.

44. Connolly EL, Fett JP, Guerinot ML. Expression of the IRT1 metal transporter is controlled by metals at the levels of transcript and protein accumulation // Plant Cell. 2002. 14:1347-1357.

45. Curie С, Panaviene Z, Loulergue C, Dellaporta SL, Briat JF, Walker EL. Maize yellow stripe 1 encodes a membrane protein directly involved in Fe(III) uptake //Nature. 2001. 18:346-349.

46. Curie C., Alonso JM., Jean MLe, Ecker JR., Briat J-F. Involvement of NRAMP1 from Arabidopsis thaliana in iron transport // Biochem J. 2000. P. 749-755.

47. Dajic Z. Salt stress salinity and tolerance mechanisms in plants. // Physiology and Molecular Biology of Stress Tolerance in Plants / Eds Madhava Rao K.V., Raghavendra A.S., Janardhan Reddy K. Dordrecht: Kluwer, 2006. P. 41-101.

48. De Domenico I, Vaughn MB, Li L. Ferroportin-mediated mobilization of ferritin iron precedes ferritin degradation by the proteasome // EMBO Journal. 2006. 25: 5396-5404.

49. Dedk M, Horvath GV, Davletova S, Тдгдк K, Sass L, Vass I,. Barna B, Kiraly Z, Dudits D. Plants ectopically expressing the iron-binding protein, ferritin, are tolerant to oxidative damage and pathogens // Nature Biotechnology. 1999. 17: 192-196.

50. Dellagi A, Rigault M, Segond D, Roux C, Kraepiel Y, Cellier F, Briat J-F, Gaymard F, Expert D. Siderophore-mediated upregulation of Arabidopsis ferritin expression in response to Erwinia chrysanthemi infection. The Plant Journal. 2005. 43: 262-272.

51. Dominguez D.M, Santiago R. T. and Garcia F. С. Modulation of the anti-oxidative response of Spartina densiflora against iron exposure // Physi-ologia Plantarum 2009. V.136. P. 168-179.

52. Donlin, M. J.; Frey, R. F.; Putnam, C.; Proctor, J. K.; Bashkin, J. K. Analysis of iron in ferritin, the iron-storage protein // J. Chem. Educ. 1998. 75, 437-441.

53. Eckhardt U, Marques AM, Buckhout TJ. Two ironregulated cation transporters from tomato complement metal uptake-deficient yeast mutants // Plant Mol Biol. 2001. 45:437-448.

54. Eide D, Broderius M, Fett J, Guerinot ML. A novel ironregulated metal transporter from plants identified byfunctional expression in yeast // Proc Natl Acad Sci USA. 1996. 93:5624-5628.

55. Eng F. C., Barsalou A., Akutsu N., Mercier I., Zechel C., Mader S., White J. H. Different classes of coactivators recognize distinct but overlapping binding sites on the estrogen receptor ligand binding domain // J Biol Chem. 1998. 273: 28371-28377.

56. Esen A. A. Simple method for quantitative, semiquantitative, and qualitative assay of protein// Anal. Biochem. 1978. 89: 264-273.

57. Fillebeen C, Chahine D, Caltagirone A, Segal P, Pantopoulos K. A phos-phomimetic mutation at Ser-138 renders iron regulatory protein 1 sensitive to iron-dependent degradation // Molecular and Cellular Biology. 2003. 19: 6973-6981.

58. Fobis-Loisy I, London K, Lobre rawc S, Lebrun Mf Briat J-F. Structure and differential expression in response to iron and abscisic acid of two maize ferritin genes // European Journal of Biochemistry. 1995.231: 609-619.

59. Foyer CH, Noctor G. Redox sensing and signalling associated with reactive oxygen in chloroplasts, peroxisomes and mitochondria // Physiol Plant 2003.119:355-364.

60. Galy B, Ferring D, Minana B, et al. Altered body iron distribution and mi-crocytosis in mice deficient in iron regulatory protein 2 (IRP2) // Blood. 2005.106: 2580-2589.

61. Gaymard F, Boucherez J, Briat JF. Characterization of a ferritin mRNA from Arabidopsis thaliana accumulated in response to iron through an oxidative pathway independent of abscisic acid // The Biochemical Journal 1996.318: 67-73.

