Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Оптимальные тест-системы для количественного определения и детекции мутаций вируса гепатита В

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Оптимальные тест-системы для количественного определения и детекции мутаций вируса гепатита В"

На правах рукописи

Пичковская Виктория Анатольевна

Оптимальные тест-системы для количественного определения и детекции мутаций вируса гепатита В

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2004

Работа выполнена в Государственном учреждении Гематологический научный центр Российской Академии медицинских наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук

СУДАРИКОВ Андрей Борисович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

ЛУКИНА Елена Алексеевна

член-корреспондент РАЕН, доктор медицинских

наук, профессор

МИХАЙЛОВ Михаил Иванович

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится «_ 2004 г., в часов на заседании

диссертационного совета Д 001.042.02 в Гематологическом научном центре РАМН (125167, г.Москва, Новозыковский пр-д, д. 4а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Гематологического научного центра РАМН.

Автореферат разослан «_» 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Реук В. Д.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации. Вирусный гепатит В занимает одно из первых мест в инфекционной патологии человека, поэтому возбудитель данного заболевания - ДНК-содержащий гепатотропный вирус гепатита В является предметом пристального внимания и всестороннего изучения. В настоящее время показано, что в репликации этого вируса присутствует стадия обратной транскрипции РНК-прегенома. Обратная транскриптаза, осуществляющая этот процесс, лишена 3'-+5' корректирующей функции, что определяет вариабельность вирусного генома. В сочетании с высокой. репликативной - активностью вируса гепатита В это приводит к повышению вероятности ошибки считывания РНК-матрицы и появлению мутантных штаммов. В свою очередь, мутации вирусного генома могут изменять профиль серологических маркеров, приводить к снижению эффективности стандартных схем противовирусной терапии и т.д. Отсюда возникла необходимость в комплексной диагностике вирусного гепатита В, включающей количественную оценку вируса в крови больного и анализ мутаций вирусного генома. С этой целью сегодня применяются различные методы генодиагностики, в частности метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Наиболее распространенным методом количественной оценки вируса гепатита В является конкурентная ПЦР, основанная на коамплификации ДНК патогена и количественно охарактеризованного внутреннего стандарта. Создание подобного внутреннего стандарта составляет определенную сложность, что ограничивает - применение количественных тест-систем, основанных на методе конкурентной ПЦР, в клинической диагностике.

В ПЦР-диагностике мутаций генома вируса гепатита В приоритетным направлением является детекция клинически значимых YMDD- и ргесоге-мутаций, ассоциирующихся со снижением/отсутствием эффективности противовирусной терапии нуклеозидными аналогами или препаратами интерферона. Кроме того, ргесоге-мутация определяет отсутствие основного маркера активной репликации вируса - НВе-антигена. YMDD- и ргесоге- мутации вызваны однонуклеотидными заменами в ДНК вируса гепатита.В. Поэтому для их выявления применяются методы, предназначенные для детекции SNPs (single nucleotide polymorphisms). В большинстве случаев с этой целью используют методы секвенирования. и определения длин рестрикционных фрагментов. Но данные методики обладают рядом недостатков: они технически сложны в исполнении и с их помощью довольно трудно оценить долю мутантных штаммов в общей вирусной популяции. Тем не

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА

менее, такая информация необходима для выработки эффективной тактики лечения больных вирусным гепатитом В.

Цель работы. Создать оптимальные диагностические тест-системы для количественного определения и детекции мутаций вируса гепатита В.

Задачи исследования.

1. Разработать методически простую технологию конструирования внутреннего стандарта для количественного определения ДНК патогенов методом конкурентной ПЦР на примере вируса гепатита В.

2. Разработать диагностическую тест-систему для количественного определения ДНК вируса гепатита В методом конкурентной ПЦР, в которой будет использоваться полученный внутренний стандарт.

3. Найти оптимальный метод для выявления дикого и УМРР/ргесоге-мутантных штаммов вируса гепатита В, позволяющий оценивать долю мутантных штаммов в общей вирусной популяции.

4. Апробировать разработанные тест-системы для количественного определения и детекции мутаций вируса гепатита В на сыворотках больных вирусным гепатитом В.

Научная новизна. Впервые предлагается универсальный и методически простой способ конструирования внутреннего стандарта для одностадийной конкурентной ПЦР. Доказывается, что метод аллель-специфической ПЦР для выявления мутаций в вирусном геноме применим в диапазоне концентраций ДНК от 104 до 107 геном/мл. Причем проведение аллель-специфической ПЦР в указанных концентрационных пределах позволяет оценивать долю мутантных штаммов в общей вирусной популяции.

Практическое значение работы. Предложенная технология конструирования. внутреннего стандарта упрощает разработку тест-систем для определения количества ДНК вируса гепатита В, основанных на методе конкурентной ПЦР. Применение конкурентной и аллель-специфической ПЦР для оценки количества и детекции мутаций в геноме вируса позволяет контролировать эффективность терапии больных вирусным гепатитом В и корректировать протокол лечения в случае выявления мутантных штаммов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработана методически простая технология конструирования внутреннего стандарта для конкурентной ПЦР, которая применена при создании тест-системы для количественного определения ДНК вируса гепатита В.

2. Показано, что аллель-специфическая ПЦР для выявления мутаций в геноме вируса гепатита В применима в диапазоне концентраций ДНК от 104 до 107 геном/мл.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на конгрессе «Человек и лекарство» (2001 г, Москва), I Всероссийском съезде гематологов (2002 г, Москва), научно-практическом симпозиуме Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении", проводимом в рамках международной научно-практической конференции "Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины" (2002 г, Москва).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ, в том числе получен патент на изобретение № 2194761, Государственный реестр изобретений РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 86 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 21 рисунок и 2 таблицы. Список цитируемой литературы включает 117 наименований. Работа выполнена на базе лаборатории молекулярной гематологии ГНЦ РАМН (зав. - к.б.н. Судариков А.Б.) За помощь и поддержку в проведении работы выражаем искреннюю благодарность в.н.с. лаборатории молекулярной гематологии ГНЦ РАМН к.б.н. Февралевой И.С., зав отд. патологии печени клиники нефрологии, внутренних и профессиональных заболеваний им. Е.М. Тареева д.м.н. проф. Крель П.Е., ст.н.с. ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ к.б.н. Гущину А.В.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования.

Сыворотки. В исследовании использовали 32 сыворотки больных вирусным гепатитом В, проходящих лечение в Гематологическом научном центре РАМН по поводу гемобластозов. Сыворотки, заведомо содержащие вирус гепатита В с УМРР-мутацией (по данным прямого определения нуклеотидной последовательности) были любезно предоставлены к.б.н. А.Е. Гущиным (ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ).

Олигонуклеотиды. Для выявления ДНК вируса гепатита В использовали 5'-СТТСОСТТСАССаСТОС-З'-прямой и 3'-САСТТССТСССТССААСТССС-5'-обратный

праймеры, фланкирующие участок 1458-1578 нуклеотидной последовательности (н.п.) ДНК вируса гепатита В.

Для выявления УМРР-мутации использовали праймеры, фланкирующие участок 720-998 н.п. ДНК вируса гепатита В. Причем прямые аллель-специфические праймеры (отличающиеся последним нуклеотидом на

были подобраны к позиции 743 н.п. так, чтобы выявить возможные замены нуклеотидов в триплете АТ<3 - локусе УМРР-мутации (т.е. выяляется триплет СТв в случае УУРР-варианта мутации и триплет АТТ в случае У1РР-варианта мутации): утсЮ»: 5'-ТСАСАААСССАААСТСААТАТАС-3' утЬА.: б'-ТСАСАААССОАААСТСААТАТ-З'

ymdV,: 5'-ТСАСАААСССАААСТСААТАС-3'

утсИа: б'-ТСАСАААСССАААСТСААТАТАА-З' Общий обратный праймер угтк!СОМм - б'САТГССАААЗТАТСТСААССЗ'

Для выявления ргесоге-мутации использовались праймеры, фланкирующие участок 1880-2084 н.п. ДНК вируса гепатита В. Прямые аллель-специфические праймеры pгecWCl и ргесМТ» были подобраны к позиции 1896 н.п. так, чтобы выявить возможные замены нуклеотидов в триплете ТГО - локусе ргесоге-мутации бцаеА:

ргесУУС, 5'-АСССААСССАСССАААС-3' -выявляет дикий штамм

ргесМТ, 5'-АСССААСССАСССАААТ-3' -штамм с мутацией вцавА

Общий обратный праймер ргесСОМи Б'-бСАААОААТТССТТСССТСА-З'.

Все представленные выше праймеры были синтезированы фирмой «Синтол», Россия.

-выявляют: УМО£5-вариант (дикий штамм)

- УУРО-вариант (штамм с мутацией)

- УЮв-вариант (штамм с мутацией)

Подготовка образцов сывороток. Исследуемую сыворотку разводили в соотношении 1:1 в буфере для выделения ДНК (изотонический раствор NaCI, содержащий 0,05% NP40 и 20% DMSO). Смесь прогревали в течение 10 минут при 95° С, центрифугировали, супернатант отбирали и использовали в полимеразной цепнойреакции.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Для выявления ДНК вируса гепатита В готовили реакционную смесь объемом 25 мкл следующего состава: 5 мкл полученного супернатанта; по 0,1 пмоль прямого и обратного праймера (фланкирующих участок 1458-1578 н.п. ДНК вируса гепатита В); смесь для ПЦР (10 мМ Tris-HCI. рН 8.3, 50 мМ KCI, 2,5 мМ MgCfe, 4% формамид, дезоксирибонуклеотидтрифосфаты по 0,2 мМ каждого («Бион», Россия), 1 единица Taq-ДНК полимеразы («Синтол», Россия); деионизованная вода). Для получения внутреннего стандарта в качестве матрицы использовали 100 нг ДНК, выделенной из мононуклеарных клеток человека. Реакцию амплификации проводили в программируемом термостате Perkin-Elmer Cetus. Температурный режим ПЦР: для выявления ДНК вируса гепатита В: 35 циклов при 94°С - 15 сек., 5б°С - 15 сек., 72°С -1 5 сек. с последующим инкубированием при 72°С в течение 10 мин.; для получения внутреннего стандарта: 5 циклов при 94°С -1 5 сек., 37°С -1 5 сек., 72°С - 15 сек., затем 30 циклов при 94°С - 15 сек., 56°С - 15 сек., 72°С - 15 сек. с последующим инкубированием при 72°С в течение 10 мин.

При выявлении YMDD и ргесоге-мутаций для каждого исследуемого образца готовили 6 реакционных проб объемом 25 мкл каждая, содержащие по 5 мкл супернатанта; 1 мкМ одного из аллель-специфических праймеров; по 1 мкМ обратных праймеров и смесь для ПЦР (см. выше). Реакцию амплификации проводили в программируемом термостате Perkin-Elmer Cetus в следующих условиях: 35 циклов при 94°С -1 5 сек., 54°С -1 5 сек., 72°С -1 5 сек. с последующим инкубированием при 72°С в течение 10 мин.

Продукты реакции анализировали методом электрофореза в 2% агарозном

геле.

Клонирование внутреннего стандарта. Выбранный в качестве внутреннего стандарта для конкурентной ПЦР, выявляющей ДНК вируса гепатита В, амплификационный ДНК-фрагмент был лигирован в плазмидный вектор pGem-T Easy (Promega) и клонирован в клетках Е. coli (штамм ТВ1). Селекция клонов с

5

лигированным фрагментом проводилась на среде LB + 2% агар + x-GAL + IPTG + ампициллин (в вектор встроен ген устойчивости к ампициллину). Белые колонии проверяли на наличие вставки методом ПЦР. Секвенирование полученной плазмидной ДНК проводилось в институте молекулярной биологии им. Энгельгарта. Все манипуляции по очистке ДНК-амплификата, его лигированию в плазмидный вектор, клонированию и выделению плазмидной ДНК со вставкой осуществляли по стандартным методикам, описанным в Current Protocols In Molecular Biology (on CD) и инструкции, прилагаемой к коммерческому набору «pGem®-T Easy Vector. System 1» (Promega).

Концентрация плазмидной ДНК с внутренним стандартом определялась спектрофотометрическим методом.

Конкурентная ПЦР. Для количественного определения ДНК вируса гепатита В брали сыворотку крови положительную по ДНК данного вируса в качественном ПЦР-анализе (см. п. «ПЦР для выявления ДНК вируса гепатита В»). Готовили серию десятикратных разведений вектора, содержащего внутренний стандарт в концентрации от 103 до 1010 геном/мл, в буфере для выделения ДНК. Пробы для количественного ПЦР были приготовлены по следующему протоколу: к 2,5 мкл сыворотки добаляли по 2,5 мкл каждого из соответствующих приготовленных разведений. Затем пробы прогревали при 95°С в течение 10 мин, после чего в каждую добавляли по 20 мкл смеси для ПЦР и праймеры, фланкирующие участок 1458-1578 н.п. ДНК вируса гепатита В, и проводили амплификацию (см. п. «ПЦР для выявления ДНК вируса гепатита В»). Продукты реакции анализировали методом электрофореза в 2% агарозном геле.

Результаты и обсуждение. Обзор информации о методах генодиагностики вирусного гепатита В показал, что в настоящее время существует необходимость в создании методически простых диагностических тест-систем для количественной оценки и идентификации клинически значимых мутаций ДНК вируса гепатита В, с помощью которых можно контролировать эффективность проводимой противовирусной терапии и корректировать тактику лечения в случае выявления мутантных штаммов вируса.

Большинство существующих методов количественной оценки вируса в крови или сыворотке реализуют принцип конкурентной ПЦР, основанной на коамплификации выявляемой ДНК и внутреннего стандарта. Внутренний стандарт

представляет собой фрагмент ДНК, имеющий длину, отличную от длины выбранного для амплификации участка выявляемой ДНК, но общие с ним районы, связывающие праймеры в ПЦР. Такой внутренний стандарт в ПЦР выполняет две основные функции. Во-первых, позволяет избегать получения ложноотрицательных результатов реакции. Во-вторых, позволяет определять концентрацию выявляемой ДНК, т.к. при внесении в пробу он конкурирует с выявляемой ДНК за связывание с праймерами и амплификацию, и равные количества ПЦР-продуктов амплифицируются в том случае, если начальные концентрации выявляемой ДНК и внутреннего стандарта равны. Поскольку в пробу вносится известное количество внутреннего стандарта, то можно оценить количество выявляемой ДНК.

Одна из задач, поставленных в данной работе, состояла в том, чтобы разработать наименее трудоемкую технологию конструирования внутреннего стандарта для конкурентной ПЦР. В ходе ее решения руководствовались тем, что при температуре, существенно меньшей, чем оптимальная температура отжига праймеров в ПЦР, специфичность взаимодействия "праймер-матрица" снижается. В этих условиях в ПЦР с произвольной ДНК и праймерами к определенному участку выявляемой ДНК нарабатывается множество неспецифических амплификационных фрагментов, т.к. для инициации процесса ДНК-полимеризации достаточно комплементарности нескольких оснований в последовательности ДНК-матрицы и нескольких нуклеотидов, прилегающих к З'-концу используемых праймеров. Далее в ходе реакции при оптимальной температуре отжига праймеров нарабатываются ДНК-фрагменты, имеющие последовательности, комплементарные использованным праймерам и, следовательно, коамплифицирующиеся с выявляемой ДНК. Следует отметить, что данная методика применима для получения внутреннего стандарта только для одностадийной ПЦР, когда не требуется наличия специфических участков внутри амплификационного фрагмента, использующегося в качестве внутреннего стандарта. Предложенная нами технология запатентована в Российском агенстве по патентам и товарным знакам (патент на изобретение № 2194761, Государственный реестр изобретений РФ).

Методику, представленную выше, применили при создании внутреннего стандарта, амплифицирующегося с праймерами для выявления ДНК вируса гепатита В. В качестве исходной матрицы была взята ДНК, выделенная из мононуклеарных клеток человека. Матрицу проамплифицировали с праймерами, фланкирующими один из участков нуклеотидной последовательности ДНК вируса гепатита В. Причем условия амплификации были следующими: в первых 5 циклах

реакции температура отжига была на 19°С ниже температуры, оптимальной для данной пары праймеров, а в последующих 30 циклах отжиг осуществлялся при оптимальной температуре (см. п. *ПЦРдля получения внутреннего стандарта»). В результате получили смесь фрагментов ДНК различной длины, имеющих фланкирующие последовательности, комплементарные праймерам, выявляющим ДНК вируса гепатита В, каждый из которых может служить внутренним стандартом в конкурентной ПЦР для выявления данного патогена (Рис. 1).

* -mw. ' use.'

-»«Г ' ~

<-500 п.н.

<-120 п.н.

Рис. 1. Внутренний стандарт для конкурентной ПЦР, выявляющей ДНК вируса гепатита В.

Дорожки: 1 - амплификация ДНК мононуклеаров с праймерами, выявляющими ДНК вируса гепатита В; 2 - отрицательный контроль (амплификация без ДНК мононуклеарных клеток и вируса гепатита В); 3 - амплификация ДНК вируса гепатита В; 4 - маркер молекулярного веса (1kb Ladder, Promega).

Далее выбрали фрагмент длиной 500 п.н., последовательность которого определили прямым секвенированием. Последовательность фрагмента представлена на Рис. 2.

5'СТТСССТТСАССССТСС1ддсасддсдаддадад1сда1с(саасасда1сда1асдс{дсааассдсдс а1масд)ассдсддсд1ссасд«сдссад(даШс1д1аас1с«ссдддсдсадШааШдсдИсссааса1даа дд1садсд(дсШдсддсддсадаасд1асаайдсдссадасса1сН«ссасдсдсддс«с1дссда(ддаа1дПд а!аа1сйд«дсШдсс^(^асадс1дсддсада1сас«ассдддааса1сааса1асддсс1дс<Лдад1даПда адсадса1а1сддаадса1сПсяа1сассассддсддса1ааса1дддсаШссдд1аадд(да1сааадссЯасс1! сасдд«асдсдссассада(сд«ааадд1дсадасдааассд(аасссдса(сддаадсса1садсадтс1да01 СААССАСССАССТТСАССС 3'

Рис. 2. Нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК, выбранного в качестве внутреннего стандарта.

Заглавными буквами обозначены участки связывания с праймерами, выявляющими ДНК вируса гепатита В.

В базе данных вепВапк провели сравнительный анализ полученной последовательности, в ходе которого было установлено, что это участок ДНК Е.соН с

фланкирующими последовательностями, комплементарными соответствующим праймерам для выявления ДНК вируса гепатита В. Причина того, что данный фрагмент является участком ДНК E.coli, а не принадлежит участку ДНК, использовавшейся в качестве матрицы в ПЦР, возможно, объясняется следующим образом. В реакции амплификации использовался препарат рекомбинантой ДНК-полимеразы Taq, при получении которого применялись клетки E.coli, трансформированные плазмидным вектором, в состав которого был введен ген ДНК-полимеразы Taq. Поэтому в растворе мог содержаться геномный материал клеток-продуцентов данного фермента, т.е. ДНК клеток E.coli. Однако, как видно на электрофореграмме, представленной на Рис. 1, при сравнении ПЦР-продуктов на дорожках 1 и 2, кроме фрагментов, принадлежащих ДНК E.coli, в смеси все же присутствуют фрагменты ДНК мононуклеарных клеток. Отсюда следует, что при получении внутреннего стандарта для конкурентной ПЦР предложенным нами методом можно использовать несколько ДНК-матриц.

После определения нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК, выбранного в качестве внутреннего стандарта, и обнаружения в его составе участков, комплементарных праймерам для выявления ДНК вируса гепатита В, для получения необходимого количества - внутреннего стандарта данный • фрагмент лигировали в плазмиду и клонировали в клетках Е. coli. Соответствующая плазмида выделена из Е. coli, очищена и растворена в воде, и после подсчета количества копий плазмидной ДНК в миллилитре водного раствора такой раствор использовался в качестве внутреннего стандарта для конкурентной ПЦР, выявляющей ДНК вируса гепатита В. Эффективность коамплификации внутреннего стандарта и ДНК вируса гепатита В проверялась в конкурентной ПЦР с плазмидной ДНК, содержащей участок 1458-1578 н.п. ДНК вируса гепатита В. Результаты опыта представлены на Рис. 3.

После определения эффективности коамплификации внутренний стандарт использовался в конкурентной ПЦР для количественного определения ДНК вируса гепатита В в сыворотке крови. Для этого готовили последовательные разведения раствора, содержащего внутренний стандарт в известной концентрации, в которые добавляли один и тот же объем исследуемой сыворотки крови. С этой смесью проводили ПЦР. В реакции, согласно принципу конкурентной ПЦР, равные количества продуктов должны были амплифицироваться в том случае, если начальные концентрации внутреннего стандарта и выявляемой ДНК равны.

Рис. 3. Эффективность коамплификации внутреннего стандарта и ДНК вируса гепатита В.

Дорожки: 1-5 - плазмидная ДНК, содержащая участок 1458-1578 н.п. ДНК вируса гепатита В (10® (а) и 107 (б) геном/мл), 120 п.н. + внутренний стандарт (10+10 геном/мл), 50о п.н.

Поэтому при визуализации ПЦР-продуктов в агарозном геле выявляли пробу, в которой ампликон, соответствующий внутреннему стандарту в определенной концентрации, и ампликон, соответствующий ДНК вируса гепатита В, имеют сопоставимую интенсивность флуоресценции в УФ-лучах. Так в случае, показанном на Рис. 4, концентрация ДНК вируса гепатита В составила 10' геном-эквивалент/мл.

Рис. 4. Определение количества ДНК вируса гепатита В в конкурентной ПЦР.

Дорожки: 1 - сыворотка, содержащая ДНК вируса гепатита В, 120 п.н.; 2 - 6 -сыворотка с ДНК вируса гепатита В, 120 п.н. + внутренний стандарт (10+10 геном/мл), 500 п.н.; 7- маркер молекулярного веса (1 kb Ladder, Promega).

Таким образом, на базе полученного внутреннего стандарта создали in house тест-систему для количественного определения ДНК вируса гепатита В в биологических жидкостях.

Кроме количественного определения ДНК вируса гепатита В, как уже упоминалось ранее, в ходе лечения возникает необходимость выявления мутационных изменений в вирусном геноме, в частности выявления клинически

значимых YMDD- и precore- мутаций. Эти мутации вызваны однонуклеотидными заменами в ДНК вируса гепатита В, поэтому для их выявления применяются методы, предназначенные для детекции SNPs (single nucleotide polymorphisms). Анализ литературных данных показал, что кроме прямого секвенирования и определения длин рестрикционных фрагментов для детекции однонуклеотидных замен можно использовать более простой метод аллель-специфической ПЦР.

Принцип данного метода состоит в том, что в ПЦР фермент ДНК-полимераза Tag осуществляет процесс элонгации ДНК только в случае строгой комплементарности З'-конца праймера соответствующему участку ДНК-матрицы. Таким образом, замена нуклеотида в ДНК-матрице может быть обнаружена по отсутствию амплификации с праймером, З'-конец которого приходится точно на место мутации. Однако амплификация может быть осуществлена с измененным праймером, З'-конец которого комплементарен мутантному нуклеотиду.

Исходя из этого были подобраны праймеры, способные выявлять дикий тип вируса и все возможные замены нуклеотидов ДНК вируса гепатита В в случае YMDD-мутации и рЛЗСОЛе-мутЭЦИИ G189SA (см. п. «Олигонуклеотиды»). С праймерами и ДНК вируса гепатита В проводили аллель-специфическую ПЦР, результаты которой представлены на Рис. 5 и Рис. 6. В данном опыте использовались сыворотки, заведомо содержащие вирус гепатита В с YMDD- и ргесоге-мутацией (по данным прямого определения нуклеотидной последовательности).

Рис. 5. Результаты аллель-специфической ПЦР по выявлению дикого и YMDD-мутантных штаммов вируса гепатита В.

Длина амплификата 278 п.н.

Дорожки: 1-4 - результат амплификации с аллель- - специфическими праймерами утЙС1, утЙАа, ут(1У„ ут<Я5,соответственно; 5 - маркер молекулярного веса (500; 278 и 120 п.н.)

Так, на электрофореграмме, представленной на Рис. 5, видно, что в случае а) при использовании всех четырех пар праймеров ПЦР-продукты образуются только в образцах, содержащих утСА» и ymdG,, которые выявляют дикий тип вируса, в то

время как в случае 6) срабатывают праймеры утс1Аз И утс11», выявляющие мутантный штамм вируса (YIDD-вариант).

На электрофорефамме Рис. 6 видно, что в случае а) ПЦР-продукты регистрируются в образце, содержащем precWC$-ПpaЙмep, выявляющий дикий штамм вируса, а в случае б) - регистрируются в образце, где присутствует праймер ргесМТ , выявляющий мутантный штамм вируса СцмА-

Ч— 500 пн Ч— 278 п н ,4— 134 пн

б)[

204 пн —>

1

Рис. 6. Результаты аллель-специфической ПЦР по выявлению дикого и ргесоге-мутантных штаммов вируса гепатита В.

Длина амплификата 204 п.н.

Дорожки: 1,2- Результат амплификации с аллель- - специфическими precWC, и ргесМТ, праймерами,соответственно; 5 - маркер молекулярного веса.

В ходе экспериментов по выявлению YMDD- и ргесоге-мутантных штаммов вируса гепатита В методом аллель-специфической ПЦР было установлено, что для получения адекватных результатов, концентрация вируса в исследуемом образце не должна превышать 107 геном/мл. Если концентрация вируса в сыворотке превышает 107 геном/мл, то при проведении ПЦР с аллель-специфическими праймерами образуются ПЦР-продукты, соответствующие как дикому, так и всем мутантным штаммам вируса (Рис. 7 б). При разведении таких сывороток до концентрации 107 геном/мл и менее определяли в этих образцах наличие только дикого или сочетание дикого и одной из мутантных форм вируса (Рис. 7 а).

Рис. 7. Результаты аллель-специфической ПЦР по выявлению дикого и УМЭЭ-мутантных штаммов вируса гепатита В в сыворотках с разной концентрацией ДНК.

а) - концентрация ДНК вируса гепатита В 107 геном-эквивалент/мл; б) -концентрация ДНК вируса гепатита В 10® геном-эквивалент/мл. Длина амплификата 278 п.н.

Дорожки: 14 - результат амплификации с аллель- - специфическими праймерами утсЮ,, угг^А,, утйУ,, утсЛ,,соответственно.

Данная ситуация может быть вызвана появлением неспецифических ПЦР-продуктов в реакции с высокой концентрацией ДНК-матрицы. Так, в работах, посвященных исследованию кинетических характеристик аллель-специфической ПЦР, было показано, что в реакции амплификации возможно связывание аллель-специфических праймеров с некомплементарным нуклеотидом матрицы (например в:Д, А:А, Т:Т и т.д.) и элонгация цепей ДНК. Однако количество ПЦР-продуктов в этом случае будет значительно меньше, чем при связывании праймеров с комплементарным нуклеотидом матрицы. Отсюда следует, что при увеличении концентрации ДНК-матрицы соответственно возрастет количество ПЦР-продуктов, образующихся при правильном и ошибочном отжиге аллель-специфических праймеров. Поэтому для установления концентрационных пределов для матрицы в аллель-специфической ПЦР был проведен следующий эксперимент. В сыворотку, не содержащую ДНК вируса гепатита В, добавляли амплификационный фрагмент, полученный в ПЦР с ушСМв-праймером и ДНК дикого штамма вируса (имеющий в своем составе последовательность АТС, что соответствует дикому штамму вируса) в концентрации от 10' до 10е копий ДНК. Затем с сывороткой, содержащей амплификационный фрагмент в соответствующей концентрации, и аллель-

специфическими праймерами утйА^ утсЮ3, утсЛз и ут(1\/,, проводили ПЦР. Результаты представлены на Рис. 8.

1 2 3 4 5

Рис. 8 Определение пределов чувствительности аллель-специфической ПЦР для выявления дикого и мутантных штаммов вируса.

Длина амллификата 278 п н.

Дорожки: 1 - маркер молекулярного веса (500/278; 200; 134 п н); 2 - 5 - результат амплификации с аллель- - специфическими праймерами ут(]6], ут<1Аа, ут<1\/,, ут<И(1 соответственно.

Поскольку в качестве матрицы в ПЦР использовался амплификационный фрагмент, соответствующий дикому штамму вируса, то продукты аллель-специфической ПЦР должны были регистрироваться только в пробах, где присутствовали праймеры утбА, и утсЮ,, выявляющие данный штамм.

Однако, как видно на электрофореграммах, представленных на Рис. 8, если начальная концентрация ДНК была больше 107 копий, то регистрировались ПЦР-продукты в пробах, где присутствовали праймеры, выявляющие как дикий, так и мутантный штамм вируса. Таким образом, было показано, что предельная концентрация ДНК вируса в аллель-специфической ПЦР - 107 копий. На электрофореграммах также видно, что ПЦР-продукты регистрируются в пробах, где

начальная концентрация ДНК составляла от 104 копий, следовательно, нижний предел чувствительности метода -1 04 копий ДНК.

Так было доказано, что в случае сыворотки с высокой вирусной нагрузкой (более 107 геном/мл) обнаружение ПЦР-лродуктов, соответствующих наличию вирусов всех форм, связано с появлением неспецифических ПЦР-продуктов.

Но существует еще одна причина такой ситуации. По данным литературы известно, что мутантные штаммы вируса в минорных количествах почти всегда присутствуют в вирусной популяции. Значит проведение аллель-специфической ПЦР с образцами, концентрация ДНК вируса в которых более 107 геном/мл, может выявлять эти штаммы в количестве 0,1 % и менее от общей вирусной популяции. Отсюда следует, что разведение сыворотки до концентрации вирусной ДНК 107 геном/мл и менее позволяет отсечь вклад минорных количеств мутантных штаммов и неспецифических реакций. Так, если в нативной сыворотке концентрация мутантных штаммов вируса составляет 0,1% и менее относительно дикого штамма, то при ее разведении до указанной концентрации после проведения ПЦР не будет зарегистрировано наличия ПЦР-продуктов, соответствующих мутантным штаммам, т.к. их количество находится за пределами чувствительности метода. В этом случае можем говорить о том, что в крови больного преимущественно содержится вирус дикого типа. Если же при разведении в образце ДНК до концентрации 107 геном/мл после ПЦР регистрируются оба (дикий и мутантный) штаммы вируса, то в исследуемом образце концентрация вирусов, несущих YMDD- или ргесоге-мутацию была не менее 104 геном/мл, следовательно, концентрации дикого и мутантного штаммов в такой сыворотке различаются не более, чем в 1000 раз, и в крови одновременно присутствуют две формы вируса. Наличие ПЦР-продуктов, соответствующих только мутантным штаммам вируса свидетельствует о том, что в крови больного количество вируса с мутацией на три порядка превышает немутантную форму. Таким образом, было установлено, что методом аллель-специфической ПЦР можно определять соотношение мутантного и дикого штаммов в сыворотке крови.

Следует отметить, что метод аллель-специфической ПЦР ранее не применялся для оценки доли мутантных штаммов в общей вирусной популяции. Между тем нами установлено, что проведение аллель-специфической ПЦР в концентрационных пределах от 104 до 1 07 геном/мл поможет ответить на вопрос, с каким штаммом, диким или мутантным, на данном этапе заболевания связан

процесс повреждения печени, а это, в свою очередь, немаловажно для выбора оптимальной тактики лечения.

Представленные выше методики в дальнейшем использовались для оценки концентрации и выявления клинически значимых УМРР- и ргесоге-мутаций ДНК вируса в сыворотках больных вирусным гепатитом В с патологией системы крови. В ходе работы был создан банк сывороток, в который вошли 32 ЧВвАд-положительные и содержащие ДНК вируса гепатита В сыворотки больных, получающих химиотерапию при лечении гемобластозов. При исследовании данных сывороток использовали следующий алгоритм. Вначале методом конкурентной ПЦР определяли концентрацию вирусной ДНК. Если концентрация ДНК в сыворотках превышала 107 геном-эквивалент/мл, то перед постановкой аллель-специфической ПЦР их разводили до указанной концентрации. Затем проводили аллель-специфическую ПЦР для выявления УМРР- и ргесоге СцввА - мутантных штаммов вируса гепатита В. В результате было показано, что концентрация ДНК вируса гепатита В в этих сыворотках составила от 107 до 1010 геном-эквивалент/мл, при разведении сывороток до концентрации ДНК 107 геном-эквивалент/мл и менее регистрировались ПЦР-продукты, соответствующие только диким штаммам вируса.

Заключение. В ходе данного исследования разработан методически простой способ конструирования внутреннего стандарта для одностадийной конкурентной ПЦР, который применен при создании диагностической тест-системы для количественного определения ДНК вируса гепатита В в биологических жидкостях. Также, оптимизированы условия аллель-специфической ПЦР для детекции мутаций в геноме вируса гепатита В, что позволило исключить ошибки при интерпретации результатов реакции. Кроме того, показана возможность использования метода аллель-специфической ПЦР для оценки доли мутантных штаммов в общей вирусной популяции.

Несомненным достоинством предложенных в работе методик является то, что они значительно упрощают количественную оценку и выявление мутаций генома вируса гепатита В, что в свою очередь позволяет более эффективно контролировать терапию больных вирусным гепатитом В и корректировать протокол лечения в случае выявления мутантных вирусных штаммов.

выводы

1. Разработана и запатентована новая технология создания внутреннего стандарта для количественного определения ДНК патогенов методом конкурентной ПЦР.

2. Разработана диагностическая тест-система для количественного определения ДНК вируса гепатита В методом конкурентной ПЦР.

3. Показано, что аллель-специфическая ПЦР для выявления вирусных мутаций применима в диапазоне концентраций ДНК от 104 до 107 геном/мл.

4. Установлено, что с помощью аллель-специфической ПЦР можно оценить долю мутантных штаммов в общей популяции вируса гепатита В.

5. Разработанные тест-системы для количественного определения и детекции мутаций вируса гепатита В апробированы на сыворотках больных вирусным гепатитом В.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Пичковская В.А. Февралева И.С., Судариков А.Б. Разработка тест-системы, основанной на методе полимеразной цепной реакции, для количественного определения ДНК вируса гепатита В в сыворотке крови. // Вестник РГМУ. - 2001. - № 2(17).- С. 153.

2. Пичковская В.А., Февралева И.С., Ибрагимова М.М., Соловьева Т.И., Крель П.Е., Судариков А.Б. Детекция УМйй-мутации в ДНК вируса гепатита В с помощью аллель-специфической полимеразной цепной реакции // Молекулярная генетика, вирусология и микробиология. - 2004. - № 1. - С. 27-29.

3. Февралева И.С., Пичковская В.А., Судариков А.Б.. Новая технология конструирования внутреннего стандарта для количественной полимеразной цепной реакции. // Проблемы гематологии и переливания крови. - 2002. - № 1. - С. 89.

4. Февралева И.С, Пичковская В.А., Судариков А.Б. Разработка экспресс-диагностикума для количественного определения ДНК гепатита В в сыворотке крови. Тез. докл. Научно-практический симпозиум Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении". М.: НПО сЛитех», 2002 г. - С. 31-33.

5. Февралева И.С, Пичковская В.А., Судариков А.Б. Способ конструирования внутреннего стандарта для количественного определения ДНК патогенов методом конкурентной полимеразной цепной реакции. Патент на изобретение № 2194761. М.: Государственный реестр изобретений РФ, 2002.

Подписано в печать 12.04.2004 г. Формат 60x90,1/16. Объем 1,25 пл. Тираж 100 экз. Заказ № 129

Отпечатано в ООО «Фирма Блок» 107140, г. Москва, ул. Русаковская, д.1. т. 264-30-73 www.blokOlcentre.narod.ru Изготовление брошюр, авторефератов, переплет диссертаций.

»11 : f

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Пичковская, Виктория Анатольевна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. ВирусгепашгаВ.

1.1.1. Морфология вирусных частиц.

1.1.2. Организация генома и продукты вирусных генов.

1.1.3. Жизненный цикл вируса.

1.1.4. Мутационные изменения генома вируса.

1.1.4.1. Precore-мутация в С-гене.

1.1.4.2. YMDD-мутация в Р-гепе.

1.1.5. Изменение концентрации вируса в крови.

1.2. ПЦР-диагностка вирусного гепатита В.

1.2.1. Количественная ПЦР-диагностика.

1.2.2. ПЦР-диагностикаprecore- и YMDD-мутаций.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Создание банка сывороток.

2.2. ВьшорпраймеровдляПЦР.

2.3. полимеразная цепная реакция.

2.4. Аллель-специфическая полимеразная цепная реакция.

2.5. Гель-электрофорезамплифицированнойДНК.

2.6. Клонирование внутреннего стандарта.

2.7. Определение концентрации плазмидной ДНК.

2.8. Количественное определение ДНК вируса гепатита В методом конкурентной ПЦР.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Получение внутреннего стандарта для конкурентной ПЦР.

3.2. Количественное определение ДНК вируса гепатита В методом конкурентной ПЦР.

3.3. Детекция YMDD/precore-мутаций в ДНК вируса гепатита В.

4. ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Оптимальные тест-системы для количественного определения и детекции мутаций вируса гепатита В"

Актуальность темы диссертации.

Вирусный гепатит В занимает одно из первых мест в инфекционной патологии человека, поэтому возбудитель данного заболевания - ДНК-содержащий гепатотропный вирус гепатита В является предметом пристального внимания и всестороннего изучения. В настоящее время показано, что в репликации этого вируса присутствует стадия обратной транскрипции РНК-прегенома. Обратная транскриптаза, осуществляющая этот процесс, лишена 3'—>5' корректирующей функции, что определяет вариабельность вирусного генома. В сочетании с высокой репликативной активностью вируса гепатита В это приводит к повышению вероятности ошибки считывания РНК-матрицы и появлению мутантных штаммов. В свою очередь, мутации вирусного генома могут изменять профиль серологических маркеров, приводить к снижению эффективности стандартных схем противовирусной терапии и т.д. Отсюда возникла необходимость в комплексной диагностике вирусного гепатита В, включающей количественную оценку вируса в крови больного и анализ мутаций вирусного генома. С этой целью сегодня применяются различные методы генодиагностики, в частности метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Наиболее распространенным методом количественной оценки вируса гепатита В является конкурентная ПЦР, основанная на коамплификации ДНК патогена и количественно охарактеризованного внутреннего стандарта. Создание подобного внутреннего стандарта составляет определенную сложность, что ограничивает применение количественных тест-систем, основанных на методе конкурентной ПЦР, в клинической диагностике.

В ПЦР-диагностике мутаций генома вируса гепатита В приоритетным направлением является детекция клинически значимых 4

YMDD- и precore-мутаций, ассоциирующихся со снижением/отсутствием эффективности противовирусной терапии нуклеозидными аналогами или препаратами интерферона. Кроме того, ргесоге-мутация определяет отсутствие основного маркера активной репликации вируса — НВе-антигена. YMDD- и ргесоге- мутации вызваны однонуклеотидными заменами в ДНК вируса гепатита В. Поэтому для их выявления применяются методы, предназначенные для детекции SNPs (single nucleotide polymorphisms). В большинстве случаев с этой целью используют методы секвенирования и определения длин рестрикционных фрагментов. Но данные методики обладают рядом недостатков: они технически сложны в исполнении и с их помощью довольно трудно оценить долю мутантных штаммов в общей вирусной популяции. Тем не менее, такая информация необходима для выработки эффективной тактики лечения больных вирусным гепатитом В.

Цель работы.

Создать оптимальные диагностические тест-системы для количественного определения и детекции мутаций вируса гепатита В.

Задачи исследования.

1. Разработать методически простую технологию конструирования внутреннего стандарта для количественного определения ДНК патогенов методом конкурентной ПЦР на примере вируса гепатита В.

2. Разработать диагностическую тест-систему для количественного определения ДНК вируса гепатита В методом конкурентной ПЦР, в которой будет использоваться полученный внутренний стандарт.

3. Найти оптимальный метод для выявления дикого и YMDD/precore-мутантных штаммов вируса гепатита В, позволяющий оценивать долю мутантных штаммов в общей вирусной популяции.

4. Апробировать разработанные тест-системы для количественного определения и детекции мутаций вируса гепатита В на сыворотках больных вирусным гепатитом В.

Научная новизна.

Впервые предлагается универсальный и методически простой способ конструирования внутреннего стандарта для одностадийной конкурентной ПЦР. Доказывается, что метод аллель-специфической ПЦР для выявления мутаций в вирусном геноме применим в диапазоне концентраций ДНК от 104 до 107 геном/мл. Причем проведение аллель-специфической ПЦР в указанных концентрационных пределах позволяет оценивать долю мутантных штаммов в общей вирусной популяции.

Практическое значение работы.

Предложенная технология конструирования внутреннего стандарта упрощает разработку тест-систем для определения количества ДНК вируса гепатита В, основанных на методе конкурентной ПЦР. Применение конкурентной и аллель-специфической ПЦР для оценки количества и детекции мутаций в геноме вируса позволяет контролировать эффективность терапии больных вирусным гепатитом В и корректировать протокол лечения в случае выявления мутантных штаммов.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены на конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2001), I Всероссийском съезде гематологов (Москва, 2002), научно-практическом симпозиуме "Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении", проводимом в рамках международной научно-практической конференции "Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины" (Москва, 2002).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 5 работ, в том числе получен патент на изобретение № 2194761, Государственный реестр изобретений РФ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 86 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 21 рисунок и 2 таблицы. Список цитируемой литературы включает 117 наименований.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Пичковская, Виктория Анатольевна

выводы.

1. Разработана и запатентована новая технология создания внутреннего стандарта для количественного определения ДНК патогенов методом конкурентной ПЦР

2. Разработана диагностическая тест-система для количественного определения ДНК вируса гепатита В методом конкурентной ПЦР.

3. Показано, что аллель-специфическая ПЦР для выявления вирусных мутаций применима в диапазоне концентраций ДНК от 104 до 107 геном/мл.

4. Установлено, что с помощью аллель-специфической ПЦР можно оценить долю мутантных штаммов в общей популяции вируса гепатита В.

5. Разработанные тест-системы для количественного определения и детекции мутаций вируса гепатита В апробированы на сыворотках больных вирусным гепатитом В.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Пичковская, Виктория Анатольевна, Москва

1. Аммосов А.Д. Гепатит В. Аналитический обзор. Кольцово: Институт средств медицинской диагностики ЗАО «Вектор-Бест», 1998.

2. Апросина З.Г. Последние достижения в изучении вирусных гепатитов: от молекулярной биологии к лечению вирусного гепатита В // Русск. мед. журн. 1996. - Т. 4. - № 3. - С. 174-177.

3. Балаян М.С., Михайлов М.И. Энциклопедический словарь -вирусные гепатиты. Изд. 2-е, переработанное и дополненное. М.: Амипресс, 1999.

4. Ильина Е.Н., Говорун В.М., Иваников И.О., Сюткин В.Е., Петухова С.В. Хронические вирусные заболевания печени. Методическое пособие для врачей. М.: Научно производственная фирма «Литех», 2001.

5. Клиническая онкогематология. Руководство для врачей / Под ред. М.А.Волковой.-М.:Медицина, 2001. 576 с.

6. Клименко С.М. Биология вируса гепатита В // Бюллетень «Вакцинация». 1999. - №4. - С. 39-44.

7. Момыналиев К.Т., Говорун В.М. Перспективы применения методов ДНК-диагностики в лабораторной службе. Часть 2 (лекция). // Клин, лаб. диагностика. — 2000. № 5. - С.25-37

8. Нетесов С.В. Вирусные гепатиты // СОЖ. 1997. - №2. - С.35-43.

9. Пичковская В.А. Разработка тест-системы, основанной на методеполимеразной цепной реакции, для количественного определения ДНК вируса гепатита В в сыворотке крови. // Вестник РГМУ. 2001. - № 2 (17). -С.153.

10. П.Рахманова А.Г., Демиденко Т.П., Кузнецов Н.И., Степанова. Е.В. Этиопатогенетическая терапия репликативных форм вирусных гепатитов В и С. Пособие для врачей. СПб.: Медицинская академия-постдипломного образования, 1998.

11. Февралева И.С., Пичковская В.А., Судариков А.Б. Новая технология конструирования внутреннего стандарта для количественной полимеразной цепной реакции. // Проблемы гематологии и переливания крови. 2002. - № 1. - С. 89.

12. Февралева И.С., Пичковская В. А., Судариков А.Б. Способ конструирования внутреннего стандарта для количественного определения ДНК патогенов методом конкурентной полимеразной цепной реакции. Патент на изобретение № 2194761. М.:

13. Государственный реестр изобретений РФ, 2002.

14. Хендерсон Д.М. Патофизиология органов пищеварения. — М.-СПб.: Бином Невский Диалект, 1997. - С. 182-184.

15. Abe A., Inoue К., Tanaka Т. et al. Quantitation of hepatitis В virus genomic DNA by real-time detection PCR // J. Clin. Microbiol. 1999. -37: 2899-2903.

16. Allen M.I., Gauthier J., Deslauriers M. et al. Two Sensitive PCR-Based Methods for Detection of Hepatitis В Virus Variants Associated with Reduced Susceptibility to Lamivudine // J. Clin. Microbiol. — 1999. -37(10): 3338-3347.

17. Arbuthnot P., Capovilla A., Kew M. Putative role of hepatitis В virus X protein in hepatocarcinogenesis: effects on apoptosis, DNA repair, mitogen-activated protein kinase and JAK/STAT pathways // J.Gastroenterol.Hepatol. 2000. - 15: 357-368.

18. Arts E.J., Wainberg M.A. Mechanisms of Nucleoside Analog Antiviral

19. Activity and Resistance During Human Immunodeficiency Virus Reverse Transcription // Antimicrob.Agents Chemother. 1996. - 40(3): 527-540.

20. Badur S., Akgun A. Diagnosis of hepatitis В infections and monitoring of Treatment//J.Clin.Virol. -2001. -21: 229-237.

21. Bartholomeusz A, Locarnini S. Hepatitis В virus mutants and fulminant hepatitis B: fitness plus phenotype // Hepatol. 2001. - 34:432-435.

22. Buti M., Sanchez F., Cotrina M. et al. Quantitative Hepatitis В Virus DNA Testing for the Early Prediction Of the Maintenance of Response during Lamivudine Therapy in Patients With Chronic Hepatitis В // J.InfectDis. -2001. 183:1277-80.

23. Chang C.-N., Skalskis V., Zhou J.H., Chengo Y.-C. Biochemical Pharmacology of (+)- and (-)-2',3'-Dideoxy-3'- Thiacytidine as Anti-hepatitis В Virus Agents // J.Biol.Chem. 1992. - 267(31): 22414-22420.

24. Chu C.J., Hussain M., Lok A.S. Quantitative serum HBV DNA levels during different stages of chronic hepatitis В infection. // Hepatol. 2002. - 36(6):1408-15.

25. Chu CJ., Suk-Fong Lok A. Clinical utility in quantifying serum HBV DNA levels Using PCR assays // J.Hepatol. 2002. -36: 549-551.

26. Chu C.-M.,. Yeh C.-T, Lee C.-S. et al. Precore Stop Mutant in HBeAg-Positive Patients with Chronic Hepatitis B: Clinical Characteristics and Correlation with the Course of HBeAg-to-Anti-HBe Seroconversion // J.Clin.Microbiol. 2002. - 40(1): 16-21.

27. Clementi M. Quantitative Molecular Analysis of Virus Expression And Replication // J. Clin. Microbiol. 2000. - 38: 2030-2036.

28. Clementi M., Bagnarelli P., Manzin A., Menzo S. Competitive Polymerase chain reaction and analysis of viral activity at the molecular level // Genet. Anal. Tech. Appl. 1994. - 11:1-6.

29. Conjeevaram H. S., Suk-Fong Lok A. Management of chronic hepatitis В // J.Hepatol. 2003. - 38: S90-S103.

30. Da Silva L.C., Fonseca L.E.P., Carrilho F.J. et al. Predictive factors for response to Lamivudine in chronic hepatitis В // Rev. Inst. Med. Trop. S. Paulo. 2000. 42(4): 189-196.

31. Dai M.S., Lu J.J., Chen Y.C. et al. Reactivation of precore mutant hepatitis В virus in chemotherapy-treated patients // Cancer. 2001. -92(11): 2927-2932.

32. Das K., Xiong X., Yang H. et al. Molecular Modeling and Biochemical Characterization Reveal The Mechanism of Hepatitis В Virus Polymerase Resistance To Lamivudine (3TC) and Emtricitabine (FTC) // J.Virol. — 2001.-75(10): 4771-4779.

33. De Clercq E. Perspectives for the treatment of hepatitis В virus infections // IntJ.Antimicrob.Agents 1999. - 12: 81-95.

34. Doo E., Liang T.J. Molecular Anatomy and Pathophysiologic Implications of Drug Resistance in Hepatitis В Virus Infection // Gastroenterol.-2001. 120: 1000-1008.

35. Drosten C., Weber M., Seifried E., Roth W.K. Evaluation of a new PCR assay with competitive internal control sequence for blood donor screening // Transfusion. 2000. - 40: 718-724.

36. Feng J.Y., Johnsoni A.A., Johnsoni K.A., Anderson K.S. Insights into the Molecular Mechanism of Mitochondrial Toxicity by AIDS Drugs //

37. J.Biol.Chem. -2001. 276(26): 23832-23837.

38. Francois G., Kew M., Van Damme P. et al. Mutant hepatitis В viruses: a matter of academic interest only or a problem with far-reaching implications? // Vaccine. -2001. 19: 3799-3815.

39. Gaillard R.K., Barnard J., Lopez V. et al. Kinetic Analysis of Wild-Type and YMDD Mutant Hepatitis В Virus Polymerases and Effects of Deoxyribonucleotide Concentrations On Polymerase Activity // Antimicrob.Agents Chemother. 2002. - 46(4): 1005-1013.

40. Ganem, D., Pollack J.R., and Tavis J. Hepatitis В virus reverse transcriptase and its many roles in hepadnaviral genomic replication // Infect. Agents Dis. 1994. - 3: 85-93.

41. Halpern M.S., Egan J., Mason W.S., England J.M. Viral antigen in endocrine cells of the pancreatic islets and adrenal cortex of Pekin ducks infected with duck hepatitis В virus // Virus Res. 1984. - 1:213-223.

42. Hammerle Т., Himmelspach M., Dorner F., Falkner F. G. A sensitive PCR assay system for the quantitation of viral Genome equivalents: human immunodeseciency virus type 1 (HIV-1) and hepatitis В virus (HBV) // Arch. Virol. 1997. - 142: 1297±1306.

43. Hendricks D.A., Stowe В J., Hoo B.S. et al. Quantitation of HBV DNA in human serum using a branched DNA (bDNA) signal amplification assay // Am. J. Clin. Pathol. 1995. - 104: 537-546.

44. Hilleman M.R. Overview of the pathogenesis, prophylaxis and therapeusis of viral hepatitis B, with focus on reduction to practical applications // Vaccine 2001. - 19: 1837-1848.

45. Hirsch R.C., Lavine J.E., Chang L.J. et al. Polymerase gene products ofhepatitis В viruses are required for genomic RNA packaging as well as for reverse transcription // Nature 1990. - 344: 552-555.

46. Jardi R., Buti M., Rodriguez-Frias F. et al. Rapid detection of lamivudine-resistant hepatitis В vims polymerase gene variants // J Virol Methods -1999.-83(1-2): 181-187.

47. Kamisango K., Kamogawa C., Sumi M. et al. Quantitative detection of hepatitis В virus by transcription-mediated amplification and hybridization protection assay // J. Clin. Microbiol. 1999. - 37: 310-314.

48. Kessler H.H., Pierer K., Dragon E. Evaluation of a new assay for HBV DNA quantitation in patients with chronic hepatitis В // Clin. Diagn. Virol.-1998.-9:37-43.

49. Kessler H.H., Preininger S., Stelzl E. et al. Identification of Different States of Hepatitis В Virus Infection With a Quantitative PCR Assay // Clin.Diagn.Lab.Immunol. 2000. - 7(2): 298-300.

50. Kessler H.H., Stelzl E., Daghofer E. et al. Semiautomated Quantification of Hepatitis В Virus DNA in a Routine Diagnostic Laboratory // Clin.Diagn.Lab.Immimol. 2000. - 7(5): 853-855.

51. Kidd-Ljunggren K., Miyakawa Y., Kidd A. H. Genetic variability in hepatitis В viruses // J.Gen.Virol. 2002. - 83: 1267-1280.

52. Kidd-Ljunggren K., Oberg M., Kidd A. H. Hepatitis В virus X gene 1751 to 1764 mutations: Implications for HBeAg status and disease // J.Gen.Virol. 1997. - 78: 1469-1478.

53. Kidd-Ljunggrena K., Zukerb M., Hofackerc I.L., Kiddd A.H. The Hepatitis В Virus Pregenome: Prediction of RNA Structure and Implications For the Emergence of Deletions // Intervirol. 2000. -43:154.164.

54. Kirby G.M., Batist G., Fotouhi-Ardakani N et al. Allele-specific PSR analysis of p53 codon 249 AGT transversion in liver tissues from patients with viral hepatitis // Int. J. Cancer 1996. - 68(l):21-25.

55. Kirishima Т., Okanoue Т., Daimon Y. et al Detection of YMDD mutant using a novel sensitive method in chronic Liver disease type В patients before and during lamivudine treatment // J.Hepatol. 2002. - 37: 259265.

56. Kobayashi S., Ide Т., Sata M. Detection of YMDD motif mutations in some lamivudine-untreated Asymptomatic hepatitis В vims carriers // J.Hepatol. 2001. - 34: 584-586.

57. Kreutz C. Molecular, immunological and clinical properties of mutated hepatitis В viruses // J.Cell.Mol.Med. 2002. - 6(1): 113-143.

58. Kwok P.-Y. Methods for genotyping single nucleotide polymorphisms // Annu.Rev.Genomics Hum.Genet. 2001. - 2: 235-258.

59. Lampertico P., Iavarone M., Lunghi G. et al. Monitoring serum HBV-dna during lamivudine therapy by quantitative PCR assay may predict development of YMDD mutants // J.Hepatol. 2002. - 32(S2): 104.

60. Lau G.K, Liang R., Chiu E.K. et al. Hepatic events after bone marrow transplantation in patients with hepatitis В infection: a case controlled study // Bone Marrow Transplant. 1997. - 19: 795-799.

61. Lewin S., Walters Т., Locarnini S. et al. Hepatitis В treatment: rational combination chemotherapy Based on viral kinetic and animal model studies // Antiviral Res. 2002. - 55: 381-396.

62. Li J., Buckwold V. E., Hon M.-W., Ou J.-H. Mechanism of Suppression of Hepatitis В Virus Precore RNA Transcription by a Frequent Double Mutation // J.Virol. 1999. - 73(2): 1239-1244.

63. Li N., Tan W.G., Tsang R.Y. et al. Quantitative polymerase chain reaction using capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection: Analysis of duck hepatitis В // Anal. Bioanal. Chem. 2002. -374: 269-273.

64. Liang R.H., Lok A.S., Lai C.L. et al. Hepatitis В infection in patients with lymphomas // Hematol. Oncol. 1990. - 8: 261-270.

65. Liao C.A., Lee C.M., Wu H.C. et al. Lamivudine for the treatment of hepatitis В virus reactivation following chemotherapy for non-Hodgkin's lymphoma // Br. J. Haematol. 2002. - 116: 166-169.

66. Lin O.S., Keeffe E.B. Current treatment strategies for chronic hepatitis В and С // Annu. Rev. Med. 2001. - 52: 29-49.

67. L0 E.S., Lo Y.M., Fleming K.A. J. Detection of hepatitis В precore mutant by allele specific polymerase chain reaction // Clin. Pathol. -1992. 45(8): 689-92.

68. Locarnini S. Hepatitis В viral resistance: mechanisms and diagnosis // J.Hepatol. 2003. - 39(S1): 124-132.

69. Locarnini S., McMillan J., Bartholomeusz A. The Hepatitis В Virus and Common Mutants // Semin. Liver Dis. 2003. - 23(1): 5-20.

70. Lopez J.L., Mbayed V.A., Telenta P.F.S. et al. "HBe" minus' mutants of hepatitis В virus. Molecular Characterization and its relation to viral genotypes // Virus Res. 2002. - 87: 41-49.

71. Louie M., Louie L., Simor A. E. The role of DNA amplification Technology in the diagnosis of infectious diseases // Can.Med.Assoc,J. -2000. 163(3): 301-9.

72. Mackay I.M., Arden K.E., Nitsche A. Real-time PCR in virology // NucLAcids Res. 2002. - 30(6): 1292-1305.

73. Maini M.K., Bertoletti A. How can the cellular immune response control hepatitis В virus replication? // J.Viral Hepat. 2000. - 7: 321-326.

74. Mantero G., Zonaro A., Albertini A. et al. DNA enzyme immunoassay: general method for detection products of polymerase chain reaction // Clin Chem. -1991.-37: 442-429.

75. Nagata I., Colucci G., Gregorio G. V. et al. The role of HBV DNA quantitative PCR in monitoring the response to Interferon treatment in chronic hepatitis В virus infection // J.Hepatol. 1999. - 30: 965-969.

76. Nakamoto Y., Guidotti L.G., Kuhlen C.V. et al. Immune Pathogenesis of Hepatocellular Carcinoma // J. Exp. Med. 1998. - 188(2): 341-350.

77. Nakamura Y., Motokura Т., Fujita A. et al. Severe hepatitis related to chemotherapy in hepatitis В virus carriers with hematologic malignancies. Survey in Japan, 1987-1991 // Cancer. 1996. - 78: 2210-2215.

78. Niesters H.G. M., de Man R.A., Pas S.D. et al. Identification of a new variant in the YMDD motif Of the hepatitis В virus polymerase gene selected During lamivudine therapy // J. Med. Microbiol. 2002. — 51: 695-699.

79. Nowak M.A., Bonhoeffer S., Hill A M. Viral dynamics in hepatitis В virus infection // Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996. - 93: 4398-4402.

80. Papatheodoridis G.V., Dimou E., Laras A., Papadimitropoulos V., Hadziyannis S.J. Course of virologic breakthroughs under long-term lamivudine in HBeAg-negative precore mutant HBV liver disease // Hepatol. -2002. 36(1): 219-226.

81. Pawlotsky J.M., Bastie A., Lonjon I. et al. What technique should be used for routine detection and quantification of HBV DNA in clinical samples? // J. Virol. Methods. 1997. - 65(2): 245-53.

82. Pawlotsky J.-M. HBV DNA assays (methods and practical use) and viral kinetics // EASL International Consensus Conference on Hepatitis B, September 13-14, 2002, Geneva, Switzerland.

83. Payan C., Veal N., Crescenzo-Chaigne B. et al. New quantitative assay of hepatitis В and С viruses by competitive PCR using alternative internal sequences // J. Virol. Methods. 1997. - 65(2): 299-305.

84. Petrosillo N., Ippolito G., Solforosi L. et al. Molecular epidemiology of an outbreak of fulminant hepatitis В // J. Clin. Microbiol. 2000. - 38(8): 2975-2981.

85. Piatak M. J., Luk K.-C., Williams В., Lifson J. D. Quantitative competitive polymerase chain reaction for accurate Quantitation of HIV DNA and RNA species // Biotechniques. 1993. - 14: 70-81.i

86. Picardi M., Pane F., Quintarelli C. et al. Hepatitis В virus reactivation after fludarabine-based regimens for indolent non-Hodgkin's lymphomas: high prevalence of acquired viral genomic mutations // Haematol. — 2003. 88: 1296-1303.

87. Pollack J.R., Ganem D. An RNA stem-loop structure directs hepatitis В vims genomic RNA encapsidation // J. Virol. 1993. - 67:3254-3263.

88. Prescott L.M. Lamivudine useful against hepatitis B-HIV co-infection // J. Int. Assoc. Physicians AIDS Care. 1995. - 1(5): 34.

89. Radziwill G., Tucher W., Schaller H. Mutational analysis of the hepatitis В virus P gene product: domain structure and RNAseH activity // J.Virol. -1990.-64:613-620.

90. Read S.J., Burnett D., Fink C.G. Molecular techniques for clinical diagnostic virology // J. Clin. Pathol. 2000. - 53: 502-506.

91. Rizzetto M., Marzano A., Lagget M. Treatment of hepatitis В e antigen-negative chronic Hepatitis В with lamivudine // J.Hepatol. — 2003. -39(S1): 168-171.

92. Seeger C., Mason W.S. Hepatitis В Virus Biology // Microbiol.Mol.Biol.Rev. 2000. - 64(1): 51-68.

93. Seigneres В., Aguesse-Germon S., Pichoud C. et al. Duck hepatitis В virus polymerase gene mutants associated with Resistance to lamivudine have a decreased replication capacity In vitro and in vivo // J.Hepatol. — 2001.-34: 114-122.

94. Shibolet O., Ilan Y., Gillis S. et al. Lamivudine therapy for prevention of immunosuppressive-induced hepatitis В virus reactivation in hepatitis В surface antigen carriers // Blood. 2002. - 100: 391-396.

95. Schodel F., Peterson D., Zheng J. et al. Structure of hepatitis В virus core and e-antigen // J.Biol.Chem. 1993. - 2: 1332-1337.

96. Silvestri F., Ermacora A., Sperotto A. et al. Lamivudine allows completion of chemotherapy in lymphoma patients with hepatitis В reactivation // Br. J. Haematol. 2000. - 108: 394-6.

97. Simmonds P. The origin and evolution of hepatitis viruses in humans // J.Gen.Virol. 2001. - 82: 693-712.

98. Stuyver L., Van Geyt C., de Gendt S. et al. Line probe assay for monitoring drug resistance in hepatitis В virus-infected patients during antiviral therapy // J. Clin. Microbiol. 2000. - 38(2): 702-707.

99. Suk-Fong Lok A. Hepatitis В infection: pathogenesis and management // J.Hepatol. 2000. - 32(S1): 89-97.

100. Suzuki F., Suzuki Y., Tsubota A. et al. Mutations of polymerase, precore and core promoter gene in hepatitis В virus during 5-year, lamivudine therapy // J.Hepatol. 2002. - 37: 824-830.

101. Torresi J. The virological and clinical significance of mutations in the overlapping envelope and polymerase genes of hepatitis В virus // J.Clin.Virol. 2002. - 25(2): 97 - 106.

102. Ustun C., Idilman R., Gurman G. et al. Hematopoietic stem cell transplantation from non-replicative hepatitis В virus carriers is safe // J.Hepatol. 1999. - 31(2): 202-209.

103. Valentine-Thon E., Van Loon A. M., Schirm J. et al. European Proficiency Testing Program for Molecular Detection And Quantitation of Hepatitis В Virus DNA // J. Clin. Microbiol. 2001. - 39(12): 44074412.

104. Wang G.H., Seeger C. The reverse transcriptase of hepatitis В virus acts as a protein primer for viral DNA synthesis // Cell.-1992.-71: 663-670.

105. Waris G., Siddiqui A. Regulatory mechanisms of viral hepatitis В and С // J. Biosci. 2003. - 28(3): 311-321.

106. Waterfall C.M., Eisenthal R., Cobb B.D. Kinetic characterization of primer mismatches in allele-specific PCR: a quantitative assessment // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. - 299: 715-722.

107. Wolters L.M.M., Niesters H.G.M., de Man R.A. Nucleoside analogues for chronic hepatitis В // EurJ.Gastroenterol.Hepatol. 2001. - 13(12): 1499-506.

108. Wu J., Sullivan D.E., Gerber M.A. Quantitative polymerase chain reaction for hepatitis В virus DNA // J.Virol.Methods. 1994. - 49(3): 331-41.

109. Yeh C.-T. Hepatitis В virus X protein: Searching for a role in hepatocarcinogenesis // J.Gastroenterol.Hepatol. 2000. — 15: 339-341.

110. Yeo W., Chan P.K., Zhong S. et al. Frequency of hepatitis В virus reactivation in cancer patients undergoing cytotoxic chemotherapy: a prospective study of 626 patients with identification of risk factors // J. Med. Virol. 2000. - 62: 299-307.

111. Yotsuyanagi H., Hino K., Tomita E. et al. Precore and core promoter mutations, hepatitis В virus DNA levels And progressive liver injury in chronic hepatitis В // J.Hepatol. 2002. - 37: 355-363.

112. Zanella I., Rossini A., Domenighini D., Albertini A., Cariani E. Quantitative analysis of hepatitis В virus DNA by real-lime amplification // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2002. - 21(l):22-26.

113. Zeuzem S., de Man R.A., Honkoop P. et al. Dynamics of hepatitis В virus infection in vivo // J. Hepatol. 1997. - 21: 431-436.

114. Zoulim F. Assessing Hepatitis В Virus Resistance In Vitro and Molecular Mechanisms of Nucleoside Resistance // Semin. Liver Dis. —2002.-22(1): 23-31.

115. Zoulim F. Hepatitis В virus resistance to antivirals: clinical implications And management // J.Hepatol. 2003. - 39(S1): 133-138.

116. Zoulim F., Trepo C. Drug therapy for chronic hepatitis B: antiviral efficacy and influence of hepatitis В virus polymerase mutations on the outcome of therapy // J.Hepatol. 1998. - 29: 151-168.1. БЛАГОДАРНОСТИ