Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Определение и анализ нуклеотидных последовательностей митохондриального и хлоропластного геномов диатомовой водоросли Synedra acus

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Определение и анализ нуклеотидных последовательностей митохондриального и хлоропластного геномов диатомовой водоросли Synedra acus"

На правах рукописи

005042672 I ул^

ГАЛАЧЬЯНЦ Юрий Павлович

ОПРЕДЕЛЕНИЕ И АНАЛИЗ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО И ХЛОРОПЛАСТНОГО ГЕНОМОВ ДИАТОМОВОЙ ВОДОРОСЛИ SYNEDRA АСІ]Б

03.01.03 — молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

і ош

Новосибирск - 2012

005042672

Работа выполнена в Лимнологическом институте СО РАН

Научный руководитель:

д.б.н., профессор Лихошвай Елена Валентиновна

Официальные оппоненты:

Демаков Сергей Анатольевич, д.б.н.

Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН,

заведующий лабораторией

Морозов Игорь Владимирович, к.б.н.

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, старший научный сотрудник

Ведущая организация:

Институт биологии гена РАН

Защита состоится « 1 » июня 2012 г. в 11 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 на базе Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автореферат разослан « 20 » апреля 2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета к.х.н., доцент

Коваль В. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Диатомовые водоросли - это одноклеточные автотрофные эукариотические организмы, одни из главных продуцентов органического углерода, формирующие около 40% первичной продукции Мирового океана, активные участники круговорота кремния, азота и фосфора (Nelson et al., 1995; Stoermer, Smol, 1999). Они распространены в различных биотопах — от морских до ультра-пресных, от пакового льда Антарктики до горячих источников (Round, Crawford, Mann, 1990).

Традиционная систематика диатомей (отдел Bacillariophyta) базируется на симметрии и особенностях строения кремнистого панциря: радиально-центрические и биполярно-центрические, пеннатные с билатеральной симметрией панциря, имеющие или не имеющие шов (Round, Crawford, Mann, 1990). В результате молекулярно-филогенетического анализа нескольких генов (ядерных рРНК - Medlin, Williams, Sims, 1993; Medlin, Kooistra, Shmid, 2000; Theriot et al., 2009; хлоропластного rbcL -Andersen, 2004; митохондриального coxl — Ehara et al., 2000) систематика диатомей была пересмотрена. Оказалось, что только группа пеннатных шовных является монофилетичной.

Диатомовые водоросли относятся к царству Chromista (Cavalier-Smith, 1981; Cavalier-Smith, 2009). Согласно одной из наиболее распространенных гипотез, диатомовые водоросли возникли около 250 млн л.н. (Medlin, 2009) в результате эндосимбиоза автотрофной клетки, от которой они унаследовали хлоропласт, и гетеротрофной разножгутиковой клетки, от которой диатомеи унаследовали митохондрии (Gibbs, 1981; Sims, Mann, Medlin, 2006). В процессе эволюции разных линий Chromista эндосимбиоз происходил многократно (Cavalier-Smith, 1999; Cavalier-Smith, 2010; Dorrell, Smith, 2011). В результате эндосимбиогенеза и эволюции часть генов клеточных органелл была перенесена в ядерный геном (Keeling, 2009). Новые сведения для развития эволюционной теории может принести сравнительный анализ полных геномов диатомей и их органелл. К моменту начала настоящего исследования были определены последовательности только двух полных ядерных геномов и нескольких геномов органелл диатомовых водорослей. До недавнего времени получение новых данных было затруднено из-за отсутствия быстрых методов секвенирования.

Учитывая сложность эволюционной истории диатомей, необходимость определения последовательностей полных геномов их органелл становится актуальной задачей геносистематики и филогеномики.

Пеннатная бесшовная диатомея Synedra acus широко распространена в пресных водоемах. В озере Байкал подвид S. acus subsp. radians (Klitz.) Skabitsch. входит в состав доминирующих видов фитопланктона, активно развивается в весенний период, вносит существенный вклад в пищевые сети и круговорот кремния, а также является биостратиграфическим маркером байкальской палеолетописи плейстоцена и голоцена (Grachev et al., 1998).

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в определении полных нуклеотидных последовательностей митохондриального и хлоропластного

геномов диатомовой водоросли S. acus для проведения сравнительного анализа геномов органелл диатомовых водорослей. В ходе исследования было необходимо решить следующие задачи:

1. Определить полные нуклеотидные последовательности геномов митохондрий и хлоропластов S. acus.

2. Провести сравнительно-геномный и молекулярно-филогенетический анализ мтДНК доступных геномов и отдельных митохондриальных генов диатомовых и других разножгутиковых (Heterokonta).

3. Провести сравнительно-геномный анализ доступных хлоропластных геномов и отдельных хлоропластных генов диатомовых водорослей.

Научная новизна н практическая ценность работы. Проведено определение нуклеотидных последовательностей полных геномов органелл диатомовой водоросли S. acus. До получения результатов настоящей работы были известны последовательности двух митохондриальных и шести хлоропластных геномов диатомей. S. acus является первой бесшовной пеннатной и первой из пресноводных диатомей, для которой определены последовательности геномов органелл. Впервые показано, что в мтДНК диатомовых водорослей существует блок с консервативным порядком генов и что интенсивность геномных перестановок в мтДНК диатомей выше, чем у бурых водорослей. Впервые показано, что разные интроны второй группы в мтДНК диатомей были приобретены независимо друг от друга. Впервые для диатомей обнаружено, что гены alpF и alpD не перекрываются в хлоропластом геноме S. acus. У S. acus выявлен ядерный ген асрр, кодирующий ацил-переносящий белок с хлоропластной локализацией. В рамках работы проведено освоение новой методики массового параллельного секвенирования с применением платформы Roche GS FLX и обработки данных, получаемых в результате пиросеквенирования.

Полученные данные имеют фундаментальное значение для выяснения вопросов филогении и эволюции диатомей и могут быть использованы в курсах лекций по молекулярной биологии для студентов университетов.

Апробация работы h публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 3 статьи в рецензируемых журналах. Результаты работы были представлены на международной конференции MolPhy2 (Москва, 2010) и на заседании Президиума ИНЦ (Иркутск, 2011).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, включающих обзор литературы, описание материалов и методов, изложение результатов и их обсуждение, выводов, списка цитированной литературы и четырех приложений. Работа изложена на 158 страницах, содержит 18 рисунков и 5 таблиц. Библиография включает 156 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Определение нуклеотидной последовательности и аннотация митохондриального генома S. acus

Предварительную сборку последовательности митохондриального генома получили при анализе библиотеки случайных фрагментов, приготовленной из

суммарной геномной ДНК ксеничной кульруры S. acus, на приборе GS FLX (Roche Life Sciences, США) в Центре «Биоинженерия» (РАН, Москва). В результате запуска секвенатора было получено -500 тыс. чтений со средней длиной 230 н.о. Сборку последовательностей чтений в контиги проводили с использованием программы GS De Novo Assembler v.2.1. Контиг протяженностью 43 384 п.н. был выявлен в сборке случайных фрагментов по значимым протяженным BLAST-совпадениям с известными мтДНК одноклеточных водорослей. Среднее значение степени перекрытия митохондриального контига составило 20. Оставшаяся область мтДНК размером 3,3 тыс. п.н., содержащая участок повторов, была амплифицирована с использованием праймеров, сайты гибридизации которых расположены во фланкирующих уникальных областях митохондриального контига, и секвенирована с помощью метода блуждающей затравки на приборе ABI 3730 («Applied Biosystems», США) в ООО «Евроген». Полученные контиги были объединены в кольцевую молекулу. Полная последовательность мтДНК S. acus доступна в GenBank (NC_013710).

Аннотацию белок-кодирующих генов проводили путем поиска в мтДНК открытых рамок считывания (ОРС) и их последующего BLAST-анализа по протоколу blastp среди аннотированных белков базы данных NR. Целостность белок-кодирующих генов проверяли вручную на основе сходства с близкородственными последовательностями. Поиск генов тРНК осуществляли с помощью программы tRNAscan-SE 1.23. Гены, кодирующие рРНК малой и большой субъединицы рибосомы, выявляли с помощью программы RNAmmer и на основе сходства Synedra-специфических последовательностей с рРНК диатомеи Thalassiosira pseudonana и других близкородственных организмов.

Основные свойства митохондриального генома S. acus

Митохондриальный геном 5. acus (рис. 1А) является кольцевой молекулой и имеет размер 46 657 п.н. Он кодирует гены рРНК малой (rns) и большой (rnl) субъединиц рибосомы, 24 гена тРНК и 34 белок-кодирующих гена, а также два псевдогена рибосомных белков. В геноме имеется протяженная некодирующая область с повторяющимися элементами (рис. 1В). Набор тРНК S. acus достаточен для связывания всех природных аминокислот кроме треонина. В мтДНК S. acus обнаружены 34 белок-кодирующих гена, среди которых 11 генов рибосомных белков, три гена, кодирующих субъединицы циклооксигеназы, ген апоцитохрома В, 10 генов, кодирующих субъединицы NADH-дегидрогеназы, три гена, кодирующих субъединицы АТФ-азы и ген твин-аргинин транслокационной машины. Кроме того, мтДНК S. acus кодирует две ОРС внутри интронов гена сох 1 и три уникальных ОРС с неизвестными функциями.

Двумя наиболее протяженными некодирующими участками в мтДНК S. acus являются область размером 4 955 п.н., которая находится между 5'-концом гена /niM(cau)f и З'-концом гена nadl, а также участок протяженностью 658 п.н. без выраженный структурных особенностей, который расположен между 5'-концом гена сох! и З'-концом frrtM(cau)f (рис. 1В). Наиболее крупный кластер (а) содержит два несовершенных прямых повтора протяженностью 1 450 и 1 316 п.н., разделенных 256-

^тЕ(иис) 1тУ(иас)

сохЗ '

оптвчэг

4? ППП АЗ ППП Ай ППГ) АК ППП АЛ ПЛЛ АК к«;7 ->лп

ЬЬ СС

Рис. 1. Митохондриальный геном £ аст. А - геномная карта мтДНК 51. асиэ. Гены рибосомных РНК обозначены желтыми блоками, гены транспортных РНК — красными и белков - синими. Гены транспортных РНК содержат в названии однобуквенный код аминокислоты и последовательность антикодона в скобках. Дуги соединяют экзоны интрон-содержащих генов. Гены, расположенные на внешней/внутренней окружностях геномной карты, транскрибируются по/против часовой стрелки, соответственно. Рамкой выделен блок генов, порядок в котором хорошо сохранился в мтДНК диатомей. В - схема некодирующей области мтДНК асиь (42 005-301 п.н.). Стрелки и треугольники показывают относительное расположение повторяющихся участков последовательностей и их ориентацию. Сходство участков (а, Ъ, с) обозначено интенсивностью заливки фигуры: черный - 100% сходство, темно-серый - сходство более 90%, светло-серый — сходство менее 90%. Последовательность из области с - входит в участок 6. Два участка с1 несут инвертированные повторы и могут формировать шпилечные структуры.

нуклеотидной уникальной последовательностью. Оба повтора содержат последовательности, имеющие высокое сходство в терминальных областях. Тандемная дупликация участка протяженностью -100 п.н. в первой копии повтора является причиной различия длины повторов. Кроме двух длинных повторов, межгенная

область trnM-nadl несет несколько относительно коротких прямых повторов, имеющих протяженность менее 50 п.н. (Ь-Ь и с-с), причем Ь-Ъ — это инверсия с-с. Повторы d содержат короткие палиндромные последовательности, способные формировать шпилечные структуры.

Сравнительно-геномный анализ мтДНК диатомей

Отсутствие гена транспортной РНК для распознавания треонинового кодона характерно для всех мтДНК разножгутиковых организмов (Gray, Lang, Burger, 2004). В отличие от Т. pseudonana, в мтДНК P. tricornutum и S. acus отсутствует ген /raW(uca), который отвечает за трансляцию кодона TGA в триптофан во многих митохондриальных генах Т. pseudonana и других водорослей. Набор белок-кодирующих генов у S. acus сходен с таковым в мтДНК других диатомей (табл. 1). Митохондриальные геномы диатомовых водорослей несут 59 общих генов, среди которых 32 белок-кодирующих гена, 24 гена транспортных РНК, два гена рибосомных РНК и одна ОРС в интроне гена сох 1. Однако, в отличие от двух других диатомей, в мтДНК S. acus отсутствует ген rpsl, а гены rpsb и rpsl присутствуют в виде псевдогенов, имеющих сдвиги рамки считывания и делеции. Вероятно, данные гены были перенесены в ядерный геном S. acus, и их митохондриальные версии утрачены или находятся в процессе утраты. Этот факт согласуется с тем, что для генов рибосомных белков обнаруживается самый высокий уровень элиминации из митохондриального генома у покрытосеменных растений (Adams, Palmer, 2003).

Судя по структуре, области повторов в мтДНК разножгутиковых организмов возникли в результате ошибок при репликации по механизму slipped-strand mispairing. Маловероятно, что области повторов были унаследованы диатомеями от общего предка или произошли в результате встройки мобильных элементов в мтДНК.

Табл. 1. Сравнение митохондриальных геномов диатомовых водорослей

порядок дивергенции Характеристика Т. pseudonana S. acus P. tricornutum

Размер генома (тыс. п.н.) 43,8 46,6 77,4

Размер области повторов (тыс. п.н.) 3,8 4,9 36

Количество белок-кодирующих генов 35 34 32

Количество псевдогенов не известно 2 не известно

Количес тво ОРС 1 3 не известно

Количество нитронов 1 (в сох 1) 3 (2 в сох 1, 1 в га/) 4 (2 в сох 1, 1 в га/, 1 в rns)

Количество ОРС в ияггронах 1 2 2

рРНК ras, га/ ras, ml rns, rnl

Количество генов тРНК 25 24 24

ГгаТ нет нет нет

1гпУ/(иса) есть нет нет

Анализ геномных перестановок в мтДНК диатомовых и бурых водорослей

Наборы генов в мтДНК трех диатомовых водорослей сходны (табл. 1), однако порядок генов отличается. Сравнение порядка генов показывает, что в мтДНК имеется два блока, которые отличаются по количеству геномных перестановок. Порядок генов в пределах первого блока й-лЯ-иси - пас/11 (рис. 1 А) хорошо сохранен. Внутри второго блока /гиСКшщ) - ГглМ(саи) гены в мтДНК диатомей переставлены. Кроме того, у & асш и Р. ¡псогпШит гены в этой области являются котранскрибируемыми блоками, а у Т. рэеиЛопста они представлены двумя разнонаправленными транскрипционными единицами. Апоморфными признаками для мтДНК аст являются делеция /рт2, транслокация гтК(иии) и встройка ог/100 и ог]160.

Генетическое расстояние, рассчитанное с помощью внесения разрывов в последовательность генов мтДНК, принимало значения в диапазоне 27-39 «разрывов» при попарном сравнении мтДНК диатомей (рис. 2А). В то же время, при попарном сравнении мтДНК бурых водорослей этот показатель находился в диапазоне 3-21 «разрыв» (рис. 2В), причем максимальное отличие наблюдалось для митохондриального генома £>. <ИсИо1ота (20-21). Отличия остальных мтДНК друг относительно друга варьировало в пределах 0-6 «разрывов». Сходная картина имеет место при подсчете генетических расстояний между мтДНК на основании внесения инверсий в последовательность генетических маркеров (рис. 2).

205 туа —СскапойзсорЬусеэе Т. ¡кеи^опапа |

<180 туа\— АгарИк! реппа(е5 асиб'__

\ 1*арЫс1 репг^еэ р. гпсотиШт

Р. спсогпШит

37

В 185

туа

0)сИ1уо1а1е5

В. (ИсИоюта |Х>. иММэ \Р. ИаогаИв ¿. (И^Иаса Г. vesiculosus

О. (ИсИомта 0 19 1 20 20 21

С. viridis 21 0 6 3 0

Р. НиогаНз 15 6 0 6 6

I. 19 3 6 0 3

Р. 1>е$1си1ови$ 19 0 6 3 0

Рис. 2. Генетическая дистанция между мтДНК диатомовых (А) и бурых (В) водорослей. Значения над диагональю - дистанция, подсчитанная с помощью внесения разрывов, под диагональю - на основании инверсий. Филограммы слева от таблиц показывают порядок и время дивергенции диатомей (по МесШп, 2009) и бурых водорослей (по Б НЬегГеМ а а/., 2010).

Сопоставление геномных перестроек в мтДНК и времени дивергенции отдельных линий бурых водорослей позволяет предположить, что наибольшее количество перестановок генов произошло в линии ОюЬ!уо1а1ез после ее дивергенции от основной линии РЬаеорЬ^а. У остальных бурых водорослей порядок генов в мтДНК является консервативным признаком. Раннее время дивергенции пеннатных диатомовых водорослей не дает возможности проверить, характерна ли для мтДНК диатомей сходная картина. Тем не менее, очевидно, что геномные перестройки протекали более интенсивно в мтДНК диатомей. чем у бурых водорослей (рис. 2). Включение в сравнительный анализ митохондриальных геномов других диатомовых водорослей позволит восстановить последовательность структурных перестроек митохондриальных геномов в ходе их эволюции.

Филогенетический анализ последовательностей ОТ-доменов из интронов группы II

В мтДНК S. acus обнаружены три интрона группы II (рис. 1А). Два интрона локализованы в гене сох 1 и имеют длину 2 564 и 2 416 п.н. Третий интрон протяженностью 778 п.н. находится в гене rnl, кодирующем рРНК большой субъединицы рибосомы. Внутри интронных ОРС с помощью BLAST-поиска по протоколу blastp и НММ-поиска в Pfam были локализованы участки, имеющие сходство с доменами, которые ассоциированы с активностями обратной транскриптазы и матуразы. В интроне гена rnl ОРС не обнаружено. BLAST-поиск показал, что orfJ55 и orfi90 S. acus имеют наибольшее сходство с ОТ-белками из интронов сох 1 бурых водорослей Pylaiella littoralis и Pavlova lutheri, соответственно. Координаты интронов внутри генов сох 1 не совпадают в мтДНК разных диатомей. Последовательности ОТ-доменов из интронов диатомей не формируют отдельной ветви при филогенетическом анализе (рис. 3).

Bacillariophyta-специфические последовательности разбросаны среди ОТ-доменов разнообразных эукариот. Как и по результатам BLAST-поиска, orj590 S. acus входит в кластер с ОТ-доменом из первого интрона сох 1 бурой водоросли P. lutheri, а orf755 - с ОТ-доменом из второго интрона гена сох 1 P. littoralis.

Сборка и аннотация хлоропластного генома S. acus

На этапе анализа библиотеки случайных фрагментов была проведена черновая сборка последовательностей, полученных в двух запусках Roche GS FLX. С помощью BLAST-анализа по протоколу blastn в сборке последовательностей были выявлены два хлоропласт-специфических контига длиной 79 362 и 40 761 п.н., которые имели сходство с известными последовательностями хлоропластньгх геномов диатомей. Для улучшения качества полученных последовательностей на отобранные контиги в процессе референсной сборки были картированы короткие последовательности Illumina. При инспектировании полученной гибридной сборки оказалось, что результирующие контиги имели протяженное перекрытие с друг с другом. На основании этого они были объединены с образованием суперконтига длиной 111 170 п.н. Концы полученной последовательности имели протяженные участки перекрывания с фланкирующими областями одного из плеч обратного повтора, локализованного с помощью картирования генов рРНК. Это сделало возможным проведение окончательной сборки in silico. Результирующие файлы сборки хлоропласт-специфических контигов предоставляются по запросу (mai!to:wi.galachyants@lin.irk.ru').

Аннотацию белок-кодирующих генов, генов рРНК и тРНК осуществляли так же, как и для мтДНК S. acus. Поиск генов траншортно-информационных РНК (тиРНК) и генов частицы узнавания сигнала проводили с использованием программ ARAGORN и SRPscan. Полная последовательность хлоропластной ДНК S. acus доступна в GenBank (JQ088178).

-Marchantía polymorpha atp9 intror¡1

-Pavlova lutherícoxl ¡ntronl AF045691

Synedra acus coxl ¡ntronl orf590

Pylaiella littoralis coxl ¡ntronl Z72500 Synedra acus coxl introni orf755

Chlorokybus atmophyticus coxl ¡ntronl Neurospora crassa coxl ¡ntronl X14669

Chattonella marina coxl ¡ntronl Rhodomonas salina coxl intron2 ORF762 Oltmannsiellopsis viridis coxl ¡ntronl - Pylaiella littoralis coxl intron2 Z72500

-Thalassiosira nordenskioeldii coxl ¡ntronl AB037974

group IIB-like introns

- Cryphonectria parasitica RT-like

i- Marchantía polymorpha coxl intron2 M68929 '-Pellia epiphylla coxl ¡ntron2

- Rhodomonas salina coxl ¡ntronl ORF621

-Marchantía polymorpha cox2 intron2

-Chlorokubus atmophyticus atp9 ¡ntronl

-Marchantía polymorpha stand-alone ORF732

- Venturía inaequalis cob ¡ntronl

-Schizosaccharomyces pombe cob ¡ntronl

-Saccharomyces cerevisiae coxl ¡ntronl V00694

_г Saccharomyces cerevisiae coxl intron2 V00694

loo l Kluyveromyces lactis coxl ¡ntronl X57546 , Podospora anserína coxl ¡ntronl X55026 L Podospora comata coxl ¡ntronl Z69899

-Allomyces macrogynus coxl intron3 U41288

-Podospora anserína coxl ¡ntron4 X55026

-C

Schizosaccharomyces pombe cox2 ¡ntronl

— Schizosaccharomyces octosporus cox2 intronl

- Marchantía polymorphe SSU ¡ntronl

- Schizosaccharomyces pombe coxl intronl AJ251292

- Phaeodactylum tricornutum coxl intronl

-Marchantía polymorpha cob intron3

Marchantía polymorpha coxl intronl M68929 Pellia epiphylla coxl ¡ntronl Kryptoperídinium foliaceum coxl intronl DQ831827

-Phaeodactylum tricornutum coxl intron2

Chattonella marina coxl intron2 Thalassiosira pseudonana coxl intronl AAZ99395 -Podospora anserína nad5 intron4

- Pylaiella littoralis coxl intron3 Z72500

- Azotobacter vinelandii intron -Escherichia coli ¡ntron

-Bacillus halodurans intron

- Pseudomonas alcaligenes intron

Рис. 3. Филогенетическое дерево, основанное на анализе аминокислотных последовательностей обратно-транскриптазных доменов из интронов группы II, обнаруженных в мтДНК различных организмов. Модель ЬСНТ. Последовательности диатомовых водорослей выделены жирным шрифтом. Значения индексов поддержки ниже 50% не показаны.

Основные свойства хлоропластного генома Я. аси\

Хлоропластный геном Я. асш является кольцевой молекулой и имеет размер 116 251 п.н. (рис. 4). Геном характеризуется как каноническая четырехсоставная структура, в которой два плеча инвертированного повтора Ша и 1ЯЬ, несущих локусы генов рРНК, находятся между большой (Ь8С) и малой (88С) уникальными областями. В хпДНК 5". асия обнаружено 160 генов, среди которых пять генов с альтернативными

Рис. 4 Геномная карта хлоропластной ДНК S. acus. Гены рибосомных РНК обозначены желтыми блоками, гены транспортных РНК — красными, гены малых РНК - зелеными и гены белков - синими. Гены транспортных РНК содержат в названии однобуквенный код и последовательность антикодона в скобках. Гены, расположенные на внешней/внутренней окружностях геномной карты, транскрибируются по/против часовой стрелки, соответственно. На внутреннем круге схематически представлены элементы четырехсоставной структуры - плечи инвертированного повтора IRa и IRb, находящиеся между большой (LSC) и малой (SSC) уникальными областями хпДНК.

старт-кодонами: в rbcS, ccsA, rps8 и гр123 используется GTG, а в secY — ATT (табл. 2). Терминирующий кодон ТАА используется в 117 генах. В десяти генах стоп-кодоном является ТТА, а в одном - TGA.

Сравнительно-геномный анализ хлоропластных геномов диатомовых водорослей

Хлоропластный геном S. acus имеет несколько меньший размер, чем другие хпДНК диатомей, тогда как GC-состав и кодирующая емкость геномов сходны. Все пластидные геномы диатомовых водорослей компактны, в них отсутствуют интроны. Как и у других диатомей, в хпДНК S. acus между генами ;-рЛ4 и гр124 нет межгенного спейсера. Сходным образом, в геноме присутствуют три пары идентично

Табл. 2. Набор генов в хлоропластном геноме X асиз

Гены, не кодирующие белки (32)

Рибосомные РНК (3) ті', гиі', ггпЬ'

Транспортные РНК (27) /глА(і^)' 1гпС(ёса), /гяО^ис), ОтіЕ(иис), ггпР(%га), /гиО^сс), /гаСг(исс), ^7їН(§и§), ґ/-пІ(саи), frnI(gau)J, /гпК(иии), /глЦсаа), /гяЦиаа), /глМ(саи)ґ, /гаМ(саи)е, гглМ^и), /гиР(і^)', fr/)R(acg), /гпК(сс§), //тгК(иси), fr•«S(gcu), /п?8(іща), 1гпТ(и$ц), (гп\(иас), /гп\У(сса), ігпУ(^иа)

Малые РНК (2) {/$, ¿зга

Белок-кодирующие гены (128)

Гены рибосомных белков (44)

Малая субъединица (18) гр$2-грв\4, грз\6-грв20

Большая субъединица (26) грП-гр!6, грП \-rplU, грПб, гр№-грГ24, грП.1, грПЭ, грПХ-грШ

Гены фотосинтеза (44)

АТФ-синтаза (8) ШрА, аірВ, аІрО, а/рЕ, аІр¥, я/рй, а/рН, аїр]

Фотосистема 1(10) ряаА, ргаВ, ріаС, рзаО, рзаЕ, рза£, рзаі, ртаТ, рзаі., рзаМ

Фотосистема II (18) ряЬА, рзЬВ, ріЬС, рзЬО, ртЬЕ, ряЬР, /«¿Н, рзЫ, рзЫ, рзЫО, рбЬЪ, рзЬІЇ, рзЬТ, рзЬУ, рзЬУ., ряЬУ'-2, рзЬЪ (уф), /«628

Ь6/Т-комтшекс (8) реї А, реіВ,реіО, реїї2, ре К}, реіЬ (уф), реМ (ус/і 1), реіК (уф)

Гены других процессов (40)

Метаболизм (5) сЖ, гЪсЬ, гЪсЯ, МЪ' (ус/40)

Фолдинг (5) сІрС, сЫаВ, сіпаК,/іїП (ус/25), ¿гоЕЬ

Сборка, транслокация (8) ссіі (ус/44), ссзА, ¡есА, зеЫЭ (ус/47), зесУ, іи/В (ус/24), яи/С (ус/16), /а/С (ус/43)

Транскрипция (6) сЬЬХ, гЪсК, гро А, гроВ, гроСІ, гроС2

Трансляция (2) $у/В\ Ш/А

ОРС (14) ус/3, уф, ус/12, .у с/33, ус/35, уф9, ус/41, ус/421, ус/Л 5, ус/46, уфб, уфЪ, ус)89й, ус/90

перекрывающихся генов: ,ум/С-5и/В (1 п.н.), гр14-гр12Ъ (8 п.н.) и р.чЬГ)-рхЬС (53 п.н.). В отличие от других диатомей, гены а/рО и аїрґ не перекрываются, а располагаются друг за другом.

С точки зрения структурной организации, хпДНК диатомей не отличаются от хлоропластаых геномов большинства других разножгутиковых организмов и характеризуются как четырехсоставные кольцевые молекулы ДНК. Такая структура характерна и для хлоропластных геномов, унаследованных от зеленых водорослей, в отличие от хпДНК красных водорослей, у которых отсутствуют области обратных повторов. По кодирующему потенциалу хпДНК диатомей имеют большее сходство с

1 Гены находятся в инвертированных повторах.

2Данные гены не входят в набор 154 генов, общих для хпДНК диатомовых водорослей.

10

пластидными геномами красных водорослей, нежели с хлоропластами «зеленой» линии (Allen et al., 2008) и несут около 160 генов, из них 154 гена являются общими для диатомей. В составе генов в хлоропластных геномах диатомей имеются различия (табл. 3).

Перестановки генов в хлоропластных геномах диатомовых водорослей

Визуальный анализ геномных перестановок показывает, что наибольшее сходство порядка генов в пределах LSC наблюдается в группе хпДНК диатомей S. acus и Р. tricornutum, а также эндосимбионтов динофлагеллят D. baltica и K.foliaceum. По сравнению с геномами других пеннатньгх диатомей, в хпДНК Fistulifera sp. имеется инверсия протяженного участка генов rbcS-rpsl4. Пластидные геномы видов Thalassiosira отличаются друг от друга наличием нескольких крупных инверсий. Порядок генов в области SSC претерпел меньшие изменения. У пеннатных диатомей в SSC имеется два консервативных блока генов (syflS-rbcS и clpC-dnaK), в последнем из которых большинство генов находятся в пределах котранскрибируемой области. Интересно отметить, что в хпДНК Thalassiosira большая часть блока syßi-rbcK перенесена в область инвертированных повторов. При анализе геномных перестановок в хпДНК диатомей обнаруживается, что в терминальных областях однокопийных участков хпДНК геномные перестановки происходили менее интенсивно. Это можно объяснить структурными ограничениями, препятствующими обмену генами между LSC- и SSC-областями и связанными с образованием «перехвата» кольцевой молекулы хпДНК в области инвертированных повторов. Судя по наблюдаемой картине, геномные перестановки в хпДНК преимущественно происходили в результате инверсий в пределах уникальных областей.

Табл. 3. Различия наборов генов в хпДНК диатомовых водорослей и эндосимбионтов динофлагеллят K.foliaceum и D. baltica

порядок дивергенции / Г*^^ , _

Название Описание TP ТО OS SA PT Fsp KF DB

acpp ацил-переносящий белок — + _ + _ _

flrn /^-подобная РНК — ■

or/127 гипотетический белок - + _ — _ _ _ _

pelf VII субъеднница комплекса Ъб/f + _ + + + + + +

psb\ I белок фотосистемы II + + + + + _ + +

serc\ предполагаемая сериновая рекомбиназа +

sercl предполагаемая сериновая рекомбиназа - — _ _ + +

syfB Р-субьединица фенилаланил-тРНК-синтазы _ ■ + + + +

thU3 G-белок пути биосинтеза тиамина ■ ■ + + + _ + +

thiS S-белок пути биосинтеза тиамина + + + + + _ + +

tsf фактор элонгации Ts — _ + + _

tyrC предполагаемая интеграза/рекомбиназа + -

ycfM консервативная ОРС; предположительно пероксиредоксин ■ + + ■ + + - -

В хпДНК диатомей и динотомовых водорослей имеется 154 общих гена (см. табл. 2). «+» -ген присутствует в хлоропластом геноме, «-» - отсутствует в хлоропластом геноме. TP -Т. pseudonana, ТО - Т. oceanica, OS - О. sinensis, SA - S. acus, PT — P. tricornutum, Fsp -Fistulifera sp., KF - эндосимбионт K.foliaceum, DB - эндосимбионт D. baltica.

Топология дерева, основанная на анализе порядка генов в хпДНК диатомовых водорослей с использованием метода максимальной экономии (рис. 5), согласуется с порядком ветвления основных групп диатомей, выявленным с использованием общепринятых генетических маркеров. Это свидетельствует о применимости порядка генов в хпДНК диатомей для филогенетического анализа. Хотя дистанция между хлоропластными геномами эндосимбиотов динофлагеллят составляет 10 инверсий согласно анализу порядка генов, они дивергигуют единым кластером от шовных пеннатных диатомей, что согласуется с исходными результатами сравнительно-геномного анализа (Imanian, Pombert, Keeling, 2010). Это дополнительно свидетельствует в пользу того, что эндосимбионты К. foliaceum и D. baltica являются близкородственными организмами. Вероятно, данная ветвь динофлагеллят произошла в результате единичного события третичного эндосимбиоза представителя Dinophyceae с пеннатной шовной диатомовой водорослью.

-О. sinensis _5

■S. acus

-Fistulifera sp.

„эндосимбионт К. foliaceum

Iэндосимбионт D. baltica

'—P. trlcornutum -T. pseudonana _15

—T. oceanica

биполярная центрическая бесшовная пеннатная

шовные пеннатные центрические

Рис. 5. Дерево, полученное на основе анализа порядка генов в хпДНК диатомовых водорослей и эндосимбионтов динофлагеллят D. baltica и К. foliaceum. Цифры над ветвями указывают количество инверсий, необходимое для получения последовательности генетических маркеров, реконструированной в проксимальном узле дерева из последовательности в терминальном узле.

Структурно-функциональный и филогенетический анализ гена atpV

Ген atpV кодирует b-субъединицу АТФ-синтазного комплекса, вторичная структура которой представляет собой протяженную а-спираль (Weber, 2006). Сравнительно-геномный анализ не обнаружил перекрывания хлоропластных генов atpV и alpD в геноме S. acus. Поскольку в других хпДНК диатомей эти гены перекрываются и протяженность перекрытия одинакова, то данный признак является автоапоморфным для хлоропластного генома S. acus. Объединение последовательностей диатомовых водорослей при анализе генетических расстояний (рис. 6) и формирование единой клады при филогенетическом анализе дает право предположить общее происхождение последовательностей atpf диатомей и дивергенцию Sywerfra-специфической последовательности atpV. Важно отметить, что при анализе atpV S. acus с помощью инструмента Pfam hmmsearch, обнаруживается значимое совпадение последовательности с выравниванием семейства ATB-synt_B (Е-значение 4.0Х10"26), которое наблюдается на всем протяжении ОРС гена.

Рис. 6. Анализ выравнивания последовательностей atpV методом главных компонент, BLOSUM62; последовательность S. acus отмечена синим цветом, последовательности остальных диатомей - красным цветом, последовательности atp¥ Rhodophyta, Cryptophyta и Haptophyta - фиолетовым цветом.

В контигах ядерного генома S. acus последовательности, сходные с геном atpF, не обнаружены. Все эти факты свидетельствуют о том, что последовательность гена atpF, показывая значительную степень дивергенции, все-таки подвержена действию стабилизирующего отбора и, вероятнее всего, белковый продукт гена является функциональным. Тем не менее, в настоящий момент остаются непонятными причины дивергенции гена atpV S. acus и период времени, в течение которого происходили изменения последовательности.

Структурно-функциональный анализ гена асрр, продукт которого имеет хлоропластную локализацию

Ген асрр кодирует ацил-переносящий белок, простетическая группа которого служит переносчиком ацильных остатков с молекулы ацетил-коэнзима-А на растущую цепь жирной кислоты. В хлоропластном геноме S. acus отсутствует ген асрр (табл. 3). При поиске сходных последовательностей в сборке ядерного генома S. acus был обнаружен контиг с ОРС, имеющей значимое совпадение с последовательностью хлоропластного асрр P. tricornutum. Дальнейший анализ показал, что аминокислотная последовательность асрр S. acus несет двусоставной сигнал пластидной локализации (рис. 7А), ответственный за транслокацию полипептида в строму хлоропласта. При анализе аминокислотной последовательности гена асрр S. acus с помощью приложения HECTAR N-концевая и транзитная часть сигнального пептида были предсказаны с высокой надежностью. Результаты выявления сигнального пептида с помощью программы SignalP также подтверждают наличие сигнального пептида и сайта его отщепления между Ala и Phe мотива ASAFAP в 15-ой позиции последовательности АПБ S. acus.

Сравнение последовательности асрр S. acus с выровненными последовательностями фосфопантетеин-связывающих доменов с использованием НММ Pfam выявило значимое совпадение профиля домена (рис. 7В). В центральной части последовательности присутствует консервативный мотив DSL, боковая группа

It НММ tí MATCH »PP iJSEQ

Рис. 7. Структурно-функциональный анализ последовательности гена асрр. А - схема структурных элементов асрр S. actis в пределах ОРС гена (показана синим цветом). Красный блок - сигнальный i пептид (SP) для транслокации в шЭПР, желтый блок - транзитный пептид (TP) для транслокации в перипластидное пространство, зеленый блок - домен связывания фосфопантетеина. Стрелкой показан | сайт отщепления сигнального пептида. В — сравнение последовательности асрр S. acus с выравниванием фосфопантетеин-связывающих доменов с использованием НММ Pfam. Рамкой выделен консервативный мотив DSL.

Ser которого служит для ковалентного связывания простетической группы фосфопантетеина при формировании активной молекулы голофермента.

Таким образом, структурно-функциональный анализ показывает, что АПБ, кодируемый последовательностью ядерного гена асрр S. acus, имеет все необходимые элементы для транслокации АПБ в строму хлоропласта и участия белка в биосинтезе жирных кислот.

Поиск сходных последовательностей в базе данных NR показал, что последовательность асрр S. acus не кластеризуется с последовательностями Р. tricornutum и О. sinensis при использовании в качестве метрики баллов BLAST-совпадений. Напротив, для АПБ S. acus наиболее родственными являются гены 8-протеобактерий Desulfovibrio и Syntrophobacter, тогда как с хлоропластными последовательностями асрр диатомей Р. tricornutum и О. sinensis наиболее сходны апикопластные последовательности, принадлежащие представителям группы гетеротрофных динофлагеллят Apicomplexa, у которых хлоропласт редуцирован и не выполняет функции фотосинтеза.

Можно предположить, что Зуиег/га-специфический асрр был приобретен в результате горизонтального переноса гена от 8-протеобактерий, а хлоропластная копия была гена утрачена. С другой стороны, возможен сценарий, при котором сходство асрр S. acus с бактериальными последовательностями АПБ является конвергентным, и возникло в ходе интенсивной эволюции гена в процессе его интеграции в ядерный ' геном. Справедливость данных предположений можно будет проверить при определении последовательностей хлоропластных геномов, родственных acus. Учитывая современную парадигму дивергенции диатомовых водорослей, маловероятно, что перенос гена асрр в ядерный геном является следствием единичного события, которое имело место при эволюции древнего предка диатомовых водорослей.

14

ASAFAP

SP 15 а ру'

TP

ФП-связывающий домен

1164 п.н.

Семейство Клан Выравнивание НММ Bit-значение Е-значение

Начало Конец От До

PP-bind¡ng CL0314 38 104 2 67 41.3 1.3Е-10

lle^V-fceV]

+l++i+a++l +d

639« »». «388Э*

idlfitl¡£Í.|Gl

ЕЕ Ж

++++ + 1 DS1++ve++ ++ee+fg+ei

* * * * * 9 6 6 *****»*-*****************

HUB

|dl fel^t|aeiaifl[

+ ++++++yl * 997

выводы

1. С применением методов массового параллельного секвенирования ДНК определены нуклеотидные последовательности митохондриального и хлоропластного геномов пресноводной пеннатной бесшовной диатомовой водоросли Synedra acus subsp. radians.

2. Митохондриальный геном S. acus subsp. radians имеет размер 46 657 п.н. и характеризуется наличием участка повторов протяженностью 4,2 тыс. п.н. В геноме присутствует 37 генов, отвечающих за транскрипцию и трансляцию митохондриальных белков (два гена рРНК, 24 гена тРНК и 11 генов рибосомных белков), 17 генов, продукты которых входят в дыхательную цепь, 6 генов с другими белок-кодирующими функциями и 2 псевдогена рибосомных белков.

3. Хлоропластный геном S. acus subsp. radians имеет размер 116 251 п.н. и содержит 160 генов, включая 83 гена, отвечающих за транскрипцию и трансляцию хлоропластных белков (три гена рРНК, 27 генов тРНК, 44 гена рибосомных белков, ген тиРНК и 8 генов, кодирующих субъединицы РНК-полимеразы, тРНК-фенилаланл-синтазу, а также кофакторы танскрипции и трансляции), 44 гена, кодирующих субъединицы АТФ-синтазы, цитохромового Ь6/Т-комплекса и фотосистем I и II, 14 генов, продукты которых участвуют в транслокации и фолдинге хлоропластных белков и 19 других белок-кодирующих генов.

4. Сравнительный анализ митохондриальных геномов трех видов диатомей показал, что мтДНК сходны по кодирующей емкости и несут 59 общих генетических маркеров. Выявлены блок с консервативным порядком генов (frnR-ucu — nad\ 1) и блок, в котором порядок генов различен (irnQ(uug) — fmM(cau)). Показано, что геномные перестройки в митохондриальных геномах диатомовых водорослей происходили интенсивнее, чем в митохондриальных геномах бурых водорослей.

5. Впервые с помощью филогенетического анализа показано, что интроны группы И, обнаруженные в генах сох\ мтДНК диатомовых водорослей, имеют независимое происхождение в каждой линии.

6. При сравнении геномов хлоропластов восьми видов диатомовых водорослей обнаружено 154 общих гена. Все хлоропластные геномы диатомей имеют характерную для разножгутиковых организмов четырехсоставную структуру. Дивергенция групп диатомовых водорослей, реконструированная при анализе порядка генов в хлоропластных геномах, согласуется с систематикой крупных таксонов диатомей. Ген асрр, который кодирует ацил-переносящий белок АСР, имеющий хлоропластную локализацию, у S. acus subsp. radians обнаружен в ядерном геноме.

7. На примере хлоропластного генома S. acus subsp. radians впервые для диатомовых водорослей показано отсутствие перекрывания генов atpD и atpV, кодирующих р- и Ъ-субъединицы АТФ-синтазы. Филогенетический анализ показал общее происхождение гена atpV у диатомовых водорослей и его дивергенцию у S. acus subsp. radians.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Ravin N. V., Galachvants Y. P.. Mardanov A. V., Beletsky A. V., Petrova D. P., Sherbakova T. A., Zakharova Y. R., Likhoshway Y. V., Skryabin K. G., Grachev M. A. Complete sequence of the mitochondrial genome of a diatom alga Synedra acus and comparative analysis of diatom mitochondrial genomes // Curr. Genet. - 2010. - V. 56. -P. 215-223.

2. Поздняк E. И., Сидоров И. А., Галачъянц Ю. П. Генерализация алгоритма таксономического классификатора CARMA // Вестник ИрГТУ. - 2011. - Т. 9. -

C.11-15.

3. Galachvants Y. P.. Morozov A. A., Mardanov А. V. Beletsky А. V., Ravin N. V., Petrova

D. P., Likhoshway Y. V. Complete chloroplast genome sequence of freshwater araphid pennate diatom alga Synedra acus from Lake Baikal // Int. J. Biol. - 2012. — V. 4. - P. 2735.

Благодарности

Автор благодарит директора ЛИН СО РАН, академика Михаила Александровича Грачева, д.б.н. Елену Валентиновну Лихошвай, коллег из отдела Ультраструктуры клетки ЛИН СО РАН, д.б.н. Николая Викторовича Равина и коллег из Центра «Биоинженерия» РАН за ценные замечания, обсуждение и помощь в подготовке работы, к.б.н. Александра Михайловича Мазура из ООО «Геноаналитика» за помощь в получении геномной библиотеки и секвенировании на приборе ІНшпіпа ОАІІх, к.т.н. Ивана Александровича Сидорова и коллег из Иркутского суперкомпьютерного ЦКП ИДСТУ СО РАН за помощь при компьютерном обсчете данных, а также жену Агнию за терпение и поддержку.

Работа выполнена при поддержке Программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», проект 6.3.

Подписано к печати 18.04.2012 г. Формат 60 х 84/16. Объем 1,2 п.л. Тираж 150 экз. Заказ № 551. Издательство Института географии им. В.Б. Сочавы СО РАН. 664033 г. Иркутск, ул. Улан-Баторская, 1.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Галачьянц, Юрий Павлович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общая биологическая и экологическая характеристика ВасП1апор11у1а.

1.2. ВасП1апор11у1а входят в группу разножгутиковых эукариот.

1.3. Эволюционная история диатомовых водорослей.

1.3.1. Палеонтологическая летопись диатомей.

1.3.2. Формирование и дивергенция отдельных групп ВасШапорЬ^а.

1.4. Эндосимбиотические органеллы разножгутиковых организмов.

1.4.1. Происхождение и сравнительная морфология митохондрий Не1егокоп1а.

1.4.2. История приобретения пластид в группе СИгоп^а.

1.4.2.1. Формирование фотосинтезирующих органелл в процессе первичного эндосимбиоза.

1.4.2.2. Эволюционная история и структурная организация пластид диатомовых водорослей.

1.4.2.3. Феномен серийного эндосимбиоза в контексте палеоклимата.

1.5. Геномика диатомовых водорослей и родственных организмов.

1.5.1. Перспективность применения филогеномного подхода.

1.5.2. Сложная эволюционная история диатомей привела к необычной комбинации генов, функционирующих в пределах одной клетки.

1.5.3. Перенос пластидных генов в ядерный геном в процессе эндосимбиоза.

1.5.4. Митохондриальные геномы Не1егокоп1а.

1.5.5. Полные пластидные геномы СЬгогг^а.

1.5.6. Организация пластидных геномов СИгоп^а.

1.5.7. Сравнительный анализ хлоропластных геномов диатомей.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Определение нуклеотидной последовательности и первичный анализ митохондриального генома S. acus.

2.1.1. Получение ДНК и пиросеквенирование.

2.1.2. Сборка митохондриального генома.

2.1.3. Аннотация.

2.2. Сравнительный анализ митохондриальных геномов.

2.2.1. Сравнительно-геномный анализ мтДНК диатомей.

2.2.2. Анализ геномных перестановок в мтДНК диатомовых и бурых водорослей.

2.2.3. Филогенетический анализ генов сох 1.

2.2.4. Филогенетический анализ последовательностей ОТ-доменов из интронов группы II.

2.3. Определение нуклеотидной последовательности хлоропластного генома S. acus.

2.3.1. Получение ДНК.

2.3.2. Пиросеквенирование и предварительная сборка последовательностей.

2.3.3. Получение и секвенирование библиотеки парно-сопряженных фрагментов.

2.3.4. Картирование коротких последовательностей Illumina на хлоропласт-специфические контиги.

2.3.5. Аннотация.

2.4. Анализ хлоропластных геномов диатомовых водорослей.

2.4.1. Сравнительно-геномный анализ хпДНК диатомей.

2.4.2. Анализ гена atp¥.

2.4.3. Поиск и анализ ядерного гена асрр, продукт которого имеет хлоропластную локализацию.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Основные свойства митохондриального генома & аст.

3.2. Сравнительно-геномный анализ мтДНК диатомей.

3.3. Анализ геномных перестановок в мтДНК диатомовых и бурых водорослей.

3.4. Филогенетический анализ генов сох 1.

3.5. Филогенетический анализ последовательностей ОТ-доменов из интронов группы II.

3.6. Сборка хпДНК Б. асш.

3.7. Основные свойства хлоропластного генома аст.

3.8. Сравнительно-геномный анализ хпДНК диатомей.

3.9. Структурно-функциональный и филогенетический анализ гена Шр¥.

3.10. Структурно-функциональный анализ гена асрр.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4.1. Массовое параллельное секвенирование как быстрый метод определения нуклеотидных последовательностей геномов органелл.

4.2. Митохондриальные геномы разножгутиковых организмов имеют общие черты и различия.

4.3. Участок повторов формировался независимо в мтДНК нескольких групп разножгутиковых.

4.4. Геномные перестановки в мтДНК диатомовых водорослей.

4.5. Использование митохондриального гена сох 1 в качестве филогенетического маркера и для идентификации диатомей.

4.6. Сравнительно-геномный анализ обнаруживает высокую консервативность состава генов в хпДНК диатомей.

4.7. Перестановки генов в хлоропластных геномах диатомовых водорослей имеют характерные особенности.

4.8. Отсутствие перекрывания генов atp¥ и atpD в хлоропластном геноме

S. acus, вероятно, вызвано дивергенцией гена atpF.

4.9. Продукт ядерного гена асрр S. acus имеет хлоропластную локализацию.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Определение и анализ нуклеотидных последовательностей митохондриального и хлоропластного геномов диатомовой водоросли Synedra acus"

Актуальность проблемы

Диатомовые водоросли - это одноклеточные автотрофные эукариотические организмы, одни из главных продуцентов органического углерода, формирующие около 40% первичной продукции Мирового океана, активные участники круговорота кремния, азота и фосфора (Nelson et al., 1995; Stoermer, Smol, 1999). Они распространены в различных биотопах - от морских до ультра-пресных, от пакового льда Антарктики до горячих источников (Round, Crawford, Mann, 1990).

Традиционная систематика диатомей (отдел Bacillariophyta) базируется на симметрии и особенностях строения кремнистого панциря: радиально-центрические и биполярно-центрические, пеннатные с билатеральной симметрией панциря, имеющие или не имеющие шов (Round, Crawford, Mann, 1990). В результате молекулярно-филогенетического анализа нескольких генов (ядерных рРНК - Medlin, Williams, Sims, 1993; Medlin, Kooistra, Shmid, 2000; Theriot et al., 2009; хлоропластного rbcL - Andersen, 2004; митохондриального cox 1 - Ehara et al., 2000) систематика диатомей была пересмотрена. Оказалось, что только группа пеннатных шовных является монофилетичной.

Диатомовые водоросли относятся к царству Chromista (Cavalier-Smith, 1981; Cavalier-Smith, 2009). Согласно одной из наиболее распространенных гипотез, диатомовые водоросли возникли около 250 млнл.н. (Medlin, 2009) в результате эндосимбиоза автотрофной клетки, от которой они унаследовали хлоропласт, и гетеротрофной разножгутиковой клетки, от которой диатомеи унаследовали митохондрии (Gibbs, 1981; Sims, Mann, Medlin, 2006). В процессе эволюции разных линий Chromista эндосимбиоз происходил многократно (Cavalier-Smith, 1999; Cavalier-Smith, 2010; Dorrell, Smith, 2011). В результате эндосимбиогенеза и эволюции часть генов клеточных органелл была перенесена в ядерный геном (Keeling, 2009). Новые сведения для развития эволюционной теории может принести сравнительный анализ полных геномов диатомей и их органелл. К моменту начала настоящего исследования были определены последовательности только двух полных ядерных геномов и нескольких геномов органелл диатомовых водорослей. До недавнего времени получение новых данных было затруднено из-за отсутствия быстрых методов секвенирования.

Учитывая сложность эволюционной истории диатомей, необходимость определения последовательностей полных геномов их органелл становится актуальной задачей геносистематики и филогеномики.

Пеннатная бесшовная диатомея Synedra actis широко распространена в пресных водоемах. В озере Байкал подвид S. acus subsp. radians (Kütz.) Skabitsch. входит в состав доминирующих видов фитопланктона, активно развивается в весенний период, вносит существенный вклад в пищевые сети и круговорот кремния, а также является биостратиграфическим маркером байкальской палеолетописи плейстоцена и голоцена (Grachev et al., 1998).

Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы состояла в определении полных нуклеотидных последовательностей митохондриалыюго и хлоропластного геномов диатомовой водоросли S. acus для проведения сравнительного анализа геномов органелл диатомовых водорослей. В ходе исследования было необходимо решить следующие задачи:

1. Определить полные нуклеотидные последовательности геномов митохондрий и хлоропластов S. acus.

2. Провести сравнительно-геномный и молекулярно-филогенетический анализ мтДНК доступных геномов и отдельных митохондриальных генов диатомовых и других разножгутиковых (Heterokonta).

3. Провести сравнительно-геномный анализ доступных хлоропластных геномов и отдельных хлоропластных генов диатомовых водорослей.

Научная новизна и практическая ценность работы

Проведено определение нуклеотидных последовательностей полных геномов органелл диатомовой водоросли S. acus. До получения результатов настоящей работы были известны последовательности двух митохондриальных и шести хлоропластных геномов диатомей. S. acus является первой бесшовной пеннатной и первой из пресноводных диатомей, для которой определены последовательности геномов органелл. Впервые показано, что в мтДНК диатомовых водорослей существует блок с консервативным порядком генов и что интенсивность геномных перестановок в мтДНК диатомей выше, чем у бурых водорослей. Впервые показано, что разные интроны второй группы в мтДНК диатомей были приобретены независимо друг от друга. Впервые для диатомей обнаружено, что гены atpF и atpD не перекрываются в хлоропластном геноме S. acus. У S. acus выявлен ядерный ген асрр, кодирующий ацил-переносящий белок с хлоропластной локализацией. В рамках работы проведено освоение новой методики массового параллельного секвенирования с применением платформы Roche GS FLX и обработки данных, получаемых в результате пиросеквенирования.

Полученные данные имеют фундаментальное значение для выяснения вопросов филогении и эволюции диатомей и могут быть использованы в курсах лекций по молекулярной биологии для студентов университетов.

Апробация работы и публикации

По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 3 статьи в рецензируемых журналах. Результаты работы были представлены на международной конференции Мо1РЬу2 (Москва, 2010) и на заседании Президиума ИНЦ (Иркутск, 2011).

Структура и объем работы

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Галачьянц, Юрий Павлович

выводы

1. С применением методов массового параллельного секвенирования ДНК определены нуклеотидные последовательности митохондриального и хлоропластного геномов пресноводной пеннатной бесшовной диатомовой водоросли Synedra acus subsp. radians.

2. Митохондриальный геном S. acus subsp. radians имеет размер 46 657 п.н. и характеризуется наличием участка повторов протяженностью 4,2 тыс. п.н. В геноме присутствует 37 генов, отвечающих за транскрипцию и трансляцию митохондриальных белков (два гена рРНК, 24 гена тРНК и 11 генов рибосомных белков), 17 генов, продукты которых входят в дыхательную цепь, 6 генов с другими белок-кодирующими функциями и 2 псевдогена рибосомных белков.

3. Хлоропластный геном S. acus subsp. radians имеет размер 116 251 п.н. и содержит 160 генов, включая 83 гена, отвечающих за транскрипцию и трансляцию хлоропластных белков (три гена рРНК, 27 генов тРНК, 44 гена рибосомных белков, ген тиРНК и 8 генов, кодирующих субъединицы РНК-полимеразы, тРНК-фенилаланл-синтазу, а также кофакторы танскрипции и трансляции), 44 гена, кодирующих субъединицы АТФ-синтазы, цитохромового Ь6/Т-комплекса и фотосистем I и II, 14 генов, продукты которых участвуют в транслокации и фолдинге хлоропластных белков и 19 других белок-кодирующих генов.

4. Сравнительный анализ митохондриальных геномов трех видов диатомей показал, что мтДНК сходны по кодирующей емкости и несут 59 общих генетических маркеров. Выявлены блок с консервативным порядком генов (irnR-ucu - nadll) и блок, в котором порядок генов различен (ir«Q(uug) -¿глМ(саи)). Показано, что геномные перестройки в митохондриальных геномах диатомовых водорослей происходили интенсивнее, чем в митохондриальных геномах бурых водорослей.

5. Впервые с помощью филогенетического анализа показано, что интроны группы II, обнаруженные в генах сох 1 мтДНК диатомовых водорослей, имеют независимое происхождение в каждой линии.

6. При сравнении геномов хлоропластов восьми видов диатомовых водорослей обнаружено 154 общих гена. Все хлоропластные геномы диатомей имеют характерную для разножгутиковых организмов четырех-составную структуру. Дивергенция групп диатомовых водорослей, реконструированная при анализе порядка генов в хлоропластных геномах, согласуется с систематикой крупных таксонов диатомей. Ген асрр, который кодирует ацил-переносящий белок АСР, имеющий хлоропластную локализацию, у S. acus subsp. radians обнаружен в ядерном геноме.

7. На примере хлоропластного генома S. acus subsp. radians впервые для диатомовых водорослей показано отсутствие перекрывания генов atpD и atpV, кодирующих Р- и b-субъединицы АТФ-синтазы. Филогенетический анализ показал общее происхождение гена atpF у диатомовых водорослей и его дивергенцию у S. acus subsp. radians.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, определение нуклеотидных последовательностей митохондриального и хлоропластного геномов пресноводной бесшовной пеннатной диатомовой водоросли S. acus subsp. radians предоставило новые данные для проведения сравнительного анализа геномов органелл диатомей. Ряд фактов, обнаруженных при анализе митохондриальных геномов диатомовых водорослей, свидетельствует о том, что интенсивное изменение последовательностей мтДНК продолжалось после дивергенции основных линий диатомей. В митохондриальном геноме общего предка диатомей, вероятнее всего, отсутствовал ген iraW(uca), кодирующий тРНК для распознавания триптофанового кодона, а его наличие в мтДНК Т. pseudonana является следствием дупликации, дивергенции и последующей транслокации гена inzW(cca). Вставка интронов группы II в мтДНК происходила независимо в разных линиях диатомей. Вероятно, области повторов митохондриальных геномов были приобретены независимо в разных линиях разножгутиковых организмов. Митохондриальные гены сох 1 Heterokonta могут быть использованы в качестве информативных филогенетических маркеров. При сравнении хлоропластных геномов диатомовых водорослей обнаружена значительная консервативность кодирующей емкости хпДНК и выявлен набор из 154 общих хлоропластных генов. Оказалось, что порядок генов в хлоропластных геномах диатомей может быть использован для филогенетического анализа. Отсутствие перекрывания генов atpD и atp¥ в хлоропластном геноме S. acus, вероятнее всего, вызвано дивергенцией гена atpF, а ядерный ген, кодирующий ацил-переносящий белок, у S. acus имеет двусоставной сигнальный пептид, отвечающий за транслокацию пропептида в строму хлоропласта.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Галачьянц, Юрий Павлович, Иркутск

1. Бедошвили Е.Д., Попкова Т.П., Лихошвай Е.В. Ультраструктура хлоропластов нескольких видов диатомовых водорослей из разных классов // Цитология. 2009. - Т. 51, № 4. - С. 346-357.

2. Грачев М.А., Кузнецова С.Ю., Щербакова Т.А. Метод выделения высокоочищенной ДНК для использования в полимеразной цепной реакции // Молекулярная биология. 2006. - Т. 40, № 1. - С. 180-183.

3. Поздняк Е.И., Сидоров И.А., Галачьянц Ю.П. Генерализация алгоритма таксономического классификатора CARMA // Вестник ИрГТУ 2011.-T.9.-C. 11-15.

4. Adams K.L., Palmer J.D. Evolution of mitochondrial gene content: gene loss and transfer to the nucleus // Mol. Phylogenet. Evol. 2003. - Vol. 29. - P. 380395.

5. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: new generation of protein database search programs // Nucleic Acids Res. 1997. - Vol. 25. - P. 3389-3402.

6. Alverson A.J., Jansen R.K., Theriot E.C. Bridging the Rubicon: phylogenetic analysis reveals repeated colonizations of marine and fresh waters by thalassiosiroid diatoms // Mol. Phylogenet. Evol. 2007. - Vol. 45, No. 1. - P. 193210.

7. Amato A., Kooistra W.H., Ghiron J.H., Mann D.G., Pröschold T., Montresor M. Reproductive isolation among sympatric cryptic species in marine diatoms // Protist. 2007. - Vol. 158, No. 2. - P. 193-207.

8. Andersen R.A. Biology and systematics of heterokont and haptophyte algae //Am. J. Bot. 2004. - Vol. 91. - P. 1508-1522.

9. Armbrust E.V. The life of diatoms in the world's oceans // Nature. -2009.-Vol. 459.-P. 185-192.

10. Bedoshvili Y.D., Likhoshway Ye.V. The cell ultrastructure of diatoms: implications for phylogeny? // The Transmission Electron Microscope / Maaz Khan (ed.). ISBN 979-953-307-311-7 - Croatia, Rijeka: InTech, 2012. - P. 1-12.

11. Ben Ali A., De Baere R., Van der Auwera G., De Wächter R., Van de Peer Y. Phylogenetic relationships among algae based on complete large-subunit rRNA sequences // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001. - Vol. 51. - P. 737-749.

12. Bhattacharya D., Archibald J.M., Weber A.P., Reyes-Prieto A. How do endosymbionts become organelles? Understanding early events in plastid evolution // BioEssays. 2007. - Vol. 29. - P. 1239-1246.

13. Bourque G., Pevzner, P.A. Genome-scale evolution: reconstructing gene orders in the ancestral species // Genome Res. 2002. - Vol. 12, No. 1. - P. 26-36.

14. Bowler C., Allen A.E., Badger J.H., Grimwood J., Jabbari K., Kuo A.,

15. Brzezinski M., Pride C., Franck V., Sigmon D., Sarmiento J., Matsumoto K., Gruber N., Rau G., Coale K. A switch from Si(OH)4 to NOJ depletion in the glacial Southern Ocean // Geophys. Res. Lett. 2002. - Vol. 29, No. 12. - P. 1-4.

16. Cavalier-Smith T. Eukaryote kingdoms: seven or nine? // Biosystems. -1981.-Vol. 14, No. 3.-P. 461-481.

17. Cavalier-Smith T. The kingdom Chromista: origin and systematics // Progress in Phycological Research / F.E. Round, D.J. Chapman (eds.). Bristol: Biopress, 1986. - P. 309-347.

18. Cavalier-Smith T. Zooflagellate phylogeny and classification. // Tsitologiia. -1995.-Vol. 37,No. 11.-P. 1010-29.

19. Cavalier-Smith T. Principles of protein and lipid targeting in secondary symbiogenesis: euglenoid, dinoflagellate, and sporozoan plastid origins and the eukaryote family tree // J. Eukaryot. Microbiol. 1999. - Vol. 46, No. 4. - P. 347-366.

20. Cavalier-Smith T. Megaphylogeny, cell body plans, adaptive zones: causes and timing of eukaryote basal radiations // J. Eukaryot. Microbiol. 2009. -Vol. 56, No 1.-P. 26-33.

21. Cavalier-Smith T. Origin of the cell nucleus, mitosis and sex: roles of intracellular coevolution // Biol. Direct. 2010. - Vol. 5, No. 7. - P. 1-78.

22. Coesel S., Obormk M., Varela J., Falciatore A., Bowler C. Evolutionary origins and functions of the carotenoid biosynthetic pathway in marine diatoms // PLoS One.-2008.-Vol.3, No. 8.-P. 1-16.

23. Cui L., Veeraraghavan N., Richter A., Wall K., Jansen R.K., Leebens-Mack J., Makalowska I., dePamphilis C.W. ChloroplastDB: the chloroplast genome database // Nucleic Acids Res. 2006. - Vol. 34. - P. D692-D696.

24. Darling A.C., Mau B., Blattner F.R., Perna N.T. Mauve: multiple alignment of conserved genomic sequence with rearrangements // Genome Res.2004. Vol. 14, No. 7. - P. 1394-1403.

25. Dorrell R.G., Smith A.G. Do red and green make brown? : Perspectives on plastid acquisitions within chromalveolates // Eukaryot. Cell. 2011. - Vol. 10, No. 7.-P. 856-868.

26. Eberhard S., Finazzi G., Wollman F.-A. The Dynamics of Photosynthesis //Annu. Rev. Genet. 2008. - Vol. 42. - P. 463-515.

27. Edgar R.C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput // Nucleic Acids Res. 2004. - Vol. 32, No. 5. - P. 1792-1797.

28. Ehara M., Inagaki Y., Watanabe K.I., Ohama T. Phylogenetic analysis of diatom coxl genes and implications of a fluctuating GC content on mitochondrial genetic code evolution // Curr. Genet. 2000. - Vol. 37. - P. 29-33.

29. Erpenbeck D., Voigt O., Worheide G., Lavrov D.V. The mitochondrial genomes of sponges provide evidence for multiple invasions by repetitive hairpin-forming elements (RHE) // BMC Genomics. 2009. - Vol. 10. - P. 1-14.

30. Evans K.M., Wortley A.H., Mann D.G. An assessment of potential diatom "barcode" genes (cox 1, rbcL, 18S and ITS rDNA) and their effectiveness in determining relationships in Sellaphora (Bacillariophyta) // Protist. 2007. -Vol. 158, No. 3.- P. 349-364.

31. Falkowski P.G., Barber R.T., Smetacek V.V. Biogeochemical controls and feedbacks on ocean primary production // Science. 1998. - Vol. 281. - P. 200-207.

32. Falkowski P.G., Katz M.E., Knoll A.H., Quigg A., Raven J.A., Schofield O., Taylor F.J.R. The evolution of modern eukaryotic phytoplankton // Science.2004. Vol. 305. - P. 354-360.

33. Field C.B., Behrenfeld M.J., Randerson J.T., Falkowski P. Primary production of the biosphere: integrating terrestrial and oceanic components // Science. 1998. - Vol. 281. - P. 237-240.

34. Foth B.J., McFadden G.I. The apicoplast: a plastid in Plasmodium falciparum and other Apicomplexan parasites // Int. Rev. Cytol. 2003. - Vol. 224. -P. 57-110.

35. Galachyants Y.P. Molecular phylogenetic analysis of mitochondrial genomes of diatoms // Contributions of the 2nd Moscow Int. Conf. "Molecular Phylogenetics" (MolPhy-2) / A. Troitsky, L. Rusin, D. Aleshin (eds). Moscow: Eleks-KM, 2010.-P. 96.

36. Gersonde R, Harwood D.M. Lower Cretaceous diatoms from ODP Leg 113 site 693 (Weddell Sea) Part 1: vegetative cells // Proc. ODP Sci. Results. 1990. -Vol. 113.-P. 365-402.

37. Gibbs S.P. The ehloroplasts of some algal groups may have evolved from endosymbiotic eukaryotic algae // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1981. - Vol. 361. - P. 193208.

38. Giordano M., Beardall J., Raven J.A. C02 concentrating mechanisms in algae: mechanisms, environmental modulation, and evolution // Annu. Rev. Plant Biol. 2005. - Vol. 56. - P. 99-131.

39. Girard V, Schmidt A.R., Saint Martin S., Struwe S., Perrichot V., Saint Martin J.P., Grosheny D., Breton G., Neraudeau D. Evidence for marine microfossils from amber // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. - Vol. 105, No. 45. - P. 1742617429.

40. Glenn T.C. Field guide to next-generation DNA sequencers // Mol. Ecol. Resour. -2011. Vol. 11, No. 5. - P. 759-769.

41. Gordon D., Desmarais C., Green P. Automated Finishing with Autofinish // Genome Res. 2001. - Vol. 11, No. 4. - P. 614-625.

42. Gray M.W., Lang B.F., Burger G. Mitochondria of protists // Annu. Rev. Genet. 2004. - Vol. 38. - P. 477-524.

43. Grayburn W.S., Hudspeth D.S.S., Gane J.K., Hudspeth M.E.S. The mitochondrial genome of Saprolegnia ferax: organization, gene content and nucleotide sequence // Mycologia. 2004. - Vol. 96. - P. 981-989.

44. Green B.R. After the primary endosymbiosis: an update on the chromalveolate hypothesis and the origins of algae with Chi c // Photosynth. Res. -2011.-Vol. 107.-P. 103-115.

45. Grzebyk D., Schofield O., Vetriani C., Falkowski P.G. The mesozoic radiation of eukaryotic algae: the portable plastid hypothesis // J. Phycol. 2003. -Vol. 39. - P. 259-267.

46. Gschloessl B., Guermeur Y., Cock J.M. HECTAR: a method to predict subcellular targeting in heterokonts // BMC Bioinformatics. 2008. - Vol. 9. - P. 112.

47. Guindon S., Gascuel O. A simple, fast, and accurate algorithm to estimate large phylogenies by maximum likelihood // Syst. Biol. 2003. - Vol. 52. - P. 696704.

48. Hackett J.D., Yoon H.S., Soares M.B., Bonaldo M.F., Casavant T.L., Scheetz T.E., Nosenko T., Bhattacharya D. Migration of the plastid genome to the nucleus in a peridinin dinoflagellate // Curr. Biol. 2004. - Vol. 14. - P. 213-218.

49. Hasle G.R., Syvertsen E.E. Marine diatoms // Identifying Marine Phytoplankton / C.R. Tomas (ed.). San Diego: Academic Press, 1997. - P. 5.

50. Huson D.H., Bryant D. Application of phylogenetic networks in evolutionary studies // Mol. Biol. Evol. 2006. - Vol. 23, No. 2. - P. 254-267.

51. Huson D.H., Richter D.C, Rausch C., Dezulian T., Franz M., Rupp R. Dendroscope An interactive viewer for large phylogenetic trees // BMC Bioinformatics. - 2007. - Vol. 8. - P. 1-6.

52. Hwang S.R., Tabita F.R. Acyl carrier protein-derived sequence encoded by the chloroplast genome in the marine diatom Cylindrotheca sp. strain N1 // J. Biol. Chem. 1991. - Vol. 266, No. 21. - P. 13492-13494.

53. Ikuta K., Kawai H., Muller D.G., Ohama T. Recurrent invasion of mitochondrial group II introns in specimens of Pylaiella littoralis (brown alga) collected worldwide // Curr. Genet. 2008. - Vol. 53. - P. 207-216.

54. Imanian B., Carpenter K.J., Keeling P.J. Mitochondrial genome of a tertiary endosymbiont retains genes for electron transport proteins // J. Eukaryot. Microbiol. 2007. - Vol. 54, No. 2. - P. 146-153.

55. Imanian B., Pombert J.F., Keeling P.J. The complete plastid genomes of the two 'dinotoms' Durinskia baltica and Kryptoperidinium foliaceum II PLoS One. -2010.-Vol. 5, No. 5.-P. 1-9.

56. Jobb G., von Haeseler A., Strimmer K. TREEFINDER: a powerful graphical analysis environment for molecular phylogenetics // BMC Evol. Biol. -2004.-Vol. 4.-P. 1-9.

57. Keeling P.J. Functional and ecological impacts of horizontal gene transfer in eukaryotes // Curr. Opin. Genet. Dev. 2009. - Vol. 19, No. 6. - P. 613-619.

58. Keeling P.J. The endosymbiotic origin, diversification and fate of plastids // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. 2010. - Vol. 365. - P. 729-748.

59. Kilian O., Kroth P.G. Identification and characterization of a new conserved motif within the presequence of proteins targeted into complex diatom plastids // Plant J. 2005. - Vol. 41, No. 2. - P. 175-183.

60. Kleffmann T., Russenberger D., von Zychlinski A., Christopher W., SjolanderK., Gruissem W., Baginsky S. The Arabidopsis thaliana chloroplast proteome reveals pathway abundance and novel protein functions // Curr. Biol. -2004.-Vol. 14.-P. 354-362.

61. Kooistra W.H., Medlin L.K. Evolution of the diatoms (Bacillariophyta). IV. A reconstruction of their age from small subunit rRNA coding regions and the fossil record // Mol. Phylogenet. Evol. 1996. - Vol. 6, No. 3. - P. 391-407.

62. Koumandou V.L., Nisbet R.E., Barbrook A.C., Howe C.J. Dinoflagellate chloroplasts where have all the genes gone? // Trends Genet. - 2004. - Vol. 20, No. 5.-P. 261-267.

63. Kowallik K.V., Stoebe B., Schaffran I., KrothPancic P., Freier U. The chloroplast genome of a chlorophyll a + c-containing alga, Odontella sinensis II Plant. Mol. Biol. Rep. 1995. - Vol. 13. - P. 336-342.

64. Krzywinski M., Schein J., Birol I., Connors J., Gascoyne R., Horsman D., Jones S.J., Marra M.A. Circos: an information aesthetic for comparative genomics // Genome Res. 2009. - Vol. 19. - P. 1639-1645.

65. Lagesen K., Hallin P., Rodland E.A., Staerfeldt H.H., Rognes T., Ussery

66. D.W. RNAmmer: consistent and rapid annotation of ribosomal RNA genes // Nucleic Acids Res. 2007. - Vol. 35, No. 9. - P. 3100-3108.

67. Lane C.E., Archibald J.M. The eukaryotic tree of life: endosymbiosis takes its TOL // Trends Ecol. Evol. 2008. - Vol. 23, No. 5. - P. 268-275.

68. Laslett D., Canback B. ARAGORN, a program to detect tRNA genes and tmRNA genes in nucleotide sequences // Nucleic Acids Res. 2004. - Vol. 32, No. 1. -P. 11-16.

69. Le S.Q., Gascuel O. An improved general amino acid replacement matrix // Mol. Biol. Evol. 2008. - Vol. 25. - P. 1307-1320.

70. Lepetit B., Goss R., Jakob T., Wilhelm C. Molecular dynamics of the diatom thylakoid membrane under different light conditions // Photosynth. Res. -2011.-Feb. 16.-P. 1-13.

71. Li H., Durbin R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler Transform // Bioinformatics. 2009. - Vol. 25. - P. 1754-1760.

72. Li H., Handsaker B., Wysoker A., Fennell T., Ruan J., Homer N., Marth G., Abecasis G., Durbin R., 1000 Genome Project Data Processing Subgroup. The Sequence alignment/map (SAM) format and SAMtools // Bioinformatics. 2009. -Vol. 25. - P. 2078-2079.

73. Lowe T.M., Eddy S.R. tRNAscan-SE: a program for improved detection of transfer RNA genes in genomic sequence // Nucleic Acids Res. 1997. - Vol. 25. -P. 955-964.

74. McElwain J.C., Punyasena S.W. Mass extinction events and the plantfossil record // Trends Ecol. Evol. 2007. - Vol. 22. - P. 548-557.

75. McGinnis K., Sommerfeld M. Plastid fatty acid biosynthesis in the diatoms Nitzschia alba and Nitzschia laevis II J. Phycol. 2000. - Vol. 36. - P. 46.

76. Martin F.N., Bensasson D., Tyler B.M., Boore J.L. Mitochondrial genome sequences and comparative genomics of Phytophthora ramorum and P. sojae I I Curr. Genet. 2007. - Vol. 51. - P. 285-296.

77. Martin W. Gene transfer from organelles to the nucleus: frequent and in big chunks // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. - Vol. 100, No. 15. - P. 8612-8614.

78. Medlin L.K. Diatoms (Bacillariophyta) // The Timetree of Life / S.B. Hedges, S. Kuman (eds). New York: Oxford University Press, 2009. - P. 127-130.

79. Medlin L.K., Kaczmarska I. Evolution of the diatoms: V. Morphological and cytological support for the major clades and a taxonomic revision // Phycologia. -2004. Vol. 43. - P. 245-270.

80. Medlin L., Williams D., Sims P. The evolution of the diatoms (Bacillariophyta) I. Origin of the group and assessment of the monophyly of its major divisions // Eur. J. Phycol. 1993. - Vol. 28. - P. 261-275.

81. Medlin L.K., Saez A.G., Young J.R. A molecular clock for coccolithophores and implications for selectivity of phytoplankton extinc-tions across the K/T boundary // Mar. Micropaleontol. 2008. - Vol. 67. - P. 69-86.

82. Metzker M.L. Sequencing technologies the next generation // Nat. Rev. Genet. -. 2010.-Vol. 11, No. 1.-P. 31-46.

83. Moniz M.B., Kaczmarska I. Barcoding of diatoms: nuclear encoded ITS revisited//Protist. -2010. -Vol. 161, No. 1.-P. 7-34.

84. Moret B.M.E., Siepel A.C., Tang J., Liu T. Inversion medians outperform breakpoint medians in phylogeny reconstruction from gene-order data // Lecture Notes in Computer Science. 2002. - Vol. 2452. - P. 1-15.

85. Moustafa A., Beszteri B., Maier U.G., Bowler C., Valentin K., Bhattacharya A. Genomic footprints of a cryptic plastid endosymbiosis in diatoms // Science. 2009. - Vol. 324. - P. 1724-1726.

86. Oudot-Le Secq M.P., Green B.R. Complex repeat structures and novel features in the mitochondrial genomes of the diatoms Phaeodactylum tricornutum and Thalassiosira pseudonana II Gene. 2011. - Vol. 476. - P. 20-26.

87. Paquin B., Laforest J.-J., Forget L., Roewer I., Wang Z., Longcore J., Lang B.F. The fungal mitochondrial genome project: evolution of fungal mitochondrial genomes and their gene expression // Curr. Genet. 1997. - Vol. 31. -P. 380-395.

88. Paquin B., Laforest M.-J., Lang B.F. Double-hairpin elements in the mitochondrial DNA of Allomyces: evidence for mobility // Mol. Biol. Evol. 2000. -Vol. 17.-P. 1760-1768.

89. Pérez-Brocal V., Shahar-Golan R., Clark C.G. A linear molecule with two large inverted repeats: the mitochondrial genome of the stramenopile Proteromonas lacerate II Genome Biol. Evol. 2010. - Vol. 2. - P. 257-266.

90. Petersen T.N., Brunak S., von Heijne G., Nielsen H. SignalP 4.0:discriminating signal peptides from transmembrane regions // Nat. Methods. 2011. -Vol. 8, No. 10.-P. 785-786.

91. Posada D. jModelTest: phylogenetic model averaging // Mol. Biol. Evol. 2008. - Vol. 25. - P. 1253-1256.

92. Pratiwi A., Syah D., Hardjito L., Panggabean L., Suhartono M. Fatty acid synthesis by indonesian marine diatom, Chaetoceros gracilis II Hayati: J. Biosci. -2010.-Vol. 16,No. 4.-P. 151-156.

93. Prihoda J., Tanaka A., de Paula W.B., Allen J.F., Tirichine L., Bowler C. Chloroplast-mitochondria cross-talk in diatoms // J. Exp. Bot. 2012. - Jan. 20. -P. 1-15.

94. Regalia M., Rosenblad M.A., Samuelsson T. Prediction of signal recognition particle RNA genes // Nucleic Acids Res. 2002. - Vol. 30, No. 15. -P. 3368-3377.

95. Rice P., Longden I., Bleasby A. EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite // Trends in Genetics. 2000. - Vol. 16, No. 6,- P. 276277.

96. Rizzuto R., Pinton P., Carrington W., Fay F.S., Fogarty K.E., Lifshitz

97. M., TuftR.A., Pozzan T. Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca2+ responses // Science. 1998. - Vol. 280, No. 5370.-P. 1763-1766.

98. Rochaix J.-D., Mayfield S., Goldschmidt-Clermont M., Erickson J. Molecular biology of Chlamydomonas // Plant Molecular Biology: A Practical Approach / C.H. Shaw (ed.). Oxford: IRL Press, 1988. - P. 253-275.

99. Rosenblad M.A., Samuelsson T. Identification of chloroplast signal recognition particle RNA genes // Plant Cell Physiol. 2004. - Vol. 45, No. 11. -P. 1633-1639.

100. Rothpietz, A. Über einen neuen jurassischen Hornschwämm und die darin eingeschlossenen // Diatomeen. Zeitschrift der Deutschen Geologischen Gesellschaft. 1900. - Vol. 52. - P. 152-160.

101. Round F.E. What characters define diatom genera, species and infra-specific taxa? // Diatom Res. 1996. - Vol. 11, No. 1. - P. 203-218.

102. Round F.E., Crawford R.M., Mann D.G. The diatom: morphology and biology of the genera // Bristol: Cambridge University Press, 1990. 747 p.

103. Rutherford K., Parkhill J., Crook J., Horsnell T., Rice P., Rajandream M.A., Barrell B. Artemis: sequence visualization and annotation // Bioinformatics. -2000. Vol. 16, No. 10. - P. 944-945.

104. Schwark L., Empt P. Sterane biomarkers as indicators of a palaeozoic algal evolution and extinction events // Palaeogeogr. Palaeoclimatol. Palaeoecol. -2006. Vol. 240. - P. 225-236.

105. Sims P.A., Mann D.G., Medlin L.K. Evolution of the diatoms: insights from fossil, biological and molecular data // Phycologia 2006. - Vol. 45. - P. 361402.

106. Sorhannus U. A nuclear-encoded small-subunit ribosomal RNA timescale for diatom evolution // Mar. Micropaleo. 2007. - Vol. 65. - P. 1-12.

107. Stoebe В., Kowallik K.V. Gene-cluster analysis in chloroplast genomics // Trends Genet. 1999. - Vol. 15, No. 9. - P. 344-347.

108. Stoermer E.F., Smol J.P. Applications and uses of diatoms: prologue // The Diatoms: Applications for the Environmental and Earth Sciences / E.F. Stoermer, J.P. Smol (eds). Cambridge: Cambridge University Press, 1999. - P. 3-8.

109. Stover B.C., Mtiller K.F. TreeGraph 2: Combining and visualizing evidence from different phylogenetic analyses // BMC Bioinformatics. 2010. -Vol. 11.-P. 1-9.

110. Talavera G., Castresana J. Improvement of phylogenies after removing divergent and ambiguously aligned blocks from protein sequence alignments // Syst. Biol. 2007. - Vol. 56. - P. 564-577.

111. Theriot E.C., Ashworth M., Ruck E., Nakov T., Jansen R.K. A preliminary multigene phylogeny of the diatoms (Bacillariophyta): challenges for future research // Plant Ecol. Evol. 2010. - Vol. 143, No. 3. - P. 278-296.

112. Theriot E.C., Cannone J.J., Gutell R.R., Alverson A.J. The limits of nuclear encoded 35. SSU rDNA for resolving the diatom phylogeny // Eur. J. Phycol. 2009. - Vol. 44, No. 3. - P. 277-290.

113. Thompson A.S., Rhodes J.C., Pettman I. (eds). Culture Collections of Algae and Protozoa: Catalogue of Strains. Kendal: Titus Wilson and Son, 1988. -P. 164.

114. Treguer P., Nelson D.M., Van Bennekom A.J., Demaster D.J., Leynaert A., Queguiner B. The silica balance in the world ocean: a reestimate // Science.1995.-Vol. 268. P. 375-379.

115. Turmel M., Otis C., Lemieux C. The complete chloroplast DNA sequence of the green alga Nephroselmis olivacea: insights into the architecture of ancestral chloroplast genomes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - Vol.96, No. 18.1. P. 10248-10253.

116. Van de Peer Y., Rensing S.A., Maier U.G., De Wachter R. Substitution rate calibration of small subunit ribosomal RNA identifies chlorarachniophyte endosymbionts as remnants of green algae // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. -Vol. 93.-P. 7732-7736.

117. Wang S.L., Liu X.Q., Douglas S.E. The large ribosomal protein gene cluster of a cryptomonad plastid: gene organization, sequence and evolutionary implications // Biochem. Mol. Biol. Int. 1997. - Vol. 41, No. 5. - P. 1035-1044.

118. Waterhouse A.M., Procter J.B., Martin D.M.A, Clamp M., Barton G.J. Jalview version 2: A multiple sequence alignment and analysis workbench // Bioinformatics. -2009. Vol. 25, No. 9. - P. 1189-1191.

119. Weber J. ATP synthase: subunit-subunit interactions in the stator stalk // Trends Biochem. Sci. 2007. - Vol. 32, No. 2 - P. 53-56.

120. Wernersson R., Pedersen A.G. RevTrans constructing alignments of coding DNA from aligned amino acid sequences // Nucleic Acids Res. - 2003. -Vol. 31.-P. 3537-3539.

121. Yoon H.S., Hackett J.D., Pinto G., Bhattacharya D. The single, ancient origin of chromist plastids // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. - Vol. 99. -P. 15507-15512.

122. Yotsukura N., Shimizu T., Katayama T., Druehl L.D. Mitochondrial DNA sequence variation of four Saccharina species (Laminariales, Phaeophyceae) growing in Japan // J. Appl. Phycol. 2010. - Vol. 22. - P. 243-251.