62. Gross J., Stein R.J., Fett-Neto A.G., Fett J.P. Iron homeostasis related genes in rice // Genetics and Molecular Biology. 2003. V.26. P.477-497.

63. Guerinot ML. The ZIP family of metal transporters // Biochim Biophys Acta. 2000. 1465:190-198.

64. Guerinot ML., Yi Y. Iron nutrition, noxious and readily available // Plant Physiology. 1994. 104: 815-820.

65. Hantke K. Iron and metal regulation in bacteria // Current Opinion in Microbiology. 2001. 4: 172-177.

66. Harrison P.M., Arosio. P. The ferritins: molecular properties, iron storage function and cellular regulation // Biochim. Biophys. Acta. 1996. 1275: 161-203.

67. Heath R.L., Packer L. Photoperoxidation in isolated cloroplasts. Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation // Archives of Biochem. and Biophys. 1968. 125: 189-198.

68. Hernandes J.A. Ferrer M-A., Jimenez A., Barcelo A-R., Francisca S. Antioxidant systems and 02"/H202 production in the apoplast of pea leaves, its relation with salt-induced necrotic lesions in minor veims // Plant Physiol., 2001. V.127, P. 817-831.

69. Higuchi K., Kanazawa K., Nishizawa N.K., Mori S. The role of nico-tianamine synthase in response to Fe nutrition status in Gramineae // Plant Soil. 1996. 178: 171-177.

70. Hintze KJ, Theil EC. DNA and mRNA elements with complementary responses to hemin, antioxidant inducers, and iron control ferritin-L expression // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 2005. 102: 15048-15052.

71. Hyde BB, Hodge AJ, Kahn A, Birnstiel ML. Studies on phytoferritin. I. Identification and localization // Journal of infrastructure Research. 1963. 59: 248-258.

72. Ilari A, CeciP, Ferrari D, Rossi GL, Chiancone E. Iron incorporation into Escherichia coli Dps gives rise to a ferritin-like microcrystalline core // The Journal of Biological Chemistry. 2002. 277: 37619-37623.

73. Ilari A, Stefanini S, Chiancone E, Tsernoglou D. The dodecameric ferritin from Listeria innocua contains a novel intersubunit iron-binding site // Nature Structural Biology. 2000.7: 38-43

74. Izuhara M, Takamune К, Takata R. Cloning and sequencing of an Escherichia coli K12 gene which encodes a polypeptide having similarity to the human ferritin H subunit // Molecular General Genetics. 1991. 225: 510-513.

75. Jin W, Takagi H, Pancorbo B, Theil EC. 'Opening' the ferritin pore for iron release by mutation of conserved amino acids at interhelix and loop sites // Biochemistry. 2001.40: 7525-7532.

76. Johnson JL, Norcross DC, Arosio P, Frankel RB, Watt GD. Redox reactivity of animal apoferritins and apoheteropolymers assembled from recombinant heavy and light human chain ferritins // Biochemistry 1999. 38: 4089-4096.

77. Kampfenkel K, Van Montagu M, Inze D. Effects of iron excess on Nico-tiana plumbaginifolia plants (implications to oxidative stress) // Plant Physiology. 1995. 107: 725-735.

78. Kampfenkel K, Van Montagu M, Inze D. Effects of iron excess on Nico-tiana plumbaginifolia plants (implications to oxidative stress) // Plant Physiology. 1995.107: 725-735.

79. Kampfenkel K, Van Montagu M., Inze D. Effects of iron excess on Nico-tiana plumbaginifolia pints//Plant. Physiol. 1995. 107: 725-735

80. Kaplan J, McVey Ward D, Crisp RJ, Philpott CC. Iron-dependent metabolic remodeling in S. cerevisiae // Biochimica et Biophysica Acta. 2006. 1763: 646-651.

81. Keech AM, Le Brim NE, Wilson MT, Andrews SC, Moore GR, Thomson AJ. Spectroscopic studies of cobalt (II) binding to Escherichia coli bacterioferritin // The Journal of Biological Chemistry. 1997. 272: 422-429.

