Диссертации » Общая биология » Генетика

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Определение и анализ регуляторных районов гена XIST полевки Microtus Rossiaemeridionalis
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Определение и анализ регуляторных районов гена XIST полевки Microtus Rossiaemeridionalis"

4841760

ОРИЩЕНКО КОНСТАНТИН ЕВГЕНЬЕВИЧ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ И АНАЛИЗ РЕГУЛЯТОРНЫХ РАЙОНОВ ГЕНА А757 ПОЛЕВКИ М1СЯОТШ ROSSIAEMERIDIONALIS

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2011

21;.;;.? гон

4841765

Работа выполнена в лаборатории эпигенетики развития Учреждения Российской академии наук Института цитологии и генетики Сибирского отделения РАН, г. Новосибирск.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор,

Закиян С.М.

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор,

Меркулова Т.Н.

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

доктор биологических наук, Дсмаков С.А.

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск

Ведущее учреждение: Институт биологии гена РАН,

г. Москва

Защита диссертации состоится « 6 2011 г. на утреннем заседании

диссертационного совета Д 003.011.01 по Защите диссертаций на соискание учёной степени доктора наук в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г.Новосибирск, проспект ак.Лаврентьева, д. 10, т. (383)363-49-06, факс. (383)333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан « МЛ^Т^ 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук — Хлебодарова 'Г.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из наиболее интересных и актуальных проблем современной генетики развития являются механизмы компенсации дозы генов Х-хромосомы. У самок млекопитающих компенсация дозы генов, сцепленных с Х-хромосомой, осуществляется за счет инактивации одной из двух эквивалентных хромосом. Инактивация Х-хромосомы - это сложный процесс, который начинается в раннем эмбриогенезе и его условно принято разделять на несколько стадий: 1) стадия инициации, на которой происходит подсчет числа Х-хромосом относительно диплоидного набора аутосом, выбор будущей неактивной Х-хромосомы и инициация инактивации; 2) стадия распространения неактивного состояния по Х-хромосоме; 3) стадия поддержания неактивного состояния.

Инактивация Х-хромосомы контролируется определенным генетическим локусом, получившим название - центр инактивации. Данный локус содержит ряд генетических элементов, важнейшими из которых являются антисмысловые гены Xist и Tsix. Предполагается, что ключевым в процессе инактивации является ген Xist - X-Inactivate Specific Transcript. Он экспрессируется только на неактивной Х-хромосоме и кодирует длинную нетранслируемую ядерную РНК. Xist РНК накапливается на Х-хромосоме, с которой она считывается, приводя к её гетерохроматинизации и транскрипционной инактивации практически всех расположенных в ней генов (Brockdorff, 1998). В свою очередь, ген Гз/х является важнейшим регулятором экспрессии Xist (Lee, Lu, 1999).

Ключевое место в регуляции экспрессии генов занимает процесс транскрипции. Транскрипция генов контролируется набором регуляторных элементов (последовательностями ДНК), с которыми взаимодействуют разнообразные регуляторные белки. Наиболее важным элементом является минимальный промотор, который представляет собой минимальную последовательность ДНК, необходимую и достаточную для сборки преинициаторного комплекса и инициации транскрипции гена. Минимальный промотор включает точку старта транскрипции и прилегающую к ней область размером от 100 до 250 п.н., в зависимости от набора образующих его элементов. Вблизи, по обе стороны от минимального промотора, располагаются проксимальные элементы, которые модулируют транскрипцию. Дополнительно процесс транскрипции контролируется дистальными элементами. К регуляторным элементам такого типа относят энхансеры, сайленсеры и инсуляторы, которые могут располагаться на произвольном расстоянии как в 5'-, так и в 3'-областях генов. Таким образом, набор определенных регуляторных элементов и взаимодействие с ними белков формирует паттерн экспрессии генов в онтогенезе и определяет тканеспецифичность их экспрессии. Поэтому важное значение имеют исследования, направленные на идентификацию отдельных регуляторных элементов в различных генах, изучение их действия и определение транскрипционных факторов, связывающихся с этими элементами. В связи с этим, идентификация районов, регулирующих транскрипцию гена Xist и определение способа их действия, позволит раскрыть механизмы его экспрессии и поможет лучше понять процесс инактивации Х-хромосомы в целом.

Привлекательной моделью для изучения инактивации Х-хромосомы являются обыкновенные полевки рода Microtus. Это третий после мыши и человека объект, на котором проводятся систематические исследования процесса инактивации. Однако, в отличие от традиционных объектов, полевки обладают рядом интересных особенностей. В частности, у межвидовых гибридов обыкновенных полевок обнаружена неслучайная инактивация Х-хромосомы, что делает их уникальной моделью для изучения факторов, ответственных за выбор неактивной Х-хромосомы. Отличия в нуклеотидных последовательностях центра инактивации и цитологические различия Х-хромосом (размеры, наличие блоков гетерохроматина, положение центромеры) у разных видов полевок позволяют использовать межвидовые гибриды для наблюдения за судьбой будущих активной и неактивной Х-хромосом на молекулярном и цитологическом уровнях (Zakian etal., 1987).

В настоящей работе проведена детальная молекулярно-генетическая характеристика регуляторного района гена Xist у обыкновенной полевки Microtus rossiaemeridionalis. Кроме этого, исследовано влияние однонуклеотидной замены -43G/A в минимальном промоторе гена Xist на неслучайную инактивацию Х-хромосомы у межвидовых гибридов обыкновенных полевок.

Цель и задачи исследования.

Цель данной работы заключалась в исследовании структурно-функциональной организации 5'-регуляторной области гена Xist у полевки Microtus rossiaemeridionalis.

Для её достижения были поставлены следующие задачи:

1. Идентифицировать районы связывания транскрипционных факторов в регуляторной области гена Xist при помощи метода in vitro футпринтинга с ДНКазой I.

2. Провести компьютерный анализ полученных районов и определить транскрипционные факторы, которые потенциально могут взаимодействовать с этими районами.

3. Определить регуляторный потенциал различных частей 5'-области гена Xist в составе репортерных конструкций.

4. Изучить влияние замены -43G/A в минимальном промоторе гена Xist на процесс неслучайной инактивации Х-хромосомы у межвидовых гибридов обыкновенных полевок.

Научная новизна исследования.

В настоящей работе впервые проведен системный анализ 5'-регуляторного района гена Xist. Показано, что в данном районе располагаются две консервативные последовательности, которые могут быть ключевыми в процессе регуляции экспрессии гена Xist. Молекулярно-генетический анализ позволил идентифицировать области, которые могут оказывать позитивное и негативное влияние на экспрессию Xist полевки Microtus rossiaemeridionalis, а также определить транскрипционные факторы, которые потенциально могут взаимодействовать с этими участками. Полученные результаты имеют существенное значение для понимания механизмов экспрессии гена Xist и всего процесса инактивации Х-хромосомы в целом.

Теоретическая и практическая значимость исследования.

Результаты данной работы расширяют знания о молекулярно-генетических механизмах регуляции экспрессии гена А'к/ и, следовательно, процесса инактивации Х-хромосомы у самок млекопитающих. Полученные в работе результаты используются в качестве материала при чтении спецкурса «Новейшие молекулярно-генетические технологии» в Новосибирском государственном университете.

Основные положения работы, выносимые на защиту.

1. Присутствие в 5'-области гена Х1$1 двух консервативных нуклеотидных последовательностей свидетельствует о наличии общих механизмов регуляции транскрипции этого гена у разных видов млекопитающих.

2. Транскрипция гена ХШ полевки М. го5$1аетепсИопаИз находится под контролем большого количества регуляторных элементов, среди которых ключевым является минимальный промотор, локализованный в районе -100/+67 п.н. Непосредственное участие в регуляции транскрипции X«? принимают транскрипционные факторы Бр1 и СТСР.

3. Однонуклеотидная замена -43С/А в районе локализации потенциальных сайтов связывания транскрипционных факторов АР2 и СТСР в промоторе гена

у полевки М. атаИз не влияет на его экспрессию в фибробластах.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 9 - 12 мая 2007 г.), на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2009» (Москва, 13-18 апреля 2009 г.), на Международной конференции «Хромосома 2009» (Новосибирск, 31 августа - б сентября 2009 г.), на семинарах и отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ, 2 из них в рецензируемых журналах из списка ВАК.

Вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Автор принимал личное участие в планировании, проведении и обсуждении всех экспериментов, по результатам которых написана диссертация. Биоинформационный анализ нуклеотидных последовательностей проводился совместно с к.б.н. Е.А. Елисафенко.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 3-х глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение), заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 145 страницах, иллюстрирована 18 рисунками, содержит 5 таблиц и одно приложение. Список цитируемой литературы включает 214 ссылок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе были использованы 6 линий фибробластов полевки (8(110, 8а00б, 8ас14, МаТЗ, Ма1"$, и МзЕВс?), а также линия эмбриональных фибробластов мыши (ЭФМ2). Линии 8(110, Ба006, васМ и ЭФМ2 были ранее получены в лаборатории эпигенетики развития ИЦиГ СО РАН. В ходе выполнения работы из легкого самца и самки полевки М. апаИз были получены линии Ма0 и МаГ$, соответственно. Линия МвЕОс? получена из 14 дневного эмбриона полевки М. гоязгаетепсИопаШ.

Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей выполняли с помощью пакетов программ BLAST (Altschul et al., 1990), FASTA (Pearson, Lipman, 1988), mVista (Frazer et al., 2004), PipMaker (Schwartz et al., 2000), и CLUSTALW2 (Larkin et al., 2007). Поиск потенциальных сайтов связывания транскрипционных факторов осуществляли при помощи программ Matlnspector (Cartharius et al., 2005) и Match™ (Wingender et al., 2001).

Для выделения белковых экстрактов из ядер использовали набор реактивов CelLytic™ NuCLEAR™ Extraction kit (SIGMA). Белковые экстракты выделяли согласно протоколу производителя и хранили при температуре -70°С.

Реакции in vitro футпринтинга с ДНКазой I проводили согласно инструкции из набора реактивов Core Footprinting System (Promega). В качестве ДНК-пробы использовали ПЦР-продукт, меченый 32Р с одного 5'-конца. Реакции связывания осуществляли с ядерным белковым экстрактом, выделенным из фибробластов самки полевки Microtus rossiaemeridionalis линии SdlO. Продукты реакций после ■очистки и осаждения анализировали в 4-6% денатурирующем полиакриламидном геле.

Для получения репортерных конструкций различные части 5'-регуляторной области гена Xist были амплифицированы с помощью праймеров, содержащих сайты рестрикции. Затем эти фрагменты были клонированы в вектор pGL 4.10[luc2] (Promega), перед геном люциферазы, не имеющим промотора. Регуляторный потенциал репортерных конструкций оценивался в фибробластах линий: SdlO, SaOOó, Sad4, Mafc?, Maf$, MsEßc? и ЭФМ2. Для трансфекции клеток использовали Lipofectamine 2000 (Invitrogen), трансфекцию проводили согласно инструкции производителя реагента. Детекцию люциферазной активности осуществляли через 48 часов после трансфекции с помощью набора реактивов Dual-Luciferase® Reporter Assay System (Promega) согласно протоколу производителя. Для измерения люциферазной активности использовали многофункциональный счетчик-анализатор Wallac 1420.

Процедура иммунопреципитации хроматина была адаптирована из протокола к набору реагентов Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Assay Kit (Millipore). Иммунопреципитацию проводили с использованием антител к транскрипционному фактору CTCF (Upstate, Lot # 30504) и транскрипционному фактору Nanog (Chemicon, Cat. № АВ9220).

• В экспериментах по гель-ретардации использовали метод, адаптированный из протокола Gel Shift Assay System (Promega) и процедуры, описанной в работе (Renda et al., 2007).

Для бисульфитной обработки геномной ДНК использовался набор реактивов EpiTect Bisulfite Kit (QIAGEN). Для наработки продукта ПЦР, при использовании в качестве матрицы модифицированной бисульфитной обработкой ДНК, применяли метод ПЦР с вложенными праймерами (Nested-PCR).

Субклонирование продуктов Nested-PCR осуществляли с помощью набора реактивов pGEM-T Easy Vector System (Promega). После трансформации клеток Е. coli, клонированные фрагменты индивидуальных клонов амплифицировали в ПЦР и затем секвенировали.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Сравнительный анализ ортологичных последовательностей 5'-регуляторной области гена Xist млекопитающих

При сравнении нуклеотидных последовательностей 5'-областей гена Xist полевки Microtus rossiaemeridionalis и других видов млекопитающих было установлено, что гомология всего исследованного района -2.5/+0.2 т.п.н. составляет около 50%. Причем выше -1 т.п.н. относительно точки старта транскрипции Xist, гомология нуклеотидной последовательности между полевкой и другими млекопитающими полностью отсутствует (рис. 1). Это можно объяснить тем, что в данной области у полевки произошли встройки четырех мобильных элементов типа SINE (два элемента ID_B1 и два Bl_Mur4), а также трех LINE элементов (L1PREC1, Ll_Mur2_orf2 и L1-5 EC), которые характерны только для полевки.

При более детальном анализе района от -1 т.п.н. до +0.2 т.п.н. с использованием программного обеспечения (mVista), позволяющего определять локальные консервативные последовательности ДНК, были идентифицированы два наиболее консервативных района: CNS1 и CNS2 (Conservative noncoding sequence) (рис. 1).

¡OOS

»N 1004

SOS IMS

SOS

loos

loos sos

2 тп.ж.

Xist

между полевкой и другими видами млекопитающих. График построен с помощью программного обеспечения mVista на основе множественного выравнивания последовательностей полевки, коровы, кролика, собаки, лошади и человека. В качестве референсной использована последовательность полевки. На оси абсцисс приведена разметка 5'-района гена Xist каждого из млекопитающих, высота пиков на оси ординат отражает уровень гомологии последовательности каждого из видов с последовательностью полевки в диапазоне от 50% до 100%. Районы, гомологичные на 70% и более, обозначены красным цветом в 5'-области и синим в первом экзоне (Параметры, использованные для построения графика: Cale Window - 20 п.н., Min Cons Width - 20 п.н.). Красными и зелеными прямоугольниками обозначены LINE и SINE элементы, соответственно.

Район CNS1 располагается в минимальном промоторе в позиции -73/-44 п.н. (рис. 1). Уровень гомологии этого района варьирует от 73% между полевкой и лошадью до 97% между коровой и собакой. В среднем уровень гомологии между

Mlcrom njsllaemertdlonalu ¡j i,(;l[i orC

L1PRIC1 ID BI B1 Miu4 ~ "" ID B1 Ll 5 EC B1 Мш4 _ _ C\V.' _ CNSl^L

Bos taurus I - * Л* л Л 1. А 1 л >1 JA L~T1 Ai лЬ.мМ №

Orctolagus cuntculus \ Л ,IUU .. М

Cants famtliaris Л i *АА ll Mlrt Ад Л к

Equus cabahts 1 i АдА i Л ll д д. кьлА IVumj1 i.Aiñ \ifit

Homosapiens i i г АЛ Г, Uli HL Л.Л , А 1 ifVuu ikiv

-2,5гл.н -2гп.н -1.5 т пн -1 тп a -0.5 тп н *1пл. +0.

Рис. 1. Гомология 5'-регуляторной области и части первого экзона гена

всеми видами составляет 84%. Такой высокий уровень гомологии нуклеотидной последовательности в некодирующей части гена указывает на то, что этот район, скорее всего, является функционально-важным для регуляции экспрессии гена Xist.

Район CNS2 располагается в позиции -540/-498 п.н. относительно точки старта транскрипции гена Xist у полевки (рис. 1). Уровень гомологии этого района варьирует от 74% между последовательностями человека и кролика до 93% между последовательностями человека и собаки. В среднем уровень гомологии между всеми изученными видами составляет 79%.

Таким образом, в результате проведенного сравнительного анализа 5'-последовательностей гена Xist разных видов млекопитающих были идентифицированы два наиболее консервативных района (CNS1 и CNS2), в которых могут располагаться сайты связывания транскрипционных факторов, регулирующих экспрессию гена Xist.

Определение потенциальных регуляторных элементов в промоторном районе гена Л1st с помощью in vitro футпринтинга и компьютерного анализа нуклеотидных последовательностей

Для того, чтобы определить участки ДНК, с которыми взаимодействуют регуляторные белки, консервативный район CNS1 и прилегающие к нему нуклеотидные последовательности (промоторный район Xist) были исследованы с помощью метода in vitro футпринтинга с ДНКазой I.

В реакциях связывания использовали радиоактивно-меченый фрагмент ДНК, содержащий промоторный район гена Xist (позиции -267/+54 п.н.), и ядерные белковые экстракты, выделенные из перевиваемой клеточной культуры фибробластов линии SdlO. Чтобы определить, с какой именно последовательностью ДНК взаимодействуют белки, параллельно реакциям связывания, проводили секвенирующие реакции по методу Максама-Гилберта. В результате этих экспериментов в промоторном районе были идентифицированы девять защищенных участков на кодирующей цепи «+» ДНК (рис. 2А и Б) и шесть на некодирующей «-» цепи (рис. 2В). Эти участки (футпринты) не подвергаются расщеплению ДНКазой I за счёт того, что с ними связываются белки.

Чтобы определить потенциальные сайты связывания транскрипционных факторов (ПССТФ) в районах футпринтов, нуклеотидная последовательность промоторного района гена Xist полевки, была исследована при помощи компьютерного анализа. В результате были идентифицированы 143 таких сайта. Так, например, удалось установить, что третьему (III) защищенному участку на «+» цепи ДНК и первому (1) защищенному участку на «-» цепи ДНК (последовательность Т-Т-Т-А-А-А) соответствует ПССТФ ТВР (TATA binding protein), который классически располагается на 25 п.н. выше точки старта транскрипции Xist.

Защищенные участки IV и V на «+» цепи и 2 на «-» цепи ДНК располагаются в консервативном районе CNS1, который представляет наибольший интерес в промоторе. Защищенному участку IV соответствует ПССТФ АР-2 (Activator protein 2), который способен взаимодействовать с GC-богатыми

последовательностями и активировать транскрипцию многих генов в геноме (Eckert et al., 2005).

А Б В Г Д Е

GC?C?C kl kl G С? k 12 k 1 2 Go kl2 GC> kl

«+»цепь «+»цепь «-»цепь «+»цепь «-»цепь

Рис. 2. Связывание белков с последовательностями в регуляторной области гена Xist полевки Мсто/ий го8з1аетепс1юпаИз. А-В - футпринтинг промоторного района Х/'э? полевки (-267/+54 п.н.), Д и Е - футпринтинг района -551/-372 п.н. (СЫЭ2 и прилегающие к нему последовательности). В реакциях связывания использовали ядерные белковые экстракты: 1-5 мкг, 2-10 мкг. Г -связывание рекомбинантного транскрипционного фактора ЭР1 человека (1 мкг белка) с его сайтом в промоторе X¡st 1 и 2 - реакции связывания проводили с 1 и 2 мкп матрицы, соответственно, к - контрольные реакции без добавления белков. С, в+А, С+Т, С - соответствующие реакции секвенирования по методу Максама-Гилберта. Линиями и цифрами обозначены защищенные от ДНКазы I участки ДНК, с которыми взаимодействуют белки.

Рядом с ПССТФ АР-2 располагаются V и 2 защищенные участки, в которых выявляются ПССТФ и ВТЕВЗ. Близкое расположение сайтов связывания

транскрипционных факторов SP1 и АР2, по-видимому, является функционально важным. Несмотря на то, что эти факторы могут по отдельности эффективно активировать транскрипцию целевых генов, наличие в промоторном районе обоих сайтов связывания приводит к еще большему усилению процесса транскрипции (Zhou, Chiang, 2002).

Помимо ядерных белковых экстрактов, в реакциях связывания был использован рекомбинантный транскрипционный фактор SP1 человека. Полной защиты района связывания этого фактора от действия ДНКазы I не выявлено (рис. 2Г), однако происходит уменьшение интенсивности полос и появление дополнительной полосы на границе сайта связывания, что свидетельствует о непосредственном взаимодействии фактора SP1 с этим районом. Необходимо отметить, что этот участок ДНК полностью соответствует пятому (V) на «+» цепи и второму (2) на «-» цепи ДНК защищенным участкам (рис. 2А и В), идентифицированным в реакциях футпринтинга с использованием белкового экстракта. Также известно, что мутации в гомологичном сайте связывания фактора SP1 в репортерных конструкциях, содержащих минимальный промотор гена Xist человека, приводят к значительному снижению их активности (Hendrich et ai, 1997). Таким образом, можно сделать вывод, что транскрипционный фактор SP1 способен in vitro связываться с GC-богатым районом -74/-54 п.н. в минимальном промоторе у полевки Microtus rossiaemeridionalis и, по всей видимости, является важным регуляторным элементом, активирующим экспрессию гена Xist.

Защищенный участок 4 (позиции -103/-97 п.н.) перекрывается с каноническим ПССТФ NFY, которому соответствует консенсусная последовательность ССААТ в позиции -105/-101 п.н. в промоторе Xist полевки. Защищенные участки VIII и 6 находятся в довольно необычном районе. В области -175/-110 п.н. относительно точки старта транскрипции гена Xist у полевки идентифицировано очень большое количество потенциальных сайтов связывания различных транскрипционных факторов (всего - 91 сайт, тогда как в среднем в последовательностях такой длины выявляется не более 30 сайтов). Из них 57 соответствуют ПССТФ, содержащих гомеодомен, и 19 соответствуют ПССТФ, имеющим POU-гомеодомен. Это объясняется наличием в этом районе двух коровых последовательностей АТТА в позициях -156/-153 п.н. и -140/-137 п.н., к которым максимальное сродство имеют белки, имеющее в своем составе гомеодомен.

Первому (I) и второму (II) защищенным участкам соответствуют ПССТФ AML1 (Runxl) и E2F, НОХА9, соответственно. Защищенный участок VI содержит ПССТФ NFAT5 и E2F, а участок - 3 перекрывается с ПССТФ SP2 и SM ARC A3. С VII и 5 защищенными участками частично перекрывается ПССТФ Octl, а в состав последнего защищенного района - IX, входят ПССТФ HSF1 и TCF11/MAFG.

Определение потенциальных регуляторных элементов во втором консервативном районе (CNS2) и в прилегающих к нему последовательностях с помощью in vitro футпринтинга и компьютерного

анализа

Помимо промотора, методом футпринтинга с ДНКазой I также был исследован второй консервативный район (CNS2) и прилегающие к нему последовательности. В реакциях связывания использовался радиоактивно-меченый фрагмент ДНК -551/-372 п.н. относительно точки старта транскрипции гена Xist и ядерный белковый экстракт, выделенный из перевиваемой культуры фибробластов полевки линии SdlO. В результате в этом районе на «+» и «-» цепях ДНК было идентифицировано девять и пять защищенных от расщепления ДНКазой I участков, соответственно (рис. 1Д и Е).

Компьютерный анализ нуклеотидной последовательности позволил определить ПССТФ, которые перекрываются с защищенными участками ДНК. Во втором консервативном районе (CNS2) находятся три таких участка: VII, VIII и 1. 1 и VII районы содержат ПССТФ STAT3 и HMGA1. Первый (I) защищенный участок на «+» цепи ДНК и пятый (5) на «-» цепи перекрываются с ПССТФ NFAT, NMP4 и RAR_RXR. Защищенные участки VI и 2 частично перекрываются с ПССТФ Znf217 (Zink finger protein 217), который в результате взаимодействия с корепрессором CtBP (C-terminal binding protein) подавляет экспрессию целевых генов (Quinlan et al., 2006). Защищенному участку V в позиции -469/-463 п.н. соответствуют ПССТФ RAR_RXR, а также ПССТФ RORA2, GR, ESRRB и AR. С IV защищенным участком перекрывается ПССТФ ERa и частично перекрываются потенциальные сайты факторов NFY и SATB1.

Транскрипционные факторы GR (Glucocorticoid receptor), ESRRB (Estrogen-related receptor beta), AR (Androgen receptor), а также ERa (Estrogen receptor alpha), относятся к одному суперсемейству ядерных рецепторов. Эти рецепторы локализуются в цитоплазме и при взаимодействии с соответствующим гормоном, посредством активного транспорта перемещаются в ядро, где активируют или подавляют экспрессию генов (Biddie et al., 2010). Так как эмбриональные фибробласты, из которых были выделены ядерные белки, не обрабатывались гормонами, то защищенные участки IV и V, по всей видимости, соответствуют сайтам связывания других транскрипционных факторов. Несмотря на это, ПССТФ ядерных рецепторов ERa и ERRB представляют особый интерес в связи с тем, что в ходе раннего эмбрионального развития, со стадии бластоцисты, во всех клетках начинают экспрессироваться эстрогеновые рецепторы, а эстрогены являются ключевыми гормонами в процессе имплантации бластоцисты в матку (Gorski, Нои, 1995). Так как случайная инактивация Х-хромосомы осуществляется примерно на стадии имплантации (Sado, Ferguson-Smith, 2005), то можно предположить, что эстрогены, связываясь с соответствующими рецепторами, могут напрямую или опосредованно участвовать в регуляции экспрессии гена Xist, либо других генов, необходимых для инактивации Х-хромосомы. Также интересным является тот факт, что недавно идентифицированный индуктор инициации инактивации Х-хромосомы - ЕЗ убиквитин-лигаза Rnfl2, является кофактором ERa. Rnfl2 выполняет функцию коактиватора и, соответственно, повышает уровень транскрипции

эстроген-чувствительных генов (Johnsen et al., 2009). Поэтому, если Xist относится к таким генам, можно предположить, что инициация инактивации X-хромосомы на стадии имплантации осуществляется за счет активации транскрипции Xist посредством комплекса Rnfl 2 и ERa.

Защищенный участок III перекрывается с ПССТФ СЕВРА (CCAAT/enhancer-binding protein alpha), который является активатором. Защищенные участки 3 и 4 на «-» цепи ДНК и II на «+» цепи перекрываются с ПССТФ SRY. Потенциальные сайтов связывания ТФ, перекрывающиеся с VIII и IX защищенными участками ДНК, идентифицировать не удалось. Возможно, им соответствуют не обнаруженные на данный момент регуляторные белки.

Таким образом, с помощью in vitro футпринтинга и компьютерного анализа были определены участки ДНК и транскрипционные факторы, которые потенциально могут с ними взаимодействовать. На основе имеющихся в литературе данных можно оценить возможное влияние на экспрессию Xist некоторых транскрипционных факторов, потенциальные сайты связывания которых были обнаружены в защищенных участках. Так, например, белки HMGA1 и SATB1/SATB2, относящиеся к «структурным» факторам, по всей видимости, могут принимать участие в создании специфической структуры хроматина на будущих активной и неактивной Х-хромосомах, формируя платформу для связывания остальных транскрипционных факторов. В свою очередь, транскрипционные факторы NMP4, NFY и СЕВРА могут выполнять функцию активаторов, a Znf217 может быть репрессором в дифференцированных типах клеток. Регуляторные факторы RARRXR, AR, GR, RORA и ERa/Rnfl2 могут участвовать в активации транскрипции Xist на стадии инициации инактивации в не дифференцированных клетках.

Функциональный анализ 5'-регуляторной последовательности гена Xist полевки Microtus rossiaemeridionalis

Регуляторный потенциал различных частей 5'-области гена Xist полевки, в состав которых входят выявленные районы футпринтов и ПССТФ, был исследован методом репортерных конструкций (рис. 3).

Анализ активности серии репортерных конструкций с последовательным увеличением фрагмента ДНК 5'-области тепа. Xist на 50 п.н. показал, что в случае конструкций pCxl и рСх2, содержащих районы -1/+67 п.н. и -50/+67 п.н., соответственно, экспрессия репортерного гена люциферазы соответствует фоновым значениям (рис. 3). Это указывает на то, что регуляторные элементы, располагающиеся в районе -50/+67 п.н. (ПССТФ ТВР, АР2, E2F, AML1 и YY1), не являются достаточными для активации репортерного гена и, соответственно, транскрипции гена Xist.

В конструкции рСхЗ ген люциферазы находится под контролем фрагмента ДНК -100/+67 п.н. из 5'-района гена Xist. В этом случае добавление 50 п.н. с 5'-конца, по сравнению с конструкцией рСх2, приводит к активации экспрессии репортерного гена люциферазы практически до максимального уровня ~ 60 o.e. (Р>0,999) (рис. 3), то есть, по-видимому, эти 50 п.н. (-100/-50 п.н.) важны для обеспечения транскрипции г та Xist полевки. Необходимо отметить, что в состав этого фрагмента полностью входит первый консервативный район CNS1 (позиции -73/-44 п.н.), а также защищенный участок V, с которым связывается

транскрипционный фактор ЭР 1 (рис. 2Г). Помимо этого, в районе -100/+67 п.н. расположены ПССТФ 8Р2, 8МАЯСАЗ, №АТ5 и Е2Р, которые также могут участвовать в активации транскрипции гена Хкг.

-1453-—

-1453—

Рис. 3. Анализ активности репортерных конструкций. Сверху представлена схема 5'-области гена Xist, прямоугольниками обозначены консервативные районы CNS1 и CNS2. рСх1-рСх14Ме - варианты репортерных конструкций в векторе pGL4.10[luc2], слева обозначены нуклеотидные позиции относительно точки старта транскрипции гена Xist. На диаграмме отражена относительная люциферазная активность конструкций в перевиваемой культуре фибробластов линии Sd10. Стрелкой обозначена точка старта транскрипции Xist, черными точками - метилированные конструкции, O.E. - относительные единицы активности люциферазы. Достоверность различий: *** - Р>0.999, ** - Р>0.99, * -Р>0.95.

В случае репортерных конструкций с делецией фрагмента -190/+67 п.н. (рСх18 и рСх19), то есть с делецией промотора, репортерный ген не экспрессируется. Это говорит о том, что в этом районе располагаются элементы, без которых транскрипция гена Xist невозможна. Таким образом, на основании данных экспериментов можно сделать вывод, что минимальная последовательность, необходимая для активации гена Xist полевки, то есть минимальный промотор, локализуется в области -100/+67 п.н. и фактор SP1, сайт связывания которого входит в состав CNS1, является одним из его элементов.

Большую часть из полученных репортерных конструкций можно разделить на два класса: содержащие район -4/+67 п.н. относительно точки старта Xist (рис. 3, pCxl-pCxl4) и несущие делецию этого района (рСх15-рСх17). Люциферазная активность всех конструкций, в состав которых входит данный район, как минимум вдвое больше, активности конструкций с его делецией (активность рСх5 в 2,5 раза больше, чем рСх15 (Р>0,999), рСх!3 в 15 раз активнее рСх16 (Р>0,999), а рСх14 в 6 раз активнее рСх17 (Р>0,999)). На основе этих экспериментов можно сделать вывод, что в районе -4/+67 п.н. располагается элемент или элементы, активирующие транскрипцию гена Xist. Среди ТФ,

которые потенциально могут связываться с этим районом, вероятнее всего, элементом промотора является фактор YY1. Этот фактор может связываться с Inr-элементом в точке старта транскрипции, способствуя её точной и правильной инициации, что согласуется с литературными данными (Hendrich et al, 1997).

Среди всех конструкций, содержащих 5'-область гена Xist полевки размером более 100 п.н., увеличение длины исследуемого участка ДНК на 50 п.н., приводило к увеличению уровня экспрессии репортерного гена только в случае конструкций рСхб (на 27 ед., Р>0,999), рСх9 (на 31 ед„ Р>0,999) и рСх!2 (на 23 ед., Р>0,999). В свою очередь, уменьшение уровня экспрессии репортерного гена происходило в случае конструкций рСх4 (на 20 ед., Р>0,99), рСх7 (на 38 ед., Р>0,999) и pCxl 1 (на 34 ед., Р>0,999) (рис. 3). Из этого следует, что в районах -100/-150 п.н., -250/-300 п.н. и -450/-500 п.н., могут располагаться репрессоры или сайленсеры транскрипции, а в районах -200/-250 п.н., -350/-400 п.н. и -500/-550 п.н., могут находиться активаторы или энхансеры транскрипции тепа Xist.

Роль замены -43G/A в промоторном районе гена Xist при неслучайной инактивации Х-хромосомы у межвидовых гибридов обыкновенных полевок

Одной из уникальных особенностей полевок рода Microtus является неслучайная инактивация Х-хромосомы у самок межвидовых гибридов. А именно, у гибридов М. arvalis с М. rossiaemeridionalis, М. arvalis с М. transcaspicus, и М. arvalis с М. kirgisorum, в 80-90% клеток Х-хромосома, унаследованная от М. arvalis, остается активной (Zakian et al., 1987). Механизм неслучайной инактивации не ясен, однако, одной из причин этого может быть различный уровень транскрипции аллелей гена Xist.

В минимальном промоторе у М. arvalis обнаружена замена гуанина (G) на аденин (А) в позиции -43 п.н. Важно отметить, что мутация -43C/G в промоторе гена Xist у мыши и человека приводит к преимущественной инактивации X-хромосомы, несущей мутацию, а мутация -43С/А, наоборот, приводит к тому, что с более высокой частотой инактивируется нативная Х-хромосома. Это объясняется тем, что -43C/G мутация вызывает значительное увеличение эффективности связывания транскрипционного фактора CTCF, что, в свою очередь, приводит к более высокому уровню транскрипции гена Xist, а эффект мутации -43С/А противоположный (Pugacheva et al., 2005).

Рис. 4. ПЦР-анализ ДНК из иммунопреципитатов, полученных с использованием антител к

транскрипционным факторам CTCF, Nanog, без антител (no Ab). Input - продукты амплификации с матрицы фрагментирован-ной геномной ДНК. В ПЦР использовали специфичные пары праймеров к минимальному промотору гена Xist (верхняя панель) и инсулятору в локусе Igf2/H19 (нижняя панель, положительный контроль).

Для того, чтобы определить взаимодействует ли фактор CTCF с минимальным промотором гена Xist полевки in vivo, был использован метод иммунопреципитации хроматина (СЫР). Эксперименты проводили на линии

Xist |

Н19

Дммеры праймеров

фибробластов полевки SdlO. Как видно из рисунка 4, ПЦР-продукт ожидаемого размера образуется только в случае амплификации с матрицы ДНК, полученной в результате иммунопреципитации с антителами к CTCF. Таким образом, можно сделать вывод, что транскрипционный фактор CTCF связывается in vivo с минимальным промотором гена Xist.

Для того, чтобы определить с каким именно аллелем активной или неактивной Х-хромосомы связывается CTCF, в дальнейшем анализе были использованы две гибридные клеточные линии фибробластов: Sa006 и Sad4 (в каждой из них одна Х-хромосома от М. rossiaemeridionalis, а другая от М. arvalis). Эти линии получены в результате субклонирования, цитологическими и молекулярными методами ранее было показано, что в культуре Sa006 неактивной является Х-хромосома М. rossiaemeridionalis, а в Sad4 неактивная X-хромосома М. arvalis. Связывание фактора CTCF с промотором Xist было проанализировано методом ChIP в обеих линиях. После секвенирования ПЦР продуктов было обнаружено, что, когда в ПЦР в качестве матрицы использовали ChIP-ДНК, выделенную из линии Sad4 с использованием антител против CTCF, то в позиции -43п.н. выявлялся гуанин, что указывало на промоторный район гена Xist активной Х-хромосомы М. rossiaemeridionalis. В аналогичных экспериментах с ChIP-ДНК из линии клеток Sa006, в позиции -43 п.н. детектировали аденин, что соответствовало промоторному району гена Xist активной Х-хромосомы М. arvalis.

Таким образом, на основании данных экспериментов был сделан вывод, что транскрипционный фактор CTCF в фибробластах полевки (как в клетках линии Sad4, так и в клетках линии Sa006) связывается in vivo с районом минимального промотора гена Xist на активной Х-хромосоме. Так как на активной X-хромосоме ген Xist не экспрессируется, то, по всей видимости, в данном случае CTCF выполняет роль либо репрессора, подавляя транскрипцию Xist, либо инсулятора, блокируя доступ удаленных энхансеров к промотору.

Необходимо отметить,. что эти результаты расходятся с данными, полученными в работе Пугачевой Е.М. с соавторами (Pugacheva et al., 2005), в которой показано, что CTCF связывается с промотором Xist на неактивной X-хромосоме у мыши и человека и выполняет функцию активатора транскрипции.

Из-за особенностей метода ChIP нельзя установить точную нуклеотидную последовательность сайта связывания, с которым взаимодействует анализируемый белок. Также методом ChIP могут детектироваться не только прямые взаимодействия определенных белков с ДНК, но и in vivo связывание исследуемого белка с другим регуляторным белком, который, в свою очередь, непосредственно контактирует с ДНК и это может быть одной из причин расхождения результатов.

Дополнительно взаимодействие CTCF фактора с минимальным промотором было исследовано методом гель-ретардации (рис. 5). В реакциях связывания использовали радиоактивно меченые ДНК-пробы и коммерческий рекомбинантный транскрипционный фактор CTCF человека.

F-II F-II V-I V-l V-II V-II

Рис. 5. Анализ связывания фактора CTCF с районом минимального промотора Xist методом гель-ретардации. ДНК-проба Pmin представляет собой меченный Р32 ПЦР-продукт, соответствующий району -111/+27 п.н. относительно точки старта Xist полевки. ДНК-пробы V-I и V-II представляют собой двуцепочечные олигонуклеотиды, содержащие участки в промоторе Xist -61/17 п.н. и -49/-5 п.н., соответственно. F-II -ДНК-проба, содержащая консенсусный сайт связывания CTCF. «+» - обозначает дорожки с ДНК-пробами, инкубированными с фактором CTCF, «-» - без CTCF. Стрелкой обозначен специфичный комплекс, образующийся в результате связывания CTCF и ДНК-пробы F-II.

Как видно из рисунка 5, CTCF формирует специфичный комплекс только с контрольной ДНК-пробой (F-II), а в случае ДНК-проб, содержащих различные участки промотора полевки (V-I, V-II) и минимальный промотор целиком (Pmin), специфичных комплексов не образуется. Поэтому можно сделать вывод, что транскрипционный фактор CTCF непосредственно не связывается in vitro ни с районом замены, ни с другими последовательностями в минимальном промоторе Xist полевки.

Данные о том, что CTCF не связывается непосредственно с нуклеотидной последовательностью промотора Xist полевки дополнительно подтверждаются результатами анализа уровня метилирования CpG сайтов в 5'-области гена Xist методом бисульфитного секвенирования в фибробластах полевки линий Sa006 и Sad4 (рис. 6). Как уже ранее упоминалась, замена -43G/A позволяет раздельно анализировать аллели М. rossiaemeridionalis и М. arvalis.

БаООб _ Sad4

\ ' i

|

_ л': i i

i •

ш

Xi

Ха

Ха

Xi

Рис. 6. Анализ метилирования 5'-регуляторной области гена Х/э/ в фибробластах полевки линий ЭаООб и Sad4. Белыми кружками обозначены неметилированные СрС сайты, черными - метилированные, стрелкой - точка старта транскрипции. Ха - активная Х-хромосома, XI - неактивная X-хромосома, М.г. - Мюго^в гозБ/аетепсИопаИз.

Из рисунка 6 видно, что в линии БаООб аллель М. дгуа/и гиперметилирован (90±3% из проанализированных Срв динуклеотидов метилированы), а аллель М rossiaemeridionalis гипометилирован, то есть только 3±3% Срй сайтов

метилированы. Напротив, в фибробластах линии Sad4 аллель M. arvalis гипометилирован, а аллель M. rossiaemeridionalis гипермегилирован, то есть 1±1% и 87±5% CpG сайтов метилированы, соответственно. Эти результаты хорошо согласуются с литературными данными о том, что метилирование CpG динуклеотидов практически полностью подавляет связывание CTCF с его целевыми сайтами (Kanduri et al., 2000). Таким образом, можно сделать вывод, что фактор CTCF связывается in vivo с промотором гена Xist полевки на активной Х-хромосоме, но не напрямую, а посредством другого белка, за счет белок-белковых взаимодействий.

Функциональная значимость замены -43G/A была проанализирована на культуре фибробластов самки полевки М. rossiaemeridionalis (линия SdlO) с помощью двух репортерных конструкций (pCx-43G и рСх-43А), содержащих ген люциферазы под контролем района -1453/+67 п.н. из промотора гена Xist полевки (рис. 7). Полученные конструкции различаются однонуклеотидной заменой G/A в позиции -43 п.н.

pCx-43G S 0109

CNS1 .

-qü

CNS2

-1453

-1453

1 Luciferase ;

рСх-43А

CNS2

CNS] .

—4lJ

1 Luciferase I

0 20 40 60 80 100 O.E.

Рис. 7. Анализ влияния замены -43G/A на активность репортерных конструкций. Слева представлены схемы конструкций pCx-43G и рСх-43А, прямоугольниками обозначены консервативные районы CNS1 и CNS2. Справа на диаграмме отражена относительная люциферазная активность конструкций в перевиваемой культуре фибробластов линии Sd10. Стрел кой обозначена точка старта транскрипции Xist, O.E. - относительные единицы активности люциферазы.

Из рисунка 7 видно, что замена -43G/A не влияет на уровень экспрессии репортерного гена. При использовании для временной трансфекции других культур фибробластов (линии: MsEßc?, MafcJ, Maf2$ и ЭФМ2$) получен аналогичный результат. Поэтому можно сделать вывод, что, по всей видимости, замена -43G/A в промоторном районе гена Xist не связана с неслучайной инактивацией Х-хромосомы у межвидовых гибридов обыкновенных полевок, по крайней мере, в соматических клетках.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данная работа направлена на изучение молекулярно-генетических механизмов регуляции экспрессии гена Xist у самок млекопитающих. В ходе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей 5'-области гена Xist разных видов млекопитающих были идентифицированы два наиболее консервативных района, первый из которых располагается в промоторе, а второй примерно на 500 п.н. выше точки старта транскрипции.

При помощи метода футпринтинга и компьютерного анализа в этих районах и прилегающих к ним последовательностях было выявлено большое количество потенциальных регуляторных элементов. Функциональный анализ этих элементов показал, что абсолютно необходимым элементом для активности гена Xist является район минимального промотора (-100/+67 п.н.). Также было установлено, что часть из выявленных элементов оказывает негативное, а часть позитивное влияние на экспрессию гена Xist.

Анализ взаимодействия белка CTCF с промотором Xist полевки показал, что данный фактор in vivo связывается с промоторным районом гена Xist на активной Х-хромосоме, но не напрямую, а посредством другого белка. Также представлены факты, указывающие на то, что замена -43G/A в промоторном районе Xist полевки, по-видимому, не влияет на его экспрессию в соматических клетках.

Таким образом, описанные в работе данные позволяют лучше понять молекулярно-генетические механизмы регуляции экспрессии гена Xist и в целом процесса инактивации Х-хромосомы у самок млекопитающих.

ВЫВОДЫ

1. В результате сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей 5'-регуляторной области гена Xist шести видов млекопитающих идентифицировано два наиболее консервативных района: первый район (CNS1) располагается в минимальном промоторе гена Xist, а второй район (CNS2) локализуется в позиции -540/-498 п.н. относительно точки старта транскрипции. Методом in vitro футпринтинга с ДНКазой I в промоторном районе гена Xist у полевки Microtus rossiaemeridionalis идентифицировано девять сайтов связывания регуляторных белков на (+) цепи и шесть на (-) цепи ДНК. Во втором консервативном районе и прилегающих к нему нуклеотидных последовательностях выявлено девять и пять сайтов связывания регуляторных белков на (+) и (-) цепях ДНК, соответственно. Определены транскрипционные факторы, которые потенциально могут взаимодействовать с этими сайтами.

2. Показано связывание рекомбинантного транскрипционного фактора SP1 с районом -73/-56 п.н. в минимальном промоторе гена Xist полевки в условиях in vitro.

3. При помощи делеционного анализа установлено, что минимальный промотор гена Xist полевки локализован в области -100/+67 п.н. и район -4/+67 п.н. оказывает существенное влияние на его активность. Показано, что в районах -100/-150 п.н., -250/-300 п.н. и -450/-500 п.н., могут располагаться негативные регуляторные элементы, а в районах -200/-250 п.н., -350/-400 п.н. и -500/-550 п.н., могут находиться позитивные элементы, регулирующие транскрипцию гена Xist полевки.

4. Методом иммунопреципитйции хроматина продемонстрировано взаимодействие фактора CTCF с промоторным районом гена Xist на активной X-хромосоме in vivo. Показано, что CTCF связывается не напрямую с ДНК в промоторе Xist, а опосредованно за счет белок-белковых взаимодействий.

5. Установлено, что в фибробластах полевки замена -43G/A в минимальном промоторе гена Xist не влияет на уровень экспрессии репортерного гена в конструкциях, содержащих район -1453/+67 п.н.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Оришенко К.Е.. Елисафенко Е.А., Кель А.Э., Закиян С.М. Молекулярно-генетическая характеристика регуляторкого района гена Xist полевки Microtus rossiaemeridionalis II Генетика. 2009. Т. 45. № 7. С. 1-11. (перечень ВАК)

2. Оришенко К.Е.. Елисафенко Е.А., Закиян С.М. Роль замены G(-43)A в промоторном районе гена Xist при неслучайной инактивации Х-хромосомы у межвидовых гибридов обыкновенных полевок // Генетика. 2010. Т. 46. № 10. С. 1-4. (перечень ВАК)

3. Оришенко К.Е.. Елисафенко Е.А. Исследование регуляторной области гена Xist полевки Microtus rossiaemeridionalis. // Сборник материалов Международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии», посвященной 50-летию СО РАН. Томск. 2007. С. 133.

4. Оришенко К.Е. Определение и анализ регуляторных районов гена Xist у полевки Microtus rossiaemeridionalis // Тезисы докладов Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых ЛОМОНОСОВ - 2009. Москва. 2009. С. 98.

5. Оришенко К.Е.. Елисафенко Е.А. Структурно-функциональная организация регуляторных районов гена Xist полевки Microtus rossiaemeridionalis II Материалы Международной конференции «Хромосома 2009». Новосибирск. 2009. С. 93.

Подписано к печати 10.02.2011 г.

Формат бумаги 60 х 90 1/16. Печ. л. 1. Уч. изд. 0,7

Тираж 110 экз. Заказ 11.

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 10.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Орищенко, Константин Евгеньевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Механизмы определения пола.

1.2. Эволюция половых хромосом.

1.3. Инактивация Х-хромосомы у млекопитающих.

1.3.1. Центр инактивации (Xic).

1.3.2. Некодирующие РНК.

1.3.3. ГенXist.

1.3.4. Механизмы регуляции активности TQRa.Xist.

1.3.4.1. Регуляция активности гена Xist в процессе импринтированной инактивации Х-хромосомы.

1.3.4.2. Регуляторная область гена Xist.

1.3.4.3. Участие транскрипционных факторов, ответственных за плюрипотентностъ ЭС клеток, в регуляции экспрессии гена Xist.

1.2.4.4. Rnfl2 - сцепленный с Х-хромосомой активатор инициации инактивации Х-хромосомы.

1.3.4.5. Ген Tsix как ключевой регулятор экспрессии Xist.

1.3.4.6. Дополнительные элементы, регулирующие транскрипцию гена Xist.

1.3.5. Неслучайная инактивация Х-хромосомы.

1.3.6. Участие малых ядерных РНК в процессе инактивации Х-хромосомы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Определение и анализ регуляторных районов гена XIST полевки Microtus Rossiaemeridionalis"

Актуальность. Одной из наиболее интересных проблем современной генетики развития являются механизмы компенсации дозы генов Х-хромосомы у самок млекопитающих. У большинства млекопитающих определение пола происходит по XY системе, где самцы являются гетерогаметными (XY), а самки гомогаметными (XX). Современные половые хромосомы произошли из пары гомологичных аутосом. Их дивергенция началась с появления на будущей Y-хромосоме гена SRY, что привело к нарушению рекомбинации между Х- и Y-хромосомами по данному локусу. Подавление рекомбинации, в свою очередь, способствовало накоплению мутаций и делеций в Y-хромосоме, её последующей специализации и деградации до того состояния, в котором она находится на данный момент (Dementyeva et al., 2009; Wallis et al., 2008).

Результатом деградации Y-хромосомы стало то, что большинство генов располагающихся на Х-хромосоме присутствуют в одной копии у самцов (XY) и в двух у самок (XX). Таким образом, происходит нарушение соотношения уровней экспрессии генов Х-хромосомы и аутосом у самцов, а также генов Х-хромосомы между полами. Часть из генов, сцепленных с Х-хромосомой, являются важными для процессов, протекающих в клетке и различие в их дозе, то есть в количестве продукта, может привести к значительным последствиям для гетерогаметного пола. Поэтому считается, что для преодоления несбалансированной экспрессии генов X-хромосомы у млекопитающих в эволюции возникла сложная система дозовой компенсации. Эта система заключается в подавлении транскрипционной активности генов на одной из Х-хромосом у самок (инактивация Х-хромосомы), а также удвоении уровня экспрессии генов на единственной Х-хромосоме у самцов и второй Х-хромосоме у самок (Nguyen, Disteche, 2006). Инактивация Х-хромосомы изучается уже в течение нескольких десятилетий, однако несмотря на значительный прогресс, достигнутый за последние годы, все еще остается большое количество вопросов, касающихся молекулярных механизмов этого процесса.

Процесс инактивации Х-хромосомы условно разделяют на несколько стадий: 1) стадия инициации, на которой происходит подсчет числа Х-хромосом относительно диплоидного набора аутосом, выбор будущей неактивной Х-хромосомы и инициация инактивации; 2) стадия распространения неактивного состояния по Х-хромосоме; и 3) стадия поддержания неактивного состояния.

Инактивация Х-хромосомы контролируется определенным генетическим локусом, получившим название - центр инактивации. Данный локус содержит ряд генетических элементов, важнейшими из которых являются антисмысловые гены Xist и Tsix. Предполагается, что ключевым в процессе инактивации является ген Xist - X-Inactivate Specific Transcript. Он экспрессируется только на неактивной Х-хромосоме и кодирует длинную нетранслируемую ядерную РНК. Xist РНК накапливается на X-хромосоме, с которой она считывается, приводя к её гетерохроматинизации и транскрипционной инактивации практически всех расположенных в ней генов (Brockdorff, 1998). В свою очередь, ген Tsix является важнейшим регулятором экспрессии Xist (Lee, Lu, 1999).

Ключевое место в регуляции экспрессии генов занимает процесс транскрипции. Транскрипция генов контролируется набором регуляторных элементов (последовательностями ДНК), с которыми взаимодействуют разнообразные регуляторные белки. Наиболее важным элементом является минимальный промотор, который представляет собой минимальную последовательность ДНК, необходимую и достаточную для сборки преинициаторного комплекса и инициации транскрипции гена. Минимальный промотор включает точку старта транскрипции и прилегающую к ней область размером от 100 до 250 п.н., в зависимости от набора образующих его элементов. Вблизи, по обе стороны от минимального промотора, располагаются проксимальные элементы, которые модулируют транскрипцию. Дополнительно процесс транскрипции контролируется дистальными элементами. К регуляторным элементам такого типа относят энхансеры, сайленсеры и инсуляторы, которые могут располагаться на произвольном расстоянии как в 5"- , так и в 3"-областях генов. Таким образом, набор определенных регуляторных элементов и взаимодействие с этими элементами регуляторных белков формирует паттерн экспрессии генов в онтогенезе и определяет тканеспецифичность их экспрессии. Поэтому важное значение имеют исследования, направленные на идентификацию отдельных регуляторных элементов в различных генах, изучение их действия и определение транскрипционных факторов, связывающихся с этими элементами. В связи с этим, идентификация элементов, регулирующих транскрипцию гена Xist и определение способа их действия, позволит установить механизмы его экспрессии и поможет лучше понять процесс инактивации Х-хромосомы в целом.

Привлекательной моделью для изучения инактивации Х-хромосомы являются обыкновенные полевки рода Microtus. Это третий после мыши и человека объект, у которого проводятся систематические исследования процесса инактивации. Однако, в отличие от традиционных объектов, полевки обладают рядом интересных особенностей. В частности, у межвидовых гибридов обыкновенных полевок обнаружена неслучайная инактивация Х-хромосомы, что делает их уникальной моделью для изучения элементов, ответственных за выбор неактивной Х-хромосомы. Отличия в нуклеотидных последовательностях центра инактивации и цитологические различия Х-хромосом (размеры, наличие блоков гетерохроматина, положение центромеры) у разных видов полевок позволяют использовать межвидовые гибриды для наблюдения за судьбой будущих активной и неактивной Х-хромосом на молекулярном и цитологическом уровнях (Zakian et al., 1987).

В данной работе проведена детальная молекулярно-генетическая характеристика регуляторного района гена Xist у обыкновенной полевки Microtus rossiaemeridionalis. Кроме этого, исследовано влияние однонуклеотидной замены -43G/A в минимальном промоторе гена Xist на неслучайную инактивацию Х-хромосомы у межвидовых гибридов обыкновенных полевок.

Цель и задачи исследования.

Цель данной работы заключалась в исследовании структурно-функциональной организации 5' -регуляторной области гена Xist у полевки Microtus rossiaemeridionalis. Для её достижения были поставлены следующие задачи:

1. Идентифицировать районы связывания транскрипционных факторов в регуляторной области гена Xist при помощи метода in vitro футпринтинга с ДНКазой I.

2. Провести компьютерный анализ полученных районов и определить транскрипционные факторы, которые потенциально могут взаимодействовать с этими районами.

3. Определить регуляторный потенциал различных частей 5"-области гена в составе репортерных конструкций.

4. Изучить влияние замены -43 в/А в минимальном промоторе гена Х1я1 на процесс неслучайной инактивации Х-хромосомы у межвидовых гибридов обыкновенных полевок.

Научная новизна исследования.

В настоящей работе впервые проведен системный анализ 5л-регуляторного района гена X«/. Показано, что в данном районе располагаются две консервативные последовательности, которые могут быть ключевыми в процессе регуляции экспрессии гена Xist. Молекулярно-генетический анализ позволил идентифицировать области, которые могут оказывать позитивное и негативное влияние на экспрессию полевки МкгоШБ го8Б1аетепсИопаИз, и также определить транскрипционные факторы, которые потенциально могут взаимодействовать с этими участками. Полученные результаты имеют существенное значение для понимания механизмов экспрессии гена Ххзг и всего процесса инактивации Х-хромосомы в целом.

Основные положения работы, выносимые на защиту.

1) В 5'-области гена Xist располагается две консервативных нуклеотидных последовательности, что указывает на наличие общих механизмов регуляции транскрипции этого гена у разных видов млекопитающих. I

2) Транскрипция гена Хгз1 полевки М. гоязгаетеггсИопаНя находится под контролем большого количества регуляторных элементов. Часть из этих элементов оказывает позитивное, а часть - негативное влияние на уровень его транскрипции. Минимальный промотор полевки М. го$$1аетеН(ИопаИх локализуется в районе -100/+67 п.н. относительно точки старта транскрипции.

3) Однонуклеотидная замена -430/А в промоторном районе гена Хш1 у полевки М агчаШ не влияет на его экспрессию в фибробластах.

Теоретическая и практическая значимость исследования. Результаты данной работы расширяют знания о молекулярно-генетических механизмах регуляции экспрессии гена Х181 и, следовательно, процесса инактивации Х-хромосомы у самок млекопитающих. Полученные в работе результаты используются в качестве материала при чтении спецкурса «Новейшие молекулярно-генетические технологии», читаемого в Новосибирском государственном университете.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 9-12 мая 2007 г.), на международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2009» (Москва, 13-18 апреля 2009 г.), на международной конференции «Хромосома 2009» (Новосибирск, 31 августа - 6 сентября 2009 г.), семинарах и отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН.

По теме диссертации опубликованы две работы в рецензируемом отечественном журнале.

Вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Биоинформационный анализ нуклеотидных последовательностей проводился совместно с к.б.н. Е.А. Елисафенко.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Орищенко, Константин Евгеньевич

ВЫВОДЫ

1. В результате сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей берегу ляторной области гена Xist шести видов млекопитающих идентифицировано два наиболее консервативных района: первый район (CNS1) располагается в минимальном промоторе гена Xist, а второй район (CNS2) локализуется в позиции -540/-498 п.н. относительно точки старта транскрипции. Методом in vitro футпринтинга с ДНКазой I в промоторном районе гена Xist у полевки Microtus rossiaemeridionalis идентифицировано девять сайтов связывания регуляторных белков на (+) цепи и шесть на (-) цепи ДНК. Во втором консервативном районе и прилегающих к нему нуклеотидных последовательностях выявлено девять и пять сайтов связывания регуляторных белков на (+) и (-) цепях ДНК, соответственно. Определены транскрипционные факторы, которые потенциально могут взаимодействовать с этими сайтами.

2. Показано связывание рекомбинантного транскрипционного фактора SP1 с районом -73/-56 п.н. в минимальном промоторе гена Xist полевки в условиях in vitro. i

3. При помощи делеционного анализа установлено, что минимальный промотор гена Xist полевки локализован в области -100/+67 п.н. и район -4/+67 п.н. i оказывает существенное влияние на его активность. Показано, что в районах -100/-150 п.н., -250/-300 п.н. и -450/-500 п.н., могут располагаться негативные регуляторные элементы, а в районах -200/-250 п.н., -350/-400 п.н. и -500/-550 п.н., могут находиться позитивные элементы, регулирующие транскрипцию гена Xist полевки.

4. Методом иммунопреципитации хроматина продемонстрировано взаимодействие фактора CTCF с промоторным районом гена Xist на активной Х-хромосоме in vivo. Показано, что CTCF связывается не напрямую с ДНК в промоторе Xist, а опосредованно за счет белок-белковых взаимодействий.

5. Установлено, что в фибробластах полевки замена -43G/A в минимальном промоторе гена Xisr не влияет на уровень экспрессии репортерного гена в конструкциях., содержащих район -1453/+67 п.н.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данная работа направлена на изучение молекулярно-генетических механизмов регуляции экспрессии гена Xist у самок млекопитающих. В ходе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей 5' -области гена Xist шести видов млекопитающих были идентифицированы два наиболее консервативных района (CNS1 и CNS2). Консервативный район CNS1 располагается в минимальном промоторе в позиции -73/-44 п.н. относительно точки старта Xist полевки и в среднем уровень его гомологии составляет 84%. |Район CNS2 располагается в позиции -540/498 п.н. и средний уровень его гомологии составляет 79%.

Последующий анализ консервативных районов и прилегающих последовательностей показал наличие в них большого количества потенциальных регуляторных элементов. Так в промоторном районе было идентифицировано девять участков, защищенных от расщепления ДНКазой I, на «+» цепи ДНК и шесть участков на «-» цепи. С помощью компьютерного анализа было установлено, что этим участкам соответствуют потенциальные сайты связывания транскрипционных факторов YY1, ТВР, SP1, АР-2, NFY, Octl и других. С помощью метода in vitro футпринтинга показано, что фактор SP1 непосредственно взаимодействует с его сайтом в промоторе Xist полевки. Во втором консервативном районе и прилегающих к нему последовательностях были выявлены девять и пять защищенных мотивов, на «+» и «-» цепях ДНК, соответственно. Эти мотивы перекрываются с потенциальными сайтами связывания транскрипционных факторов NMP4, RARRXR, SATB1, HMGIY, Znf217, ERa и других. Таким образом, были определены транскрипционные факторы, которые потенциально могут регулировать экспрессию гена Xist полевки.

Функциональный анализ идентифицированных потенциальных регуляторных элементов показал, что абсолютно необходимым элементом для активности гена Xist является район минимального промотора (-100/+67 п.н.). Другие элементы сами по

I , | себе не могут обеспечить транскрипцию и лишь моделируют её уровень. При этом для активации и модуляции транскрипции важен не только сам факт наличия определенных элементов, но и их правильная ориентация относительно точки старта транскрипции. Кроме того были обнаружены районы соответствующие активаторам и репрессорам транскрипции, а также продемонстрировано, что метилирование цитозинов в 5"-области гена Xist приводит к подавлению активности репортерных конструкций и транскрипции Xist.

Анализ взаимодействия белка CTCF с промотором Xist полевки показал, что данный фактор in vivo связывается с промоторным районом гена Xist на активной X-хромосоме, но не напрямую с последовательностью ДНК, а, по всей видимости, с другим регуляторным белком, который взаимодействует со своим целевым сайтом. В результате было сделано заключение, что CTCF, скорее всего, выполняет функцию репрессора на активной Х-хромосоме и может принимать участие в неслучайной инактивации Х-хромосомы у межвидовых гибридов обыкновенных полевок только опосредованно, за счет связывания с другим белком. Также было установлено, что замена -43G/A в промоторе Xist полевки не влияет на уровень экспрессии репортерного гена в составе конструкций в соматических клетках. Поэтому было высказано предположение о связи неслучайной инактивации Х-хромосомы у межвидовых гибридов обыкновенных полевок с тем, что с районом замены G(-43)A может взаимодействовать какой-либо транскрипционный фактор, который экспрессируется только в ходе эмбрионального развития и замена влияет на эффективность его связывания.

Таким образом, в результате выполнения данной работы установлены регуляторные элементы, которые способны активировать и подавлять транскрипцию гена Xist, а также представлены некоторые факты, указывающие на то, что замена -43G/A в промоторном районе Xist полевки, возможно, не влияет на его экспрессию в соматических клетках. Описанные в работе данные позволяют лучше понять молекулярно-генетические механизмы регуляции экспрессии гена Xist и в целом , 1 1 ' процесса инактивации Х-хромосомы у самок млекопитающих.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Орищенко, Константин Евгеньевич, Новосибирск

1. Васильева JI.A. Статистические методы в биологии, медицине и сельском хозяйстве. М.: Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирский государственный университет, 2007. С. 76.

2. Воронцов Н.Н., Сухорукова JI.M. Эволюция органического мира. М.: Наука, 1996. С. 28.

3. Колесников Н.Н., Елисафенко Е.А. Сравнительная организация и происхождение некодирующих регуляторных РНК генов центра инактивации Х-хромосомы человека и мыши // Генетика, в печати. V. № Р.

4. Мазин А.В., Кузнеделов К.Д., Краев А. С. et al. Методы молекулярной генетики и генной инженерии. М.: Наука, 1990. С.

5. Шевченко А.И., Павлова С.В., Дементьева Е.В. et al. Модификации хроматина в процессе инактивации Х-хромосомы у самок млекопитающих // Генетика. 2006. V. 42. №9. Р. 1255-1234.

6. Agrelo R., Souabni A., Novatchkova М. et al. SATB1 defines the developmental context for gene silencing by Xist in lymphoma and embryonic cells // Dev. Cell. 2009. V. 16. № 4. P. 507-516.

7. Allenby G., Bocquel M.T., Saunders M. et al. Retinoic acid receptors and retinoid X receptors: interactions with endogenous retinoic acids // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1993. V. 90. № l.P. 30-34.

8. Altschul S.F., Gish W., Miller W. et al. Basic local alignment search tool // J. Mol. Biol. 1990. V. 215. № 3. p. 403-410.

9. Alvarez M., Shah R., Rhodes S.J. et al. Two promoters control the mouse Nmp4/CIZ transcription factor gene // Gene. 2005. V. 347. № 1. P. 43-54.

10. Avner P., Heard E. X-chromosome inactivation: counting, choice and initiation // Nat. Rev. Genet. 2001. V. 2. № 1. P. 59-67.

11. Barr M.L., Bertram E.G. A morphological distinction between neurones of the male and female, and the behaviour of the nucleolar satellite during accelerated nucleoprotein synthesis // Nature. 1949. V. 163. № 4148. P. 676.

12. Bartova E., Kozubek S. Nuclear architecture in the light of gene expression and cell differentiation studies // Biol. Cell. 2006. V. 98. № 6. P. 323-336.

13. Batada N.N., Hurst L.D. Evolution of chromosome organization driven by selection for reduced gene expression noise // Nat. Genet. 2007. V. 39. № 8. P. 945-949.

14. Beard C., Li E., Jaenisch R. Loss of methylation activates Xist in somatic but not in embryonic cells // Genes Dev. 1995. V. 9. № 19. P. 2325-2334.

15. Benetti R., Gonzalo S., Jaco I. et al. A mammalian microRNA cluster controls DNA methylation and telomere recombination via Rbl2-dependent regulation of DNA methyltransferases //Nat. Struct. Mol. Biol. 2008. V. 15. № 3. P. 268-279.

16. Biddie S.C., John S., Hager G.L. Genome-wide mechanisms of nuclear receptor action // Trends Endocrinol. Metab. 2010. V. 21. № 1. P. 3-9.

17. Blewitt M.E., Gendrel A.V., Pang Z. et al. SmcHDl, containing a structural-maintenance-of-chromosomes hinge domain, has a critical role in X inactivation // Nat. Genet. 2008. V. 40. № 5. P. 663-669.

18. Boulikas T. Homeodomain protein binding sites, inverted repeats, and nuclear matrix attachment regions along the human beta-globin gene complex // J. Cell. Biochem. 1993. V. 52. № l.p. 23-36.

19. Boumil R.M., Ogawa Y., Sun B.K. et al. Differential methylation of Xite and CTCF sites in Tsix mirrors the pattern of X-inactivation choice in mice // Mol. Cell. Biol. 2006. V. 26. №6. P. 2109-2117.

20. BrockdorffN. The role,of Xist in X-inactivation // Curr. Opin. Genet. Dev. 1998. V. 8. № 3. P. 328-333.

21. Brockdorff N., Ashworth A., Kay G.F. et al. The product of the mouse Xist gene is a 15 kb inactive X-specific transcript containing no conserved ORF and located in the nucleus // Cell. 1992. V. 71. № 3. P. 515-526.

22. Brown C.J., Ballabio A., Rupert J.L. et al. A gene from the region of the human X inactivation centre is expressed exclusively from the inactive X chromosome // Nature. 1991. V. 349. № 6304. P. 38-44.

23. Brown C.J., Hendrich B.D., Rupert J.L. et al. The human XIST gene: analysis of a 17 kb inactive X-specific RNA that contains conserved repeats and is highly localized within the nucleus // Cell. 1992. V. 71. № 3. P. 527-542.

24. BrQwn C.J., Lafreniere R.G., Powers V.E. et al. Localization of the X inactivation centre on the human X chromosome in Xql3 // Nature. 1991. V. 349. № 6304. P. 82-84.

25. Brown C.J., Willard H.F. The human X-inactivation centre is not required for maintenance of X-chromosome inactivation // Nature. 1994. V. 368. № 6467. P. 154-156.

26. Bucher P. Weight matrix descriptions of four eukaryotic RNA polymerase II promoter elements derived from 502 unrelated promoter sequences // J. Mol. Biol. 1990. V. 212. № 4. P. 563-578.

27. Calo V., Migliavacca M., Bazan V. et al STAT proteins: from normal control of cellular events to tumorigenesis // J. Cell. Physiol. 2003. V. 197. № 2. P. 157-168.

28. Cantrell M.A., Carstens B.C., Wichman H.A. X chromosome inactivation and Xist evolution in a rodent lacking LINE-1 activity // PLoS ONE. 2009. V. 4. № 7. P. e6252.

29. Carninci P., Kasukawa T., Katayama S. et al The transcriptional landscape of the mammalian genome // Science. 2005. V. 309. № 5740. P. 1559-1563.

30. Carrel L., Willard H.F. X-inactivation profile reveals extensive variability in X-linked gene expression in females //Nature. 2005. V. 434. № 7031. P. 400-404.

31. Cartharius K., Freeh K., Grote K. et al. Matlnspector and beyond: promoter analysis based on transcription factor binding sites // Bioinformatics. 2005. V. 21. № 13. P. 29332942.

32. Casavant N.C., Scott L„ Cantrell M.A. et al. The end of the LINE?: lack of recent LI activity in a group of South American rodents // Genetics. 2000. V. 154. № 4. P. 18091817.

33. Cattanach B.M., Rasberry C. Identification of the Mus spretus Xce allele // Mouse Genome. 1991. V. 89. № P. 565-566.

34. Chambers I., Silva J., Colby D. et al. Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development//Nature. 2007. V. 450. № 7173. P. 1230-1234.

35. Chang S.C., Brovm C.J. Identification of regulatory elements flanking human XIST reveals species differences // BMC Mol. Biol. 2010. V. 11. № 1. P. 20.

36. Chang S.C., Tucker T., Thorogood N.P. et al. Mechanisms of X-chromosome inactivation // Front. Biosci. 2006. V. 11. № P. 852-866.

37. Chao W., Huynh K.D., Spencer R.J. et al. CTCF, a candidate trans-acting factor for X-inactivation choice // Science. 2002. V. 295. № 5553. P. 345-347.

38. Chen T., Ueda Y., Dodge J.E. et al. Establishment and maintenance of genomic methylation patterns in mouse embryonic stem cells by Dnmt3a and Dnmt3b // Mol. Cell. Biol. 2003. V. 23. № 16. P. 5594-5605. .

39. Chen X., Xu K, Yuan P. et al. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells // Cell. 2008. V. 133. № 6. P. 1106-1117.

40. Cheshenko K., Brion F., Le Page Y. et al. Expression of zebra fish aromatase cypl9a and cypl9b genes in response to the ligands of estrogen receptor and aryl hydrocarbon receptor // Toxicol. Sci. 2007. V. 96. № 2. P. 255-267.

41. Chow J., Heard E. X inactivation and the complexities of silencing a sex chromosome // Curr. Opin. Cell Biol. 2009. V. 21. № 3. P. 359-366.

42. Chuang P.T., Albertson D.G., Meyer B.J. DPY-27:a chromosome condensation protein homolog that regulates C. elegans dosage compensation through association with the X chromosome // Cell. 1994. V. 79. № 3. P. 459-474.

43. Chureau C., Prissette M., Bourdet A. et al. Comparative sequence analysis of the X-inactivation center region in mouse, human, and bovine /'/ Genome Res. 2002. V. 12. № 6. P. 894-908.

44. Clark S.J., Harrison J., Paid C.L. et al. High sensitivity mapping of methylated cytosines //Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. № 15. p. 2990-2997.

45. Clemson C.M., Hall L.L., Byron M. et al. The X chromosome is organized into a generich outer rim and an internal core containing silenced nongenic sequences // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2006. V. 103. № 20. P. 7688-7693.

46. Cleynen I., Van de Ven W.J. The HMGA proteins: a myriad of functions (Review) // Int. J. Oncol. 2008, V. 32. № 2. P. 289:305.1

47. Cohen D.E., Davidow L.S., Erwin J.A. et al. The DXPas34 repeat regulates random and imprinted X inactivation // Dev. Cell. 2007. V. 12. № 1. P. 57-71.

48. Cooper D.W., Johnston, P. G., Watson J.M. et al. X-inactivation in marsupials and monotremes // Seminars in Developmental Biology. 1993. V. 4. № 2. P. 117-128.

49. Dementyeva E.V., Shevchenko A.I.; Zakian S.M. X-chromosome upregulation and inactivation: two sides of the dosage compensation mechanism in mammals // Bioessays. 2009. V. 31. № l.P. 21-28.

50. DengX., Meller V.H roX RNAs are required for increased expression of X-linked genes in Drosophila melanogaster males // Genetics. 2006. V. 174. № 4. P. 1859-1866.

51. Donohoe M.E., Zhang L.F., Xu N. ei al. Identification of a Ctcf cofactor, Yyl, for the X chromosome binary switch // Mol. Cell. 2007. V. 25. № 1. P. 43-56.

52. Duret L., Chureau C., Samain S. et al. The Xist RNA gene evolved in eutherians by pseudogenization of a protein-coding gene // Science. 2006. V. 312. № 5780. P. 16531655.

53. Duszczyk M.M., Zanier K, Sattler M. A NMR strategy to unambiguously distinguish nucleic acid hairpin and duplex conformations applied to a Xist RNA A-repeat // Nucleic Acids Res. 2008. V. 36. № 22. P. 7068-7077.

54. Dyer R.B., Herzog N.K. Isolation of intact nuclei for nuclear extract preparation from a fragile B-lymphocyte cell line /7 Biotechniques. 1995. V. 19. № 2. P. 192-195.

55. Eckert D., Buhl S., Weber S. et al. The AP-2 family of transcription factors // Genome Biol. 2005. V. 6. № 13. P. 246.

56. Eggan K., Akutsu H., Hochedlinger K. et al. X-Chromosome inactivation in cloned mouse embryos // Science. 2000. V. 290. № 5496. P. 1578-1581.

57. Elisaphenko E.A., Kolesnikov N.N., Shevchenko A.L et al. A dual origin of the Xist gene from a protein-coding gene and a set of transposable elements // PLoS ONE. 2008. V. 3. №6. P. e2521.

58. Espinoza C.A., Allen T.A., Hieb A.R. et al. B2 RNA binds directly to RNA polymerase II to repress transcript synthesis //Nat. Struct. Mol. Biol. 2004. V. 11. № 9. P. 822-829.

59. Frazer K.A., Pachter L., Poliakov A. et al. VISTA: computational tools for comparative genomics // Nucleic Acids Res. 2004. V. 32. № Web Server issue. P. W273-279.

60. Frontini M., Imbriano C., diSilvio A. et al NF-Y recruitment of TFIID, multiple interactions with histone fold TAF(II)s // J. Biol. Chem. 2.002. V. 277. № 8. P. 5841-5848.

61. Gilthorpe J., Vandromme M, Brend T. et al. Spatially specific expression of Hoxb4 is dependent on the ubiquitous transcription factor NFY // Development. 2002. V. 129. № 16. P. 3887-3899.

62. Gor ski J., Hou Q. Embryonic estrogen receptors: do they have a physiological function? // Environ. Health Perspect. 1995. V. 103 Suppl 7. № P. 69-72.i u

63. Greaves I.K., Rangasamy ,D., Devoy M. et al. The X and Y chromosomes assemble into H2A.Z-containing facultative heterochromatin following meiosis // Mol. Cell. Biol. 2006. V. 26. № 14. P. 5394-5405.

64. Grigor'eva E.V., Shevchenko A.I., MazurokN.A. et al. FGF4 independent derivation of trophoblast stem cells from the common vole // PLoS ONE. 2009. V. 4. № 9. P. e7161.

65. He S., Weintraub S.J. Stepwise recruitment of components of the preinitiation complex by upstream activators in vivo // Mol. Cell. Biol. 1998. V. 18. № 5. P. 2876-2883.

66. Hendrich B.D., Plenge R.M., Willard H.F. Identification and characterization of the human XI ST gene promoter: implications for models of X chromosome inactivation // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. № 13. P. 2661-2671.

67. Husberg C., Murphy P., Martin E. et al. Two domains of the human bZIP transcription factor TCF11 are necessary for transactivation // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. № 21. P. 17641-17652.

68. Jamieson R. V., Tan S.S., Tom P.P. Retarded postimplantation development of X0 mouse embryos: impact of the parental origin of the monosomic X chromosome // Dev. Biol. 1998. V. 201. № l.P. 13-25.

69. Jetten A.M. Recent advances in the mechanisms of action and physiological functions of the retinoid-related orphan receptors (RORs) // Curr. Drug Targets Inflamm. Allergy. 2004. V. 3.№>4.P. 395-412.

70. Jin C., Felsenfeld G. Nucleosome stability mediated by histone variants H3.3 and H2A.Z // Genes Dev. 2007. V. 21. № 12. P. 1519-1529.

71. Jin S., Scotto K.W. Transcriptional regulation of the MDR1 gene by histone acetyltransferase and deacetylase is mediated by NF-Y // Mol. Cell. Biol. 1998. V. 18. № 7. P. 4377-4384.

72. Johnsen O., Murphy P., Prydz H. et al. Interaction of the CNC-bZIP factor TCF11/LCR-Fl/Nrfl with MafG: binding-site selection and regulation of transcription I I Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. № 2. P. 512-520.

73. Johnsen S.A., Gungor C., Prenzel T. et al. Regulation of estrogen-dependent transcription by the LIM cofactors CLIM and RLIM in breast cancer // Cancer Res. 2009. V. 69,№ LP. 128-136.

74. Johnston C.M., Nesterova T.B., Formstone E.J. et al Developmentally regulated Xist promoter switch mediates initiation of X inactivation // Cell. 1998. V. 94. № 6. P. 809817.

75. Jonkers I., Barakat T.S., Achame E.M. et al. RNF12 is an X-Encoded dose-dependent activator of X chromosome inactivation // Cell. 2009. V. 139. № 5. P. 999-1011.

76. Jurka J., Klonowski P., Dagman V. et al. CENSOR~a program for identification and elimination of repetitive elements from DNA sequences // Comput. Chem. 1996. V. 20. № l.P. 119-121.

77. Just W., Baumstark A., Suss A. et al. Ellobius lutescens: sex determination and sex chromosome // Sex. Dev. 2007. V. 1. № 4. P. 211-221.

78. Juven-Gershon T., Hsu J.Y., Theisen J. W. et al. The RNA polymerase II core promoter -the gateway to transcription // Curr. Opin. Cell Biol. 2008. V. 20. № 3. P. 253-259.

79. Juven-Gershon T., Kadonaga JT. Regulation of gene expression via the core promoter and the basal transcriptional machinery // Dev. Biol. 2010. V. 339. № 2. P. 225-229.

80. Kalantry S., Purushothaman S., Bowen R.B. et al. Evidence of Xist RNA-independent initiation of mouse imprinted X-chromosome inactivation // Nature. 2009. V. 460. № 7255. P. 647-651.

81. Kanduri C., Pant V., Loukinov D. et al. Functional association of CTCF with the insulator upstream of the HI 9 gene is parent of origin-specific and methylation-sensitive // Curr. Biol. 2000. V. 10. № 14. P. 853-856.

82. Kanduri C., Whitehead J., Mohammad F. The long and the short of it: RNA-directed chromatin asymmetry in mammalian X-chromosome inactivation // FEBS Lett. 2009. V. 583. № 5. p. 857-864,

83. Katayama S., Tomaru Y., Kasukawa T. et al. Antisense transcription in the mammalian transcriptome // Science. 2005. V. 309. № 5740. P. 1564-1566.

84. Kohlmaier A., Savarese F., Lachner M. et al A chromosomal memory triggered by Xist regulates histone methylation in X inactivation // PLoS Biol. 2004. V. 2. № 7. P. El71.

85. Komura J., Sheardown S.A., BrockdorffN. et al. In vivo ultraviolet and dimethyl sulfate footprinting of the 5' region of the expressed and silent Xist alleles // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. № 16. P. 10975-10980.

86. Lafreniere R.G., Brown C.J., Rider S. et al. 2.6 Mb YAC contig of the human X inactivation center region in Xql3: physical linkage of the RPS4X, PHKA1, XIST and DXS128E genes//Hum. Mol. Genet. 1993. V. 2. № 8. P. 1105-1115.

87. Lanz R.B., McKenna N.J., Onate S.A. et al. A steroid receptor coactivator, SRA, functions as an RNA and is present in an SRC-1 complex // Cell. 1999. V. 97. № 1. P. 1727. .

88. Larkin M.A., Blackshields G., Brown N.P. et al. Clustal W and Clustal X version 2.0 // Bioinformatics. 2007. V. 23. № 21. P. 2947-2948.

89. Lee J.T. Disruption of imprinted X inactivation by parent-of-origin effects at Tsix // Cell. 2000. V. 103. № 1. P. 17-27.

90. Lee J.T., Davidow L.S., Warshawsky D. Tsix, a gene antisense to Xist at the X-inactivation centre //Nat. Genet. 1999. V. 21. № 4. P. 400-404.

91. Lee J.T., Lu N. Targeted mutagenesis of Tsix leads to nonrandom X inactivation // Cell. 1999. V. 99. № l.P. 47-57.

92. Lee J.T., Strauss V/.M., Dausman J.A. et al. A 450 kb transgene displays properties of the mammalian X-inactivation center // Cell. 1996. V. 86;№ 1. P. 83-94.

93. Littlefield O., Korkhin Y, Sigler P.B. The structural basis for the oriented assembly of a TBP/TFB/promoter complex // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999. V. 96. № 24. P. 13668-13673.

94. Lomvardas S., Barnea G., Pisapia D.J. et al. Interchromosomal interactions and olfactory receptor choice // Cell. 2006. V. 126. № 2. P. 403-413.

95. Luikenhuis S., Wutz A., Jaenisch R. Antisense transcription through the Xist locus mediates Tsix function in embryonic stem cells ■// Mol., Cell. Biol. 2001. V. 21. № 24. P.8512-8520.'. . • ■.•i

96. Lyon M.F. Gene action in the X-chromosome of the mouse (Mus musculus L.) // Nature. 1961. V. 190. №,P. 372-373. \ . •

97. Lyon M.F. X-chromosome inactivation: a repeat hypothesis // Cytogenet. Cell Genet. 1998. V. 80. № 1-4.-P. 133-137.

98. Mak W., Nester ova T.B., de Napoles M. et al. Reactivation of the paternal X chromosome in early mouse embryos // Science. 2004. V. 303. № 5658. P. 666-669.

99. Malin S., Linder son Y„ Almqvist J. et al. DNA-dependent conversion of Oct-1 and Oct-2 into transcriptional repressors by Groucho/TLE //Nucleic Acids Res. 2005. V. 33. № 14. P. 4618-4625.

100. Mangs A.H., Morris B.J. The Human Pseudoautosomal Region (PAR): Origin, Function and Future // Curr. Genomics. 2007. V. 8. № 2. P. 129-136.

101. Mank J.E. The W, X, Y and Z of sex-chromosome dosage compensation // Trends Genet. 2009. V. 25. № 5. P. 226-233.

102. MankJ.E., Hultin-Rosenberg L., Webster M.T. et al. The unique genomic properties of sex-biased genes: insights from avian microarray data // BMC Genomics. 2008. V. 9. № P. 148.

103. Manolakou P., Lavranos G., Angelopoulou R. Molecular patterns of sex determination in the animal kingdom: a comparative study of the biology of reproduction // Reprod. Biol. Endocrinol. 2006. V. 4. № P. 59.

104. Martens J.A., Laprade L., Winston F. Intergenic transcription is required to repress the Saccharomyces cerevisiae SER3 gene // Nature. 2004. V. 429. № 6991. P. 571-574.

105. Mazurok N.A, Rubtsova N.V., Isaenko A.A. et al. Comparative chromosome and mitochondrial DNA „ analyses and phylogenetic relationships within common voles (Microtus, Arvicolidae) // Chromosome Res. 2001. V. 9. № 2. P. 107-120.

106. McDonald L.E., Paterson C.A., Kay G.F. Bisulfite genomic sequencing-derived methylation profile of the xist gene throughout early mouse development // Genomics. 1998. V. 54. № 3. P. 379-386.

107. Mercer T.R., Dinger M.E., Sunkin S.M. et al. Specific expression of long noncoding RNAs in the mouse,brain // Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 2008. V. 105. № 2. P. 716-721.

108. Michels A.A., Fraldi A., Li Q. et al. Binding of the 7SK snRNA turns the HEXIM1 protein into a P-TEFb (CDK9/cyclin T) inhibitor // EMBO J. 2004. V. 23. № 13. P. 26082619. , 1

109. Migeon B.R. Non-random X chromosome inactivation in mammalian cells // Cytogenet. Cell Genet. 1998. V. 80. №-1-4. P. 142-148.

110. Migeon B.R., Chowdhury A.K., Dunston J.A. et al Identification of TSIX, encoding an RNA antisense to human XIST, reveals differences from its murine counterpart: implications for X inactivation // Am. J. Hum. Genet. 2001. V. 69. № 5. P. 951-960.

111. Migeon B.R., Sprenkle J.A., Do T.T. Stability of the "two active X" phenotype in triploid somatic cells // Cell. 1979. V. 18. № 3. P. 637-641.

112. Minotto L., Tutticci E.A., Bagnara A.S. et al. Characterisation and expression of the carbamate kinase gene from Giardia intestinalis // Mol. Biochem. Parasitol. 1999. V. 98. № l.P. 43-51.

113. Mizzen C.A., YangX.J., Kokubo T. et al. The TAF(II)250 subunit of TFIID has histone acetyltransferase activity // Cell. 1996. V. 87. № 7. P. 1261-1270.

114. Mohandas T.K., Speed R.M., Passage M.B. et al Role of the pseudoautosomal region in sex-chromosome pairing during male meiosis: meiotic studies in a man with a deletion of distal Xp // Am.- J. Hum. Genet. 1992. V. 51. № 3. P. 526-533.

115. Monk M., McLaren A. X-chromosome activity in foetal germ, cells of the mouse // J. Embryol, Exp. Morphol. 1981.-V. 63. № P. 75-84.

116. Monkhorst K., Jonkers L, Rentmeester E. et al X inactivation counting and choice is a stochastic process: evidence for involvement of an X-linked activator // Cell. 2008. V. 132. №3. P. 410-421.

117. Murchison E.P., Hannon G,J. miRNAs on the move: miRNA biogenesis and the RNAi machinery // Curr. Opin. Cell Biol. 2004. V. 16. № 3. P. 223-229.

118. Nagpal S., Ghosn C., DiSepio D. et al Retinoid-dependent recruitment of a histone HI displacement activity by retinoic acid receptor // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. № 32. P. 22563-22568.

119. NavarroP., Avner P. When X-inactivation meets pluripotency: an intimate rendezvous //FEBS Lett. 2009. V. 583; № 11. P. 1721-1727.

120. Navarro P., Avner P. An embryonic story: analysis of the gene regulative network controlling Xist expression in mouse, embryonic stem cells // Bioessays. 2010. V. 32. № 7. P. 581-588. .

121. Navarro P., Chambers I., Karwacki-Neisius V. et al. Molecular coupling of Xist regulation and pluripotency // Science. 2008. V. 321. № 5896. P. 1693-1695.

122. Navarro P., Pichard S., Ciaudo C. et al. Tsix transcription across the Xist gene alters chromatin conformation without affecting Xist transcription: implications for X-chromosome inactivation // Genes Dev. 2005. V. 19. № 12. P. 1474-1484.

123. Nesterova T.B., Barton S.C., Surani M.A. et al. Loss of Xist imprinting in diploid parthenogenetic preimplantation embryos // Dev. Biol. 2001. V. 235. № 2. P. 343-350.

124. Nesterova T.B., Johnston C.M., Appanah R. et al. Skewing X chromosome choice by modulating sense transcription across the Xist locus // Genes Dev. 2003. V. 17. № 17. P. 2177-2190.

125. Nesterova T.B., Popova B.C., Cobb B.S. et al. Dicer regulates Xist promoter methylation in ES cells indirectly through transcriptional control of Dnmt3a // Epigenetics Chromatin. 2008. V. 1. № 1. P. 2.

126. Newall A.E., Duthie S., Formstone E. et al. Primary non-random X inactivation associated with disruption of Xist promoter regulation // Hum. Mol. Genet. 2001. V. 10. № 6. P. 581-589.

127. Nguyen D.K., Disteche C.M. Dosage compensation of the active X chromosome in mammals // Nat. Genet. 2006. V. 38. № 1. P. 47-53.

128. Nilsen T.W. Spliceosome assembly in yeast: one ChJP at a time? // Nat. Struct. Mol. Biol. 2005. V. 12. № 7. p. 571-573.

129. O'Shea-Greenfield A., Smale S.T. Roles of TATA and initiator elements in determining the start site location and direction of RNA polymerase II transcription // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. № 9. P. 6450.

130. Ogawa Y., Lee J.T. Xite, X-inactivation intergenic transcription elements that regulate ' the probability of choice // Mol. Cell. 2003. V. 11, № 3. P. 731-743.

131. Ogawa Y., Sun B.K., Lee J.T. Intersection of the RNA interference and X-inactivation pathways // Science. 2008. V. 320. № 5881. P. 1336-1341.

132. Ohhata T., Hoki Y., Sasaki H. et al. Crucial role of antisense transcription across the Xist promoter in Tsix-mediated Xist chromatin modification // Development. 2008. V. 135. №2. P. 227-235.

133. Ohno S., Kaplan W.D., Kinosita R. Formation of the sex chromatin by a single X-chromosome in liver cells of Rattus norvegicus // Exp. Cell Res. 1959. V. 18. № P. 415418.

134. Orlando V. Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde-crosslinked-chromatin immunoprecipitation // Trends Biochem. Sci. 2000. V. 25. № 3. P. 99-104.

135. Orstavik K.H. Skewed X inactivation in healthy individuals and in different diseases // Acta Paediatr. Suppl. 2006. V. 95. № 451. P. 24-29.

136. Pang K.C., Frith M.C., Mattick J.S. Rapid evolution of noncoding RNAs: lack of conservation does not mean lack of function // Trends Genet. 2006. V. 22. № 1. P. 1-5.

137. Panning B. X-chromosome inactivation: the molecular basis of silencing // J. Biol. 2008. V. 7. № 8. P. 30.

138. Parada L.A., Sotiriou S., Misteli T. Spatial genome organization // Exp. Cell Res. 2004. V. 296. № l.P. 64-70.

139. Pavan Kumar P., Purbey P.K., Sinha C.K. et al. Phosphorylation of SATB1, a global gene regulator, acts as a molecular switch regulating its transcriptional activity in vivo // Mol. Cell. 2006. V. 22. № 2. P. 231-243.

140. Payer B., Lee J.T. X chromosome d6sage compensation: how mammals keep the balance // Annu. Rev. Genet. 2008. V. 42. № P. 733-772.

141. Pearson W.R., Lipman D.J. Improved tools for biological sequence comparison // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1988. V. 85. № 8. P. 2444-2448.

142. Pena P., Reutens A.T., Albanese C. et al. Activator protein-2 mediates transcriptional activation of the CYP11A1 gene by interaction with Spl rather than binding to DNA // Mol. Endocrinol. 1999. V. 13. № 8. P. 1402-1416.

143. Peng Y., Jahroudi N. The NFY transcription factor inhibits von Willebrand factor promoter activation in non-endothelial cells through recruitment of histone deacetylases // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. № 10. P. 8385-8394.

144. Pieaa C., Dorizzi M. Oestrogens and temperature-dependent sex determination in reptiles: all is in the gonads // J. Endocrinol. 2004. V. 181. № 3. P. 367-377.

145. Pillet N., Bonny C., Schorderet D.F. Characterization of the promoter region of the mouse Xist gene // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995. V. 92. № 26. P. 12515-12519.

146. Piriyapongsa J., Marino-Ramirez L., Jordan I.K. Origin and evolution of human microRNAs from transposable elements // Genetics. 2007. V. 176. № 2. P. 1323-1337.

147. Prissette M., El-Maarri O,, Arnaud D. et al. Methylation profiles of DXPas34 during the onset of X-inactivation // Hum. Mol. Genet. 2001. V. 10. № 1. P. 31-38.

148. Pugacheva E.M., Tiwari V.K., Abdullaev Z. et al. Familial cases of point mutations in the XIST promoter reveal a correlation between CTCF binding and pre-emptive choices of X chromosome inactivation // Hum. Mol. Genet. 2005. V. 14. № 7. P. 953-965.

149. Pugh B.F., Tjian R. Mechanism of transcriptional activation by Spl: evidence for coactivators // Cell. 1990. V. 61. № 7. P. 1187-1197.

150. Quinlan K.G., Nardini M., Verger A. et al. Specific recognition of ZNF217 and other zinc finger proteins at a surface groove of C-terminal binding proteins // Mol. Cell. Biol. 2006. V. 26. № 21. P. 8159-8172.

151. Rastan S. Non-random X-chromosome inactivation in mouse X-autosome translocation embryos—location of the inactivation centre // J. Embryol. Exp. Morphol. 1983. V. 78. № P. 1-22.

152. Redrup L., Branco M.R., Perdeaitx E.R. et al. The long noncoding RNA Kcnqlotl organises a lineage-specific nuclear domain for epigenetic gene silencing // Development. 2009. V. 136. № 4. P. 525-530.

153. Rinn J.L., Kertesz M., Wang J.K. et al Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs // Cell. 2007. V. 129. № 7. P. 1311-1323., . •

154. Romer J.T., Ashworth A. The upstream region of the mouse xist gene contains two , ribosomal protein pseudogenes // Mamm. Genome. 2000. V. 11. № 6. P. 461-463.

155. Ross MS.,- Grafham D.V., Coffey A.J. et,al The DNA sequence of the human X chromosome //Nature. 2005. V. 434.,№ 7031. P. 325-337.

156. Rougeulle C., Avner P. Controlling X-inactivation in mammals: what does the centre hold? // Semin. Cell Dev. Biol. 2003. V. 14. № 6. P. 331-340.

157. Rougeulle C., Chaumeil J., Sarma K. et al. Differential histone H3 Lys-9 and Lys-27 methylation profiles on the X chromosome // Mol. Cell. Biol. 2004. V. 24. № 12. P. 54755484.

158. Rougeulle C., Heard E. Antisense RNA in imprinting: spreading silence through Air // Trends Genet. 2002. V. 18. № 9. P. 434-437.

159. Roy A.L., Meisterernst M., Pognonec P. et al. Cooperative interaction of an initiator-binding transcription initiation factor and the helix-loop-helix activator USF // Nature. 1991. V. 354. № 6350. P. 245-248.

160. Russell L.B., Montgomery C.S. Comparative studies on X-autosome translocations in the mouse. II. Inactivation of autosomal loci, segregation, and mapping of autosomal breakpoints in five T (X;l) S // Genetics. 1970. V. 64. № 2. P. 281-312.

161. Sado T., Ferguson-Smith A.C. Imprinted X inactivation and reprogramming in the preimplantation mouse embryo // Hum. Mol. Genet. 2005. V. 14 Spec No 1. № P. R59-64.

162. Sado T., Hoki Y., Sasaki H. Tsix silences Xist through modification of chromatin structure // Dev. Cell. 2005. V. 9. № 1. P. 159-165.

163. Sado T., Hoki Y., Sasaki H. Tsix defective in splicing is competent to establish Xist silencing // Development. 2006. V. 133. № 24. P. 4925-4931.

164. Sado T., Okano M., Li E. et al. De novo DNA methylation is dispensable for the initiation and propagation of X chromosome inactivation // Development. 2004. V. 131. № 5. P. 975-982.

165. Sado T., Tada T., Takagi N. Mosaic methylation of Xist gene before chromosome inactivation in undifferentiated female mouse embryonic stem and embryonic germ cells // Dev. Dyn. 1996. V, 205. № 4. P. 421-434.

166. Savarese F., Davila A., Nechanitzky? R. et al. Satbl and Satb2 regulate embryonic stem cell differentiation and Nanog expression // Genes Dev. 2009. V. 23. № 22. P. 2625-2638.

167. Schwartz S., Zhang Z., Frazer K.A. et al. PipMaker~a web server for aligning two genomic DNA sequences // Genome Res. 2000. V. 10. № 4. P. 577-586.

168. Sheardown S.A, Newall A.E., Norris i).P. et al. Regulatory elements in the minimal promoter region of the mouse Xist gene // Gene. 1997. V. 203. № 2. P. 159-168.

169. Shevchenko A.I., Pavlova S V., Dementyeva E.V. et al. Mosaic heterochromatin of the inactive X chromosome in vole Microtus rossiaemeridionalis // Mamm. Genome. 2009. V. 20. №9-10. P. 644-653.

170. Shibata S., Lee J.T. Tsix transcription- versus RNA-based mechanisms in Xist repression and epigenetic choice // Curr. Biol. 2004. V. 14. № 19. P. 1747-1754.

171. Simmler M.C., Cattanach B.M., Rasberry C. et al. Mapping the murine Xce locus with (CA)n repeats II Mamm. Genome. 1993. V. 4. № 9. P. 523-530.

172. Sinkkonen L., Hugenschmidt T., Berninger P. et al. MicroRNAs control de novo DNA methylation through regulation of transcriptional repressors in mouse embryonic stem cells // Nat. Struct. Mol. Biol. 2008. V. 15. № 3. P. 259-267.

173. Skaletsky H., Kuroda-Kawaguchi T., Minx P.J. et al. The male-specific region of the human Y chromosome is a mosaic of discrete sequence classes // Nature. 2003. V. 423. № 6942. P. 825-837.

174. Stadtfeld M., Maherali N., Breaalt D.T. et al. Defining molecular cornerstones during fibroblast to iPS cell reprogramming in mouse // Cell Stem Cell. 2008. V. 2. № 3. P. 230240.

175. Starmer J., Magnuson T. A new model for random X chromosome inactivation // Development. 2009. V. 136. № 1. P. 1-10.

176. Storz G. An expanding universe of noncoding RNAs // Science. 2002. V. 296. № 5571. P. 1260-1263.j

177. Sugimoto M., Abe K. X chromosome reactivation initiates in nascent primordial germ cells in piice // PLoS Genet. 2007. V. 3. № 7. P. el 16.

178. Sun B.K., Deaton A.M., Lee J.T. A transient heterochromatic state in Xist preempts X inactivation choice without RNA stabilization // Mol. Cell. 2006. V. 21. № 5. P. 617-628.

179. Sutou S., Mitsui Y, Tsuchiya K. Sex determination without the Y chromosome in two Japanese rodents Tokudaia osimensis osimensis and Tokudaia osimensis spp // Mamm. Genome. 2001. Y. 12. № 1. P. 17-21.

180. Suwinska A., Tarkowski A.K., Ciemerych M.A. Pluripotency of bank vole embryonic cells depends on FGF2 and activin A signaling pathways // Int. J. Dev. Biol. 2010. V. 54. № l.P. 113-124.

181. Szymanski M., Barciszewska M.ZErdmann V.A. et al. A new frontier for molecular medicine: noncoding RNAs // Biochim, Biophys. Acta. 2005. V. 1756. № 1. P. 65-75.

182. Tada M., Takahama Y, Abe K. et al. Nuclear reprogramming of somatic cells by in vitro hybridization with ES cells //-Curr. Biol. 2001. V. 11. № 19. P. 1553-1558.

183. Takagi N., Yoshida M.A., Sugawara O. et al. Reversal of X-inactivation in female mouse somatic ceils hybridized with murine teratocarcinoma stem cells in vitro // Cell. 1983. V. 34. № 3. P. 1053-1062. ,

184. Thelma B.K., Tewari R., Juyal R.C. et al. Random/nonrandom X-chromosome inactivation in Nesokia indica: possible influence of heterochromatin // Cytogenet. Cell Genet. 1991. V. 56. № 2. P. 87-90.

185. Toth J., Biggin M.D. The specificity of protein-DNA crosslinking by formaldehyde: in vitro and in drosophila embryos // Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. № 2. P. e4.

186. Tsai C.L., Rowntree R.K., Cohen D.E et al. Higher order chromatin structure at the X-inactivation center via looping DNA // Dev. Biol. 2008. V. 319. № 2. P. 416-425.

187. Turker M.S. Gene silencing in mammalian cells and the spread of DNA methylation // Oncogene. 2002. V. 21. № 35. P. 5388-5393.

188. Usheva A., Shenk T. YY1 transcriptional initiator: protein interactions and association with a DNA site containing unpaired strands // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996. V. 93. №24. P. 13571-13576.

189. Vogel W., Jainta S., Rau W. et al. Sex determination in Ellobius lutescens: the story of an enigma// Cytogenet. Cell Genet. 1998. V. 80. № 1-4. P. 214-221.

190. Wakimoto B.T., Hearn M.G. The effects of chromosome rearrangements on the expression of heterochromatic genes in chromosome 2L of Drosophila melanogaster // Genetics. 1990. V. 125. № 1. P. 141-154.

191. Wallis M.C., Waters P.D., Graves J.A. Sex determination in mammals before and after the evolution of SRY // Cell. Mol. Life Sci. 2008. V. 65. № 20. P. 3182-3195.

192. Warshawsky D., Stavropoulos N., Lee J.T. Further examination of the Xist promoterswitch hypothesis in X inactivation: evidence against the existence and function of a P(0) promoter // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999. V. 96. № 25. P. 14424-14429.

193. Wassarman K.M., Storz G. 6S RNA regulates E. coli RNA polymerase activity // Cell. 2000. V. 101. №6. P. 613-623.

194. Wingender E., Chen X, Fricke E. et al. The TRANSFAC system on gene expression regulation // Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. № 1. P. 281-283.

195. Wutz A., Jaenisch R. A shift from reversible to irreversible X inactivation is triggered during ES cell differentiation // Mol. Cell. 2000. V. 5. № 4. P. 695-705.

196. Wutz A., Rasmussen T.P., Jaenisch R. Chromosomal silencing and localization are mediated by different domains of Xist RNA // Nat. Genet. 2002. V. 30. № 2. P. 167-174.

197. Wylie A.A., Murphy S.K., Orton T.C. et al. Novel imprinted DLK1/GTL2 domain on human chromosome 14 contains motifs that mimic those implicated in IGF2/H19 regulation// Genome Res. 2000. V. 10. № 11. P. 1711-1718.

198. Xu N., Donohoe M.E., Silva S.S. et al. Evidence that homologous X-chromosome pairing requires transcription and Ctcf protein // Nat. Genet. 2007. V. 39. № 11. P. 13901396.

199. Xu N., Tsai C.L., Lee J.T. Transient homologous chromosome pairing marks the onset of X inactivation // Science. 2006. V. 311. № 5764. P. 1149-1152.

200. Yaneva M., Kippenberger S., Wang N. et al. PU.l and a TTTAAA element in the myeloid defensin-1 promoter create an operational TATA box that can impose cell specificity onto TFIID function // J. Immunol. 2006. V. 176. № 11. P. 6906-6917.

201. Yang P.K., Kuroda M.I. Noncoding RNAs and intranuclear positioning in monoallelic gene expression // Cell. 2007. V. 128. № 4. P. 777-786.

202. Yang X., Schadt E.E., Wang S. et al. Tissue-specific expression and regulation of sexually dimorphic genes in mice // Genome Res. 2006. V. 16. № 8. P. 995-1004.

203. Yasui D., Miyano M, Cai S. et al. SATB1 targets chromatin remodelling to regulate genes over long distances // Nature. 2002. V. 419. № 6907. P. 641-645.

204. Zakharova I.S., Shevchenko A.I., Zakian S.M. Monoallelic gene expression in mammals // Chromosoma. 2009. V. 118. № 3. P. 279-290.

205. Zakian S.M., Kulbakina N.A., Meyer M.N. et al. Non-random inactivation of the X-chromosome in interspecific hybrid voles // Genet. Res. 1987. V. 50. № 1. P. 23-27.

206. Zawel L., Reinberg D. Initiation of transcription by RNA polymerase II: a multi-step process // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 1993. V. 44. № P. 67-108.

207. Zhang Y., Chen B., Li Y. et al. Transcriptional regulation of the human PNRC promoter by NFY in HepG2 cells // J Biochem. 2008. V. 143. № 5. P. 675-683.

208. Zhao J., Sun B.K., Erwin J.A. et al. Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome I! Science. 2008. V. 322. № 5902. P. 750-756.

209. Zhou T., Chiang CM. Spl and AP2 regulate but do not constitute TATA-less human TAF(II)55 core promoter activity // Nucleic Acids Res. 2002. V. 30. № 19. P. 4145-4157.

210. Zuccotti M, MonkM. Methylation of the mouse Xist gene in sperm and eggs correlates with imprinted Xist expression and paternal X-inactivation // Nat. Genet. 1995. V. 9. № 3. P. 316-320.

Информация о работе
  • Орищенко, Константин Евгеньевич
  • кандидата биологических наук
  • Новосибирск, 2011
  • ВАК 03.02.07
Диссертация
Определение и анализ регуляторных районов гена XIST полевки Microtus Rossiaemeridionalis - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно
Автореферат
Определение и анализ регуляторных районов гена XIST полевки Microtus Rossiaemeridionalis - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации
Похожие работы