Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Определение интегральной резистентности организма методом коли-клиренса

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Определение интегральной резистентности организма методом коли-клиренса"

На правах рукопис

Виноходова Мария Владимировна

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНТЕГРАЛЬНОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ОРГАНИЗМА МЕТОДОМ КОЛИ-КЛИРЕНСА

06.02.02 —ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

2015

005569240

Санкт-Петербург 2015

005569240

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования (ФГБОУ ВПО) «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» Научный руководитель:

Сухииин Александр Александрович, доктор биологических

наук, профессор

Официальные оппоненты:

Трефнлов Борис Борисович, доктор ветеринарных наук, профессор, заведующий отделом вирусологии и опухолевых болезней птиц имени академика Р.Н. Коровина Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного институт птицеводства.

Кузьмина Ольга Геннадьевна, кандидат ветеринарных наук, начальник отдела организации мероприятий по предупреждению и ликвидации болезней животных, лабораторного мониторинга и ветсанэспертизы Управления ветеринар™ Ленинградской области

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Донской государственный аграрный университет»

Защита состоится « 11 » июня 2015 года в 13.00 часов на заседании диссертационного совета Д 220.059.03 при ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» по адресу: г. Санкт-Петербург, ул. Черниговская, д.5; тел/факс (812) 388 10 55.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» по адресу: г. Санкт-Петербург, ул. Черниговская, д.5.

Автореферат размещен на сайтах: ВАК Минобразования и науки РФ: http://vak.ed.gov.ru « 10 » апреля 2015 г.

ФГБОУ ВПО СПбГАВМ: http://www.spbgavm.ru « 10 »апреля 2015 г.

Автореферат разослан: «_»_" 2015 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

Белова Лариса Михайловна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Настоящая работа посвящена разработке метода измерения интегральной естественной резистентности высших позвоночных организмов (Amniota), к которым относится большинство сельскохозяйственных животных, включая птиц. В качестве прототипа мы использовали разработанный Ьо " Всесоюзном научно-исследовательском ветеринарном институте птицеводства (Ленинград, СССР) метод коли-клиренса.

Контроль состояния здоровья сельскохозяйственных животных и их популяций, поддержание здоровья в физиологических пределах и коррекция по показаниям - одно из важных направлений деятельности специалистов в ветеринарии (Дмитриева M. Е., 2008; Долгов Д.Л., Борисов В.В., Фролов C.B., 2009; Ермолова Ю. С., 2010; Ковтуненко, А. Ю., 2009 и др.).

Эффективно эту задачу решить невозможно без измерения естественных возможностей организма, количественного контроля его физиологического состояния, в частности его"естественной резистентности к воздействию агрессивных агентов внешней среды обитания.

По мнению многих авторов, понижение естественной резистентности организма часто приводит к возникновению болезненного состояния и к болезни, а излишнее повышение - к проявлению реакций гиперчувствительности к факторам внешней среды, что сопровождается возникновением аутоиммунных и других патологических процессов. (Джавадов Э. Д., 2004; Кузьмин Г., 2009;. Маревская В. Ю., 2010; Мишина Д. М„ 2012 и др.)

Кроме того, в настоящее время не установлены количественные характеристики воздействия на резистентность организма агрессивных факторов внешней среды, таких как стрессы, неудовлетворительные условия содержания и кормления, физические перегрузки и др., а так же биологическая активность стимуляторов и иммуномодуляторов, использующихся для профилактики и лечения болезней животных. Без внимания исследователей остаются эффекты общего воздействия на резистентность организма вакцин и других биопрепаратов.

Поэтому разработка метода измерения интегральной резистентности организма может позволить определить норму и количественно охарактеризовать эффекты воздействия на организм ветеринарных препаратов путём сравнения с нормой, плацебо и эффектами других лекарственных средств и препаратов, что является актуальной задачей.

Степень разработанности проблемы. В настоящее время авторами используются различные биохимические и иммунологические показатели, а также их сочетания, для оценки неспецифической резистентности организма (Андреева А. В., 2005; Бостанова С. К., Шейко Ю. Н., 2008; Грачева Н. С., Зайцева М. Л., Деева А. В., 2005; Гусельникова Е. В., 2005; Ермолова Ю. С., 2010; Зайцев В. В., Сергеева С. А., Зайцева Л. М., 2008 и др.). Кроме того, учеными предпринимались попытки измерить биологическую (иммунологическую) активность препаратов, применяемых для коррекции

естественной резистентности животных. . s

При анализе литературы установлено, что в настоящее время не существует единого подхода к измерению и контролю естественной резистентности организма. Нет также и общепринятого метода измерения этой величины, а, следовательно, не определены такие понятия как норма резистентности, изменения нормы, отклонения от нормы, не установлена величина интегральной биологической активности иммуномодуляторов и иммуноде-прессантов, используемых в клинической практике. Не имеется также и общепринятой единицы измерения резистентности организма.

На наш взгляд, использование предложенного нами метода для измерения резистентности организма позволяет решить все перечисленные выше проблемы.

Цель исследования. Цель настоящих исследований заключается в создании строго количественного (экспертного) метода измерения резистентности организма. Для достижения этой цели в качестве биологической модели были использованы цыплята-бройлеры. Мы изучали закономерности микробного клиренса у цыплят в норме, при патологических состояниях, при действии иммунодепрессантов, а так же при действии профилактических и лечебных препаратов, влияющих на устойчивость организма к патогенам.

Задачи исследования. 1 .Выделить и охарактеризовать тест-штаммы Е. coli для воспроизведения метода микробного клиренса на цыплятах.

2.Изучить в экспериментальных условиях динамику и характер течения микробного клиренса Е. coli в норме и при патологических состояниях. Создать модель микробного клиренса для количественного анализа процесса очищения организма от Е. coli.

3.Изучить в экспериментальных условиях влияние иммунодепрессантов на течение микробного клиренса.

4.Изучить в экспериментальных условиях влияние иммуностимуляторов на течение микробного клиренса в норме и на фоне действия иммунодепрессантов.

5.Сравнить изученные иммунотропные препараты по количественной характеристике их действия на резистентность организма по результатам измерения резистентности методом коли-клиренса.

Научная новизна. В результате исследований создан новый, строго количественный, метод измерения резистентности организма. В основе его использован модифицированный метод микробного клиренса Е. coli на цыплятах М. В. Бабаевой с соавторами. С помощью этого метода нам удалось измерить интегральную величину естественной резистентности организма в условных единицах (yep).

Определена норма резистентности организма цыплят к экспериментальной Е. coli- инфекции.

Измерено интегральное иммунодепрессивное действие гидрокортизона, циклофосфамида и вируса ньюкаслской болезни птиц на цыплят.

Изучено интегральное стимулирующее действие коммерческих иммуно-

модуляторов, применяемых в ветеринарии, на резистентность организма per se и при экспериментальной иммуносупрессии.

Практическая ценность работы. Измерения резистентности организма методом микробного клиренса могут быть использованы:

•для характеристики естественной резистентности цыплят в биологических экспериментах и диагностики иммунодепрессивных состояний у птиц;

•для контроля естественной резистентности ныне используемых и новых генетических линий и кроссов с целью селекции и отбора устойчивых к болезням птиц;

•для количественной характеристики биологической активности как им-мунодепрессантов, так и иммуномодуляторов, планируемых к использованию в экспериментальных, а также в профилактических или терапевтических целях;

•для контроля результатов коррекции иммунодепрессивных состояний у цыплят в бройлерных хозяйствах;

•для отработки доз ветеринарных препаратов по действию их на уровень естественной резистентности организма;

•для стандартизации по биологической активности новых и ныне выпускаемых иммунотропных препаратов в фармацевтической и биологической промышленности.

Кроме того, результаты проведенных исследований могут быть использованы в учебном процессе и при издании учебной и методической литературы.

Внедрение результатов работы в практику. Модифицированный метод коли-клиренса использован для контроля резистентности племенных ремонтных цыплят кросса «Иза-15» в ООО «Племенная птицефабрика Лебяжье» к К со//-инфекции.

Материалы диссертации используются в качестве практического материала в проведении стажировок и повышении квалификации ветеринарных специалистов, при чтении лекций студентам по направлению подготовки «Ветеринария» и «Биотехнология» профиля в ФБГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины», ФГБОУ ВПО «Омский Государственный аграрный университет им. Столыпина П. А.», ФГБОУ ВПО «Бурятская государственная сельскохозяйственная академия имени Филиппова В. Р.», ФГБОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет», в ФГБОУ ВПО СПбГТИ (ТУ).

Положения, выносимые на защиту.

1.Измерение резистентности организма с помощью усовершенствованного метода коли-клиренса для количественной характеристики естественной резистентности организма на модели экспериментальной Е. со//-инфекции цыплят.

2.Физиологическая норма интегральной естественной резистентности цыплят.

3.Измерение действия иммунодепрессантов на естественную резистентность организма.

4.Измерение действия иммуномодуляторов на естественную резистентность организма. .

5.Измерение корректирующего действия иммуномодуляторов на естественную резистентность организма на фоне экспериментальной иммунодепрес-сии, вызванной действием иммунодепрессантов.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на ученом совете ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины» 2012—2014 гг., на Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Знания молодых для развития ветеринарной медицины и АПК страны» 2014 года, на международном симпозиуме «Lactation research in mammals and humans: The mammary gland in health and disease» в Королевстве Швеция (2010 год).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 научных статей, в том числе 5 - в журналах, входящих в список ВАК, в которых изложено основное её содержание.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 10 таблицами. Список литературы включает 267 источников, в том числе 61 зарубежный.

1. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1.1. Материалы и методы исследований

Эпизоотические штаммы Е. coli выделяли из трубчатых костей, взятых из трупов павших от колибактериоза цыплят-бройлеров й идентифицировали их. В качестве тест-культуры использовали вирулентный штамм кишечной палочки №12 серотита 02. В процессе работы колонии этого штамма были в S-форме, размер колоний на среде Эндо и Левина не превышали 1,0 мм в диаметре, по форме были выпуклые, с ровными краями и гладкой поверхностью.

Рост Е. coli, штамм № 12, на питательных средах изучали в опыте №1 с целью определения константы роста этого штамма на питательных средах и в крови птиц. Для этого использовали нативную и проавтоклавирован-ную кровь цыплят-бройлеров, физиологический раствор, пептонную воду под вазелиновым маслом и мясо-пептонный бульон (МПБ).

В пробирки со средами вносили микропипеткой взвесь штамма Е. coli № 12 в количестве 100 млн. МТ/мл микробной взвеси, очищенной от ростовой среды (эквивалентно заражающей дозе Е. coli для 25-дневных цыплят в дальнейших экспериментах). В контрольные пробирки был добавлен физиологический раствор. Через 30 мин., 1, 3, 6, 12 и 24 часа из всех пробирок брали пробы по 0,05 мл и делали пересевы на среду Эндо в чашках Петри. В случаях высокой концентрации бактерий предварительно делали кратные разведения проб в физиологическом растворе. Результаты учишвали, подсчитывая количество колоний Е. coli на поверхности агара. Полученный результат умножали на разведение пробы и пересчитывали в единицы КОЕ/мл. Для контроля отдельные

колонии пересевали и определяли их серологическую принадлежность.

Методом наименьших квадратов нам удалось смоделировать рост Е. coli

. ' С,=СУ''

№ 12 на разных питательных средах по формуле (Формула 1),

где С, - концентрация живых Ecoli в момент t (КОЕ/мл); С0 - посевная доза E.coli (КОЕ/мл); е — основание натурального логарифма; k¡ - коэффициент накопления E.coli в среде; í- момент времени определения Ct (час.). Полученная нами экспоненциальная модель соответствовала таковой при описании роста бактерий на питательных средах, принятой в биотехнологии. Согласно этой модели был рассчитан коэффициент накопления Е. coli № 12 в крови цыплят и в питательных средах.

Для проведения опытов in vivo были использованы суточные цыплята кросса «Ross-308», которых выращивали в условиях вивария до 25-дневного возраста и живой массы тела 1 кг. Поголовье в подопытные и контрольные группы цыплят подбирали по принципу аналогов.

ДЦ50 и оптимальную дозу заражения определяли экспериментально в опыте №2 путем контрольного инфицирования цыплят разными дозами бактериальной взвеси Е coli № 12, отмытой от питательной среды методом трехкратного осаждения при 1500 g и эмульгирования в физиологическом растворе натрия хлорида.

Готовили последовательные разведения миллиардной взвеси Е. coli в пробирках и вводили их цыплятам внугрибрюшинно в дозе 1 мл/кг живой массы тела. Результаты заражения учитывали, изучая динамику концентраций живых бактерий E.coli в крови, а так же клинически, и, в случае гибели цыплят, патологоанатомически. В процессе опыта выборочно определяли серотип выделенных культур кишечной палочки. В конце наблюдения, через 24 часа после заражения, всех выживших цыплят декапитировали и проводили патологоанатомитческие и бактериологические исследования.

При изучении коли-клиренса мы воспользовались методикой, описанной М. В. Бабаевой с соавторами в нашей модификации. В качестве тест-культуры использовали протестированный в предыдущем эксперименте вирулентный штамм кишечной палочки №12 серотипа 02.

Из 16-18-часовой культуры готовили суспензию с концентрацией 100 млн. микробных клеток в 1 мл, контролируя разведение в компараторе со стандартом мутности. Полученную суспензию вводили подопытным и контрольным (зараженный контроль) цыплятам внугрибрюшинно в дозе 1 мл (100 млн. микробных тел) на 1 кг массы тела. Контрольных (чистый контроль) цыплят не инфицировали. Им вводили стерильный физиологический раствор.

Через 1,3,6,24 часа и далее, при необходимости, один раз в сутки в течение 4-5 дней от птиц опытной и контрольной групп брали по 0,05 мл крови, производя забор стерильной микропипеткой с соблюдением правил асептики, и делали посевы на среду Эндо в чашках Пегри, равномерно распределяя шпателем кровь по всей поверхности агара. Посевы инкубировали в термостате при 37 °С в течение 16-18 ч. Результаты учитывали по числу выросших колоний кишеч-

ной палочки. При значительной бактериальной обсемененности крови делали серию двукратных разведений ее в стерильном физиологическом растворе и производили посевы из полученных разведений. Результаты подсчета выросших колоний умножали на степень исследованного разведения.

Динамику элиминации живых Е. coli из кровяного русла цыплят мы подвергли математическому анализу с целью выявления закономерностей этого процесса. Первичный анализ элиминации Е. coli позволил определить экспоненциальную зависимость динамики концентрации живых бактерий Exoli от времени, прошедшем после заражения цыплят. Математическая модель была рассчитана методом наименьших квадратов по Линник Ю. В. В результате анализа была получена зависимость

С = С

' (Формула 2), которая справедлива для описания

процесса элиминации Е. coli, протекающего дольше 1 часа (Г, > 1 час.). В этой формуле С, — концентрация живых E.coli в момент времени Т, (КОЕ/ мл); Сi - концентрация живых Exoli в момент первого исследования T¡ через 1 час после заражения (КОЕ/мл); е — основание натурального логарифма; k¡ — коэффициент накопления E.coli в крови; к2 — коэффициент элиминации E.coli из крови; Т, — момент времени определения С, (час.).

Для характеристики процесса элиминации E.coli из кровяного русла цыплят, исходя из принятой модели и экспериментальных данных, были рассчитаны следующие показатели.

к/ — коэффициент накопления E.coli в крови цыплят in vitro определяли исходя из модели роста бактерий в питательных средах (Формула 1) в опыте №1. Основной средой для определения ^служила кровь цыплят. Этот показатель определили как константу (k¡ = 0,325 = const.) для штамма Ecoli 02 №12.

к] — коэффициент элиминации E.coli из крови цыплят после их заражения определяли in vivo исходя из формулы 2 соответственно

Т —Т

' ' (Формула 3, обозначения соответствуют формуле 2). vc — средняя скорость элиминации E.coli из крови (по линейной модели)

с J

определяли по формуле ' ' (КОЕ/мл.час.) (формула 4, обозначения соответствуют формуле 2).

t¡/2 — время полувыведения живых бактерий из организма определяли по

1п2 '"2 ~ к -к

формуле 1 2 (час.) (формула 5, обозначения соответствуют формуле

2).

С/ — клиренс E.coli из крови цыплят (мл/час) определяли по формуле Cl=D/AUC (Формула 6), где D - доза заражения, AUC (Area Under the Curve)

AUC = \C,T,-,

- площадь под кривой элиминации; ' (формула 8, обозначения

8

соответствуют формуле 2); ■

R — резистентность организма определяли по формуле R = (к2— k¡)-100 (Формула 7); результат выражали в условных единицах резистентности (yep).

Все полученные экспериментальные и расчетные данные были подвергнуты статистическому анализу по критерию согласия Пирсона (метод а также были посчитаны и проанализированы средние значения по группам (X), их ошибка (М), среднее квадратическое отклонение (S) и его ошибка (MS), коэффициент вариации (CV) и его ошибка (MCV).

В опыте № 2 мы изучали клиренс живых бактерий E.coli, штамм №12, из организма здоровых цыплят бактериологическим методом. Целью эксперимента было установить вирулентность этого штамма для 25-цыплят и определить оптимальную дозу их заражения для исследования динамики патологического процесса, вызванного кишечной палочкой при искусственном внутрибрюшинном заражении.

Для этого сформировали по принципу аналогов 16 групп цыплят в возрасте 25 дней и массой 1±0,02 кг по 5 голов в каждой, которых заражали внутрибрюшинно разными (кратными) дозами E.coli, штамм №12. Контролем служили интактные цыплята.

В результате этого исследования нам уцалось определить ЛД50 E.coli, штамм №12 для 25-дневных цыплят и оптимальную дозу заражения для изучения процесса коли-клиренса.

В опыте № 3 мы изучали клиренс убитых (инактивированных) бактерий E.coli, штамм №12, в организме здоровых цыплят методом ПЦР. Целью эксперимента было установить динамику элиминации целых ДНК E.coli и их фрагментов (геномных эквивалентов) в крови 25-дневных цыплят для того, чтобы сравнить её с динамикой элиминации живых бактерий.

Для этого мы сформировали по принципу аналогов 8 групп цыплят в возрасте 25 дней и массой 1±0,02 кг по 5 голов в каждой. Им вводили внутрибрюшинно инактивированный автоклавированием штамм E.coli №12 в дозах от 1 млрд. до 31,25 млн. микробных тел на голову (или на 1 кг живой массы тела). Контролем служили интактные цыплята.

Контрольные пробы крови в объеме 0,05 мл у всех цыплят брали через 1,3, 6, 12 и 24 часа Количество геномных эквивалентов (ГЭ) Е. coli определяли методом ПЦР в реальном времени (Real-time PCR, qPCR) по ГОСТ Р 52833-207 (ИСО 22174:2005).

Исследования проводили в абакгериальной воздушной среде (ПЦР-боксе). Для выделения ДНК из проб крови и культур Е. coli серотипа 02, штамм № 12 использовали комплект реагентов «ДНК-сорб-В» (ТУ 9398-003 -01897593-2009) с дополнительными материалами и оборудованием согласно инструкции к комплекту реагентов.

Измерения накопления ДНК проводили в программируемом амплифика-торе с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени» Rotor-Gene 3000/6000 (Corbett Research, Австралия) с использованием комплекта реагентов «АмплиСенс® Эшерихиозы-FL» вариант FEP/

FRT-50 F согласно «Инструкции ...».

Калибровку метода проводили на разведениях очищенного от среды смыва убитой автоклавированием агаровой культуры Е. coli с первичной концентрацией 1 млрд. МТ/мл, приготовленному по соответствующему стандарту мутности. Концентрацию бактерий в контрольных пробах изменяли стандартным методом десятикратных разведений. Калибровочную кривую строили, рассчитывая среднюю по 10 измерениям концентрации геномных эквивалентов (ГЭ/мл) Е. coli в контрольных разведениях.

Результаты измерений в экспериментальных пробах крови цыплят пересчитывали в единицы ГЭ/мл. Результаты представляли в экспоненциальном выражении.

В опыте № 4 мы изучали клиренс бактерий E.coli, штамм №12, в организме цыплят с искусственно вызванными дефектами иммунитета.

Модель тимэкгомии у цыплят воспроизводили путем инъекции 3-дневным цыплятам гидрокортизона. Препарат вводили однократно внутри-брюшинно, в дозе 50 мг/кг живой массы.

Подавление нармального развития бурсы Фабрициуса вызывали введением 3-дневным цыплятам циклофосфамида, который инъецировали в течение трех дней внутрибрюшинно в дозе 60 мг/кг живой массы.

Для полной блокировки иммунитета у цыплят обе инъекции проводили внутримышечно. Контролем служили интактные цыплята, которым вводили 0,85% раствор натрия хлорида.

Всех цыплят выращивали до 25-дневного возраста и массы 1 кг в виварии. По достижению этого возраста цыплят заражали E.coli, штамм №12, в дозе 100 млн. МТ/кг живой массы.

Далее периодически, в течение 24 часов, бактериологически определяли обсемененность крови цыплят бактериями E.coli с целью установления динамики их элиминации из крови.

Результаты исследований пересчитывали в единицы КОЕ/мл и анализировали по принятой математической модели (Формула 2).

В опыте № 5 мы изучали клиренс бактерий Ecoli, штамм №12, из организма цыплят; иммунизированных против ньюкаслской болезни (НБ) вакциной из штамма LaSota. Для проведения эксперимента использовали вакцину против ньюкаслской болезни из штамма Ла-Сота сухую производства ФГУ «ВНИИЗЖ».

Было сформировано по принципу аналогов 7 групп цыплят в возрасте 25 дней и массой 1±0,02 кг по 5 голов в каждой. Всех цыплят; кроме контрольной группы, провакцинировали против НБ методом выпаивания (согласно «Инструкции ...»), применив в каждой группе разные дозы вакцины. Цыплят седьмой группы содержали в отдельном боксе вивария и не вакцинировали.

На следующие сутки после вакцинации цыплят исследовали клинически и заражали внутрибрюшинно взвесью бактерий E.coli, штамм №12. в дозе 100 млн. МТ/кг живой массы для исследования клиренса. Далее периодически, в течение 24 часов, бактериологическим методом определяли обсемененность крови цыплят бактериями E.coli с целью установления динамики

их элиминации из крови. Выборочно определяли серотип выделенных культур для контроля чистоты эксперимента.

Результаты исследований пересчитывали в единицы КОЕ/мл и анализировали по принятой математической модели (Формула 2).

В опыте № 6 мы изучали профилактическое действие иммуномодулято-ров на клиренс бактерий E.coli, штамм №12, из организма цыплят. В частности мы исследовали эффекты коммерческих препаратов ронколейкина, фос-пренила, иммунофана, препарата АСД и аллокина альфа, а так же хвойного отвара собственного приготовления. Для исследования каждого препарата были сформированы группы 25-дневных цыплят массой 1±0,02 кг по 5 голов в каждой. Контролем служили 5 цыплят, которым вводили стерильный физиологический раствор.

Иммуномодуляторы применяли согласно инструкциям по их применению.

Хвойный отвар готовили по методу В.Я и О.В. Виноходовых (не опубликовано). В эмалированную кастрюлю наливали 5 литров водопроводной воды и нагревали её до кипения, после чего в неё опускали 500 г крупно нарезанной хвои ели (acus Piceae abies) и кипятили в течение 10 минут. После этого кастрюлю убирали от огня и давали остыть и отстояться отвару в течение суток. На следующий день отвар отфильтровывали и вводили цыплятам в зоб через зонд в дозе 1 мл на голову. Препарат назначали ежедневно в течение трех дней до экспериментального заражения цыплят Е. coli.

Перед проведением эксперимента цыплят исследовали клинически и заражали внутрибрюшинно взвесью бактерий E.coli, штамм №12. в дозе 100 млн. МТ/кг живой массы для исследования клиренса. Далее периодически, в течение 24 часов, бактериологическим методом определяли обсеменен-ность крови цыплят бактериями E.coli с целью установления динамики их элиминации из крови. Выборочно определяли серотип выделенных культур для контроля чистоты эксперимента.

Результаты исследований пересчитывали в единицы КОЕ/мл и анализировали по принятой математической модели (Формула 2).

В опыте № 7 мы изучали профилактическое действие сслвимина-селена и лечебное действие иммуномодупяторов на клиренс бактерий E.coli, штамм №12, из организма вакцинированных против ньюкаслской болезни цыплят.

Было сформировано по принципу аналогов 7 групп цыплят в возрасте 25 дней и массой 1±0,02 кг по 5 голов в каждой.

Для профилактики поствакцинальных осложнений после предстоящей вакцинации цыплят против ньюкаслской болезни мы провели курс превентивной витаминотерапии препаратом Солвимин Селен (Solvimin Selen), производства АО «КРКА, фармацевтический завод, Ново место». Согласно «Инструкции ...». Препарат вводили всем подопытным цыплятам по 0,3 г препарата, приготовленного в виде 5 % водного раствора в зоб через зонд ежедневно в течение трех дней до вакцинации и экспериментального заражения Е. coli. Контролем служили две группы цыплят по 5 голов, которым вводили стерильный физиологический раствор.

Всех цыплят, кроме контрольной группы, провакцинировали против НБ методом выпаивания согласно «Инструкции ...». Каждый цыпленок получил по 10 назальных доз вакцины. Цыплят контрольной группы содержали в отдельном боксе вивария и не вакцинировали.

В тот же день цыплятам в группах Sol+HB+Fos, 8о1+НБ+АСД2, Sol+НБ+АН были применены иммуномодулирующие препараты с целью превентивной терапии поствакцинальных осложнений. Цыплятам в группе Sol+HB+Fos был введен однократно фоспренил в дозе 0,05 мл на 1 кг живой массы в виде водного раствора в зоб через зонд. Цыплятам в группе Бо1+НБ+АСД2 был введен однократно 5 % раствор АСД2 в дозе 10 мл на 1 кг живой массы тела в зоб через зонд. Цыплятам.в группе Sol+НБ+АН был введен аллокин альфа. Для этого ампулу препарата растворяли в 100 мл стерильного физиологического раствора и вводили цыплятам подкожно в среднюю треть шеи в дозе 1,5 мл на голову.

Перед проведением основного эксперимента цыплят исследовали клинически и заражали внутрибрюшинно взвесью бактерий E.coli, штамм №12. в дозе 100 млн. МТ/кг живой массы для исследования клиренса. Далее периодически, в течение 24 часов, бактериологическим методом определяли обсе-мененность крови цыплят бактериями E.coli с целью установления динамики их элиминации из крови. Выборочно определяли серотип выделенных культур для контроля чистоты эксперимента. . . ..

Результаты исследований пересчитывали в единицы КОЕ/мл и анализировали по принятой математической модели (Формула 2).

Для контроля общей эффективности экспериментов мы проводили регулярные клинические исследования путем определения общего состояния птицы, поедаемости корма, состояния оперения, наблюдали за естественными отправлениями, пигментацией кожи в области плюсны, поверхности клюва, слизистых оболочек, при необходимости измеряли температуру тела и частоту дыхания у цыплят.

1.2. Результаты собственных исследований

1.2.1. Выделение и характеристика рабочего штамма Е. coli

Для исследования было отобрано 27 трупов цыплят с признаками коли-бактериоза. В том числе суточных - 2, 10-суточных - 8, 30-дневных — 10, 38 -дневных — 7. Из костного мозга было сделано 168 посевов.

Изучение свойств выделенных культур Е. coli показало, что все они подвижны и грам-негативны. В мазках располагаются как одиночно, так и цепочками по 2 — 6 штук. Отличаются преимущественным постоянством в ферментировании молока, МПБ с глюкозой, лактозы, маннита, арабинозы, ксилита, галактозы. Некоторые культуры образовывали индол (143 или 85,12%), в процессе роста выделяли сероводород (6 или 3,57 %), ферментировали дульцит (72 или 42,86 %), сахарозу (116 или 69,05 %). Все культуры не ферментировали инозитол.

Серологическое типирование выделенных культур Е. coli позволило иденти-

фицировать полученные штаммы Е. coli по группам. Дальнейшее типированире культур позволило установить' иммунологическую идентичность по следующим О-антигенам: Ot — 10 шт., 02 — 25 шт., О5 — 1 шт., Os — 8 шт., 09 — 6 шт., О15 - 1 шт., О21 - 1 шт., 02б - 1 шт., О33 - 1 шт., О35 - 1 шт., 043 - 1 шт., 047 - 10 шт., 062 - 1 шт., 063 - 6 шт., Об8 - 1 шт., О70 - 1 шт., О77 - 4 шт., 078 - 10 шт., О80 - 1 шт., 098 - 1 шт., Oioi - 1 шт., Ош - 7 шт., Оц5 - 1 шт., Oi26- 8 шт., Ош - 1 шт., Oi37 - 4 шт., Ош - 4 шт., Oi47 - 7 шт., О149 - 4 шт. Таким образом, было идентифицировано по О-антигену 128 (76,19 %) вьщеленных штаммов Е. coli. Большинство из них принадлежали к серотипам Оь 02, 08, 047, 078, Ош, 0[26, 0147. 40 культур идентифицировать серологически не удалось.

Все идентифицированные штаммы Е. coli были посеяны на пептонную воду под вазелиновым маслом. Посевы выдерживали в термостате в течение 4 часов их хранили в холодильнике при +4 °С в течение всего времени проведения исследований.

Патогенность вьщеленных штаммов Е. coli определяли методом постановки биопробы, используя для этого 510 цыплят (168 групп, по 3 гсш.) и одну контрольную группу (6 гол.).

В результате исследований было выявлено следующее количество патогенных штаммов К coli (процентов от вьщеленных): Oi — 9 шт.(90 %), 02 — 22 шт. (88 %), 08 - 5 шт. (62,5 %), 09 - 6 шт. (100 %), 033 - 1 шт. (100 %), 035 - 1 шт. (100 %), 047 - 3 шт. (30 %), 078 - 8 шт. (80 %), О80 - 1 шт. (100 %), 0„, - 6 шт. (85,71 %), Ои5 - 1 шт. (100 %), Oi26 - 7 шт. (87,5 %), 0137 - 1 шт. (25 %), 0142 - 1 шт. (25 %), Oi47 — 6 шт. (85,71 %). Все эти штаммы Е. coli после введения их внутрибрюшинно 25-дневным цыплятам в дозе 425 млн. микробных тел в объеме 0,5 мл. вызывали у цыплят клиническую картину болезни, однако не все штаммы вызывали гибель цыплят в течение недели после заражения (срок наблюдения). Таким образом наиболее вирулентными из вьщеленных в хозяйстве установлены следующие серотипы Е. coli: Оь 02,08,09, Оу8, Ош, 0[2б и Oi47.

Проведенные исследования позволили нам выбрать рабочий штамм Е. coli для проведения дальнейших исследований. Им стал штамм № 12 Е. coli сероти-па 02. Бактерии подвижны, грам-отрицателены, в мазках располагаются как одиночно, так и цепочками по 2 — 6 штук, ферментируют молоко, МПБ с глюкозой, лактозу, маннит; арабинозу, ксилит, галактозу, не выделяют индол и сероводород, не ферментируют дульциц сахарозу, инозитол. При постановке биопробы выбранный штамм Е. coli № 12 вызывает гибель цыплят на 2 — 3 сутки после заражения. В трупах цыплят вызывает развитие характерных патологоана-томических изменений для колибакгериоза. При контрольных бактериологических исследованиях выделяется из костного мозга павших цыплят. Изменений свойств штамма после пассирования на цыплятах не установлено.

1.2.2. Изучение роста Е. coli, штамм № 12, в крови цыплят in vitro

В опыте № 1 мы изучили способность выбранного штамма Е. coli № 12 к росту в полусинтетических питательных средах и в крови и, на основании полученных экспериментальных данных, рассчитали коэффициент накопления

бактерий (kj, формула 1) при наиболее благоприятных условиях культивирования.

Установлено, что в физиологическом растворе натрия хлорида бактерии Е. coli № 12 практически не развивались, поскольку субстратом служили погибшие бактерии и следы питательных веществ — компонентов среды Эн-до, используемой нами для получения взвеси этих бактерий.

На пептонной воде в анаэробных условиях штамм Е. coli № 12 развивался умеренно. За 24 часа инкубации увеличение численности бактерий произошло почти в 700 раз и составило 9,03-Ю8 ± 1,10-Ю7 КОЕ/мл., а коэффициент накопления ку = 0,28 ± 0,05 при средней скорости накопления биомассы 3,92-107 ± 2,15-Ю5 КОЕ/(мл.-час.), что достоверно отличается от контрольного показателя, полученного на физиологическом растворе.

На МПБ штамм Е. coli № 12 продемонстрировал типичный экспоненциальный рост. За 24 часа инкубации численность бактерий увеличилось в 1140 раз и составила 1,54-109± 1,41-107КОЕ/мл., а коэффициент накопления ki = 0,31 ± 0,07 при средней скорости накопления бактерий 6,71-Ю7 ± 2,73-Ю5 КОЕ/ (мл.-час.). Таким образом, условия роста бактерий в МПБ были более благоприятными, чем на пептонной воде и в физиологическом растворе.

Рост бактерий штамма Е. coli № 12 в пробирках с кровью цыплят был еще более интенсивный, чем в МПБ. За 24 часа инкубации численность бактерий увеличилось в 1760 раз и составила в нативной крови 2,45-109± 5,53-107КОЕ/мл., а в инактивированной - 2,53-Ю9 ± 2,18-Ю7КОЕ/мл. Коэффициент накопления в обеих группах составил kj = 0,325 ± 0,03 при средней скорости накопления бактерий 1,07 —1,1-1О8 КОЕ/(мл.-час.).

Нам не удалось обнаружить существенные отличия в интенсивности роста штамма Е. coli № 12 в нативной и автоклавированной крови. Бактерии развивались примерно одинаково.

1.2.3. Исследование клиренса живых бактерий штамма Е. coli № 12 у здоровых цыплят

Целью эксперимента по моделированию коли-инфекции на 25-дневных цыплятах было определить ЛД50 и рабочую заражающую дозу Е. coli, штамм № 12 (02). Для этого мы внутрибрюшинно заразили цыплят разных групп этим штаммом кишечной палочки в следующих дозах (млн.МТ/кг живой массы): 1000, 500, 250, 160, 140, 125, 120, 100, 80, 60, 62,5, 31,25.

Все цыплята, зараженные Е. coli в дозе 250 млн.МТ/кг массы тела и выше заболели и пали в течение 48 — 72 часов после заражения. При патологоанатомическом вскрытии во всех трупах был обнаружен полисерозит разной степени интенсивности, что свидетельствовало о подострой и острой форме септицемии.

По данным бактериологических исследований у подопытных цыплят происходило интенсивное накопление бактерий в крови, значительно превышающее их элиминацию.

Клинические признаки болезни у цыплят в подопытных группах, получивших 120 — 160 млн.МТ/кг живой массы проявились через 0,5 — 1 час по-

еле заражения, но менее интенсивно, чем в предыдущем случае. От 20 до 60 % цыплят пали в период наблюдения. При патологоанатомическом вскрытии у всех цыплят был диагностирован колибакгериоз.

По данным бактериологических исследований в организме цыплят, получивших Е. coli в дозах 80-100 млн.МТ/кг живой массы наблюдалась элиминация бактерий, незначительно превышающая их накопление со скоростью -6,61 ± 4,85 и -38,78 ± 4,70 КОЕ/(мл.-час.) при к2 равном 0,29 ± 0,06 и 0,39 ± 0,06 соответственно.

Клинические признаки болезни у цыплят, получивших Е. coli в дозах 31,25 — 60 млн.МТ/кг живой массы проявились незначительно через 1—2 часа после заражения, а у двух цыплят не были обнаружены в течение всего эксперимента. В конце опыта цыплята этих групп были убиты и исследованы. Патологоанатомически колибакгериоз был диагностирован у 72 % цыплят. Бактерии Е. coli серотипа 02 были выделены из всех трупов.

По данным бактериологических исследований в организме всех цыплят получивших Е. coli в дозе менее 60 млн.МТ/кг живой массы наблюдалась элиминация бактерий, превышающая их накопление со скоростью —22,09 ± 1,62 —18,43 ± 1,62 КОЕ/(мл.-час.) при к2 равном 0,45 ± 0,02 - 0,51 ± 0,04.

При исследовании полностью живой и здоровой контрольной группы цыплят нам не удалось обнаружить признаков болезни и выделить бактерий Е. coli серотипа 02. Поэтому, результат эксперимента в этой контрольной группе цыплят мы приняли за 0. Результаты выделения иных бактерий мы не использовали в анализе эксперимента, поскольку цыплят не заражали искусственно.

Таким образом, нам удалось подтвердить патогенность штамма № 12 Е. coli, поскольку он вызывал болезнь и гибель цыплят в дозе 125 млн. МТ/кг массы тела и выше. При этом ДЦ50 его составила 250 млн. МТ/кг массы тела при весьма незначительной скорости элиминации бактерий —6,61 ± 4,85 КОЕ/(мл.-час.) и коэффициенте элиминации 0,29 ± 0,06, что говорит о высокой, но недостаточной для активного выздоровления, интенсивности клиренса бактерий из больного организма.

Креме того, нам удалось рассчитать следующие показатели, характеризующие динамику накопления или выведения бактерий coli N° 12 после заражения.

Установлено, что при заражении цыплят в дозах 500 млн. МТ/кг массы тела и выше в крови происходит накопление Е. coli № 12, то есть vc (формула 5) была положительна и значительно больше нуля. Это говорит об интенсивно развивающейся септицемии, не дающей шансов цыплятам на выживание. В дозе 250 млн. МТ/кг массы тела (ЛД50) и ниже установлены отрицательные значения этого показателя от -6,61 ± 4,85 до —18,43 ± 1,62 КОЕ/(мл.-час.), что подтверждает наличие динамики элиминации (клиренса) Е. coli Ks 12 из организма цыплят.

Время полувыведения (tj/2) бактерий Е. coli № 12 из организма при дозах заражения 1 млрд. и 500 млн. МТ/кг массы тела определить не удалось, поскольку в этих группах была установлена положительная динамика накопления бактерий в крови. В остальных группах показатель варьировал прямо

пропорционально дозе заражения в широких пределах. , :

Клиренс (С/) в эксперименте изменялся обратно пропорционально заражающей дозе в пределах от 30,62 ± 13,43 до 443,35 ± 52,55 мл/час., не проявляя пороговых значений. --,,.-.■.■--.

Наиболее интересные результаты были нами получены при анализе количественной характеристике резистентности организма (R). При дозах заражения, превышающих ЛД50, эта величина имела отрицательное значение. При дозе заражения, равной ЛД50 (250 млн. МТ/кг массы тела) R достоверно соответствовала 0,40±0,31, то есть практически была равна нулю. При оптимальной дозе заражения 100 млн. МТ/кг массы тела R соответствовала 7,15 ±0,13 yep. По соотношению показателя с сопредельными дозами R изменялась от 6,83 ± 0,24 до 8,24 ± 0,27 yep. Значения этого показателя при дозах заражения цыплят ниже 60 млн. МТ/кг массы тела оказались недостоверными.

Таким образом, было установлено, что ЛД50 Е. coli № 12 составляет 250 млн. МТ/кг массы тела, а оптимальная заражающая доза этого штамма для 25-дневных цыплят кросса «Ross-308» — 100 млн. МТ/кг массы тела. При описанных условиях эксперимента, резистентность таких цыплят составляет 7 - 8 yep. в норме.

1.2.4. Исследование действия иммуносуирессоров

Исследование клиренса Е. coli у цыплят с искусственно угнетенным

иммунитетом

Для постановки опыта использовали 5 тимэктомированных, 5 бурсэкто-мированных цыплят, а также 5 цыплят с инакгивированными тимусом и бурсой Фабрициуса одновременно.

Первым контролем служили интактные цыплята, которым вводили 0,85% раствор натрия хлорида. Вторьм (зараженным) контролем служили здоровые цыплята, на которых была воспроизведена модель коли-клиренса.

Установлено, что все цыплята, которым вводили гидрокортизон, а также гидрокортизон и циклофосфамид тяжело переболевали после их заражения Е. coli № 12 и в результате эксперимента погибли в течение 48 — 72 часов после начала опыта. Кроме того, 1 цыпленок из 5 (20 %), которому ввели циклофосфамид и изучали клиренс Е. coli № 12 так же погиб.

Развитие септицемии у цыплят, получивших курс гидрокортизона было интенсивным. Скорость накопления Е. coli в крови была 372,87 ± 14,72 и 424,00 ± 23,92 КОЕ/(мл.-час.) соответственно при коэффициенте элиминации (к2) и 0,20 ± 0,02, что не давало им шансов на выздоровление. Резистентность организма этих цыплят была значительно меньше нуля и достоверно составила -7,73±0,24 и -8,24±0,40 yep. соответственно.

Цыплята, получившие премедикацию только циклофосфамидом, заражение Е. coli перенесли значительно легче. Скорость выведения Е. coli из крови была -53,22 ± 0,4 КОЕ/(мл.-час.) при коэффициенте элиминации (к2) 0,33 ± 0,07. Резистентность организма этих цыплят была 5,82±0,41 yep., что на 2 yep. (25,5 %) меньше контроля.

Значение клиренса (CI) в опытных группах отличались между собой не существенно и находились в пределах от 3,61 ± 1,56 до 4,56 ± 0,95 мл/час., что почти в 2 раза ниже, чем в контроле.

Период полувыведения (tI/2) живых бактерий Е. coli серотипа 02 из организма подопытных цыплят удалось установить только при тестировании циклофосфамида. i;/? составил 11,92 час., против 8,88 час. в контроле.

Таким образом, было установлено, что как тимус, так и бурса Фабрициуса участвуют в механизмах резистентности цыплят к экспериментальной Е. coli—инфекции. Инактивация этих органов ведёт к снижению резистентности организма на 14—15 yep. по сравнению с контролем и приводит к гибели птицы при экспериментальном заражении её Е. coli № 12. Иммунологическая активность бурсы Фабрициуса менее значима, чем таковая у тимуса.

1.2.5. Исследование клиренса Е. coli у вакцинированных против нью-каслской болезни цыплят

Установлено, что все цыплята, получившие соответственно 10 и 5 назальных доз вакцины, тяжело переболевали после их заражения Е. coli № 12 и в результате эксперимента погибли в течение 48 — 72 часов после заражения. Кроме того, часть цыплят; получивших 2,5 и 1,25 назальных доз вакцины, так же погибли.

Развитие септицемии у цыплят, получивших максимальные дозы вакцины было интенсивным. Скорость накопления Е. coli в крови была от 200 до 332 КОЕ/(мл.-час.) при коэффициенте элиминации (к2) 0,18 0,23, что не давало им шансов на выздоровление. Резистентность организма этих цыплят была значительно меньше нуля и составила соответственно —6,93±0,75 —6,79±0,88 yep. с сомнительной достоверностью.

Цыплята, получившие 2,5 назальных дозы вакцины, переболевали остро и продемонстрировали минимальный клиренс Е coli из крови. Скорость элиминации была -4,87 ± 5,63 КОЕ/(мл.-час.) при коэффициенте элиминации (к2) 0,28 ± 0,07. При этом резистентность организма достоверно определялась в 0,91±0,59 yep., что на 7 yep. меньше контроля, то есть практически была близка к нулю.

Цыплята, получившие 0,625 и 0,31 назальных доз вакцины, переболева-лии менее остро. Скорость выведения Е. coli из крови была —54,61 ±6,81 и — 49,91 ± 6,81 КОЕ/(мл.-час.) при коэффициенте элиминации (к2) 0,40 ± 0,06 и 0,39 ± 0,09 соответственно. Резистентность организма к заражению Е. coli у этих цыплят была близка к контролю.

Клиренс (С7) не продемонстрировал стабильных изменений и составил в разных группах от 5,36 ± 1,48 до 8,46 ± 1,46 мл/час. при контроле 9,07 ± 1,56 мл/час., не проявляя пороговых значений.

Период полувыведения Е. coli из организма изменялся прямо экспоненциально от дозы заражения и был во всех случаях выше контроля.

Таким образом, было установлено, что вакцинный штамм Ла-Сота вируса ньюкаслской болезни является иммунодепрессантом, то есть снижает естественную резистентность цыплят и способствует развитию колибакте-риоза. Уменьшение показателя резистентности организма рекомендуемой в

«Инструкции ...» профилактической дозой вируса сопоставимо с таковой при иммунодепрессии, производимой гидрокортизоном и циклофосфами-дом, и составляет 14 - 15 yep.

Уменьшение иммунизирующей дозы вакцины до 2,5 назальных доз приводит к снижению интенсивности поствакцинального патологического процесса, но не сохраняет нормальный уровень резистентности цыплят к заражению Е. coli № 12. -., .. •

Применение вакцины в дозах 1,25 назальных доз и ниже позволяет сохранить резистентность цыплят к заражению Е. coli № 12 на уровне, близком к контролю.

1.2.6. Исследование действия иммуномодуляторов и иммуностимуляторов на показатель клиренса и резистентности

Целью эксперимента было определить величину стимулирующего резистентность цыплят действия иммуномодулирующих коммерческих препаратов методом кали-клиренса.

Для этого мы использовали ронколейкин, фоспренил, иммунофан, АСД-2, аллокин альфа и хвойный отвар. Для исследования действия препаратов были сформированы группы цыплят по 5 голов. Иммуномодупяторы применяли согласно инструкциям по их применению в течение трёх дней до заражения их Е. coli, штаммом № 12. Хвойный отвар вводили в зоб через зонд в дозе 1 мл/кг живой массы. Контролем служила группа цыплят, которым вводили стерильный физиологический раствор.

В результате эксперимента было установлено, что у цыплят во всех подопытных группах клиренс Е. coli протекал интенсивно. Скорость элиминации была выше контроля и составляла от -49,39 ± 5,35 до -60,17 ± 3,64 КОЕ/(мл.-час.) при коэффициенте элиминации (к?) от 0,39 ± 0,05 до 0,45 ± 0,08 при использовании всех исследуемых иммуномодуляторов.

Установлено так же, что профилактическое применение ронколейкина, иммунофана, аллокина альфа и хвойного отвара не повлияло на резистентность цыплят к заражению Е. coli №12. Их резистентность (R) достоверно находилась на уровне интактного организма и составила от 7,42 ± 0,97 до 8,48 ± 0,93 yep. при контроле 7,91 ± 0,16 yep.

Профилактическое применение фоспренила позволило существенно повысить устойчивость цыплят к заражению Е. coli. Так, после премедикации этим препаратом, скорость элиминации составила -60,17 ± 3,64 КОЕ/ (мл.-час.) при коэффициенте элиминации (к2) 0,43 ± 0,05, что соответственно на 29 % и 39 % выше, чем в контроле. Резистентность (R) при этом была 13,24 ± 0,99 yep., что на 67,4 % выше, чем в контроле. То есть, применение препарата позволило повысить резистентность цыплят, как минимум, на 4,25 yep. в норме.

Профилактическое применение препарата АСД-2 так же позволило существенно повысить устойчивость цыплят к заражению Е. coli. После трёхдневного выпаивания растворов этого препарата, скорость элиминации бактерий составила -59,64 ± 4,39 КОЕ/(мл.-час.) при коэффициенте элимина-

ции (к2) 0,45 ± 0,08, что на 39 % выше, чем в контроле. Резистентность (R) при этом бьша 20,25 ± 5,04 yep., что в 2,6 раза выше, чем в контроле. То есть применение препарата АСД-2. позволило повысить резистентность здоровых цыплят, как минимум, на 7 yep.

Клиренс (С/) во всех группах цыплят не показал значительных изменений и составил от 7,90 ± 1,39 до 8,90 ± 1,31 мл/час. и находился в пределах ошибки контроля 9,13 ± 1,67 мл/час.

Период полувыведения Е. coli из организма в группах находился в пределах 8,17 - 9,34 час. и практически не отличался от контроля (8,76 час.). Значительное снижение этого показателя установлено при исследовании фос-пренила - 5,23 час. (- 40 %) и препарата АСД-2 - 3,42 час. (-61 %).

Таким образом установлено, что ронколейкин, иммунофан, хвойный отвар и аллокин альфа, при курсовом профилактическом их применении, не способны стимулировать резистентность цыплят к заражению вирулентным штаммом Е. coli № 12. Фоспренил и препарат АСД-2 при тех же условиях стимулируют потенциальную устойчивость здоровых цыплят к заражению на 4,25 и 7 yep. соответственно.

1.2.7. Исследование клиренса E.coli у цыплят, вакцинированных против ньюкаслской болезни, на фоне протекции иммуномодуляторов и иммуностимуляторов

В результате эксперимента было подтверждено иммунодепрессивное действие вакцины против ньюкаслской болезни на организм цыплят. Развитие септицемии у цыплят контрольной группы было интенсивным. Скорость накопления Е. coli в крови была 390,96 ± 19,63 КОЕ/(мл.-час.) при коэффициенте элиминации (к2) 0,22 ± 0,03, что не давало им шансов на выздоровление. Резистентность организма (R) этих цыплят бьша отрицательной и составила —7,57±0,39 yep. с сомнительной достоверностью.

Премедикация солвимином позволила повысить резистентность цыплят к заражению Е. coli № 12. Скорость выведения бактерий из организма составила —69,39 ± 1,00 КОЕ/(мл.-час.) при коэффициенте элиминации (к2) 0,39 ± 0,06, что выше контроля на 39 % и 21 % соответственно. Резистентность организма (R) этих цыплят бьша 8,76±0,41 yep. и на 13 % достоверно превышала контрольный показатель.

Иммунопротективный эффект солвимина проявился и на вакцинированных цыплятах. Применение этого препарата позволило нивелировать депрессивное действие вакцины. У вакцинированных цыплят скорость выведения бактерий из организма составила -62,09 ± 4,01 КОЕ/(мл.-час.) при коэффициенте элиминации (к2) 0,38 ± 0,06, что выше контроля на 32 % и 18 % соответственно. Резистентность организма (R) практически не отличалась от таковой у невакцинированных цыплят и составила 8,73±0,46 yep. и так же бьша на 13 % достоверно выше контроля.

Однократное применение фоспренила для превентивной терапии поствакцинальных осложнений, вызванных заражением цыплят Е. coli № 12,

не увенчалось успехом. Скорость выведения бактерий из организма составила -61,74 ± 2,64 КОЕ/(мл.-час.) при коэффициенте элиминации (к2) 0,37 ± 0,07, а резистентность организма (R) составила 8,72 ± 0,36 yep., что не отличалось ог контрольного показателя,

Однократное применение препарата АСД-2 и аллокина альфа с той же целю, позволило увеличить устойчивость организма к инфекции.

Так у цыплят, получивших курс ссшвимина, при однократном выпаивании препарата АСД-2 в день вакцинации, скорость выведения бактерий из организма составила -73,39 ± 0,90 КОЁ/(мл.-час.) при коэффициенте элиминации (к2) 0,41 ± 0,07, что на 15,7 % и на 10,8 % выше, чем в контроле. Резистентность организма (R) составила 10,71 ± 0,30 yep. То есть превентивное применение препарата АСД-2 в день вакцинации позволило увеличить резистентность на 2 yep. (19 %) по сравнению с контролем на фоне протекции резистентности организма солвимином.

При однократном введении аллокина альфа в день вакцинации у цыплят, получивших курс солвимина, скорость выведения бактерий из организма незначительно отличалась от контроля и составила -64,00 ± 1,00 КОЕ/ (мл.-час.) при коэффициенте элиминации (к2) 0,40 ± 0,07. Резистентность организма (R) составила 11,22 ± 0,64 yep. Увеличение этого показателя по сравнению с контролем составило 2,5 yep. (22 %) на фоне протекции резистентности организма солвимином.

В группе вакцинированных цыплят клиренс (СГ) был значительно ниже, чем во всех других группах и составлял 3,09 ± 1,35 мл/час, что на 77 % ниже контроля.

В других группах цыплят этот показатель не продемонстрировал значительных изменений. Его величина варьировала от 5,58 ± 0,94 до 6,34 ± 0,94 мл/час. и находилась на 32 — 41 % ниже контроля.

Период полувыведения Е. coli из организма в подопытных группах находился в пределах 6,18 — 7,95 час. и был достоверно ниже контроля (9,08 час.). Значительное снижение этого показателя установлено при исследовании аллокина альфа - 6,18 час. (-32 %) и препарата АСД-2 - 6,47 час. (- 29 %).

2. ВЫВОДЫ

1.Определена интегральная резистентность организма методом коли-клиренса. Предложенный нами метод позволяет количественно определить величину резистентности тест-организмов (25-дневных цыплят кросса Ross-308) к экспериментальной Е. со//-инфекции в различных условиях. Предложены новые единицы измерения — условные единицы резистентности (yep.). 2.Впервые определена норма резистентности организма. Клинически здоровый организм 25-дневного цыпленка кросса Ross-308 (тест-организм) имеет резистентность к Е. со//-инфекции R = 7+8 yep. Процессы элиминации бактерий у цыплят проходят на уровне адаптации и не вызывают возникновение болезни после внутрибрюшинного заражения тест-дозой Е. coli (штамм

02, №12), если их Ä>7,15 yep.

3.Впервые измерено депрессивное действие классических иммуносупрессо-

ров. Гидрокортизон, циклофосфамид, их сочетание в одной форме, а также высокие дозы вируса ньюкаслской болезни птиц, введенные в организм, снижают резистентность цыплят до -6 — 8 yep. Вместе с тем, низкие дозы вируса ньюкаслской болезни птиц существенно не влияют на резистентность организма к экспериментальной Е. со//-инфекции.

4.Впервые измерено стимулирующее действие иммуномодуляторов, используемых в клинической ветеринарной практике. Установлено, что в норме у цыплят резистентность увеличивалась от действия иммунофана, алло-кина-альфа, солвимина, фоспренила и препарата АСД-2. Наибольшая стимулирующая активность установлены при введении цыплятам фоспренила и препарата АСД-2. Профилактическое применение этих препаратов стимулировало нормальную резистентность цыплят до 13,24±0,99 и до 20,25±5,04 yep., что на 5,67±0,44 yep. (75,0%) и на 12,68±4,49 yep. (164,0±47%) соответственно, выше, чем в норме.

5.Впервые измерена резистентность организма при сочетанном применении вируса (иммунодепрессанта) и иммуномодуляторов на модели вакцинации цыплят против ньюкаслской болезни. Установлено, что премедикация цыплят солвимином вызывает повышение их резистентности на 1,15+1,2 yep. (16,0±3,5%). Такая стимуляция достаточна для профилактики поствакцинальных осложнений, вызванных иммуносупрессивным действием вируса ньюкаслской болезни. Препараты АСД-2 и аллокин альфа на фоне фармакологического действия солвимина взывают усиление стимулирующего эффекта на 42+49 % в рекомендованных авторами дозах.

3. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Материалы научных исследований использованы при написании методических рекомендаций «Методические рекомендации по комплексной оценке естественной резистентности организма птиц методом коли-клиренса» (рассмотрены и одобрены методическим советом ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины», протокол №3 от 05.03.2015 г)

1.Полученные результаты значительно дополняют знания о природе есте-венной резистентности организма.

2.Метод рекомендован для характеристики естественной резистентности цыплят в биологических экспериментах и диагностики иммунодепрессив-ных состояний у птиц; для контроля естественной резистентности ныне используемых и новых генетических линий и кроссов с целью селекции и отбора устойчивых к болезням птиц; для количественной характеристики биологической активности как иммунодепрессантов, так и иммуномодуляторов, планируемых к использованию в экспериментальных, а также в профилактических или терапевтических целях; для контроля результатов коррекции иммунодепрессивных состояний у цыплят в бройлерных хозяйствах; для отработки доз ветеринарных препаратов по действию их на уровень естественной резистентности организма, а так же для стандартизации

по биологической активности новых и ныне выпускаемых иммунотропных препаратов в фармацевтической и биологической промышленности.

4. СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Виноходов В.О., Тяминова С. О., Сухинин А. А., Виноходова М. В., Смирнова Е. М. Синдром «опухшая голова» или введение в оториноларингологию птиц. Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии, №4,2011 г. с. 40-51

2.Виноходова М.В., Сухинин A.A. «Устойчивость» клинического показателя — эффективный фактор оценки его значимости для дифференциации нормы от патологии и при оценке естественной резистентности организма. «Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии», № 4, 2014, с. 67-73.

3.Сухинин A.A., Виноходова М.В. Метод коли-клиренса (Сообщение 1). Определение нормы резистентности организма. «Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии», № 4,2014, с. 50-57.

4.Сухинин A.A., Виноходова М.В. Метод коли-клиренса (Сообщение 2). Измерение иммуносупрессии организма. «Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии», № 4,2014, с. 57-62.

5.Сухинин A.A., Виноходова М.В. Метод коли-клиренса (Сообщение 3). Измерение стимулирующего действия иммунотропных препаратов. «Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии», № 4, 2014, с. 63-67.

ó.Vinokhodova М., Sukhinin A. A. Mastitis monitoring in the Lomonosovski district of the Leningrad region. //Lactation research in mammals and humans: The mammary gland in health and disease. Uppsala, Sweden, 2010. - p 42.

Подписано в печать 10.04.2015. Формат 60x84 '/16. Бумага офсетная. Гарнитура Times. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,00. Тираж 100 экз. Заказ № 003.

Отпечатано в Издательстве ВВМ 198095, Санкт-Петербург, ул. Швецова, 41