Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Оптимизация условий культивирования Melissococcus pluton в лабораторных условиях и разработка реакции коагглютинации для его индикации

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Оптимизация условий культивирования Melissococcus pluton в лабораторных условиях и разработка реакции коагглютинации для его индикации"

з ин

') 1 Р"Ч >л<М

/ ULIli ii/Jü *

ВСЕРОССИЙСКИЙ НтЮ-ИСОтЮВАТгМСШГЛ' ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТА.®!.!. -Л DETEPiDiAPJ-DI им. Я.Р.Ковалонко (БИЭВ)

российская акадыш сшгьскохозяйстеышх НАУК

(РАСХН)

На правах рукописи-ЧШШШВА ЛАРИСА ВЛЩС.11!К)БНА

ошпшзщш УСЛОВИЙ ШЪ'ДШИРйЕЛШШ MüLISSOQCX'CtfS PLÜJCH В ЛАБОРАТОРНЫХ УСЛОВИЯХ И РАЗРАБОТКА Р1АКЦИИ ШГЩШШДШ ДЛЯ ЕГО ШЩИКАЩШ

03.00.07 - Микробиология

Автореферат на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1993

Работа выполнена во Вс.ероссййском научно-исследователь-ком институте экспериментальной.ветеринарии им. Я.Р.Крвалэико.

Научные руководители: Заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор О.Ф.ГРОБОВ,

доктор ветеринарных наук Э.А.ШЕПЩЕВИЧ

Официальные оппоненты: доктор биологических наук М.М.ИНТИЗАРОВ (МВД), кандидат ветеринарных наук А. К. ЛИХО "ШН

Ведущее учреждение - Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (БНЖВСГЭ).

Защита диссертации состоится " 1993 г.

в часов на заседагаш специализированного совета Д 020.28.01 по защрте диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринария им. Я.Р.Коваленко по адресу: 109472, Москва, Кузьминкн, БИЭВ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ.

Автореферат , разослан ^S&ZjZz&Z- 1993 г. '

Ученый секретарь " ч

специализированного совета,

кандидат ветеринарных наук Ф.Г.ТЕРЫШФВ

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Среди ннфекциошшх заболеваний медоносных пчел по распространению и наносимому экономическому ущербу европейский гнилец занимает одно из первых мест. Гнилец обнаруживают на всех континентах в местностях, где развито пчеловодство.

Европейский пшлец - сборное понятие, охватывающее группу болезней расплода, которые при некотором сходстве внешних признаков имеют различную этнологию. По данным L.Bailey (1957, 1969, 1984), E.W.Herbert, H.Shiraanuki (I9B4), основным причинным'агентом заболевания является Ие11азососсиз pluton (G.F.White), роль других микроорганизмов, обнаруживаемых при данной болезни, отрицается. В отечественной литературе в качестве возбудителей европейского гнильца рассматривают п.pluton, Bec.alvei, Ent.faeoalia (В.И.Полтев, 1964; А.М.Смирнов, IS84 и др.). Французские, немецкие исследователи (A.Borchert, 1974; W.Fritzsch, Й.Вгешег, 1975; A.Brizard, J.Albiaefcti, 1977) И некоторые отечественные авторы (О.Ф.Гробов, Л.Н.1уэева, 1992) считают, что существуют три самостоятельных заболевания: европейский гнилец, вызываемый M.plcitoa, доброкачественный гнилец (возбудители Bac.alvei, Bao.laterosporus)t кислый гнилец (возбудитель Enfc.faeoalio). Несмотря на различив -»тих взглядов, роль м.pluton, как причинного агента поражения личинок в настоящем считается признанной.

1Л.pluton открыт в 1908 году G.F.white. Описан им в 1912 году под названием Bacillus pluton. В 1957 году микроорганизм был охарактеризован на основании морфологических особенностей как Streptococcus pluton (L.Beiley, 1957). В последние годы он рекласси.м'цпрован как типовой вид нового рода

Helissococcus по нуклеиновой кислоте, содержащей в клетке 29-30$ молекул гуашш+цитозин против характерного для рода Bfereptococcus 35-44$ (Ь.Baile/, U.Collins, 1982).

Идентификация U.pluton на основе бактериологического исследования осложняется трудностью выделения бактерии из патологического материала из-за частого присутствия других микроорганизмов, угнетающих размножение искомого возбудителя. Некоторые аьторы считают, что из личинок последней стадии разложения ü.plufcon невозмо^чо виееять. Для выделения данного микроорганизма требуются специальные среды и условия культивирования. Значительные осложнения в изоляции бактерии и ее идентификации обусловлены также морфологической вариабельностью M.plutoa. В лабораторных условиях на искусственных писатель- . них средах поддерживать U.pluton удается непродолжительное время.

В последние года в нашей стране получили широкое применение серологические методы исследования некоторых заболеваний медоносных пчел. К сожалонию, диагностика европейского гнильца путем серологической идентификации отсутствует, нет данных по идентичности шташов ü.plutoa. В связи с этим весьма актуальна разработка простых, высокочувствительных, специфичных, экс-

•v.

прессшх методов диагностики возбудителя европейского гаильца.

Цель и задачи исследования.

Целью исследования является разработка специфичного, чувствительного и экономичного экспресс-метода индикации возбудителя европейского гнильца пчел. В соответствии с поставленной целью в задачи исследования входило:

I. Выделить культуры ii.pluton из патологического материала из различных регионов страны.

2. Изучи тт. морфологические, культуралыше и биохимические особенности выделенных штаммов М.рХиЪоп.

3. Разработать оптимальные условия для роста ,и.р1и1;оа с целью максимального накопления бактериальной масси.

4. Полугать пшериммунную сыворотку на Ц.р1иЪоп, отработать условия приготовления диагностикума и проведения реакции коагглютинации (РКОА).

5. Провести сравнительные исппташш серологических методов'индикации bl.pl.uton в пробирочной и капельной реакции агглютинации (РА) и РКОА.

Научная новизна. Отмечены штаммовые различил ¡Л.р1йЬса, выделенных из различных регионов России и блшшего Зарубежья, а также показаны некоторые биологические особенности возбудителя европейского гнильца пчел, отношение ь'.р1цЬол к различным питательным среда!,!. Определена скорость размножения данного микроорганизма в организме личинок при экспериментальлом заражении.

Практическая ценность. По результатам проведенной работы разработаны: "Лабораторный регламент изготовления диашостику-ма для тнпирования культур возбудителя европейского гнильца медоносных пчел", рассмотренный и одобренный Методической ко-тлиссиеЛ БПЭВ (10.11.92 г., протокол № 10), Ученым Советом ВНЭВ (10.11.92 г., протокол И 16), и метод индикации Ц.р1иЬоп , с помощью-РКОА; предложен способ длительного поддержания li.pl.uton в лабораторных условиях.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены на Всероссийской научной конференции "Зкологаческиэ проблем! глвотноводотва" (Троицк,

1992 г.), моклабораторном совещашщ сотрудников В1ЮВ (20 июня

1993 г.).

Луоликагши.

По ьатирналам диссертации опубликовано 2 статьи.

Острукт.у].а циосертации.

Диссертация изломана на ■/У? страницах шшшописного текста и состоит на введения, обзора литературы, собственных мсслбдоканий, ыишчшццх разделы "Материалы и методы", "Результаты исследований'', обсуждение, выводы, практические предложе-Ю1Я, описка литературы, содержащего отечественных и заруоешпх ието'пшлоь.

г. МАТШШШ и ышдо

Исследования проводили в период с К8У по 1992 гг. б лаборатории профилактики полезней и экологической охрани пчел, ни карантинной пасеке ЫШ, а такхе в неблагополучных хозяйствах, где о ил зафиксирован европейски!! пшлец медоносных пчел.

За указанный период ь опытах по заражению находилось 8 кроликов, около 500 личинок пчел. Для выделения ы.р1иЬоп была исследована 51 проба пораженных личинок, полученных из различных регионов страны (Московская, Калининская, Калужская, Амурская области, Краснодарский край) и Казахстана.

В работе использовали эпизоотические штаммы 1!.р1и1оп № 531, "3", "К", "Л", выделенные из патологическо.го,материала, присланном из Московской,'Калужской, Амурской областей и Казахстана; Ьыо.еЪгб! типовой шташ: В - 502 - АТСС 6314, штаммы 333, 332; Ьао.1вЬегоарогиа юте.:*;.« 424, 499, а также КиЪеюсосоиБ ^оесаИв штамш 180, 52, 324 из музея микроорганизмов лаборатории профилактики болезней и экологической охраны пчел ВИЭВ.

Выделение М.р1и1оп и изучение морфологических и культу-

ралыю-Люхимнческих свойств исследуемой группы микроорганизмов производили согласно матотапесгаш рекомпнданням по пабора-торпой диагностике американского гнплъиа, европейского гнчльпа, парагпилыщ, септпиомии и сальмонелле;«! пчел (А.П.О.'ирнов и др., I98t'0, а такле npymm оСвепрянятнг»» мотоци'го я ппвгчрчо-логип (ij.O.Fnprep, 1981). Билочую прпналлечноцтт. ишелчнних культур шкрооштитз'-лов устанавливали чг- опрол®'<*:т«лпм (ti.И. Нолт<т>, T0G4; Еердхе, I98G), в сравнении с 1!г:рн;п'"чся глпо*н-ми культурами.

Ллп первичного г-нла-тения. кул*трвяюоййялл и мпкоплчпия бпктешошгей тгон U.pluton целюнеялп рячлпчши; питательные среды. как твердые, так ч кчлгля: стандартная егег< Беилп. а такие составлении« по интернатам работ Вопли п Коачянзд (среда J,1"- Т с пептоном, спела 2 г пептоном v тшгтрино" ч випе чрпто-но-иисточчорогс). атара (!Г!1А) п яплкоИ попт'то-т'етсщно^И сро-дн). Б исследованиях тякяе использовали среды, *л>оп.ноз!топнч<з для культивирования культур тканс-íi ч клеток, ?пхоиля?м 'ír..l-с, обогащенный T(r¿ сыворотки лошади, T'J'A. г.гепа д 19Э, 0,3,1 агар из перегара блчьего сорпца, обоп«цоп»шй 2Ц? сыворотки лота пи).

Дта опрелрпетя накопления вопбултгап" в »"щ л:нтшск гртел v гчярлеиял сохр^ппоот!* патогенннх сгоП':тч n.piiifcon ит. 531 я ходе длительного лабораторного ку.:гг,тптч1роргпт и ппс(пп?!тослтп1Я. " иассе:;е лпнпой культу он пробел" лпчлчок медоносных тол 3-4-лн®гного возраста, kv'тьтивируомад л условиях лаборатории на 'iwax Потри на ор'ще Чихаатя-Лс'та-мгвича (водопровопипя вела, натурп.'г-.нгп цоп„ 'М'отракт ».та чпстчо пекарские лро"т:п в соотчо'чотпт (>,5:?.,гу: I).

Зарплате осуществляли онгчшапыпм >в'к]ои«ъ'.?кторгед. ifa

головной конец личинок опытных групп наносили бактериосодержа-щий материал в концентрации 10 млн.бак.кл/мл в дозах 0,03 и 0,025 мкл. 'Личинок контрольных групп содержали в отдельных чашках Петри на чистой питательной среде, на ротовой конец наносили физиологический растЕор в таком ке'объеме. Осмотр личинок проводили через каждоз 24 часа. Повторность опытов трехкратная. Длительность опыта 6 суток. Полученные данные были подвергнуты статистической обработке по общепринятым методикам (Ю.К.Баюн, 1989).

Для изготовления гипериммунных сывороток при иммунизации кроликов в качестве антигенов использовал) штаммы микроорганизмов: M.pluton шт. 534; Eec.elvei шт. 332, Bac.laterospo-rua шт. 424, 499; Eaterococcus faecalis ит. 180.

Антигены готовили в концентрации I млрд. микробных клеток в I мл, путем сшва-суточной культуры с поверхности HIIA, а в случае с m.pluton брали 4-6-ти суточные культуры, выращенные на жидкой поптоно-цистеиновой среде, трижды отмытые в стерильном физиологическом .растворе центрифугированием при 3000g в течение 10-15 минут с последующим ресуспендироЕанием до указанной концентрации. Материал разливали во флаконы по 1-2 мл и замораживали (-4°С).

Иммунизацию кроликов осуществляли трехкратно по следующей схеме: I мл антигена смешивали с полным адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1 и вводили кролику в подушечки задних лапок по 0,2 мл, в бедренные мышцы по 0,5 мл и внутршсокно в шести точках спины по 0,1 мл; вторую и третью внутривенные инъекции антигена проводили без адъюванта в объеме I мл в той же концентрации соответственно через 21 и 28 дней. В процессе иммунизации кроликов через глгдае 7 дней брали кровь из ушной

- д -

веш для опрс.членая титра сывороток. Обескровливании животных проводил;! иа У-10 день ¡¡осле последней ппьекцпи, крсы брали из сонной артерии ты из сердца в стерильные колбы, Ы1дир>л1ла— ли при 37° I час, образовавшлнся сдусток йуд.ишли от сзе-пок стерильнцна стеклятшмп калочхаш. Hoo.se охстсштшяя ~ри 4° в течение 10-20 часов отделившуюся сыворотку отсасиьил! оте/лы»-н пипетками, а в случав необходимости, для осводьздешш от эритроцитов, центрииунфовалн при ,*30С0 в 10 мшу т. л полученным сивориткш.1 ди&шлшш шртио.'шг до конечной кошшитрациа 1:10 ООО, хран.ч;т в з.ччороиениом м«де. От каг-пого крдеака било получено около 50 ил сыворотки.

Активность и специ&плость ш~ыуч&шшх гигюрлигуклих сывороток определяли в реакции агглютинации в пробирках, придерживаясь методики Б.А.Трцд-.-пкс (15ЬЗ). Постановку реакции мнкрс-агтлютннто.и проводил! согласил общепринятой методою.

Ка основе■ птерш.ь.гунной еыворогкн проань и.р1июи ¡иг.531 II стафилококкового реагента (взваеъ 31арЬу1саоссП1; аигеаа ttTaj.i-.ia Са>лвп-1), выпускаемого Саикт-Петорбургским научно-исследовательским институтом эпидемиологии и микдобпэдсиш ии. Л.Пастора, готов:иа коагииотинпрунщи; реагент, необходимый для постановки РГОА. Предварительно осуц«стшшла контроль си- • воротки на содержите противостаГилокскког.ых антител и антлтел к тканям личинок; на предметном стекле сиеиявали ее о вдовев 1СЙ суспензии стафилококкового реагента или с Ш}', экстрактом из здоровых личинок.

Отрабатывали условия приготовления диагностику;®, получения антигена из больных и 'погибе'х личинок пчел и постановки реакции. Каждый опит сопровождали несколькими отрпнательговт контролями: стафилококковый реагент, сенсибилизированный нор-

мальной сывороткой + испытуемый антиген; гоагглттиниругощпй реагент + экстракт из заведомо здоровых личинок пчел; коагглюти-ниругвдп" реагент + физиологический раствор; испытуемый антиген + физиологический раствор. В качестве контрольного положительного антигена использовали смыв 4-6-суточной культуры M.pluton шт. 534 с жидкой пептоно-цпстешювой среды в кон-

q

центрации 10 бак.кл/мл. Постановку РКОА осуществляли в виде обычной роакши на стекле. Определяли условия и длительности, храпения диагностикума и контрольного положительного антигена. СпециЛпкость ГША проверял!. путем постанови; перекрестных ре-агалй с гомологичным и гетеролопгпшми антигенами. ГКОЛ сравнивали с РА (капельной и пробирочной).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Выделение Lfelissocqccua pluton из патологического материала

Работа проводилась совместно со старшим научны?.! сотрудником лаборатории профилактики болезней и экологической охраны пчел ВНЭВ Л.П.Гузевой.

При бактериологическом исследовании использовали патологический материал (больше и погибшие личинки с коническими I признаками гнильцов), доставлешш'г с II пасок страны и ближнего Зарубежья. Из 51 пробы в 45 (88,2%') били выделены возбудители гнильцовнх заболеваний.

M.pluton выявлено 5 культур из 51 пробы (9,8;?). Обнару-1 , лея только в ассоциации с другими микроорганизмами: Bac.alvei, Erfc.fEecsliB, Bec.elvei + Ent.fbocbIIb. M.pluton установлен в пробах, получении* из Московской, Калукской, Амурской областей и Казахстана. Наиболее часто встречался с Bnt.faeoelis (I.5J';).

Bac.el.vfci выделено 23 культуры из 45,1% проб. Самостоятельно обнаружен в II пробах (5,3$). Б ассоциации встречался с И.р1и1;оп, ^п!;..СаесаНз, 1.1.р1и-Ьоц ЕпЬ.ГвосыНа.

КаЬ.ГаесаНа выделено 1С культур из 31,4/» проб. Возбудитель кислого гнильца встречался как самостоятельно (3 пробы -1,53/0, так И В ассоциациях С Вбс,еЬ/е1, М.рЫЬоп, Bac.aJ.vei + + М.р1и1;оп.

Вао .1а1егоерогиа выделена I культура (I, в ассоциации с вбоиз материала, поступившего пи е/з Акатьев-ский Коломенского района московской ооласти.

Полученные данные подтверждают результаты ранее проведенных работ по частому выявлению Ц.р1цюп в ассоциации с другими микроорганизмшла на территории нашей страны.

3.2. Морфологические, культуралглше л биохимические особенности яьИззоооооиа р1иЬоц

Ц.р1иЬоп (шт. 531, "К", "Л", "О") - кокки удлиненной Форш, размер 0,7-1,5 мил, встречаются одиночные клетки и клетки, расположешше цепочками пли в скоплениях ("пакеты", "гроздья", "розетки"). Грампозитивны, спор не образуют, неподвижны, кислотоустойчивы. Анаэробы до мпкроазрефплов. tt.pJ.uton не растет на обычных питателышх средах. Оптииаи -¡ал температура культивирования 35°. Оптимум рН среды 6,5-6,6. На поверхности специальных питательных сред (Бейли, пелтонс-цаетешюЕом агаре) через .3-6 суток образуются мелкие росинчатые бе пне колонии плотной консистенции, примерно I ш в диаметре. На жидкой пептоно-цистенновой среде растет в виде хлопьев, выпадающих в осадок на дно и стенки пробирки. При встряхивании осадок поднимается в виде косички, а затем полностью разбивается.

В биохимическом отношении u.pluton ферментирует глюкозу, фруктозу (с образованием кислоты), штамм 53-1 и "Л" наряду с , этими углеводами расщепляли также мелицитозу (на I" пассаже культуры они потерял; эту способность). Не ферментируют машшт, дулырт, лактозу, сахарозу, араблнозу, декстрозу, салицин, глицерин, инулин, крахмал;- не разиикают MID,:; не коагулируют молоко; не образую? индол и сероводород; не используют цитраты.

Выделенные rniKpoopz^aiuiз:.ти из проб патологического материала с территории наией страны по свой'.т морфологическим, кулъту-ралншм и биохимическим свойствам соответствовал) U.pluton. Отличи о выделенных изолятов было незначительным и касалось растепления мелпцитозы.

3.3. Подбор питательных сред для первичного выделения и длительного лабораторного культивирования Uolisoococcus pluton

В связи с трудностью культивирования li.pluton, особенно при первичном выделении из патологического материала, изучали возможности'использования различных питательных сред, которые бы отвечали требования,! максимального накопления бактериальной паесн данного микроорганизма, определяли оптимальные условия f для поддержания роста и развития бактерии при про доли! тельном культивировании. В ходе исследований, при первичном выделении возбудителя 0,5 мл суспензии патологического материала, приготовленного путем растирания 10-15 погибших от европейского гнильца личинок в 5 мл стерильного физиологического раствора воевали на среду Еейлн и специальные питательные среда. Инкубирование на данных средах проводили в анаэробных условиях при температуре 35°. Осуществляли егедаовтй контроль за пнтен-

сивностыо и особенностями роста культур на различных питательных средах в течение всего периода инкубации.

На среде Еейли на 4-6 сутки культивирования репродукция микроорганизма состаппла Г08-Ю9 бак. кл/мл. Бозбудптел* европейского .шильца рос в виде точёчтх колоний белого щзота с чуть выпуклым центром и ровными крат®. На ерэле Г' 1 о пептоном отмечали подобии?! рост на 5-? день культивирования. Количество бактериальных клеток в I мл по оптическому стандарту Я о

мутности составило 10-10 бак кл/мл. На пептоно-пл стой новом агар? появление отчетливого поста n.plutun наблюдали тга 3-6 сутки. IМикроорганизм рос в виде колоний белого цвета диаметром 0,0-1,5 гил с четким центром и зевнистой периферической частью. Размеры колоний варьировали от 0,6-0,9 до 1,5 мм в диаметра. На этой питательной сред? репродукция чтакрооргяиип.ма на 3-G сутки составила 10®-1(Г бак кл/мл. На пидкой пептонс-цчстртшо-вой среде также получены положительные результаты. Интенсивность роста M.pluton к 3-6 суткам инкубирования составила IÜ^-10® бак кл/мл. Бактерия росла в виде хлопьев на дне и стекках пробирки, при встряхивании осадок полностью разбивался.

После 3-4 пассажа на средах Еейли и среде I с пептоном роста культуры M.pluton не наблюдали, На среде № 2 (пептоно-цистечновни агар) рост не отмечался после 5 пассаиа, на жидкой пептоно-цистепновой среде M.pluton хорошо развивался в течение 13 пассажей (пересевы производили через 15-20 дней, срок наблюдения I год 2 месяца). Лдя контроля за чистотой культуры возбудителя европейского гнильца в жидкой пептоно-цистеиновой средо осуществляли параллельные посевы M.pluton на МПА, культивирование проводили в аэробных условиях прт,1 температура Хр в течение 24-48 часов.

На средах, ФГМ-с и среде 199, к шестым суткам культнЕиро-

о а

ваши получен обидъшй рост микроорганизма (10 -Ш бак.кл/ми), а первых двух пассаках культуры, но последующие пересевы не дали положительного результата. 11а средах, ФГь1-с, обогащенной

сыворотки лошадл, ГМ, на шестые сутки находилось J0'1 бак.кл/мл, пересевы не удались. На 0,$> агаре из перевара бычьего сердца роста li.pluton не отмечали.

Дли успешного культивирования u.pluton необходимо добавление ь используемые среды глюкозы. Благоприятной для роста бактерии являйся среда, содержащая 1,0-1,5$ глюкозы. Ьакно также. рН среди. Наилучше результаты получены на нидкей пепто-»¡о-цистеяноБой среде с pli 6,5-6,li. Интенсивное накопление биомассы M.clatur, происходит при анаэробных условиях ъ присутствии С0о и температуре культивирования 30~55°С.

Таким образом, наиболее приемлемой средой для накопления бактериальной пассы M.pluvon и длительного поддержания его в ' лабораторных условиях является нидкая пептоно-циотеиновая среда с содержанием 1,0-1,5$ глюкозы. В I мл этой среды на 6-7

9

сутки культивирования накапливается около 5x10 бак.кл/мл.

В то ке время в I мл смыва с поверхности пептоно-цистеинового -

с;

агара можно получить в среднем около 6x10 микробных клеток. Па хидкой пептоно-цистеиновой среде возмоино выращивание возбудителя без использования С02 (в мнкроаэрофилышх условиях). Полученные данные по влиянию на рост M.plutoa содержания глюкозы в средах, рН, роли температуры и необходимости С09 при культивировании этого микроорганизма подтверждают ранее известные сведения.

3.4. Накопление возбудителя европейского пвшца в теле личинок мелоносянх ггтол

Культивировать B.plnkotr гаг. 531 я течение 7 пяссатеЯ па пептоно-цистеиновой сре?е нй' вз^таяе? его иатогешшт: свойств для 3-4-х днсвних лтгпток, íTm ^чражеята п догах 250 и 300 микробных клеток/особь (0,С25 * 0,03 ?жл) вог-гбулителъ приводит к 100$ гибели личинок зг? т ггн? гггп 40?? rnr-е.та е контроле, Вречя проявление яябсюгжтя я гггбель зипяппа иякодятс.«! в прямой зависимости от wv*r»ecwr 7тг?еттровачн"7: «»нкробтлс клеток. При скариглванип дятптогаег т •TO'J яифоАннх метек наибольшая гибель (34,4$) била -терет» 7Л чпгя. При шосекиз 550 ипкробных клеток наибольший проотч? <4Т,7?> гиболтг о-тммзя не. 3 сутки. Количество бактввягатапа: ютчтггк за I '»«»с г парий день после заражения в среднее уя<?готпгето<?5 в О, Ti разя, второй - в 0,07 раза, л третий — ж Й'.М раза и ч тегеерткЛ -в 0,03 раза. Суточное обнарутечл*»' ятеппчетвя М7ярооррэтаз«ов в I г ткавп хозяина не загпепл)' отт зетветяицей ногти. Так, при скарг.шшанип 300 клеток на личинку уяязанпая навеска ттагга личинки в среднем по опнту сотсряи® тптгегр 953,3 зиетки, 48 ч - 4182,3 клетки, Тг т - 498ХЯР кжтет, 96 ч - 5678.7 клетки; прп даче 250 микробннт клетстгЛшгпптна соотр^тстр^пчо 3853,3; 4342,7; 4811,7 и 4787 ютггяг. В среднеч I г ткпш погибшей личинки содержал 4700 клеток тапера организма, что укпзп-. вает на преимущество культуральнотт способа накгшлетптя бчемдр^ сы микроорганизма.

3.5. Разработка РКОА для индикации ^lib^OGOCQUt.'. pluton

-\ктиьност1. и снопи.ичноеть получениях сывороток. В про-цосси иммунизации Tnvpu сыворотки крови кролика в реакции мик-роаггшлглшацти к гомологичному шт^ь.ту u.pluton изменялись сле-дуллигл образом: через У и 14 дней посла первого введения антигена - 1:600, а 26 де:и - 1:1600; ь момент обескровливания - i:6-100. Перекрестных реакций с гетерологичными антигенами гапзраммуиная сыворотка не давала. Во всех контролях (контроль сыворотки и антигена) была отрицательная реакция.

Условия приготовления компонентов для постановки РКОЛ и условия ое проветптя. Для уенеиного проведения РКОЛ необходимо было отработать процесс сенсибилизации стафилококкового реагента специфической гипераммунной сывороткой; методику проведения РКОА с ку.льтурельным антигеном и.pluton; методику приготовления антогена из личинок, пораженных ы.pluton, а также материала из здоровых личинок; определить условия правильной постановки РКОА и учета ее результатов; специфичность и чувствительность данной реакции; установить всзмокность консервирования хоагглютинпрующего реагента и антигенов, условия и время ХрЛЬЫШЯ. ,s

Наиболее эффективный диагностику» получается при использовать: 10,"¿-ной взвеси стафилококка, оптимальным соотношением сыворотки и стафилококка является 1:1. Процесс сенсибилизации необходимо проводить при комнатной температуре (18-20°) в течения 30 минут, с последующим однократным отмыванием стафилококка от несвязавшейся сыворотки при 3000g в течение 15-20 минут.

Антиген из погибших от европейского гнильца личинок гото-

вили в виде 10$-ного экстракта путем гомогенизации 5 личинок в 5 мл физиологического раствора с последующим прогреванием полученной суспензии на водяной Оане при 65-70° в течение 5 минут, отстаиванием в течение 5 минут после двухкратной

фильтрации в горячем виде, сначала через бумажный фильтр, а затем через бумажный. Наиболее четкая реакция с интенсивностью в 4 креста получается при использовании равных объемов 25?-ной взвеси диэгностикума и антигена /соотношение 1:1/.

Антигены, полученные из бактериальной массы при смыве культуры с пептоно-ияетеиновой среды и из погибших личинок, подготовленных вютеописачным способом, вели себя в реакции идентично. Срок учета реакции составил 3-5 минут.

При испытании диагностикума на специфичность были получены положительные результаты с гомологичным антигеном, в то жа время л реакции с гетерологичными антигенами и с физиологическим раствором диагностикум не реагировал.

Хранение при комнатной температуре неконсервированного диэгностикума и контрольного положительного антигена, приготорлт-

них для РКОА, ведет к снижению их активности через 5 дней и

о

через Ю дней - в условиях 4 С. Консервирование мергиолятом /до конечной концентрации 1:10 ООО/ позволяло хранить препараты в условиях -4°С в течение 6 месяцев /срок наблюдения/. При +4°С титр антигена, выявляемый диагностикумом, к 3-4 месяцу изменился /1:1б+-<- и 1:?'+++/. при комнатной температуре данные лрепчр'эты значительно теряли свою активность и чувствительном /1-.Р+++/.

И ГЛ антиген ¿1.р1иЬоп (смыв чистой кулыури) выявляли в концентрация Ю'1 блк.кл/мл, в ГКОА - в концентрации 10^ бак. кл/пл. Ь Г0'>-чом экстракте с помочью РКОА возбудитель бил обнаружен в экстракте, разведенном до 1:10, а в РА антиген обнаруживали только в {^разведенном виде.

ГКОА прм »'няилрйии антигена |«> вавепп чпстоИ культуры била в 10 раз чувствительна''. РА и в 16 раз - при обнаружении ого в Ц#-1г:ч скстркте из тгшнэк, погибгнх от й.р1иЬоп.

Но сравнении о РКОЛ, капельная реакция агглютинации на стекло (;о пригодна дия точной и окончательной индикации возбудителя европейского rmm.ua. 'Пир сыворотки при проведении РА шкроагглэтннап/ш на стекло составил 1:800, при постановке перекрестных реакции отпечена чеспвцНаческ&я атг-откнаотя гшгориммунной сыворотки fJ.pl ц';оп с гетерологичшгм антигеном КпЪ.£иесаНа шт. 180. В РКОА подобных нсоп'-цн^пческих реакций но наблудили. 2^-ный диагностику:.!, приготовленный путем обработки 10#-ной взвеси стафилококка спецнТпческой сывороткой из расчета 0,5 мл сыворотки на 2,0 мл взвеси, позволяет провести около 200-250 реагапш коагглгпчщацпи, тогда к.ак такое Ре количество сыворотки расходуется ДЛЯ псотаноЕкп всего дъух. реакций агглгтииашш. Для проведения одной пробирочной реакции агглютинации требуется 0,5 мл антигена, а для РКОА - 0,025. Следовательно, по сравнении с пробирочной реакцией агглютинации ГКОА в 100 раз окономпчнео по расходу спецафмескоП гвпер-иммунной сыворотки, в 20 раз экономичнее по расходу антигена,

а самое гла!!:;-'=э, в точенае 20-25 минут поэволнот поставить диагноз, тогда ак для постановки ГА требуется 1Н-2-1 часа (55-60 раз).

Ис^довастеИ.ЩА ■ 'Ьиде разработки метода РКОА 51 проба патологического материала, исследованного бактериологическим методом, била подвергнута псследованию с помощью данной реакции, а такко параллельно ьтаыигл РА (капельную и пробирочную).

Бо ид х случаях бактериологического виполбяия диагноз Спч подтвержден в РКОА и РА.

Однако, в двух случаях при предварительной проверке антигенов, приготовленных из гслиейках личинок, в РКОА получены неспецифические реакции.

. Устранение неспоцнфическоИ агглютинации прэизшдшш по методике, списанной Г.1:1.Аветисян (19Ьу), путем истощения экстракта стафилококком маша Сокеп-Г и в одном случае был достигнут положительный результат, но в проое аз Ставропольского края, при наличии в материале Вас.а1уе1 И ¿иЬ.£веаа-11а, неспедо^пчеекую реакции не удалось избегать поело пятикратного ИОЮ1ЦС1ШЯ вышеописанным способом. Таким образом, РКОА при индикации Ы.р1иЬсп в патологическом материале позволяет получить результат в 98,9/5 случаев.

ВЫВОДЫ

I. В исследуемом патологическом материале ы.рХиЬсп установлен в ассоциации с другими шкроориишэиаш. Выделенные шташы возбудителя отличаются друг от друга способность» ферментировать мелицитозу.

2. Максимальное накопление бактериальной массы JU.pluton наблюдают на поптоно-цистеиновом агаре в условиях 5$ С02 и киДкой пептоно-цистеиновой среде, содержащих 1,0-1,5$ глюкозы, рН 6,5-6,8 при температуре культивирования 30-35°С.

3. Кидкая пептоно-цистеиновая среда отвечает требованиям дательного виращиЕания культуры M.pluton, интенсивность роста данного микроорганизма к 3-6 суткам составляет 10^-10® бак.кл/мл.

4. При заражешш личинок 3-4-х дневного возраста в дозах 250 и 300 шкробных клеток/особь на 4 день отмечена 100;» га-бель расплода. Время проявления заболевания и табель хозяина находится в прямой зависимости от количества инъецщювашшх микробных тел. Количество бактериальных клеток за I час в первый день после заражения увеличилось в 0,13 раза, во второй -в 0,07 раза, в третий - в 0,04 раза и в четвертый - в 0,03 раза. В среднем в I г личинки, погибшей в. ходе экспериментального заражения, содержится 4700 клеток микроорганизма.

5. Активный диагностику« для РКОА готовят сенсибилизацией 10^-ной взвеси стафилококка гипериммунной сывороткой в соотношении 4:1 при комнатной температуре в течение 30 минут. Стафи-

I лококк отмывают от несвязавшейся сыворотки центрифугированием ; при 3000 g в течение 15-20 минут. Как антиген в РКОА используют специально подготовленный 10#-ный экстракт погибших личи-hoki Соотношение диагностику!,ta и антигена при постановке реакции ^агглютинации должно быть 1:1. Срок учета реакции 3-5 минут.

6. По сравнению с решай ей агглютинации, РКОА в 10 раз • чувствительнее при выявлении антигена во взвеси чистой культуры и в 16 раз - при обнаружении его в 10^-ном экстракте из

погибших mmui'ii. PICOA в 100 раз экономичнее по расходу специфической пшоришунной сыворотка, в 20 раз - по расходу антигена, сокращает время диагностики примерно в 55-60-раз.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРГДОДНШ

1. "Лабораторный регламент изготовления диагностику!,га для Филирования культур возбудителя,европейского гнильца медоносных пчел" рассмотрен и, одобрен Методической комиссией БИЗВ (10.II.92 г., протокол И 10), Ученым Советом ВИЭВ (10.11.92 г., протокол ¡i 16).

2. Разработана реакция коагглкшшшрщ для индикации Ыо1. pluton возбудителя .европейского пальца медоносных пче л.

3. Разработан способ длительного поддержания штаммов JJ.pluton в лаборатор[шх условиях.

' ■ СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАНИЯ ПО TRIE ДИССЕРТАЦИИ

1. Чернышова Л.В. Влияние внешней среды на рост l&lisso-coccus pluton // Материалы Всероссийской научной конференции "Экологические проблемы животноводства". - Троицк, I9S2. -С.- 69-71.

2. Чернышова Л.В. Возмокяость длительного лабораторного культивирования l&llsbococcus pluton - возбудителя европейского гнильца медоносных пчел // Ветеринария. - М., 1993 • (в печати). .