Оптимизация размножения вирусов гриппа птиц в различных субстратах и совершенствование инактивированных вакцин против вирусов гриппа птиц

Васильев, Юрий Михайлович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Оптимизация размножения вирусов гриппа птиц в различных субстратах и совершенствование инактивированных вакцин против вирусов гриппа птиц
ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Оптимизация размножения вирусов гриппа птиц в различных субстратах и совершенствование инактивированных вакцин против вирусов гриппа птиц"

На правах рукописи

ВАСИЛЬЕВ Юрий Михайлович 80460

703

ОПТИМИЗАЦИЯ РАЗМНОЖЕНИЯ ВИРУСОВ ГРИППА ПТИЦ В РАЗЛИЧНЫХ СУБСТРАТАХ И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ИНАКТИВИРОВАННЫХ ВАКЦИН ПРОТИВ ВИРУСОВ ГРИППА ПТИЦ

03.02.02 - вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 9 АПР 2010

Москва - 2010

004601703

Работа выполнена в ГОУ ВГТО Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова Росздрава и в НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН

Научный руководитель:

кандидат биологических наук

Сергей Николаевич Орехов

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук

Фирая Галиевна Нагиева

доктор биологических наук

Ирина Анатольевна Ленева

Ведущая организация:

НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН

Защита диссертации состоится «20» мая 2010 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 в НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН по адресу: 105064, г. Москва, Малый Казенный пер., д. 5а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН

Автореферат разослан « 1 ^ » апреля 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук

Ирина Владимировна Яковлева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) заболеваемость при ежегодных сезонных эпидемиях, вызванных вирусами гриппа человека, составляет 20-30% у детей и 5-10% у взрослых, численность группы риска может достигать сотен миллионов человек, при этом в развитых странах от гриппа и его осложнений ежегодно погибают от 250 до 500 тысяч человек (WHO, 2002).

В 1997 году в Гонконге были выявлены случаи инфекции людей, в том числе с летальным исходом, вызванные вирусом гриппа птиц серотипа A/H5N1, а к концу 2009 года по данным ВОЗ инфекция, обусловленная этим серотипом вируса, была выявлена у 445 человек, из которых около 60% умерло (WHO, 2009). В связи с этим многими специалистами было высказано опасение о возможном возникновении пандемии у людей, вызванной высоковирулентными вирусами гриппа птиц (Львов Д.К., 2006). Следует также отметить, что участившиеся в последнее время эпизоотии гриппа среди домашней птицы приносят огромный экономический ущерб (Гендон Ю.З., 2006).

Вакцинопрофилактика является одним из основных способов борьбы с гриппом (WHO, 2002). Выделяют сезонные гриппозные вакцины, предназначенные для ежегодной профилактики сезонных эпидемий гриппа, препандемические вакцины для так называемого праймирования населения против возможного пандемического штамма вируса гриппа, а также пандемические вакцины для защиты против пандемического штамма вируса гриппа. В то же время последние препараты не лишены ряда ограничений.

Одно из таких ограничений для препандемических и пандемических гриппозных вакцин связано с тем, что мощности всех производителей гриппозных вакцин недостаточно для проведения иммунизации даже тех групп людей, которых обычно относят к группам риска (WHO, 2006).

Проблема оперативного увеличения мощности производства гриппозных вакцин может быть решена в определенной степени при использовании культур перевиваемых линий клеток для выращивания вакцинных штаммов вирусов гриппа, что, к тому же, может повысить стабильность и стандартность производства (WHO, 2007). Однако многие свежевыделенные штаммы вирусов гриппа, в том числе вирусов гриппа птиц, плохо размножаются в куриных эмбрионах и культуре перевиваемых линий клеток (Wilschut J. et al., 2006). По этой причине весьма важно для каждого штамма вируса, который предполагается использовать в качестве вакцинного, и для каждого субстрата выявить наиболее оптимальные параметры размножения вируса, а также изучить дополнительные условия для усиления репродукции вируса в различных субстратах.

Серьезным недостатком большинства инактивированных гриппозных вакцин является их неспособность защитить от вновь возникающих дрейфовых вариантов вирусов гриппа. Так, при несовпадении антигенной специфичности штамма вируса, содержащегося в сезонной гриппозной вакцине, с новым антигенным вариантом вируса эффективность препарата оказывается крайне низкой (DeJong J. et al., 2000).

Использование адъювантов может повысить иммуногенность и защитную эффективность вакцин против вирусов гриппа и даже повысить защиту от дрейфовых вариантов вируса. В то же время адъювант не должен вызывать неблагоприятные реакции у вакцинируемых (Aguilar J. et al., 2007). Известные в настоящее время адъюванты гриппозных вакцин - производные алюминия (гидроксид алюминия) и сквалена (MF59 и AS03) - не вполне удовлетворяют этим требованиям (Nicholson К. et al., 2009; Banzhoff А. et al., 2009).

Изучение новых адъювантов гриппозных вакцин, обладающих высокой

иммуногенностью и низкой реактогенностью, является одним из актуальных

направлений совершенствования инактивированных вакцин против вирусов

гриппа, в том числе вирусов гриппа птиц. Одним из таких адъювантов может

быть хитозан, который является биосовместимым и биодеградируемым полимером на основе глюкозы (Arca Н. et al., 2009).

В последнее время было показано, что массовая вакцинация домашней птицы вакцинами против вирусов гриппа птиц, в частности серотипа H5N1, является не только эффективным способом борьбы с эпизоотиями гриппа птиц, но также практически исключает инфекцию людей этими вирусами (Chen Н., 2009). В то же время такие вакцины должны быть простыми и недорогими в производстве, а также способными защищать не только от гомологичного штамма вируса, но также и от дрейфовых вариантов.

Таким образом, сравнительное изучение репродукции вирусов гриппа птиц в культурах перевиваемых линий клеток и куриных эмбрионах, изучение перспективных адъювантов гриппозных вакцин, а также разработка простого способа изготовления инактивированной вакцины против вирусов гриппа птиц для массовой вакцинации домашней птицы являются актуальными направлениями совершенствования инактивированных вакцин против вирусов гриппа птиц, что, кроме того, может быть использовано и при изготовлении аналогичных вакцин для иммунизации людей.

Цель и задачи исследования

Цель исследования - оптимизация размножения вирусов гриппа птиц в куриных эмбрионах и культуре перевиваемых линий клеток и совершенствование инактивированных вакцин против вирусов гриппа птиц.

В соответствии с поставленной целью задачами настоящего исследования являлись:

1. Изучение и оптимизация репродукции вирусов гриппа птиц в различных субстратах:

- в культуре перевиваемых линий клеток MDCK и Vero;

- в культуре перевиваемых линий клеток MDCK с использованием микроносителя;

- в куриных эмбрионах.

2. Разработка простого способа удаления инактивирующего агента при изготовлении инактивированных вакцин против вирусов гриппа птиц с целью снижения потерь антигена.

3. Изучение иммуногенности и защитной эффективности инактивированных препаратов вирусов гриппа птиц, вводимых парентерально, при использовании в качестве адъюванта хитозана (опыты на мышах).

Научная новизна работы

Показано, что оптимальные условия размножения штаммов вирусов гриппа птиц различных серотипов в культурах перевиваемых линий клеток MDCK и Vero, а также в куриных эмбрионах (множественность заражения, время инкубации и концентрация трипсина) являются неодинаковыми для исследованных штаммов. При этом перевиваемые линии клеток MDCK более чувствительны к вирусам гриппа птиц в сравнении с линией клеток Vero.

Впервые показано, что добавление трипсина одновременно с заражением куриных эмбрионов существенно повышает урожай вирусов гриппа птиц как по титрам гемагглютинина, так и инфекционности.

Впервые показано, что добавление к инактивированным препаратам вирусов гриппа птиц в качестве адъюванта хитозана существенно повышает иммуногенность, а также защитную эффективность препарата не только по отношению к гомологичному штамму вируса, но также и к гетерологичным штаммам вирусов гриппа птиц серотипа Н5.

Впервые разработан способ простого и полного удаления инактивирующего агента (формалина) из инактивированных препаратов вируса гриппа птиц без потери антигена (уровня гемагглютинирующей активности), который при одинаковых титрах гемагглютинина повышает иммуногенность инактивированных препаратов вирусов гриппа птиц против как гомологичного, так и гетерологичных штаммов вирусов гриппа птиц серотипа Н5.

Впервые предложен простой, быстрый и недорогой способ получения инактивированной вакцины против вирусов гриппа птиц для массовой вакцинации домашней птицы с добавлением в качестве адъюванта хитозана, способной индуцировать высокие титры антител против гомологичного и гетерологичных штаммов вирусов гриппа птиц серотипа Н5.

Практическая значимость исследования

Определенные в исследованиях оптимальные параметры размножения ряда штаммов вирусов гриппа птиц различных серотипов (НЗ, Н4, Н5, Н7) могут быть использованы для повышения урожая вирусов гриппа птиц при изготовлении инактивированных вакцин.

Выявлена большая чувствительность к различным штаммам вирусов гриппа птиц линии клеток MDCK в сравнении с линией клеток Vero, что может применяться при лабораторной диагностике вируса гриппа птиц и при изготовлении культуральных вакцин против вирусов гриппа птиц.

Внесение трипсина одновременно с заражением вирусом приводит к существенному увеличению урожая вирусов гриппа птиц и может быть использовано при изготовлении эмбриональных вакцин против вирусов гриппа птиц.

Хитозан, существенно увеличивающий иммуногенность и защитную эффективность инактивированных препаратов вирусов гриппа птиц против гомологичного и гетерологичных штаммов вирусов гриппа серотипа Н5, является перспективным адъювантом вакцин против вирусов гриппа птиц.

Простой способ удаления формалина из инактивированных препаратов вируса гриппа птиц без потери антигена, при одинаковых титрах гемагглютинина повышающий иммуногенность против гомологичного и гетерологичных штаммов вируса гриппа птиц серотипа Н5, целесообразно использовать при изготовлении вакцин против вирусов гриппа птиц.

Полученные данные могут также использоваться при изготовлении вакцин против вирусов гриппа птиц для иммунизации людей.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на следующих конференциях: V-ой конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008); 7-ом конгрессе детских инфекционистов России «Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики у детей» (Москва, 2008); 3-ей международной конференции «Influenza Vaccines for the World» (Гриппозные вакцины для мира) (Канны, Франция, 2009); 3-ей международной конференции «Modern vaccines adjuvants and delivery systems» (Современные вакцины и системы доставки) (Вена, Австрия, 2009); итоговой научной конференции молодых исследователей с международным участием «Татьянин день» (Москва, 2010).

Апробация диссертации состоялась на совместной научной конференции кафедры общей фармацевтической и биомедицинской технологии фармацевтического факультета ММА им. И.М. Сеченова и лаборатории генетики РНК-содержащих вирусов отдела вирусологии НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН 01 февраля 2010 года.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Объем и структура

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы, 3-х глав собственных исследований, обсуждения и выводов. Список цитируемой литературы включает 342 отечественных и иностранных источника.

Работа изложена на 242 страницах машинописного текста, иллюстрированного 41 рисунком и 11 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Размножение вирусов гриппа птиц в различных субстратах изучали с использованием следующих штаммов: A/Mallard/Pennsylvania/10218/84 (H5N2 / М), A/FP VAV eybridge (H7N7), A/Duck/Ukiaine/63 (H3N2), A/Duck/Czechoslovakia/56 (H4N6), A/Ruddy Turnstone/Delaware/344/91 (H5N2 / R), A/Duck/Ho Chi Minh/014/78 (H5N3) и NIBRG-14 (H5N1). Инактивированные препараты готовили из штаммов H5N1 и H5N2 / М. Для изучения иммуногенности инактивированных препаратов использовали штаммы H5N1, H5N2 / М, а также A/duck/Potsdam/1402/86 (H5N2 / Р) и A/duck/Singapore/3/97 (H5N3). При изучении защитной эффективности в опытах на мышах использовали вирус гриппа птиц H5N2 / М, адаптированный к мышам (Smirnov Y. et al., 2000).

Перевиваемая линия клеток MDCK АТСС получена из Института Пастера (Париж, Франция), Vero - НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова (Москва).

Культивирование клеток проводили на питательных средах Игла-МЕМ (MEM) и RPMI-1640 для культур клеток MDCK и Vero соответственно с добавлением 5% фетальной бычьей сыворотки на этапе роста клеток или бессывороточной среде MDSS2 Axcevir MDCK.

В качестве адъюванта использовали хитозан, деацетилированный на 85%. Раствор хитозана (1% высокомолекулярной фракции и 0,1% низкомолекулярной фракции в глутаматном буфере в соотношении 1:1) добавляли к инактивированным препаратам вирусов гриппа птиц в соотношении 1:1.

Инфицирование культуры клеток. Клетки (1 ООО ООО клеток в мл) промывали, добавляли среду с трипсином до 1/3-1/2 объема и вносили необходимое количество вируса (ЦПД50/кл.). После адсорбции вируса (30 мин при температуре 36° С) среду с трипсином доводили до полного объема

и культивировали вирус при температуре 36° С. При культивировании в спиннере (объем питательной среды 250 мл) использовали микроноситель СуЮёех I (2 мг/мл), скорость мешалки составляла 25 об/мин. При изучении динамики репродукции вирусов пробы отбирали каждые 24 часа и немедленно замораживали (температура -18° С). Анализ проб проводили одновременно.

Приготовление инактивированных препаратов. Вируссодержащую жидкость осветляли центрифугированием при 6 ООО об/мин в течение 30 минут (центрифуга 02-21, ротор 014), после чего проводили инактивацию. При изучении динамики инактивации пробы отбирали каждые 4-12 часов в течение 96 часов и немедленно замораживали (температура -18°С). Анализ проб проводили одновременно.

Инактивацию формалином (концентрация в вируссодержащей жидкости 0,05%) проводили в течение 72 часов при температуре 36° С. Формалин удаляли с помощью центрифугирования при 18 000 об/мин в течение 2 часов (центрифуга 02-21, ротор 020), осадок концентрировали в глутаматном буфере. Формалин также удаляли с помощью концентрированного свежеприготовленного раствора сульфита натрия.

Инактивацию гидроксиламином (концентрация в вируссодержащей жидкости 1 Н) проводили в течение 48 часов при температуре 24° С. Гидроксиламин удаляли с помощью ацетона (соотношение вируссодержащей жидкости и ацетона 10:1).