82. Kidane TZ, Sauble E, binder MC. Release of iron from ferritin requires lysosomal activity // American Journal of Physiology: Cell Physiology 2006. 291: C445-C455.

83. Kim S, Ponka P. Nitric oxide-mediated modulation of iron regulatory proteins: implication for cellular iron homeostasis // Blood Cells Molecular Diseases. 2002. 29: 400-410.

84. Kim S, Wing SS, Ponka P. S-nitrosylation of IRP2 regulates its stability via the ubiquitin-proteasome pathway // Molecular and Cellular Biology. 2004. 24: 330-337.

85. Kim SA., Punshon Т., Lanzirotti A., Li L., Alonso JM., Ecker JR., Kaplan J., Guerinot ML. Localization of Iron in Arabidopsis Seed Requires the Vacuolar Membrane Transporter VIT1 // Science. 2006. 314: 1295-1298.

86. Kimata Y, Theil EC. Posttranscriptional regulation of ferritin during nodule development in soybean // Plant Physiology. 1994. 104: 263-270.

87. Ко MP, Huang PY, Huang JS, Barker KR. The occurrence of phytoferritin and its relationship to effectiveness of soybean nodules // Plant Physiology. 1987. 83: 299-305.

88. Kosegarten H, Hoffmann B, Rroco E, Grolig F, Glusenkamp K-H, Mengel K. Apoplastic pH and Felll reduction in young sunflower (Helianthus an-nuus) roots // Physiol Plant. 2004. 122: 95-106.

89. Kuznetsov VI. V, Shevyakova N.I. Polyamines and plant adaptation to saline environments // Desert Plants. 2010. P. 261-298.

90. Kuznetsov VI. V, Shevyakova N.I. Polyamines and stress tolerance of plants // Plant Stress. Global Science Books. 2007. 1: 50-71.

91. Kuznetsov VI.V., Stetsenko LA., Shevyakova N.I. Exogenous Cadaverine Induces Oxidative Burst and Reduces Cadaverine Conjugate Content in the Common Ice Plant // J. Plant Physiol. 2008. 166: 40-51.

92. Laemmli UK Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. 227(5259): 680-685.

93. Lanquar V, Lelievre F, Bolte S, et al. Mobilization of vacuolar iron by AtNRAMP3 and AtNRAMP4 is essential for seed germination on low iron // EMBO Journal. 2005. 24: 4041^1051.

94. Laulhere JP, Laboure AM, Briat JF. Mechanism of the transition from plant ferritin to phytosiderin // The Journal of Biological Chemistry 1989. 264: 3629-3635.

95. Laulhere JP, Laboure AM, Briat JF. Photoreduction and incorporation of iron into ferritins // The Biochemical Journal 1990. 269: 79-84.

96. Le Brun NE, Andrews SC, Guest JR, Harrison PM, Moore GR, Thomson A J. Identification of the ferroxidase centre of Escherichia coli bacterioferritin // The Biochemical Journal. 1995. 312: 385-392.

97. Le Dily F., Huault C., Gaspar Th., Billard J.P. Gabaculine as a tool to investigate the polyamine biosynthesis pathway in habituated callus of Beta vulgaris (L.). Plant Growth Regul. 1993. 18: 221-223.

98. Lee JW, Helmann JD. The PerR transcription factor senses H2O2 by metal-catalysed histidine oxidation // Nature. 2006. 440: 363-367.

99. Lemanceau P, Bauer P, Kraemer S, Briat JF. Iron dynamics in the rhizosphere as a case study for analyzing interactions between soils, plants and microbes // Plant Soil. 2009. 321: 513-535.

100. Lescure AM, Proudhon D, Pesey H, Ragland M, Theil EC, Briat JF. Ferritin gene transcription is regulated by iron in soybean cell cultures // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 1991. 88: 8222-8226.

101. Levi S, Santambrogio P, Cozzi A, et al. The role of the L-chain in ferritin iron incorporation: studies of homo and heteropolymers. Journal of Molecular Biology. 1994. 238: 649-654.

