Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структура, регуляция и экспрессия генов Oct4 и Nanog у обыкновенных полевок рода Microtus (Arvicolinae, Rodentia)

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Структура, регуляция и экспрессия генов Oct4 и Nanog у обыкновенных полевок рода Microtus (Arvicolinae, Rodentia)"

На правах рукописи

Медведев Сергей Петрович

СТРУКТУРА, РЕГУЛЯЦИЯ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ Ос14 И Nanog У ОБЫКНОВЕННЫХ ПОЛЕВОК РОДА \UCROTUS (АЛУГСОЬШАЕ, НОБЕИПА)

Генетика-03.00.15

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск аил—

2009

003458920

Работа выполнена в лаборатории эпигенетики развития Института цитологии и генетики Сибирского отделения РАН, г. Новосибирск.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Сурен Минасович Закиян Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Александр Владимирович Таранин

доктор биологических наук, профессор Людмила Васильевна Высоцкая

Ведущее учреждение: Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова, г. Москва

Защита состоится на утреннем заседании

Диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-003.011.01) при Институте цитологии и генетики Сибирского отделения РАН по адресу: 630090, г. Новосибирск, пр. академика Лаврентьева, 10. Факс: (383) 333-12-78; e-mail: dissov@bionet.nsc.ru.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института цитологии и генетики Сибирского отделения РАН.

Автореферат разослан Ученый секретарь

Диссертационного совета, « У

доктор биологических наук —" "N/i^4^ А.Д. Груздев

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность.

Получение и исследование эмбриональных стволовых клеток различных видов млекопитающих является одной из актуальных проблем современной биологии. Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) получают из внутренней клеточной массы (ВКМ) либо эпибласта предымплантационных эмбрионов млекопитающих. Одно из основных уникальных свойств ЭСК -плюрипотентность. Плюрипотентность определяет способность ЭСК дифференцироваться, in vivo и in vitro, в производные всех трех зародышевых листков, эктодермы, энтодермы и мезодермы, а также образовывать во время эмбрионального развития клетки предшественники функциональных гамет (Boiani, Sholer, 2005).

На сегодняшний день известно, что поддержание плюрипотентного статуса клеток предымплантационных эмбрионов и ЭСК обеспечивается сложной системой клеточно-поверхностных белков, их молекулярных сигнальных путей (подсистема «внешних регуляторов плюрипотентности») и транскрипционных факторов инициирующих или модулирующих транскрипцию генов-мишеней (подсистема «внутренних регуляторов плюрипотентности»).

Подсистема, так называемых «внешних регуляторов плюрипотентности», включает в себя несколько сигнальных путей, основными из которых являются каскады, запускаемые белками LIF, ВМР4 и \VNT. Действие данных сигнальных путей происходит in vitro, осит видоспецифичньш характер. Одни и те же молекулы могут поддерживать плюрипотентность ЭСК мыши и не влиять на плюрипотентность ЭСК человека. Более того, одни и те же пути могут иметь противоположное влияние на ЭСК мыши и человека (Xu et al., 2002; Humphrey étal, 2004; Sumi étal., 2004; Boiani, Sholer, 2005).

Другой подсистемой, регулирующей плюрипотентность ЭСК, является подсистема «внутренних регуляторов плюрипотентности» - транскрипционных факторов, действующих в ядрах клеток. К числу ключевых регуляторов в данной подсистеме относятся транскрипционные факторы ОСТ4 и NANOG. Данные факторы участвуют в поддержании плюрипотентности клеток как in vivo так и in vitro. Эмбрионы мыши, гомозиготные по нокауту генов Oct4 и Nanog, гибнут в периимплантоционный период развития вследствие недоразвития ВКМ и эпибласта, соответственно (Nichols et al, 1998; Chambers étal., 2003; Mitsui et al, 2003). Подавление экспрессии генов Oct4 и Nanog в ЭСК мыши и человека вызывает дифференцировку клеток в трофобластные производные и производные примитивной энтодермы и мезодермы, соответственно (Niwa et al, 2000; Vekey, О'Shea, 2003; Hay et al, 2004; Hyslop et al., 2005). Совместно с транскрипционным фактором SOX2 они образуют единую систему регуляции транскрипции генов в ЭСК. Взаимодействие этих факторов приводит к формированию двух регуляторных подсистем: авторегулягорной и подсистемы прямой регуляции широкого спектра генов мишеней, большинство из kotoj

участвует в процессах дифференцировки ЭСК (Boyer et al., 2005; Loh et al, 2006). Геномная организация, экспрессия и регуляция генов, кодирующих факторы ОСТ4 и NANOG, подробно исследованы только у человека и мыши -видов, для которых получены стабильные линии ЭСК (Chambers, Smith, 2004).

Получение линий ЭСК других видов млекопитающих представляет на сегодняшний день серьезную проблему. Открытым остается вопрос о причинах высокой разницы в эффективности получения плюритютентных эмбриональных стволовых клеток у различных видов млекопитающих. Некоторые экспериментальные данные говорят о том, что отрицательный результат экспериментов по получению стабильных линий ЭСК может быть следствием видоспецифичных особенностей регуляции и экспрессии генов системы поддержания плюрипотентности, таких как Oct4 и Nanog (Buehr et al., 2003).

Исследование структуры, регуляции и экспрессии генов, кодирующих транскрипционные факторы ОСТ4 и NANOG у различных видов млекопитающих важно для формирования представлений о функционировании системы поддержания плюрипотентности в целом и особенностях данной системы у каждого вида в отдельности. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей регуляторных и кодирующих частей генов Oct4 и Nanog млекопитающих позволяет выявить наиболее эволюционно консервативные последовательности, несущие функциональную нагрузку. Кроме того, сравнение нуклеотидных последовательностей и паттерна экспрессии генов Oct4 и Nanog у различных видов млекопитающих позволяет проследить отличия, которые могут являться причиной неудач при получении ЭСК.

Обыкновенные полевки рода Microtiis являются модельным объектом для которого ведутся работы по получению ЭСК (Nesterova et al., 2001; Шевченко и др., 2006). Использование стандартных протоколов получения ЭСК мыши и человека на полевках не привели к получению стабильных, плюрипотентных ЭСК. Исследование молекулярно-генетических особенностей структуры генов Oct4 и Nanog, их регуляции и экспрессии у полевок может способствовать выявлению видоснецифических особенностей подсистемы «внутренних регуляторов плюрипотентности» и разработке оптимальной стратегии исследования характеристик «генов плюрипотентности», критичных для получения ЭСК. Полученные знания позволят составить модифицированные, более эффективные, протоколы получения эмбриональных стволовых клеток для видов млекопитающих, получение ЭСК у которых затруднено.

Цель и задачи исследования. Цель работы - исследовать структуру, регуляцию и особенности экспрессии генов Oct4 и Nanog у обыкновенных полевок рода Microtus. В конкретные задачи работы входило:

1. Определить последовательность нуклеотидов кодирующих и

регуляторных частей генов Oct4 и Nanog полевки М. rossiaemeridionalis.

2. Произвести анализ полученных нуклеотидных последовательностей и сравнение нуклеотидных последовательностей генов ОсЫ и Nanog полевки с ортологами этих генов у других видов млекопитающих.

3. Исследовать экспрессию мРНК генов Ос(4 и Nanog в онтогенезе полевки.

4. Построить репортерные конструкции, содержащие ген люциферазы под контролем различных элементов регуляторной области гена Ом4, и исследовать активность данных конструкций в линиях плюрипотентных и неплюрипотентных клеток.

Научная новизна.

1. Впервые получены геномные нуклеотидные последовательности генов Ос 14 и Nanog полевки М. го$5'шетег'кИопаИ$. Установлена их экзон-интронная структура. Для гена Ос14 установлена нуклеотидная последовательность регуляторной области, размером 4017 п.н. Геномные нуклеотидные последовательности и последовательности кДНК генов Ос14 и Nanog полевки М. го8$1аетеп(ИопаИ5 зарегистрированы в базе данных ОепеВапк под номерами: Ос14 (ЕР032593 и ЕР030115, соответственно); Ыапо£ (Еи908043 и Еи908044, соответственно).

2. В данной работе впервые исследована экспрессия генов Ос14 и Nanog в онтогенезе и отдельных органах полевки М. го$$1аетег'и1юпаИ$. Показаны сходства и отличия в паттерне экспрессии генов Ос14 и Nanog в онтогенезе мыши и полевки.

3. Впервые исследована активность репортерных конструкций, содержащих различные части регуляторной области гена Ос14 полевки в линиях плюрипотентных клеток мыши и трофобластных стволовых клетках полевки. Показано, что регуляторная область гена Ос14 полевки активна в клетках мыши и неактивна в неплюрипотентных клетках полевки.

Положения выносимые на защиту.

1. Молекулярно-генетическая организация, регуляция и экспрессия гена Ос¡4 обладают высокой эволюционной консервативностью.

2. Молекулярно-генетическая организация гена Nanog полевки сходна с таковой у мыши. Однако, существуют отличия на уровне аминокислотных последовательностей функционального домена СВ2. Обнаружено, что несколько из остатков ароматических аминокислот, влияющих на трансактивационные свойства домена С02 белка ЫАЫОО мыши, отсутствуют у полевок. Паттерн экспрессии гена Nanog полевки и мыши различаются, в отличие от гена Nanog мыши, он не экспрессируется на постымпланационных стадиях развития эмбрионов.

Практическая значимость.

Результаты данной работы расширяют знания о генах Oct4 и Nanog как отдельных элементов системы поддержания плюрипотентности клеток у млекопитающих и могут быть использованы при планировании и проведении экспериментов по получению ЭСК.

Апробация работы.

Результаты работы представлены в материалах международной конференции «Генетика в России и мире» (Москва, 28 июня - 2 июля, 2006 г.), на международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы Молекулярной и Клеточной Биологии» (Томск, 9-12 мая 2007 г.).

По теме диссертации опубликованы две работы. Одна - в рецензируемом зарубежном журнале, другая - в рецензируемом отечественном журнале. Еще две стать приняты в печать, в рецензируемые отечественные журналы

Вклад автора.

Основные результаты получены автором самостоятельно. Скрининг фаговой геномной библиотеки полевки М. rossiaemeridionalis проводился совместно с к.б.н. А.И. Шевченко, анализ нуклеотидных последовательностей генов Oct4 и Nanog проводился совместно с к.б.н. Е.А. Елисафенко.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, 3-х глав, выводов и списка литературы (134 наименований). Работа изложена на 116 страницах, содержит 12 рисунков и 15 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 1. Скрининг фаговой геномной библиотеки и молекулярные методы работы.

Геномная библиотека полевки М. rossiaemeridionalis (Nesterova et al., 2001) построенная на основе фагового вектора Lamda DASH II (Stratagene), скринирована в соответствии со стандартной методикой (Sambrook et al., 1989). Зондом для скрининга служил ПЦР-продукт размером 631 п.н., полученный с использованием в качестве матрицы геномной ДНК полевки и праймеров: Oct2F 5'-ccaagctgctgaagcagaaga-3' и Oct5R 5'-tttgaatgcatgggagagccca-3'. Выделение ДНК фагов проводили согласно методу описанному Забаровским и Туриной с некоторыми модификациями (Забаровский, Турина, 1998). Все методы, связанные с работой с рекомбинантной ДНК (выделение плазмидной ДНК, расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции, лигирование, субклонирование фрагментов ДНК, ПЦР) выполнялись согласно руководству Sambrook et al., 1989.

Амплификацию гена Nanog осуществляли с помощью набора реагентов Expand Long Template PCR System (Roche). Реакцию проводили в объеме 50 мкл, с использованием буфера 3. Программа: 94°С - 2 мин., 10 циклов: 94°С - 10 сек., 58°С - 30 сек., 68°С - 8 мин.; 25 циклов: 94°С - 15 сек., 58°С - 30 сек., 68°С - 8

мин (+20 сек. каждый цикл). Финальная элонгация - 8 мин. Праимеры использованные для амплификации гена Nanog: NanogLF: 5'-ctgggtcaccttacagcttcttttgcattacaatg-3; Nanog-3UTR_R2: 5'- aggattggggtgggtaagtgtgtgtgaatgtgggg-3'.

Определение нуклеотидной последовательности проводили согласно протоколу ABI PRISM BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems, Perkin-Elmer Corporation).

2. Работа с РНК, ОТ-ПЦР, 3'- и 5'-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) эксперименты.

РНК из предымплантационных эмбрионов полевок выделяли с помощью TRI REAGENT (Sigma). РНК из клеточных культур (RI, XEN Мб) и органов взрослых полевок (передних долей головного мозга, сердца, тимуса, желудка, печени, кишечника, яичников и семенников) выделяли с помощью RNA-Bee (Biogenesis), согласно прилагаемым рекомендациям. Для очистки образцов РНК от контаминации ДНК использовали набор реагентов TURBO DNA-free (Ambion). Реакции обратной транскрипции проводили при помощи обратной транскриптазы M-MLV (Promega) и случайных праймеров Random-Decamer (Ambion), согласно рекомендациям фирм производителей. Полученная кДНК затем амплифицировалась при помощи ПЦР. Для амплификации использовались следующие праймеры:

Oct 4 (5 ' -ccaagctgctgaagcagaaga-3 ' ; 5 '-tttgaatgcatgggagagccca-3 '), Nanog (5'-acctcagcctccagcagatgcaag-3"; 5'-aaggcttgtggggtgctaaaatg-3'), ß-actin (5 '-gacggggtcacccacactgt-3 ' ; 5 ' -gagtacttgcgctcaggaggag-3 ' ).

Для проведения RACE экспериментов использовали BD SMART RACE cDNA Amplification Kit (Clontech).

Гснспецифические праймеры, использованные в RACE экспериментах: oct4_3'RACEl: 5'-ctggagaagtgggtggaggaagccgacaa-3'; oct4_5'RACE2: 5'-ggttccccctcacgccgttctcaat-3'; nanog-3'RACEl : 5'-gcagccagacctggaccaaccctac-3'; ß-actin: 5'-gatatcgctgcgctggtcgt-3' и 5'-agatcttctccatgtcgtcc-3\

3. Конструирование репортерных векторов. Временная трансфекция и измерение активности люциферазы.

Для получения репортерной конструкции, содержащей дистальный энхансер гена Oct4 полевки, (pDE2) фрагмент регуляторной области (-2186/1895) клонирован в вектор pGL2-Basic (Promega) по сайтам Bgl ll-Hind III в 5'-область гена люциферазы. Для получения конструкции, содержащей все элементы регуляторной области, в плазмиду pDE2 по сайту Hind III клонирован фрагмент (-1895/+106), содержащий проксимальный энхансер и промотерную область гена Oct4 полевки (конструкция pDEH6). Фрагмент (-1895/+106) клонирован в pDE2 также в противоположенной ориентации (конструкция pDEH7). Кроме того, фрагмент (-1895/+106) клонирован отдельно в вектор pGL2-Basic в обеих ориентациях по отношению к гену люциферазы (конструкции pADEl и рДЕ)Е2, соответственно). В результате гидролиза плазмиды pDEH6 эндонуклеазой рестрикции Крп I и последующего лигирования получена конструкция pDEH6K4, несущая делецию сайта 1А проксимального

энхансера. Плазмида pDEH6S7, содержащая исключительно промоторную область (-603/+106) гена Oct4 полевки, получена в результате гидролиза плазмиды pDEH6 эндонуклеазой рестрикции Sma I.

Для транфекции клеток использовали Lipofectamin2000 (Invitrogen), трансфекцию проводили согласно прилагающейся к реагенту инструкции. Для детекции люциферазной активности использовали Luciferase Assay System (Ргогг^а).Для измерения люциферазной активности использовали биолюминометр ЛБ-ЗПА.

4. Контекстный анализ последовательностей ДНК.

Компьютерный анализ последовательностей ДНК выполнен с помощью пакетов программ BLAST (Altschul et al., 1990), FASTA (Pearson, Lipman, 1988), DNASTAR (DNASTAR Inc.). Выравнивание последовательности нуклеотидов производилось при помощи программы Pip Maker (http:Wwww.bio.cse.psu.edu), LALIGN из пакета программ FASTA, CLUSTAL X 1.81, для оценки статистической значимости гомологии двух последовательностей - программа RSS из пакета FASTA. Для выявления повторяющихся элементов использовалась база данных повторов в геномах человека и грызунов RepBase (Jurka, 1995), программа RepeatMasker (http://www.repeatmasker.org/cgi-bin/WEBRepeatMasker).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Исследование нуклеотидной последовательности и экзон-интронной структуры гена Oct4 полевки М. rossiaemeridionalis.

Геномная последовательность Oct4 полевки выделена в результате скрининга геномной фаговой библиотеки полевки М. rossiaemeridionalis построенной на основе вектора Lamda DASH II (Nesterova et al., 2001). Определена последовательность встройки фага размером 10315 п.н., в составе которых, на основании гомологии с последовательностью гена Oct4 мыши, выявлены 5 экзонов, 4 интрона и регуляторная область гена Oct4. В пределах 5'-регуляторной области, обшей протяженностью 4017 п.н., выявлены минимальный промотор, проксимальный и дистальный энхансеры. Последовательности, расположенные за пятым экзоном гена Oct4, которые секвенированы лишь частично, имеют область гомологии, размером 856 п.н. с З'-областью и четвертым экзоном гена Tcfl9 мыши. Наличие в З'-области гена Oct4 полевки последовательностей, гомологичных гену Тс/19 мыши, указаваег на то, что у полевки, по-видимому, сохраняется синтенная группа, обнаруженая у всех исследованных видов млекопитающих (Yeom et al., 1991;Takeda et al., 1992; van Eijk et al., 1999; Shi et al., 2007). С использованием программы RepeatMasker полученная последовательность проанализирована на предмет наличия повторяющихся элементов. В интронах и 5' и 3' области гена Oct4 полевки выявлены повторяющиеся последовательности ДНК. Основную их массу составляют SINE элементы. Совокупная доля повторов А1и/В1 и В2-В4 в полученной последовательности гена Oct4 и его регуляторной области составляет 16,24 %.

Для определения экзон-интронных границ и границ транскрипции гена ОШ полевки проведены 3'- и 5'-ИАСЕ эксперименты. Выявленный транскрипт гена ОШ полевки имеет длину 1357 нуклеотидов и кодирует белок размером 354 а.о.. На 5'-иТ11 приходится 71 п.н., на З'-иТЯ - 224 п.н. Точка старта транскрипции ОШ у полевки, по сравнению с мышью, располагается на 23 п.н. раньше и приходится на инсерцию 8 п.н., характерную для минимального промотора полевки. Сигнал полиаденилпрования Осч4 полевки имеет видоспецифическую последовательность, 3' граница гена, по сравнению с геном мыши, располагается на 7 п.н. раньше. Продуктов альтернативного сплайсинга гена ОШ полевки не обнаружено.

2. Сравнительный анализ ортологичных последовательностей гена ОШ млекопитающих.

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов ОШ семи видов млекопитающих (полевки, мыши, крысы, человека, шимпанзе, быка и собаки), проведенный с помощью программы ИрМакег, показал наличие высокого уровня гомологии в экзонах генов ОШ. Наибольшее среднее значение гомологии кодирующей части гена ОШ полевки наблюдается с мышью и крысой, наименьшее ~ с собакой. Высокий уровень гомологии (75-95%) характерен в основном только для экзонов. В интронах, 5' и 3' области гомология ниже (55-70%), особенно в участках, где локализуются видоспецифичсские мобильные элементы. При сравнении аминокислотной последовательности гена ОШ на высоком уровне во всех парах сравниваемых видов сохраняется сходство РСШ-домена (Таб. 1).

Таблица 1. Гомология (%) нуклеотидных/аминокислотных последовательностей кодирующих частей генов ОШ полевки и шести видов млекопитающих.

Пары сравниваемых видов Номера экзонов Среднее значение гомологии Гомология в области POU- . домена

1 2 3 4 5

Mr/Mm 83/ 80 95/ 95 91/ 97 86/ 81 79/ 85 87/80 90/91

Mr/Rn 84/ 82 95/ 95 92/ 97 88/ 84 84/ 87 89/87 91/93

Mr/Hs 80/ 80 87/ 92 87/ 97 83/ 90 71/ 80 83/85 87/94

Mr/Pt 79/ 78 86/ 90 87/ 95 79/ 86 83/ 78 82/83 86/92

Mr/Bt 75/ 72 85/ 90 88/ 97 87/ 94 70/ 78 81/82 88/94

Mr/Cf 75/ 70 85/ 90 87/ 97 88/ 92 81/ 77 81/80 88/94

Примечания. Mr - M rossiaemeridionalis, Mm - Mus musculus, Rn — Rattus norvégiens, Hs - Homo sapiens, Pt - Pan troglodytes, Bt - Bos taurus, Cf - Canis familiaris.

5'-рс1уляторная область гена Oct4 была исследована на предмет наличия консервативных элементов, которые могут быть задействованы в регуляции экспрессии гена Oct4. Филогенетический футпринт промоторной области выявил, что наиболее консервативными в ней являются потенциальные сайты связывания транскрипционных факторов семейства Sp и гормончувствительный элемент, которые сохраняют высокое сходство и устойчивое расположение друг относительно друга. Гомология остальных элементов регуляторной области гена Oct4 существенно варьирует. Наблюдается высокая гомология GC-богатых мотивов и авторегуляторного Oct4/Sox2 сайта, в то время как гомология сайтов связывания транскрипционных факторов MASH-2 и РЕМ довольно ограничена. Этот факт может говорить о том, что основную функцию в регуляции гена Oct4 играют именно GC-богатые мотивы и авторегуляторный сайт OCT4/SOX2.

3. Анализ активности промотора гена Oct4 полевки.

Проведена временная трансфекция люциферазных репортерных векторов, содержащих различные элементы 5'-регуляторной области гена Oct4 полевки, в эмбриональные стволовые клетки мыши линии TG-2a, клетки эмбриональной карциномы мыши Р19 и трофобластные стволовые клетки полевки линии R1 (Рис. 1). Наибольшую люциферазную активность (превышающую фоновый уровень в ~8 раз) в плюрипотентных клетках линии TG-2a мыши показал клон pDEH6, содержащий промотор и оба энхансера (-2186/+106) в прямой ориентации по отношению к гену люциферазы. Таким образом, показано, что полноразмерная регуляторная область гена Oct4 полевки проявляет высокую активность в плюрипотентных клетках мыши. В плюрипотентных клетках эмбриональной карциномы линии Р19, высокую активность, практически равную pDEH6, показал клон pADEl (-1895/+106), дистальный энхансер в котором делетирован. Однако в эмбриональных стволовых клетках активность данной конструкции была выше фоновой лить в 1,5 раза (Рис. 1). Этот результат согласуется с данными полученными при исследовании активности различных элементов регуляторной области гена Oct4 мыши. Дистальный энхансер гена Oct4 мыши неактивен в ЭСК и активен в клетках линии Р19. По-видимому, у полевки данный элемент имеет сходную с мышью схему активности.

Наименьшую активность, сравнимую с фоновой, показали конструкции pDEH7 и pDE2. В клоне pDEH7 промотор и проксимальный энхансер находятся в обратной ориентации по отношению к гену, а в клоне pDE2 данная область (-1895/+106) делегирована. Таким образом, для активации транскрипции осуществляемой регуляторной областью гена Oct4 неоходима его прямая ориентация по отношению к гену. Клон pDEH6K4, содержащий делецию сайта 1А проксимального энхансера, также показал низкую активность в клетках TG-2a и Р19 (в ~2 и ~3 раза выше фоновой в TG-2a и PI9, соответственно). Активность конструкции pDEH6S7, содержащей только промотор гена Oct4 (-603/+106), также была выше фона в ~3 раза. Таким образом, для оптимальной активации транскрипции не достаточно наличия промоторной области и энхансерные элементы вносят значительный вклад в его активацию. При трансфекции клеток

линии Ш наблюдали низкий, сравнимый с фоновым, уровень люциферазной активности во всех вариантах конструкций (Рис. 1). По всей видимости, только в плюрипотентных клетках существует сбалансированный, и достаточный набор факторов, участвующих в активации г ена ОШ, как у мыши так и у полевки.

Крп I Крп!

ар/и шпат 5та1 им ш

-2186 .1896 -1136 -воз +106

DE (2А) PE (1А) (IB) РР

—|-И-«

О 50 100 1S0 200

Люциферазная активность

Рис. 1. Анализ активности люциферазных репортерных конструкций содержащих различные элементы регуляторной области гена Oct4 полевки в линиях клеток TG-2a, Р19 и Rl. РР - проксимальный промотор; PE (1А) (1В) — проксимальный энхансер, сайты 1А и !В; DE (2А) - дист&чьный энхансер, сайт2А.

В качестве негативного контроля трансфекции и определения фонового уровня люминесценции использовали плазмиду pGL2-Basic без встройки (Рис. 1).

4. Исследование нуклеотидной последовательности и экзон-интронной структуры гена Nanos полевки М. rossiaemeridionalis.

Для получения геномной последовательности гена Nanog полевки проводили ТТЦР с праймерами NanogLF и Nanog-3UTR_R2. ПЦР-продукт размером 7026 п.н. секвенирован с помощью генспецифических праймеров. К полученной последовательности была добавлена последовательность З'-области кДНК гена Nanog полевки, определенная после секвенирования продуктов 3'-RACE. В итоговой последовательности размером 7849 п.н. на основании гомологии с последовательностью гена Nanog мыши выявлены последовательности, соответствующие 4 экзонам и 3 интронам гена Nanog.

Повторяющиеся последовательности ДНК в гене Nanog представлены исключительно SINE элементами. Доля данных элементов (Alu/Bl, В2-В4, ID) в изученной последовательности составляет 36,07%. SINE элементы обнаружены во всех трех интронах и З'-UTR гена Nanog полевки.

Для определения экзон-интронных границ и границ транскрипции гена Nanog полевки использованы ОТ-ПЦР и З'-RACE эксперименты. В качестве источника РНК использовали бластоцисты М. rossiaemerídionalis. Сравнение клонов кДПК, полученных в результате RACE, с геномной последовательностью позволило подтвердить наличие в гене Nanog четырех экзонов, соответствующих экзонам Nanog других исследованных видов млекопитающих. Выявленный размер транскрипта гена Nanog составляет 2411 н. предполагаемый размер белка NANOG полевки 319 а.о. Транскрипт гена Nanog полевки имеет протяженную З'-UTR, размером 1291 п.н., содержащею блок SINE элементов. Альтернативных вариантов сплайсинга гена Nanog полевки не обнаружено.

5. Сравнительный анализ ортологичных последовательностей гена Nanos млекопитающих.

Проведен, сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей ортологичных генов Nanog и аминокислотных последовательностей белков NANOG семи видов млекопитающих (полевки, мыши, крысы, человека, шимпанзе, быка и собаки). Числовые значения гомологии представлены в таблице 2. Наибольшим уровнем гомологии обладают второй и третий экзоны. Первый экзон проявляет низкий уровень гомологии. Четвертый экзон гомологичен лишь частично, основную его часть составляет З'-UTR, содержащая видоспецифичные SINE элементы. В интронах генов Nanog гомология крайне низка, что, по всей видимости, также связано с большим содержанием SINE элементов.

Таблица 2. Гомология (%) нуклеотидных/амикокистаткых последовательностей кодирующих частей генов Ыапо£ полевки и шести видов млекопитающих

Пары сравниваемых видов Номера экзонов Среднее значение гомологии

1 2 3 4

Mr/Mm 60/54 80/64 82/76 54/64 60/62

Mr/Rn 65/60 80/65 86/83 57/69 77/67

Mr/Hs 54/49 71/64 82/79 48/57 66/54

Mr/Pt 53/49 70/64 82/79 48/56 66/54

Mr/Bt 48/47 68/64 84/76 42/56 63/52

Mr/Cf 46/43 68/61 78/72 47/48 65/49

Примечания. Mr - M. rossiaemeridionalis, Mm - Mus musculus, Rn - Rattus norvegicus, Hs - Homo sapiens, Pt - Pan troglodytes, Bt - Bos taurus, Cf - Canis familiaris.

Проведено детальное сравнение функциональных элементов белка ЫАЫОО полевки и шести видов млекопитающих. В анализ были включены аминокислотные последовательности гомеодоменов, С02-терминальных трансактивационных доменов и \У-повторов белков ЫАМОО семи видов млекопитающих, включая полевку. Числовые значения гомологии аминокислотных последовательностей функциональных доменов белка ЫАЫОО семи видов млекопитающих представлены в таблице 3.

Таблица 3. Гомология (%) аминокислотных последовательностей функциональных элементов белков ЫАМОО полевки и шести видов млекопитающих.

Пары сравниваемых видов Гомология гомеодомена Гомология N-терминалыюго домена Гомология W-повтора Гомология CD2-терминального домена

Mr/Mm 86,66 48,48 75,00 62.80

Mr/Rn 88,33 51,51 84,61 68,48

Mr/Hs 86,66 42,85 59,57 50,29

Mr/Pt 86,66 42,85 59.57 49,70

Mr/Bt 88,33 38,82 59,57 45,32

Mr/Cf 85,00 40,74 55,31 40,96

Примечания. Mr - M. rossiaemeridionalis, Mm - Mus musculus, Rn - Rattus norvegicus, Hs - Homo sapiens, Pt - Pan troglodytes, Bt - Bos taurus, Cf - Canis familiaris.

В белке NANOG полевки обнаружено самое большое среди проанализированных последовательностей белков NANOG семи видов млекопитающих число мономеров данного повтора - тринадцать (мышь -10; крыса - 11; человек и шимпанзе - 8; бык и собака - 9) (Рис. 2). Один из мономеров у полевки редуцирован и имеет вид W-(X)3. Общая протяженность триптофанового повтора в белке NANOG полевки 64 а.о. Недавние исследования показывают, что W-повтор белка NANOG мыши необходим для трансактивации транскрипции генов-мишеней. Он участвует в димеризации молекул белка NANOG, что необходимо при LIF-независимом поддержании плюрипотентности ЭСК мыши (Mullin et al., 2008). По всей видимости, функциональную роль играют именно остатки триптофана. Замена триптофана на аланин вызывает существенное снижение грансактивационной способности белка NANOG мыши, в то время как замена остальных аминокислот в пределах мономеров W-повтора не вызывает существенного изменения активности (Pan, Pei, 2005). Сравнение аминокислотных последовательностей белков NANOG полевки и шести видов млекопитающих выявило высокую консервативность остатков триптофана по сравнешо с остальными аминокислотными остатками в мономерах W-повторов (Рис. 2). Это может служить еще одним доказательством их высокой функциональной значимости. Вариация числа мономеров W-повторов от 13 (полевка) до 9 (бык и собака) у разных видов вероятно не

является критической при образовании димеров и проявлении трансактивационных свойств белков NANOG.

Еще одним трансактивационным элементом белка NANOG является С-терминальный домен 2(CD2) (Wang et al., 2008). Данный элемент необходим для ' NANOG-опосредованного самообновления ЭСК мыши. Обнаружено, что активность домена CD2 зависит от наличия в нем остатков ароматических ' аминокислот (фенилаланина и триптофана). Сравнение аминокислотных последовательностей домена CD2 показало, что большинство остатков ароматических аминокислот, играющих определяющую роль в

трансактивационной способности CD2 белка NANOG мыши, обладают низкой консервативностью среди млекопитающих и их участие в данном процессе у различных видов следует изучать подробнее.

S4

S3 ftï

75 72

169 16« 1С 9 165

157

252 237

230 1

230

221

cd2

Рис. 2. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей белков NANOG семи видов млекопитающих. Синими линиями выделены: гомеодомен и W-повтор. Красными линиями выделены: С-концевые домены 1(CD1) и 2(CD2). Черными прямоугольниками и цифрами обозначены позиции ароматических аминокислот необходимых для оптимальной трансактивационной активности домена CD2 белка NANOG мыши. * - полностью совпадающие позиции. Mr - M. rossiaemeridionalis, Mm - Mus musculus, Rn - Rattus norvegicus, Hs - Homo sapiens, Pt - Pan troglodytes, Bt - Bos taurus, Cf - Canis familiaris.

мг юдоедюдоамшгяалшрт*»«^^ - ITUAWIM

м» тшммвигчи. -ммюДстидаючшдаай «сацдегам)

WWW jp^P^ "p »з"- ! * i^r},;.

Гомеодомеи

a ¡(¿тЗЯЕоГ i^llIxljKSi

6. Анализ экспрессии генов Ос14 и Nanos в онтогенезе полевки М. rossiaemeridionalis.

Методом З'-RACE экспрессия гена Oct4 полевки выявлена в предымплантационном развитии на стадиях морулы, бастоцисты (2,5 - 4,5 д.п.о.), а также на постимплантационных стадиях развития до 17 д.п.о. (Рис. 3).

Nanog

Оси

p-nctiu

Рис. 3. (А) Анализ экспрессии генов Oct4 и Nanog в эмбриогенезе полевки М. rossiaemeridionalis методом З'-RACE. (Б) Анализ экспрессии генов Oct4 и Nanog в линиях клеток примитивной энтодермы полевок (XEN Мб), трофобластных стволовых клетках полевок (R1), а также органах взрослых полевок М. rossiaemeridionalis. В качестве положительного контроля реакций обратной транскрипции в ПЦР использовали праймеры на fi-actin. (ОТ+) реакции с добавлением обратной транскриптазы, (ОТ-) отрицательный контроль. Реакции без обратной транскриптазы.

В предымплантационном эмбриогенезе полевки транскрипция гена Oct4 впервые выявляется на стадии морулы и продолжается вплоть до стадии бластоцисты. На постимплантацционных стадиях (8,0-17,0 д.п.о.) транскрипция гена Oct4 обнаружена во всех образцах. Экспрессия гена Nanog обнаружена на 2-х клеточной стадии, на стадии морулы и бластоцисты. На постимплантационных стадиях развития эмбрионов полевки экспрессия гена

1$сто£ не детектировалась. По всей видимости, у полевок происходит более ранняя репрессия транскрипции гена Nanog. Возможно, остаточного белка достаточно для первичной специализации терминальных клеток. В органах взрослых полевок (передние доли головного мозга, сердце, тимус, желудок, печень, кишечник, яичники и семенники), помощью метода ОТ-ПЦР транскрипция генов Ос ¡4 и Nanog не обнаружена. В данном случае паттерн экспрессии генов ОШ и Nartog совпадает с таковым у мыши. В клетках линий Ш и ХНЫ Мб полевки, являющихся производными трофобласта и примитивной энтодермы бластоцист, соответственно, экспрессия Ос14 и Nanog также не обнаружена. Вероятно, у полевки, как и у мыши, экспрессия генов ОШ и Nanog ограничивается недифференцированными, плюрипотснтными клетками. Следовательно, гены Ом4 и Nanog можно использовать как маркерные гены при получении ЭСК полевок рода МкгоШ. Наиболее полно в данном направлении можно использовать ген Nanog, поскольку его экспрессия у полевок ограничивается стадиями предымплантационного развития.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе представлены результаты исследований структуры, регуляции и особенностей экспрессии генов Ос14 и Nanog у обыкновенных полевок рода МкгоШ, Гены Ос¡4 и Nanog являются одними из основных в системе поддержания плюрипотентности клеток у млекопитающих.

Определена полная нуклеотидная последовательность гена Ос14 полевки М. гоя5'шете.г1сИопа1п размером 4607 п.н. Проведено детальное исследование экзон-интронной организации генов Ос14 и Nanog, сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей данных генов у полевки и шести видов, относящихся к разным отрядам млекопитающих. Сравнение нуклеотидных последовательностей генов Ос/4 полевки М. гохх1аетег'и1юпа1Ь и шести видов млекопитающих (мыши, крысы, человека, шимпанзе, быка и собаки) показало высокую консервативность кодирующей последовательности гена Ос!4 Наибольший уровень гомологии наблюдается между эволюционно близкими видами: полевкой, мышью и крысой.

Проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей 5'-регуляторных областей ортологичных генов Ос14. Основные функциональные элементы данной области (область минимального промотора, дистальный и проксимальный энхансер) проявляют высокую степень сходства у всех сравниваемых видов млекопитающих. Показано, что наибольшей консервативностью обладают: вС-богатые сайты, потенциальные сайты связывания транскрипционных факторов семейства Зр, гормончувствительный элемент (НКЕ), а также авторегуляторный композиционный сайт связывания факторов ОСТ4 и 80X2. Гомология сайтов транскрипционных факторов МАБН-2 и РЕМ низка.

Показано, что последовательность 5'-регуляторной области гена Ос/4 проявляет способность активировать транскрипцию в составе репортерных конструкций в плгорипотентных клетках мыши. Отдельные элементы

регуляторной области гена ОШ полевки проявляют функциональную гомологию с таковыми у мыши. Дистальный энхансер гена ОШ полевки, как и у мыши, активен в ЭСК.

В ходе работы, определена полная нуклеотидная последовательность гена Nanog полевки М. говйаетеп<ИопаИз размером 7586 п.н., установлена его экзон-интронная структура. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов Nanog и шести видов млекопитающих (мыши, крысы, человека, шимпанзе, быка и собаки) выявил более низкий по сравнению с геном ОШ уровень гомологии (до 77%). Наибольшей гомологией обладают второй и третий экзоны генов Nanog, кодирующие основной функциональный элемент белка КАМСЮ - гомеодомен. Сравнение аминокислотных последовательностей предсказанного белка ИАМСЮ полевки и шести видов млекопитающих показало относительно высокий уровень гомологии (85-88%) гомеодомена во всех парах сравниваемых видов. № и С-трансактивационные домены, а также область W-пoвтopa показали относительно высокий уровень гомологии только между эволюционно близкими видами: полевкой, мышью и крысой. Однако, показано, что остатки ароматических аминокислот в домене С02 белка NANOG, играющим важную роль в трансактивации генов-мишеней у мыши, обладают низкой консервативностью среди изученных видов.

Исследование экспрессии генов ОШ и Nanog в онтогенезе полевки показало, что данные гены в основном сохраняют паттерн экспрессии характерный для мыши, т.е. их экспрессия ограничивается плюрипотентными клетками. Однако, экспрессия гена Nanog, в отличие от мыши, ограничивается предымплантационными стадиями развития эмбриона. Возможно, на стадии бластоцисты, той стадии развития эмбриона, которая используется для получения ЭСК, у полевок, уже происходят процессы связанные с репрессией транскрипции гена Nanog. Снижение уровня транскрипции гена Nanog в свою очередь может критически снижать вероятность получения стабильных линий ЭСК. Вероятно, выходом из данной ситуации может быть использование для получения ЭСК более ранних стадий развития эмбрионов, например, морул.

Описанные в работе данные, позволяют лучше понять особенности функционирования элементов системы поддержания плюрипотентносги клеток у млекопитающих и будут полезны при проведении экспериментов по получению ЭСК различных видов млекопитающих.

ВЫВОДЫ

1. Впервые определена нуклеотидная последовательность гена ОШ полевки М. гси.иаетег^сИопаНз размером 4607 п.н. и установлена его структурно-функциональная организация. Ген ОШ полевки состоит из 5 экзонов л 4 интронов. Размер мРНК равен 1357 н., размер кодируемого белка составляет 354 а.о.

2. Анализ 5'-регуляторной области гена ОШ полевки, размером 4017 п.н., показал наличие консервативных элементов: СС-богатых сайтов, потенциальных сайтов связывания транскрипционных факторов семейства

Sp, гормончувствительного элемента, а также авторегуляторного композиционного сайта связывания факторов ОСТ4 и SOX2.

3. 5'-регуляторная область гена Oct4 полевки, встроенная в состав репортерных конструкции проявляет активность в плюрипотентных клетках мыши (TG-2a, PI9) и неактивна в трофобластных стволовых клетках полевки (R1). Делеция дистального энхансера регуляторной области гена Oct4 полевки существенно снижает активность конструкций в клетках TG-2a и не влияет на нее в клетках линии Р19. Делеции и инверсии других элементов регуляторной области также вызывают снижение активности репортерных конструкций в разной степени. Показана важность ориентации регуляторных элементов в модуляции транскрипции.

4. Впервые определена нуклеотидная последовательность гена Nanog полевки М. rossiaemeridionalis размером 7586 п.н. и его структурно-функциональная организация. Ген Nanog полевки состоит из 4 экзонов и 3 интронов. Размер мРНК составляет 2411 н., размер кодируемого белка составляет 319 а.о. Четвертый экзон гена Nanog полевки содержит протяженную З'-нетронслируемую область размером 1291 п.н.

5. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей белков NANOG полевки и шести видов млекопитающих показал высокий уровень гомологии гомеодоменов данных белков. В последовательности белка NANOG полевки выявлен блок триптофановых повторов, характерный для белков NANOG других видов млекопитающих. Обнаружено, что несколько из остатков ароматических аминокислот, влияющих на трансактивационные свойства домена CD2 белка NANOG мыши, отсутствуют у полевок.

6. Анализ экспрессии генов Oct4 и Nanog в онтогенезе полевки М. rossiaemeridionalis показал, что транскрипция гена Nanog впервые выявляется в 2-х клеточных эмбрионах и ограничивается предымплантационными стадиями развития эмбриона. Транскрипция гена Oct4 впервые выявляется на стадии морулы и продолжается до семнадцатого дня эмбрионального развития. Транскрипция генов Oct4 и Nanog не обнаружена в линиях трофобластных стволовых клеток (R1) и клеток примитивной энтодермы (XEN Мб) полевок, а также в восьми органах взрослых полевок (мозге, сердце, тимусе, желудке, печени,

•N кишечнике, яичнике и семеннике). Ген Nanog можно использовать как маркер плюрипотентности клеток полевок.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Medvedev S.P., Shevchenko A.I., Elisaphenko Е.А., Nesterova T.B., Brockdorff N., Zakian S.M. Structure and expression pattern of Oct 4 gene are conserved in vole Microtus rossiaemeridionalis // BMC Genomics. 2008. 9:162.

2. Медведев С.П., Шевченко А.И., Мазурок H.A., Закиян C.M. Oct4 и Nanog ~ ключевые гены в системе поддержания плюрипотентности клеток млекопитающих // Генетика. 2008. Т. 44. № 12. С. 1586-1607.

3. Медведев С.П., Елисафенко Е.А., Шевченко А.И., Мазурок H.A., Закиян С.М. Молекулярно-генетическая организация и особенности экспрессии гена Nanog у полевки Microtus rossiaemeridionalis II Доклады Академии Наук. 2009. Принята в печать.

4. Шевченко А.И., Медведев С.П.. Мазурок H.A., Закиян С.М. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки // Генетика. 2009. Т. 45. № 2. Принята в печать.

5. Медведев С.П., Шевченко А.И., Елисафенко Е.А. Характеристика структуры и экспрессии гена Oct4 полевки Microtus rossiaemeridionalis // Материалы Международной Конференции «Генетика в России и мире» (Москва, 28 июня - 2 июля 2006 г.), стр. 123.

6. Медведев С.П., Шевченко А.И., Елисафенко Е.А., Закиян С. М.

Oct4 и Nanog - ключевые гены в системе поддержания плюрипотентности клеток млекопитающих // Материалы Международной Молодежной Научно-Мегодической Конференции «Проблемы Молекулярной и Клеточной Биологии» (Томск, 9-12 мая 2007 г.), стр. 118-119.

Подписано к печати 06.11.2008 г. Формат бумаги 60 х 90 1/16, печ. л. 1, уч. изд. л. 0,7 Тираж 100. Заказ № 123

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 10.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Медведев, Сергей Петрович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 .Феномен плюрипотентности клеток млекопитающих in vivo и in vitro

1.2. Сигнальные пути, участвующие в поддержании клеточной плюрипотентности

1.2.1. LIF-STAT

1.2.2. ВМР

1.2.3. WNT

1.3. Транскрипционные факторы и плюрипотентность 23 1.3.1 Транскрипционный фактор ОСТ4 23 1.3.2. Транскрипционный фактор NANOG

1.4. Спектр генов-мишеней транскрипционных факторов ОСТ4 и NANOG.

Авторегуляция и взаимодействие с другими транскрипционными факторами

1.4.1. Гены-мишени транскрипционного фактора ОСТ

1.4.2. Анализ распределения сайтов посадки факторов ОСТ4, NANOG и SOX2 в геномах ЭСК человека и мыши

1.5. Структура и хромосомная локализация Oct4 и Nanog. Структура белков

ОСТ4 и NANOG

1.5.1. Структура и хромосомная локализация гена Oct4. Структура белка ОСТ

1.5.2. Предшественники гена Oct4 плацентарных млекопитающих

1.5.3. Структура и хромосомная локализация гена Nanog.

Структура белка NANOG

1.6. Динамика экспрессии генов Oct4 и Nanog в онтогенезе млекопитающих 42 1.6.1. Экспрессия гена Oct

1.6.2. Экспрессия гена Nanog

1.7. Регуляция экспрессии генов Oct4 и Nanog

1.7.1. Регуляция экспрессии гена Oct

1.7.2. Регуляция экспрессии гена Nanog 5 О ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 54 2.1 Объект исследования

2.2. Скрининг геномной библиотеки полевки М. rossiaemeridionalis

2.3. Выделение ДНК фагов

2.4. Микробиологические методы работы

2.4.1. Приготовление компетентных клеток Е. coli

2.4.2. Трансформация компетентных клеток E.coli

2.5. Методики работы с рекомбинантной ДНК

2.5.1. Выделение плазмидной ДНК

2.5.2. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции

2.5.3. Электрофорез ДНК в агарозном геле

2.5.4. Выделение фрагментов ДНК из гелей 58 2.5.4. Субклонирование фрагментов ДНК

2.7. Полимеразная цепная реакция

2.8. Определение нуклеотидной последовательности ДНК

2.9. Контекстный анализ последовательности ДНК

2.10. Конструирование репортерных векторов

2.11. Временная трансфекция и измерение активности люциферазы 64 2.11. Работа с РНК

2.11.1. Выделение РНК из эмбрионов и органов полевки М. rossiaemeridionalis

2.11.2. Обработка РНК ДНКазой

2.11.3. Синтез кДНК

2.11.4. 3'- и 5'-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) 67 2.12. Работа с культурами эукариотических клеток

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Исследование нуклеотидной последовательности и экзон-интронной структуры гена Oct4 полевки М. rossiaemeridionalis

3.2. Сравнительный анализ ортологичных последовательностей гена Oct4 млекопитающих

3.3. Анализ активности промотора гена Oct4 полевки

3.4. Исследование нуклеотидной последовательности и экзон-интронной структуры гена Nanog полевки М. rossiaemeridionalis

3.5. Сравнительный анализ ортологичных последовательностей Nanog гена млекопитающих 91V.

3.6. Анализ экспрессии генов Oct4 и Nanog в онтогенезе полевки M.rossiaemeridionalis

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структура, регуляция и экспрессия генов Oct4 и Nanog у обыкновенных полевок рода Microtus (Arvicolinae, Rodentia)"

Актуальность. Получение и исследование эмбриональных стволовых клеток различных видов млекопитающих является одной из актуальных проблем современной биологии. Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) получают из внутренней клеточной массы (ВКМ) либо эпибласта предымплантационных эмбрионов млекопитающих. При сохранении оптимальных условий культивирования ЭСК, в течение продолжительного времени могут сохранять ряд свойств, характерных для клеток ВКМ и эпибласта эмбриона (Smith, 2001; Boiani, Sholer, 2005). Одно из основных уникальных свойств ЭСК - плюрипотентность. Плюрипотентность определяет способность ЭСК дифференцироваться, in vitro и in vivo, в производные всех трех зародышевых листков, эктодермы, энтодермы и мезодермы, а также образовывать во время эмбрионального развития клетки предшественники функциональных гамет (Boiani, Sholer, 2005). Это свойство ЭСК делает их перспективным объектом фундаментальных и прикладных исследований (Smith, 2001). ЭСК являются уникальной модельной системой при исследовании процессов, происходящих в раннем эмбриогенезе млекопитающих (Martin, 1981; Evans, Kaufman, 1981; Thomson etal., 1998; Chaumeil et al, 2002; Boiani, Sholer, 2005).

На сегодняшний день известно, что поддержание плюрипотентного статуса клеток предымплантационных эмбрионов и ЭСК обеспечивается сложной системой клеточно-поверхностных белков, их молекулярных сигнальных путей и транскрипционных факторов, инициирующих или модулирующих транскрипцию генов-мишеней. Подсистема, так называемых «внешних регуляторов плюрипотентности», включает в себя несколько сигнальных путей, основными из которых являются каскады, запускаемые белками LIF, ВМР4 и WNT. Оказалось, что действие данных сигнальных путей происходит in vitro, но носит видоспецифичный характер. Одни и те же молекулы могут поддерживать плюрипотентность ЭСК мыши и не влиять на плюрипотентность ЭСК человека. Более того, одни и те же пути могут иметь противоположное влияние на ЭСК мыши и человека (Xu et al., 2002; Humphrey et al, 2004; Sumi et al, 2004; Boiani, Sholer, 2005).

Другой подсистемой, регулирующей плюрипотентность ЭСК, является подсистема «внутренних регуляторов плюрипотентности» - транскрипционных факторов, действующих в ядрах клеток. К числу ключевых регуляторов в данной подсистеме относятся транскрипционные факторы ОСТ4 и NANOG. Данные факторы участвуют в поддержании плюрипотентности клеток как in vivo так и in vitro. Эмбрионы мыши, гомозиготные по нокауту генов Oct4 и Nanog, гибнут в предымплантоционный период развития вследствие недоразвития ВКМ и эпибласта, соответственно (Nichols et ah, 1998; Chambers et ah, 2003; Mitsui et al., 2003). Подавление экспрессии генов Oct4 и Nanog в ЭСК мыши и человека вызывает дифференцировку клеток в трофобластные производные и производные примитивной энтодермы и мезодермы, соответственно (Niwa et ah, 2000; Vekey, О'Shea, 2003; Hay et ah, 2004; Hyslop et ah, 2005). Совместно с транскрипционным фактором SOX2 они образуют единую систему регуляции транскрипции генов в ЭСК. Взаимодействие этих факторов приводит к формированию двух регуляторных подсистем: авторегуляторной и подсистемы прямой регуляции широкого спектра генов мишеней, большинство из которых участвует в процессах дифференцировки ЭСК (Boyer et ah, 2005; Loh et ah, 2006). Геномная организация, экспрессия и регуляция генов, кодирующих факторы ОСТ4 и NANOG, подробно исследованы только у человека и мыши - видов, для которых получены стабильные линии ЭСК (Chambers, Smith, 2004). Получение линий ЭСК других видов млекопитающих представляет на сегодняшний день серьезную проблему. Открытым остается вопрос о причинах высокой разницы в эффективности получения плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток у различных видов млекопитающих. Некоторые экспериментальные данные говорят о том, что отрицательный результат экспериментов по получению стабильных линий ЭСК может быть следствием видоспецифичных особенностей регуляции и экспрессии генов системы поддержания плюрипотентности, таких как Oct4 и Nanog (Buehr et ah, 2003).

Исследование структуры, регуляции и экспрессии генов, кодирующих транскрипционные факторы ОСТ4 и NANOG у различных видов млекопитающих важно для формирования представлений о функционировании системы поддержания плюрипотентности в целом и особенностях данной системы у каждого вида в отдельности. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей регуляторных и кодирующих частей генов Oct4 и Nanog млекопитающих позволяет выявить наиболее эволюционно консервативные последовательности, несущие функциональную нагрузку. Кроме того, сравнение нуклеотидных последовательностей и паттерна экспрессии генов Oct4 и Nanog у различных видов млекопитающих позволяет проследить отличия, которые могут являться причиной неудач при получении ЭСК.

Обыкновенные полевки рода Microtus являются модельным объектом для которого ведутся работы по получению ЭСК (Nesterova et al., 2001; Шевченко и др., 2006). Использование стандартных протоколов получения ЭСК мыши и человека на полевках не привели к получению стабильных, плюрипотентных ЭСК. Исследование молекулярно-генетических особенностей структуры генов Oct4 и Nanog, их регуляции и экспрессии у полевок может способствовать выявлению видоспецифических особенностей подсистемы «внутренних регуляторов плюрипотентности» и разработке оптимальной стратегии исследования характеристик «генов плюрипотентности», критичных для получения ЭСК. Полученные знания позволят составить модифицированные, более эффективные, протоколы получения эмбриональных стволовых клеток для видов млекопитающих, получение ЭСК у которых затруднено.

Для полноценного решения этой проблемы необходимо ответить на вопрос, справедлива ли для полевок характерная для мыши схема дифференцированной экспрессии Oct4 и Nanog в предымплантационном эмбрионе, т.е. ограничена ли экспрессия Oct4 и Nanog только плюрипотентными клетками эмбриона (ВКМ, эпибласт). Важно проследить, динамику экспрессии генов Oct4 и Nanog в течение развития эмбриона полевки, поскольку от времени начала репрессии этих генов во многом зависит успешность получения ЭСК. Кроме того, необходимы знания об особенностях структуры и регуляции генов Oct4 и Nanog у полевок.

Для решения проблемы, безусловно, были необходимы комплексные исследования, включающие полное секвенирование геномных и кДНК последовательностей генов Oct4 и Nanog полевок, сравнительный анализ структуры полученных последовательностей, изучение особенностей строения регуляторных областей этих генов с помощью репортерных конструкций, исследование экспрессии генов Oct4 и Nanog в онтогенезе полевок.

Цели и задачи работы.

Цель работы — исследовать структуру, регуляцию и особенности экспрессии генов Oct4 и Nanog у обыкновенных полевок рода Microtus.

Задачи работы:

1. Определить последовательность нуклеотидов кодирующих и регуляторных частей генов Oct4 и Nanog полевки М. rossiaemeridionalis.

2. Произвести анализ полученных нуклеотидных последовательностей и сравнение нуклеотидных последовательностей генов Oct4 и Nanog полевки с ортологами этих генов у других видов млекопитающих.

3. Исследовать экспрессию мРНК генов Oct4 и Nanog в онтогенезе полевки.

4. Построить репортерные конструкции, содержащие ген люциферазы под контролем различных элементов регуляторной области гена Oct4, и исследовать активность данных конструкций в линиях плюрипотентных и неплюрипотентных клеток.

Научная новизна.

1. Впервые получены геномные нуклеотидные последовательности генов Oct4 и Nanog полевки М. rossiaemeridionalis. Установлена их экзон-интронная структура. Для гена Oct4 установлена нуклеотидная последовательность регуляторной области, размером 4017 п.н. Геномные нуклеотидные последовательности и последовательности кДНК генов Oct4 и Nanog полевки М. rossiaemeridionalis зарегистрированы в базе данных GeneBank под номерами: Oct4 (EF032593 и EF030115, соответственно); Nanog (EU908043 и EU908044, соответственно).

2. В данной работе впервые исследована экспрессия генов Oct4 и Nanog в онтогенезе и отдельных органах полевки М. rossiaemeridionalis. Показаны сходства и отличия в паттерне экспрессии генов Oct4 и Nanog в онтогенезе мыши и полевки.

3. Впервые исследована активность репортерных конструкций, содержащих различные части регуляторной области гена Oct4 полевки в линиях плюрипотентных клеток мыши и трофобластных стволовых клетках полевки. Показано, что регуляторная область гена Oct4 полевки активна в клетках мыши и неактивна в неплюрипотентных клетках полевки.

Практическая значимость. Результаты данной работы расширяют знания о функционировании отдельных элементов системы поддержания плюрипотентности клеток у млекопитающих и могут быть использованы при планировании и проведении экспериментов по получению ЭСК.

Апробация работы. Результаты работы представлены в материалах международной конференции «Генетика в России и мире» (Москва, 28 июня - 2 июля 2006 г.), на международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы Молекулярной и Клеточной Биологии» (Томск, 9-12 мая 2007 г.).

По теме диссертации опубликованы две работы. Одна - в рецензируемом зарубежном журнале, другая — в рецензируемом отечественном журнале. Еще две статьи приняты в печать, в рецензируемые отечественные журналы.

Вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Скрининг фаговой геномной библиотеки полевки М. rossiaemeridionalis проводился совместно с к.б.н. А.И. Шевченко, анализ нуклеотидных последовательностей генов Oct4 и Nanog проводился совместно с к.б.н. Е.А. Елисафенко.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3-х глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 116 страницах, содержит 12 рисунков и 15 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Медведев, Сергей Петрович

102 ВЫВОДЫ

1. Впервые определена нуклеотидная последовательность гена Oct4 полевки

М. rossiaemeridionalis размером 4607 п.н. и установлена его структурно-функциональная организация. Ген Oct4 полевки состоит из 5 экзонов и 4 интронов. Размер мРНК равен 1357 н., размер кодируемого белка составляет 354 а.о.

2. Анализ 5'-регуляторной области гена Oct4 полевки, размером 4017 п.н., показал наличие консервативных элементов: GC-богатых сайтов, потенциальных сайтов связывания транскрипционных факторов семейства Sp, гормончувствительного элемента, а также авторегуляторного композиционного сайта связывания факторов ОСТ4 и SOX2.

3. 5'-регуляторная область гена Oct4 полевки, встроенная в состав репортерных конструкции проявляет активность в шпорипотентных клетках мыши (TG-2a, Р19) и неактивна в трофобластных стволовых клетках полевки (R1). Делеция дистального энхансера регуляторной области гена Oct4 полевки существенно снижает активность конструкций в клетках TG-2a и не влияет на нее в клетках линии Р19. Делеции и инверсии других элементов регуляторной области также вызывают снижение активности репортерных конструкций в разной степени. Показана важность ориентации регуляторных элементов в модуляции транскрипции.

4. Впервые определена нуклеотидная последовательность гена Nanog полевки

М. rossiaemeridionalis размером 7586 п.н. и его структурно-функциональная организация. Ген Nanog полевки состоит из 4 экзонов и 3 интронов. Размер мРНК составляет 2411 н., размер кодируемого белка составляет 319 а.о. Четвертый экзон гена Nanog полевки содержит протяженную 3'-нетронслируемую область размером 1291 п.н.

5. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей белков NANOG полевки и шести видов млекопитающих показал высокий уровень гомологии гомеодоменов данных белков. В последовательности белка NANOG полевки выявлен блок триптофановых повторов, характерный для белков NANOG других видов млекопитающих. Обнаружено, что несколько из остатков ароматических аминокислот, влияющих на трансактивационные свойства домена CD2 белка NANOG мыши, отсутствуют у полевок.

6. Анализ экспрессии генов Oct4 и Nanog в онтогенезе полевки М. rossiaemeridionalis показал, что транскрипция гена Nanog впервые выявляется в 2-х клеточных эмбрионах и ограничивается предымплантационными стадиями развития эмбриона. Транскрипция гена Oct4 впервые выявляется на стадии морулы и продолжается до семнадцатого дня эмбрионального развития. Транскрипция генов Oct4 и Nanog не обнаружена в линиях трофобластных стволовых клеток (R1) и клеток примитивной энтодермы (XEN Мб) полевок, а также в восьми органах взрослых полевок (мозге, сердце, тимусе, желудке, печени, кишечнике, яичнике и семеннике). Ген Nanog можно использовать как * маркер плюрипотентности клеток полевок.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе представлены результаты исследований структуры, регуляции и особенностей экспрессии генов Oct4 и Nanog у обыкновенных полевок рода Microtus.

Определена полная нуклеотидная последовательность гена Oct4 полевки М. rossiaemeridionalis размером 4607 п.н. Проведено детальное исследование экзон-интронной организации генов Oct4 и Nanog, сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей данных генов у полевки и шести видов, относящихся к разным отрядам млекопитающих. Сравнение нуклеотидных последовательностей генов Oct4 полевки М. rossiaemeridionalis и шести видов млекопитающих (мыши, крысы, человека, шимпанзе, быка и собаки) показало высокую консервативность кодирующей последовательности гена Oct4 (до 89%). Наибольшей гомологией обладают второй (до 95%) и третий (до 92%) экзоны генов Oct4, кодирующие POU-домен. Наибольший уровень гомологии наблюдается между эволюционно близкими видами: полевкой, мышью и крысой.

Проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей 5'-регуляторных областей ортологичных генов Oct4. Основные функциональные элементы данной области (область минимального промотора, дистальный и проксимальный энхансер) проявляют высокую степень сходства у всех сравниваемых видов млекопитающих. Показано, что наибольшей консервативностью обладают: GC-богатые сайты, потенциальные сайты связывания транскрипционных факторов семейства Sp, гормончувствительный элемент (HRE), а также авторегуляторный композиционный сайт связывания факторов ОСТ4 и SOX2. Гомология сайтов транскрипционных факторов MASH-2 и РЕМ низка.

Показано, что последовательность 5'-регуляторной области гена Oct4 проявляет способность активировать транскрипцию в составе репортерных конструкций в плюрипотентных клетках мыши. Отдельные элементы регуляторной области гена Oct4 полевки проявляют функциональную гомологию с таковыми у мыши. Дистальный энхансер гена Oct4 полевки, как и у мыши, активен в ЭСК.

В ходе работы, определена полная нуклеотидная последовательность гена Nanog полевки М. rossiaemeridionalis размером 7586 п.н., установлена его экзон-интронная структура. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов Nanog и шести видов млекопитающих (мыши, крысы, человека, шимпанзе, быка и собаки) выявил более низкий по сравнению с геном Oct4 уровень гомологии (до 77%). Наибольшей гомологией обладают второй и третий экзоны генов Nanog, кодирующие основной функциональный элемент белка NANOG - гомеодомен. Сравнение аминокислотных последовательностей предсказанного белка NANOG полевки и шести видов млекопитающих показало относительно высокий уровень гомологии (8588%) гомеодомена во всех парах сравниваемых видов. N- и С-трансактивационные домены, а также область W-повтора показали относительно высокий уровень гомологии только между эволюционно близкими видами: полевкой, мышью и крысой. Однако, показано, что остатки ароматических аминокислот в домене CD2 белка NANOG, играющим важную роль в трансактивации генов-мишеней у мыши, обладают низкой консервативностью среди изученных видов.

Исследование экспрессии генов Oct4 и Nanog в онтогенезе полевки показало, что данные гены в основном сохраняют паттерн экспрессии характерный для мыши, т.е. их экспрессия ограничивается плюрипотентными клетками. Однако, экспрессия гена Nanog, в отличие от мыши, ограничивается предымплантационными стадиями развития эмбриона. Возможно, на стадии бластоцисты, той стадии развития эмбриона, которая используется для получения ЭСК, у полевок, уже происходят процессы связанные с репрессией транскрипции гена Nanog. Снижение уровня транскрипции гена Nanog в свою очередь может критически снижать вероятность получения стабильных линий ЭСК. Вероятно, выходом из данной ситуации может быть использование для получения ЭСК более ранних стадий развития эмбрионов, например, морул.

Описанные в работе данные, позволяют лучше понять особенности функционирования элементов системы поддержания плюрипотентности клеток у млекопитающих и будут полезны при проведении экспериментов по получению ЭСК различных видов млекопитающих.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Медведев, Сергей Петрович, Новосибирск

1. Забаровский Е.Р., Турина О.В. Быстрое выделение ДНК фага XII Молекулярная биология. 1998. Т. 22. №. 6. С. 1451-1455.

2. Шевченко А.И., Павлова С.В., Дементьева Е.В. и др. Модификации хроматина в процессе инактивации Х-хромосомы у самок млекопитающих // Генетика. 2006. Т. 42. № 9. С. 1225-1234.

3. Abeyta M.J., Clark А.Т., Rodriguez R.T. et al. Unique gene expression signatures of independently-derived human embryonic stem cell lines // Hum. Mol. Genet. 2004. V. 13. №6. P. 601-608.

4. Altschul S.F., Gish W., Miller W. et al. Basic local alignment search tool // J. Mol. Biol. 1990. V. 215. № 3. P. 403-410.

5. Aubert J., Dunstan H., Chambers I., Smith A. Functional gene screening in embryonic stem cells implicates Wnt antagonism in neural differentiation // Nat. Biotechnol. 2002. V. 20. № 12. P. 1240-1245.

6. Bartel D.P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function // Cell. 2004. V. 116. № 2. P. 281-297.

7. Boiani M., Sholer H. Regulatory networks in embryo-derived pluripotent stem cells // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2005. V. 6. № 11. P. 872-884.

8. Booth H.A., Holland P. W. Eleven daughters of NANOG // Genomics. 2004. V. 84. № 2. P. 229-238.

9. Botquin V., Hess H., Fuhrmann G. et al. New POU dimer configuration mediates antagonistic control of an osteopontin preimplantation enhancer by Oct-4 and Sox-2 // Genes Dev. 1998. V. 12. № 13. P. 2073-2090.

10. Boyer L.A, Lee T.I, Cole M.F. et al. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells // Cell. 2005. V.122. № 6. P. 947-956.

11. Brandenberger R., Khrebtukova I., Thies R.S. et al. MPSS profiling of human embryonic stem cells // BMC Dev. Biol. 2004. V. 4. № 10. P. 10-25.

12. Buehr M., Nichols J., Stenhouse F. et al. Rapid loss of Oct-4 and pluripotency in cultured rodent blastocysts and derivative cell lines // Biol. Reprod. 2003. V. 68. № 1. P. 222-229.

13. Burdon Т., Chambers I., Stracey C. et al. Signaling mechanisms regulating self-renewal and differentiation of pluripotent embryonic stem cells // Cells Tissues Organs. 1999. V. 165. № 3-4. P. 131-143.

14. Catena R., Tiveron C., Ronchi A. et al. Conserved POU binding DNA sites in the Sox2 upstream enhancer regulate gene expression in embryonic and neural stem cells // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. № 40. P. 41846-41857.

15. Cauffinan G., Van de Velde H., Liebaers I., Van Steirteghem A. Oct-4 mRNA and protein expression during human preimplantation development // Mol. Hum. Reprod. 2005. V. 11. №3. P. 173-181.

16. Chambers I., Colby D., Robertson M. et al. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells // Cell. 2003. V. 113. № 5. P. 643-655.

17. Chambers I., Smith A. Self-renewal of teratocarcinoma and embryonic stem cells // Oncogene. 2004. V. 23. № 43. P. 7150-7160.

18. Chambers I., Silva J., Colby D. et al. Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development//Nature. 2007. V. 450. № 7173. P. 1230-1235.

19. Chaumeil J., Okamoto I., Guggiari M., Heard E. Integrated kinetics of X chromosome inactivation in differentiating embryonic stem cells // Cytogenet. Genome Res. 2002. V. 99. № 1-4. P. 75-84.

20. Chew J.L., Loh Y.H., Zhang W. et al. Reciprocal transcriptional regulation of Pou5fl and Sox2 via the Oct4/Sox2 complex in embryonic stem cells // Mol. Cell. Biol. 2005. V. 25. № 14. P. 6031-6046.

21. Darr H., Mayshar Y., Benvenisty N. Overexpression of NANOG in human ES cells enables feeder-free growth while inducing primitive ectoderm features // Development. 2006. V. 133. № 6. P. 1193-1201.

22. Evans M.J., Kaufman M. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos //Nature. 1981. V. 292. № 5819. P. 154-156.

23. Ezashi Т., Ghosh D., Roberts R.M. Repression of Ets-2-induced transactivation of the Tau interferon promoter by Oct-4 // Mol. Cell. Biol. 2001. V. 21. № 23. P. 78837891.

24. Fairbanks D.J., Maughan P.J. Evolution of the NANOG pseudogene family in the human and chimpanzee genomes // BMC Evol. Biol. 2006. V.6. № 12.

25. Frankenberg S., Tisdall D., Selwood L. Identification of a homologue of POU5F1 (OCT3/4) in a marsupial, the brushtail possum // Mol. Reprod. Dev. 2001. Y. 58. № 3. P. 255-261.

26. Gu P., Goodwin В., Chung А. С. et al. Orphan nuclear receptor LRH-1 is required to maintain Oct4 expression at the epiblast stage of embryonic development // Mol. Cell. Biol. 2005. V. 25. № 9. P. 3492-3505.

27. Gu P., LeMenuet D., Chung A. C. et al. Orphan nuclear receptor GCNF is required for the repression of pluripotency genes during retinoic acid-induced embryonic stem cell differentiation // Mol. Cell. Biol. 2005. V. 25. № 19. P.8507-8519.

28. Guo Y., Costa R., Ramsey H. et al. The embryonic stem cell transcription factors Oct-4 and FoxD3 interact to regulate endodermal-specific promoter expression // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. № 6. P. 3663-3667.

29. Hamazaki Т., Kehoe S.M., Nakano Т., Terada N. The Grb2/Mek pathway represses Nanog in murine embryonic stem cells // Mol. Cell. Biol. 2006. V. 26. № 20. P. 7539-7549.

30. Hanna L.A., Foreman R.K., Tarasenko I.A. et al. Requirement for Foxd3 in maintaining pluripotent cells of the early mouse embryo // Genes Dev. 2002. V. 16. №20. P. 2650-2661.

31. Hansis C., Grifo J.A., Krey L.C. Oct-4 expression in inner cell mass and trophectoderm of human blastocysts // Mol. Hum. Reprod. 2000. V. 6. № 11. P. 9991004.

32. Hart A.H., Hartley L., Ibrahim M., Rabb L. Identification, cloning and expression analysis of the pluripotensy promoting Nanog genes in mouse and human // Dev. Dyn. 2004. V. 230. № 1. P. 187-198.

33. Hatano S.Y., Tada M., Kimura H. et al. Pluripotential competence of cells associated with Nanog activity // Mech. Dev. 2005. V. 122. № 1. P. 67-79.

34. Hattori N., Imao Y., Nishino K. et al. Epigenetic regulation of Nanog gene in embryonic stem and trophoblast stem cells // Genes Cells. 2007. V. 12. № 3. P. 38796.

35. Hattori N. Nishino К., Ко Y. et al. Epigenetic control of mouse Oct-4 gene expression in embryonic stem cells and trophoblast stem cells // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. № 17. P. 17063-17069.

36. Hay D.C., Sutherland L., Clark J., Burdon T. Oct-4 knockdown induces similar patterns of endoderm and trophoblast differentiation markers in human and mouse embryonic stem cells // Stem Cells. 2004. V. 22. № 2. P. 225-235.

37. He S., Pant D., Schijfmacher A. et al. Developmental expression of pluripotency determining factors in caprine embryos: novel pattern of NANOG protein localization in the nucleolus // Mol. Reprod. Dev. 2006. V. 73. № 12. P. 1512-1522.

38. Herr W., Cleary M.A. The POU domain: versatility in transcriptional regulation by a flexible two-in-one DNA-binding domain // Genes Dev. 1995. V. 9. № 14. P. 16791693.

39. Humphrey R.K., Beattie G.M., Lopez A.D. et al. Maintenance of pluripotency in human embryonic stem cells is STAT3 independent // Stem Cells. 2004. V. 22. № 4. P. 522-530.

40. Hyslop L., Stojkovic M., Armstrong L. et al. Downregulation of NANOG induces differentiation of human embryonic stem cells to extraembryonic lineages // Stem Cells. 2005. V. 23. № 8. P. 1035-1043.

41. James D., Levine A.J., Besser D., Hemmati-Brivanlou A. TGFbeta/activin/nodal signaling is necessary for the maintenance of pluripotency in human embryonic stem cells // Development. 2005. V. 132. № 6. P. 1273-1282.

42. Jurka J. Database of repetitive elements (repbase). NCBI Database Repository. 1995. (ftp: //ncbi.nlm.nih.gov/repository/ repbase/).

43. Kanellopoulou C., Muljo S.A., Kung A.L. et al. Dicer-deficient mouse embryonic stem cells are defective in differentiation and centromeric silencing // Genes Dev. 2005. V. 19. № 4. P. 489-501.

44. Kehler J., Tolkunova E., Koschorz B. et al. Oct4 is required for primordial germ cell survival //EMBO Rep. 2004. V. 5. № 11. P. 1078-1083.

45. Kim J.S., Kim J., Kim B.S. et al. Identification and functional characterization of an alternative splice variant within the fourth exon of human nanog // Exp. Mol. Med. 2005. V. 37. № 6. P. 601-607.

46. Kirchhof N., Carnwath J.W., Lemme E. et al. Expression pattern of Oct-4 in preimplantation embryos of different species // Biol. Reprod. 2000. V. 63. № 6. P. 1698-1705.

47. Kuroda Т., Tada M., Kubota H. et al. Octamer and Sox elements are required for transcriptional cis regulation of Nanog gene expression // Mol. Cell. Biol. 2005. V. 25. № 6. P. 2475-2485.

48. Larroux C., Luke G.N., Koopman P. et al. Genesis and expansion of metazoan transcription factor gene classes // Mol. Biol. Evol. 2008. V. 25. № 5. P. 980-996.

49. Lavial F., Acloque H., Bertocchini F. et al. The Oct4 homologue PouV and Nanog regulate pluripotency in chicken embryonic stem cells // Development. 2007. V. 134. № 19. P. 3549-3563.

50. Lee J., Kim H.K., Rho J.Y. et al. The human OCT-4 isoforms differ in their ability to confer self-renewal // J. Biol. Chem. 2006. V. 281. № 44. P. 33554-33565.

51. Lewis B.P., Burge C.B., Bartel D.P. Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets // Cell. 2005. V. 120. № l.P. 15-20.

52. Lin Т., Chao C., Saito S. et al. p53 induces differentiation of mouse embryonic stem cells by suppressing Nanog expression // Nat. Cell Biol. 2005. V. 7. № 2. P. 165-171.

53. Liu L., Leaman D., Villalta M., Roberts R.M. Silencing of the gene for the alpha-subunit of human chorionic gonadotropin by the embryonic transcription factor Oct-3/4//Mol. Endocrinol. 1997. V. 11. № 11. p. 1651-1658.

54. Liu L., Roberts R.M. Silencing of the gene for the beta subunit of human chorionic gonadotropin by the embryonic transcription factor Oct-3/4 // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. №28. P. 16683-16689.

55. Loh Y.H., Wu Q., Chew J.L. et al. The Oct4 and Nanog transcription network regulates pluripotency in mouse embryonic stem cells // Nat. Genet. 2006. V. 38. № 4. P. 431-440.

56. Lunde K., Belting H.G., Driever W. Zebrafish pou5fl/pou2, homolog of mammalian Oct4, functions in the endoderm specification cascade // Curr. Biol. 2004. V. 14. № l.P. 48-55.

57. Martin G.R. Isolation of a pluripotentcell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. V. 78. № 12. P. 7634-7638.

58. Matsuda Т., Nakamura Т., Nakao К. et al. STAT3 activation is sufficient to maintain an undifferentiated state of mouse embryonic stem cells // EMBO J. 1999. V. 18. № 15. P. 4261-4269.

59. Minucci S., Botquin V., Yeom Y.I. et al. Retinoic acid-mediated down-regulation of Oct3/4 coincides with the loss of promoter occupancy in vivo // EMBO J. 1996. V. 15. №4. P. 888-899.

60. Mitalipov S.M., Кио H.C., Hennebold J.D., Wolf D.P. Oct-4 expression in pluripotent cells of the rhesus monkey // Biol. Reprod. 2003. V. 69. № 6. P. 1785-1792.

61. Mitsui K., Tokuzawa Y., Itoh H. et al. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells // Cell. 2003. V. 113. № 5. P. 631-642.

62. Mullin N.P., Yates A., Rowe A.J. et al. The pluripotency rheostat Nanog functions as a dimer // Biochem. J. 2008. V. 411. № 2. P. 227-231.

63. Nichols J., Chambers I., Taga Т., Smith A. Physiological rationale for responsiveness of mouse embryonic stem cells to gpl30 cytokines // Development. 2001. V. 128. № 12. P.2333-2339.

64. Nichols J., Zevnik В., Anastassiadis K. et al. Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct-4 // Cell. 1998. V. 95. №3. P. 379-391.

65. Nishimoto M., Miyagi S., Yamagishi T. et al. Oct-3/4 maintains the proliferative embryonic stem cell state via specific binding to a variant octamer sequence in the regulatory region of the UTF1 locus // Mol. Cell. Biol. 2005. V. 25. № 12. P. 50845094.

66. Niwa H., Burdon Т., Chambers I., Smith A. Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3 // Genes Dev. 1998. V. 12. № 13. P. 2048-2060.

67. Niwa II., Miyazaki J., Smith A.G. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells // Nat. Genet. 2000. V. 24. № 4. P. 372-376.

68. Niwa, H. Molecular mechanism to maintain stem cell renewal of ES cells // Cell Struct. Funct. 2001. V. 26. № 3. P. 137-148.

69. Nordhoff V., Hubner K., Bauer A. et al. Comparative analysis of human, bovine, and murine Oct-4 upstream promoter sequences // Mamm. Genome. 2001. V. 12. № 4. P. 309-317.

70. Oh J.H., Do H.J., Yang H.M. et al. Identification of a putative transactivation domain in human Nanog // Exp. Mol. Med. 2005. V. 37. № 3. P. 250-254.

71. Okamoto K., Okazawa II, Okuda A. et al. A novel octamer binding transcription factor is differentially expressed in mouse embryonic cells // Cell. 1990. V. 60. № 3. P. 461-472.

72. Okamura D., Tokitake Y., Niwa H., Matsui Y. Requirement of Oct3/4 function for germ cell specification//Dev. Biol. 2008. V. 317. № 2. P. 576-584.

73. Okuda A., Fukushima A., Nishimoto M. et al. UTF1, a novel transcriptional coactivator expressed in pluripotent embryonic stem cells and extra-embryonic cells // EMBO J. 1998. V. 17. № 7. P. 2019-2032.

74. Okumura-Nakanishi S., Saito M., Niwa H., Ishikawa F. Oct-3/4 and Sox2 regulate Oct-3/4 gene in embryonic stem cells // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. № 7. P. 53075317.

75. Ovitt С. E., Sholer Н. The molecular biology of Oct-4 in the early mouse embryo // Mol. Hum. Reprod. 1998. V. 4. №11. P. 1021-1031.

76. Pain D., Chirn G.W., Strassel C., Kemp D.M. Multiple retropseudogenes from pluripotent cell-specific gene expression indicates a potential signature for novel gene identification // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. № 8. P. 6265-6268.

77. Pan G., Li J., Zhou Y. et al. A negative feedback loop of transcription factors that controls stem cell pluripotency and self-renewal // FASEB J. 2006. V. 20. № 10. P. 1730-1732.

78. Pan G.J., Pei D.O. Identification of two distinct trans activation domains in the pluripotency sustaining factor Nanog // Cell Res. 2003. V.13. № 6. P. 499-502.

79. Pan G., Pei D. The stem cell pluripotency factor NANOG activates transcription with two unusually potent subdomains at its С terminus // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. №2. P. 1401-1407.

80. Pearson W.R., Lipman D.J. Improved tools for biological sequence comparison // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. № 8. P. 2444-2449.

81. Pereira L., Yi F., Merrill B.J. Repression of Nanog gene transcription by Tcf3 limits embryonic stem cell self-renewal // Mol. Cell. Biol. 2006. V. 26. № 20. P.7479-7491.

82. Pesce M., Anastassiadis K, Scholer H.R. Oct-4: lessons of totipotency from embryonic stem cells // Cells Tissues Organs. 1999. V. 165. № 3-4. P. 144-152.

83. Pesce M., Scholer H.R. Oct-4: control of totipotency and germline determination // Mol. Reprod. Dev. 2000. V. 55. № 4. P. 452-457.

84. Pesce M., Scholer H.R. Oct-4: gatekeeper in the beginnings of mammalian development// Stem Cells. 2001. V. 19. № 4. P. 271-278.

85. Robertson M., Stenhouse F., Colby D. et al. Nanog retrotransposed genes with functionally conserved open reading frames // Mamm. Genome. 2006. V. 17. № 7. P. 732-743.

86. Rodda D.J., Chew J.L., Lim L.H. et al. Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2 //J. Biol. Chem. 2005. V. 280. № 26. P. 24731-24737.

87. Rosner M.H., Vigano M.A., Ozato К. T. et al. A POU-domain transcription factor in early stem cells and germ cells of the mammalian embryo // Nature. 1990. V. 345. № 6277. P. 686-692.

88. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis., T Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989.

89. Sato N., Meijer L., Skaltsounis L. et al. Maintenance of pluripotency in human and mouse embryonic stem cells through activation of Wnt signaling by a pharmacological GSK-3-specific inhibitor // Nat. Medicine. 2004. V. 10. № 1. P. 5563.

90. Sato N., Sanjuan I.M., Heke M. et al. Molecular signature of human embryonic stem cells and its comparison with the mouse // Dev. Biol. 2003. V. 260. № 2. P. 404-413.

91. Scholer H.R. Octamania: the POU factors in murine development // Trends Genet. 1991. V. 7. № 10. P. 323-329.

92. Scholer H.R., Balling R., Hatzopoulos A.K. et al. Octamer binding proteins confer transcriptional activity in early mouse embryogenesis // EMBO J. 1989. V. 8. № 9. P. 2551-2557.

93. Shi J.J., Cai D.H., Chen X.J., Sheng H.Z. Cloning and characterization of the rabbit POU5F1 gene // DNA Seq. 2007. V. 8. №1. (Epub. ahead of print).

94. Smith A.G. Embryo-derived stem cells: of mice and men // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2001. V. 17. P. 435-462.

95. Snir M., О fir R., Elias S., Frank D. Xenopus laevis POU91 protein, an Oct3/4 homologue, regulates competence transitions from mesoderm to neural cell fates // EMBO J. 2006. V. 25. № 15. P. 3664-3674.

96. Soodeen-Karamath S., Gibbins A.M. Apparent absence of oct 3/4 from the chicken genome //Mol. Reprod. Dev. 2001. Y. 58. № 2. P. 137-148.

97. Sumi Т., Fujimoto Y., Nakatsuji N. Suemori H. STAT3 is dispensable for maintenance of self-renewal in nonhuman primate embryonic stem cells // Stem Cells. 2004. V. 22. № 5. P. 861-872.

98. Suo G., Han J., Wang X. et al. Oct4 pseudogenes are transcribed in cancers I I Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005. V. 337. № 4. P. 1047-1051.

99. Sutton J., Costa R., Klug M. et al. Genesis, a winged helix transcriptional repressor with expression restricted to embryonic stem cells // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. № 38. P. 23126-23133.

100. Tai M.H., Chang С. C„ Kiupel M., Webster J.D. et al. Oct4 expression in adult human stem cells: evidence in support of the stem cell theory of carcinogenesis // Carcinogenesis. 2005. V. 26. № 2. P. 495-502.

101. Takao Y., Yokota Т., Koide H. Beta-catenin up-regulates Nanog expression through interaction with Oct-3/4 in embryonic stem cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007. V. 353. № 3. P. 699-705.

102. Takeda J., Seino S., Bell G.I. Human Oct3 gene family: cDNA sequences, alternative splicing, gene organization, chromosomal location, and expression at low levels in adult tissues //Nucl. Acids Res. 1992. V. 20. № 17. P. 4613-4620.

103. Thomson J.A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S.S. et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts // Science. 1998. V. 282. №> 5391. P. 1145-1147.

104. Velkey J.M., О'Shea K.S. Oct4 RNA interference induces trophectoderm differentiation in mouse embryonic stem cells // Genesis. 2003. V. 37. № 1. P. 18-23.

105. Wang S.H., Tsai M.S., Chiang M.F., Li H. A novel NK-type homeobox gene, ENK (early embryo specific NK), preferentially expressed in embryonic stem cells // Gene Expr. Patterns. 2003. V. 3. № 1. P. 99-103.

106. Wang Z, Ma Т., ChiX., Pei D. Aromatic Residues in the C-terminal Domain 2 Are Required for Nanog to Mediate LIF-independent Self-renewal of Mouse Embryonic Stem Cells // J. Biol. Chem. 2008. V. 283. № 8. P. 4480-4489.

107. Wei C.L., Miura Т., Robson P. et al. Transcriptome profiling of human and murine ESCs identifies divergent paths required to maintain the stem cell state // Stem Cells. 2005. V. 23. №2. P. 166-185.

108. Wei F., Scholer H.R., Atchison M.L. Sumoylation of Oct4 enhances its stability, DNA binding, andtransactivation // J. Biol. Chem. 2007. V. 282. № 29. P. 21551-21560.

109. Wu D.Y., Yao Z. Functional analysis of two Spl/Sp3 binding sites in murine Nanog gene promoter// Cell Res. 2006. V.16. № 3. P. 319-322.

110. Wu Q., ChenX., Zhang J. et al. Sall4 interacts with Nanog and co-occupies Nanog genomic sites in embryonic stem cells // J. Biol. Chem. 2006. V. 281. № 34. P. 24090-24094.

111. Xu H.M., Liao В., Zhang O.J. et al. Wwp2, an E3 ubiquitin ligase that targets transcription factor Oct-4 for ubiquitination // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. № 22. P. 23495-23503.

112. Xu R.H., Chen X., Li D.S. et al. BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast // Nat. Biotechnol. 2002. V. 20. №. 12. P. 1261-1264.

113. Yamaguchi S., Kimura Я, Tada M. et al. Nanog expression in mouse germ cell development// Gene Expr. Patterns. 2005. V. 5. № 5. P. 639-646.

114. Yasuda S. Y., Tsuneyoshi N., Sumi T. et al. NANOG maintains self-renewal of primate ES cells in the absence of a feeder layer // Genes Cells. 2006. V. 11. № 9. P. 11151123.

115. Yeom Y.I., Fuhrmann G., Ovitt C.E. et al. Germline regulatory element of Oct-4 specific for the totipotent cycle of embryonal cells // Development. 1996. V. 122. № 3.P. 881-894.

116. Yeom Y.I., Ha H.S., Balling R. et al. Structure, expression and chromosomal location of the Oct-4 gene //Mech. Dev. 1991. V. 35. №. 3. P. 171-179.

117. Ying Q.L., Nichols J., Chambers I., Smith A. BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3 // Cell. 2003. V. 115. № 3. P. 281-292.

118. Yuan Н., Corbi N., Basilico С., Dailey L. Developmental-specific activity of the FGF-4 enhancer requires the synergistic action of Sox2 and Oct-3 // Genes Dev. 1995. V. 9. № 21. P. 2635-2645.

119. Zhang J., Wang X., Chen B. et al. Expression of Nanog gene promotes NIH3T3 cell proliferation // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005. V. 338. № 2. P. 1098-1102.

120. Zhang J., Wang X., Li M. et al. NANOGP8 is a retrogene expressed in cancers // FEBS J. 2006. V. 273. № 8. P. 1723-1730.

121. Zhang Z., Liao В., Xu M., Jin Y. Post-translational modification of POU domain transcription factor Oct-4 by SUMO-1 // FASEB J. 2007. Y. 21. № 12. P. 30423051.