Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Оптимизация методов диагностики Helicobacter pylori-инфекции у больных хроническими воспалительными заболеваниями гепатобилиарной системы

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Оптимизация методов диагностики Helicobacter pylori-инфекции у больных хроническими воспалительными заболеваниями гепатобилиарной системы"

На правах рукописи

Исаева Гузель Шавхатовиа

ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ HELICOBACTER PYLORI-ИНФЕКЦИИ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ1ГВОСПАЛИТЕЛЬНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ ГЕПАТОБИЛИАРНОЙ СИСТЕМЫ

03.02.03 — микробиологии

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

1 2 СЕН 2013

Москва- 2013

005532876

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные консультанты:

доктор медицинских наук Сслькопа Евгения Петровна

доктор биологических наук,

профессор Ллёшкин Владимир Андрнановнч

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор,

директор, Институт инженерной иммунологии Нчелинцев Сергей Юрьевич

доктор медицинских наук, профессор,

руководитель отдела молекулярной микробиологии и эпидемиологии, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт детских инфекций»

Федерального медико-биологического агентства России Сидоренко Сергей Владимирович

доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой инфекционных болезней, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский

университет» Минздравсоцразвития Российской Федерации Фазылов Вильдаи Хайруллаевнч

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Первый Московский государственный медицинский университет им.И.М.Сеченова» Минздрава России

Защита состоится « » /О 2013 года в 10 часов на заседании диссертационного совета

Д.208.046.01 в Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, г.Москва, ул.Адмирала Макарова, д.10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального бюджетного учреждения науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека

Автореферат разослан "_"__2013 года.

Ученый секретарь диссертационного советау

доктор медицинских наук /( Ольга Юрьевна Борисова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Болезни желчного пузыря и желчевыводящнх путей и печени составляют одну из важнейших медицинских и социальных проблем: во всем мире отмечается постоянный рост заболеваний гепатобилиарной системы. Хронический некалькулезный холецистит является одним из самых распространенных заболеваний не только среди болезней билиарного тракта, но и среди заболеваний органов пищеварения (Ильиченко A.A., 2001). Хроническим калькулезньш холециститом страдает до 10% взрослого населения развитых стран. Из года в год растет количество операций на желчных путях, а также число послеоперационных осложнений, которые заставляют прибегать к повторным хирургическим вмешательствам и нередко приводят к стойкой потере трудоспособности больного.

Этиология заболеваний желчевыводящнх путей до настоящего времени окончательно не установлена. В желчи больных с патологией бил парной системы обнаруживают патогенные (сальмонеллы, лептоспиры и др.) и условно-патогенные бактерии (кишечная палочка, клебсиеллы, протей, эитеробактер, стафилококки, энтерококки и др.), вирус гепатита А, грибы рода Candida, возбудители протозойных и глистных инвазий. В печати полнились сообщения об обнаружении ДНК бактерий рода Helicobacter в органах гепатобилиарной системы (Avenaud Р. et al., 2000; Casswall Т.Н. et al., 2010; Dore M.P. et al., 2002; Esmat G. et al., 2012; Fan X.G. et al., 2002; Fukuda K. et al, 2002; Karagin P. et al., 2010; Lee J.-W et al., 2010; Moricz A. et al., 2010; Rocha M. et al., 2005; Silva L.D. et al., 2011; Xuan S.Y. et al., 2006). Роль Helicobacter pylori в развитии воспалительных заболеваний гепатобилиарной системы окончательно не изучена. Возможное участие Н.pylori в патогенезе заболеваний гепатобилиарной системы подтверждают положительные результаты молекулярно-генетических, серологических исследований, выявление цитотоксического действия Н.pylori на клеточные культуры гепатощггов in vitro и в опытах in vivo на животных моделях (Zhou D. et al., 2011). Обнаружение ДНК Н.pylori в образцах слизистой оболочки желчного пузыря при холециститах, холелитиазе и карциноме сочеталось с выявлением этого микроорганизма в тканях иммуногистохимическими методами, что указывает на возможность обитания бактерии в билиарном тракте (Yakoob J. et al., 2011). Двухлетнее изучение патогенного действия Н.pylori на мышей линии C57BL/6, зараженных перорально, показало наличие сочетанного поражения слизистой оболочки желудка и печени в виде воспаления, фиброза, гиперплазии гепатоцитов (Tian X.F. et al., 2008) и развитие первичного билиарного цирроза (Goo M.J. et al., 2008). Выявление корреляции между присутствием ДНК хеликобактеров и повышением клеточной пролиферации желчного эпителия демонстрирует высокую вероятность участия этих бактерий в генезе заболеваний билиарной системы (Fukuda К. et al., 2002).

Штаммы Н. pylori отличает большое разнообразие. Для клинических изолятов Н.pylori, выявляемых у больных с гастродуоденалыюй патологией, характерна выраженная генетическая гетерогенность в отношении факторов вирулентности -продуктов генов cagA, vacA, ЬаЬА2 (Yamaoka Y., 1999). Определение связи между генотипами Н. pylori и клиническими проявлениями у лиц, инфицированных

определенными штаммами, представляет большой научный и практический интерес, но вопрос о генотипах изолятов H.pyloi-i, колонизирующих гепатобилиарную систему остается не изученньш.

Следует заметить, что в большинстве опубликованных работ указывается на трудности получения чистой культуры хеликобактеров: сообщения об успешном выделении бактерий рода Helicobacter из печени и желчи единичны (de Magalhaes Queiroz D.M. et al., 2001; Xuan S.Y. et al., 2006). Трудности бактериологического метода исследования могут быть обусловлены особенностями микроорганизма, недостатками технического исполнения или несовершенством питательных сред, что требует разработки новых диагностических подходов к детекции бактерий рода Helicobacter и совершенствования технологий культивирования микроаэрофнльных и капнофильных микроорганизмов.

Потенциальная роль желчетолерантных хеликобактеров в генезе поражений печени и билиарного тракта может быть объяснена наличием определенных факторов патогенности этих возбудителей, запускающих каскад патологических процессов в гепатобилиарной системе , но их роль в поражении эпителия желчного пузыря и гепатоцитов остается не выясненной. Отсутствие «золотого» стандарта микробиологического подтверждения обнаружения хеликобактеров в тканях печеш!, желчного пузыря и желчи может оказывать сдерживающий эффект в исследованиях по изучению этиологической значимости этих бактерий в патогенезе заболеваний гепатобилиарной системы. Все вышесказанное объективно обосновывает необходимость оптимизации микробиологической диагностики заболеваний гепатобилиарной системы, ассоциированных с Н.pylori — инфекцией, совершенствования и создания новых технологий культивирования и детекции бактерий рода Helicobacter.

Цель исследования: оптимизация методов диагностики Helicobacter pylori инфекции у больных хроническими воспалительными заболеваниями гепатобилиарной системы с разработкой новых биотехнологий культивирования и детекции микроаэрофнльных и капнофильных бактерий рода Helicobacter.

Задачи исследования:

1. Изучить микробиоценозы различных биотопов желудочно-кишечного тракта (желудка, 12-перстной кишки и желчного пузыря) у больных хроническими воспалительными заболеваниями гепатобилиарной системы.

2. Определить частоту обнаружения Н.pylori в органах гепатобилиарной системы и морфологические изменения слизистой оболочки желчного пузыря при Н.pylori — инфекции.

3. Выявить частоту обнаружения Н.pylori молекулярно-генетическими методами и изучить гены патогенности изолятов Н.pylori, выделенных от больных с гепатобилиарной патологией.

4. Провести микробиологический мониторинг циркуляции Н.pylori - инфекции с изучением динамики распространенности хеликобактериоза среди жителей г.Казани.

5. Усовершенствовать диагностику Н.pylori -инфекции путем разработки новых биотехнологии культивирования и детекции.

6. Разработать алгоритм комплексного исследования, направленного на выявление инфицирования Н.pylori больных с гепатобилиарной патологией.

Научная новшна

Впервые выполнено одновременное изучение пристеночной микрофлоры слизистой оболочки желудка, 12- перстной кишки, желчного пузыря и желчных протоков с морфологической оценкой патологических изменений слизистых оболочек больных с воспалительными заболеваниями билиарного тракта и пациентов контрольной группы без гепатобилиарной патологии, что позволило оценить значение расстройств микробиоценозов биотопов гастродуоденалыюй зоны и билиарного тракта в развитии хронических воспалительных заболеваний гепатобилиарной системы. Выявлена высокая частота инфицирования органов гепатобилиарной системы Н.pylori у больных хроническим некалькулезньш холециститом и циррозом печени, ассоциированная с развитием патологических морфологических изменений, что дало возможность установить этиологическое значение этого микроорганизма в патогенезе хронических воспалительных заболеваний гепатобилиарной системы. Обнаружены закономерности

колонизации различных биотопов микроорганизмами (бактериями, грибами, простейшими) с определением частоты и степени обсемененности, что позволило продемонстрировать прямую связь гастродуоденального дисмикробиоцепоза и микробохолии, а также верифицировать восходящий (дуоденогенньш) путь инфицирования желчных путей.

Впервые в результате изучения генов патогенности изолятов Л.pylori, выделенных из органов гепатобилиарной системы, определены доминирующие генотипы, выявлены закономерности распределения Тох+ и Тох- генотипов при патологии гепатобилиарной системы. Обнаружены существенные различия генотипов H.pylori, выделенных из гастродуоденалыюй зоны, желчного пузыря и печени, что позволило выявить феномен специфичной колонизации гепатобилиарного тракта штаммами хеликобактеров, отличных от изолятов, колонизирующих желудок или двенадцатиперстную кишку. Впервые получены новые данные о преимущественной роли cagA - негативных штаммов H.pylori, связанные с выявлением ранее неизученных сторон патогенеза хеликобактериоза, при этом показана роль данного микроорганизма в развитии хронических воспалительных заболеваний гепатобилиарной системы.

Установлена высокая частота распространенности H.pylori инфекции среди жителей города Казани как среди детского, так и взрослого населения с тенденцией повышения инфицироваиности с возрастом и достижения в подростковом возрасте уровней инфицирования взрослых, что указывает на сохранение высоких степеней риска для этой популяции развития онкологических заболеваний желудочно-кишечного тракта и требует широкого внедрения скришшговых методов диагностики хеликобактериоза и проведения своевременной эрадикационной терапии с целыо первичной профилактики злокачественных новообразований.

Разработан оптимальный диагностический комплекс исследований для применения в условиях микробиологических лабораторий, который включает современные высокоэффективные микробиологические и молекулярно-генетнческие методы и отвечает актуальным требованиям технологии обследования пациентов с целью выявления возбудителя и назначения эрадикационной терапии. Создана комбинированная питательная среда для накопления бактерий рода Helicobacter, позволяющая облегчить идентификацию и постановку антибиотикограмм, а также разработан метод окраски катноновым синим (О) основным для детекции Н.pylori и выявления патоморфологических изменений.

Теоретическая значимость работы

Исследования микробиоценозов различных биотопов желудочно-кишечного тракта (желудка, 12-перстной кишки и желчного пузыря) у больных хроническими воспалительными заболеваниями гепатобилиарной системы позволили установить связь дисбиотических нарушений с развитием патологических морфологических изменений в органах гепатобилиарной системы. Научно обоснована и разработана новая концепция этиологической и патогенетической роли Н. pylori в развитии хронических воспалительных заболеваний гепатобилиарной системы. Выявление закономерностей колонизации органов гепатобилиарной системы различными генетическими вариантами Н.pylori позволило раскрыть ранее неизученные вопросы патогенеза хеликобактериоза и послужило основой для развития инфекционной теории роли микроорганизмов в патогенезе воспалительных заболеваний гепатобилиарной системы.

Практическая значимость исследования.

Выявлена корреляция патоморфологических изменений слизистой оболочки желчного эпителия с микробохолией, которая позволяет предположить значение микробной колонизации желчных путей в развитии хронического воспаления. При этом тяжесть морфологических изменений находится в прямой зависимости от колонизации Н.pylori и степени обсемененности. Результаты, полученные в ходе исследования, подтверждают предположение о существовании желчетолерантных вариантов H.pylori, что указывает на необходимость коррекции микробиоценозов желчевыводящих путей с помощью противомикробных и пробиотических препаратов.

Высокая частота распространенности H.pylori инфекции среди жителей города Казани как среди детского, так и взрослого населешш указывает на необходимость проведения комплексных противоэпидемических и санитарно-гигиенических мероприятий по разрыву путей передачи инфекции, внедрения скрининговых малоинвазивных методов для наиболее полного выявления инфицированных и проведешш эрадикационной терапии.

Для накопления культуры H.pylori рекомендован метод тонкослойного двухфазного культивирования, обладающий рядом преимуществ, а именно отсутствие необходимости использования дополшгтельного оборудования для поддержания микроаэрофильных условий в жидкой фазе среды, использование

стандартных питательных сред (Колумбия агара и бульон Шедлера), накопление чистой культуры Н.pylori в количестве, достаточном для морфологической, биохимической идентификации и постановки антибиотикограммы. Разработана биотехнология культивирования микроаэрофильных и капнофильных бактерий на двухфазной питательной среде, основанная на биологических особенностях хеликобактеров, которая создает условия роста и размножения, приближенные к естественным, когда часть жизненного цикла микроба требует плотной питательной среды, а другое стадии проходят в жидкой фазе, что свойственно эпителиальным патогенам, к которым относятся бактерии рода Helicobacter, размножающиеся пристеночно и в просвете органа.

Окраска катионовым синим О (основным) для цитологического метода диагностики Н.pylori обеспечивает высокую контрастность микроорганизмов, а также позволяет оценить морфологические изменения окружающих тканей. Предложенный метод отличается быстротой, простотой, доступностью исполнения, воспроизводимостью полученных результатов и может быть использован как для первичной диагностики Н.pylori инфекции, так и для контроля эрадикационной терапии.

Разработан алгоритм комплексного обнаружения Н.pylori у больных хроническими воспалительными заболеваниями гепатобнлиарной системы. В качестве «золотого» стандарта детекции бактерий рода Helicobacter в органах гепатобилиарной системы предложена многоступенчатая полимеразная цепная реакция, которая предусматривает проведение поэтапной генетической идентификации хеликобактеров.

Основные положения, выпоснммс на защиту:

1. Нарушеши микробиоценозов гастродуоденального и гепатобилиарного биотопов указывают на возможность развития сочетанной патологии.

2. H.pylori способен колонизировать органы гепатобилиарной системы, что подтверждено цитологическим, иммуногистохимическим, молекулярно-генетическим и бактериологическим методами, и может являться одним из этиологических факторов развития хрошиеских воспалительных заболеваний гепатобилиарной системы и одним из факторов риска развития неоплазий желудочно-кишечного тракта.

3. Доминирующий генотип изолятов H.pylori, выделенных от больных хроническими воспалительными заболеваниями гепатобилиарной системы, представлен ureA+vacA+cagA-babA- подтипом.

4. Алгоритм обнаружения H.pylori, включающий морфологические, молекулярпо-генетические, микробиологические исследования с использованием биотехнологических методов, позволяет оптимизировать диагностику H.pylori - инфекции у больных с гепатобилиарной патологией.

Анробацнп работы

Диссертация апробирована на заседании Ученого Совета ФБУН «Московский

научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 27 сентября 2012 года, протокол № 7.

Основные положения диссертации доложены на IX съезде Научного общества гастроэнтерологов России (Москва, 2009); XXII International Workshop on Helicobacter and related bacteria in chronic digestive inflammation and gastric cancer (Porto, Portugal, 2009); GASTRO - 2009, UEGWAVCOG (The United European Gastroenterology Federation (UEGF) and the World Gastroenterology Organization (WGO) (London, 2009); международном форуме «Гастро-2010» (Санкт-Петербург, 2010); XXIII International Workshop on Helicobacter and related bacteria in chronic digestive inflammation and gastric cancer (Rotterdam, 2010); 8 Северо-Западной научной гастроэнтерологической сессии (С.-Петербург, 2011); XXV International Workshop on Helicobacter and related bacteria in chronic digestive inflammation and gastric cancer (Slovenia, 2012); 14 Международном Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург-Гастро-2012»; IV Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2012); X съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации» (Москва, 2012); III Международной научной онлайн конференции "Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнолопш" (Казань, 2012). Результаты исследования были представлены на Всероссийском конкурсе научных работ «Инфекция H.pylori в России» (С.-Петербург, 2010), где была отмечена дипломом почетного участника; на

II международном конкурсе научно-исследовательских работ «Инфекция Helicobacter pylori и дыхательная диагностика заболеваний и патологических состояний организма человека по выдыхаемому воздуху» (С.-Петербург, 2011); на

III международном конкурсе научно-исследовательских работ «Диагностика заболеваний желудочно-кишечного тракта по выдыхаемому воздуху» (С.Петербург, 2012).

Внедрение результатов нсслсдовашга.

Получено положительное заключение экспертизы на заявку патента на изобретение РФ №2012125394/10 «Способ тонкослойного культивирования Helicobacter pylori и двухфазная питательная среда для его осуществления».

Результаты исследования внедрены в лечебно-диагностическую работу эндоскошиеского центра и бактериологической лаборатории Государственного автономного учреждения здравоохранения «Республиканский клинический онкологический диспансер» МЗ Республики Татарстан (акт о внедрении от 5.06.2012); цитолопиеской лаборатории и эндоскошиеского центра ООО «Лечебно-диагностический центр «Фарм-Т» (г.Казань) (акт о внедрении от 3.04.2012г.). Полученные результаты внедрены в научно-исследовательскую работу научно-исследовательских лабораторий кафедр микробиологии и генетики Института фундаментальной медицины и биолопш Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Казанский Федеральный (Приволжский) университет» Мшшстерства

образования и науки Российской Федерации (акт о внедрении от 10.04.2012 г.); ООО «ГенДжин» (г.Казань) (акт о внедрении от 15.09.2012 г.); лаборатории диагностики и профилактики инфекционных заболеваний ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (акт о внедрешш от 20.09. 2012г.).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 30 научных работ, в том числе 15 статей в рецензируемых изданиях, в сборниках научных трудов и материалах конференций - 14, монография - 1. Получено положительное заключение экспертизы на заявку патента №2012125394/10.

Структура и объем диссертации.

Материалы диссертации ихчожены на 304 страницах машинописного текста, иллюстрированы 25 таблицами, 65 рисунками. Диссертационная работа включает обзор литературы, материалы и методы исследования, четыре главы собственных исследований, заключение, выводы, практические рекомендации, список литературы, содержащий 36 отечественных и 467 зарубежных источника.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Материалы. Обследовано 419 больных, обратившихся в лечебные учреждения г.Казани (Республика Татарстан), из которых 131 мужчин и 288 женщин. Средний возраст больных составил 46,2 года, из них средний возраст мужчин - 48,4 лет, женщин - 45,9 лет.

В исследовании по типу «случай-контроль» группу «случаев» составили больные с заболеваниями гепатобилнарной системы. Группу «контроля» составили пациенты без соответствующей патологии. С целью изучения патологии билиарного тракта было обследовано 290 больных хроническим холециститом, из них 185 женщин и 72 мужчин. Выборку больных хроническим некалькулезным холециститом составили 244 больных, среди которых мужчин - 71, женщин - 173. Средний возраст пациентов этой подгруппы составил 41,6 лет. Выборку пациентов хроническим калькулезным холециститом составили 46 больных, среди которых мужчин - 7, женщин - 39. Средний возраст этой подгруппы - 57,2 года. Выборку группы больных с заболеваниями печени составили 58 пациентов (мужчин - 36, женщин - 22), из которых 26 больных циррозом печени невыясненной этиологии и 32 больных вирусным гепатитом С. Средний возраст больных составил 43,2 года. Выборку контрольной подгруппы составили 69 пациентов без хронических воспалительных заболеваний гепатобилнарной системы, из которых 17 мужчин и 52 женщины. Средний возраст этой подгруппы - 42,9 года. В исследование также были включены 18 больных с различной патологией гастродуоденалыюй зоны, которым проводили диагностическую фиброэзофагогастродуоденоскопию, в ходе которой были отобраны биоптаты слизистой оболочки желудка. Биоптаты были использованы для бактериологического исследования с целью получения штаммов Н.pylori для разработки питательных сред для выделения Н.pylori.

Для изучения динамики распространенности H.pylori - инфекции в г. Казани было обследовано 905 взрослых, среди которых 567 женщин и 338 мужчин в возрасте от 18 до 80 лет, и 68 детей и подростков в возрасте от 7 до 17 лет. До назначения диагностической ФЭГДС детям был проведен дыхательный тест для определения H.pylori по составу выдыхаемого воздуха с помощью тест-системы «Хелик» индикаторными трубками (ООО «AMA», г.Санкт-Петербург). В ходе диагностической ФЭГДС у всех обследованных были отобраны биоптаты слизистой оболочки желудка для цитологического исследования.

В ходе работы был проведен следующий объем исследований (таблица 1). Таблица 1. Методы и объем проведенных исследований

№ Метод исследования Материал и объект исследования Объем исследований

1 Цитологический Желчь 750

Биоптаты слизистой оболочки желудка 55

2. Гистологический Иммуно гистохимический Биоптаты слизистой оболочки желчного пузыря 16

3. Бактериологический Желчь 64

Биоптаты слизистой оболочки желудка 18

4. Биохимический Дыхательный тест Уреазный тест 93 25

5. Молекулярно-генетический Желчь 145

Биоптаты слизистой оболочки желчного пузыря 60

Биоптаты слизистой оболочки желудка 51

Ткани печени 34

Изоляты ДНК 46

6. Метод эпидемиологического анализа Амбулаторные карты 973 больных (905 взрослых и 68 детей)

Методы исследования.

1. Гистологический метод

Гистологические и иммуногистохимические исследования проводились на базе

паталогоанатомической лаборатории Республиканской клинической больницы №2 МЗ Республики Татарстан (г.Казань). Гистологические препараты фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина с последующей спиртовой проводкой и заливкой в парафин. Гистологические срезы изготавливали на санном микротоме, окрашивали гемотоксилин - эозином. Для иммуногистохимического обнаружения Н.pylori использовали парафиновые срезы тех же блоков с применением авидин-биотин-пероксидазного метода по схеме, рекомендованной фирмой-производителем DakoCytomation (Дания). В качестве первичных антител были использованы поликлональные антитела к Н.pylori (В0471) с применением системы LSAB2 Kits с диамипобензидином и докраской ядер гематоксилином Гарриса согласно протоколу LSAB (Kit компании «Dako», Дания).

2. Цитологический метод

Цитологические исследования проведены в цитологической лаборатории ООО «Лечебно-диагностический центр «Фарм-Т»(г.Казань). Для цитологического исследования использовали мазки-отпечатки, окрашенные катионовым синим О (основным). Морфолопяеское исследование проводили в соответствии с методикой, предложенной Сигал М.С. и соавт. (1991 г.) и рекомендациями Общества цитологов России «О практической ценности окраски цитологических препаратов катионовым синим» (М., 2000) в авторской модификации. Степень обсемененности Н.pylori определяли количественными методами по шкале от 0 до 3 согласно Сиднейской системе, принятой в 1990 году (Price A.B., 1991).

3. Бактериологический метод

Бактериолопиеское исследование проведено на базе бактериологической лаборатории Республиканского онкологического клинического диспансера МЗ Республики Татарстан. Биоптаты помещали в пробирки с 5 мл транспортной тиогликолевой средой и в течение 4-6 часов с момента взятия материала доставляли в лабораторгао. Из биоптата готовили взвесь в 1 мл физиологического раствора. Производили посев по одной капле гомогената: кровяной агар, колумбийский агар с 10% кровью барана, шоколадный агар. Чашки культивировали в микроаэрофильных

условиях в течение 3-7 дней при 37 Принадлежность культур к Н. pylori определяли по характерной морфологии колоний, изучения морфологии бактерий при микроскопии мазков из выросших колоний, окрашенных по Граму и разведенным фуксином, изучения «винтообразной подвижности» в препарате «раздавленная капля» методом фазово-контрастной микроскопии, способности к росту в микроаэрофильных условиях, а также определением оксидазной, каталазной и уреазной активности. Бактериологическое исследование проводили в соответствии с методическим пособием «Диагностика, профилактика и лечение заболеваний, ассоциированных с Helicobacter pylori - инфекцией» (С-Пб., 2002).

4. Молекулярно-генетические методы

Молекулярно-генетнческое исследование проведено в лаборатории молекулярных основ патогенеза Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук и научно-исследовательской лаборатории кафедры микробиологии Федерального (Приволжского) Казанского университета.

Экстракцию и очистку ДНК из образцов осуществляли с помощью коммерческого набора «Хеликопол» (НПФ «Литех», Москва), согласно инструкции производителя. Детекцию ДНК проводили посредством ПЦР с помощью набора «Хеликопол II» (НПФ «Литех», Москва) с использованием специфических праймеров на ген игеС, согласно инструкции изготовителя. Амплификацию проводили в приборе «Терцик» (ДНК-технология», Россия). Результаты документировали с помощью видеосистемы для регистрации гелей «DNA Analyzer» (НПФ «Литех», Москва). Генотипнрование штаммов Н.pylori в отношении cagA, vacA, babA2, осуществляли с помощью наборов реагентов НПФ «Лнтех» (Москва), в соответствии с рекомендациями производителя.

Для амплификации фрагмента 16S рРНК размером 1456 п.о. использовали универсальную ПЦР F2/R4 с использованием праймеров F2-16S-CHPEC ATCCTGGCTCAGAGTGAACG и R4-16S-CHPEC CCTACGGTTACCTTGTTACGAC (Rocha М., 2005). Следующим этапом было проведение родоспецифичной ПЦР (С97/С98) для выявления фрагмента 16SрРНК бактерий рода Helicobacter размером 398 п.о. с использованием праймеров С97 GCТATGACGGGTАТС С и С98 GATTTTACCCCTACACCA (Fox J.G.,1998). Образцы ДНК, имеющие положительный результат в специфичной ПЦР для рода Helicobacter, подвергли видоспецифической ПЦР с целью детекции хеликобактеров, наиболее часто колонизирующих ГБС: Н.pylori, H.bilis, H.pitlloriim, H.rappini с использованием праймеров гомологичных участкам генов 23SрРНКН,pylori (Menard А., 2002), cdtB H.bilis, cdtBH.pullorum, ureBH.rappini (Rocha M., 2005).

5. Биохимический метод

Включал определение уреазной активности в биоптатах слизистой оболочки желудка и 12-перстной кишки с помощью индикаторных дисков «Хелпил»-теста (ООО «АМА», г. Санкт-Петербург). Исследования были проведены на базе Государственного учреждения здравоохранения «Республиканская клиническая инфекционная больница» МЗ Республики Татарстан.

Дыхательный тест для определения Н.pylori по составу выдыхаемого воздуха с помощью тест-системы «Хелик» с индикаторными трубками (ООО «АМА», г.Санкт-Петербург) проведен на базе ООО «ЛДЦ «Фарм - Т» и Государственного учреждения здравоохранения «Республиканская клиническая инфекционная больница» МЗ Республики Татарстан.

6. Биотехнологический метод

Исследования по разработке метода тонкослойного культивировашш на двухфазной питательной среде проведены на базе ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

7. Метод эпидемиологического анализа.

Анализ распространенности хеликобактериоза в г.Казани проведено совместно с зав. лабораторией диагностики и профилактики инфекционных заболеваний ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиолопш и микробиологии им. Г.Н. Габричевского».

8. Статистическая обработка результатов и программное обеспечение. Для вычисления средних величин, средней квадратичной ошибки, критерия достоверности разности средних величин использовали программный пакет Microsoft Office 2000 и Statistica 6.0 for Windows.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Во всех порциях желчи больных хроническими воспалительными заболеваниями желчного пузыря была обнаружена смешанная микрофлора. Видовая принадлежность флоры желчи больных совпала полностью или частично во всех трех локализациях: содержимом 12-перстной кишки, протоковой и пузырной желчи. По видовому составу преобладали кокки (стафилококки и стрептококки), палочки, Н.pylori, фузобактерш!, актиномицеты, грибы рода Candida, лямблии (таблица 2).

Таблица 2. Микрофлора желчи у больных хроническим некалькулезным холециститом и контрольной группы.__

Порция/ микро-зм Порция А (п/%) Порция В (п/%) Порция С (п/%)

Опыт, группа (п=210) Контроль (п=40) Опыт. группа (п=210) Контроль(п=40) Опыт. группа (п=210) Контроль (п=40)

Н.pylori 178 84,76± 2,48% 20 50±7,9% 87 41,43± 3,39% 10 25±6,85% 133 63,33±3,3 3% 12 30±3,16%

Кокки 200 95,24± 1,47% 34 85±5,б5% 162 77Д4±2,% 15 37,5±7,65% 161 76,67±2,9 2°/о 25 62,5±7,65%

Палочки 121 57,62± 3,41% 25 62,5±7,65 % 97 46,19± 3,44% 14 35±7,54% 89 42,38±3,4 1% 17 42,5±7,82%

Фузобак терпи 132 62,85± 3,33% 22 55±7,87% 69 32,86± 2,94% 10 25±6,85% 76 36,19 ±3,32% 9 22,5±6,6%

Грибы рода Candida 204 97,14± 1,62% 35 87,5±5,23 % 145 69,05±3,19 % 19 47,5±7,9% 157 74,76±3,0 % 26 65±7,54%

Актиномицеты 17 8,09± 1,88% 4 10±4,74% 9 4,28± 1,4% 3 7,5±4,16% 6 2,86±1,15 % 3 7,5±4,16%

Лямблии 58 27,62± 3,09% 10 25±6,85% 67 31,9± 3,22% 9 22,5±6,6% 73 34,76±3,2 3% 15 37,5±7,65°/о

Кишечные амебы 69 32,85± 3,24°/« 14 35±7,54% 72 34,29± 3,28% 10 25±6,85% 75 35,71±3,3 1% 14 35±7,54%

Была изучена степень обсемененности желчи у больных опытной и контрольной групп различными микроорганизмами (рис. 1-8). Сравнение частоты обнаружения Н.pylori в трех порциях желчи показало, что достоверно чаще Н.pylori выявляли в порции А (р<0,001). Но эта порция отражает содержимое двенадцатиперстной кишки. Наибольший интерес в плане возможности существования Н.pylori в такой агрессивной среде, как желчь, представляют порции В и С. Порция В отражает содержимое желчного пузыря, а порция С - желчных протоков. При сравнении частоты обнаружения в этих двух порциях было установлено, что Н.pylori достоверно чаще выявляли в желчи из желчных протоков, чем из желчного пузыря (р<0,001). При этом частота обнаружения коррелировала со степенью обсемененности образцов желчи из каждой порции. Низкая частота выявления H.pylori из порции В сочеталась с низкой степенью обсемененности, причем эта зависимость была характерна как для опытной, так и для контрольной групп, тогда как в порции С H.pylori обнаруживали достоверно чаще чем в порции В, с преобладанием высокой и умеренной степени обсемененности (р<0,001). Сравнение частоты обнаружения микроорганизмов в опытной и контрольной групп показало, что в группе хронического некалькулезного холецистита микроорганизмы колонизируют билиарную систему достоверно чаще, чем в опытной группе (р<0,001). В количественном отношении эта колонизация сопровождается преобладанием высоких степеней обсемененности желчного эпителия в опытной группе, чем в контрольной (р<0,01).

о

порция А порция В порция С

■ низкзя степень ■ средняя степень высокая степень

Рис.1. Степени обсемененности желчи H.pylori у больных хроническим некалькулезным холециститом.

Рис.2. Степени обсемененности желчи кокками у больных хроническим некалькулезным холециститом.

иорцин А

ггариция С

1 низкая степень

пори^я В 1 сре/л^няя степень

- высокая степень

Рис.3. Степени обсемененности желчи палочками у больных хроническим некалькулезным холециститом.

порция А

« низкая степень

Л высокая степень

порция С

Рис. 4. Степени обсемененности грибами рода Candida у больных хроническим некалькулезным холециститом.

порция А порция В порция С

■ низкая степень ■ средня степень ' высокая степень

Рис. 5. Степени обсемененности желчи актиномицетами у больных хроническим некалькулезным холециститом.

порция А порция в порция с

В низкая степень И сре^1няя степень А высокая степень

Рис. 6. Степени обсемененности желчи фузобактериями у больных хроническим некалькулезным холециститом.

порция А ПОрЦИЯ В порция С

низкая степень ■ средняя степень V высокая степень

Рис.7. Степени обсемененности желчи лямблиями у больных хроническим некалькулезным холециститом.

Рис. 8. Степени обсемененности желчи кишечными амебами у больных хроническим некалькулезным холециститом.

При цитологическом исследовании 210 образцов желчи, полученной из желчных протоков больных хроническим некалькулезным холециститом была выявлена лейкоцитарная инфильтрация на фоне хронического воспаления в 26 случаях (12,38±2,27%), дистрофические изменения с лейкоцитарной инфильтрацией - в 59 случаях (28,1±3,1%), пролиферация эпителия желчных протоков в 107 случаях (50,95±3,5%), кишечная метаплазия и дисплазия в 18 случаях (8,57±1,93%) (рис.9).

□ пролиферация

□ Лейкоцитарная инфильтрация

И Метаплазия и дисплазия

□ дистрофия

Рис.9. Структура морфологических изменений слизистой оболочки желчного пузыря больных хроническим некалькулезным холециститом.

В образцах желчи, полученной от больных контрольной группы, лейкоцитарная инфильтрация была выявлена в 5 случаях (12,5±5,2%), пролиферация желчного эпителия у 8 больных (20±6,3%), дистрофические изменения с лейкоцитарной инфильтрацией - в 5 случаях (12,5±5,2%), в 22 случаях слизистая желчного эпителия была без изменений - (55±7,9%)(рис. 10).

□ прол иферация

□ лейкоцитарная инф ил ьтра ция

БЗ дистроф ия Обез изменений

Рис.10. Структура морфологических изменений слизистой оболочки желчного пузыря контрольной группы

При изучении микробного состава желудка больных хроническим некалькулезным холециститом была обнаружена смешанная микрофлора, представленная Н.pylori в 98,18±1,8% случаях, кокками - в 63,63±6,49% случаях, грибами рода Candida - в 63,63±6,49% случаев, палочками - в 10,9±4,2% случаев, акшномицетами - в 1,82±1,8%, фузобактериями - в 9,09±3,88%, ляблиями - в 29,09±6,12%. При цитологическом исследовании мазков-отпечатков слизистой оболочки желудка преобладающими формами морфологических изменений были инфильтрация лимфоцитами и плазмоцитами и пролиферация (рис. 11). Изучение микробного пейзажа показало наличие ассоциации между присутствием Н.pylori и этими морфологическими изменениями. При этом в большинстве случаев пролиферация слизистой оболочки желудка чаще ассоциирована с микст-инфицированием Н.pylori и смешанной бактериально-грибковой микрофлорой - в 72,94±5,99% случаев (р<0,05). Лимфоидная инфильтрация чаще связана с колонизацией смешанной бактериально-грибковой флорой и простейшими (р<0,01). При сравнении частоты обнаружения различных видов микроорганизмов и патологическими изменениями слизистой оболочки желчных путей была установлена взаимосвязь между формированием более тяжелых форм морфологических изменений в случае колонизации Н.pylori, чем при инфицировании другими микроорганизмами. При инфицировании смешанной условно-патогенной флорой в сочетании с Н.pylori лейкоцитарную инфильтрацию желчного эпителия обнаруживали в 89,47±3,52% случаев с фагоцитозом Н.pylori,

□ пролиферация покровно-ямочного эпителя

□ лимфоидная инфильтрация

¡S кишечная метаплазия

®дисплазия

пролиферацию в сочетании с лейкоцитарной инфильтрацией - в 85,71±4,18% случаев, метаплазию - в 88,89±7,41% случаев.

Рис. 11. Структура морфологических изменений слизистой оболочки желудка больных хроническим некалькулезным холециститом.

При гистологическом исследовании биоптатов слизистой оболочки желчного пузыря больных хроническим калькулезным холециститом выявлена гипотрофия, склеро-липоматозная трансформация стенки желчного пузыря с очаговой лейкоцитарной инфильтрацией, а также начальная атрофия желчного эпителия с урежением и деформацией ворсин, в патологическом секрете желез выявлены скопления микроорганизмов, в том числе С и S-образно изогнутые палочки. Иммуногистохимическое исследование образцов слизистой оболочки желчного пузыря выявило слабую степень обсемененности. В просвете железы видны положительно окрашенные бактерии, адгезированные на апикальном конце железистого эпителия.

Для обнаружения Н.pylori в органах гепатобилиарной системы было исследовано 173 образца биологического материала (79 образца желчи, 34 образца ткани печени, 60 образцов слизистой оболочки желчного протока и желчного пузыря). В результате тестирования биоптатов печени, желчных протоков и желчного пузыря, а также образцов желчи 95 больных с заболеваниями гепатобилиарной системы с помощью ПЦР на наличие H.pylori ДНК бактерии была обнаружена у 31 больного (32,6%). Результаты ПЦР на наличие гена игеС (492 п.н.) Н. pylori в контрольной группе (п=30) оказались отрицательными. В результате наших исследований было показано, что частота встречаемости Н. pylori в гепатобилиарной системе больных хроническими воспалительными заболеваниями различается и достоверно выше, чем в контрольной группе (р<0,001). Полученные

данные также свидетельствуют о существовании значительной разницы между частотой обнаружения Н. pylori при различных формах холецистита: при хроническом некалькулезном холецистите она составила 50%, а при калькулезном -только 4,76%.

В ходе исследования была изучена частота обнаружения Н.pylori в зависимости от локализации, в результате которого было установлено, что результаты ПЦР на ген ureC Н. pylori при разных заболеваниях гепатобилиарной системы также различались в зависимости образцов (желчи, биоптатов желчного протока, желчного пузыря и печени). Показано, что большинство положительных результатов ПЦР приходится на долю образцов ДНК, полученных из желчи больных хроническим некалькулезным холециститом (76,2%), что может свидетельствовать о возможности выживания Н. pylori в слабо щелочных условиях. Но в то же время, при сравнительном изучении различных порций желчи было установлено, что во всех случаях ДНК Н.pylori была выделена только из порции С, тогда как все образцы порции В, отражающей содержимое желчного пузыря, были Н.pylori - негативными. На результаты также не оказывало влияние разведения желчи. Разведения желчи 1:10 были сделаны для удаления возможных ингибиторов реакции, но результаты реакции не зависели от разведения: они были одинаковыми как в образцах цельной, так и в разведенной желчи. При хроническом калькулезном холецистите частота выявления Н.pylori как в образцах желчи из желчного пузыря, так и образцах слизистой оболочки желчного пузыря низкая, что может свидетельствовать об уменьшении количества рецепторов на поверхности, способствующих адгезии микроорганизма после образования камней. Частота обнаружения Н. pylori наиболее высока в тканях печени (50,0%), при этом достоверных различий между частотой обнаружения в области неизмененной и измененной ткани не выявлено. Также ДНК этого микроорганизма была выявлена в слизистой оболочки желчного пузыря и желчного протока, что может свидетельствовать о существовании восходящего пути колонизации печени. Изоляты Н.pylori, выделенных из желчи, биоптатов печени и слизистой оболочки желчного пузыря были проанализированы на одновременное присутствие генов vacA , cagA , ЬаЪА2 (рис. 12-13).

Генотипирование изолятов, выделенных из желчи, показало наличие той или иной аллели гена vacA во всех образцах. Так, vacA sl генотип присутствовал у 16 изолятов, vacAs2 - у 9 изолятов. В шести случаях был верифицирован смешанный генотип vacAsl/s2, указывающий на присутствие более чем одного штамма Н.pylori. В обследуемой нами выборке у 69,6% больных хроническим холециститом обнаружен ген vacAsl. Ген cagA, по результатам нашего исследования, обнаруживали в геноме лишь некоторых штаммов Н. pylori. Генотипирование выделенных из желчи и желчного пузыря изолятов Н.pylori показало присутствие гена cagA только в 9 случаях, в большинстве случаев (60,9%) изоляты были cagA-негативными. Ген ЬаЬА был верифицирован у 5 изолятов Н.pylori, также как и в случае с геном cagA, большинство выделенных изолятов (70,6%) являлись ЬаЬА2-негативными.

К+ 1 2 3 4 М

М К+ 1 2 3 4 К-

vacAml тс А 352 пл.о.

s2 286 п.н.о. sl 259 п.н.о.

Рис.12. Электрофореграмма продуктов амплификации с помощью праймеров на субтипы гена уасА э2, т2).

Примечание. К+ - положительный контроль, К" - отрицательный контроль, 1 - 4 -образцы от больных с различными заболеваниями ГБС, М - маркер молекулярных масс.

К+ I 2 3 м к-

ШК+ 1 2 3 4 М

а ^ а, > ,

■■К 1

Рис. 13. Электрофореграмма продуктов амплификации с помощью праймеров на гены ЬаЬА2 (А) и cagA (Б).

Примечание. К+ - положительный контроль, К" - отрицательный контроль, 1 - 4 — образцы от больных с различными заболеваниями ГБС, М - маркер молекулярных масс.

Образцы ДНК, выделенные из тканей печени, слизистой оболочки желчного пузыря и желчных протоков были также проанализированы на присутствие генов vacA, cagA, ЬаЬА. В 75% изолятов Н.pylori имели ген vacA, при этом у большинства изолятов (50%) он был представлен vacAs2 аллельным вариантом, поровну - по 12,5% -вариантом vacAsl и смешанным генотипом vacAsl/s2. Регион т был выявлен только в одном аллельном варианте т2 . Большинство изолятов Н.pylori, выделенные из биоптатов печени и желчных протоков, оказались cagA и ЬаЬА негативными - в 62,5% случаев и 87,5% случаев соответственно (рис. 14).

cagA+ vacA s1 vacA s2 vacAs1/s2 vacAml vacAm2 babA2 генотипы H. pylori

Рис. 14. Частота встречаемости генотипов Н.pylori при патологии гепатобилиарной системы.

Для штаммов H.pylori, имеющих «островок патогенности» cagA и секретирующих цитотоксин VacA (cagA+vacAsl+), характерна способность к более выраженной адгезии и внутриклеточной инвазии (Su Z. et al., 1999). Наличие одновременно «островка патогенности» cagA и гена vacA у штаммов H.pylori препятствует фагоцитозу хеликобактера и, соответственно, благоприятствует их персистенции. Напротив, штаммы cagA~vacA~ быстро фагоцитируются и легко перевариваются макрофагами (Allen L.A. et al, 2000). В этой связи штаммы H.pylori с генотипами cagA+vacAsl+ определяют как высоковирулентные, а штаммы H.pylori с генотипами cagA~vacA~ - как низковирулентные.

Частота встречаемости высоко- и низковирулентных генотипов у больных холециститом и циррозом печени представлены в таблице 3. Нами не было обнаружено различий в частотах встречаемости высоко- (cagA+vacAs Ґ) и низковирулеитных (cagA~vacA~ ) изолятов при холецистите и циррозе. Достоверные различия оказались (р<0,05) лишь в частоте встречаемости комбинации генотипов cagA +vacAsl-

Таблица 3. Распределение Тох+ и Тох- генотипов H.pylori, выделенных от больных хроническими воспалительными заболеваниями гепатобилиарной системы.

Генотипы Хронический Цирроз Р Гепато билиарная

Н. pylori холецистит N=23 (%) N=8 (%) система "(%)

Тип I cagA+vacAsl+ 9(39,1) 0 0,099 2,72 9 (29,0)

Тип 1а cagA+vacAsl- 0 3(37,5) 0,017 5,74 3(9,7)

Тип Ib cagA-vacAsI + 6(26,1) 2(25,0) 0,960 0,00 8(25,8)

Тип И cagA-vacAsl - 8(34,8) 3(37,5) 0,873 0,03 11(35,5)

Исследование генотипов изолятов II. pylori, выделенных от больных хроническим холециститом, показало огромное разнообразие генотипов. Нами были обнаружены практически все возможные комбинации генов vacA, cagA, babA. Достоверных различий во встречаемости тех или иных комбинаций генотипов H.pylori у больных не обнаружено. Генотипы изолятов, выделенных от больных циррозом печени, отличало меньшее разнообразие по сравнению с изолятами, выделенными от больных холециститом и распределились следующим образом: cagA+vacAs2m2, cagA+vacAs2, cagA-vacAsls2/m2, cagA-vacAs2m2, cagA-vacAm2babA2, cag/l-vacAsl. Преобладающего генотипа H.pylori выявлено не было (табл.4).

Таблица 4. Комбинации генов патогенности уд с/1, cagA и ЬаЬА2 клинических изолятов Н. pylori, выделенных от больных хроническим холециститом и циррозом.

Генотипы H.pylori Холецистит n(%) Цирроз n(%) p Xі Гепатобіишарная система n(%)

cagA+vacAsl 4(17,4) 0 0,515 0,42 4(12,9)

cagA+vacAslml 1 (4,3) 0 0,574 0,32 1(3,2)

cagA+vacAsl/s2 2(8,7) 0 0,979 0,00 2(6,5)

cagA+vacAslm2 3(13) 0 0,703 0,14 3 (8,0)

cagA +vacAsl m l/m2 1(4,3) 0 0,574 0,32 1 (3,2)

cagA+vacAs2 0 2(25) 0,100 2,70 2(6,5)

cagA +vacAs2m2 0 1 (12,5) 0,574 0,32 1 (3,2)

cagA+vacAslbabA2 1(4,3) 0 0,574 0,32 1(3,2)

cagA-vacAsls2 3 (13,0) 0 0,703 0,14 3(8,0)

cagA -vacAsls2/m2 1 (4,3) 0 0,574 0,32 1 (3,2)

cagA-vacAsl/m2 1 (4,3) 0 0,574 0,32 1(3,2)

cagA -vacA s2m2 2 (8,7) 0 0,979 0,00 2(6,5)

cagA- vacAsls2babA2 1 (4,3) 0 0,574 0,32 1(3,2)

cagA- vacAslm2babA2 2(8,7) 0 0,979 0,00 2(6,5)

cagA -vacA ml b ab А 2 1 (4,3) 0 0,574 0,32 1(3,2)

cagA-vacA m2babA2 1 (4,3) 0 0,574 0,32 1 (3,2)

В результате генотипирования было обнаружено, что полученные генотипы Н. pylori в разных органах гепатобилиарной системы в отдельных случаях не идентичны, что может быть объяснено инфицированием того или иного больного различными генотипами хеликобактера. Явление специфичной колонизации

гепатобилиарного тракта штаммами хеликобактеров, отличных от таковых, колонизирующих желудок или двенадцатиперстную кишку, возможно, объясняется наличием определенных рецепторов в тканях гепатобилиарной системы и условий, в которых определенные штаммы оказываются более успешными, а другие элиминируются под действием этих же условий. Другое возможное объяснение может быть связано с тем, что на начальном этапе инфицирования потеря «островка патогенности» cagA штаммами Н.pylori может стать полезной ввиду его высокой иммуногенности, тем самым способствовать задержке таких бактерий в гепатобилиарном тракте. Возможно, этим можно объяснить, что в исследуемой нами группе больных более половины пациентов являются носителями cagA -отрицательных штаммов Н.pylori.

При ПЦР-исследовашш образцов желчи, отобранных у 33 пациентов, универсальная F2/R4 реакция была положительной в 15 случаях. Последующая реакция С97/С98 выявила ДНК бактерий рода Helicobacter в 12 случаях (36,4%). В группе больных с патологией гепатобилиарной системы ДНК хеликобактеров обнаружена в 8 случаях, из iuix в 6 случаях хронического некалькулезного холецистита и в 2 случаях хронического гепатита, при этом в одном случае ассоциированного с вирусом гепатита С. Среди больных без патологии гепатобилиарной системы ДНК бактерий рода Helicobacter обнаружена у больных хроническим панкреатитом и дискинезией толстого кишеч1шка. Положительные в отношении бактерий рода Helicobacter образцы ДНК от 12 больных были последовательно протестированы с помощью видоспецифических праимеров Н. bilis, Н. pullorum, Н. pylori и Н. rappini. В 7 случаях образцы были позитивными в отношении гена 23S рРНК Н.pylori и столько же в отношении гена ureB Н.rappini. При этом Н.pylori выявлен в желчи 4 больных гепатобилиарной патологией (у 3 больных хроническим некалькулезным холециститом, у одного больного хроническим гепатитом невыясненной этиологии), а Н.rappini у 5 (у 3 больных хроническим некалькулезным холециститом, у 2 - хроническим гепатитом, в том числе в одном случае ассоциированном с вирусом гепатита С). Бактериальная микст-инфекция Н.pylori л-H.rappini обнаружена у 5 больных. Все образцы в отношении генов cdtB Н.pullorum и cdtB Н. bilis были негативными.

При бактериологическом исследовании образцов желчи 64 больных с гепатобилиарной патологией Н.pylori был выделен в 5 случаях (7,81%). При изучении степени обсемененности преимущественно была обнаружена низкая степень обсемененности (101 -102 КОЕ/мл). Выделенная культура Н.pylori проявляла типичные морфологические, тинкториальные, культуральные свойства. В мазках из колоний, окрашенных фуксином, эти микроорганизмы имели с-образную форм}', в препаратах «раздавленная капля» осуществляли стремительные движения. Данные, полученные в ходе исследования, коррелируют с мировым бактериологическим опытом по выделению Н.pylori из органов гепатобилиарной системы. Низкая частота выделения Н.pylori из желчи может указывать на существование желчетолерантных вариантов Н.pylori, по свойствам близких к энтерогепатическим видам рода Helicobacter, относящихся к трудно- и некультивируемым бактериям.

Исследования, проведенные в разных странах, указывают на широкое распространение Н. pylori среди населения: инфицированность может варьировать от 5% и до 90% (Ford A.C. et al., 2010). Проведенный микробиологический мониторинг за распространенностью Н.pylori- инфекции, проведенный за 5 лет среди взрослых, проживающих в городе Казани, указывает на существование тенденции повышения частоты инфицирования с 83% в 2007 году до 94% в 2011 году (рис.15), при этом данная тенденция выявлена для всех возрастных групп. Полученные результаты указывают на высокий уровень инфицированное™ населения как при манифестных проявлениях инфекции, так и при бессимптомных формах заболевания. Достоверных различий по тендерному признаку не обнаружено(р>0,5).

Многочисленные эпидемиологические исследования показывают, что заражение происходит в раннем возрасте и частота инфицирования с годами прогрессивно увеличивается. Однако это не всегда объясняет распространенность Н.pylori. На степень инфицирования населения разного возраста, проживающего в одинаковых социально-экономических условиях, оказывает эффект возрастных когорт. В нашем исследовании минимальный уровень инфицированности среди больных с гастродуоденальной патологией обнаружен у детей младшей возрастной группы 710 лет (78,9%) с последующим ростом показателей в старших возрастных группах (15-17 лет) до 93,75%. Мониторинг хеликобактериоза среди жителей Казани за 2007-2011 годы выявил тенденцию повышения инфицированности с возрастом и достижения в подростковом возрасте уровней инфицирования взрослых.

94,2%........ 905% ......93,7%

2007 2008 2009 2010 2011

Рис. 15. Распространенность хеликобактериоза среди взрослых в 2007-2011 г.г.

Н.pylori - это очень прихотливый микроорганизм, чувствительный к любым изменениям окружающей среды, нуждающийся в создании комплекса условий, включающих определенную атмосферу, температуру культивирования и состав питательной среды. При работе с этим микроорганизмом возникает проблема субкультивирования, когда в ряде случаев после пересева изолированных колоний для выделения чистой культуры вырастают единичные колонии, и биологического

материала оказывается недостаточно для идентификации и постановки антибиотикограммы.

Проблему накопления культуры можно решить с помощью использования жидких сред. Сходный с твердыми средами состав (основы, ростовые и селективные добавки) используется и в жидких средах, хотя процесс культивирования более трудоемок и в практических лабораториях не нашел широкого применения. Недостатки способов культивирования на жидких питательных средах заключаются в сложности создания и поддержания микроаэрофильных условий в жидких питательных средах; необходимости использования дополнительного оборудования (шейкеров, вращательных платформ, биореакторов и т.д.) для принудительного введения углекислого газа.

В процессе исследования был разработан способ тонкослойного культивирования Н.pylori, который предусматривает применение двухфазной питательной среды, содержащей твердую фазу, представленную шоколадным агаром, изготовленный на основе Колумбия агара с 5% крови барана и разлитый в чашки Петри, и жидкую фазу, представляющую собой бульон Шедлера, обогащенный 10% сывороткой крупного рогатого скота. В ходе исследования было определено оптимальное соотношение твердой и жидкой фаз при розливе среды в чашки Петри диаметром 90 мм.

Цитологическая диагностика Н.pylori - инфекции требует решения как минимум трех основных задач: обнаружение бактерий, определения их количества и оценка состояния слизистой оболочки. Существующие методы имеют различные ограничения, затрудняющие диагностику: плохой контраст бактерий и окружающих тканей, дороговизна реактивов, необходимость их приготовления ex tempore, сложность методик окраски, длительное время экспозиции и т.д. Для совершенствования диагностики Н.pylori- инфекции нами была предложена окраска катионовым синим О (основным). При окраске мазков, приготовленных из биоптатов слизистой оболочки желудка, желчи, эпителиальные клетки окрашивались панхромно с хорошей дифференциацией ядерно-цитоплазматических, межклеточных границ. Цитоплазма клеток была окрашена в голубые тона, выявлены включения, ядра окрашены в сиреневато-фиолетовые тона различной интенсивности в зависимости от степени зрелости клеток, ядрышки - сине-голубые. В межклеточном пространстве отчетливо контрастировала микрофлора, представленная палочковидными, кокковидными, нитевидными,

веретенообразными бактериями, мицелием грибов и цистами простейших. Н.pylori имели типичную спиралевидную форму как в образцах из биоптатов слизистой оболочки желудка, так и в порциях желчи. Бактерии окрашивались интенсивно в синий цвет и хорошо контрастировали на фоне слизи. Таким образом, предлагаемый краситель обеспечивает высокую контрастность микроорганизмов, а также позволяет оценить морфологические изменения окружающих тканей. Метод является простым, доступным, быстрым (на окраску требуется 2-3 минуты). Окраска катионовым синим О может быть использована как для первичной диагностики Н.pylori инфекции, так и для контроля эрадикационной терапии, и может быть

рекомендована для внедрения в практику цитологических, гистологических и бактериологических лабораторий.

Для определения эффективности различных методов диагностики Н.pylori -инфекции у больных с заболеваниями гепатобилиарной системы была проведена сравнительная оценка микроскопического, бактериологического, биохимического, молекулярно-генетического и гистологического методов по следующим критериям: специфичность, чувствительность, возможность количественной оценки обсемененности Н.pylori, быстрота получения результатов, доступность и возможность проведения дополнительных исследований (таблица 5).

В результате проведенных исследований был сделан вывод о том, что ни один из существующих методов диагностики Н.pylori у больных гепатобилиарными заболеваниями не является универсальным. Пределы возможностей ограничены не только их чувствительностью и специфичностью, но и зависят от множества факторов: особенностей микроорганизма, его колігчественного содержания, неравномерности распределения бактерий в слизистых оболочках и тканях и других факторов.

Таблица 5. Сравнение различных методов для диагностики Н.pylori - инфекции у больных с заболеваниями гепатобилиарной системы.

Метод диагностики Цитологи Биохимич Гистологичес Бактериоло- І1ЦР

ческий ескии кий гическии

Чувствительность +++ ++ + ++ +++

Специфичность ++ + ++ +++ +++

Количественная +++ + +++ +++ +

оценка

Быстрота +++ +++ ++ + ++

Доступность +++ +++ ++ + ++

Дополнительные +++ + +++ +++ +++

исследования

Примечание: +++ - высокая оценка; ++ - средняя оценка; + - низкая оценка.

Для диагностики Н.pylori у больных с заболеваниями гепатобилиарной системы разработан алгоритм, включающий цитологический, гистологический, молекулярно-генетический, бактериологический методы, при этом биохимический метод может дополнять прямые методы обнаружения Н.pylori в гастродуоденальной зоне. В качестве «золотого» стандарта детекции бактерий рода Helicobacter в органах гепатобилиарной системы предложена многоступенчатая полнмеразная цепная реакция, которая предусматривает проведение поэтапной генетической идентификации хеликобактеров. Данный алгоритм рекомендован для применения в практическом здравоохранении.

ВЫВОДЫ

1. Частота обнаружения Н.pylori у больных хроническими воспалительными заболеваниями гепатобилиарной системы составила 32,6%, при этом выявлены достоверные различия в зависимости от метода исследования, патологии и биотопа. Молекулярно-генетическим методом H.pylori выявлен у 50%) больных хроническим некалькулезным холециститом, у 4,76% больных хроническим калькулезным холециститом, у 72,7% больных циррозом печени. Частота обнаружеши H.pylori микроскопическим методом варьировала от 98,18% в слизистой оболочке желудка и 84,76% в 12-перстной кишке до 41,43% в желчном пузыре и 63,33% в желчных протоках больных хроническим некалькулезным холециститом. Бактериологически культура H.pylori выделена в 7,81% случаях при гепатобилиарной патологии.

2. Установлены достоверные различия между выявлением H.pylori в органах гепатобилиарной системы у больных опытных и контрольной групп, что может указывать на возможную роль этого микроорганизма в патогенезе хронических воспалительных заболеваний гепатобилиарной системы.

3. Выявлена корреляция между частотой обнаружения H.pylori в желудке и в желчном пузыре. Анатомо-функциональная взаимосвязь гепатобилиарной и гастродуоденальной зоны может являться одной из причин развития сочетанной патологии, объединяющим фактором которой может служить инфицирование H.pylori, а основным путем колонизации - дуоденогенный.

4. Показано, что патоморфологические изменения слизистой оболочки желчного эпителия коррелируют с микробохолией (р<0,001). Полученные данные позволяют предположить значение микробной колонизации желчных путей в развитии хронического воспаления, при этом тяжесть морфологических изменений находится в прямой зависимости от колонизации H.pylori и степени обсемененности.

5. Установлено, что в колонизации печени и желчных путей патогенетическое значение могут иметь штаммы H.pylori ureC -положительные, cagA, babA2 - негативные, vacA — позитивные, но отличающиеся преобладанием т2 аллельного варианта, имеющего незначительный уровень токсической активности. Обнаружение различий генотипов H.pylori, выделенных из желудка, желчных протоков и печени от одного больного, может указывать на наличие избирательной колонизации биотопов различными подтипами H.pylori.

6. Проведенный мониторинг выявил высокий уровень инфицированности H.pylori населения г.Казани как при манифестных проявлениях инфекции, так и при бессимптомных формах заболевания с тенденцией повышения частоты хеликобактерной инфекции с возрастом и достижения в подростковом возрасте уровней инфицирования взрослых. Данные, полученные в ходе исследования, указывают на повышенный риск развития неоплазий в данной популяции.

7. Для диагностики H.pylori - инфекции при хронических воспалительных

заболеваниях гепатобилиарной системы предложены комплексные исследования, включающие молекулярно-генетический, бактериологический и морфологические методы. В качестве «золотого» стандарта рационально использовать многоступенчатую полимеразную цепную реакцию для идентификации бактерий рода Helicobacter.

8. Создана комбинированная питательная среда для накоплешш бактерий рода Helicobacter, позволяющая облегчить идентификацию и постановку антибиотикограмм, а также разработан метод окраски катионовым синим (О) основным для детекции Н.pylori и выявления патоморфологических изменений.

Практические рекомендации

1. При хронических воспалительных заболеваниях гепатобилиарной системы выявлены дисбиотические нарушения состава микрофлоры желудка, 12-перстной кишки и билиарного тракта, что указывает на необходимость коррекции микробиоценозов в данных биотопах с помощью противомикробных и пробиотических препаратов.

2. Для накопления культуры H.pylori в количестве достаточном для морфологической, биохимической идентификации и постановки антибиотикограмм рекомендовано использовать разработанный биотехнологический метод тонкослойного культивирования на двухфазной питательной среде.

3. Для обнаружения H.pylori предложена методика окраски катионовым синим О, обеспечивающая высокую контрастность микроорганизмов и позволяющая оценить морфологические изменения тканей. Метод является простым, доступным, быстрым и может быть использован как для первичной диагностики H.pylori инфекции, так и для контроля эрадикационпой терапии.

4. Выявлена высокая частота распространенности H.pylori инфекщш среди жителей города Казани, как среди детского, так и взрослого населения, которая указывает на сохранение высоких степеней риска для этой популяции развития онкологических заболеваний желудочно-кишечного тракта. Основой их профилактики могут служить комплексные противоэпидемические и санитарно-гигиенические мероприятия по разрыву путей передачи инфекции, внедрение скрининговых малоинвазивных методов в группах риска.

5. Оптимизирована технология культивирования и детекции хеликобактеров, позволяющая проведение микробиологической диагностики H.pylori - инфекции при хронических воспалительных заболеваниях гепатобилиарной системы с использованием разработанного алгоритма комплексного лабораторного обследования пациентов с гепатобилиарной патологией.

Список работ, опубликованных но теме диссертации

1. Исаева Г.Ш. Роль бактерии рода Helicobacter в патологии человека. /Исаепа Г.Ш., Поздеев O.K. // Казанский медицинский журнал. - 2007 -№1. - Том 88. - С.55-61.

2. Исаева Г.Ш. Распределение генотипов Helicobacter pylori в Республике Татарстан. /Исаева Г.Ш., Мураш.си В.Ю. //Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. - 2008. - №1.- С. 11-15.

3. Исаева Г.Ш. Возможное участие бактерий рода Helicobacter в патогенезе гепатобнлиарных заболеваний. / Исаева Г.Ш. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологнн, колонроктологии.- 2008. - №4. -С. 14-22.

4. Исаева Г.Ш. Микробная колонизация желчного пузыря. /Исаева Г.Ш., Ефимова Н.Г. // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. -2009. -№1 (приложение 1). - С. 154-155.

5. Исаева Г.Ш. Генотипы изолятов Helicobacter pylori, выделенных от больных с различной гепатобилиарной патологией. /Исаева Г.Ш., Абузарова Э.Р., Франс Н. // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. -2009.-№1 (приложение 1). - С.12-13.

6. Исаева Г.Ш. Окраска катноновым синим О для цитшюгнческого выявления Helicobacter pylori. /Исаева Г.Ш., Ефимова Н.Г., Хайрутдинова Г.Н. // Клиническая лабораторная диагностика. — 2009. -№5. - С.19-20.

7. Исаева Г.Ш. Резнстеитность Helicobacter pylori к антибактериальным препаратам и методы се определения. /Исаева Г.Ш. // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. — 2010. - №1. - С.57-66.

8. Исаева Г.Ш. Эффективность различных методов диагностики Helicobacter pylori - инфекции у больных хроническим холециститом. /Исаева Г.Ш., Ефимова Н.Г., Абузарова Э.Р.//Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. - 2010.

- №2-3. - М38.

9. Исаева Г.Ш. Helicobacter pylori у больных хроническим калькулезным холециститом. /Исаева Г.Ш., Зайцева JI.IO., Абузарова Э.Р., Фахрутдинов Р.Н., Волков Д.Е. // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. - 2010. - №2-3. -М38.

10. Исаева Г.Ш. Желудочный гиардназ, ассоциированный с Helicobacter pylori. /Исаева Г.Ш., Ефимова Н.Г. // Экспериментальная клиническая гастроэнтерология. - 2010. — №6. — С.30-34.

11. Исаева Г.Ш. Проблемы совершенствования диагностики Helicobacter pylori ннфекцпи. / Исаева Г.Ш. // Казанский медицинский журнал. - 2011.

- №2. - С.257-261

12. Исаева Г.Ш. Детекция Helicobacter pylori у больных хроническим холециститом с генотипированнем изолятов. /Исаева Г.Ш. // Практическая медицина. - 2011. - №2 (49) - С.104-108.

13. Исаева Г.Ш. Генетическая гетерогенность штаммов Helicobacter

pylori, выделенных от больных с заболеваниями генатобнлнарной системы. /Исаева Г.Ш. // Всстннк Чувашского государствешюго университета. - 2011. - №3. — С.347-351.

14. Исаева Г.Ш. Комплексная диагностика Helicobacter pylori инфекции у больных хроническим холециститом. / Исаева Г.Ш. //Практическая медицина. - 2012. -№1. - С.77-80.

15. Исаева Г.Ш. Молекулярная детекция бактерий рода Helicobacter при заболеваниях желудочно-кишечного тракта. /Исаева Г.Ш., Шагнмарданова Е.И., Шнршикова Т.В., Фазульзянова А.И., Ризванов A.A., Селькова Е.П. // Современные проблемы науки и образования. -2012. - № 1. - Идентификационный номер 0421200037W0041.

16. Исаева Г.Ш. Комбинированный метод диагностики Helicobacter pylori в билиарном тракте. /Исаева Г.Ш., Селькова Е.П. //Материалы IV Всероссийского конгресса но инфекционным болезням, Москва. - 2012. -С.166.

17. Фазульзянова А.И. Выявление Helicobacter pylori и энтерогепатических хеликобакгеров у больных хроническим гепатитом С. /Фазульзянова А.И., Исаева Г.Ш. //Материалы IV Всероссийского конгресса по инфекционным болезням, Москва. - 2012. - С.398-399.

18. Исаева Г.Ш., Селькова Е.П. Анализ распространенности хеликобакгериоза среди жителей г. Казани. /Исаева Г.Ш., Селькова Е.П.//Инфекция и иммунитет (Материалы X съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов). - 2012. - №1-2. - С.272-273.

19.Исаева Г.Ш. Энтсрогенатические хеликобактеры: свойства, методы диагностики. /Исаева Г.Ш.// Современные проблемы пауки и образования. - 2012. - №6. -URL: http://mvw.seicncc-c4lucation.ru/106-7759

20. Исаева Г.Ш. Мониторинг Helicobacter pylori инфекции в Казани. / Исаева Г.Ш., Бурханов P.P., Ефимова Н.Г., Селькова Е.П. // Фундаментальные исследования. - 2012. - №12 (часть 2). — С.270-273.

21. Исаева Г.Ш. Хелнкобактерноз у больных хроническим гепатитом С. / Исаева Г.Ш.//Фундамснталы1ые исследования. — 2012. - №12 (часть 2). -С.266-269.

22. Исаева Г.Ш. Двухфазная среда для с j С> кул ыт in i ip о и а и i ш Helicobacter pylori. Я1саева Г.Ш., Алсшкнн В.А., Селькова Е.П., Герасимова М.С., Мороз Д.П. //Клиническая лабораторная диагностика. - 2013. - №6. -С.40-12.

23. Исаева Г.Ш. / Исаева Г.Ш., Алешкин В.А., Селькова Е.П., Герасимова М.С., Мороз Д.П.// Биотехнологнческие аспекты тонкослойного культивирования бактерий рода Helicobacter. //Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологий, Казань. - 2013. - С. 137-139.

24. Isaeva G.Sh. Prevalence of Helicobacter pylori genotypes in patients with hepatobiliary diseases. /Isaeva G.Sh., Abuzarova E., Frans N. - //Gut (International Journal of Gastroenterology and Hepatology). - 2009. - Vol.58

(suppl.II). - abstractA405.

25. Isaeva G.Sh. Detection of H.pylori in hepatobiliary system of patients with biliary tract diseases. /Isaeva G.Sh., Abuzarova E., Frans N. // Helicobacter -2009. - Vol.14. - №4. -P.362-363.

26. Isaeva G.Sh. Genotyping of Helicobacter pylori in bile samples from patients with cholecystitis. Ляаеуа G.Sh., Abuzarova E., Frans N. // Helicobacter - 2009. -Vol.14. - №4. -P. 412-413.

27. Isaeva G.Sh. Helicobacter pylori in gallbladder mucosa of patients with chronic calculous cholecystitis. Яваеуа G.Sh., Zaitseva L., Volkov D., FakhrutdinovR. //Helicobacter. - 2010. - Vol.15. -№4. -P.379.

28. Isaeva G. Detection of Helicobacter pylori and enterohepatic helicobacters in bile of patients with chronic hepatitis C. /Isaeva G., Fazulzyanova A. // Helicobacter. -2012. - Vol.17(suppl. 1). - P. 117-118.

29. Fazulzyanova A. Evaluation of effectiveness of different methods of Helicobacter pylori infection in patients with chronic HCV-infection. /Fazulzyanova A., Isaeva G., Ivanovskaya K. // Helicobacter. - 2012. -Vol. 17(suppl. 1).-P.95.

30. Исаева Г.Ш. Helicobacter pylori и энтерогепатические хеликобактеры. (ISBN: 978-3-659-22036-4) - LAP LAMBERT(Germany). -2012.-290c.

ИЗОБРЕТЕНИЯ

1.Алешюш В.А., Исаева Г.Ш., Селькова Е.П., Афанасьев С.С. Заявка на патент «Способ тонкослойного культивирования Helicobacter pylori и двухфазная питательная среда для его осуществления» (приоритетная справка №2012125394/10 от 20.06.2012). Получено положительное заключение экспертизы на заявку патента на изобретение РФ №2012125394/10.

Сппсок сокращении:

ЛДЦ - Лечебно-диагностический центр

МЗ - Министерство здравоохранения

НПФ - научно-производственная фирма

ООО - общество с ограниченной ответственностью

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ФБУН - Федеральное бюджетное учреждение науки

ФЭГДС - фиброэзофагогастродуоденоскопия

babA2 - blood group antigen-binding adhesion

cagA - cytotoxin-associated gene

vacA - vacuolating-associatted cytotoxin

Выражаю признательность:

1. Абузаровой Э.Р. - К.6.Н., м.н.с. лаборатории молекулярных основ патогенеза Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук

2. Басиашвили Т.Г. - к.млі., гл.врачу ООО «Лечебно-диагностический центр «Фарм - Т» (Казань)

3. Герасимовой М.С. - врачу-бактериологу высшей категории, зав. бактериологической лаборатории Республиканского клинического онкологического диспансера МЗ Республики Татарстан

4. Дмитриенко М.А. - к.т.н., директору ООО «Ассоциация медицины и аналитики» (г. Санкт-Петербург)

5. Ефимовой Н.Г. - врачу - цитологу высшей категории ООО «Лечебно-диагностический центр «Фарм - Т»

6. Зайцевой Л.Ю. - к.м.н., зав. паталогоанатомической лаборатории Республиканской клинической больницы №2 МЗ Республики Татарстан

7. Муравьёву В.Ю. - д.м.н., профессору, зав.эндоскопическим центром Республиканского клинического онкологического диспансера МЗ Республики Татарстан

8. Ризванову А.А. -д.б.н., зав.каф. генетики Института фундаментальной медищшы и биологии Федерального (Приволжского) Казанского университета

9. Шагимардановой Е.И. - к.б.н., н.с. научно-исследовательской лаборатории кафедры микробиологии Института фундаментальной медицины и биологии Федерального (Приволжского) Казанского университета

Особую признательность выражаю д.м.н., главному врачу Федерального бюджетного учреждения здравоохранения «Центр гигиены и эпидемиологии в Республике Татарстан (Татарстан)» В.Б. Зиатдинову и секретарю Европейской группы по изучению Helicobacter профессору Фрэнсису Мегро.

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора медицинских наук, Исаева, Гузель Шавхатовна, Москва

Федеральное бюджетное учреждение науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

05201 450331 На правах рукописи

ИСАЕВА ГУЗЕЛЬ ШАВХАТОВНА ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ HELICOBACTER PYLORI -ИНФЕКЦИИ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМИ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ ГЕПАТОБИЛИАРНОЙ СИСТЕМЫ

03.02.03 - микробиология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Научные консультанты: доктор медицинских наук Селькова Евгения Петровна;

доктор биологических наук, профессор Алёшкин Владимир Андрианович

Москва-2013

Список сокращений ГБС - гепатобилиарная система ЖКТ- желудочно-кишечный тракт ПЦР- полимеразно-цепная реакция СОЖ - слизистая оболочка желудка СОЖП - слизистая оболочка желчного пузыря ХВЗ - хронические воспалительные заболевания ХКХ - хронический калькулезный холецистит ХНХ - хронический некалькулезный холецистит HCV - (hepatitis С virus) - вирус гепатита С babA - (blood group antigen-binding adhesion)

- адгезин, ассоциированный с группой крови) cagA (cytotoxin-associated gene)-цитотоксин-ассоциированный ген vacA(vacuolating-associatted cytotoxin )-

- вакуолизирующий ассоциированный цитотоксин

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ_ 6

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общая характеристика бактерий рода Helicobacter_ 18

1.2. Биологические свойства Н.pylori_ 22

1.3. Эпидемиология H.pylori - инфекции_ 35

1.4. Устойчивость H.pylori к антибактериальным препаратам_ 38

1.5. Методы микробиологической диагностики H.pylori - инфекции_ 51

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Общая характеристика клинических наблюдений_82

2.2. Методы исследований_86

2.2.1. Гистологический и иммуногистохимический

метод_86

2.2.2. Цитологический метод_90

2.2.3. Бактериологический метод_91

2.2.4. Молекулярный метод_96

2.2.5. Биохимический метод_109

2.2.6. Статистический метод_111

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 3. МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ Я. PYLORI У

БОЛЬНЫХ С ХРОНИЧЕСКИМИ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫМИ

ЗАБОЛЕВАНИЯМИ ГЕПАТОБИЛИАРНОЙ СИСТЕМЫ

3.1. Изучение микробиоценоза билиарного тракта_113

3.2. Изучение степени обсемененности желчи различными микроорганизмами_ 124

3.3. Морфологические изменения желчного эпителия при хронических воспалительных заболеваниях гепатобилиарной системы_134

3.4. Микрофлора и морфологические изменения слизистой оболочки желудка у больных хроническим холециститом_143

Глава 4. ОБНАРУЖЕНИЕ Н.PYLORI У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМИ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ ГЕПАТОБИЛИАРНОЙ СИСТЕМЫ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИМ МЕТОДОМ С ГЕНОТИПИРОВАНИЕМ ИЗОЛЯТОВ

4.1. Обнаружение Н.pylori в гепатобилиарной системе методом ПЦР _149

4.2. Определение генов патогенности изолятов H.pylori, выделенных от больных хроническими воспалительными заболеваниями гепатобилиарной системы_153

4.3. Частота встречаемости комбинаций генов патогенности Н. pylori_ 157

4.4. Распределение генотипов H.pylori в различных биотопах гепатобилиарной системы_162

4.5. Детекция энтерогепатических хеликобактеров в гепатобилиарной системе 165

Глава 5. ОБНАРУЖЕНИЕ Н.РУЮШ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМИ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ ГЕПАТОБИЛИАРНОЙ СИСТЕМЫ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИМ МЕТОДОМ.

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ МОНИТОРИНГ ЗА Н.РУЬОШ - ИНФЕКЦИЕЙ В РЕСПУБЛИКЕ ТАТАРСТАН.

5.1. Выделение Н.ру1оп бактериологическим методом из желчи_167

5.2. Микробиологический мониторинг за распространенностью Н.ру1оп -инфекции в г.Казани_170

Глава 6. СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ДИАГНОСТИКИ Н.PYLORI -ИНФЕКЦИИ

6.1.Разработка технологии тонкослойного культивирования Н.pylori на двухфазной питательной среде_ 175

6.2. Совершенствование цитологического метода диагностики Н.pylori -инфекции_ 177

6.3. Сравнение эффективности методов диагностики заболеваний гепатобилиарной системы, ассоциированных с H.pylori_ 184

6.3.1. Оценка цитологического метода_185

6.3.2. Оценка гистологического метода_186

б.З.З.Оценка бактериологического метода_188

6.3.4. Оценка молекулярно-генетического метода_190

6.3.5. Оценка биохимического метода_ 192

6.4. Алгоритм диагностики H.pylori- инфекции у больных с ХВЗ ГБС_196

ЗАКЛЮЧЕНИЕ_204

ВЫВОДЫ_238

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

240 242

ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы Болезни желчного пузыря и желчевыводящих путей составляют одну из важнейших медицинских и социальных проблем: во всем мире отмечается постоянный рост заболеваний гепатобилиарной системы. По данным эпидемиологических исследований, число больных с заболеваниями желчевыводящих путей вдвое превышает число лиц, страдающих язвенной болезнью желудка и 12-перстной кишки [33]. Хронический некалькулезный холецистит является одним из самых распространенных заболеваний не только среди болезней билиарного тракта, но и среди заболеваний органов пищеварения [14]. Хроническим калькулезным холециститом страдает до 10% взрослого населения развитых стран. Это заболевание можно отнести к болезням цивилизации. Из года в год растет количество операций на желчных путях, а также число послеоперационных осложнений, которые заставляют прибегать к повторным хирургическим вмешательствам и нередко приводят к стойкой потере трудоспособности больного.

Этиология заболеваний желчевыводящих путей до настоящего времени окончательно не установлена. Существует две теории патогенеза заболеваний билиарного тракта: инфекционная и метаболическая. В конце XIX и начале XX века были высказаны мнения, что этиологическим фактором, вызывающим воспаление желчных путей, могут быть различные микроорганизмы [19]. В 60-е годы XX века после работ Admirand W.H. и Small D.M. (1968) развитие получила метаболическая теория [40]. В 90-е годы на Западе стала доминировать концепция об асептическом механизме камнеобразования [85]. Для отечественных ученых была характерна точка зрения, объединяющая основные положения инфекционной и метаболической теорий [32]. В желчи больных с патологией билиарной системы обнаруживают патогенные (сальмонеллы, лептоспиры и др.) и условно-патогенные бактерии (кишечная палочка, клебсиеллы, протей,

энтеробактер, стафилококки, энтерококки и др.), вирус гепатита А, грибы рода Кандида, возбудители протозойных и глистных инвазий. В печати последних лет появились сообщения об обнаружении ДНК бактерий рода Helicobacter в органах гепатобилиарной системы[57; 87; 131; 140; 144; 154; 161; 231; 266; 327; 347; 391; 422; 489]. Роль Helicobacter pylori в развитии воспалительных заболеваний билиарной системы окончательно не изучена. Возможное участие H.pylori в патогенезе заболеваний гепатобилиарной системы подтверждают положительные результаты молекулярно-генетических, серологических исследований, выявление цитотоксического действия H.pylori на клеточные культуры гепатоцитов in vitro и в опытах in vivo на животных моделях [503]. Детекция ДНК H.pylori в образцах слизистой оболочки желчного пузыря при холециститах, холелитиазе и карциноме сочеталась с выявлением в тканях иммуногистохимическими методами, что доказывает возможность обитания этой бактерии в билиарном тракте [490]. Серологическое исследование, проведенное AnanievaD. с соавт. (2002), выявило достоверную разницу между уровнем антител к наружным протеинам H.pullorum, H.bilis, H.hepaticus, H.pylori у пациентов с хроническими заболеваниями печени и здоровых [45]. Исследования на тканевых печеночных культурах, зараженных хеликобактерами, показали присутствие цитотоксинов [441]. Двухлетнее изучение патогенного действия H.pylori на мышах линии C57BL/6, зараженных перорально, показало наличие сочетанного поражения слизистой оболочки желудка и печени в виде воспаления, фиброза, гиперплазии гепатоцитов [447] и развитие первичного билиарного цирроза [180]. Выявление корреляции между присутствием ДНК хеликобактеров и повышением клеточной пролиферации желчного эпителия демонстрирует высокую вероятность участия этих бактерий в генезе заболеваний билиарной системы [161].

Штаммы Н. pylori отличает большое разнообразие. Для клинических изолятов H.pylori, выявляемых у больных с гастродуоденальной патологией,

характерна выраженная генетическая гетерогенность в отношении факторов вирулентности - продуктов генов cagA, vacA, ЪаЪА2 [492]. При этом распределение генотипов Н. pylori в отношении генов патогенности в разных регионах мира различаются и имеют этно-географические особенности [492; 493]. Определение связи между генотипами Н. pylori и клиническими проявлениями у лиц, инфицированных определенными штаммами, представляет большой научный и практический интерес. Важность представлений о распределении генотипов H.pylori при различных заболеваниях может быть обусловлена следующими фактами: штаммы CagA оказывают более значимое воздействие на прогноз заболевания, чем штаммы без CagA [67; 109]; штаммы с типом VacA si чаще ассоциированы с заболеваниями желудка, чем штаммы VacAs2 [52]; BabA2 штаммы H.pylori строго связаны с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки и аденокарциномой в отличии от Vac As 1 и CagA штаммов, которые ассоциированы только с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки [167]; эффективность лечения также во многом зависит от генотипа H.pylori [465; 466]. Но если распределение генотипов H.pylori при различных заболеваниях желудка и 12-перстной кишки изучено достаточно полно, то вопрос о генотипах H.pylori, колонизирующих ткани печени и желчных путей, остается не изученным.

Следует заметить, что в большинстве опубликованных работ указывается на трудности получения чистой культуры хеликобактеров: сообщения об успешном выделении бактерий рода Helicobacter из печени и желчи единичны [117; 489]. Трудности бактериологического метода исследования могут быть обусловлены различными факторами. Возможно, что исследуемый материал (биоптаты печени, желчного пузыря, желчь) содержит ингибиторы роста хеликобактеров (желчные кислоты, ферменты и т.д.), либо это связано с недостатками технического исполнения (длительная транспортировка, замораживание образцов и т.д.), а также с особенностями

микроорганизмов (большинство энтерогепатических относятся к некультивируемым, и получение культуры возбудителя возможно только биологическим методом). Н.ру1оп - это очень прихотливый микроорганизм, чувствительный к любым изменениям окружающей среды, нуждающийся в создании комплекса условий, включающих определенную атмосферу, температуру культивирования и состав питательной среды. Недостатком способов выращивания на плотных питательных средах является невысокая эффективность высеваемости хеликобактеров при первичной изоляции, также при дальнейших пересевах для получения чистых культур штаммы теряются, всхожесть ослабевает и утрачивается, а скудность роста чистых культур приводит к невозможности определения чувствительности выделенного штамма к антибиотикам и химиопрепаратам. Проблему накопления культуры можно решить с помощью использования жидких сред, но к недостаткам культивирования на жидких питательных средах можно отнести сложность создания и поддержания микроаэрофильных условий в жидких питательных средах и необходимость использования дополнительного оборудования для принудительного введения углекислого газа. Поэтому возникает необходимость разработки новых технологий культивирования микроаэрофильных и капнофильных бактерий, доступных к применению в рутинной лабораторной практике.

Анатомо-функциональная взаимосвязь гепато-дуоденальной зоны является одной из причин общности патологических механизмов развития сочетанной патологии. Объединяющим фактором здесь может служить инфицирование Н.ру1оп, хотя патогенетические механизмы участия этого микроорганизма в развитии заболеваний гепатобилиарной системы пока не изучены. Потенциальная роль желчетолерантных хеликобактеров в генезе поражений печени и билиарного тракта может быть объяснена наличием определенных факторов патогенности этих возбудителей, запускающих каскад патологических процессов в гепатобилиарной системе, но их роль в

поражении эпителия желчного пузыря и гепатоцитов остается не выясненной. Отсутствие «золотого» стандарта микробиологического подтверждения об обнаружении хеликобактеров в тканях печени и желчного пузыря, желчи может оказывать сдерживающий эффект в исследованиях по изучению этиологической значимости этих бактерий в патогенезе заболеваний ГБС. Эта проблема требует совершенствования микробиологических методов диагностики H.pylori. Все вышесказанное объективно обосновывает необходимость оптимизации диагностики заболеваний, ассоциированных с H.pylori - инфекцией. Цель исследования: оптимизация методов диагностики Helicobacter pylori инфекции у больных хроническими воспалительными заболеваниями гепатобилиарной системы с разработкой новых биотехнологий культивирования и детекции микроаэрофильных и капнофильных бактерий рода Helicobacter.

В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. Изучить микробиоценозы различных биотопов желудочно-кишечного тракта (желудка, 12-перстной кишки и желчного пузыря) у больных хроническими воспалительными заболеваниями гепатобилиарной системы.

2. Определить частоту обнаружения H.pylori в органах гепатобилиарной системы и морфологические изменения слизистой оболочки желчного пузыря при H.pylori - инфекции.

3. Выявить частоту обнаружения H.pylori молекулярно-генетическими методами и изучить гены патогенности изолятов H.pylori, выделенных от больных с гепатобилиарной патологией.

4. Провести микробиологический мониторинг циркуляции H.pylori -инфекции с изучением динамики распространенности хеликобактериоза среди жителей г.Казани.

5. Усовершенствовать диагностику Н.pylori -инфекции путем разработки новых биотехнологий культивирования и детекции.

6. Разработать алгоритм комплексного исследования, направленного на выявление инфицирования H.pylori больных с гепатобилиарной патологией.

Научная новизна

Впервые выполнено одновременное изучение пристеночной микрофлоры слизистой оболочки желудка, 12- перстной кишки, желчного пузыря и желчных протоков с морфологической оценкой патологических изменений слизистых оболочек больных с воспалительными заболеваниями билиарного тракта и пациентов контрольной группы без гепатобилиарной патологии, что позволило оценить значение расстройств микробиоценозов биотопов гастродуоденальной зоны и билиарного тракта в развитии хронических воспалительных заболеваний гепатобилиарной системы. Выявлена высокая частота инфицирования органов гепатобилиарной системы H.pylori у больных хроническим некалькулезным холециститом и циррозом печени, ассоциированная с развитием патологических морфологических изменений, что дало возможность установить этиологическое значение этого микроорганизма в патогенезе хронических воспалительных заболеваний гепатобилиарной системы. Обнаружены закономерности колонизации различных биотопов микроорганизмами (бактериями, грибами простейшими) с определением частоты и степени обсемененности, что позволило продемонстрировать прямую связь гастродуоденального дисмикробиоценоза и микробохолии, а также верифицировать восходящий (дуоденогенный) путь инфицирования желчных путей.

Впервые в результате изучения генов патогенности изолятов H.pylori, выделенных из органов гепатобилиарной системы, определены

доминирующие генотипы, выявлены закономерности распределения Тох+ и Тох- генотипов при патологии гепатобилиарной системы. Обнаружены существенные различия генотипов H.pylori, выделенных из

гастродуоденальной зоны, желчного пузыря и печени, что позволило выявить феномен специфичной колонизации гепатобилиарного тракта штаммами хеликобактеров, отличных от изолятов, колонизирующих желудок или двенадцатиперстную кишку. Впервые получены новые данные о преимущественной роли cagA - негативных штаммов H.pylori, связанные с выявлением ранее неизученных сторон патогенеза хеликобактериоза, при этом показана роль данного микроорганизма в развитии хронических воспалительных заболеваний гепатобилиарной системы.

Установлена высокая частота распространенности H.pylori инфекции

в

среди жителей города Казани как среди детского, так и взрослого населения с тенденцией повышения инфицированности с возрастом и достижения в подростковом возрасте уровней инфицирования взрослых, что указывает на сохранение высоких степеней риска для этой популяции развития онкологических заболеваний желудочно-кишечного тракта и требует широкого внедрения скрининговых методов диагностики хеликобактериоза | и проведения своевременной эрадикационной терапии с целью первичной профилактики злокачественных новообразований.

Разработан оптимальный диагностический комплекс исследований для применения в условиях микробиологических лабораторий, который включает современные высокоэффективные микробиологические и молекулярно-генетические методы и отвечает актуальным требованиям технологии обследования па