102. Li L., ChengX., LingH.O. Isolation and characterization of Fe(III)-chelate reductase gene LeFrol in tomato // Plant Molecular Biology. 2004. 54: 125-136.

103. Lindsay WL. Chemical reactions in soil that affect iron availability to plants. A quantitative approach // In: Abadia J, ed. Iron nutrition in soils and plants. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers. 1995. P: 7-14.

104. Ling HQ, Bauer P, Keller B, Ganal M. The fer gene encoding a bHLH transcriptional regulator controls development and physiology in response to iron in tomato // ProcNatl Acad Sci USA. 2002. 99: 13938-13943.

105. Liphadzi M.S. and Kirkham M.B. Physiological effects of heavy metals on plant growth and function // Plant-Environment Interactions. Bingru Huang. 2006. Taylor a. Francis Group. P: 243-269.

106. Lipinski P., Drapier JC. Interplay between ferritin metabolism, reactive oxygen species and nitric oxide // JBIC. 1997. 2: 559-566.

107. Liu XS, Patterson LD, Miller MJ, Theil EC. Peptides selected for the protein nanocage pores change the rate of iron recovery from the ferritin mineral // The Journal of Biological Chemistry. 2007. 282: 31821-31825.

108. Lobreaux S, Briat JF. Ferritin accumulation and degradation in different organs of pea (Pisum sativum) during development // The Biochemical Journal. 1991. 274: 601-606.

109. Lobreaux S, Hardy T, Briat JF. Abscisic acid is involved in the iron-induced synthesis of maize ferritin I I EMBO Journal. 1993. 12: 651-657.

110. Lobreaux S, Massenet O, Briat JF. Iron induces ferritin synthesis in maize plantlets // Plant Molecular Biology. 1992b. 19:563-575.

111. Lobreaux S, Yewdall S, Briat JF, Harrison PM. Amino acid sequence and predicted three-dimensional structure of pea seed ferritin // The Biochemical Journal. 1992a. 288: 931-939.

112. Maehly А. С. and Chance B. The assay of eatalases and peroxidases // In: Methods of Biochemical Analysis, Glick, D. (eds.). Interscience, New York, 1954. P: 357-408.

113. Marschner H, Dell B. Nutrient uptake in mycorrhizal symbiosis // Plant Soil 1994. 159: 89-102.

114. Marschner H, Romheld V. Strategies of plants for acquisition of iron // Plant Soil. 1994. 165: 261-274.

115. Masuda T, Goto F, Yoshihara T, et al. Construction of homo- and heter-opolymers of plant ferritin subunits using an in vitro protein expression system // Protein Expression and Purification. 2007. 56: 237-246.

116. Masuda T, Goto F, Yoshihara T. A novel plant ferritin subunit from soybean that is related to a mechanism in iron release // The Journal of Biological Chemistry. 2001.276: 19575-19579.

117. Matysik J., Alia, Bhalu В., Mohanty P. Molecular mechanisms of quenching of reactive oxygen species by proline under stress in plants // Curr. Sci. 2002. 82: 525-532.

118. Meyron-Holtz EG, Ghosh MC, Ixvai K, et al. Genetic ablations of iron regulatory proteins 1 and 2 reveal why iron regulatory protein 2 dominates iron homeostasis // EMBO Journal. 2004. 23: 386-395.

119. Murgia I, Delledonne M, Soave C. Nitric oxide mediates iron-induced ferritin accumulation in Arabidopsis // The Plant Journal. 2002. 30: 521—528.

120. Murgia I, Vazzola V, Tarantino D, et al. Knock-out of ferritin AtFerl causes earlier onset of age-dependent leaf senescence in Arabidopsis. Plant Physiology and Biochemistry. 2007. 45: 898-907.

121. Navarre DA, Wendehenne D, Durner J, Noad R, Klessig DF. Nitric oxide modulates the activity of tobacco aconitase I I Plant Physiology. 2000. 122: 573-582.

122. Nili X, Narasimhan ML, Salzman RA, Bresson RA, Hasegawa PM. NaCl regulation of plasma membrane H+-ATPase gene expression in a glyco-phyte and a halophyte // Plant Physiol. 1993. 103: 713-718.