Лабораторные животные. Использовали нелинейных мышей (самки) в возрасте 6-8 недель массой 12-16 г по 4-8 особей в группе (общее количество особей во всех экспериментах - 450).

Мышей иммунизировали внутримышечно однократно или двукратно с интервалом 21 день, вводя по 200 мкл вакцины с хитозаном. Контрольные группы мышей иммунизировали вакциной с добавлением глутаматного буфера. На 21-ый день после первой или на 10-ый день после второй

иммунизации мышей обескровливали под эфирным наркозом.

В опытах по изучению защитной эффективности на 10-ый день после второй вакцинации мышей инфицировали интраназально, вводя при частичном эфирном наркозе по 50 мкл различных доз вирулентного, адаптированного к мышам вируса H5N2 / М.

Методики титрования вирусов и антител (реакция гемагглютинации, титрование вирусов в куриных эмбрионах и в культуре клеток, реакция задержки гемагглютинации (РЗГА) и реакция нейтрализации (РН)) приводились в соответствии с действующей нормативной документацией и рекомендациями ВОЗ. Титры цитопатогенности и инфекционности вируса выражали в ЦПД50 в 100 мкл (ЦПД50) и ЭИД50 в 100 мкл (ЭИД50) соответственно.

Результаты и обсуждение

Размножение вирусов гриппа птиц в культурах клеток MDCK и Vero

Первые опыты изучения влияния концентрации трипсина и множественности заражения на урожай двух штаммов вирусов гриппа птиц H5N1 и H5N2 / М, которые проводили с использованием 12-луночных планшетов и среды MEM и RPMI, показали, что оптимальные условия неодинаковы для изученных штаммов. Больший урожай вирусов наблюдался в культуре клеток MDCK в сравнении с культурой клеток Vero, при этом дробное добавление трипсина и изменение времени культивирования не смогли значительно повысить урожай изученных вирусов по анализу титров гемагглютинина в культуре клеток Vero.

В следующей серии опытов было изучено влияние множественности заражения и концентрации трипсина на титры гемагглютинина семи штаммов вирусов гриппа птиц различных серотипов в культуре линии клеток MDCK с использованием матрасов объемом 50 мл и питательной среды MEM (рисунок 1).

Множественность заражения (ЦПД50/Ч.)

ПОД »0,01 ■ 0.001

2мкг/мл 5мкг/мл 2мкг/мл 5мкг/мл 2мкг/мл 5мкг/мл 2мкг/мл 5мкг/мл 2мкг/мл 5мкг/мл 2мкг/мл 5 миг/мл 2мкг/мл 5мкг/мл

Н5И1 Н5М2/М Н7И7 НЗМ2 Н4И6 Н5Ы2/К Н5МЗ

Штамм вируса и концентрация трипсина

Рисунок 1. Влияние множественности заражения и концентрации трипсина на титры гемагглютинина при культивировании вирусов гриппа птиц в культуре клеток МОСК.

* Здесь и далее для расчета доверительных границ к среднему использовали распределение Стьюдента (р = 0,05).

Результаты показали, что все семь исследованных штаммов достаточно активно размножались в линии клеток MDCK при оптимальной множественности заражения и концентрации трипсина, которые являлись неодинаковыми для исследованных штаммов. Так, для вируса H5N1 они составили 0,1 ЦПД50/кл. и 5 мкг/мл соответственно, а для вируса H5N2 / М -0,01 ЦГТД50/КЛ. и 2 мкг/мл соответственно.

Изучение влияния множественности заражения и концентрации трипсина на титры гемагглютинина семи штаммов вирусов гриппа птиц в культуре линии клеток Vero при использовании матрасов на 50 мл и питательной среды RPMI показало, что практически лишь один из исследованных штаммов активно репродуцировался в культуре клеток Vero при всех исследованных условиях.

Размножение вирусов гриппа птиц в культуре клеток MDCK на микроносителе

В этой серии опытов изучали в динамике размножение вирусов гриппа птиц H5N1 и H5N2 / М в культуре клеток MDCK на микроносителе, выращенных в спиннере с использованием среды MEM или бессывороточной среды Axcevir, а также используя оптимальные параметры культивирования вирусов, определенные в предыдущих опытах (рисунок 2).

Результаты показали, что тип среды для культивирования, а также сроки культивирования оказывают влияние на урожай вирусов, при этом оптимальные сроки культивирования неодинаковы для исследованных штаммов вирусов. Урожай изученных вирусов несколько выше при использовании бессывороточной среды в сравнении со средой MEM.

При соблюдении оптимальных условий урожай изученных вирусов в культуре клеток MDCK на микроносителе был выше в сравнении с урожаем в культуре этих клеток без использования микроносителя.

■=t 6

s- 2

H5N1 бес/с H5N1MEM -H5M2/M бес/с -H5N2/MMEM

24 48 72 96 120 144 Время культивирования,часы

H5M1 бес/с H5N1MEM -H5N2/M 6et/c -H5N2/MMEM

24 48 72 96 120 144 Время культивирования,часы

Рисунок 2. Размножение вирусов гриппа птиц в культуре выращенных в спиннере клеток MDCK с использованием микроносителя (титры гемагглютинина и цитопатогенности (^ЦПД50)).

Размножение вирусов гриппа птиц в куриных эмбрионах В первых опытах по изучению влияния времени инкубации и дозы заражения на урожай штаммов вирусов гриппа птиц H5N1 и H5N2 / М в куриных эмбрионах было обнаружено, что оптимальное время инкубации инфицированных куриных эмбрионов было неодинаковым для исследованных штаммов и составило 72 и 48 часов соответственно, а оптимальная доза заражения для обоих штаммов составила 1000 ЭИД50 на эмбрион.

Условия репродукции

□ безтрипсина, 48 часов

я безтрипсина, 72 часа

■ с трипсином, 48 часов

■ с трипсином,72 часа

Н5М2/М Н7М7

Н5 Ы2/Й

Рисунок 3. Влияние времени инкубации и добавления трипсина в инфицированные куриные эмбрионы на титры гемагглютинина семи штаммов вирусов гриппа птиц.

Добавление 20 мкг трипсина на эмбрион при инфицировании куриных эмбрионов при соблюдении оптимального времени инкубации существенно увеличивало урожай этих двух вирусов гриппа птиц при анализе титров гемагглютинина, цитопатогенности и инфекционности. Необходимо отметить, что оптимальное количество трипсина составляет 20 мкг на эмбрион, а марка трипсина - Sigma Т1426 (наиболее очищенная и биологически активная субстанция).

В следующей серии опытов изучали влияние времени инкубации инфицированных куриных эмбрионов, а также добавления трипсина в инфицированные куриные эмбрионы на титр гемагглютинина семи штаммов вирусов гриппа птиц (рисунок 3). В этих опытах также было обнаружено, что оптимальное время инкубации инфицированных куриных эмбрионов является неодинаковым для различных штаммов, а добавление 20 мкг трипсина на эмбрион при инфицировании при соблюдении оптимального времени инкубации куриных эмбрионов существенно повышает титры гемагглютинина для всех исследованных штаммов вирусов гриппа птиц.

Добавление к инактивированным препаратам вирусов гриппа птиц хитозана как адъюванта

Вирусы гриппа птиц H5N1 и H5N2 / М выращивали в куриных эмбрионах с добавлением трипсина, а также в культуре клеток MDCK на микроносителе при использовании среды MEM или бессывороточной среды Axcevir с учетом оптимальных параметров культивирования, полученных в предыдущих опытах, и инактивировали формалином. Окончательные титры гемагглютинина для всех препаратов составили 1024 ГАЕ в 100 мкл.

Группы мышей иммунизировали внутримышечно однократно или двукратно различными инактивированными препаратами вирусов H5N1 и H5N2 / М с хитозаном и без этого адъюванта и определяли титры антител в РЗГА и РН.

2 ^ 2 г

1280 040 320 160 80 40 20 10

□ безхитозана ■ схнтоэаном

Н5М1 Н5Н2/МН5Н2/Р Н5МЗ Н5М1 Н5М2/МН5Н2/Р Н5МЗ 1 вакцинация II вакцинация

1280

640

320

5. 160

□ безхитозана ■ схитозаном

Н5М1 Н5Н2/М Н5И2/Р Н5НЗ Н51М Н5М2/М Н5Н2/Р Н5НЗ I вакцинация II вакцинация

Рисунок 4. Титры антител (РЗГА и РН) после однократной и двукратной иммунизации мышей инактивированным препаратом вируса гриппа птиц Н51чГ1, выращенным в культуре клеток МО С К на микроносителе (бессывороточная среда).

Результаты показали, что добавление хитозана в качестве адъюванта к

инактивированным препаратам исследованных вирусов, выращенных в

линии клеток MDCK при использовании бессывороточной среды (рисунок 4) и среды MEM, а также в куриных эмбрионах, существенно повышает иммуногенность против гомологичных и гетерологичных вирусов, включая штаммы, выделенные с интервалом 20 лет и более. Кроме того, даже при однократной вакцинации добавление хитозана позволяет сохранять сравнительно высокие титры антител против гомологичных и гетерологичных вирусов вне зависимости от того, в каком субстрате и какой среде выращены вирусы.

В то же время тип субстрата и питательной среды оказывают влияние на иммуногенность инактивированного препарата вируса гриппа птиц. Наиболее иммуногенными против как гомологичных, так и гетерологичных штаммов в большинстве случаев оказываются инактивированные препараты вирусов, выращенных в куриных эмбрионах с добавлением трипсина.

Антитела, индуцированные инактивированными гриппозными вакцинами с добавлением хитозана, сохраняются в высоких титрах по крайней мере в течение 6 месяцев (опыты на кроликах). Кроме того, инактивированные гриппозные вакцины с хитозаном хорошо сохраняют иммуногенность при хранении по крайней мере в течение 8 месяцев при температуре 4° С, что свидетельствует о стабильности адъювантных свойств хитозана при хранении с вакциной.

Мышей вакцинировали инактивированными препаратами вирусов гриппа птиц H5N1 и H5N2 / М с хитозаном или без этого адъюванта и инфицировали вирулентным штаммом вируса гриппа птиц H5N2 / М, адаптированным к мышам. Защитная эффективность при добавлении хитозана к инактивированным препаратам исследованных вирусов против гомологичного (H5N2 / М - H5N2 / М) вируса возрастала в 10-100 раз, а против гетерологичного (H5N1 - H5N2 / М) вируса - в 100 раз (данные представлены в таблице), при этом существенное увеличение защитной эффективности при добавлении хитозана наблюдалось вне зависимости от

того, в каком субстрате и какой среде выращивали вирусы.

Таблица

Защитная эффективность инактивированных препаратов вирусов гриппа птиц с хитозаном или без этого адъюванта.__

субстрат для инфекцион- вакцинация вакцинация невакци-

выращива- ная доза вирусом H5N1 вирусом H5N2 / M нирован-

ния вируса вируса без с хито- без с хито- ные мыши

Н5Ш / М хито- заном хито- заном (контроль)

(ЛД5О/0,1 мл) зана зана

линия клеток Г 0/5XJ 0/5 0/6 0/5 3/6

МБСК, 10 0/6 0/5 0/5 0/6 4/6

бессыворо- 102 3/6 0/6 0/6 0/6 6/6

точная 103 5/6 0/6 1/6 0/6 5/5

среда 104 5/5 3/6 3/6 0/6 6/6

линия клеток 1 0/4 0/4 0/4 0/4 1/4

МБСК, 10 0/4 0/4 0/4 0/4 3/4

среда МЕМ 102 2/4 0/4 0/4 0/4 4/4

103 3/4 0/4 2/4 0/4 4/4

ю4 4/4 2/4 3/4 0/4 -

ю5 4/4 4/4 4/4 2/4 -

куриные 1 0/4 0/4 0/4 0/4 1/4

эмбрионы с 10 0/4 0/4 0/4 0/4 3/4

добавлением 102 0/4 0/4 0/4 0/4 4/4

трипсина 103 2/4 0/4 0/4 0/4 4/4

ю4 4/4 0/4 1/4 0/4 -

ю5 4/4 2/4 3/4 1/4 -

х) в числителе - количество павших животных, в знаменателе - число инфицированных мышей

При иммунизации мышей инактивированным препаратом вируса гриппа птиц Н5Ш с добавлением хитозана титры антител в РЗГА против гомологичного (Н5Ш) и гетерологичного (Н5Ш / М) штаммов остаются практически на том же уровне даже при снижении дозы антигена до 4 раз (0,75 мкг) и существенно превышают титры антител, индуцируемых аналогичным препаратом без хитозана даже при дозе гемагглютинина 3 мкг (рисунок 5).

безхитозана ш СХИТ03АН0М

бмкг Змкг 1.5 мкг 0.75 мкг Н5М1

бмкг 5 мкг 1,5 мкг 0,75 мкг Н5М2/М

Доза антигена

Рисунок 5. Изучение иммуногенности инактивированного препарата вируса гриппа птиц Н5№ с адъювантом хитозаном против гомологичного (Н5№) и гетерологичного (Н5И2 / М) штаммов при снижении дозы антигена (гемагглютинина).

Удаление инактивирующего агента при изготовлении инактивированной вакцины против вирусов гриппа

Сравнительное изучение динамики инактивации вирусов гриппа птиц Н5№ и Н5К2 / М показало, что формалин и гидроксиламин полностью инактивируют изученные вирусы, однако в разные сроки и при различных уровнях снижения гемагглютинирующей активности, которая оказалась ниже при использовании формалина. В то же время при удалении формалина центрифугированием, а также при обработке гидроксиламина ацетоном в различных условиях наблюдается существенное дополнительное снижение уровня гемагглютинирующей активности.

Использование свежеприготовленного раствора сульфита натрия для

удаления формалина (в избытке 10:1 соответственно) позволяет быстро и

полностью освободить вируссодержащую жидкость от инактивирующего

агента без снижения уровня гемагглютинирующей активности. Контроль

удаления формалина проводился с использованием ряда химических реакций, принятых в токсикологической практике (предел обнаружения менее 0,000 01%): реакция с хромотроповой кислотой, реакция с метиловым фиолетовым и реакция с резорцином (Крамаренко В.Ф., 1989).

При иммунизации мышей инактивированными препаратами вируса гриппа птиц H5N1, выращенного в куриных эмбрионах с добавлением трипсина, титры антител в РЗГА против гомологичного (H5N1) и гетерологичного (H5N2 / М) штаммов были выше при использовании сульфита натрия для удаления формалина, а также хитозана в качестве адъюванта (рисунок 6). Аналогичные результаты были получены для инактивированного препарата вируса H5N2 / М, выращенного в культуре клеток MDCK на микроносителе с использованием среды MEM. Следует подчеркнуть, что титр гемагглютинина для всех препаратов составил 1024 ГАЕ в 100 мкл.

Рисунок 6. Иммуногенность инактивированных препаратов вируса гриппа птиц Н5М1 при удалении формалина центрифугированием или с помощью сульфита натрия против гомологичного (Н5№) и гетерологичного (Н5№ / М) штаммов.

Сульфит натрия является сильным восстановителем и в растворе быстро окисляется до сульфата натрия. Можно предполагать, что между сульфитом натрия и формалином протекает окислительно-восстановительная реакция. Сульфат натрия применяется в медицине в качестве лекарственного вещества (солевое слабительное).

Таким образом, наиболее простой способ изготовления вакцины против вирусов гриппа птиц для массовой вакцинации домашней птицы может состоять из следующих этапов:

1. Определение оптимального времени инкубации куриных эмбрионов при заражении конкретными штаммами вируса гриппа птиц и одновременном введении трипсина, а также определение времени полной инактивации этого штамма формалином.

2. Получение большого количества вируссодержащей аллантоисной жидкости и инактивация вируса с использованием оптимальных параметров, полученных ранее.

3. Удаление формалина из вируссодержащей жидкости с использованием сульфита натрия.

4. Контроль полноты инактивации вируса и удаления формалина.

5. Добавление в качестве адъюванта хитозана.

6. Расфасовка вакцины для массовой вакцинации.

Приведенный способ можно использовать и для изготовления вакцин против вирусов гриппа птиц для иммунизации людей, однако при этом необходимо уделять особое внимание очистке препарата, в частности удалению клеточного дейтрита (при выращивании вирусов гриппа в культурах перевиваемых линий клеток) или удалению белков куриного яйца (при выращивании вирусов в куриных эмбрионах).

выводы

1. Перевиваемые линии клеток MDCK более чувствительны к вирусам гриппа птиц в сравнении с линией клеток Vero. Из семи изученных штаммов вирусов гриппа птиц различных серотипов (НЗ, Н4, Н5, Н7) все активно репродуцировались в клетках MDCK, но лишь один штамм вируса активно размножался в клетках Vero (H7N7). Дополнительное введение трипсина в культуру этой линии клеток не улучшало репродукцию исследованных штаммов вирусов гриппа птиц.

2. Изучение условий размножения семи исследованных штаммов вирусов гриппа птиц в культуре линии клеток MDCK и Vero (множественность заражения на клетку, концентрация трипсина) показало, что необходимо устанавливать оптимальные параметры репродукции для каждого штамма вируса гриппа птиц.

3. Изученные штаммы вирусов гриппа птиц активно размножались в культуре линии клеток MDCK в лабораторном спиннере с использованием микроносителя, а также как питательной среды MEM, так и бессывороточной среды Axcevir. Оптимальное время для максимального урожая вируса в этой системе оказалось неодинаковым для разных штаммов вирусов. Титры гемагглютинина и инфекционности вируса в культуре клеток MDCK с использованием микроносителя были выше, чем в культуре этой линии клеток без использования микроносителя.

4. При выращивании семи штаммов вирусов гриппа птиц в куриных эмбрионах время инкубации куриных эмбрионов для максимального урожая вируса оказалось неодинаковым для различных изученных штаммов вирусов гриппа птиц. Внесение в куриные эмбрионы трипсина одновременно с заражением вирусом при соблюдении оптимального времени инкубации существенно повышает урожай вируса как по титрам гемагглютинина, так и инфекционности.

5. При производстве инактивированных гриппозных вакцин против вирусов гриппа птиц при использовании в качестве субстрата линий клеток или куриных эмбрионов необходимо предварительное изучение оптимальных условий для обеспечения максимального урожая вируса каждого конкретного штамма (множественность инфекции, концентрация трипсина, время инкубации инфицированного субстрата).

6. При добавлении адъюванта хитозана к инактивированным препаратам вирусов гриппа птиц существенно повышаются титры задерживающих гемагглютинацию и нейтрализующих антител к гомологичному штамму, а также к гетерологичным штаммам вирусов гриппа серотипа Н5. Защитная эффективность этих препаратов при добавлении хитозана повышается в 10-100 раз по отношению к гомологичному штамму и в 100 раз к гетерологичному вирусу гриппа серотипа Н5. При добавлении хитозана высокие титры антител индуцируются даже при однократной иммунизации и при снижении дозы антигена в 4 раза.

7. Разработан способ быстрого и полного удаления инактивирующего агента формалина из вируссодержащей аллантоисной или культуральной жидкости путем добавления сульфита натрия при получении инактивированных препаратов вирусов гриппа птиц. При этом способе удаления формалина, в отличие от удаления инактивирующего агента центрифугированием, не наблюдается снижение уровня гемагглютинирующей активности инактивированного препарата, а также при одинаковых титрах гемагглютинина в инактивированных препаратах повышаются титры задерживающих гемагглютинацию антител против гомологичного и гетерологичных штаммов вирусов гриппа птиц серотипа Н5.

8. Предложен простой и экономичный способ получения инактивированной вакцины против вирусов гриппа птиц, который можно использовать как с целью массовой вакцинации домашней птицы, так и для производства вакцин для людей: выращивание вирусов в куриных эмбрионах

проводят с добавлением трипсина, для удаления инактивирующего агента применяют химический способ, в качестве адъюванта используют хитозан, что повышает иммуногенность и защитную эффективность вакцин не только от гомологичного, но и гетерологичных штаммов вирусов гриппа птиц серотипа Н5.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Васильев Ю.М. Применение нового адъюванта для повышения эффективности инактивированных гриппозных вакцин / Тезисы V конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» // Вестник Российской академии медицинских наук. - 2008. - № 6 (приложение). - С. 83.

2. Васильев Ю.М. Хитозан как перспективный адъювант гриппозных вакцин для детей / Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики у детей: материалы конгресса / Гендон Ю.З., Маркушин С.Г., Акопова И.И., Коптяева И.Б., Кривцов Г.Г., Борисова О.В., Ахматова Н.К., Курбатова Е.А., Мазурина С.А., Гервазиева В.Б. // Детские инфекции. - 2008. - Приложение. - С. 35.

3. Васильев Ю.М. Вакцины против вируса гриппа птиц // Вопросы вирусологии. - 2008. - № 6. - С. 4-15.

4. Ghendon Y. Evaluation of properties of chitosan as an adjuvant for inactivated influenza vaccines administered parenterally / Markusin S., Vasiliev Y., Akopova I., Koptiaeva I., Krivtsov G., Borisova O., Ahmatova N., Kurbatova E., Mazurina S., Gervazieva V. // Journal of Medical Virology. - 2009. - № 81. - P. 494-506.

5. Vasiliev Y. Development of a cell culture derived inactivated adjuvanted vaccine against avian influenza viruses / Ghendon Y., Markushin S., Akopova I.,

Koptiaeva I., Krivtsov G. // Influenza vaccines for the world: conference materials. - 2009. - abstract.

6. Гендон Ю.З. Хитозан как адъювант для инактивированных вакцин против вирусов гриппа птиц / Васильев Ю.М., Маркушин С.Г., Акопова И.И., Коптяева И.Б., Кривцов Г.Г. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2009. - № 2. - С. 40-47.

7. Васильев Ю.М. Сравнительное изучение размножения вирусов гриппа птиц в культуре клеток и куриных эмбрионах / Руднева И.А., Коптяева И.Б. // Вопросы вирусологии. - 2009. - № 4. - С. 18-23.

8. Ghendon Y. Chitosan as a promising adjuvant for parenterally administered inactivated vaccines against human and avian influenza viruses / Vasiliev Y., Markushin S., Akopova I., Koptiaeva I., Krivtsov G., Borisova O., Ahmatova N., Kurbatova E., Mazurina S., Gervazieva V. // Modern vaccines adjuvants and delivery systems: conference materials. - 2009. - abstract.

9. Васильев Ю.М. Совершенствование инактивированных препаратов против вирусов гриппа с пандемическим потенциалом / Тезисы итоговой научной конференции молодых исследователей с международным участием «Татьянин день» // Фарматека. - 2010. - Приложение. - С. 26.

10. Васильев Ю.М. Адъюванты гриппозных вакцин // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2010. - № 1. - С. 100-110.

11. Васильев Ю.М. Получение инактивированной вакцины против вируса гриппа птиц / Гендон Ю.З. // Ветеринария. - 2010. - № 4. - С. 58-61.

12. Орехов С.Н. Изучение репродукции вирусов гриппа птиц в суспензионной культуре клеток с использованием биореактора / Васильев Ю.М. // Фармация. - 2010. - № 5. - В печати.

ЛР № 063109 от 04.02.1999 г

Формат 60x90/16. Заказ 896. Тираж 100 экз.

Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов.

Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, ул. Кедрова, д. 15, тел. 774-26-96

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Васильев, Юрий Михайлович

Оглавление.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

Раздел 1.1. Общие сведения о вирусе гриппа: экология, молекулярная генетика и биология, инфекционный цикл, эпидемиология, вакцинопрофилактика.

1.1.1. Общие сведения и экология вируса гриппа.

1.1.2. Молекулярная биология и генетика вируса гриппа.

1.1.3. Эпидемиология вируса гриппа.

1.1.4. Вакцинопрофилактика гриппа.

1.1.5. Направления вакцинопрофилактики гриппа.

Раздел 1.2. Вакцины против вируса гриппа птиц.

1.2.1. Заболевания людей, вызванные вирусами гриппа птиц.

1.2.2. Получение безопасных вакцинных штаммов из высоковирулентных штаммов вирусов гриппа птиц.

1.2.3. Инактивированные вакцины против вирусов гриппа птиц.

1.2.3.1. Инактивированные и водно-эмульсионные вакцины против вирусов гриппа птиц для вакцинации домашней птицы.

1.2.3.2. Инактивированные вакцины против вирусов гриппа птиц для вакцинации людей.

1.2.4. Живые вакцины.

1.2.5. Культуральные вакцины.

1.2.6. Виросомальные вакцины.

1.2.7. ДНК-вакцины.

1.2.8. Векторные вакцины на базе вирусов животных.

1.2.9. Рекомбинантные вакцины, полученные с помощью векторов на основе вирусов растений, насекомых, культур линий клеток и дрожжейбЗ

1.2.10. Вакцины на основе нейраминидазы.

1.2.11. Универсальные вакцины.

1.2.12. Новые способы вакцинации.

Раздел 1.3. Адъюванты для вакцин против вирусов гриппа птиц и человека

1.3.1. Общие сведения.

1.3.2. Адъюванты алюминия.

1.3.2.1. Характеристика адъюванта.

1.3.2.2. Алюминий как адъювант для препандемических гриппозных вакцин против вирусов гриппа птиц и человека.

1.3.3. Адъюванты на основе сквалена.

1.3.3.1. Характеристика адъюванта.

1.3.3.2. Производные сквалена как адъюванты гриппозных вакцин против вирусов гриппа человека.

1.3.3.3. Производные сквалена как адъюванты для препандемических вакцин против вирусов гриппа птиц.

1.3.4. Полигликозиды.

1.3.5. Иммуномодуляторы.

Глава 2. Материалы и методы.

Глава 3. Изучение размножения вирусов гриппа птиц в различных субстратах

3.1. Размножение вирусов гриппа птиц в культурах клеток MDCK и Vero

3.2. Размножение вирусов гриппа птиц в культуре клеток МБСК с использованием микроносителя.

3.3. Размножение вирусов гриппа птиц в куриных эмбрионах.

3.3.1. Изучение влияния времени инкубации и дозы заражения на урожай вирусов гриппа птиц.

3.3.2. Изучение влияния добавления трипсина при инфицировании куриных эмбрионов на урожай вирусов гриппа птиц.

3.3.3. Изучение влияния добавления трипсина при инфицировании куриных эмбрионов и времени инкубации на титр гемагглютинина семи штаммов вируса гриппа птиц.

Глава 4. Хитозан как адъювант для парентеральных инактивированных гриппозных вакцин против вирусов гриппа птиц.

4.1. Получение инактивированных препаратов вирусов гриппа птиц.

4.2. Влияние хитозана как адъюванта на иммуногенность и защитную эффективность препаратов при добавлении к инактивированным вирусам гриппа птиц.

4.3. Возможность снижения дозы антигена инактивированных препаратов вирусов гриппа птиц, вводимых парентерально, при использовании в качестве адъюванта хитозана.

4.4. Защитная эффективность инактивированных препаратов вирусов гриппа птиц, вводимых парентерально, с хитозаном и без этого адъюванта.

4.5. Сохранение титров антител у кроликов, иммунизированных инактивированной гриппозной вакциной при использовании в качестве адъюванта хитозана.

4.6. Сохранение адъювантной активности хитозана, добавленного к гриппозной вакцине, при хранении.

Глава 5. Разработка простого способа приготовления инактивированной вакцины против вирусов гриппа птиц для массовой вакцинации домашней птицы.

5.1. Динамика инактивации вируса формалином и гидроксиламином.

5.2. Удаление инактивирующего агента.

5.3. Иммуногенность инактивированных препаратов вируса гриппа H5N1 при удалении инактивирующего агента (формалина) химическим способом.

Обсуждение.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Оптимизация размножения вирусов гриппа птиц в различных субстратах и совершенствование инактивированных вакцин против вирусов гриппа птиц"

Актуальность проблемы

В настоящее время грипп остается одной из актуальных проблем здравоохранения. Заболеваемость при ежегодных сезонных эпидемиях, вызванных вирусами гриппа человека, по данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) составляет до 10% населения земли, а численность группы риска может достигать 1 миллиарда человек, при этом от 250 до 500 тысяч человек ежегодно погибают от гриппа и его осложнений [321].

В 1997 году в Гонконге были выявлены случаи инфекции людей вирусом гриппа птиц серотипа А/Н5Ш [91]. К концу 2009 года от этого серотипа вируса гриппа птиц погибло по данным ВОЗ 263 человека из 445 заболевших по всему миру [325]. В связи с этим многими специалистами было высказано опасение о возможном возникновении пандемии у людей, вызванной высоковирулентными вирусами гриппа птиц.

Следует также отметить, что участившиеся в последнее время эпизоотии гриппа среди домашней птицы приносят огромный экономический ущерб [6].

Таким образом, проблема не только сезонных эпидемий вируса гриппа, но также эпизоотий гриппа у животных, в частности у птиц, приводящих к заражению людей этими вирусами, остается весьма актуальной.

Вакцинопрофилактика является одним из основных способов борьбы с гриппом [2]. Выделяют сезонные гриппозные вакцины, а также препандемические и пандемические гриппозные вакцины. Сезонные гриппозные вакцины предназначены для ежегодной профилактики сезонных эпидемий гриппа, препандемические - для так называемого праймирования населения против возможного пандемического штамма вируса гриппа, в частности вируса гриппа птиц, а пандемические гриппозные вакцины — для защиты против пандемического штамма вируса гриппа.

В последние годы разрабатываются несколько типов препандемических и пандемических вакцин против вирусов гриппа птиц - в основном инактивированные и живые вакцины. Однако эти препараты не лишены ряда ограничений.

Для препандемических и пандемических гриппозных вакцин одно из ограничений связано с тем, что количество людей, которых необходимо вакцинировать в случае пандемии, намного больше, чем при сезонных эпидемиях, поскольку массовую вакцинацию необходимо проводить во всех странах земного шара. В то же время мощности всех производителей гриппозных вакцин не хватит для проведения иммунизации даже тех групп людей, которых обычно относят к группам риска [319]. При этом следует учитывать, что обычный субстрат для производства гриппозных вакцин -куриные эмбрионы - может существенно ограничить возможность увеличения мощности производства гриппозных вакцин с использованием куриных эмбрионов, поскольку быстро увеличить количество куриных эмбрионов в 10 и более раз для приготовления вакцины вряд ли будет возможно.

Проблема оперативного увеличения мощности производства гриппозных вакцин может быть решена при использовании культур перевиваемых линий клеток для размножения вирусов гриппа, что, к тому же, позволяет повысить стабильность и стандартность производства [4].

Следует также отметить важность высокого урожая вируса при размножении на том или ином субстрате, что крайне необходимо для получения высокоэффективной вакцины, особенно если необходимо производить увеличенные количества этого препарата. Известно, однако, что многие свежевыделенные штаммы вирусов гриппа, в том числе вирусов гриппа птиц, плохо размножаются в куриных эмбрионах и культуре перевиваемых линий клеток [327]. Поэтому весьма важно для каждого индивидуального штамма вируса, который предполагается использовать в качестве вакцинного, и для каждого субстрата выявить наиболее 7 оптимальные параметры для максимального размножения вируса, а также изучить дополнительные условия для усиления размножения вируса в разных субстратах.

Поскольку культуры перевиваемых линий клеток MDCK и Vero рассматриваются ВОЗ как весьма перспективные для получения гриппозных вакцин, то сравнительное изучение репродукции вирусов гриппа птиц именно в этих субстратах, а также в куриных эмбрионах как традиционном субстрате, представляется наиболее целесообразным.

Серьезным недостатком большинства гриппозных вакцин, даже предлагаемых для борьбы с сезонными эпидемиями гриппа, является их неспособность защитить от вновь возникающих дрейфовых вариантов вирусов гриппа, а при несовпадении антигенной специфичности штамма вируса, содержащегося в вакцине, с новым антигенным вариантом вируса, эффективность препарата оказывается крайне низкой [2]. Это относится и к препандемической вакцине - в случае существенного отличия антигенной специфичности препандемического и пандемического вируса использование препандемической вакцины окажется малоэффективным.

В настоящее время только два препарата получили распространение в качестве адъювантов гриппозных вакцин — неорганические соединения алюминия (сульфат и гидроксид алюминия) и производные сквалена (водномасляные эмульсии со скваленом, например MF59 и. AS03). Однако адъюванты на основе алюминия слабо повышают эффективность гриппозных вакцин, а также обладают повышенной реактогенностью [18, 196].

Адъюванты на основе сквалена существенно повышают иммуногенность и защитную эффективность вакцин в том числе против антигенно отличных 8 штаммов вирусов при добавлении к гриппозным вакцинам как против вирусов гриппа человека, так и птиц, однако обладают повышенной реактогенностью [27, 54, 236].

Изучение новых адъювантов гриппозных вакцин, обладающих высокой иммуногенностью и низкой реактогенностью является одним из актуальных направлений совершенствования инактивированных вакцин против вирусов гриппа птиц. Одним из таких адъювантов может быть хитозан, который является биосовместимым и биодеградируемым полимером на основе производных глюкозы [21].

В последнее время было показано, что массовая вакцинация домашней птицы вакцинами против высоковирулентных вирусов гриппа птиц, в частности серотипа Н5Ш, не только является эффективным способом борьбы с эпизоотиями птиц, но также существенно снижает и даже исключает инфекцию людей вирусами гриппа птиц [57]. В то же время вакцины против вирусов гриппа птиц для массовой вакцинации домашней птицы должны быть простыми в производстве, недорогими и способными защищать не только от гомологичного штамма вируса, но также и от дрейфовых вариантов. Разработка способа получения такой вакцины и ее использование для массовой вакцинации домашней птицы может оказаться наиболее эффективным методом борьбы с инфекцией людей вирусами гриппа птиц.

Таким образом, сравнительное изучение репродукции вирусов гриппа птиц в культурах перевиваемых линий клеток и в куриных эмбрионах, изучение перспективных адъювантов гриппозных вакцин, а также разработка простых способов получения вакцин против вирусов гриппа птиц для массовой вакцинации домашней птицы являются актуальными направлениями совершенствования инактивированных вакцин против вирусов гриппа птиц.

В то же время оптимизация размножения вирусов гриппа птиц в разных субстратах и разработка эффективного и безопасного адъюванта, 9 повышающего эффективность препарата и защиту от дрейфовых вариантов вируса, могут быть использованы и при изготовлении вакцин против вирусов гриппа птиц для иммунизации людей.

Цель и задачи исследования

Цель исследования — оптимизация размножения вирусов гриппа птиц в куриных эмбрионах и культуре перевиваемых линий клеток и совершенствование инактивированных вакцин против вирусов гриппа птиц.

В соответствии с поставленной целью задачами настоящего исследования являлись:

1. Изучение и оптимизация репродукции вирусов гриппа птиц в различных субстратах:

- в культуре перевиваемых линий клеток MDCK и Vero;

- в культуре перевиваемых линий клеток MDCK с использованием микроносителя;

- в куриных эмбрионах.

Научная новизна работы

Показано, что оптимальные условия размножения штаммов вирусов гриппа птиц различных серотипов в культурах перевиваемых линий клеток

MDCK и Vero, а также в куриных эмбрионах (множественность заражения,

10 время инкубации и концентрация трипсина) являются неодинаковыми для исследованных штаммов. При этом перевиваемые линии клеток MDCK более чувствительны к вирусам гриппа птиц в сравнении с линией клеток Vero.

Практическая значимость исследования

Объем и структура

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Васильев, Юрий Михайлович

Выводы

205 проводят с добавлением трипсина, для удаления инактивирующего агента применяют химический способ, в качестве адъюванта используют хитозан, что повышает иммуногенность и защитную эффективность вакцин не только от гомологичного, но и гетерологичных штаммов вирусов гриппа птиц серотипа Н5.

Благодарности

Автор выражает глубокую благодарность доктору Ю.А. Смирнову - за предоставление адаптированного к мышам штамма вируса гриппа птиц Н5Ы2 / М; доктору С.Г. Маркушину, доктору И.И. Акоповой и доктору И.Б. Коптяевой - за помощь в проведении исследований.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Васильев, Юрий Михайлович, Москва

1. Ахматова Н.К., Егорова Н.Б., Курбатова Е.А. и др. Влияние хитозана на иммунофенотип и функциональную активность мононуклеарных лейкоцитов мышей при иммунизации инактивированной противогриппозной вакциной // Журн. микробиол. 2008. - № 6. - С. 3135.

2. Гендон Ю.З. Вакцины и химиопрепараты для профилактики гриппа // Вопр. вирусол. 2007. - № 1. - С. 4-10.

3. Гендон Ю.З. Использование гидроксиламина для изготовления вирусных инактивированных антигенов // Вопр. вирусол. 1966. - № 4. - С. 483-487.

4. Гендон Ю.З. Культуральные гриппозные вакцины // Вопр. вирусол. 2002.- № 6. С. 4-11.

5. Гендон Ю.З. Пандемия гриппа: предположения и факты // Журн. микробиол. 2008. - № 5. - С. 109-118.

6. Гендон Ю.З. Эпизоотии гриппа птиц и борьба с ними // Журн. микробиол.- 2006. № 5. - С. 17-28.

7. Герасимов А.Н. Медицинская статистика. М.: Медицинское информационное агентство, 2007. - 487 с.

8. Горбунова A.C. Пысина Т.В. Грипп животных (млекопитающих и птиц). -М.: Колос, 1973. -232 с.

9. Зверев В.В. Катлинский A.B., Костинов М.П. и др. Результаты сравнительного клинического исследования вакцин против вируса гриппа птиц // Журн. микробиол. 2007. - № 3. - Р. 10-16.

10. Львов Д.К. Популяционные взаимодействия в биологической системе: вирус гриппа А дикие и домашние животные - человек // Журн. микробиол. - 2006. - № 3. - С. 96-100.

11. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М.: Издательство Новая Волна, 2005. - 1200 с.

12. Н.Руднева И.А., Каверин Н.В., Тимофеева Т.А. и др. Оптимизация генного состава реассортантов, содержащих геммаглютинин вируса гриппа подтипа Н5, и их эффективность в опытах перекрестной иммунной защиты // Вопр. вирусол. 2008. - № 1. - С. 24-27.

13. Сульфит натрия // Химическая энциклопедия. М.: Большая Российская Энциклопедия, 1992. - Т. 3 - 639 с.

14. Aballea S., De Juanes J., Barbieri M. et al. The cost effectiveness of influenza vaccination for adults aged 50 to 64 years: a model-based analysis for Spain // Vaccine. 2007. - Vol. 25. - P. 6900-6910.

15. Adar Y., Singer Y., Levi R. et al. A universal epitope-based influenza vaccine and its efficacy against H5N1 // Vaccine. 2009. - Vol. 27. - P. 2099-2107.

16. Aguilar J., Rodriguez E. Vaccine adjuvants revisited // Vaccine. 2007. - Vol. 25. - P. 3752-3762.

17. Aiba S. Studies on chitosan: 4. Lysozymic hydrolysis of partially N-acetylated chitosans // Int. J. Biol. Macromol. 1992. - Vol. 14. - P. 225-228.

18. Ansaldi F., Bacilieri S., Durando P. et al. Cross-protection by MF59-adjuvanted influenza vaccine: neutralizing and haemagglutination-inhibiting antibody activity against A(H3N2) drifted influenza viruses // Vaccine. 2008. - Vol. 26. -P. 1525-1529.

19. Area H., Gunbeyaz M., Senel S. Chitosan-based systems for the delivery of vaccine antigens // Exp. Rev. Vaccines. 2009. - Vol. 8. - P. 937-953.

20. Asa P., Cao Y., Garry R. et al. Antibodies to squalene in Gulf War Syndrome // Exp. Mol. Pathol. 2000. - Vol. 68. - P. 55-64.

21. Atmar R., Keitel W., Patel S. et al. Safety and immunogenicity of nonadjuvanted and MF59-adjuvanted influenza A/H9N2 vaccine preparations // Clin. Infect. Dis. 2006. - Vol. 43. - P. 1135-1142.

22. Audsley J., Tannock G. The role of cell culture vaccines in the control of the next influenza pandemic // Exp. Opin. Biol. Ther. 2004. - Vol. 4. - P. 709-717.

23. Avakian A., Poston R., Kong F. et al. Automated mass immunization of poultry: the prospect for nonreplicating human adenovirus-vectored in ovo vaccines // Exp. Rev. Vaccines. 2007. Vol. 6. - P. 457-465.

24. Bacon A., Makin J., Sizer P. et al. Carbohydrate biopolymers enhance antibody responses to mucosally delivered vaccine antigens // Infect. Immun. 2000. -Vol. 68. - P. 5764-5770.

25. Banzhoff A., Gasparini R., Laghi-Pasini F. et al. MF59-adjuvanted H5N1 vaccine induces immunologic memory and heterotypic antibody responses in non-elderly and elderly adults // PLoS ONE. 2009. - Vol. 4. - e4384.

26. Banzhoff A., Nacci P., Podda A. et al. A new MF59-adjuvanted influenza vaccine enchances the immune response in the elderly with chronic diseases: results from an immunogenicity meta-analysis // Gerontology. 2003. - Vol. 49. -P. 177-1784.

27. Baras B., Stittelaar K., Simon J. et al. Cross-protection against lethal H5N1 challenge in ferrets with an adjuvanted pandemic influenza vaccine // PLoS ONE. 2008. - Vol. 3. - el401.

28. Barouch D. Bovine adenovirus vectored vaccine for avian influenza // Mol. Ther. 2008. - Vol. 16. - P. 807-808.

29. Baxter announces final PI/II data for H5N1 influenza vaccine // Pharm. Japan. -2007. Vol. 2037. - P. 14.

30. Beato M., Toffan A., De Nardi R. et al. A conventional, inactivated oil emulsion vaccine suppresses shedding and prevents viral meat colonisation in commercial (Pekin) ducks challenged with HP AI H5N1 // Vaccine. 2007. -Vol. 25. - P. 4064-4072.

31. Beigel J., Voell J., Huang C. et al. Safety and immunogenicity of multiple and higher doses of an inactivated influenza A/H5N1 vaccine // J. Infect. Dis. -2009.-Vol. 200.-P. 501-509.

32. Belshe R., Gruber W., Mendelman P. et al. Efficacy of vaccination with live attenuated, cold-adapted, trivalent, intranasal influenza viurs vaccine against a variant (A/Sydney) not contained in the vaccine // J. Pediatr. 2000. - Vol. 136. -P. 168-175.

33. Bernstein D., Edwards K., Dekker C. et al. Effects of adjuvants on the safety and immunogenicity of an avian influenza H5N1 vaccine in adults // J. Infect Dis. 2008. - Vol. 197. - P. 667-675.

34. Betakova T. M2 protein-a proton channel of influenza a virus // Curr. Pharm. Des. 2007. - Vol. 13. - P. 3231-3235.

35. Beyer W., Palache A., Osterhaus A. Comparison of serology and reactogenicity between influenza subunit vaccines and whole virus or split vaccines: a review and meta-analysis of the literature // Clin. Drug Investig. 1998. - Vol. 15. - P. 1-12.

36. Boltz D., Douangngeun B., Sinthasak S. et al. Field assessment of an H5N1 inactivated vaccine in chickens and ducks in Lao PDR // Arch. Virol. 2009. -Vol. 154.-P. 939-944.

37. Bos M., Nielen M., Koch G. et al. Effect of H7N1 vaccination on highly pathogenic avian influenza H7N7 virus transmission in turkeys // Vaccine. -2008. Vol. 26. - P. 6322-6328.

38. Bouma A., Muljono A., Jatikusumah A. et al. Field trial for assessment of avian influenza vaccination effectiveness in Indonesia // Rev. Sei. Tech. 2008. - Vol. 27. - P. 633-642.

39. Brady R., Treanor J., Atmar R. et al. Safety and immunogenicity of a subvirion inactivated influenza A/H5N1 vaccine with or without aluminum hydroxide among healthy elderly adults // Vaccine. 2009. - Vol. 27. - P. 5091-5095.

40. Bresson J., Perronne C., Launay O. et al. Safety and immunogenicity of an inactivated split-virion influenza A/Vietnam/1194/2004 (H5N1) vaccine: phase I randomised trial // Lancet. 2006. - Vol. 367. - P. 1657-1664.

41. Bublot M., Le Gros F., Nieddu D. et al. Efficacy of two H5N9-inactivated vaccines against challenge with a recent H5N1 highly pathogenic avian influenza isolate from a chicken in Thailand // Avian Dis. 2007. - Vol. 51. - P. 332-337.

42. Bublot M., Pritchard N., Cruz J. et al. Efficacy of a fowlpox-vectored avian influenza H5 vaccine against Asian H5N1 highly pathogenic avian influenza virus challenge // Avian Dis. 2007. - Vol. 51. - P. 498-500.

43. Bublot M., Pritchard N., Swayne D. et al. Development and use of fowlpox vectored vaccines for avian influenza // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2006. - Vol. 1081.-P. 193-201.

44. Bungenera L., Geeraedtsa F., Ter Veera W. et al. Alum boosts Th2-type antibody responses to whole-inactivated virus influenza vaccine in mice but does not confer superior protection // Vaccine. 2008. - Vol. 26. - P. 23502359.

45. Capua I., Alexander D. Avian influenza: recent developments // Avian Pathol. -2004. Vol. 33. - P. 393-404.

46. Capua I., Marangon S. The use of vaccination as an option for the control of avian influenza // Avian Pathol. 2003. - Vol. 32. - P. 335-343.

47. Capua I., Marangon S. Vaccination for avian influenza in Asia // Vaccine. -2004. Vol. 22. - P. 4137-4138.

48. Carragher D., Kaminski D., Moquin A. et al. A novel role for non-neutralizing antibodies against nucleoprotein in facilitating resistance to influenza virus // J. Immunol. 2008. - Vol. 181. - P. 4168-4176.

49. Carter N., Plosker G. Prepandemic influenza vaccine H5N1 (split virion, inactivated, adjuvanted) Prepandrix.: a review of its use as an active immunization against influenza A subtype H5N1 virus // Biodrugs. 2008. -Vol. 22. - P. 279-292.

50. CDC. CDC expansion of use of live attenuated influenza vaccine (FluMist) to children aged 2-4 years and other FluMist changes for 2007-08 influenza season // Morb. Mort.Weekl. Rep. 2007. - Vol. 56. - P. 1217-1219.

51. CDC. Preliminary assesment of effectiveness of the 2003/2004 inactivated influenza vaccine // Morb. Mort. Weekl. Rep. 2004. - Vol. 53. - P. 8-11.

52. Chen H. Avian influenza vaccination: the experience in China // Rev. Sci. Tech. 2009. - Vol. 28. - P. 267-274.

53. Chen H., Matsuoka Y., Swayne D. et al. Generation and characterization of a cold-adapted influenza A H9N2 reassortant as a live pandemic influenza virus vaccine candidate // Vaccine. 2003. - Vol. 21. - P. 4430-436.

54. Chen M., Cheng T., Huang Y. et al. A consensus-hemagglutinin-based DNA vaccine that protects mice against divergent H5N1 influenza viruses II Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2008. - Vol. 105. - P. 13538-13543.

55. Chen Q., Kuang H., Wang H. et al. Comparing the ability of a series of viral protein-expressing plasmid DNAs to protect against H5N1 influenza virus // Virus Genes. 2008. - Vol. 38. - P. 30-38.

56. Chen S., Sun L., Liu W. et al. Recombinant fowlpox virus coexpressing HA and NA gene from subtype H5N1 of avain influenza virus and its protective efficacy // Wei Sheng Wu Xue Bao. 2006. - Vol. 46. - P. 111-114.

57. Chen Z., Santos C., Aspelund A. et al. Evaluation of live attenuated influenza A H6 vaccines in mice and ferrets // J. Virol. 2008. - Vol. 83. - P. 65-72.

58. Chotpitayasunondh T., Thisyakorn U., Pancharoen C. et al. Safety, humoral and cell mediated immune responses to two formulations of an inactivated, split-virion influenza A/H5N1 vaccine in children // PLoS ONE. 2008. - Vol. 3. -e4028.

59. Coopmans M., Wilbrink B., Conyon M. et al. Transmission of H7N7 avian influenza A virus to human beings during a large outbreak in commercial poultry farm in the Netherlands // Lancet. 2004. - Vol. 363. - P. 587-593.

60. Couch R., Keitel A., Cate T. et al. Prevention of influenza virus infection by current inactivated influenza vaccines // Options for the control of influenza III: ed. Brown L. et al. Amsterdam, 1996. - P. 97-106.

61. Cox M. Progress on baculovirus-derived influenza vaccines // Curr. Opin. Mol. Ther. 2008. - Vol. 10. - P. 56-61.

62. Cox M. Vaccines in development against avian influenza // Minerva Med. -2007.-Vol. 98.-P. 145-153.

63. De Donato S., Granoff D., Minutello M. et al. Safety and immunogenicity of MF59-adjuvanted influenza vaccine in the elderly // Vaccine. 1999. - Vol. 17. -P. 3094-101.

64. De Filette M., Martens W., Roose K. et al. An Influenza A vaccine based on tetrameric ectodomain of matrix protein 2 // J. Biol. Chem. 2008. - Vol. 283. -P. 11382-11387.

65. Doerr H., Varwig D., Allwinn R. et al. Will the next human influenza pandemic be caused by the virus of the avian flu A/H5N1? // Med. Microbiol. Immunol. -2006.-Vol. 195.-P. 45-47.

66. Ehrlich H., Muller M., Oh H. et al. A clinical trial of a whole-virus H5N1 vaccine derived from cell culture // N. Engl. J. Med. 2008. - Vol. 358. - P. 2573-2584.

67. Eliasson D., Bakkouri K., Schon K. et al. CTA1-M2e-DD: a novel mucosal adjuvant targeted influenza vaccine // Vaccine. 2008. - Vol. 26. - P. 12431252.

68. Ernst W., Kim H., Tumpey T. et al. Protection against HI, H5, H6 and H9 influenza A infection with liposomal matrix 2 epitope vaccines // Vaccine. -2006. Vol. 24. - P. 5158-5168.

69. ESWI newsletter to policy makers // Eur. Sci. Workgr. Influenza . 2007. - Vol. 7.-P. 1.

70. Fan H., Li J., Li Z. et al. Cloning of M and NP gene of H5N1 avian influenza virus and immune efficacy of their DNA vaccines // Virol, sinica. 2007. - Vol. 22. - P. 46-52.

71. Fan S., Deng G., Song J. et al. Two amino acid residues in the matrix protein Ml contribute to the virulence difference of H5N1 avian influenza viruses in mice // Virology. 2008. - Vol. 384. - P. 28-32.

72. Fan S., Gao Y., Shinya K. et al. Immunogenicity and protective efficacy of a live attenuated H5N1 vaccine in nonhuman primates // PLoS Pathog. 2009. -Vol. 5.-el000409.

73. FDA. FDA approves first human avian influenza vaccine // 2007. URL: http://www.fda.gov/bbs/topics/NEWS/2007/NEW01611 .html

74. Felt O., Buri P., Gurny R. Chitosan: a unique polysaccharide for drug delivery // Drug Dev. Ind. Pharm. 1998. - Vol. 24. - P. 979-993.

75. Feng J., Zhao L., Yu Q. Receptor-mediated stimulatory effect of oligochitosan in macrophages // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. - Vol. 317. - P. 414-420.

76. Forrest H., Khalenkov A., Govorkova E. et al. Single- and multiple-clade influenza A H5N1 vaccines induce cross protection in ferrets // Vaccine. 2009. -Vol. 27.-P. 4187-4195.

77. From the Centers for Disease Control and Prevention. Isolation of avian influenza A(H5N1) viruses from humans Hong Kong, May-December 1997 // J. Am. Med. Ass. - 1998. - Vol. 279. - P. 263-264.

78. Fu T., Grimm K., Citron M. et al. Comparative immunogenicity evaluations of influenza A virus M2 peptide as recombinant virus like particle or conjugate vaccines in mice and monkeys // Vaccine. 2009. - Vol. 27. - P. 1440-1447.

79. Furger M., Hoop R., Steinmetz H. et al. Humoral immune response to avian influenza vaccination over a six-month period in different species of captive wild birds // Avian Dis. 2008. - Vol. 52. - P. 222-228.

80. Gabriel G., Gam H., Wegmann M. et al. The potential of a protease activation mutant of a highly pathogenic avian influenza virus for a pandemic live vaccine // Vaccine. 2008. - Vol. 26. - P. 956-965.

81. Galli G., Hancock K., Hoschler K. et al. Fast rise of broadly cross-reactive antibodies after boosting long-lived human memory B cells primed by an MF59 adjuvanted prepandemic vaccine // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009. - Vol. 106.-P. 7962-7967.

82. Galli G., Medini D., Borgogni E. et al. Adjuvanted H5N1 vaccine induces early CD4+ T cell response that predicts long-term persistence of protective antibody levels // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009. - Vol. 106. - P. 3877-3882.

83. Gao W., Soloff A., Lu X. et al. Protection of mice and poultry from lethal H5N1 avian influenza virus through adenovirus-based immunization // J. Virol. 2006. - Vol. 80. - P. 1959-1964.

84. Garg S., Hoelscher M., Belser J. et al. Needle-free skin patch delivery of a vaccine for a potentially pandemic influenza virus provides protection against lethal challenge in mice // Clin. Vaccine Immunol. 2007. - Vol. 14. - P. 926928.

85. Ge J., Deng G., Wen Z. et al. Newcastle disease virus-based live attenuated vaccine completely protects chickens and mice from lethal challenge of homologous and heterologous H5N1 avian influenza viruses // J. Virol. 2007. -Vol. 81.-P. 150-158.

86. Ghendon Y., Kaira A., Elshina G. The effect of mass influenza immunization in children on morbidity of the unvaccinated elderly // Epidemiol Infect. 2006. - Vol. 134. - P. 71-78.

87. Ghendon Y., Markushin S., Akopova I. et al. Development of cell culture (MDCK) live cold-adapted (CA) attenuated influenza vaccine // Vaccine. -2005. Vol. 23. - P. 4678-4684.

88. Ghendon Y., Markushin S., Krivtsov G. et al. Chitosan as an adjuvant for parenterally administered inactivated influenza vaccines // Arch. Virol. 2008. -Vol. 153.-P. 831-837.

89. Gherardi R., Coquet M., Cherin P. et al. Macrophagic myofasciitis lesions assess long-term persistence of vaccine-derived aluminium hydroxide in muscle //Brain.-2001.-Vol. 124.-P. 1821-1831.

90. Gillis J. An avian influenza vaccine for humans targeting the polymerase B2 protein inside the capsid instead of hemagglutinin or neuramidase on the virus surface // Med. Hypotheses. 2006. - Vol. 66. - P. 975-977.

91. Gioia C., Castilletti C., Tempestilli M. et al. Cross-subtype immunity against avian influenza in persons recently vaccinated for influenza // Emerg. Infect. Dis. 2008. - Vol. 14. - P. 121-128.

92. Girard M., Osterhaus A., Pervikov Y. et al. Report of the third meeting on Influenza vaccines that induce broad spectrum and long-lasting immune responses, WHO, 3-4 December 2007 // Vaccine. 2008. - Vol. 26. - P. 24432450.

93. Girard M., Palkonyay L., Kieny M. Report of the 4th meeting on the «Evaluation of pandemic influenza prototype vaccines in clinical trials» WHO, 14—15 February 2008 // Vaccine. 2008. - Vol. 26. - P. 4975-4977.

94. Groth N., Montomoli E., Gentile C. et al. Safety, tolerability and immunogenicity of a mammalian cell-culture-derived influenza vaccine: A sequential Phase I and Phase II clinical trial // Vaccine 2009. - Vol. 27. - P. 786-791.

95. Gupta R., Siber G. Adjuvants for human vaccines current status, problems and future prospects // Vaccine. - 1995. - Vol. 13. - P. 1263-1276.

96. Hagenaars N., Verheul R., Mooren I. et al. Relationship between structure and adjuvanticity of N,N,N-trimethyl chitosan (TMC) structural variants in a nasal influenza vaccine // J. Control Release. 2009. - Vol. 140. - P. 126-133.

97. Hale B., Randall R., Ortin J. et al. The multifunctional NS1 protein of influenza A viruses // J. Gen. Virol. 2008. - Vol. 89. - P. 2359-2376.

98. Hampson A., Osterhaus A., Pervikov Y. et al. Report of the second meeting on the development of influenza vaccines that induce broad-spectrum and long-lasting immune responses // Vaccine. 2006. - Vol. 24. - P. 4897-4900.

99. Hasegawa H., Ichinohe T., Strong P. et al. Protection against influenza vims infection by intranasal administration of hemagglutinin vaccine with chitin microparticles as an adjuvant // J. Med. Virol. 2005. - Vol. 75. - P. 130-136.

100. Hehme N., Engelman H., Kuenzel W. et al. Immunogenicity of a monovalent, aluminum-adjuvanted influenza whole virus vaccine for pandemic use // Virus Res. 2004. - Vol. 103. - P. 163-171.

101. Hehme N., Engelman H., Kuenzel W. et al. Pandemic preparedness: lessons learnt from H2N2 and H9N2 candidate vaccines // Med. Microbiol. Immunol. -2002.-Vol. 191.-P. 203-208.

102. Heiny A., Miotto O., Srinivasan K. et al. Evolutionarily conserved protein sequences of influenza a viruses, avian and human, as vaccine targets // PLoS ONE. 2007. - Vol. 2.-el 190.

103. Hickman D., Hossain M., Song H. et al. An avian live attenuated master backbone for potential use in epidemic and pandemic influenza vaccines // J. Gen. Virol. 2008. - Vol. 89. - P. 2682-2690.

104. Hirst G. The agglutination of red cells by allantoic fluid of chicken embryos infected with influenza virus // Science. 1941. - Vol. 94. - P. 22-23.

105. Hobson D., Lane C., Beare S. et al. Serological studies on adult volunteers inoculated with oil-adjuvant asian influenza vaccine // Br. Med. J. 1964. - Vol. 2. - P. 271-274.

106. Hoelscher M., Garg S., Bangari D. et al. Development of adenoviral-vector-based pandemic influenza vaccine against antigenically distinct human H5N1 strains in mice // Lancet. 2006. - Vol. 367. - P. 475-481.

107. Holman D., Wang D., Raja N. et al. Multi-antigen vaccines based on complex adenovirus vectors induce protective immune responses against H5N1 avian influenza viruses // Vaccine. 2008. - Vol. 26. - P. 2627-2639.

108. Horimoto T., Murakami S., Muramoto Y. et al. Enhanced growth of seed viruses for H5N1 influenza vaccines // Virology. 2007. - Vol. 366. - P. 23-27.

109. Horimoto T., Takada A., Fujii K. et al. The development and characterization of H5 influenza virus vaccines derived from a 2003 human isolate // Vaccine. 2006. - Vol. 24. - P. 3669-3676.

110. Hu A., Weng T., Tseng Y. et al. Microcarrier-based MDCK cell culture system for the production of influenza H5N1 vaccines // Vaccine. 2008. - Vol. 26. - P. 5736-5740.

111. Huang M., Huang C., Lin S. et al. Enhancement of potent antibody and T-cell responses by a single-dose, novel nanoemulsion-formulated pandemic influenza vaccine // Microbes Infect. 2009. - Vol. 11. - P. 654-660.

112. Huleatt J., Nakaar V., Desai P. et al. Potent immunogenicity and efficacy ofa universal influenza vaccine candidate comprising a recombinant fusion219protein linking influenza M2e to the TLR5 ligand flagellin // Vaccine. 2008. -Vol. 26.-P. 201-214.

113. Ilium L. Chitosan and its use as a pharmaceutical excipient // Pharm. Res. -1998.-Vol. 15.-P. 1326-1331.

114. Ilium L., Farraj N., Davis S. Chitosan as a novel nasal delivery system for peptide drugs // Pharm. Res. 1994. - Vol. 11. - P. 1186-1189.

115. Ilium L., Jabbal-Gill I., Hinchcliffe M. et al. Chitosan as a novel nasal delivery system for vaccines // Adv. Drug Deliv. Rev. 2001. - Vol. 51. - P. 8196.

116. Isoda N., Sakoda Y., Kishida N. et al. Potency of an inactivated avian influenza vaccine prepared from a non-pathogenic H5N1 reassortant virus generated between isolates from migratory ducks in Asia // Arch. Virol. 2008. -Vol. 153.-P. 1685-1692.

117. Jadhao S., Achenbach J., Swayne D. et al. Development of Eurasian H7N7/PR8 high growth reassortant virus for clinical evaluation as an inactivated pandemic influenza vaccine // Vaccine. 2008. - Vol. 26. - P. 17421750.

118. James C., Foong Y., Mansfield J. et al. Evaluation of a positive marker of avian influenza vaccination in ducks for use in H5N1 surveillance // Vaccine. -2008. Vol. 26. - P. 5345-5351.

119. Johansson B., Brett I. An inactivated subvirion influenza A (H5N1) vaccine //N. Engl. J. Med. 2006. - Vol. 354. - P. 2724-2725.

120. Joseph T., McAuliffe J., Lu B. et al. A live attenuated cold-adapted influenza A H7N3 virus vaccine provides protection against homologous and heterologous H7 viruses in mice and ferrets // Virology. 2008. - Vol. 378. - P. 123-132.

121. Kalhoro N., Veits J., Rautenschlein S. et al. A recombinant vesicular stomatitis virus replicón vaccine protects chickens from highly pathogenic avian influenza virus (H7N1) // Vaccine. 2009. - Vol. 27. - P. 1174-1183.

122. Kang S., Yoo D., Lipatov A. et al. Induction of long-term protective immune responses by influenza H5N1 virus-like particles // PLoS ONE. 2009. - Vol. 4. - e4667.

123. Karron R., Talaat K., Luke C. et al. Evaluation of two live attenuated cold-adapted H5N1 influenza virus vaccines in healthy adults // Vaccine. 2009. -Vol. 27. - P. 4953-4960.

124. Kas H. Chitosan: properties, preparations and application to microparticulate systems // J. Microencapsul. 1997. - Vol. 14. - P. 689-711.

125. Kato Y., Onishi H., Machida Y. Contribution of chitosan and its derivatives to cancer chemotherapy // In Vivo. 2005. - Vol. 19. - P. 301-310.

126. Kaverin N., Webster R. Impairment of multicycle influenza virus growth in Vero (WHO) cells by loss of trypsin activity // J. Virol. 1995. - Vol. 69. - P. 2700-2703.

127. Kawaoka Y., Webster R. Sequence requirements for cleavage activation of influenza virus hemagglutinins in mammalian cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. - Vol. 85. - P. 324-328.

128. Kendirgi F., Yun N., Linde N. et al. Novel linear DNA vaccines induce protective immune responses against lethal infection with influenza virus type A/H5N1 // Hum. Vaccine. 2008. - Vol. 4. - P. 410-419.

129. Kim J., Seiler P., Forrest H. et al. Pathogenicity and vaccine efficacy of different clades of Asian H5N1 avian influenza A viruses in domestic ducks // J. Virol. 2008. - Vol. 82. - P. 11374-11382.

130. Kistner O., Howard M., Spruth M. et al. Cell culture (Vero) derived whole virus (H5N1) vaccine based on wild-type virus strain induces cross-protective immune responses // Vaccine. 2007. - Vol. 25. - P. 6028-6036.

131. Klenk H., Rott R., Orlich M. et al. Activation of influenza A viruses by trypsin treatment // Virology. 1975. - Vol. 68. - P. 426-439.

132. Kodihalli S., Goto H., Kobasa D. et al. DNA vaccine encoding hemagglutinin provides protective immunity against H5N1 influenza virus infection in mice // J. Virol. 1999. - Vol. 73. - P. 2094-2098.

133. Kreijtz J., Suezer Y., van Amerongen G. et al. Recombinant modified vaccinia virus Ankara-based vaccine induces protective immunity in mice against infection with influenza virus H5N1 // J. Infect. Dis. 2007. - Vol. 195. -P. 1598-1606.

134. Laddy D., Yan J., Corbitt N. et al. Immunogenicity of novel consensus-based DNA vaccines against avian influenza // Vaccine. 2007. - Vol. 25. - P. 2984-2989.

135. Laddy D., Yan J., Kutzler M. et al. Heterosubtypic protection against pathogenic human and avian influenza viruses via in vivo electroporation of synthetic consensus DNA antigens // PLoS ONE. 2008. - Vol. 3. - e2517.

136. Lan D., Shi X., Wang Y. et al. Construction of a recombinant HVT virus expressing the HA gene of avian influenza virus H5N1 via Rde/ET recombination system // Wei Sheng Wu Xue Bao. 2009. - Vol. 49. - P. 78-84.

137. Lazarowitz S., Choppin R. Enchancement of infectivity of influenza A and B viruses by proteolytic cleavage of hemagglutinin polypeptide // Virology. -1975.-Vol. 68.-P. 440-454.

138. Le Gall-Recule G., Cherbonnel M., Pelotte N. et al. Importance of a prime-boost DNA/protein vaccination to protect chickens against low-pathogenic H7 avian influenza infection // Avian Dis. 2007. - Vol. 51. - P. 490-494.

139. Lee J., Kim H., Seo S. Genetic characterization and protective immunity of cold-adapted attenuated avian H9N2 influenza vaccine // Vaccine. 2008. -Vol. 26. - P. 6569-6576.

140. Lee K., Ha W., Park W. Blood compatibility and biodegradability of partially N-acylated chitosan derivatives // Biomaterials. 1995. - Vol. 16. - P. 1211-1216.

141. Lee L., Ha D:, Simmons C. et al. Memory T cells established by seasonal human influenza A infection cross-react with avian influenza A (H5N1) in healthy individuals // J. Clin. Invest. 2008. - Vol. 118. - P. 3478-3490.

142. Lee Y., Sung H., Choi J. et al. Effects of homologous and heterologous neuraminidase vaccines in chickens against H5N1 highly pathogenic avian influenza// Avian Dis. 2007. - Vol. 51. - P. 476-478.

143. Leroux-Roels I., Bernhard R., Gerard P. et al. Broad Clade 2 cross-reactive immunity induced by an adjuvanted clade 1 rH5Nl pandemic influenza vaccine // PLoS ONE. 2008. - Vol. 3. - el665.

144. Leroux-Roels I., Borkowski A., Vanwolleghem T. et al. Antigen sparing and cross-reactive immunity with an adjuvanted rH5Nl prototype pandemic influenza vaccine: a randomised controlled trial // Lancet. 2007. - Vol. 370. -P. 580-589.

145. Leroux-Roels I., Van der Wielen M., Kafeja F. et al. Humoral and cellular immune responses to split-virion H5N1 influenza vaccine in young and elderly adults // Vaccine. 2009. - Vol. 27. - P. 6918-6925.

146. Li C., Ping J., Jing B. et al. H5N1 influenza marker vaccine for serological differentiation between vaccinated and infected chickens // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008. - Vol. 372. - P. 293-297.

147. Li Z., Ramay H., Hauch K. et al. Chitosan-alginate hybrid scaffolds for bone tissue engineering//Biomaterials. 2005. - Vol. 26. - P. 3919-3928.

148. Lin J., Li C., Wang X. et al. Antibody persistence after 2-dose priming and booster response to a third dose of an inactivated, adjuvanted, whole-virion H5N1 vaccine // J. Infect. Dis. 2009. - Vol. 199.-P. 184-187.

149. Lin J., Zhang J., Dong X. et al. Safety and immunogenicity of an inactivated adjuvanted whole-virion influenza A (H5N1) vaccine: a phase I randomised controlled trial // Lancet. 2006. - Vol. 368. - P. 991-997.

150. Lin Y., Deng M., Wu S. et al. Baculovirus-derived hemagglutinin vaccine protects chickens from lethal homologous virus H5N1 challenge // J. Vet. Med. Sci. 2008. - Vol. 70. - P. 1147-1152.

151. Lipatov A., Govorkova E., Webby R. et. al. Influenza: emergence and control // J. Virol. 2004. - Vol. 78. - P. 209-213.

152. Lipatov A., Webby R., Govorkova E. et al. Efficacy of H5 influenza vaccine produced by reverse genetics in a lethal mouse model // J. Infect. Dis. 2005. -Vol. 191.-P. 1216-1220.

153. Liu M., Li S., Hu S. et al. Display of avian influenza virus nucleoprotein on Bacillus thuringiensis cell surface using CTC as a fusion partner // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2008. - Vol. 78. - P. 669-676.

154. Lu X., Edwards L., Desheva J. et al. Cross-protective immunity in mice induced by live-attenuated or inactivated vaccines against highly pathogenic influenza A (H5N1) viruses // Vaccine. 2006. - Vol. 24. - P. 6588-6593.

155. Maas R., Tacken M., van Zoelen D. et al. Dose response effects of avian influenza (H7N7) vaccination of chickens: serology, clinical protection and reduction of virus excretion // Vaccine. 2009. - Vol. 27. - P. 3592-3597.

156. Maeda T., Shintani Y., Nakano K. et al. Failure of inactivated influenza A vaccine to protect healthy children aged 6-24 months // Pediatr. Int. 2004. -Vol. 46.-P. 122-125.

157. Mahmood K., Bright R., Mytle N. et al. H5N1 VLP vaccine induced protection in ferrets against lethal challenge with highly pathogenic H5N1 influenza viruses // Vaccine. 2008. - Vol. 26. - P. 5393-5399.

158. Mao J., Zhao L., Yin Y. et al. Structure and properties of bilayer chitosan-gelatin scaffolds // Biomaterials. 2003. - Vol. 24. - P. 1067-1074.

159. Marangon S., Cecchinato M., Capua I. Use of vaccination in avian influenza control and eradication // Zoonoses Public Health. 2008. - Vol. 55. - P. 65-72.

160. Marchetti M., Kuhnel U., Colombo G. et al. Cost-effectiveness of adjuvanted influenza vaccination of healthy children 6 to 60 months of age // Hum. Vaccin. 2007. - Vol. 3. - P. 14-22.

161. Mayrhofer J., Coulibaly S., Hessel A. et al. Non-replicating vaccinia vectors expressing the H5 influenza hemagglutinin produced in modified Vero cells induce robust protection // J. Virol. 2009. - Vol. 83. - P. 5192-5203.

162. Meng D., Hui Z., Yang J. et al. Reduced egg production in hens associated with avian influenza vaccines and formalin levels // Avian Dis. 2009. - Vol. 53.-P. 16-20.

163. Merten O., Managuerra J., Hannoun C. et al. Production of influenza virus in cell culture for vaccine preparation // Novel strategies in design and production of vaccines: ed. Cohen S., Shafferman A. Plenum Press, 1995. - P. 141-151.

164. Merten O., Managuerra J., Hannoun C. et al. Production of influenza virus in serum-free mammalian cell cultures // Dev. Biol. Stand. 1999. - Vol. 98. - P. 23-37.

165. Middleton D., Bingham J., Selleck P. et al. Efficacy of inactivated vaccines against H5N1 avian influenza infection in ducks // Virology. 2007. - Vol. 359. -P. 66-71.

166. Molinari N., Ortega-Sanchez I., Messonnier M. et al. The annual impact of seasonal influenza in the US: measuring disease burden and costs // Vaccine. -2007. Vol. 25. - P. 5086-5096.

167. Monto A., Davenport F., Napier J. et al. Effect of vaccination of a schoolage population on the course of an A2/Hong Kong influenza epidemic // Bull WHO. 1969. - Vol. 41. - P. 537-542.

168. Mosca F., Tritto E., Muzzi A. et al. Molecular and cellular signatures of human vaccine adjuvants // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. - Vol. 105. - P.10501-10506.

169. Murakami S., Horimoto T., Mai L. et al. Growth determinants for H5N1 influenza vaccine seed viruses in MDCK cells // J. Virol. 2008. - Vol. 82. - P.10502-10509.

170. Mutsch M., Zhou W., Rhodes P. et al. Use of the Inactivated Intranasal Influenza Vaccine and the Risk of Bell's Palsy in Switzerland // N. Engl. J. Med. 2004. - Vol. 350. - P. 896-903.

171. Nayak B., Rout S., Kumar S. et al. Immunization of chickens with Newcastle disease virus expressing H5 hemagglutinin protects against highly pathogenic H5N1 avian influenza viruses // PLoS One. 2009. - Vol. 4. -e6509.

172. Nemchinov L., Natilla A. Transient expression of the ectodomain of matrix protein 2 (M2e) of avian influenza A virus in plants // Protein Expr. Purif. -2007.-Vol. 56.-P. 153-159.

173. Nichol K. Efficacy/clinical effectiveness of inactivated influenza vims vaccines in adults // Textbook of Influenza / ed. Nicholson K., Webster R., Hay A. Blackwell Sci., 1998. - P. 358-372.

174. Nicholson K., Thompson C., Clap J. et al. Safety and immunogenicity of whole-virus, alum-adjuvanted whole-vims, virosomal, and whole-virus intradermal influenza A/H9N2 vaccine formulations // Vaccine. 2009. - Vol. 28.-P. 171-178.

175. Nishimura K., Ishihara C., Ukei S. et al. Stimulation of cytokine production in mice using deacetylated chitin // Vaccine. 1986. - Vol. 4. - P. 151-156.

176. Nishimura K., Nishimura S., Nishi N. et al. Adjuvant activity of chitin derivatives in mice and guinea-pigs // Vaccine. 1985. - Vol. 3. - P. 379-384.

177. Nishimura K., Nishimura S., Nishi N. et al. Immunological activity of chitin and its derivatives // Vaccine. 1984. - Vol. 2. - P. 93-99.

178. Nolan T., Richmond P., Formica N. et al. Safety and immunogenicity of a prototype adjuvanted inactivated split-virus influenza A (H5N1) vaccine in infants and children // Vaccine. 2008. - Vol. 26. - P. 6383-6391.

179. Nolan T., Richmond P., Skeljo M. et al. Phase I and II randomised trials of the safety and immunogenicity of a prototype adjuvanted inactivated split-virus influenza A (H5N1) vaccine in healthy adults // Vaccine. 2008. - Vol. 26. - P. 4160-4167.

180. Nwe N., He Q., Damrongwatanapokin S. et al. Expression of hemagglutinin protein from the avian influenza vims H5N1 in a baculovirus/insect cell system significantly enhanced by suspension culture // BMC Microbiol. 2006. - Vol. 6.-P. 16.

181. O'Brien J. 11th annual conference on vaccine research // Exp. Rev. Vaccines. 2008. - Vol. 7. - P. 721-723.

182. Onishi H., Machida Y. Biodégradation and distribution of water-soluble chitosan in mice // Biomaterials. 1999. - Vol. 20. - P. 175-182.

183. Palache A., Beyer W., Osterhaus A. Influenza vaccine dosages // Vaccine. -2008. Vol. 26. - P. 2305-2306.

184. Palache B. New vaccine approaches for seasonal and pandemic influenza // Vaccine. 2008. - Vol. 26. - P. 6232-6236.

185. Parida R., Shaila M., Mukheijee S. et al. Computational analysis of proteome of H5N1 avian influenza virus to define T cell epitopes with vaccine potential // Vaccine. 2007. - Vol. 25. - P. 7530-7539.

186. Park M., Steel J., Garcia-Sastre A. et al. Engineered viral vaccine constructs with dual specificity: avian influenza and Newcastle disease // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. - Vol. 103. - P. 8203-8208.

187. Patriarca P. Use of cell lines for the production use of cell lines for the production: an appraisal of technical, manufacturing, and regulatory considerations. WHO, 2007. - 12 p.

188. Peluso G., Petillo O., Ranieri M. et al. Chitosan-mediated stimulation of macrophage function // Biomaterials. 1994. - Vol. 15. - P. 1215-1220.

189. Philippa J., Baas C., Beyer W. et al. Vaccination against highly pathogenic avian influenza H5N1 virus in zoos using an adjuvanted inactivated H5N2 vaccine // Vaccine. 2007. - Vol. 25. - P. 3800-3808.

190. Podda A., Del Guidice G. MF59-adjuvanted vaccines: increased immunogenicity with an optimal safety profile // Exp. Rev. Vaccines. 2003. -Vol. 2. - P. 197-204.

191. Poetri O., Bouma A., Murtini S. et al. An inactivated H5N2 vaccine reduces transmission of highly pathogenic H5N1 avian influenza virus among native chickens // Vaccine. 2009. - Vol. 27. - P. 2864-2869.

192. Porporatto C., Bianco I., Correa S. Local and systemic activity of the polysaccharide chitosan at lymphoid tissues after oral administration // J. Leukoc. Biol. 2005. - Vol. 78. - P. 62-69.

193. Potter C. Inactivated influenza virus vaccines // Basic and applied influenza research: ed. Beare A. Boca Raton: CRC press. - P. 116-158.

194. Qiao C., Jiang Y., Tian G. et al. Recombinant fowlpox virus vector-based vaccine completely protects chickens from H5N1 avian influenza virus // Vaccine. 2008. - Vol. 81. - P. 234-238.

195. Qiao C., Tian G., Jiang Y. et al. Vaccines developed for H5 highly pathogenic avian influenza in China // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2006. - Vol. 1081.-P. 182-192.

196. Qiao C., Yu K., Jiang Y. et al. Development of a recombinant fowlpox virus vector-based vaccine of H5N1 subtype avian influenza // Dev. Biol. (Basel). -2006.-Vol. 124.-P. 127-132.

197. Qiu M., Fang F., Chen Y. et al. Protection against avian influenza H9N2 vims challenge by immunization with hemagglutinin- or neuraminidase-expressing DNA in BALB/c mice // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006. -Vol. 343. - P. 1124-1131.

198. Read R., Naylor S., Potter C. et al. Effective nasal influenza vaccine delivery using chitosan // Vaccine. 2005. - Vol. 23. - P. 4367-4374.

199. Reed S., Bertholet S., Coler R. et al. New horizons in adjuvants for vaccine development // Trends in Immunology. 2008. - Vol. 30. - P. 23-32.

200. Reisinger K., Block S., Izu A. et al. Subunit influenza vaccines produced from cell culture or in embryonated chicken eggs: comparison of safety, reactogenicity, and immunogenicity // J. Infect. Dis. 2009. - Vol. 200. - P. 849-857.

201. Rimmelzwaan G., Osterhaus A. The role of adjuvants for pandemic influenza vaccines // ESWI the influenza bulletin. 2008. - Vol. 23. - P. 3-4.

202. Romanova J., Krenn B., Wolschek M. et al. Preclinical evaluation of a replication-deficient intranasal DeltaNSl H5N1 influenza vaccine // PLoS One. 2009. - Vol. 4. - e5984.

203. Rudenko L., Desheva J., Korovkin S. et al. Safety and immunogenicity of live attenuated influenza reassortant H5 vaccine (phase I-II clinical trials) // Influenza Other Resp. Viruses. 2008. - Vol. 2. - P. 203-209.

204. Rudneva I., Timofeeva T., Shilov A. et al. Effect of gene constellation and postreassortment amino acid change on the phenotypic features of H5 influenza virus reassortants // Arch. Virol. 2007. - Vol. 152. - P. 1139-1145.

205. Rudolf M., Poppel M., Frohlich A. et al. Efficacy of a commercial inactivated H5 influenza vaccine against highly pathogenic avian influenza H5N1 in waterfowl evaluated under field conditions // Rev. Sci. Tech. 2009. -Vol. 28.-P. 275-291.

206. Rumke H., Bayas J., de Juanes J. et al. Safety and reactogenicity profile of an adjuvanted H5N1 pandemic candidate vaccine in adults within a phase III safety trial // Vaccine. 2008. - Vol. 26. - P. 2378-2388.

207. Saito T., Lim W., Tashiro M. Attenuation of a human H9N2 influenza virus in mammalian host by reassortment with an avian influenza virus // Arch. Virol. 2004. - Vol. 149. - P. 1397-1407.

208. Schalk J., Mooi F., Berbers G. et al. Preclinical and clinical safety studies on DNA vaccines // Human Vaccines. 2006. - Vol. 2. - P. 45-53.

209. Schotsaert M., De Filette M., Fiers W. et al. Universal M2 ectodomain-based influenza A vaccines: preclinical and clinical developments // Exp. Rev. Vaccines. 2009. - Vol. 8. - P. 499-508.

210. Schwartz J., Buonocore L., Roberts A. et al. Vesicular stomatitis virus vectors expressing avian influenza H5 HA induce cross-neutralizing antibodies and long-term protection // Virology. 2007. - Vol. 366. - P. 166-173.

211. Schwarzer J., Rapp E., Henning R. et al. Glycan analysis in cell culture-based influenza vaccine production: Influence of host cell line and virus strain on the glycosylation pattern of viral hemagglutinin // Vaccine. 2009. - Vol. 27. - P. 4625-4336.

212. Seferian P., Matinez M. Immune stimulating activity of two new chitosan containing adjuvant formulations // Vaccine. 2000. - Vol. 19. - P. 661-668.

213. Shen S., Mahadevappa G., Oh H. et al. Comparing the antibody responses against recombinant hemagglutinin proteins of avian influenza A (H5N1) virus expressed in insect cells and bacteria // J. Med. Virol. 2008. - Vol. 80. - P. 1972-1983.

214. Shi H., Liu X., Zhang X. et al. Generation of an attenuated H5N1 avian influenza virus vaccine with all eight genes from avian viruses // Vaccine. -2007. Vol. 25. - P. 7379-7384.

215. Shoji Y., Bi H., Musiychuk K. et al. Plant-derived hemagglutinin protects ferrets against challenge infection with the A/Indonesia/05/05 strain of avian influenza // Vaccine. 2008. - Vol. 27. - P. 1087-1092.

216. Shoji Y., Farrance C., Bi H. et al. Immunogenicity of hemagglutinin from A/Bar-headed Goose/Qinghai/1A/05 and A/Anhui/1/05 strains of H5N1 influenza viruses produced in Nicotiana benthamiana plants // Vaccine. 2009. -Vol. 27.-P. 1087-1092.

217. Singh D., Ray A. Biomedical application of chitin, chitosan and their derivatives // Rev. Macromol. Chem. Phys. 2000. - Vol. C40. - P. 69-83.

218. Singh N., Pandey A., Jayashankar L. et al. Bovine adenoviral vector-based H5N1 influenza vaccine overcomes exceptionally high levels of pre-existing immunity against human adenovirus // Mol. Ther. 2008. - Vol. 16. - P. 965971.

219. Singla A., Chawla M. Chitosan: some pharmaceutical and biological aspects an update // J. Pharm. Pharmacol. - 2001. - Vol. 53. - P. 1047-1067.

220. Skountzou I., Quan F., Jacob J. et al. Transcutaneous immunization with inactivated influenza virus induces protective immune responses // Vaccine. -2006.-Vol. 24.-P. 6110-6119.

221. Smirnov Y., Lipatov A., Van Beek R. et al. Characterization of adaptation of an avian influenza A (H5N2) virus to a mammalian host // Acta Virol. 2000. -Vol. 44.-P. 1-8.

222. Smith K., Colvin C., Weber P. et al. High titer growth of human and avian influenza viruses in an immortalized chick embryo cell line without the need for exogenous proteases // Vaccine. 2008. - Vol. 26. - P. 3778-3782.

223. Smith W., Andrews C., Laidlow P. A virus obtained from influenza patients // Lancet. 1933. - Vol. 2. - P. 66-68.

224. Soda K., Ozaki H., Sakoda Y. et al. Antigenic and genetic analysis of H5 influenza viruses isolated from water birds for the purpose of vaccine use // Arch. Virol. 2008. - Vol. 153. - P. 2041-2048.

225. Soda K., Sakoda Y., Isoda N. et al. Development of vaccine strains of H5 and H7 influenza viruses // Jpn. J. Vet. Res. 2008. - Vol. 55. - P. 93-98.

226. Song H., Nieto G., Perez D. A new generation of modified live-attenuated avian influenza viruses using a two-strategy combination as potential vaccine candidates // J. Virol. 2007. - Vol. 81. - P. 9238-9248.

227. Song L., Zhang Y., Yun N. et al. Superior efficacy of a recombinant flagellin: H5N1 HA globular head vaccine is determined by the placement of the globular head within flagellin // Vaccine. 2009. - Vol. 27. - P. 5875-5884.

228. Sorlier P., Hartmann D., Denuziere A. et al. Preparation and development of anti-chitosan antibodies // J. Biomed. Mater. Res. 2003. - Vol. 67. - P. 766774.

229. Spitsin S., Andrianov V., Pogrebnyak N. et al. Immunological assessment of plant-derived avian flu H5/HA1 variants // Vaccine. 2009. - Vol. 27. - P. 1289-1292.

230. Steel J., Burmakina S., Thomas C. et al. A combination in-ovo vaccine for avian influenza virus and Newcastle disease virus // Vaccine. 2007. - Vol. 26. -P. 522-531.

231. Steel J., Lowen A., Pena L. et al. Live attenuated influenza viruses containing NS1 truncations as vaccine candidates against H5N1 HPAI // J. Virol. 2008. - Vol. 83. - P. 1742-1753.

232. Steensels M., Bublot M., van Borm S. et al. Prime-boost vaccination with a fowlpox vector and an inactivated avian influenza vaccine is highly immunogenic in Pekin ducks challenged with Asian H5N1 HPAI // Vaccine. -2008. Vol. 27. - P. 646-654.

233. Steensels M., Van Bonn S., Lambrecht B. et al. Efficacy of an inactivated and a fowlpox-vectored vaccine in Muscovy ducks against an Asian H5N1 highly pathogenic avian influenza viral challenge // Avian Dis. 2007. - Vol. 51. - P. 325-331.

234. Stephenson I., Democratis J. Influenza: current threat from avian influenza // Br. Med. Bull. 2006. - Vol. 75-76. - P. 63-80.

235. Stephenson I., Gust I., Pervikov Y. et al. Development of vaccines against influenza H5 // Lancet Infect Dis. 2006. - Vol. 6. - P. 458-460.

236. Stephenson I., Nicholson K., Colegate A. et al. Boosting immunity to influenza H5N1 with MF59-adjuvanted H5N3 A/Duck/Singapore/97 vaccine in a primed human population // Vaccine. 2003. - Vol. 21. - P. 1687-1693.

237. Stephenson I., Nicholson K., Gluck R. et al. Safety and antigenicity of whole virus and subunit influenza A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) vaccine in healthy adults: phase I randomised trial // Lancet. 2003. - Vol. 362. - P. 1959-1966.

238. Stephenson I., Nicholson K., Hoschler K. et al. Antigenically distinct MF59-adjuvanted vaccine to boost immunity to H5N1 // N. Engl. J. M. 2008. - Vol. 359.-P. 1631-1633.

239. Stowe J., Andrews N., Wise L. et al. Bell's Palsy and parenteral inactivated influenza vaccine // Human Vaccines. 2006. - Vol. 2. - P. 110-112.

240. Suguitan A., McAuliffe J., Mills K. et al. Live, attenuated influenza A H5N1 candidate vaccines provide broad cross-protection in mice and ferrets // PLoS Med. -2006. -Vol. 3. e360.

241. Suh J., Mattew H. Application of chitosan-based polysaccharide biomaterials in cartilage tissue engineering: a review // Biomaterials. 2000. -Vol. 21.-P. 2589-2598.

242. Sun S., Cui Z., Wang J. et al. Protective efficacy of vaccination against highly pathogenic avian influenza is dramatically suppressed by early infection of chickens with reticuloendotheliosis virus // Avian Pathol. 2009. - Vol. 38. -P. 31-34.

243. Swayne D. Principles for vaccine protection in chickens and domestic waterfowl against avian influenza: emphasis on Asian H5N1 high pathogenicity avian influenza// Ann. N.Y. Acad. Sci. 2006. - Vol. 1081. - P. 174-181.

244. Sylte M., Hubby B., Suarez D. Influenza neuraminidase antibodies provide partial protection for chickens against high pathogenic avian influenza infection // Vaccine. 2007. - Vol. 25. - P. 3763-3772.

245. Szymczakiewicz-Multanowska A., Groth N., Bugarini R. et al. Safety and immunogenicity of a novel influenza subunit vaccine produced in mammalian cell culture // J. Infect. Dis. 2009. - Vol. 200. - P. 841-848.

246. Talaat K., Karron R., Callahan R. et al. A live attenuated H7N3 influenza virus vaccine is well tolerated and immunogenic in a phase I trial in healthy adults // Vaccine. 2009. - Vol. 27. - P. 3744-3753.

247. Thompson W., Shay D., Weintraub E. et al. Mortality associated with influenza and respiratory syncytial virus in the United States // J. Am. Med. Ass. 2003. - Vol. 289. - P. 179-186.

248. Tomihata K., Ikada Y. In vitro and in vivo degradation of films of chitin and its deacetylated derivatives // Biomaterials. 1997. - Vol. 18. - P. 567-575.

249. Toro H., Tang D. Protection of chickens against avian influenza with nonreplicating adenovirus-vectored vaccine // Poult. Sci. 2009. - Vol. 88. - P. 867-871.

250. Toro H., Tang D., Suarez D. et al. Protection of chickens against avian influenza with non-replicating adenovirus-vectored vaccine // Vaccine. 2008. -Vol. 26. - P. 2640-2646.

251. Toro H., Tang D., Suarez D. et al. Protective avian influenza in ovo vaccination with non-replicating human adenovirus vector // Vaccine. 2007. -Vol. 25.-P. 2886-2891.

252. Treanor J., Campbell J., Zangwill K. et al. Safety and immunogenicity of an inactivated subvirion influenza A (H5N1) vaccine // N. Engl. J. Med. 2006. -Vol. 354.-P. 1341-1351.

253. Treanor J., Schiff G., Hayden F. et al. Safety and immunogenicity of a baculovirus-expressed hemagglutinin influenza vaccine: a randomized controlled trial // J. Am. Med. Ass. 2007. - Vol. 297. - P. 1577-1582.

254. Treanor J., Wilkinson B., Masseoud F. et al. Safety and immunogenicity of a recombinant hemagglutinin vaccine for H5 influenza in humans // Vaccine. -2001.-Vol. 19.-P. 1732-1737.

255. Vajo Z., Kosa L., Szilvasy I. et al. Safety and immunogenicity of a prepandemic influenza A (H5N1) vaccine in children // Pediatr. Infect. Dis J. -2008. Vol. 27. - P. 1052-1056.

256. Van Damme P., Kafeja-Osterhuis F., van der Wielen M. et al. Safety and efficacy of a novel microneedle device for dose sparing intradermal influenza vaccination in healthy adults // Vaccine. 2009. - Vol. 27. - P. 454-459.

257. Van der Berg T., Lambrecht B., Marche S. et al. Influenza vaccines and vaccination strategies in birds // Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. -2008.-Vol. 31.-P. 121-165.

258. Van der Goot J., van Boven M., Koch G. et al. Variable effect of vaccination against highly pathogenic avian influenza (H7N7) virus on disease and transmission in pheasants and teals // Vaccine. 2007. - Vol. 25. - P. 83188325.

259. Van der Goot J., van Boven M., Stegeman A. et al. Transmission of highly pathogenic avian influenza H5N1 virus in Pekin ducks is significantly reduced by a genetically distant H5N2 vaccine // Virology. 2008. - Vol. 382. - P. 9197.

260. VandeVord P., Matthew H., DeSilva S. et al. Evaluation of the biocompatibility of a chitosan scaffold in mice // J. Biomed. Mater. Res. 2002. - Vol. 59. - P. 585-590.

261. Veits J., Romer-Oberdorfer A., Helferich D. et al. Protective efficacy of several vaccines against highly pathogenic H5N1 avian influenza virus under experimental conditions // Vaccine. 2008. - Vol. 26. - P. 1688-1696.

262. Veits J., Wiesner D., Fuchs W. et al. Newcastle disease virus expressing H5 hemagglutinin gene protects chickens against Newcastle disease and avian influenza // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. - Vol. 103. - P. 8197-9202.

263. Vesikari T., Pellegrini M., Karvonen A. et al. Enhanced immunogenicity of seasonal influenza vaccines in young children using MF59 adjuvant // Pediatr. Infect. Dis. 2009. - Vol. 28. - P. 563-571.

264. Vincent-Falquet J., Peyron L., Souvras M. et al. Qualification of working cell banks for the Vero cell line to produce licensed human vaccines // Dev. Biol. Stand. 1989. - Vol. 70. - P. 153-156.

265. Voeten J., Claas E., Brands R. Generation and characterization of reassortant influenza A viruses propagated in serum-free cultured MDCK-SF1 cells // Dev. Biol. Stand. 1999. - Vol. 98. - P. 77-87.

266. Vu T., Farish S., Jenkins M. et al. A meta-analysis of effectiveness of influenza vaccine in persons aged 65 years and over living in the community // Vaccine. 2002. - Vol. 20. - P. 1831-1836.

267. Wang C., Luo Y., Chen Y. et al. The cleavage of the hemagglutinin protein of H5N2 avian influenza virus in yeast // J. Virol. Methods. 2007. - Vol. 146. -P. 293-297.

268. Wang C., Wang S., Lai C. et al. Impact of influenza vaccination on major cause-specific mortality // Vaccine. 2007. - Vol. 25. - P. 1196-1203.

269. Wang K., Holtz K., Anderson K. et al. Expression and purification of an influenza hemagglutinin one step closer to a recombinant protein-based influenza vaccine // Vaccine. - 2006. - Vol. 24. - P. 2176-2185.

270. Wang L., Suarez D., Pantin-Jackwood M. et al. Characterization of influenza virus variants with different sizes of the non-structural (NS) genes and their potential as a live influenza vaccine in poultry // Vaccine. 2008. - Vol. 26. - P. 3580-3586.

271. Wang S., Ke C., Zou L. et al. A Novel emulsion adjuvant increases the immunogenic responses and protective efficacy of an inactivated influenza vaccine in BALB/c mice // Intervirology. 2009. - Vol. 52. - P. 252-257.

272. Watanabe S., Watanabe T., Kawaoka Y. Influenza A virus lacking M2 protein as a live attenuated vaccine // J. Virol. 2009. - Vol. 83. - P. 5947-5950.

273. Webby R., Perez D., Coleman J. et al. Responsiveness to a pandemic alert: use of reverse genetics for rapid development of influenza vaccines // Lancet. -2004. Vol. 363. - P. 1099-1103.

274. Webster R., Govorkova E. H5N1 influenza continuing evolution and spread // N. Engl. J. Med. - 2006. - Vol. 355. - P. 2174-2177.

275. Webster R., Guan Y., Peiris M. et al. H5N1 influenza continues to circulate and change // Microbe. 2006. - Vol. 1. - P. 559-565.

276. Webster R., Rott R. Influenza virus A pathogenicity: the pivotal role of hemagglutinin // Cell. 1987. - Vol. 50. - P. 656-666.

277. Webster R., Webby J., Hoffmann E. et al. The immunogenicity and efficacy against H5N1 challenge of reverse genetics-derived H5N3 influenza vaccine in ducks and chickens // Virology. 2006. - Vol. 351. - P. 303-311.

278. Wei C., Xu L., Kong W. et al. Comparative efficacy of neutralizing antibodies elicited by recombinant hemagglutinin proteins from avian H5N1 influenza virus // J. Virol. 2008. - Vol. 82. - P. 6200-6208.

279. Wen K., Qiu L., Wang Y. et al. Expression and identification of H5 subtype hemagglutinin of avian influenza A virus in insect cells // Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 2007. - Vol. 27. - P. 20-23.

280. WHO. Antigenic and genetic characteristics of influenza A(H5N1) viruses andcandidate vaccine viruses developed for potential use in human vaccines // Wkly Epidem. Rec. 2009. - Vol. 84. - P. 12-16.

281. WHO. Global pandemic influenza action plan to increase vaccine supply // 2006. URL: http://www.who.int/csr/resources/publications/influenza/ /CDSEPRGIP20061 .pdf.

282. WHO. Global pandemic influenza action plan to increase vaccine supply. -WHO, 2006. 24 p.

283. WHO. Influenza // Wkly Epidem. Rec. 2002. - Vol. 77. - P. 229-240.

284. WHO. Influenza vaccines // Wkly Epidem. Rec. 2005. - Vol. 80. - P. 277288.

285. WHO. Pandemic influenza A (H1N1) 2009 virus vaccine conclusions and recommendations from the October 2009 meeting of the immunization Strategic Advisory Group of Experts // Wkly Epidem. Rec. - 2009. - Vol. 84. -P. 505-516.

286. WHO. Requirements for the use of animal cells as in vitro substrate for the production of biologicals // Requirements for Biological Substances N 50 WHO Tech. Rep. Ser. WHO, 1998. - Vol. N 878, Annex 1. - P. 20-56.

287. WHO. URL: http://www.who.int/csr/disease/avianinfluenza/en/index.html.

288. WHO. WHO-confirmed human cases of avian influenza A (H5N1) infection // Wkly Epidem. Rec. 2008. - Vol. 83. - P. 413-420.

289. Wilschut J. McElhaney J., Palache A. Influenza. Elseiver, 2006. - 240 p.

290. Wiselka M. Vaccine safety // Textbook of Influenza: ed. Nicholson K., Webster R., Hay A. Blackwell Sci., 1998. - P. 346-357.

291. Wood J., Robertson J. Development of a vaccine for humans against highly pathogenic avian influenza virus // Euro surveillance. 2004. - Vol. 9. - P. 3132.

292. Wu F., Yuan X., Huang W. et al. Heterosubtypic protection conferred by combined vaccination with M2e peptide and split influenza vaccine // Vaccine. 2008. - Vol. 27. - P. 6095-6101.

293. Wu Q., Fang L., Wu X. et al. A pseudotype baculovirus-mediated vaccine confers protective immunity against lethal challenge with H5N1 avian influenza virus in mice and chickens // Mol. Immunol. 2009. - Vol. 46. - P. 2210-2217.

294. Xie H., Liu T., Lu X. et al. A live attenuated H1N1 Ml mutant provides broad cross-protection against influenza A viruses, including highly pathogenic

295. A/Vietnam/1203/2004, in mice // J. Infect. Dis. 2009. - Vol. 200. - P. 18741883.

296. Xu Y., Jin N., Xia Z. et al. Expression of AIV subtype H5HA, H7HA and H9HA hemagglutinin gene in Pichia pastoris // Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 2006. - Vol. 22. - P. 231-236.

297. Yang K., He F., Li S. et al. Expression of H5N1 avian influenza virus haemagglutinin protein in pichia pastoris by high-density cell fermentation // Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 2009. - Vol. 25. - P. 773-778.

298. Yongkiettrakul S., Boonyapakron K., Jongkaewwattana A. et al. Avian influenza A/H5N1 neuraminidase expressed in yeast with a functional head domain // J. Virol. Methods. 2008. - Vol. 156. - P. 44-51.

299. Youil R., Su Q., Toner T. et al. Comparative study of influenza virus replication in Vero and MDCK cell lines // J. Virol. Methods. 2004. - Vol. 120.-P. 23-31.

300. Zaharoff D., Rogers C., Hance K. et al. Chitosan solution enhances both humoral and cell-mediated immune responses to subcutaneous vaccination // Vaccine. 2007. - Vol. 25. - P. 2085-2094.

301. Zheng L., Wang F., Yang Z. et al. A single immunization with HA DNA vaccine by electroporation induces early protection against H5N1 avian influenza virus challenge in mice // BMC Infect. Dis. 2009. - Vol. 9. - P. 17.

302. Zhirnov O., Isaeva E., Konakova T. et al. Protection against mouse and avian influenza A strains via vaccination with a combination of conserved proteins NP, Ml and NS1 // Influenza other respir viruses. 2007. - Vol. 1. - P. 71-79.

303. Zhou W., Pool V., DeStefano F. et al. A potential signal of Bell's Palsy afterparenteral inactivated influenza vaccines: reports to the Vaccine Adverse Event241

Информация о работе

Васильев, Юрий Михайлович
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.02.02

Диссертация

Оптимизация размножения вирусов гриппа птиц в различных субстратах и совершенствование инактивированных вакцин против вирусов гриппа птиц - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы