Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Оптимизация агробактериального метода трансформации кукурузы
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология
Автореферат диссертации по теме "Оптимизация агробактериального метода трансформации кукурузы"
Я-ЗАЗМ
На правах рукописи
Данилова Светлана Алексеевна
Оптимизация агробактериального метода трансформации кукурузы
(03.00,23 - биотехнология)
АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ
на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва - 2001
Работа выполнена в Российском Государственном Аграрном заочном Университете и в Институте физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН.
Научные руководители: заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук профессор Примак А.П.; кандидат биологических наук Долгих Ю.И.
Официальные оппоненты: доктор биологических наук Мазин В.И.;
кандидат биологических наук Ралдугина Г.Н.
Ведущая организация: Московское отделение ВНИИ
растениеводства РАСХН
Защита состоится «_»_2001 г. в_час. на
заседании диссертационного совета Д.006.027.01 при ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН по адресу: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, д. 42., факс: (095) 977-09-47.
С диссерт?'г^т" ; г 'лжно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сеЛЬСКОХОЗЯйствеинс _^ГИИ РАСХН . - V
Автореферат разослан «_»___ 2001 г.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологически [ г'
к
С.А. Мелихова
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы. В последние годы в связи с задачами наращивания производства сельскохозяйственной продукции большое внимание уделяется теоретическим разработкам и практической реализации достижений биотехнологии и, в частности, генетической инженерии. Применение трансгенных растений, способных противостоять насекомым-вредителям, патогенам, неблагоприятным факторам окружающей среды без дополнительных обработок химическими веществами может не только принести экономическую выгоду, но и значительно улучшить экологическое состояние природы и сделать более 'органическими" продукты питания для человечества.
Кукуруза, которая является очень ценной зерновой и кормовой культурой, стала одним из первых объектов генетической трансформации, имеющей практическую направленность. Трансгенные сорта, обладающие устойчивостью к гербицидам и насекомым-вредителям, уже воздепываются на полях в некоторых странах. Тем не менее до сих пор генетическая трансформация кукурузы остается серьезной проблемой. 8 настоящее время основным способом введения чужеродных генов в растения злаковых является баллистическая трансфекция. Наряду с рядом преимуществ, этот метод имеет такие недостатки как низкая эффективность, нестабильность и малая емкость вводимых конструкций, высокая стоимость. Значительно большую экономическую эффективность и стабильность результатов обеспечивает введение генов, опосредованное агробактериями. Этот метод детально разработан для двудольных растений, но почти не используется для однодольных. Хотя в литературе встречаются отдельные сообщения о применении метода агробактериальной трансформации к зерновым, однако для кукурузы он практически не разработан.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы является разработка условий генетической трансформации кукурузы с использованием АдгоЬайепигп 1игт^ас1епз как одного из способов увеличения производства зтой ценной сельскохозяйственной культуры.
Для достижения поставленной цели нужно было решить следующие задачи: 1. оптимизировать условия агробактериального заражения эксгшантов и отбора трансформированных растений:
2. получить трансгеннь а ^астеДйг ¿^уруЗк^АЯ
. .... ' --.-^кд
3. проверить наследование введенных генов.
Научная новизна. Оптимизирован метод генетической трансформации кукурузы с использованием АдгоЬа&еПит 1ите?ас1епз. Предложен новый способ заражения ино кул (Омов кукурузы путем культивирования их на газоне агробактерий. Впервые получены трансгенные растения кукурузы при использовании е качестве зксппамтов для агробактеризльной трансформации каллусиых инокулюмов, Отобраны трансгенные растения кукурузы, экспрессирующие ген устойчивости к канамицику, маркерный ген ¡5-глюкуронидазы и хозяйственно ценный ген дефензина редьки. Трансфекция введенных генов подтверждена ПЦР -анализом и блот-гибридизацией по Саузериу. Показано наследование введенных генов. Впервые обнаружена стимуляция регенерации растений в культуре тканей кукурузы под действием малых доз антибиотика цефотаксима.
Теоретическая и практическая значимость работы. Предложенные методы генетической трансформации дают возможность получения трансгенной кукурузы с ценными признаками. При использовании нового способа заражения в качестве зксплантов можно применять не только незрелые зародыши, но и пассируемый змбриогенный каллус кукурузы, что позволяет получать трансгенные растения в течение всего года, независимо от сезона. Выявлены условия повышения эффективности регенерации растений из эмбриогенного каллуса кукурузы. Апробация работы. Работа апробирована в лаборатории физиологических, и молекулярных механизмов адаптации Института физиологии растений РАН. Публикации. По материалам диссертации опубликованы 4 печатные работы и 2 заявки на патент.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов; введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список литературы.
Работа изложена на 121 стр. машинописного текста, содержит 17 рисунков и 21 таблиц. Список использованной литературы включает 259 наименований.
Характеристика используемой культуры, в работе исгтользовали две линии кукурузы: А168 и 91 и гибрид Р1 между ними. Инбредная линия А183 была выведена в США Свойства линии А188 ¡п уйго детально изучены и описаны (йгееп е\ а!.. 1982, Като еЛ а!,, 1935), Линия кукурузы 91 была регенерирована из каппуса. отобранного из
культивируемых тканей гибрида F2 китайской линии Chines31 с латиноамериканской расой Cateto Sulino Grosso после селекции in vitro на среде с попиэтиленгликолем [Долгих и др., 1994}. Растения линии 91 отличались повышенной устойчивостью к засухе, засолению и низким положительным температурам [Долгих и др., 1997, Данилова, Долгих, 19981- Каллусные ткани линии 91 и гибрида А183x91 также имели высокую регенерационную способность. Семена линии А188 и F2 гибрида Chi31xCateto S.G, получены из Краснодарского НИИ сельского хозяйства.
Характеристика используемых плазмид и штамма A.tumefaciefis. Плазмида PBJ121 содержит ген неомицинфосфотрансферазы П (opt (/), сообщающий устойчивость к какамицину (Км), под контролем промотора 19S вируса мозаики цветной капусты и ген ß-глюкуронидазы (utíA) под промотором 35S вируса мозаики цветной капусты. Плазмида pK22rs содержит селективный ген неомицинфосфотрансферазы It (npt 11} под контролем промотора 19S вируса мозаики цветной капусты и смысловой ген дефензина <rs) из семян редьки, сообщающий устойчивость к фитопатогвнам, под промотором 35S вируса мозаики цветной капусты. Обе плазм иды получены из Института сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.
Плазмиды были встроены в копэлиновый штамм Agrobacterium tumefaciens LBA 4404. Агробактерии культивировали на среде LS [Мэниатис и др.,1964].
Культивирование эксллантов in vitro и получение регенерантов, Каллус получали из незрелых зародышей, выделенных на 11-12 день после опыления. Зерновки вычленяли из початков и стерилизовали 0.1 % раствором сулемы (HgCLj) в течении 20 минут, затем 3 раза промывали стерильной дистиллированной водой. Изолированные зародыши 1-2 мл длиной помещали на агаризованную среду в чашки Петри щитком в верх по 15 - 20 эксллантов на чашку. Каллус получали и выращивали на питательной среде Мурасиге -Скуга (MC) [Murashige, Skoog, 1962], содержащей 30 г/л сахарозы. 500 мг/л педролизата казеина и 1 мг/п 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д) (среда П).
Для получения регенерантое, кусочки каллуса с зачатками побегов переносили на среду MC без гормонов (среда Р). Для укоренения развившиеся побеги пересаживали е стаканчики высотой 10 см, содержащие среду без гормонов и витаминов с половинной концентрацией солей no MC и 10 г/л сахарозы (среда К), Укоренившиеся растения-регенеранты высотой Б - 7 см переносили в грунт, состоящий из 3 частей почвы, 2 частей торфа и 1 части песка. Перед посадкой в почву корни регенерантов тщательно отмывали от агара и споласкивали слабо розовым раствором марганцовокислого калия. Растения
выращивали в теплице при дневной температуре 25"С, ночной - 20°С и 16-н фотопериоде, интенсивность освещения 2000 пк. Частоту регенерации определяли как отношение количества растений-регенерантов к числу культивированных инокулюмов. Частоту Км-устойчивых форм оценивали как среднее число зеленых растений на и ко кулю м, выраженное в процентах.
Приготовление экссудата табака. Листья асептически выращенных растений табака измельчали и заливали на 1 час жидкой стерильной средой LB, 5г на 10 ил среды. Отцеженный экссудат добавляли в ночную бактериальную культуру непосредственно перед трансформацией.
Приготовление а гроба сериального газона. На агариэованную питательную среду (П) в чашку Петри вносили 0,3 мл суточной суспензии агробактерий и равномерно распределяли ло всей поверхности агариэоеанной среды шпателем, после чего приоткрывали чашки и в течении 10-15 минут подсушивали в ламинар-боксе, Газон подращивапи в течении суток при температуре 2S " С,
Использование ацетосиримгона. Ацетосирингон (3.5-Dimettioxy-4-hydroxy-acetophenone) растворяли в стерильной воде, 100 мМ ацетосирингона добавляли в ночную бактериальную культуру непосредственно перед трансформацией.
Определение экспрессии GUS. Экспрессию GUS определяли в каллусах и отрезках листьев и корней растений-регенерантов гистохимически или флуориметр и чески согласно методике Джемпера и др. [1S91J.
Математическая обработка. Опыты проводили в трёх кратной повторносги. Данные проведенных исследований обрабатывали статистическими методами по Зайцеву [1&94] В таблицах и на графиках приведены средний величины со стандартной ошибкой.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Классический метод генетической трансформации, опосредованный Agrobacterium tumefaciens, включает совместное культивирование растительных эксплантов и агробактерий, элиминацию бактерий с помощью антибиотиков, отбор трансформированных клеток на селективных средах и регенерацию растений.
Применение этого метода для введения чужеродных генов в геном кукурузы потребовало модификации условий проведения каэедого этапа трансформации.
1-Влияние антибиотика канамицика на каллус и регенеранты кукурузы.
Этап отбора трансформированных клеток является ключевым при получении трансгенных растений. Обе использованные в равоте плаэмиды включали в качестве селективного, ген устойчивости к канамицину. Поэтому в первую очередь анализировали рост и регеиерационную способность каллусных инокулюмов, а также чувствительность растений, регенерированных из культивируемых клеток или выращенных иэ семян, на средах с 25-400 мг/л канамицина, с целью определения селективной для каллусов и растений кукурузы концентрации, В течение первого пассажа на среде с антибиотиком клетки кукурузы продемонстрировали высокую устойчивость: прирост каллуса был ингибирован в два раза по сравнению с контрольным только при дозе антибиотика более 100 мг/л, при концентрации канамицина 400 мг/л часть каллуса еще сохраняла способность к росту. В то же время, инкубация на среде с Км, начиная с концентрации 25 мг/л, вызвала резкое снижение морфогенетического потенциала каллуса. Повторное культивирование каллуса кукурузы на среде с антибиотиком вызывало гибель клеток, независимо от использованной концентраци Км. По-видимому, действие антибиотика на рост каллуса проявляется не сразу, Км накапливается в культивируемых тканях и позже вызывает их гибель.
При определения влияния Км на развитие растений-регенерамтов побеги длиной 0,5-1,0 а« отсаживали на среду для регенерации Р, содержащую Км в концентрациях 25 и 50 мг/л. Под действием антибиотика в листочках регене рантов разрушался хлорофилл, и они белели. В отличие от двудольных растений, у которых канаммцин препятствует образованию корней, у кукурузы корнеобразование мало зависело от присутствия Км в среде. Чтобы определить продолжительность контакта растений с антибиотиком, необходимого для проявления действия Км, регенеранты выдерживали на среде с Км в течение 3, 6, и 14 дней, зате* пересаживали на среду без антибиотика и учитывали время побеления и долю побелевших растений. Было показано, что культивирования регенерантов на среде как с 50, так и с 25 мг/л Км в течение трех дней достаточно для элиминации чувствительных растений. Однако, скорость обесцвечивания
обработанных регенерантов зависела от продолжительности контакта с антибиотиком. При концентрации Км 25 мг/л через 14 дней белели только те регенеранты. которые постоянно культивировали на среде с антибиотиком. Реакция на шестидневную обработку проявлялась только к двадцатому дню культивирования, а после трехдневной обработки регенераты белели на 23 сутки. Для растений, выращенных та семян, селективной была концентрация Км 100 мг/л.
На основании полученных данных можно сказать, что Км четко дифференцирует чувствительные и устойчивые формы только на уровне растений. При обработки каллуса Км ингибирует способность к морфогенезу.
2. Влияние антибиотика цефотаксима (СХ) на каллус кукурузы.
Для успешной трансформации немаловажно было подобрать такие дозы Сх, используемого для элименации агробактерий, которые, подавляя рост бактерий, не угнетали бы рост и регенерацмонную способность каллуса кукурузы. Для определения влияния Сх на рост каллуса и морфогенез, эмбриогенный каллус кукурузы инкубировали на среде П с разными дозами антибиотика в течение нескольких пассажей. Как показали опыты, двухкратной двухнедельной инкубации эксплантов на среде с Сх в концентрациях 100-500 мг/л было достаточно для полной элиминации агробактерий. Инкубация каллусов на среде с 500 мг/л Сх приводила к снижению активности их роста и существенному уменьшению частоты регенерации по сравнению с контролем (среда П без антибиотика). Цефотаксим в дозах 150 и 250 мг/л, напротив, стимулировал морфогенез. У обеих использованных линий и гибрида наибольшая стимуляция отмечена при концентрации антибиотика 150 мг/л. Цефотаксим в концентрации 250 мг/л также стимулировал регенерацию растений, но в меньшей степени (Табл.1).
Все представленные линии кукурузы по разному проявляли регенерационМую активность при добавлении антибиотика. Так у линии А188 число регенерированных побегов на каллус возросло в 2 раза при применении Сх 150 мг/л.. у гибрида А188 х 91 - в 2,6 раза, а у линии 91 - в 18 раз.
Возможно, это зависит от морфогенных особенностей каждой линии. Эмбриогенный каллус линии АШ имеет плотную структуру, в каждом пассаже из части эмбриогенного каллуса образуется неэмбриогенный и развиваются побеги. Гибрид А13Э х 91 по своим морфогенным качествам схож с линией А188, однако,
имеет более высокую частоту регенерации. Линия 91 значительно отличается от двух представленных линий. Каппуо этой линии, представляет из себя, исключительно змбриогенную ткань зернистой структуры с активным ростом. Вся поверхность каллуса 91 линии покрыта зелеными почками, которые, по-видимому, блокированы на поздней стадии развитии, о чем свидетельствует низкая частота регенерации. Вероятно, биологически-активные вещества антибиотика стимулируют заложившиеся зародыши к развитию, поэтому под действием Сх частота регенерации возрастает сильнее, чем у линии А188 и ее гибрида с линией 91.
Таблица 1.
Воздействие Сх на каллус кукурузы
генотип доза Сх (мг/л) кол-во кол-во частота
каллусов регешрантов регенерации
А188 0 72 86 1,2 + 0,3
150 71 171 ** 2,4 ± 0,2
250 74 89 1,3 ±0,2
91 0 151 43 0,3 ± 0,06
150 151 820 *"5 А ± 0,5
250 176 609 *"3.5 ± 0,4
А188x91 0 56 74 1,3 + 0,2
150 74 251 " 3,4 ± 0,3
250 86 199 * 2,3 + 0,3
- Достоверность различий с контролем при соответствующем уровне значимости - 0,05; 0,01,0,001.
Для освобождения от агробактериальной инфекции достаточно использовать цефотаксим в дозе 150 мг/л., в этом случае, цефотаксим играет важную роль не только как злиминатор бактерий, но и как биологически активный стимулятор регенерации растений из эмбриогенного каллуса кукурузы, без чего невозможен успешный исход трансформации.
3. Оптимизация условий агробактериапьном трансформации при культивировании каллуса кукурузы в суспензии агробактерий
Первые опыты по трансфомации эмбриогенкого каллуса кукурузы были проведены по 'классической* схеме, разработанной для введения генов в двудольные растения, то есть кусочки каллуса кукурузы инкубировали в течение часа в ночной культуре A. iumefaciens, а затем высаживали их на среду с Км и Сх. Из 489 каллускых инокулюмов в течение первого месяца культивирования было получено только 24 белых растения-регеиеранта. Во втором пассаже каллус утратил способность к эмбриогенезу. По-видимому, из-за ингибирования канамицином морфогенеза такой способ отбора трансформированных клеток не подходит для кукурузы.
Поэтому в дальнейшем, чтобы избежать преждевременной гибели клеток и блокирования регенерации растений, каллус после обработки агробактериями культивировали на среде П, содержащей только Сх, до появления побегов. Км использовали только при селекции уже полученных регенерактов, а не на стадии развития каллуса, как это происходит при трансформации других культур, таких, например, как табак. Маленькие регенераты (до 1 см высотой) переносили на среду Р с 25 мг/л Км и 150 мг/л цефотаксима. Через две недели большая часть побегов белела. Зеленые регенеранты подращивали на среде К без антибиотиков. Во время культивирования на среде К у части растений процесс поселения продолжался, видимо, за счет Км, который успел накопиться в тканях во время культивирования нз среде с антибиотиком. Те растения, которые остааались зелеными в течение месяца культивирования на среде К, считали устойчивыми к канамицику. Их пересаживали в почву или использовали для определения экспрессии второго маркера - р-глюкуронидаэы, и для ПЦР-анализа.
По выше описанной схеме провели трансформацию кукурузы всех представленных генотипов. При трансформации каллуса А188 канамицин-устойчивых растений отобрать не удалось. Эффективность трансформации двух других генотипов составила 3,3 % для гибрида А188 х 91 и 14,4 % для линии 91 (Табл.2). Вероятность отбора зеленых растений положительно коррелировала с регенерационной способностью генотипа: чем больше растений-регенерантов, тем выше возможность выявления среди них канамицин-устойчивых.
Таблиц« 2.
Трансформация эмбриогенного каллуса кукурузы путем культивирования в суспензии А.и>тв!ас(еп5
кол-во коп-во частота кол-во Км- частота Км-
генотип каллусов регенерантов регенерации устойчивых устойчивых
растений растений, %
А188 118 130 1,1 ±0,3 0 0
150 330 2,2 ± 0,3 5 3,3 +1,2
91 180 785 4,4 ±0,4 26 14,4 ±2,6
Использованная нами модификация описанного в литературе [Дрейпер и др., 1931] метода агробактериальной трансформации, включающая снижение концентрации антибиотиков и применение Км только на стадии регенерации растений, позволила получить Км-устойчивые регенеранты у линии 91 и гибрида А188 х 91. Однако частота появления зеленых растений была низкой, а у линии А188 не было отобрано ни одного стабильно устойчивого к канамицину растения. Возможно, эмбриогенный каллус линии А188 обладает повышенной чувствительностью к обработкам, связанным с агробактериальным заражением. Среднее число растений-регенерантов, получаемых из одного каллуса этой линии без дополнительных обработок, составляет 2-2,5 (Диас и др.. 1994). После кокультивирования с агробактериями и последующей инкубации на средах с антибиотиками частота регенерации понизилась до 0,4-1,1 растений на каллус. Вероятность получения трансгенных растений зависит от частоты встраивания Т-ДНК в геном клетки.и способности трансформированной клетки сформировать растение. Поэтому при низкой регенерационной способности, существенным является повышение эффективности агробактериального заражения.
3.1. Оптимизация условий кокультивирования каллусных инокулюмоа и А. 1итеТас1епве
С целью повышения эффективности заражения каллуса кукурузы агробактериями, анализировали влияние типа питательной среды для кокультивирования и его продолжительности, а также роль специальных обработок.
направленных на облегчение контакта бактерий с клетками кукурузы, в частности, вакуумной инфильтрации и встряхивания на вортексе.
Кокультивирование каллу сных инокулюмов и агробактерии проводили как в среде для роста бактерий (1.В), так и в жидкой среде для роста каллуса (П без агара). Было показано, что среда П успешно поддерживает рост бактериальной культуры. Выяснилось, что выход канамицин-устойчивых растений не выше при использовании среды 1_В для роста агробактерий.
Для определения оптимального времени кокультивации каллуса гибрида А158 х 91 с агробаетерией кокультивацию каллуса кукурузы с агробактерией проводили в течение 1-24 часов, после чего каллус высаживали на среду П с цефотаксимом. Увеличение времени кокультивации не привело к увеличению выхода зеленых растений. При этом, чем длительнее был контакт каллуса кукурузы с суспензией агробактерий, тем ниже выход регенератов. Возможно, снижение эффективности регенерации растений связано с тем, что среда 1.В содержит 1% N301, соль в такой концентрации ингибирует рост каллуса кукурузы. При увеличении продолжительности культивирования каллуса кукурузы в суспензии агробактерий возрастает и токсическое влияние соли. Для предотвращения снижения частоты регенерации растений в дальнейших опытах агробактерии выращивали не в среде 1В, а в среде П, и время контакта клеток кукурузы с агробактерией ограничивали 1 часом.
Обработка иа вортексе незрелых зародышей кукурузы в течение 30 секунд, по данным 15Ы<*а и соавторов (1996), не вызывала повреждения зародышей. Однако, эмбриогенный каллус кукурузы используемых в данной работе генотипов оказался более чувствительным к механическому воздействию. Каллусные инокулюмы после обработки иа вортексе плохо росли, их регенерационная способность сильно снижалась. Среди немногочисленных растений-регенеракгов, которые удалось получить, не оказалось канамицин-устоймивых. Видимо, этот метод неприменим для трансформации халлусных тканей кукурузы.
Использование вакуумной инфильтрации основано на том, что при понижении давления воздух, находившийся в межклеточных пространствах каллусной ткани, выходит, и после возвращения к нормальному давлению место воздуха занимает суспензия агробактерий. Таким образом, создаются условия для контакта агробактерий с большим числом клеток растительного экспланта,
Использование вакуумной инфильтрации позволило повысить выход зеленых растений у гибрида А188 х 91 более, чем в три раза (Табл. 3). При этом условия обработки не вызвали снижения частоты регенерации растений. У более чувствительной линии А188 вакуумная обработка отрицательно сказывалась на способности к морфогенезу, и Км-устойчивые растения получены не были.
■ Таблица 3.
Влияние вакуумной инфильтрации на частоту появления Км-устойчивых
растений.
кол-во кол-во частота кол-во Км- частота Км-
генотип вариаит каллусов ре гене рантов регенерации устойчивых устойчивых
растений растений, %
A18S стандарт 118 130 1,1 ¿0.3 0 0
+вакуум. 117 48 0,4 + 0,2 0 0
А188x91 стандарт 124 274 2,2 ±0,3 4 3,4 ± 1,2
+ вакуум 120 300 2,5 + 0,5 12 10,0 ±2.7
3.2. Повышение вирулентности агробактернй
В природе однодольные растения не заражаются агробактериями, считается, что специфические сигнальные молекулы, индуцирующие область vir агробактерий, обладают у однодольных недостаточной активностью. Показано, что предварительная индукция vir области с помощью экссудатов двудольных растений или синтетических фенольных соединений повышает частоту трансформации злаковых (Stachel 85, IsNda 96).
С целью увеличения частоты генетической трансформации кукурузы, агробактерии перед кокультивированием активировали, добавляя в культуральную Среду 100 мкМ ацетосирингона или разбавляя ее в два раза экссудатом листьев табака. Использование ацетосирингона при трансформации кукурузы существенно повысило выход канамицин-устойчивых растений гибрида А186х 91 (в 3,5 раза), но мало повлияло на частоту зеленых растений у 91 линии. Применение экссудата табака оказалось эффективным для обоих генотипов: доля зеленых растений после трансформации возросла для гибрида А188 х 91 и линии 91, соответственно,
8 5,4 и 2,4 раза по сравнению с кокультивировамнем с неактивированными агробактериями (Табл. 4).
Таблица 4.
Влияние ацетосирингона и экссудата табака на частоту появления Км-устойчивых растений
кол-во коп-во частота кол-во Км • частота Км-
генотип вариант каллусов регенерант. регенерац. устойчивых растений устойчивых растений, %
А188x91 стандарт 150 330 2,2 ± 0,3 5 3,3 ±1,7
+ацетосир 129 318 2,5 ±0,6 15 * 11,6 ±2,8
+экссудат табака 120 336 2,а±0,5 22 "18,3±3,5
91 стандарт 124 528 4,2 ± 0,3 18 14,5 ± 3,2
+ацетосир 129 480 3,7 ± 0,2 21 16,3 ±3,3
- +экссудзт табака 136 602 4,4 ± 0,5 48 *35,3 ±4,1
По-видимому, это связано с тем, что экссудат табака имеет более широкий спектр фенольных соединений и других веществ, которые могут влиять на трансфекцию генов, по сравнению с синтетическим фемольным соединением - ацетссирингоном. Использование ацетосирингона и экссудата листьев табака не вызвало увеличения общей частоты регенерации растений из каллусов гибрида А188 X 91 и линии 91. Следовательно, в данном случае повышение частоты канамицин-устойчивых растений не является следствием увеличения количества регенерантов, как в случае использования неактивированных агробэктерий (см, табл. 2), а отражает специфическую активацию VIг области генома агробактерий.
Во всех выполненных ранее немногочисленных работах по агробакгериальной трансформации кукурузы в качестве эксплактов использовали незрелые зародыши кукурузы или стеблевые апексы. Частота генетической трансформации варьировала от 5 до 30%. Японским исследователям [¡эЫйа е( а!., 1996], несмотря на предпринятые попытки, не удалось трансформировать каллусные инокулюмы. Между тем, использование для трансформации
пассируемого каллуса дает возможность круглогодичной работы, а то время как получение незрелых зародышей приурочено к определенному сезону и ограничено одним- двумя урожаями в год. Оптимизация условий генетической трансформации позволила нам получить Км-уетойчивые растения путем заражения эмбриогенного каллуса, при этом частота предполагаемых трансформантоа была не ниже достигнутой ранее.
При генетической трансформации эмбриогенного каллуса кукурузы путем инкубации в суспензии А. (итеГасяелз получены канамицин-устойчивые растения линии 91 и гибрида А188 х 91. Вакуумная инфильтрация, а также активация агробактерий ацетосирингоном и экссудатом листьев табака способствовали повышению частоты зеленых растений. У линии А188 получить трансгенные растения не удалось.
4. Трансформация кукурузы путем культивирования ка газоне агробактерий
Трансформация с использованием суспензии агробактерий применительно к кукурузе имеет 'ряд существенных недостатков, основные из которых -ограничение времени кокультивации и снижение частоты регенерации после обработки каллуса суспензией агробактерий, следствием которой является уменьшение вероятности отбора трансформированных регенератов. В связи с этим был разработан новый способ агробакгериальиой трансформации кукурузы, свободный от вышеперечисленных недостатков.
Суть его состоит в том, что растительные эксплангты при заражении не выдерживают б суспензии агробактерий, а высаживают на газон агробактерий, выращенный ка среде для роста каллуса, культивируют в течении пассажа (15-20 дней), и потом пересаживают на среду с Сх. Контакт клетки с агробактерией происходит в течение длительного времени, клетки проходит все фазы клеточного цикла, в том числе и наиболее чувствительную к трансфекции Т-ДНК Э-фазу (КаиэсЬ 95, У111етоп1 97). Культивирование на газоне агробактерий в меньшей степени влияет на регенерационную способность эксгшантов, чем культивирование в суспензии.
Первые опыты по генетической трансформации путем культивирования на газоне агробактерий были выполнены нами с использованием незрелых зародышей кукурузы. Свежевыделенные зародыши были высажены на газон
бактерий на среду для образования каллуса. Присутствие агробактерий не мешало каллусогенезу: например, для линии 91 доля зародышей, формирующих эмбриогенный каллус на газоне и на стандартной среде П составила, соответственно, 67 и71%.
Каллус, образовавшийся на газоне агробактерий, пересаживали на среду с Сх, а побеги, по мере их формирования, проверяли на среде с Км. У двух проверенных генотипов (линия 91 и гибрид А1В8 х 91) частота регенерации из каллусных тканей, полученных на газоне агробактерий, была достаточно высокой, среднее число побегов на незрелый зародыш составило, соответственно 3,5 и 2,5. Среди полученных рэгенерантое у обоих генотипов были выявлены Км-устойчивые формы. Если культура агробактерий была перед высевом для образования газона активирована ацетосирингоном или экссудатом листьев табака, доля зеленых регенеранте в обоих генотипов повышалась примерно в полтора раза.
Таким же методом, то есть культивированием на газоне агробактерий, были заражены эмбриогенные каллусы. Каллусные инокулюмы культивировали на газоне бактерий б течение одного пассажа. Поскольку используемая ллазмида РВ1121 помимо гена лр( II, ответственного за устойчивость к канамицину, содержала маркерный ген р-глюкурокидаэы, была возможность проверить транзиентную экспрессию гена ш'е№ в каллусе после культивирования на газоне. На давленных препаратах каллусных тканей и сформировавшихся на каллусе корней хорошо просматривалась синяя окраска, свидетельствующая о С1)5-активности и локализованная, в основном, в ядрах каллусных клеток и в зоне меристемы корня. Проявление активности (З-глюкуронидазы в каллусе после культивирования на агробактериальном газоне показывает эффективность предложенного способа заражения инокулюмов.
Среди регенератов, полученных из каллуса после инкубации на газоне бактерий, зеленые растения были выявлены у всех трех используемых генотипов кукурузы. Из представленных в таблице 5 данных видно, что применение газона агробактерий при Трансформации, позволило отобрать канамициноустойчивых растений больше, чем после трансформации путем культивирования в суспензии агробактерий.
У линии 91 процент кзнамициноустойчивх растений увеличился в 1.4 раза, а у гибрида А108 х 91 - в 4,0 раза по сравнению трансформацией с
использованием суспензии агробактерий. Если у линии А 188 ранее не удавалось получить зеленые растения, то при использовании газона они были получены. Как и в предыдущих опытах, очень эффективна была активация бактерий экссудатом табака.
Таблица 6.
Трансформация эмбриогеиного каллуса кукурузы путем культивирования на
газоне A.tumefaciens
кол-во КОЛ-ВО частота Км кол-во Км- частота Км
генотип вариант каллусов регенерар. устойчивых растений устойчивых растений устойчивых растений,
А188 стандарт 118 130 1,1 ± 0,3 0 0
газон 138 166 1,2 ±0,1 8 4,3 ± 1,7
+эксеуд. табака 135 144 1,1 ±0,2 24 "17,8 ±3.3
А188x91 стандарт 150 330 2.2 ±0,3 5 3,3 ±1,2
газон 124 258 2,1 ± 0,2 16 12,9 ±3,0
+ЭКССУД. табака 104 216 2,1 ± 0,3 * 22 *21,1±4,0
91 стандарт 180 785 4,4 ± 0,4 26 14,4 ±2,6
газон 199 876 4,4 ± 0,2 39 19,6 ± 2,8
+ЭКС, табака 155 526 3,8 + 0,1 63 * 40,6 ±4,0
При определение активности р-глюкуронвдазы в срезах листьев Км-устойчивых растений гистохимическим методом не было обнаружено окрашенных зон. Поскольку оиЭ-активность могла быть приурочена к тканям листа, не попавшим в анализ, ее определение было выполнено на листовых пробах большего размера с помощью флуориметрического метода. Из трех проб в одной, представляющей Км-устойчиеый регенерант линии 91, полученный после инкубации каллуса на газоне активированных экссудатом табака бактерий, показана р-глюкуронидазная активность.
Таким образом, эффективность предложенного метода генетической трансформации была подтверждена экспрессией обоих вводимых генов не только в каллусных тканях, но и в растениях-регенерантах.
Если сравнить различные способы агробактериальной трансформации эмбриогекного каллуса кукурузы, то заражение путем инкубации на газоне агробактерий имеет явное преимущество перед культивированием в суспензионной бактериальной культуре. Разница в использовании методов особенно заметна для гибрида А188 х 91, у которого инкубация каллусов на газоне была в 3,8 раз эффективнее, чем в суспензии (Табл.6).
Таблица 6.
Частота Км-устойчивых растений кукурузы, полученных после
трансформации различными способами, 7».
методы А 188 А 188x91 91
стандарт 0 3,3 ±1,7 14,4 ±3,2
+ацетосерингон ♦ 11,6 ±2,8 16,3 ±3,3
+экйсуд. табака 0 18,3 ± 3,5 35,3 ± 4,1
+вакум инфильтр. 0 10,0 ±2,7 —.'*
газон 4,3 ±1,7 12,9 ±3,0 19,6 ±2,8
+■ ацетосерингон * 25,0 ±4,1
+ экссуд. табака 17,8 ±3,3 21,1 ±4,0 40,6 ± 4,0
•- — нет данных
При проверке эффективности разработанных методов на линии А188, только культивирование эксплантов на газоне агробактерий позволило получить растения, экслрессирующие чужеродные гены. По-видимому, в данном случае имело значение сведение к минимуму воздействий, отрицательно влияющих на жизнеспособность клеток и морфогенез. Метод генетической трансформации путем инкубации эксплантов на газоне агробактерий можно рекомендовать для особенно чувствительных к изменениям условий культивирования тканей. При трансформации линии 91, различимой разницы 8 применении двух агробактериальных методов не наблюдается, скорее всего это связано с высокой
устойчивостью и активной дифференцировкой трансформируемого каллуса этого клона.
Другим наиболее значимым фактором является активация vir области агробактерий экссудатом листьев табака. Использование активированных бактерий при заражении как в суспензии, так и на газоне, в несколько раз повышало частоту Км-устойчивых растений у всех генотипов кукурузы.
Анализируя полученные данные можно утверждать, что предложенная нами система трансформации путем культивирования растительных эксплантов на газоне A. tumefaciens технически проще и значительно эффективнее для кукурузы, чем другие ранее использованные методы агробактериальной генетической трансформации.
S. Тестирование потомства канзмицин-устойчивых растений кукурузы
С целью проверки наследуемости устойчивости к канамицину было проверено потомство пяти трансформированных растений линии 91 от самоопыления или от скрещивания с нетрансгенными растениями той же линии. Четыре из проверяемых Км-устойчивых растений были получены после инкубации эмбриогенного каллуса на газоне агробактерий и одно - после культивирования каллуса в суспензионной бактериальной культуре с добавлением экссудата листьев табака. Потомство растений Neffe 2 и 3 было полнено от самоопыления Км-устойчивых растений, а растения №№ 1,4 и 5 из-за большого интервала между цветением метелок и початков пришлось опылить пыльцой нетрансформированных растений. Завязываемость и жизнеспособность полученных семян была низкой: с первых трех растений удалось собрать, соответственно, лишь 42.17 и 2 зерновки. Частичная стерильность является, вероятно, следствием сомаклокапьных вариаций, возникших в течение продолжительного (окопо года) культивирования каллуса in vitro до регенерации растений. Потеря фертильносги и различные аномалии развития характерны для длительно культивируемых ткзней кукурузы [Dolgikh, 1999]. Семена первых трех растений были замочены в растворе канамицина (100 мг/л) и затем высажены в почву. Зерновки растения № 3 не проросли в почве, среди проростков из семян первого растения не было обнаружено устойчивых к антибиотику, а у растения № 2 из трех проростков один был устойчив к канамицину.
Учитывая низкую жизнеспособность семян, у двух оставшихся растений зародыши были вычленены из поверхностно простерилизованных незрелых зерновок и помещены на агаризованную питательную среду Г) с канамицином,
У Км-усгойчивого растения № 4 зародыши были выделены на 16 день после опыления. Из 60 незрелых зародышей 49 образовали змбриогенный каллус, то есть жизнеспособность незрелых зародышей составила 81,6 %, что значительно больше чем всхожесть вызревших семян. Из полученного эмбриогенного каллуса были регенерированы растения и проверены на устойчивость к канамицину. Тринадцать регенерантов сохранили зеленую окраску после культивирования на среде с антибиотиком. В одном из Км-устойчивых растений флуоримегричесшм методом была показана экспрессия гена GUS.
У растения Ыя 5 зародыши, выделенные через 21 день после опыления, на питательной среде проросли без образования каллуса. Из 55 проростков на среде с канамицином 47 побелело, а 8 остались зелеными.
Таким образом, в потомстве в трех из пяти полученных после генетической трансформации растений показана экспрессия вводимого гена npt ¡i а в потомстве одного растения - экспрессия обоих генов: и npt //, и uid А. Это свидетельствует об эффективности разработанных методов генетической трансформации кукурузы.
6. Введение гена дефензина редьки. Разработанный метод генетической трансформации, был использован для введения в калл у сны е ткани кукурузы гшазм иды pK22rs, содержащей ген дефензина (г$) из семян редьки, с целью повышения устойчивости к некоторым фитопатогенным грибам, таким как Fusarium oxysporum, F. lateritium, Alternaría solani, A, tenius и др. В качестве объекта трансформации, была использована активно регенерирующая линия кукурузы 91. После культивирования змбриогенного каллуса на газоне активизированной экссудатом табака агробактерии было получено несколько Км-устойчивых растений.
встраивание генов npil! и rs было проверено молекулярно-генетическими методами. Совместно с Е.С.Осиповой проведен ПЦР-анализ ДНК, выделенной из Км-устойчивых растений-регенерантое, с прайме ракли для гена Км-устойчивости. Характерная зоны амплификации была обнаружена на препарате ДНК из зеленого растения и отсутствовала в контрольных образцах (Рис.1).
Рисунок 1
ПЦЙ - анализ проростков кукурузы: 1 - Маркер весов Ур$11; 2 - Плазмцца РВ1121; 3 - ДНК ^трансформированного растения кукурузы: 4-5 - ДНК устойчивых к канамицину проростков кукурузы.
г я
Данные ПЦР-анаяиэа были подтверждены блот-гибридизацией по Cay зерну, которая была выполнена сотрудником лаборатории молекулярной генетики рака Института биологии гена РАН А.Кибардиным (Рис.2).
Рисунок 2
Блот - гибридизация ло Саузерну ДНК проростков кукурузы: 1 - Плазм ид а РВИ21 рестрицироеаиная EcoRI; 2- ДНК ^трансформированного проростка кукурузы; 3-4-6-10- ДНКустойчивых к канамицину пророспсов кукурузы.
п ^ ( » С ^ t t
Растение, в котором был обнаружен ген пр1 И, исследовали при использовании соответствующих прайм еров на наличие гена /5. Анализ, проведенный сотрудницей ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии Н.СЛяпковой, подтвердил встраивание гена дефензина в геном кукурузы (Рис.З),
Рисунок 3.
ПЦР - анализ проростков кукурузы: 1 - Маркер весов Х/рйЯ; 2 - Ллазмида рК22ге; 3 - рК22ге + ДНК нетрансформироваиного растения; Л - ДНК нетрансформированного растения; 5-7 - ДНК трансформированы* проростков кукурузы.
Следовательно, описанный способ трансформации дает возможность эффективно интегрировать в геном кукурузы плазмвд«ую ДНК, которая наследуется в следующем поколении.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результат© проведенной работы оптимизирован метод трансформации кукурузы с использованием А йяпеГасйепзе. Разработан новый способ заражения эксплантов кукурузы агробактериями, который заключается в продолжительном (15 дней) культивировании эксллактов на газоне агробактерий, активированных экссудатом листьев табака. Преимуществами данного способа по сравнению с культивированием эксплантов в суспензии агробактерий является длительный контакт растущих тканей растений и активных бактерий, что повышает вероятность заражения, при этом существенно снижается негативное влияние процедуры трансформации на регенерационную способность эксплантов. Последнее особенно важно для аысокочуаствительных генотипов кукурузы.
Новый способ заражения эффективен при использовании в качестве эксплантов и незрелых зародышей, и эмбриогенного каллуса кукурузы. Пассируемый эмбриогенный каллус в качестве эксплантов при агробактериальной трансформации использован впервые.
Разработанный метод агробактериальной трансформации имеет ряд преимуществ по сравнению с используемыми ранее для кукурузы электроларацией протопластов или баллистической трансфекцией, прежде всего, из-за высокой эффективности. Если частота трансгенных растений, полученных путем электропорации, составляет 1 -6 % [Гготт е{ а1.,1986; О'НаНшп е1 а)., 19921, а полученных путем бомбардировки микрочастицами - не превышает 10 % рЛГап!еге е! а1.,1992; ВгеК5сЬпе1<1ег е! а1.,1997], то после заражения эксплантов на газоне агробактерий частота Км-устойчивых растений варьировала от 18 до 40 %. Новый метод значительно дешевле ранее используемых,
Получены растения кукурузы, экспрессирующие маркерные гены пpt II и иША, а также ген га дефензина редьки. Трансфекция чужеродных генов доказана ПЦР-анализом и блот-гибридиэацией по Саузерну. Показано наследование введенных генов.
выводы
V Оптимизирован метод генетической трансформации кукурузы путем кокультивирования с Agrobactenum tumefaciens, в частности, определены концентрации и время применения антибиотиков канамицина и цефотаксима, подобраны условия, способствующие более активному заражению эксплантов.
2. Показано, что применение вакуумной инфильтрации, ацетосирингона или экссудатов листьев табака способствуют повышению частоты трансформации.
3. Выявлено стимулирующее действие цефотаксима на регенерацию растений в культуре тканей кукурузы in vitro. Частота регенерации повышалась в 3 -18 раз в зависимости от генотипа. Цефогаксим усиливал морфогенез, способствуя полной дифференцировке клеток в течение 4-5 месяцев.
4. Предложен новый способ агробактериальной генетической трансформации кукурузы, основанный на культивировании эксплантов на газоне агробактерий в течение 15 дней и позволяющий использовать в качестве эксплантов как незрелые зародыши, так и эмбриогенный каллус. Частота выделения устойчивы* к канамицину растений этим методом была выше по сравнению с ранее предложенными способами трансформации кукурузы,
5. Показана зависимость эффективности генетической трансформации от частоты регенерации растений из каллу сны* тканей кукурузы.
6. Получены трансгекные растения кукурузы, со встроенными генами неомицинфосфотрансферззы II (opt I/), р-глюкуронидазы (ufd А) и дефензиш (rs). Встраивание генов npt II и rs подтверждено данными молекулярного анализа. Показана экспрессия генов npt И и uidA
Список работ, опубликованных по теме диссертации.
1. Данилова СА, Долгих Ю.И. Оценка холодоустойчивости растений кукурузы, полученных in vitro, ti Тезисы научной сессии «Новые методы селекции и создание адаптивных сортов сельскохозяйственных культур: результаты и перспективы» - Киров -1-3 июля - 1998-с. 119-120.
2. Danitova S., Larina S„ Dolgikh YU. Testing of different systems for maize transformation. W In proceeding II Intornat. Sytnp. «Plant biotechnology в - Kiev -4-8 oktober-1998.
3. Данилова С.А. Особенности методики генетической трансформации кукурузы с использованием A.Tumefaciens. II Тезисы школы-конференции «Горизонты физико-химической биологии» - Пущино - 2000 - с. 157-158.
4. Данилова С.А. Оптимизация условий Агробактериальной трансформации кукурузы. II Сб. науч. трудов «РГАЗУ- Агропромышленному комплексу» -Москва -2000 - с. 64-65,
5. Данилова С Л, Долгих Ю.И. II Заявка на патент РФ «Способ получения трансформированных растений кукурузы in vitro» №2001117631 от 26 июня 2001 года.
6. Данилова С.А, Долгих Ю.И. II Заявка на патент РФ «Способ обработки э мбр йог енмого каллуса кукурузы in мйго» На 2001121086 от 27 июля 2001 года.
Обі, см 5"пл.
За к .Sbfy_Тираж ЮО экз.
AHO «Издательство МСХА»
127_>ÍO, Москва, ул. Тимирязевская, 44
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Данилова, Светлана Алексеевна
Введение
Обзор литературы
Глава I. Трансгенные растения для целей практической селекции.
1.1. Устойчивость к гербицидам
1.2. Устойчивость к насекомым
1.3. Устойчивость к вирусам
1.4. Устойчивость к фитопатогенам . Ю
I. 5. Устойчивость к абиотическим стрессам
1.6. Сбалансированный аминокислотный состав запасных белков
I. 7.Изменение состава вторичных метаболитов
I. 8.Получение вакцин с помощью трансгенных растений
1.9.Экологическая роль трансгенных растений
Глава П.Генетическая трансформация растений - представителей семейства злаковых
II. 1. Методы генетической трансформации однодольных растений
II. 1. 1. Метод "прямого" переноса генов в протопласты
II. 1. 2. Трансформация с помощью опыления
II. 1.3. Баллистическая трансформация
II. 1. 4. Трансформация с использованием агробактерий
II. 2. Маркёры трансформации
II. 2.1. Селективные гены
II. 2. 2. Репортёрные гены
II. 3. Экспрессия чужеродных генов и её регуляция в трансгенных растениях ЗЗ
II. 4. Генетическая трансформация кукурузы
Экспериментальная часть
Глава III. Материал и методы
Глава IV. Результаты и обсуждение
IV. 1.Влияние антибиотика канамицина на каллус и растения кукурузы
IV. 2. Влияние антибиотика цефотаксима на рост каллуса и регенерацию растений кукурузы
IV. 3. Трансформация кукурузы с использованием суспензии агробактерий
IV. 4. Оптимизация условий агробактериальной трансформации при культивировании каллуса кукурузы в суспензии агробактерий
IV. 5. Трансформация кукурузы путем культивирования на газоне агробактерий
IV.6. Тестирование семян полученных из канамицин устойчивых растений кукурузы'
IV. 7. Введение гена дефензина редьки
Введение Диссертация по биологии, на тему "Оптимизация агробактериального метода трансформации кукурузы"
В последние годы, в связи с задачами наращивания производства сельскохозяйственной продукции, большое внимание уделяется теоретическим разработкам и практической реализации достижений биотехнологии. Для обеспечения потребностей населения, численность которого достигнет к 2040 году 8,5 млрд.человек, потребуется при существующих площадях сельскохозяйственных угодий повысить урожайность возделываемых кулыур в 3 раза (Захаренко 2000). При ограниченных земельных ресурсах и почти исчерпанных возможностях увеличения урожайности за счет традиционных факторов интенсификации земледелия (химизация, механизация и мелиорация земель), внедрение новейших достижений биотехнологии и, в частности, генетической инженерии растений, является реальным направлением повышения продуктивности земледелия.
Генетическая инженерия дает возможность получения растений со свойствами, присутствие которых невозможно обеспечить методами традиционной селекции. Классическая селекция, в лучшем случае, могла использовать наследственный материал только ближайших родственников культурных растений, но и эта возможность сопровождалась дополнительным балластом нежелательных генов, от которых нужно было избавляться многократными возвратными скрещиваниями с большим риском утратить немногие полезные признаки. Весь же оставшийся генофонд живой природы был полностью недоступен для применения в селекционной практике. Методами генетической инженерии можно конструировать функционально активные генетические структуры in vitro из фрагментов генов различных организмов и вводить такие конструкции в клетку, создавая условия для экспрессии введенных, часто совершенно чужеродных генов. 4
Применение трансгенных растений, способных противостоять насекомым-вредителям, патогенам, неблагоприятным факторам окружающей среды без дополнительных обработок химическими веществами может значительно улучшить экологическое состояние природы и сделать более "органическими" продукты питания для человечества. Генетическая инженерия растений оперирует с теми же веществами -молекулами нуклеиновых кислот и белков, с которыми человечество сталкивается постоянно за своим обеденным столом. В отличие от химического производства, она не создает новые вещества, которые были бы незнакомы человеческому организму или природе в целом. Эта технология свободна от загрязняющих мир токсических отходов.
В настоящее время решены фундаментальные вопросы, связанные с передачей генов: разработаны методы трансформации, созданы плазмиды для переноса, подобраны условия эффективного введения чужеродных генов. С помощью генетической трансформации уже получены трансгенные растения, представляющие интерес для сельскохозяйственного производства, в том числе, обладающие такими признаками как устойчивость к гербицидам, насекомым, вирусам, фитопатогенам, абиотическим стрессам и др. Трансгенные формы картофеля, томатов, табака, риса, кукурузы, сои, подсолнечника, льна проходят испытания на экспериментальных полях, а некоторые уже составляют значительную часть в валовом сельскохозяйственном продукте ряда стран, в первую очередь, США. По данным международной службы по применению агробиотехнологических разработок за период с 1996 по 1999 г. площадь посевов трансгенных сортов расширилась с 1,7 до 39,9 млн. га. Общая прибыль от использования трансгенных сортов оценивается в сотни млн. долларов (Левенко, 2000, Захаренко, 2000). В России полученные трансгенные растения пока только проходят полевые и производственные испытания.
Кукуруза, которая является очень ценной зерновой и кормовой культурой, стала одним из первых объектов генетической трансформации, имеющей практическую 5 направленность. Трансгенные сорта, обладающие устойчивостью к гербицидам и насекомым-вредителям, уже возделываются на полях в США, Канаде и некоторых других странах. Тем не менее, до сих пор генетическая трансформация кукурузы остается серьезной проблемой. В настоящее время основным способом введения чужеродных генов в растения злаковых является баллистическая тр;шсфекция. Наряду с рядом преимуществ, этот способ имеет такие недостатки как низкая эффективность, нестабильность и малая емкость вводимых конструкций, высокая стоимость. Значительно большую экономическую эффективность и стабильность результатов обеспечивает введение генов, опосредованное агробактериями. Этот метод детально разработан для двудольных растений, но почти не используется для однодольных. Хотя в литературе встречаются отдельные сообщения о применении метода агробактериальной трансформации к зерновым, однако для кукурузы он практически не разработан.
Целью данной работы является разработка оптимальных условий генетической трансформации кукурузы с использованием Agrobacterium tumsfaciens, как одного из способов увеличения производства этой ценной сельскохозяйственной культуры. Для достижения поставленной цели нужно было решить сле дующие задачи:
1. оптимизировать условия агробактериального заражения эксплантов и отбора трансформированных растений;
2. получить трансгенные растения кукурузы;
3. проверить наследование введенных генов. 6
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
В 1983 г. были опубликованы первые работы по получению трансгенных растений табака, содержавших в качестве чужеродных генов селективные маркеры устойчивости к антибиотикам и гены - репортеры и использовавшихся, как чисто научные модели. Однако, уже через три года были проведены первые полевые испытания сельскохозяйственных трансгенных растений, а спустя десять лет генетическая инженерия растений решительно заявила о себе, предложив рынку десятки экономически важных трансгенных растений. В 1995 г. в США были получены первые разрешения на коммерциализацию трансгенных сортов растений и их продуктов.
В настоящее время различные методические приемы генетической инженерии стали составной частью современной молекулярной и клеточной биологии. К основным задачам генетической инженерии относятся генетическая трансформация различных видов растений, экспрессия чужеродных генов и её регуляция в клетках трансгенных растений.
Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Данилова, Светлана Алексеевна
ВЫВОДЫ
1. Оптимизирован метод генетической трансформации кукурузы путем кокультивирования с Agrobacterium tumefaciens, в частности, определены концентрации и время применения антибиотиков канамицина и цефотаксима, подобраны условия, способствующие более активному заражению эксплантов.
2. Показано, что применение вакуумной инфильтрации, ацетосирингона или экссудатов листьев табака способствуют повышению частоты трансформации.
3. Выявлено стимулирующее действие цефотаксима на регенерацию растений в культуре тканей кукурузы in vitro. Частота регенерации повышалась в 3 - 18 раз в зависимости от генотипа. Цефотаксим усиливал морфогенез, способствуя полной дифференцировке клеток в течение 4-5 месяцев.
4. Предложен новый способ агробактериальной генетической трансформации кукурузы, основанный на культивировании эксплантов на газоне агробактерий в течение 15 дней и позволяющий использовать в качестве эксплантов как незрелые зародыши, так и эмбриогенный каллус. Частота выделения устойчивых к канамицину растений этим методом была выше по сравнению с ранее предложенными способами трансформации кукурузы.
5. Показана зависимость эффективности генетической трансформации от частоты регенерации растений из каллусных тканей кукурузы.
6. Получены трансгенные растения кукурузы, со встроенными генами неомицинфосфотрансферазы II (npt II), (3-глюкуронидазы (uid А) и дефензина (rs). Встраивание генов npt II и rs подтверждено данными молекулярного анализа. Показана экспрессия генов npt II и uidA.
93
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате проведенной работы оптимизирован метод трансформации кукурузы с использованием A. tumefaciense. Разработан новый способ заражения: эксплантов кукурузы агробактериями, который заключается в продолжительном (15 дней) культивировании эксплантов на газоне агробактерий, активированных экссудатом листьев табака. Преимуществами данного способа по сравненк ю с культивированием эксплантов в суспензии агробактерий является длительный контакт растущих тканей растений и активных бактерий, что повышает вероятность заражения, при этом существенно снижается негативное влияние процедуры трансформации на ре генерационную способность эксплантов. Последнее особенно важно для высокочувствительных генотипов кукурузы.
Новый способ заражения эффективен при использовании з качестве эксплантов и незрелых зародышей, и эмбриогенного каллуса кукурузы. Пассируемый эмбриогенный каллус в качестве эксплантов при агробактериальной трансформации использован впервые.
Разработанный метод агробактериальной трансформации имеет ряд преимуществ по сравнению с используемыми ранее для кукурузы электропара цией протопластов или баллистической трансфекцией, прежде всего, из-за высокой эффективности. Если частота трансгенных растений, полученных путем электропоращш, составляет 1 -6 % [Fromm et al.,1986; O'Halluin et al.,1992], а полученных путем бомбардировки микрочастицами - не превышает 10 % [Wanters et al.,1992; Brettschneider et al.,1997], то после заражения эксплантов на газоне агробактерий частота Км-уетойчивых растений варьировала от 18 до 40 %. Новый метод значительно дешевле ранее используемых, Получены растения кукурузы, экспрессирующие маркерные гены npt II и aid А, а также ген rs дефензина редьки. Трансфекция чужеродных генов доказана ПЦР ■■ анализом и блот - гибридизацией по Саузерну. Показано наследование введенных генов.
92
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Данилова, Светлана Алексеевна, Москва
1. Бурьянов Я.И. Успехи и перспективы генно-инженерной биотехнологии растений. // Физиология растений 1999 - т. 46 - № 6 - с. 930-944.
2. Бурьянов Я.И., Кадо К.И. Стратегия создания трансгенных растений с устойчивостью к фитопатогенам и вредителям.//Биорганическая химия 1999 - т.25 - №12 - с.903-910.
3. Гамбург К.З., Рекославская Н.И., Швецов С.Г. Ауксины в культурах тканей и клеток растений. // Новосибирск: Наука 1990 - 241с.
4. Данилова С.А. Особенности методики генетической трансформации кукурузы с использованием A. tumefaciens. // Тезисы школы-конференции "Горизонты физико-химической биологии", Пущино, II часть 2000а - с. 157-158.
5. Данилова С.А. Оптимизация условий агробактериальной трансформации кукурузы. // Сб. научных трудов "РГАЗУ Агропромышленному комплексу" I часть, Москва -2000 - с. 64-65.
6. Диас С., Долгих Ю.И., Шамина З.Б., Шевелуха И.С. Значение физиологических и генетических факторов в индукции эмбриогенного каллуса у разных линий кукурузы. // Доклады РАСХН 1994 - № 2 - с. 6-8.
7. Долгих Ю.И., Ларина С.Н., Шамина З.Б., Жданова Н.Е., Пустовойтова Т.Н. Засухо устойчивость растений кукурузы, поллученных из устойчивых к осмотическому94действию полиэтиленгликоля клеточных линий. // Физиология Растений 1994 - т. 41-№6-с. 853-858.
8. Ю.Драйпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Уолден Р. (Ред.) Геннная инженерия растений.- Москва: Мир 1991 - 408 с.
9. Ивашута С.И., Агафодорова М.Н., Солодкая J1.A., Кирьян И.Г., Мазин В.В. Влияние реципиентных систем на эффективность генетической трансформации кормовых растений // Биотехнология 1995 - № 1-2 - с.6-10.
10. Кучук Н.В. Генетическая инженерия высших растений // Киев: Наукова думка 1997- 152 стр.
11. Левенко Б.А. Биотехнология растений: сегодня и завтра // Физиология и биохимия культурных растений 1999 - т.31 - №3 - с. 163 - 172.
12. Лихтенштейн К., Дрейпер Д. Генетическая инженерия растений. // Клонирование ДНК. Методы. М: Мир - 1988 - с. 315-380.95
13. Лутова JI.А., Павлова З.Б., Иванова М.М. Агробактериальная трансформация как способ изменения гормонального метаболизма у высших растений. // Генетика 1998 -т. 34-№2-с. 165 - 182.
14. МаниатисТ., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Москва: Мир - 1984 - 480с.
15. Неумывакин JI.B., Пирузян Э.С. Использование методов генной инженерии для повышения осмоустойчивости растений. // Тезис доклада VIII конференции "Новые направления биотехнологии" 27 - 29 апреля 1998 - М. - с. 29.
16. Парашина Е.В., Шаденков А.А., Лаврова Н.В., Аветисов В.А. Использование гена защитного пептида (дефензина) из семян редьки для повышения устойчивости томатов к заболеваниям, вызываемым грибами. // Биотехнология 1999 - г.6 - с.35- 41.
17. Пирузян Э.С. Основы генетической инженерии растений // Москва: Наука 1988 -304 стр.
18. Пухальский В.А., Смирнов С.П., Коростылева Т.В., Билинская Е.Н., Елисеева А.А. Генетическая трансформация пшеницы (Triticum aestivum L.) с помощью Agrobacterium tumefaciens. // Генетика 1996 - т. 32 - № 11 - с. 1596 - 1600.
19. Ралдугина Г.Н., Горелова С.В., Кожемякин А.В. Стабильность и наследование трансгеннов в растениях рапса. // Физиология растений 2000 - т. 47 - № 3 - 437-445.
20. Чесноков Ю.В., Король А.Б. Перенос чужеродных генов в интактные растения кукурузы посредством процесса опыления оплодотворения. // Генетика - 1993 - т. 29 -N. 8 - с. 1345 - 1355.
21. Agrawal D.C., Baneijee А.К., Kedari Р.Н., Jacob S., Hazra S., Krishnamurthy K.V. Effect of cefotaxime on the growth of excised embryo-axes of 6 cultivars of cotton (Gossypium hirsutum L.) // J. Plant Physiology 1998 - v.152 - Iss.4-5 - p.580-582.
22. Akella V., Lurguin P.F. Expression in cowpea seedlings of chimeric transgenes after electroporation into seed derived embryos. // Plant Cell Repts. - 1993 - v. 12 - is. 2 -p. 110-117.
23. Aldemita R.R., Hodges Т.К. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of japonica and indica rice varieties. // Planta 1996 - v. 199 - p. 612-617.
24. АНа, Hayaski H., Chen Т.Н., Murata N. Transformation with a gene for choline oxidase enhances the cold tolerance of Arabidopsis during germination and early growth. // Plant Cell and Environment. 1998 - v. 21 p. 232 - 239.
25. Altenbach S.B., Pearson K.W., Leung F.W., Sun S.S.M. Cloning and sequence analysis of cDNA encoding a Brazil nut protein exceptionally rich in methionine. // Plant Mol. Biol. -1987-v. 8-p. 239-250.
26. Ап G., Costa M.A., Ha S.B. Nopaline synthase promoter is wound inducible and auxin inducible. // Plant Cell 1990 - v. 2 - p. 225 - 333.
27. Anderson J.M., Palukaitis P., Zaitlin M. A defective replicase gene induces resistance to cucumber mosaic virus in transgenic tobacco plants. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1992 - v. 89-is. 18-p. 8759-8763.
28. Anderson N., Kirihara J. Selection of stable transformants from Black Mexican sweet maize suspension cultures. // The Maize Handbook, Eds. Freeling M., Walbot V. New York: Springer - 1994 - p. 690 - 694.
29. Аппе C.F., Graves I.S.L., Goldman. The transformation of Zea mays seedlings with Agrobacterium tumefaciens. // Plant Moiecular Biology 1986 - v. 7 - p. 43-50.
30. Arakawa Т., Langridge W. et al. Efficacy of a food plant based oral cholera toxin P. subunit vaccine. // Nature Biotechnol. 1998 - v. 16 - p. 292 - 297.
31. Atabekov J.G.,Dorokhov Y.L. Plant virys specific transport function and resistance of plants to viruses. //Adv. Virus Res. 1984 - v. 29 - p. 313 - 364.
32. Barcelo P., Hagel C., Becker D. et al. // Transgenic cereal (tritordeum) plants obtained at high efficiency by microprojectile bombardment of inflorescence tissue. // Plant J. 1994 -v. 5 - is. 4 - p. 583 - 592.
33. Bates G.W. Electroporation of plant protoplasts and tissues. // Methods in Cell Biology v. 50 / Eds. D.W. Galbraith, D.P. Bourque, H.J. Bohnert - New York: Acad. Press - 1995 -p 363 - 373.
34. Bayley C., Trolinder N., Ray C. et al. Engineering 2,4 D resistance into cotton. // Ibid. -1992 v. 83 - p. 645 - 649.
35. Becker D., Brettschneider R., Lorz H. Fertile transgenic wheat from microprojectile bombardment of scutellar tissue. // Plant J. 1994 - v. 5 - is. 2 - p. 299 - 307.
36. Benfey P.N., Chua N.H. The cauliflower mosaic virus 35S promoter: combinatorial regulation of transcription in plants. // Science 1990 - v. 250 - p. 959-966.
37. Bharathi M., Foissac X., Du J. et. al. Enhancing the resistance of rice to brown planthopper. //Abstr. IX Intern Congr. Plant Tissue Cell Culture 1998 - Jerusalem -14-19 June - p. 130.
38. Birch R. G., Franks T. Development and optimization of microprojectile systems for plant genetic transformation. // Aust. J. Plant Physiol. -1991 v. 18 - p.453 - 469.
39. Borrelli G.M., Difonzo N., Lupotto E. Effect of cefotaxime on callus culture and plant regeneration in durum wheat // J. Plant Physiology 1992 - v. 140 - Iss.3 - p.372-374.
40. Brettschneider R., Becker D., Lorz H. Efficient transformation of scutellar tissue of maize embryos. // Theor Appl Genet -1997 v. 94 - p. 737 - 748.98
41. Breusegem E., Slooten L., Stassart J.M. et al. Overprooduction of Arabidopsis thaliana FeSOD confers oxidative stress tolerance to transgenic maize. // Plant & Cell Physiology -1999-v. 40-is. 5-p. 515-523.
42. Callis J., Fromm M.E., Walbot V. Introns increase gene expression in cultured maize cells. // Genes Devel. 1987 - v. 1 - p. 1183 - 1200.
43. Cassas A.M., Kononowicz A.K., Zehr U.B., Tomes D.T., Axtell J.D., Butler L.G., Bressan R.A., Hasegawa P.M. Transgenic sorghum plants via microprojectile bombardment. // Proc. Natl. Acad. Sci.USA 1993 - v. 90 - p. 11212 -11216.
44. Castillo A.M., Vasil V., Vasil I.K. Rapid production of fertile transgenic plants of rye (Secale cereale L.). // Biotechnology 1994 - v. 12 - is. 12 - p. 1366-1371.
45. Cheng M., Joyce E. Fry, Shengzhi Pang., Huaping Zhou, Catherine M. Hironaka, DDuncan D.R., Conner T.W., Wan Y. Genetic transformation of wheat Mediated by Agrobacterium tumefaciens. // Plant Physiology 1997 v. 115 - p. 971-980.
46. Comail L., Facciotti D., Hiatt W. et al. Expression in plants of a mutant Salmonella gene from Salmonella typhimurium confers tolerance to glyphosate. // Nature 1985 - v. 317 - p. 741 - 744.
47. Cuozzo M., O'Connel K.M., Kaniewski W. et al. Viral protection in transgenic tobacco plants expressing the cucumber mosaic virus coat protein or its antisence RNA. // Biotechnology 1988 - v. 6 - p. 549 - 557.
48. Dai Z., An G. Induction of nopaline synthase promoter activity by H202 has no direct correlation with salicylic acid. // Plant Physiol. 1995 - v. 109 - p. 1191 -1197.
49. Datta S.K., Peterhans A., Datta K., Potrykus I. // Genetically engineered fertile Indica rice recovered from protoplast. // Biotechnology - 1990 - v. 8 - p. 736 - 740.
50. De Block M., Botterman J., Vandewiele M. et al. Engineering herbicide resistance in plants by expression of a detoxifying enzyme. // Ibid. 1987 - v. 6 - p. 2513 - 2518.
51. Dekeyser R.A., Claes В., De Rycke R.M.U. et al. Transient gene expression in intact and organized rice tissues. // Plant and Cell 1990 - v. 2 - is. 7 - p. 591 - 602.
52. Delannay X., Vallee B.J. la, Proksch R.K. et al. Field performance of transgenic tomato plants expressing the Bacillus thuringiensis var. kurstaki insect control protein. // Biotechnology 1989 - v. 7 - p. 1265 - 1269.
53. Dennebey B.K., Petersen W.L., Ford Santino C. et al. Comparison of selectiwe agents for use with the selectable marker gene bar in maize transformation. // Plant Cell Tis. and Org. Cult. - 1994-v. 36-is. 1-p. 1-7.
54. Dennehey B.K., Petersen W.L., Fordsantino C., Pajeau M., Armstrong C.L. Comparison of selective a gents for use with the selectable markers gene bar in maize transformation. // Plant Cell Tissue and Organ Culture 1994 - v. 36 - is. 1 - p. 1-7.
55. DeWet J.R., Wood K.V., DeLuca M., Helinski D.R. Firefly luciferase gene: structure and expression in mammalian cells. // Mol. Cell Biol. 1987 - v. 7 - p. 725 - 737.
56. Dillen W., Engler G., Van Montagu M. et al. Electroporation mediated DNA delivery to seedling tissues of Phaseolus vulgaris L. (common bean). // Plant Cell Repts. - 1995 - v. 15 -is. 1/2- p. 119-124.
57. Dolgykh Y.I. High level of variability among the plants regenerated from callus of inbred A188. // Maize Genetics Cooperation Newsletter 73 1999 - april 15 - p. 70.
58. Ding X., Gopalakrishnan В., Johnson L.B. et al. Insect resistance of transgenic tobacco expressing an insect chitinase gene. // Transgenic Res. 1998 - v. 7 - N 2 - p. 77-84.
59. Duan X., Li X., Xue Q., Aboo et - Saad M., Xu D., Wu R. Transgenic rice plants harboring an introduced potato proteinase inhibitor II gene are insect resistant. // Nature Biotechnol. - 1996 - v. 14 - p. 494 - 498.
60. Dunder E., Dawson J., Suttie J., Page G. Maiz transformation by microprojectile bombardment of immature embryos. // In: Potrykus I., Spangenberg G. (eds) Gene transfer to plants. Springer, Berlin Heidelberg New York 1995 - p. 127 - 138.
61. Dupuis J., Pace G.M. Gene transfer to maize male reproductive structure by particle bombardment of tassel primordia. // Plant cell Reports - 1993 - v. 12 - is. 11 - p. 607-611.
62. Ellis J.G., Llewellyn D.L., Dennis E.S., Peacock W.J. Maize adh-I promoter sequences control anaerobic regulation: addition of upstream promoter elements from constitutive genes is necessary for expression in tabacco. // Embo J. 1987 - v. 6 - p. 11-16.
63. Ellis J.R., Shirsat A.H., Hepher A. et al. Tissue specific expression of a pea legumin gene in seeds of Nicotiana plumbaginifolia. // Plant Mol. Biol. 1988 - v. 10 - p. 203 - 214.
64. Elmayan Т., Tepfer M. Synthesis of a bifunctional metallothionein (3 glucuronidase fusion protein in transgenic tobacco plants as a means of reducing leaf cadmium levels. // Plant J. -1994 - v. 6 - is. 3 - p. 433 - 440.
65. Faranda S., Genga A., Viotti A., Manzocchi L.A. Stably transformed cell lines from protoplasts of maize endosperm suspension - cultures. // Plant Cell Tissue and Organ Culture - 1994 - v. 37 - is. 1 - p. 39 - 46.
66. Fischoff D.A., Bowdish K.S., Perlak F.J. et al. Insect tolerant transgenic tomato plants. // Ibid. 1987-v. 8-p. 807-813.
67. Fromm M.E., Morrish F., Armstrong C. et al. Inheritance and expression of chimeric genes in the progeny of transgenic maize plants. // Biotechnology 1990 - v. 8 - p. 833 - 844.
68. Fromm M.E., Taylor L.P., Walbot V. Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation. // Proc. Nat.Acad.Sci. USA. 1985 - v.82 - p.5824-5825.
69. Fromm M.E., Taylor L.P., Walbot V. Stable transformation of maize after gene transfer by electroporation. // Nature 1986 - v. 319 - p. 791 - 793.
70. Fujimoto H., Itoh K.,Yamamoto M. et al. Insect resistant rice generated by introduction of a modified delta toxin of Bacillus thuringiensis. // Ibid. - 1993 - v. 11 - p. 1151 -1155.
71. Gioppa della G., Bacur S.C., Taylor M.L. et al. Targeting herbicide - resistant enzyme from Escherichia coli to chlroplasts of higher plants. // Biotechnology - 1987 - v.5 - p.579 -584.
72. Godwin I., Ford-Lloyd В., Newbury H. In vitro approaches to extending the host-range of Agrobacterium for plant transformation. // Aust. J. Bot. 1992 - v. 40 - p. 751-763.102
73. Golovkin M.V., Abraham M., Morocz S., Bottka S., Feher a., Dudits D. Productiin of transgenic maize plants by direct DNA uptake into embryogenic protoplasts. // Planta Science 1993 - v. 90 - is. 1 - p. 41 - 52.
74. Gordon Kamm W. J., Spencer T.M., Mangano M.L. et al. Transformation of maize cells and regeneration of fertile transgenic plants. // Plant Cell. - 1990 - v. 2 - p. 603 - 618.
75. Gould J., Devey M., Hasegawa O., Eugenio C.U., Peterson G., Smith R.H. Transformation of Zea mays L. using Agrobacterium tumefaciens and the shoot apex. // Plant Physiology -1991 v. 95 - p. 426-434.
76. Graves A.S.F., Goldman S.L. The transformation of Zea mays seedlings with Agrobacterium tumefaciens: detection of T-DNA specific enzyme activities. // Plant Mol. Biology 1986 - v. 7 - p. 43-50.
77. Green C.E. Somatic embryogenesis and plant regeneration from friable callus of Zea mais. // In plant tissue culture, maruzen со., Tokyo, Japan 1982 - Ed. Fujiwara A. - p. 107-108.
78. Greenwood J.S., Chrispefls M.J. Correct targeting of the bean storage protein phaseolin in the seeds of transformed tobacco. //Plant Physiol. 1985 - v. 79 - p. 65 - 71.
79. Grimsley N., Hohn Т., Davis J.W., Hohn B. Agrobacterium mediated delivery of infectious maize streak virus into maize plants. // Nature 1987 - v. 325 - p. 177-179.
80. Grimsley N., Hohn Т., Ramos C., Kado C., Rogowsky R. DNA transfer from agrobacterium to Zea mays or Brassica by agroinfection is dependent on bacterial virulence functions. // Mol. Gen Genet. 1989 - v. 217 - p. 309-316.
81. Gritz L., Davies J. Plasmid encoded hygromycin В resistance: the sequence of hygromycin В phosphotransferase gene and its expression in Esherichia coli and Saccharomyces cerevisiae. // Gene - 1983 - v. 25 - p. 179 - 188.
82. Hafte H., Whiteley H.R. Insecticidal crystal protein of Bacillus thuringiensis. // Microbiology Rev. 1989 - v. 53 - p. 242-255.103
83. Hain R., Reif H. J., Krause E. et. al. Disease resistance results from foreign phytoalexin expression in novel plant. // Nature 1993 - v. 361 - p. 153 - 156.
84. Hansen G., Chilton M.D. "Agrolistic transformation of plant cell: integration of T strans generated in planta. // Proc Nat. Acad. Sci. USA - 1996 - v. 93 - p. 14978 - 14983.
85. Hauptmann R.M., Ashraf M., Vasil V., Hannah L.C., Vasil I.K., Ferl R. Promoter strength comparisons of maize Shrunken 1 and Alcohol dehydrogenase 1 and 2 promoters in mono-and dicotyledonous species. // Plant Physiol. 1988 - v. 88 - p. 1063 - 1066.
86. Hauptmann R.M., Ozias Akins P., Vasil V., Tabaeizadeh Z., Rogers S.G., Horsch R.B., Vasil I.K., Fraley R.T. Transient expression of electroporated DNA in monocotyledonous and dicotyledonous species. // Plant Cell Rep. - 1987 - v. 6 - p. 265 - 270.
87. He D.G., Mouradov A., Yang Y.M. et al. Transformation of wheat (Triticum aestivum L.) through electroporation of protoplasts. // Plant Cell Rep. -1994 v. 14 - p. 192 - 196.
88. He G.Y., Lazzeri P.A. Analysis and optimization of DNA delivery into wheat scutellum and tritordeum inflorescence explants by tissue electroporation. // Plant Cell Rep. 1998 -v.18- is. 1/2 - p. 64 - 70.
89. Hess D., Dressier K., Nimmrichter R. Transformation experiments by pipetting Agrobacterium into spikelets of wheat (Triticum aestivum L.). // Plant Sci. 1991 - v. 72 -p.233 - 244.
90. Hilder V.A., Gatehouse A.M.R., Sheerman S., Barker R., Boulter D. A novel mechanism of insect resistance engineered into tobacco. // Nature 1987 - v. 330 - p. 160 - 167.
91. Hoekema A., Roelvink P.W., Hooykaas P.J.J., Schilperoort R.A. Delivery of T-DNA from the A. tumefaciens chromosome into plant cells. // Embo J. 1984 - v. 3 - p. 2485-2490.
92. Hoffman L.M., Donaldson D.D., Bookland R. et al. Synthesis and protein body deposition of maize 15-kd zein in transgenic tobacco seeds. // EMBO J. 1987 - v. 6 -p. 3113 - 3221.
93. Ishizaki-Nishizawa O., Fujii Т., Azuma M. et al. Low-temperature resistance of higher plants is significantly enhanced by a nonspecific cyanobacterial desaturase. // Ibid 1996 -v.14 - p, 1003-1006.
94. Jefferson R.A., Kavanagh T.A., Bevan M.W. GUS fusion: p glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in plants. // EMBO J. - 1987 - v. 6 - p. 3901 - 3907.
95. Kaeppler H.F., Menon G.K., Skadsen R.W., Nuutila A.M., Carlson A.R. Transgenic Oat plants via visual selection of cells expressing green fluorescent protein. // Plant Cell Reports -2000-v. 19-is. 7-p. 661 -666.
96. Kaeppler H.F., Somers D.A., Rines H.W., Cockburn A.F. Silicon carbide fiber -mediated stable transformation of plant - cells. // Theor. and Appl. Genet. - 1992 - v. 84 -p.560 - 566.
97. Пб.Като K.K., Becwar M.R., Hodges Т.К. Regeneration Zea mays L. from embryogenic callus. // Bot. Gas. 1985 - v. 146 - is. 3 - p. 327-334.105
98. Kar S., Basu D., Das S. et al. Expression of cryA(c) gene of Bacillus thuringiensis in transgenic chickpea plants inhibits development of pod borer (Heliothis armigera) larvae. // Transgenic Res. - 1997 - v. 6 - p. 177 - 185.
99. Keil M., Sanchers Serrano J.J., Willmitzer L. Both wound - inducible and tuber - specific expression are mediated by the promoter of a single member of the potato proteinase inhibitor II gene family. // EMBO J - 1989 - v. 8 - p. 1323 - 1330.
100. Kim S.R., Kim Y., An G. Identification of methyl iasmonate and salicylic acid response elements from nopaline synthase (nos) promoter. // Plant Physiol. 1993 - v. 103 - p.97-103.
101. Klein T.M., Fromm M., Weissinger A. et al. Transfer of foreing genes into intact maize cells with high velocity microinjection. // Proc. Nat. acad. Sci. USA - 1988 - v. 85 -p. 4305 - 4309.
102. Klein T.M., Roth B.A., Fromm M.E. Regulation of anthocyanin biosynthetic genes introduced into intact maize tissues by microprojectiles. // Ibid. 1989 - v. 86p.6681 -6685.
103. Kloti A., Iglesias V.A„ Wunn J. et al. Gene transfer by electroporation into intact scutellum cells of wheat embryos. // Plant Cell Repts. 1993 - v. 12 - is. 12 - p. 671 - 675.106
104. Konez С., Kreuzaler F., Kahnan Z., Schell J.A. Simple method to transfer, integrate and study expression of foreign genes, such as chicken ovalbumin and a-actin in plant tumors. // Embo J. 1984 - v. 3 - p. 1029-1037.
105. Kramer C., DiMaio J., Carswell G.K., Shillito R.D. Selection of transformed protoplast-derived Zea mays colonies with phosphinothricin and a novel assay using the pH indicator chlorophenol red. // Planta 1993 - v. 190 - p. 454-458.
106. Kuboi Т., Noguchi A., Yazaki J. Family dependent cadmium accumulation characteristics in higher plants. // Plant Soil. 1986 - v. 92 - p. 405 - 415.
107. Laursen C.M., Krzyzek R.A., Flick C.E., Anderson P.C., Spencer T.M. Production of fertile transgenic maize by electroporation of suspension culture cells. // Plant Molecular Biology - 1994 - v. 24 - is. 1 - p. 51-56.
108. Lazzeri P.A., Brettschneider R., Luhrs R., Lorz H. Stable transformation of barley via PEG induced direct DNA uptake into protoplasts. // Theor. and Appl. Genet. -1991 - v. 81 -p. 434 - 437.
109. Leedel P.J., Zhany G., Cass D.D. Transient GFP expression in sperm cells and zygotes of Zea mays L. // Plant Physiology 1997 - v. 114 - is.l - p. 297-298.
110. Lefebvre D.D., Miki B.L., Laliberte J.F. Mammalian metallothionnein functions in plants. // Biotechnology 1987 - v. 16 - p. 4743 - 4751.107
111. Levesque H., Delepelaire P., Rauze P. et al. Common evolutionary origin of the central portions of the RiTL-DNA of the A. rhizogenes and the Ti-DNAs of A. tumefaciens. // Plant
112. Molecular Biology 1988 - v. 11 - p. 731-744.
113. Li L., Qu R., De Kochko A. et al. An improved rice transformation system using the biolistic method. // Plant Cell Reports 1993 - v. 12 - is. 5 - p. 250-255.
114. Li Z., Hayashimoto A., Murai N. A sulfonylurea herbicide resistance gene from Arabidopsis thaliana as a new selectable marker for production of fertile transgenic plants. // Plant Phisiol. 1992 - v. 100 - p. 662 - 668.
115. Lin W., Anuratha C.S., Datta K. et al. Genetic engineering of rice for resistance to sheath blight. //Ibid. 1995 - v. 13 - is. 7 - p. 686 - 691.
116. Ludwig S., Bowen В., Beach L., Wessler S. A regulatory gene as a novel visible marker for maize transformation. // Science 1990 - v. 247 - p. 449 - 450.
117. Luo Z.K., Wu R. A simple method for transformation of rice via the pollen tube pathway. // Plant Mol. Biol. Rep. - 1988 - v. 6 - p. 165 - 174.
118. Lupotto E., Reali A., Passera S., Chan M.T. Maize elite inbred lines are susceptible to Agrobacterium tumefaciens - mediated transformation. // Maydica - 1999 - v. 44 - is. 3 -p. 211 -218.
119. Ma S.W., Zhao D.L., Yin Z.O. et al. Transgenic plants expressing autoantigens fed to mice to induce oral immune tolerance. //Nature Medicine 1997 - v. 3 - is. 7 - p. 793 - 795.
120. Maiti T.B., Wagner G.J., Hunt A.G. Light inducible and tissue specific expression of a chimeric mouse metallothionein cDNA in tobacco. // Plant Sci. -1991 v. 76 - p. 99 - 107.
121. Marcotte W.R.J., Russell S.H., Quatrano R.S. Abscisic acid-responsive sequence from EM gene of wheat. // Plant Cell 1989 - v. 1 - p. 969-976.
122. Mason H.S., Ball J.M., Shi J.J. et al. Expression of norwalk virus capsid protein in transgenic tobacco and potato and its oral immunogenecity in mice. // Proc. Nat. Acad. Sci.USA. 1996 - v. 93 - p. 5335 - 5340.
123. Misra S., Gedamu L. Heavy metal tolerant transgenic Brassica napus L. and Nicotiana tabacum L. plants. // Theor. and Appl. Genet. 1989 - v. 78 - p. 161 -168.
124. Moller E.M., Bahnurg G., Sandermann H., Jeiger H.H. A simple and efficient protocol for isolation of high molecular weight DNA from filamentos fungi fruit bodies and infected plant tosscus. // Nucl. Acid. Res. 1992 - v. 20 -is. 22 - p. 6115-6116.
125. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tabacco tissue cultures. // Physiol. Plant -1962 v. 15 - is. 4 - p. 473-497.
126. Nagata Т., Okada K., Kawazu Т., Takebe I. Cauliflower mosaic virus 35S promoter directs S phase specific expressiom in plant cells. // Mol. Gen. Genet. 1987 - v. 207 -p.242-244.
127. Nayak P., Basu D., Das S. et al. Transgenic elit indica rice plants expressing CrylAc 8 -endotoxin of Bacillus thuringiensis are resistant against yellow stem borer. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1997 - v. 94 - p. 2111 - 2116.
128. Negrutiu I., Mouras L., Horth M., Jacobs M. Direct gene transfer to plants: Present development and some future prospectives. // Plant Physiol. Biochem. 1987 - v. 25 -p. 493 - 503.
129. Nehra N.S., Chibbar R.N., Leung N. et al. Self fertile transgenic wheat plants regenerated from isolated scutellar tissues following microprojectile bombardment with two distinct gene constructs. // Plant J. - 1994 - v. 5 - is. 2 - p. 285 - 297.
130. Nelson R.S., McCormic S.W., Delannay X. et al. Virus tolerance plant growth, and field performance of transgenic tomato plants, expressing coat protein from tomato mosaic virus. // Biotechnology 1988 - v. 6 - p. 403 - 409.
131. Nguyen L., Lucas W.J., Ding В., Zaitlin M. Viral RNA trafficking is inhibited in replicase mediated resistant transgenic tobacco plants. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996 - v. 93 -p. 12643 - 12647.
132. Pareddy D„ Petolino J., Skokut Т., Hopkins N., Miller M., Welter M., Smith K., Clayton D., Pescitelli S., Gould A. Maize transformation via helium blasting. // Maydica 1997 -v.42 - is. 2 - p. 143-154.
133. Pena A., Lorz H., Schell J. Transgenic rye plants obtained by injecting DNA into young floral tillers. // Nature 1987 - v. 325 - p. 274 - 276.1.l
134. Perlak F.G., Deaton R.W., Armstrong T.A. et al. Insect resistant cotton plants. // Biotechnology 1990 - v. 8 - p. 939 - 943.
135. Pescitelli S.M., Sukhapinda K. Stable transformation via electroporation into maize type-II callus and regeneration of fertile transgenic plants. // Plant Cell Reports 1995 - v. 14 -is.ll - p. 712-716.
136. Petersen S., Stummann В., Olesen P., Henningsen K. Structure and function of root-inducing (Ri) plasmids and their relation to tumour inducing (Ti) plasmids. // Physiol. Plantrum. - 1989 - v. 77 - p. 427-435.
137. Petolino J.E., Young S., Hopkins N., Sukhapinda K., Woosley A., Hayes C., Pelcher L. // Expression of murine adenosine deaminase (ADA) in transgenic maize. // Transgenic Research - 2000a - v. 9 - is.l - p. 1 - 9.
138. Petolino J.F., Hopkins N.L., Kosegi B.D., Skokut M. Whisker mediated transformation of embryogenic callus of maize. // Plant Cell Reports - 2000 - v. 19 - is. 8 - p. 781 - 786.
139. Petolino J.F., Hopkins N.L., Kosegi B.D., Skokut M. Whisker mediated transformation of embryogenic callus of maize. // Plant Cell Reports - 2000 - v. 19 - is. 8 - p. 781-786.
140. Potrikus I., Saul M.W., Petruska J. et al. Direct gene transfer to cells of a graminaceous monocot. // Ibid. 1985 - v. 199 - p. 183 - 188.
141. Potrykus I., Shillito R.D., Saul M.W., Paszkowski J. Direct gene transfer. State of the art and future potential. // Plant Mol. Biol. Rep. 1985a - v. 3 - p. 117 - 128.
142. Powell P.A., Stark D.M., Sanders P.R., Beachy R.N. Protection against tobacco mosaic virus in transgenicplants that express tobacoo mosaic virus antisense RNA. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1989 - v. 86 - p. 6949 - 6952.
143. Rao K.V., Rathore K.S., Hodges Т.К. Physical, chemical and physiological parameters for electroporation- mediated gene delivery into rice. // Transgenic Res.- 1995 v.4 - p.361-368.112
144. Rao A.M., Sree K.P., Kishor P.B.K. Enhanced plant regeneration in grain and sweet sorghum by asparagine, proline and cefotaxime // Plant Cell Rep. 1995 - v.15 - N 1-2 -p.72-75.
145. Rasmussen J.L., Kikkert J.R., Roy M.K., Sanford J.C. Biolistic transformation of tabacco and maize suspension cells using bacterial cells as microprojectiles. // Plant Cell Reports -1994-v. 13-is. 3-4-p. 212-217.
146. Rhodes C.A., Pierce D., Mettler I.J. et al. Genetically transformed maize plants from protoplasts. // Science 1988 - v. 240 - p. 204 - 207.
147. Roberts W.K., Selitrennikoff C.P. Isolation and portial characterizatiom of two antifungal proteins from barley. // Biochim. et biophys acta. 1986 - v. 880 - p. 161 -170.
148. Rooke L., Byrne D., Salgueiro S. Marker Gene expressio driven by the maize ubiquitin promoter in transgenic wheat.// Annals of Applied Biology. - 2000 - v. 136 - is.2 - p. 167-172.
149. Rosahl S., Schmidt R., Schell J., Willmitzer L. Isolation and characterisation of a gene from Solanum tuberosum encoding patatin the major storage protein of potato tubers. // Mol. and Gen. Genet. 1986 - v. 203 - p. 214 - 220.
150. Ryan C.A. Proteinase inhibitor gene families: Strategies for transformation to improve plant defenses against Herbivores. // BioEssays. 1989 - v. 10 - p. 20 - 24.
151. Saalbach I., Waddell D., Pickardt T. et al. Stable expression of the sulphur rich 2S albumin gene in transgenic Vicia narborensis increases the methionine content in seeds. // J. Plant Physiol. - 1995 - v. 145 - p. 674 - 681.113
152. Shen W.H., Escudero J., Schlappi M., Ramos C., Hohn В., Koukolikova Z.N. T-DNA transfer to maize cells: histochemical inves tigation of ^-glucuronidase activiti in maize tissues. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993 - v. 90 - p. 1488-1492.
153. Shimamoto K., Teda R., Izawa Т., Fujimoto H. Fertile transgenic rice plants regenerated from transformed protoplasts. // Nature 1989 - v. 338 - p. 274 - 277.
154. Simpson J., Timko M.P., Cashmore A.R. et al. Light inducible and tissue - specific expression of a chimaeric gene under control of 5'flanking sequence of a pea chlorophyll a/b - binding protein gene. // EMBO J. - 1985 - v. 4 - p. 2723 - 2729.
155. Singh N., Chawla H.S. Use of silicon carbide fibers for agrobacterium - mediated transformation in Wheat. // Current Science - 1999 - v. 76 - is. 11 - p. 1483 - 1485.
156. Singsit C., Adang M.J., Lynch R.E. et al. Expression of a Bacillus thuringiensis cryAc gene in transgenic peanut plants and its efficacy against lesser cornstalk borer. // Transgen. Res. 1997 - v. 6 - p. 169- 176.
157. Smith H.A., Swaneu S.L., Parks T.D. et al. Transgenic plant virus resistance mediated by untranslatable sense RNAs: Expression, regulation, and fate of nonessential RNAs. // Plant Cell.- 1994-v. 6-p. 1441 1453.
158. Somers D.A., Rines H.W., Gu W., Kaeppler H.F., Bushnell W.R. Fertile, transgenic oat plants. // Bio/Technol. 1992 - v. 10 - p. 1589 - 1594.115
159. Songstad D.D., Armstrong C.L., Petersen W.L., Hairston В., Hinchee-Maw Production of transgenic maize plants and progeny by bombardment of Hi II immature embryos. // In Vitro Cellular & Developmental Biology Plant - 1996 - v. 32 - is. 3 - p. 179-183.
160. Songstad D.D., Halaka F. G., De Boer D.L. et al. Transient expression of GUS and anthocyanin constructs in intact maize immature embryos following electroporation. // Plant Cell Tissue and Organ Cult. 1993 - v. 33 - is. 2 - p. 195 - 201.
161. Sorokin A.P., Ke X.Y., Chen D.F., Elliott M.C. Production of fertile transgenic wheat plants via tissue electroporation. // Plant Science 2000 - v. 156 - is. 2 - p. 227 - 233.
162. Southgate E.M., Davey M.R., Power J.B., Westcott R.J. A Comparison of methods for direct gene-transfer into maize (Zea mays L.) In Vitro Cellular & Developmental Biology Plant - 1998 - v. 34 - is. 3 - p. 218-224.
163. Spena A., Hain R., Ziervogel U., Saedler H., Shell J. Construction of a heat-inducible gene for plants. Demonstration of heat-inducible activity of the Drosophila hsp 70 promoter in plants. // Embo J. 1985 - v. 4 - p. 2739-2743.
164. Spencer T.M., Gordon-Kamm W.J., Paines R.J., Start W.G., Lemaux P.G. Bialaphos selection of stable transformants from maize cell cultures. // Theor. Appl. Genet 1990 -v.79-p. 625-631.
165. Spenser T.M., O'Brien J.V., Start W.G., Adams T.R., Gordon-Kamm W.J., Lemaux P.G. Segregation of transgenes in maize. // Plant Mol. Biology 1992 - v. 18 -p. 201-210.
166. Stachel S.E., Messens E., Montagu M.Van, Zambiyski P. Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens. // Nature - 1985 - v. 318 - p. 624 - 629.
167. Stewart C.N.J., Adang M.J., All J.N. et all. Genetic transformation,recovery, and characterization of fertile soybean transgenic for a synthetic Bacillus thuringiensis crylAc gene. // Ibid. 1996a - v. 112 - p. 121 -129.
168. Stewart C.N.J., Adang M.J., All J.N. et all. Insect control and dosage effects in transgenic canola containing a synthetic Bacillus thuringiensis crylAc gene. // Plant Physiol. 1996 -v. 112-p. 115-120.
169. Sukhapinda K., Kozuch M.E., Rubin-Wilson В., Ainley W.M., Merlo D.J. Transformation of maize (Zea mays L.) protoplasts and regeneration of haploid transgenic plants. // Plant Cell Reports 1993 - v. 13 - p. 63-68.
170. Tacke E., Salamini F., Rohde W. Genetic engineering of potato for broad spectrum protection agains virus infection. //Nature Biotechnol. - 1996 - v. 14 - p. 1597 - 1601.
171. Tada Y., Sakamoto M., Fujmura T. Efficient gene introduction into rice by electroporation and analysis of transgenic plants: use of electroporation buffer lacking chloride ions. // Theor. and Appl. Genet. 1990 - v. 80 - p. 475 - 480.
172. Tang K., Wu A., Yao J., Qi H., Lu X. Development mediated transformation and genetic analysis based selektion. // Acta Biotech. - 2000 - v. 20 - is. 2 - p. 175 - 183.
173. Tempe J., Goldman A. Occurence and biosynthesis opines. // Molec. Biol. Plant Tumours. -1982 New York: Acad. Press - p. 575 - 584.
174. Thompson J.A., Drayton P.R., Frame B.R., Wang K., Dunwell J.M. Maize transformation utilizing silicon carbide whiskers-a review. // Euphytica - 1995 - v. 85 - is. 1-3 - p. 75-80.
175. Toki S., Takamatsu S., Nojiri C., Ooba S., Anzai H., Iwata M., Christensen A.H., Quail P.H., Uchimiya H. Expression of a maize ubiquitin gene promoter bar chimeric gene in transgenic rice plants. // Plant Physiol. -1992 - v. 100 - p. 1503 - 1507.
176. Tomsett В., Salter M., Garoosi A. et al. A chemically inducible gene expression cassette for transgenic plants. // Abstr. 5th Intern. Congr. Plant Molecular Biology - 21 - 27 sept. -1997-Singapore-p. 318.
177. Topfer R., Prols M., Schell J., Steinbiss H.H. Transient gene expression in tobacco protoplasts: Comparison of the reporter gene systems for CAT, NPT II, and GUS. // Plant Cell Rep. 1988 - v.7 - p. 225 - 228.
178. Toriyama K., Arimoto Y., Uchimiya H., Hinata K. Transgenic rice plants after direct gene transfer into protoplasts. // Biotechnology 1988 - v. 6 - p. 1072 - 1074.
179. Tumer N.E., O'Connel K.M., Nelson R.S., Sanders P.R., Beachy R.N., Fraley R.T., Shaw D.M. Expression of alfalfa mosaic virus coat protein confers cross protection in transgenic tobacco and tomato plants. // EMBO J 1987 - v. 6 - p. 1181 -1188.
180. Uknes S., Dincher S., Friedrich L. et al. Regulation of pathogenesisrelated protein la gene expression in tobacco. // Plant Cell - 1993 - v. 5 - p. 159- 169.
181. Vacek M., Reynaerts A., Hofte H., Jansens S., Beuckeller M., Dean C., Zabcan M., Montagu M. van, Leemans J. Transgenic plants protected from insect attack. // Nature -1987-v. 328- p. 33 -37.
182. Vain P., Keen N., Nurillo J. et al. Development of the particle inflow gun. // Plant Cell Tissue and Organ Cult. 1993 - v. 33 - is. 3 - p. 237 - 246.
183. Vain P., Mc Mullen M.D., Finer J.J. Osmotic treatment enhances particle bombardment-mediated transient and stable transformation of maize. // Plant Cell Reports 1993a - v. 12 -p. 84-88.118
184. Van Larebeke п., Engler G., Holsters M. et al. Large plasmid in A. tumefaciens essential for crown gall inducing ability. // Nature -1974 - v. 252 - p. 169-170.
185. Vasil I.K. Molecular improvement of cereals. // Plant Mol. Biology 1994 - v. 25 -p. 925 - 937.
186. Vasil V., Castillo A.M., Fromm M.E., Vasil I.K. Herbicide resistant fertile transgenic wheat plants obtained by microprojectile bombardment of regenerable embryogenic callus. // Bio/technology 1992 - v. 10 - p. 667 - 674.
187. Vasil V., Srivastava V., Castillo A.M., Fromm M.E., Vasil I.K. Rapid production of transgenic wheat plants by direct bombardment of cultured immature embryos. // Bio/ technology 1993 - v. 11 - p. 1553 - 1558.
188. Villemont E., Dubois F., Sangwan R.S. et al. Role of host cell cycle in the Agrobacterium mediated genetic transformation of Petunia: evidence of an S - phase control mechnism for T - DNA transfer. // Planta - 1997 - v. 201 - p. 160 - 172.
189. Wan Y., Widholm J.M., Lemaux P.G. Type I callus as a bombardment target for generating fertile transgenic maize (Zea mays L.). // Plant 1995 - v. 196 - p. 7-14.
190. Wang A.S., Evans R.A., Altendorf P.R., Hanten J.A., Doyle M.C., Rosichan J.L. A mannose selection system for production of fertile transgenic maize plants from protoplasts. // Plant Cell Reports 2000 - v. 19 - is. 7 - p. 654 - 660.
191. Wang G., Castiglione S., Chen Y. et al. Poplar (Populus nigra L.) plants transformed with a Bacillus thuringiensis toxin gene: incecticidal activity and genomic analysis. // Transgenic Res. 1996-v. 5-p. 289-301.
192. Wang Y.C., Klein T.M., Fromm M. et al. Transient expression of foreign genes in rice, wheat and soybean cells following particle bombardment. // Plant Mol. Biol. 1988 - v. 11 -p. 433 - 439.
193. Weeks I.T., Anderson O.D., Blechl A.E. Rapid prodyction of multiple independent lines of fertile transgenic wheat (Triticum aestivum). // Plant Physiol. 1993 - v. 102 -p. 1077-1084.
194. Werr W., Lorz H. Tranzient gene expression in Gramineae cell line. // Mol. and Gen. Genet. 1986 - v. 202 - p. 472 - 475.
195. Wiberg E., Banas A., Stymne S. Fatty acid distribution and lipid metabolismm in developing seeds of laurate producing rape (Brassica napus L.). // Planta - 1997 - v. 203 -p. 341 - 348.
196. Wordragen M.F. van, Honee G., Dons H.J.M. Insect resistance chrysanthemum calluses by introduction of a Bacillus thuringiensis crystal protein gene. // Transgenic Res. 1993 -v.2 - p. 170- 180.
197. Yepes L.M., Aldwinckle H.S. Factors that affectleaf regeneration efficiency in apple, and effect of antibiotics in morphogenesis // Plant Cell Tissue Organ Culture 1994 - v. 37 -N 3 - p.257-269.
198. Yun D.J., Hashimoto Т., Yamada Y. Metabolic engineering of medicinal plants: Transgenic Atropa belladonna with an improved alkaloid composition. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992 - v. 89 - p. 11799- 11803.120
199. Yusibov V., Steck Т., Gupta V. et al. Transfer of T-DNA from A. tumefaciens and targeting to the nucleus of tobacco cells. // Abstracts 4th Intern. Congress of Plant Molecular Biology Amsterdam, June 19-24 1994 - N 1669.
200. Zhang H.M., Yang H., Rech E.L. et al. Transgenic rice plants produced by electroporation mediated plasmid uptake into protoplasts. // Plant Cell Rep. 1988 - v. 7 - p. 379 - 383.
201. Zha Zhang W., Mc Elroy D., Wu R. Analysis of rice Actl 5' region activity in transgenic rice plants. // Plant Cell -1991 v. 3 - p. 1155 - 1165.
202. Zhou F.Y., Wang G.Y., Xie Y.J., Cui H.Z., Guo S.D., Dai J.R. Establishment of a genetic- transformation system for maize inbred P9 10. // Chinese Science Bulletin - 1999 - v. 44 is.7 p. 624 - 627!
-
Данилова, Светлана Алексеевна
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2001
-
ВАК 03.00.23
- Анализ переноса агробактериальной Т-ДНК в генеративные клетки кукурузы
- Разработка эффективной системы генетической трансформации льна-долгунца (Linum usitatissimum L. ) и дикорастущих видов рода Linum
- Изучение регенерации и создание векторной конструкции для генетической трансформации рапса (Brassica napus L.)
- Структура и функции белка VirE2 в переносе оцДНК в эукариотические клетки
- Изучение исходного материала с целью создания сортов и гибридов кукурузы для Юго-Востока Европейской части России