123. Niu X., Narasimham ML., Salzman R.A., Bressan R.A., and Hasegawa P.M. NaCl regulation of plasma membrane H+-ATPase Gene expression in a glycophyte and a halophyte // Plant Physiol. 1993. 103: 713-718.

124. Nozoye Т., Inoue H, Takahashi Met al. The expression of iron homeosta-sis-related genes during rice germination // Plant Mol. Biol. 2007. 64: 3547.

125. Ogo Y, Itai RN, Nakanishi H et al The rice bHLH protein 0sIR02 is an essential regulator of the genes involved in Fe uptake under Fe-deficient conditions // Plant J. 2007. 51: 366-377.

126. Ogo Y, Kobayashi T, Itai R.N. et al. A novel NAC transcription factor, IDEF2, that recognizes the iron deficiency-responsive element 2 regulates the genes involved in iron homeostasis in plants // JBC. 2008. 283: 1340713417.

127. Ogo, Y, Itai RN, Nakanishi H et al. Isolation and characterization of IR02, a novel iron-regulated bHLH transcription factor in graminaceous plants // J. Exp. Bot. 2006. 57: 2867-2878.

128. Pekker I, Tel-Or E, Mittler R. Reactive oxygen intermediates and glutathione regulate the expression of cytosolic ascorbate peroxidase during iron-mediated oxidative stress in bean // Plant Molecular Biology. 2002. 49: 429-438.

129. Peng XX, Yamauchi M. Ethylene production in rice bronzing leaves induced by ferrous ion // Plant Soil. 1993. 149: 227-234.

130. Peng, X.X. and M. Yamauchi. Ethylene production in rice bronzing leaves by ferrous iron // Plant Soil. 1993. 149: 227-234.

131. Petit JM, Briat JF, Lobreaux S. Structure and differential expression of the four members of the Arabidopsis thaliana ferritin gene family // The Biochemical Journal. 2001a. 359: 575-582.

132. Pianelli K., Mari S., Marques L., Lebrun M., Czernic P. Nicotianamine Over-accumulation Confers Resistance to Nickel in Arabidopsis thaliana II Transgenic Res. 2005. 14: 739-748.

133. Pich A, Manteujfel R, Hillmer S, Scholz G, Schmidt W. Fe homeostasis in plant cells: Does nicotianamine play multiple roles in the regulation of cytoplasmic Fe concentration? // Planta. 2001. 213: 967-976.

134. Ponnamperuma FN, Bradfield R, Peech M. Physiological disease of rice attributable to iron toxicity //Nature. 1955. 175: 275-279.

135. Proudhon P, Briat JF, Lescure AM. Iron induction of ferritin synthesis in soyabean cell suspensions // Plant Physiology. 1989. 90: 586—590.

136. Ragland M, Briat JF, Gagnon J, Laulhere JP, Massenet O, Theil EC. Evidence for conservation of ferritin sequences among plants and animals and for a tr ansit peptide in soybean // The Journal of Biological Chemistry. 1990.265: 18339-18344.

137. Ragland M, Theil EC. Ferritin (mRNA, protein) and iron concentrations during soybean nodule development // Plant Molecular Biology. 1993. 21: 555-560.

138. Ranieri A., Castagna A., BaldanB., Soldatini GF. Iron deficiency differently affects peroxidase isoforms in sunflower // Journal of Experimental Botany. 2001. 354: 25-35.

139. Ravet K, Touraine В, Boucherez J, Briat JF, Gaymard F, Cellier F. Ferritins control interaction between iron homeostasis and oxidative stress in Arabidopsis // The Plant Journal. 2009. 57: 400-412.

140. Reif DW. Ferritin as a source of iron for oxidative damage // Free Radic Biol Med. 1992. 12(5): 417-427.

141. Ridge I., Osborne D.J. Role of peroxidase when hydroxyproline-rich protein in plant cell wall is increased by ethylene // Nature, 1971. 229: 205208.

142. Robinson NJ., Procter СМ., Connolly EL., Guerinot ML. A ferric-chelate reductase for iron uptake from soils //Nature. 1999. 397: 694-697.

143. Romheld V., Midler C., Marschner H. Localization and capacityof proton pumps in roots of intact sunflower plants // Plant Physiol. 76: 603-606.

144. Rouault ТА, Klausner R. Iron-sulfur clusters as biosensors of oxidants and iron // Trends in Biochemical Sciences. 1996. 21: 174-177.

145. Sammarco MC, Ditch S, Banerjee A, Grabczyk E. Ferritin L and H sub-units are differentially regulated on a post-transcriptional level // The Journal of Biological Chemistry. 2008. 283: 457S-45S7.

146. Santos С. V. Regulation of chlorophyll biosynthesis and degradation by salt stress in sunflower leaves // Sci. Hort. 2004. 103: 93-99.

147. Savino G., Briat J-F., Lobreaux S. Inhibition of the Iron-induced ZmFerl Maize Ferritin Gene Expression by Antioxidants and Serine/Threonine Phosphatase Inhibitors // The Journal of Biological Chemistry. 1997. 272 (52): 33319-33326.

148. Sayers DE., Theils EC., Rennick FJ. Iron(III) in the complex with horse spleen apoferritin observed by X-ray absorption spectroscopy // The Journal of biological chemistry. 1983. 258(23): 14076-14079.

149. SeckbackJJ. Ferreting out the secrets of plant ferritin: a review // Journal of Plant Nutrition. 1982. 5: 369-394.

150. Shi H, Bencze KZ, Stemmler TL, Philpott CC. A cytosolic iron chaperone that delivers iron to ferritin // Science. 2008. 320: 1207-1210.

151. Smith JL. The physiological role of ferritin-like compounds in bacteria // Critical Reviews in Microbiology. 2004. 30: 173-185.

152. Stephani K, Weichart D, Hengge R. Dynamic control of Dps protein levels by ClpXP and ClpAP proteases in Escherichia coli // Molecular Microbiology. 2003. 49: 1605-1614.

153. Takahashi M., Terada Y., Nakai I., Nakanishi H., Yoshimura E., Mori S., Nishizawa NK. Role of Nicotianamine in the Intracellular Delivery of Metals and Plant Reproductive Development // Plant Cell. 2003. 15: 12631280.

154. Tarantino D, Petit JM, Lobre'aux S, Briat JF, Soave C, Murgia I. Differential involvement of the IDRS cis-element in the developmental and environmental regulation of the AtFerl ferritin gene from Arabidopsis // Planta. 2003. 217: 709-716.

155. Theil E.C., Briat J.-F. Plant ferritin and non-hem iron nutrition in humans // HarvestPlus Technical Monograph 1. Washington, DC and Cali: Int. Food Polici Res. Inst, and Int. Center Tropical Agricult. (CIAT), 2004. 1: 1-13.

156. Theil EC, Hase T. Plant and microbial ferritins. In: Barton LL, Hemings В eds. Iron chelation in plants and soil microorganisms // New York, NY: Academic Press. 1993. P: 133-156.

157. Theil EC, Matzapetakis M, Liu X. Ferritins: iron/oxygen biominerals in protein nanocages // Journal of Biological Inorganic Chemistry. 2006. 11: 803-810.

158. Theil EC. Coordinating responses to iron and oxygen stress with DNA and mRNA promoters: the ferritin story // Biometals. 2007. 20: 513-521.

159. Theil EC. Ferritin: At the Crossroads of Iron and Oxygen Metabolism // J. Nutr. 2003. 133: 1549-1553.

160. Theil EC. Ferritin: structure, gene regulation, and cellular function in animals, plants, and microorganisms // Annu. Rev. Biochem. 1987. 56: 289315.

161. Toledano MB, Kumar C, Le Moan N, Spector D, Tacnet F. The system biology of thiol redox system in Escherichia coli and yeast: differential functions in oxidative stress, iron metabolism and DNA synthesis // FEBS Letters. 2007. 581:3598-3607.

162. Torti FM, Torti SV. Regulation of ferritin genes and protein // Blood. 2002. 99:3505-3516.

163. Touati D, Jacques M, Tardat B, Bouchard L, Despied S. Lethal oxidative damage and mutagenesis are generated by iron in fur mutants of Escherichia coli: protective role of superoxide dismutase // Journal of Bacteriology. 1995. 177: 2305-2314.

164. Touati D. Iron and oxidative stress in bacteria // Archives in Biochemistry and Biophysics. 2000. 373: 1-6.

165. Towin, H; Staehlin Т., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrilamide gels to nitrocellulose sheets // Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1979. 76: 4350-4354.

166. Truty J, Malpe R, Linder MC. Iron prevents ferritin turnover in hepatic cells // The Journal of Biological Chemistry. 2001. 276: 48775-48780.

167. Van Wuytswinkel О, Briat JF. Conformational changes and in vitro core formation modifications induced by site directed mutagenesis of the specific amino terminus (EP) of pea seed ferritin // The Biochemical Journal 1995. 305: 959-965.

168. Van Wuytswinkel O, Vansuyt G, Grignon N, Fourcroy P, Briat JF. Iron homeostasis alteration in transgenic tobacco overexpressing ferritin // The Plant Journal. 1999. 17: 93-97.

169. Vert G, Grotz N, Dedaldechamp F, Gaymard F, Guerinot ML, Briat JF, Curie C. IRT1, an Arabidopsis transporter essential for iron uptake from the soil and for plant growth // Plant Cell. 2002. 6: 1223-33.

170. Vert G., Briat JF., Curie C. Dual regulation of the Arabidopsis high-affinity root iron uptake system by local and long-distance signals // Plant Physiology. 2003. 132: 796-804.

171. Von WN., Marschner H., Romheld V. Roots of iron-efficient maize also absorb phytosidyrofore-chelated zinc//Plant Physiology. 1996. Ill: 11191125.

172. Wade VJ, Treffry A, Laulhe >e JP, et al. Structure and composition of ferritin cores from pea seed // Biochimica et Biophysica Acta. 1993. 1161: 91-96.

173. Waldo GS, Wright E, Wang ZH, Briat JF, Theil EC, Sayers DE. Formation of the ferritin iron mineral occurs in plastids: an X-ray absorption spectroscopy study. Plant Physiology. 1995. 109:797-802.

174. Wang J, Fillebeen C, Chen G, Biederbick A, Lill R, Pantopoulos K. Iron-dependent degradation of apo-IRPl by the ubiquitin-proteasome pathway // Molecular and Cellular Biology. 2007. 7: 2423-2430.

175. War drop A J, Wicks RE, Entsch B. Occurrence and expression of members of the ferritin gene family in cowpeas // The Biochemical Journal. 1999. 337: 523-530.

176. Waters В M., Blevins DG., Eide DJ. Characterization of FRO 1, a Pea Fer-ric-Chelate Reductase Involved in Root Iron Acquisition // Plant Physiol. 2002. 129: 85-94.

177. Winter K., Holtum J. A. M. Environment or Development? Lifetime Net CO2 Exchange and Control of the Expression of Crassulacean Acid Metabolism in Mesembryanthemum crystallinum II Plant Physiology. 2007. 143: 98-107.

178. Zancani M., Peresson C., Biroccio A., Federici G., Urbani A., Murgia I., Soave C., Micali F., Vianello A., Macri F. Evidence for the presence of ferritin in plant mitochondria // Eur. J. Biochem. 2004. 271: 3657-3664.

179. Zer H, Peleg I, Chevion M. The protective effect of desferoxamine on paraquat-treated pea (Pisum sativum) // Physiologia Plantarum. 1994. 92: 437-442.

180. Zhao G, Ceci P, Ilari A, et al. Iron and hydrogen peroxide detoxification properties of DNA-binding protein from starved cells: a femtin-like DNA-binding protein of Escherichia coli // The Journal of Biological Chemistry. 2002. 277: 27689-27696.if 0

Информация о работе

Ешинимаева, Бэлигма Цыденжаповна
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.05

Диссертация

Влияние дефицита и избытка железа на активность антиоксидантных ферментов и образование ферритина у растений хрустальной травки - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Влияние дефицита и избытка железа на активность антиоксидантных ферментов и образование ферритина у растений хрустальной травки - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы