Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительное исследование ультраструктуры диатомовых водорослей из разных классов методами световой и электронной микроскопии

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительное исследование ультраструктуры диатомовых водорослей из разных классов методами световой и электронной микроскопии"

На правах рукописи

Бедошвили Екатерина Джамбулатовна

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ УЛЬТРАСТРУКТУРЫ

ДИАТОМОВЫХ ВОДОРОСЛЕЙ ИЗ РАЗНЫХ КЛАССОВ МЕТОДАМИ СВЕТОВОЙ И ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2010

2 3 СЕН 2010

004609087

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Лимнологическом институте Сибирского отделения РАН, в отделе ультраструктуры клетки, г. Иркутск

Научный руководитель: доктор биологических наук

Е.В. Лихошвай

Лимнологический институт СО РАН г. Иркутск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

И.И. Кикнадзе

Институт цитологии и генетики СО РАН г. Новосибирск

доктор биологических наук Ю.В. Науменко

Центральный сибирский ботанический сад СО РАН г. Новосибирск

Ведущее учреждение: Сибирский институт физиологии и

биохимии растений СО РАН г. Иркутск

Защита диссертации состоится «29» сентября 2010 г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание учёной степени доктора биологических наук Д 003.011.01 в Институте цитологии и генетики СО РАН, в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 10, тел./факс (383)-333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан А 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Т.М. Хлебодарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Диатомовые водоросли благодаря способности формировать кремнистый панцирь с тонкими структурами ианометрового размера привлекают внимание специалистов различных профилей, которое активизировалось с развитием нанотехнологий. Исследования процесса отложения кремнезема у диатомовых водорослей ведутся с 60-х годов прошлого века. Были описаны специфические органеллы отложения кремнезема (SDV -silica deposition vesicle; Reimann, 1964; Drum, Pankratz, 1964) и везикулы транспорта кремния (STV - silicon-transport vesicle; Schmid, Schultz, 1979). Недавно было открыто семейство белков SIT (silicon transporter) у морских диатомей (Hildebrand et al, 1997; Hildebrand, Dahlin, Volcani, 1998), а затем и у пресноводных (Грачев и др., 2002; Щербакова и др., 2005), способных транспортировать кремний в виде кремниевой кислоты из водного окружения внутрь клетки. Однако локализация белка SIT пока не определена, механизмы формирования видоспецифических кремнистых структур неизвестны, вопросы внутриклеточного транспорта кремния остаются дискуссионными (Mediin, 2002; Schmid, 2003; Medlin, 2004; Schmid, 2005; Thamatrakoln, Hildebrand, 2007; Vrieling et al., 2007; Grachev, Annenkov, Likhoshway, 2008; Thamatrakoln, Hildebrand, 2008; Thamatrakoln, Kustka, 2009).

Имеющиеся данные о строении клеток диатомовых водорослей разрозненны и не охватывают все крупные систематические таксоны (порядки, семейства) BACILLARIOPHYTA, поэтому новые данные об ультраструктуре диатомовых водорослей, представляющих различные классы, актуальны как для выяснения механизмов, определяющих морфогенез кремнистых структур, так и для систематики диатомей.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы было выявление особенностей строения клеток и морфогенеза кремнистых панцирей нескольких видов диатомовых водорослей, принадлежащих к основным таксономическим группам.

. Были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать ультраструктуру клеток диатомовых водорослей, принадлежащих к известным классам (центрических с радиальной симметрией, центрических с биполярной симметрией, иеннатных бесшовных и пеннатных шовных) и к разным филогенетическим кладам (1, 2а и 2Ь).

2. Исследовать морфогенез кремнистых панцирей в природной популяции в течение годового цикла и в лабораторной культуре на разных стадиях клеточного цикла для некоторых видов.

3. Разработать метод мягкого растворения кремнистых панцирей, не повреждающий ультраструкгуру клеток.

4. Локализовать белок транспортер кремния (SIT) в клетках одного из видов диатомей различными методами ИЭМ.

Научная новизна. Описаны особенности строения клеточных органелл диатомовых водорослей Thalassiosira proschkinae Makarova, Aulacoseira baicalensis (К. Meyer) Siinonsen, Attheya ussurensis Stonik, Orlova et Crawford, Chaetoceros muelleri Lemmermann, Synedra acus subsp. radians (Kützing) Skabitschevsky, Cymbella ventricosa Agardh. Впервые показано, что

формирование разделительных створок, потенциально обеспечивающих расселение вида, начинается в подледной стадии развития Aulacoseira baicalensis и наиболее активно происходит при максимальной плотности клеток в популяции. Впервые произведена внутриклеточная визуализация белка SIT.

Практическая и теоретическая значимость работы. Данные об изменении морфологии колоний доминирующего в озере Байкал вида Aulacoseira baicalensis могут иметь практическое применение в мониторинге за его экосистемой и при построении палеоклиматических реконструкций. Данные об ультраструктуре клеток диатомовых водорослей важны для понимания эволюционных процессов, лежащих в основе формирования крупных таксонов этой группы водорослей. Визуализация белка SIT важна для исследований, направленных на выявление его роли в механизмах, определяющих особенности морфогенеза кремнистых структур. Метод мягкого растворения кремнистого панциря позволяет получать данные о строении клеток диатомей без применения алмазного ножа и исследовать внутриклеточную локализацию белков методами преэмбеддинга. Получены новые фундаментальные данные о строении клеток диатомовых водорослей, которые могут быть использованы в курсах лекций по цитологии.

Основные защищаемые положения:

1. Признаки ультраструктуры хлоропластов широко варьируют у диатомовых водорослей, принадлежащих ко всем филогенетическим группам.

2. Формирование разделительных створок у диатомовой водоросли Aulacoseira baicalensis наиболее активно происходит при переходе популяции в планктонную фазу годового цикла.

3. В клеточном цикле Synedra actis subsp. radians образование первого пояскового ободка и деление хлоропластов происходят после экзоцитоза сформировавшейся створки.

4. Метод мягкого растворения кремнистого панциря пригоден для исследования ультраструктуры клеток диатомовых водорослей.

5. Антигенные детерминанты белка SIT локализованы в районе ареол и в цитоплазме.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены на конференциях: "The living diatom cell" (Irkutsk, September 17-22, 2004); The 19th International Diatom Symposium (Lystvyanka, August 28-September 2, 2006); IX-ой Международной конференции молодых ботаников (Санкт-Петербург, 21-26 мая, 2006); IV-ом съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 11-15 мая, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них 4 статьи в рецензируемых журналах и 1 глава в монографии на английском языке. В диссертационную работу вошли исследования, поддержанные Программой Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» (гранты № 10.3, 10.4, 22.3, 6.3), грантом Президента РФ НШ-4738.2006.4, интеграционным проектом СО-ДВО РАН № 58 и выполненные в рамках темы фундаментальных исследований № 6.1.1.10 «Контроль морфогенеза кремнистых структур на геномном и клеточном уровне», номер гос. регистрации 01.2.00703351

(Приоритетное направление 6.1. «Биология развития и эволюция живых систем». Программа 6.1.1. «Биология развития и эволюция живых систем»).

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 122 страницах, состоит из введения, 4 глав, списка литературы (169 источников, из них 151 на иностранных языках) и приложения; содержит 2 текстовые таблицы, 36 рисунков, включающих 125 микрофотографий.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Объекты исследований. В работе было исследовано шесть видов, представляющие все классы диатомовых водорослей и их известные филогенетические клады (табл.).

Таблица. Виды, исследованные в работе.

Систематическое положение (по Round, Crawford, Mann, 1990) Отношение к кладе (no Mediin, Kaczmarska, 2004)

класс Coscinodiscophyceae Round et Crawford подкласс Thalassiosirophycidae Round et Crawford порядок Thalassiosirales Glezer et Makarova семейство Thalassiosiraceae Lebuor род Thalassiosira Cleve Thalassiosira proschkinae 2a

подкласс Coscinodiscophycidae Round et Crawford порядок Aulacoseirales Crawford семейство Aulacoseiraceae Crawford род Auiacoseira Thwaites Aulacoseira baicalensis 1

подкласс Chaetocerotophycidae Round et Crawford порядок Chaetocerotales Round et Crawford семейство Chaetocerotaceae Ralfs род Chaetoceros Ehrenberg Chaetoceros muelleri 2a

семейство Attheyaceae Round et Crawford род Attheya T. West Attlieva ussurensis 2a

класс Fragilariophyceae Round подкласс Fragilariophycidae Round порядок Fragilariales Silva семейство Fragilariaceae Greville род Synedra Ehrenberg Synedra acus subsp. radians 2b

класс Bacillariophyceae Haeckel подкласс Bacillariophycidae Mann порядок Cymbellales Mann семейство Cymbellaceae Greville род Cymbella Agardh Cymbella ventricosa 2b

Культура клеток S. acus subsp. radians была выделена из залива Лиственничный оз. Байкал и выращена Т.А. Сафоновой на среде DM1 (Culture Collection ..., 1988). С. ventricosa была выделена из популяции Иркутского водохранилища и выращена Т.Н. Башариной на той же среде. Т. proschkinae, A. ussurensis, С. muelleri были получены от H.A. Айздайчер из Института биологии моря ДВО РАН (Владивосток). Отбор проб A. baicalensis проводили в

заливе Лиственничный оз. Байкал в период весенней вегетации, а также летом и осенью 2004 года.

Химический анализ биогенных элементов в байкальской воде выполняла М.В. Сакирко колориметрическими методами: кремния в виде кремнемолибденовой гетерополикислоты, фосфатов - с образованием комплексной фосфорно-молибденовой кислоты (Руководящий документ 52.24.382-95, Руководящий документ 52.24.433-95).

Световую микроскопию (СМ) живых, клеток проводили с помощью Axiovert 200 («Zeiss», Германия). Для флуоресцентных исследований использовали зеленый фильтр Filter set 15 «Zeiss» (BP 546/12, FT 580, LP 590). Микрофотографии получены с помощью камеры Penguin 600 CL «Fixera» и обработаны в программе ВидеоТест 5.0.

Пробы для сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) отбирали сетью Джеди с глубин 0-25, 25-50 и 50-100 м, фиксировали 70-80% этанолом, наносили на покровные стекла, высушивали и монтировали стекла на столики для СЭМ. Анализ проводился па СЭМ Philips SEM 525М. Разделительный индекс (SVI - separation valve index) для A. baicalensis выражали как процент разделительных створок от общего их количества среди 200 случайно встреченных створок. Измерение длины клеток и колоний проводили для 20-50 случайно встреченных колоний.

Для просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) кдетки фиксировали в логарифмической фазе роста в 2,5 % глутаровом альдегиде («Sigma-Aldrich», Германия) на 0,066 M фосфатном буфере Соренсена pH 7,0, приготовленного из 39,2 мл 0,066 M КН2Р04 («ICN», США) и 60,8 мл 0,066 M Na2HP04 («ICN», США), в течение 12 ч и в 1 % четырех окиси осмия («Merck KGaA», Германия) на том же буфере (2 ч). Затем клетки заключали в 1 % агарозу («Helicon», Москва). Для растворения кремнистого панциря клетки обрабатывали в течение трех мин с последующей двукратной отмывкой в фосфатном буфере 1 M раствором фтористого аммония pH 5,0, приготовленного из 45 % плавиковой кислоты (ООО «Реахимкомплект», Ангарск) и 25 % водного раствора аммиака («Сигма Тек», Москва). Обезвоживание проводили в' серии растворов этанола (ООО «Реахимкомплект», Ангарск): 30, 50,70, 96 %, а затем в обезвоженных над сульфатом меди (ООО «Реахимкомплект», Ангарск) этаноле и ацетоне (ООО «Реахимкомплект», Ангарск) - в каждом по 5 мин. Обезвоженный материал пропитывали в трех смесях эпоксидной смолы Araldite 502 Kit («SPI», США) и ацетона в соотношениях 1:2, 1:1 и 2:1 по 3 ч в каждой, затем в свежей смоле - 12 ч. После этого материал переносили в полипропиленовую капсулу Веет™ в свежую смесь смолы с катализатором (250 мкл DMP-30 («SPI», США) на 20 мл смолы) и полимеризовали в термостате при и 60°С (3 сут). Ультратонкие срезы делали алмазным ножом ULTRA 35° («Diatom», Швейцария) на микротоме Ultracut R («Leica», Австрия), срезы клеток, обработанных фтористым аммонием, получали с помощью стеклянных ножей на том же микротоме. Срезы помещали на палладиевые сетки и контрастировали в цитрате свинца по Рейнольдсу (Reynolds, 1963).

Для иммуно-электронной микроскопии (ИЭМ) клетки в логарифмической фазе роста концентрировали методом последовательного

центрифугирования и фиксировали в 4 % параформальдегиде («Реахим», Россия) на фосфатном буфере Соренсена при pH 7,4 в течение 30 мин. Затем клетки отмывали от фиксатора тем же буфером и выдерживали в растворе 2 % глицина («Raana», Венгрия). Далее дая постэмбеддинга после отмывки в буфере клетки заключали в 1 % агарозу («Helicón», Москва) и проводили обезвоживание материала в серии растворов этанола (30, 50, 70, 96, 100 % - в каждом по 5 мин). Затем материал переносили в смолу Unicryl™ («British BioCell Int.», Великобритания) и выдерживали при температуре 4°С 1 ч, и затем еще 12 ч в свежей смоле. После этого материал переносили в свежую смолу и полимеризовали в холодильной камере 17020-Ах («SPI», США) при -10°С при облучении ультрафиолетом 4 сут. Срезы получали алмазным ножом Diatome 35° («Diatome», Швейцария) на ультрамикротоме Ultracut R («Leica», Австрия), собирали на никелевые сетки с формваровой подложкой и окрашивали с помощью антисывороток к фрагменту SIT CQVNAANSMLDFINNY, представляющему собой один из внемембранных участков исследуемого белка (ГНЦ ВБ «Вектор», Новосибирск, разведение 1:100), и раствора коллоидного золота («Биотест», Новосибирск) с частицами диаметром 9 im, коньюгированного с белком А (разведение 1:100), как описано ранее (Raska, 1988). Для контроля срезы выдерживали в растворе коллоидного золота 1:100 без предварительной обработки антисыворотками. Все препараты контрастировали в 1 % растворе уранилацетата («Sigma-Aldrich», Германия) на 10 % этаноле и цитратом свинца по Рейнольдсу (Reynolds, 1963).

Для преэмбеддинга часть из зафиксированных клеток обрабатывали 1 M фтористым аммонием pH 5,0 в течение 3 мин, а другую часть раздавливали в ступке. После этого полученный материал выдерживали в 1 % растворе BSA («Amresco», США), а затем в растворе антисывороток. Для контроля часть материала антисывороткой не обрабатывали. После отмывки в фосфатном буфере материал выдерживали в растворе коллоидного золота (разведение 1:100), после вторичной отмывки фиксировали в 2,5 % глутаровом альдегиде на фосфатном буфере в течение 1 ч и далее постфиксировали 12 ч в 1 % растворе оксида осмия («Merck KGaA», Германия) на фосфатном буфере. Клетки заключали в 1 % агарозу и обезвоживали в серии растворов этанола (30, 50, 70, 96, 100 % - в каждом по 15 мин), затем в обезвоженном над сульфатом меди ацетоне (ООО «Реахимкомплект», Ангарск). Обезвоженный материал пропитывали в трех смесях эпоксидной смолы Araldite 502 Kit («SPI», США) и ацетона в соотношениях 1:2, 1:1 и 2:1 по 3 ч в каждой, затем в свежей смоле -12 ч. После этого материал переносили в полипропиленовую капсулу Веет™ в свежую смесь смолы с катализатором (250 мкл DMP-30 («SPI», США) на 20 мл смолы) и полимеризовали в термостате при и 60°С (4 сут). Срезы получали алмазным ножом Diatome 35° («Diatome», Швейцария) на ультрамикротоме Ultracut R («Leica», Австрия) и помещали на палладиевые сетки.

Исследование всех препаратов проводили с помощью ПЭМ Leo 906 Е («Zeiss», Германия) при ускоряющем напряжении 80 kV. Микрофотографии получены камерой MegaView II («Zeiss», Германия) и обработаны в программе MegaVision.

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Ультраструктура клеток нескольких видов диатомовых водорослей разного систематического положения Несколько видов диатомей исследованы методами СМ и ПЭМ (рис. 1,2). Thalassiosira proschkinae. Крупный хлоропласт разделен на две доли (рис. 1 А, Б). Опоясывающая ламелла состоит из двух или трех коротких ламелл (рис. 1Н); виден перипластидный ретикулум (рис. 1У). Двояковыпуклый пиреноид окружен оболочкой, его пронизывает одна ламелла с одним тилакоидом (рис. 1Н). Ядро находится рядом с одной из створок (рис. 2А), аппарат Гольджи -вблизи ядерной мембраны (рис. 2А). Митохондрии крупные (рис. 2Ж).

Aulacoseira baicalensis. Хлоропласта многочисленные, дисковидной формы (рис. 1В, Г). По периферии хлоропласта располагаются стопки тилакоидов, уходящие в строму хлоропласта (рис. Ю); виден перипластидный ретикулум (рис. 1Ф). Лигаовидный пиреноид пересекают 1-3 ламеллы (рис. 10). Ядро имеет четко выраженное ядрышко, 1-4 аппарата Гольджи расположены по периферии клетки вблизи ядра (рис. 2Б). Митохондрии имеют сложную разветвленную форму (рис. 2К).

Attheya ussurensis. Хлоропласт имеет несколько долей, расходящихся от центра клетки (рис. 1Д, Е). Опоясывающая ламелла состоит из нескольких фрагментов, в зону пиреноида не заходит (рис. 1Р); виден перипластидный ретикулум (рис. 1Ц). Полупогруженные пиреноиды обращены к центру клетки (рис. 1Р). Ядро с хорошо выраженным ядрышком прижато к поясковым ободкам, 1-2 аппарата Гольджи расположены рядом с ядром (рис. 2Г). Митохондрии удлиненные, на поперечных, срезах округлой формы (рис. 2И),

Chaetoceros muelleri. Клетки мелкие, имеют щетинки (рис. 1Ж). Хлоропласт занимает большую часть клетки (рис. 13), прилегает к ее поверхности, окружен непрерывной опоясывающей ламеллой (рис. 1П); виден перипластидный ретикулум (IX). Линзообразный пиреноид обращен выпуклой частью к периферии клетки, его пронизывает одна ламелла, состоящая из трех тилакоидов (рис. 1П). Ядро смещено к поясковым ободкам, аппарат Гольджи с многочисленными цистернами прижат к ядерной мембране (рис. 2В). Одна митохондрия сложной разветвленной формы или с инвагинацией (рис. 23).

Synedra acus subsp. radians. Длинные хлоропласта вытянуты вдоль клетки (рис. 1И, К), окружены опоясывающей ламеллой; виден перипластидный ретикулум (рис. 14). Пиреноид обращен к периферии клетки (рис. IT). Ядро располагается диагонально, имеет лопасти и инвагинации, внутрь которых заходят цистерны ЭПР (рис. 2Д; 5Ж). Аппараты Гольджи (рис. 2Д) располагаются вдоль ядра, многочисленные длинные и узкие митохондрии - по периферии клетки (рис. 2JI).

Cymbella ventricosa. Хлоропласт разделен на две доли (рис. 1Л, М). Сферический пиреноид имеет оболочку, его пронизывает одна ламелла, состоящая из одного тилакоида, не связанного с другими тилакоидами (рис. 1С). Хлоропласт окружают несколько коротких ламелл (рис. 1С); виден перипластидный ретикулум (рис. 1Ш). Ядро прижато к поясковым ободкам, вокруг него находятся несколько аппаратов Гольджи (рис. 2Е). Длинные и разветвленные митохондрии расположены по периферии клетки (рис. 2М).

Рис. 1. Строение хлоропластов нескольких видов диатомовых водорослей. А-М - СМ; Н-Ш -ПЭМ. А, Б, Н, У - Г. proschkinae-, В, Г, О, Ф -A. baicalensis; Д, Е, Р, Ц -A. ussurensis, Ж, 3, П, Ц - С. muelleri, И, К, Т, Ч - S. acus subsp. radians; Л, М, С, III - С. ventricosa. Условные обозначения: П - пиреноид; Л - ламелла пиреноида; длинная стрелка - перигшастидный ретикулум; короткая белая стрелка - оболочка пиреноида; короткая черная стрелка - место прерывания опоясывающей ламеплы. Масштаб: А, Б - 5 мкм; В-М - 10 мкм; Н, П, У, Ч, Ш -500 нм; О, Р-Т - 1 мкм; Ф-Ц - 200 нм.

V Ж^'й&Ж» ■ ;

п кМ

шшшшш. 3 J щшяшш наш

шуи

Рис. 2. Ультраструктура клеток диатомовых водорослей нескольких видов. ПЭМ. А-Е -околоядерное расположение аппаратов Гольджи; Ж-М - строение митохондрий; А, Ж -Т. proschkinae', Б, К - A. baicalensis', В, 3 - С. muellerí, Г, И — A. ussurensis; Д, Л - S. acus subsp. radians; Е, М - С. ventricosa. Условные обозначения: стрелка - аппарат Гольджи; Я - ядро. Масштаб: А, В, Ж, 3, К - 500 нм ; Б - 2 мкм; Г, Д, Е, Л, М - 1 мкм; И, Л - 200 нм.

2. Изменение морфологии колоний планктонной диатомовой водоросли Aulacoseira baicalensis на разных стадиях годового цикла в озере Байкал

Исследована сезонная динамика формирования разделительных шипов в колониях клеток вида A. baicalensis, доминирующего в оз. Байкал (рис. 3). Показано, что на разных стадиях годового цикла количество клеток в колониях A. baicalensis изменяется. Формирование разделительных шипов начинается в апреле, в подледный период, а максимальное содержание створок с разделительными шипами (20 %) наблюдается в начале июня в период открытой воды. Вслед за этим, в июле, когда температура верхнего слоя воды повышается до 6-8°С, ввд покидает фотическую зону.

Лед Планктон Период нпблюденнП. мес.

Рис. 3. Морфология колоний А. Ьтса1еп513. А-В - СЭМ. А -створки с соединительными шипами; Б - створка на конце колонии с разделительными шипами; В - разделительные шипы закрыты поисковыми ободками; Г - концентрация клеток в планктоне и температура в поверхностном слое воды; Д - процент разделительных створок в колониях; Е - концентрация фосфатов и кремния в поверхностном слое воды. Масштаб -10 мкм.

3. Морфогенез элементов панциря S. acus subsp. radians на разных стадиях клеточного цикла

S. acus subsp. radians является объектом молекулярно-биологических исследований, направленных на выяснение механизмов транспорта кремния и отложения кремнезема (Грачев и др., 2002; Щербакова и др., 2005; Grachev, Annenkov, Likhoshway, 2008), поэтому актуальны морфологические данные об особенностях строения клеток этого вица на разных стадиях клеточного цикла. С помощью ПЭМ удалось наблюдать изменение ультраструкгуры клеток во время основных этапов морфогенеза элементов панциря этого вида (рис. 4,5).

Рис 4. Схема клеточного цикла S. acus subsp. radians. Условные обозначения: Г -гипотека родительской

клетки; г - гипотеки дочерних клеток; Пл - плазмалемма; ПО - поясковые ободки; Э -эпитека родительской клетки; SDV - silica deposition vesicle (везикула отложения

кремнезема).

Рис. 5. Ультраструктура клеток Synedra acus subsp. radians. A-K - ПЭМ; Л-П - ИЭМ, ПЭМ. A -поперечный срез интерфазной клетки перед началом митоза; Б - начальная стадия формирования створок (стрелки), крупные вакуоли внутри клетки (звездочки); В - начальная стадия деления хлорошастов; Г - поперечный срез дочерних клеток с разделившимися хлоропластами; Д - продольный срез через дочерние клетки при морфогенезе створок (стрелки); Е - поперечный срез через хлоропласт и аппарат Гольджи; Ж - поперечный срез через инвагинацию ядра с цистерной шероховатого ЭПР внутри (стрелка), ядерная пора (короткая стрелка); 3-И - стадии формирования первого пояскового ободка (черная стрелка) внутри SDV, окруженной силикалеммой (белая стрелка); К - поперечный срез интерфазной клепси после растворения панциря; JI - локализация SIT в клетках с растворенным панцирем; М - метка на обломках створок; Н - срез клетки в ингерфазе, в цитоплазме видны частицы коллодиного золота; О - срез створки через ареолы, на диатотепуме видны частицы коллоидного золота. Условные обозначения: АГ - аппарат Гольджи; М - митохондрия; ПР -перигшастидный регикулум; Хл - хлоропласт, Я - ядро. Масштаб: А-Ж. К - 1 мкм; 3, И, Л-П -500 нм.

Перед делением клетки аппарат Гольджи из своего интерфазного положения между ядром и хлоропластом перемещается к поисковым ободкам и располагается параллельно им (рис. 5А). Сразу после деления ядра начинается морфогенез створки. Появляется SDV, внутри которой происходит отложение кремнезема; при этом в районе SDV наблюдаются крупные вакуоли (рис. 5Б). В процессе морфогенеза происходит рост SDV и утолщение створки.

После экзоцитоза вновь сформировавшихся створок делится хлоропласт, разделение происходит вдоль его оси (рис. 5В). Пока деление хлоропласта не закончится, дочерние клетки удерживаются вместе системой поясковых ободков (рис. 5В). В дочерних клетках перед разделением хлоропластов при большом увеличении обнаруживаются везикулы аппарата Гольджи, сливающиеся с наружной мембраной хлоропласта (рис. 5Д), а в делящемся хлоропласте наблюдается значительное увеличение количества везикул в перипластидном пространстве (рис. 5Е).

Одновременно с делением хлоропластов происходит формирование первого пояскового ободка в отдельных SDV (рис. 53, И), при этом силикалемма повторяет очертания формирующегося пояскового ободка, а между силикалеммой и электронно-плотным содержимым SDV наблюдается зазор (рис. 511).

4. Метод мягкого растворения кремнистого панциря фтористым аммонием для исследования ультраструктуры клетки Жесткий кремнистый панцирь диатомовых водорослей ограничивает исследования их цитологии. В ходе выполнения данной работы был разработан метод обработки клеток S. acus subsp. radians, позволяющий получать ультратонкие срезы после растворения кремнистого панциря в 1 М фтористом аммонии (pH 5.0). В результате от кремнистого панциря остается органический матрикс, окружающий клетку, а клеточные органеллы сохраняют свою структуру (рис. 5К). В дальнейшей работе этот метод был использован наряду с другими в ИЭМ исследованиях.

5. Локализация антигенных детерминант белка SIT в клетках S. acus subsp. radians методом иммуно-электронной микроскопии

В результате применения различных модификаций ИЭМ удалось выявить антигенные детерминанты белка SIT. При исследовании срезов клеток после растворения панциря антигенные детерминанты белка SIT выявляются по периферии клетки на «тенях» створок, представленных диатотепумом и на мембранных структурах (рис. 5Л). При исследовании ультратонких срезов раздавленных клеток показано наличие метки по периферии клетки, а также на фрагментах створок (рис. 5М). С применением метода постэмбедаинга антигенные детерминанты белка SIT в большом количестве выявлены в цитоплазме и на диатотепуме в районе ареол (рис. 5Н, О).

ОБСУЖДЕНИЕ

1. Формирование разделительных шипов - реакция вида A. baicalensis на изменение условий окружающей среды

В данной работе максимальные значения индекса разделительных створок, отмечены в начале июня, когда концентрация клеток в фотическом слое была максимальной. По нашим наблюдениям температура поверхностного слоя воды, являющаяся лимитирующим фактором для данного организма (Скабичевский, 1929, I960), в начале июня еще была ниже 4°С и не могла служить «сигналом» неблагоприятной обстановки, но вид уже переключился на формирование разделительных створок.

Потребление кремния диатомовыми водорослями в период их массового развития приводит к снижению его концентрации в воде, что соответствует данным литературы (Вотинцев, Мещерякова, Поповская, 1975; Грачев, 2002). Ранее было выяснено, что наиболее важным фактором среды для многих меропланктонных Aulacoseira являются высокие концентрации фосфора (Kilham, Kilham, Hecky, 1986; Reynolds et al., 1986; Kilham, 1990; Jewson et al., 1993). По всей видимости, существенные изменения в жизни клеток A. baicalensis также вызваны изменением концентрации фосфатов (рис. ЗВ). Формирование разделительных створок с шипами иной формы, чем у соединительных створок, связано с необходимостью более широкого расселения вида и может служить примером управления процессом морфогенеза кремнистых структур в клетке при изменении условий окружающей среды.

2. Особенности ультраструктуры клеток диатомовых водорослей в зависимости от их формы и размера

Некоторые особенности ультраструктуры клеток диатомовых водорослей во многом обусловлены их размерами и формой. Так, виды, относящиеся к разным классам, но имеющие сходные размеры и форму клеток, имеют общие черты строения. Например, в мелких клетках С. muelleri и Т. proschkinae около ядра расположен один аппарат Гольджи, у A- ussurensis - один или два, у A. baicalensis и С. ventricosa - до четырех, а в узких клетках вытянутой формы S. acus subsp. radians - шесть. Для С. muelleri и Т. proschkinae характерны крупные митохондрии (иногда разветвленные), у крупных видов, таких как A. baicalensis и S. acus subsp. radians, многочисленные длинные и узкие митохондрии вытянуты вдоль клетки. Ядро в клетках S. acus subsp. radians также удлиненное, в инвагинации ядра можно наблюдать цистерны ЭПР. Такая форма ядра увеличивает его поверхность и обеспечивает лучший контакт с другими клеточными органеллами через ядерные поры, отмеченные в инвагинациях ядерной мембраны. В районе инвагинации ядра наблюдается также массовое слияние везикул от аппарата Гольджи с наружной мембраной ядерной оболочки (рис. 5Ж), свидетельствующее об активном транспорте веществ.

3. Детали строения хлоропластов у исследованных видов

В ходе проведенного исследования показано, что расположение, форма и тонкое строение хлоропластов многообразно и имеет как общие черты строения,

свойственные всем диатомовым водорослям, так и некоторые особенности. У всех исследованных видов тилакоиды собраны в пачки по три и образуют анастомозы. Перипластидный ретикулум, являющийся рудиментом ЭПР эндосимбионта первого порядка, обнаружен у всех исследованных видов: четко видны сферические или овальные мембранные образования между парой внутренних и парой наружных мембран хлоропласта. Можно предположить, что цистерны и везикулы перипластидного ретикулума выполняют роль ЭПР, то есть путем компартментализации перипластидного пространства разделяют протекающие процессы транспорта и модификации белков, синтезированных в цитоплазме. Об участии перипластидного ретикулума в активном транспорте веществ свидетельствуют наблюдения слияния везикул с наружной мембраной хлоропласта перед его делением (рис. 5Д).

Впервые отмечено, что непрерывная опоясывающая ламелла, которая, по данным литературы, не имеет особых признаков строения (Round, Crawford, Mann, 1990; Mann, 1996), встречается не у всех видов диатомовых водорослей.

4. Детали строения пиреноидов у представителей разных филогенетических клад На основе исследования генов 18S рРНК (Mediin, 1997; Mediin, Kaczmarska, 2004) было показано, что отдел диатомовых водорослей BACILLARIOPHYTA распадается на три монофилетические клады, каждая из которых имеет свои особенности в строении пиреноида. Была предпринята попытка связать филогенетическое древо с данными по ультраструктуре клеток разных видов диатомей (Mediin, 1997; Mediin, Kaczmarska, 2004). С учетом полученных в настоящей работе данных уточнены и расширены признаки строения пиреноидов у представителей разных филогенетических клад:

• клады 1 - один пиреноид, окруженный или не окруженный мембраной, пересекается одной или более ламеллами;

• порядок Thalassiosirales из клады 2а - один окруженный мембраной пиреноид, ламелла, пересекающая пиреноид, часто отсутствует;

• остальные порядки из клады 2а - один пиреноид, может пересекаться ламеллами;

• клада 2Ь - морфология пиреноидов очень разнообразна, ни один из входящих в эту кладу порядков не может быть охарактеризован единым набором признаков строения пиреноида.

5. Особенности морфогенеза панциря у Synedra actis subsp. radians

Исследование срезов клеток с помощью ПЭМ позволило выявить основные события клеточного цикла и морфогенеза створки (рис. 4,5). Деление хлоропластов в клетках диатомей может происходить до деления клеток, во время расщепления ядра или после деления клеток. У S. acus subsp. radians деление хлоропластов происходит после экзоцитоза новых створок одновременно с формированием первого пояскового ободка. Морфогенез второго и третьего поясковых ободков происходит на протяжении всей интерфазы, что может являться четким указанием на эту фазу клеточного цикла. На ранних этапах морфогенеза створок у S. acus subsp. radians присутствуют

крупные вакуоли, иногда сливающиеся с полостью между дочерними клетками (рис. 5Б). Обнаруженные вакуоли могут свидетельствовать в пользу недавно высказанной гипотезы об участии макропиноцитоза в захвате клеткой кремниевой кислоты из водной среды (Vrielingeía/., 2007).

6. Достоинства предложенного метода подготовки препаратов диатомей для ПЭМ

Метод получения ультратонких срезов диатомовых водорослей стеклянными ножами после растворения кремнистых створок использовался ранее (Drum, 3963; Громов, Мамкаева, 1981), при этом непосредственно перед приготовлением срезов блоки с материалом рекомендовалось обрабатывать в течение 1-36 часов 10-20 % плавиковой кислотой. Такой метод не получил широкого распространения из-за жесткости воздействия кислоты (pH 1-2) и ограничения выбора заливочных сред, например, эпоксидные смолы в результате обработки плавиковой кислотой становятся полужидкими и непригодными для получения срезов. D данной работе благодаря заключению клеток диатомей в агар и использованию в качестве растворяющего агента 1 М раствора фтористого аммония с pH 5,0 удалось добиться сокращения времени обработки до 3 мин и применить более широкий спектр заливочных сред, при этом элементы ультраструктуры сохранялись в нативном состоянии.

7. Сравнение методов ИЭМ и результатов, получен ных с их помощью

До настоящего исследования локализация белка SIT в клетке была неизвестна. Исследование с помощью ИЭМ показало, что в эксперименте с постэмбеддингом антигенные детерминанты белка SIT экспонированы в ареолах на диатотепуме (рис. 50), а также в большом количестве в цитоплазме (рис. 5Н), что может отображать как процесс синтеза этого белка, так и его участие во внутриклеточном транспорте кремниевой кислоты или ее комплексов. Фиксация материала с помощью параформальдегида сохраняет антигенные детерминанты и повышает качество иммунохимической реакции, но не способствует сохранности клеточных мембран или окруженных мембранами везикул (Oliver, 1999). Применение метода преэмбеддинга с последующей за иммуноокрашиванием постфиксацией в глутаровом альдегиде и оксиде осмия по стандартной процедуре позволило выявить антигенные детерминанты на мембранных структурах и диатотепуме, выстилающем панцирь (рис. 4JI, М).

8. Возможная роль белка SIT в морфогенезе створки

Согласно аминокислотной последовательности белок SIT является мембранным белком (Hildebrand et al., 1997; Щербакова и др., 2005). Однако недавнее исследование показало наличие белка в экстрактах при обработке их как 8 М мочевиной и 2 % SDS, что приводит к разрушению мембран, так и при достаточно мягких условиях при обработке материала 10 тМ трис HCl/1 тМ СаСЬ (Петрова и др., 2007). В данном исследовании было показано наличие исследуемого белка не только на плазмалемме, но и на полисахаридном слое, выстилающем кремнистую створку изнутри, что не противоречит предыдущему исследованию. Наличие везикул между плазмалеммой и диатотепумом (рис. 5П)

позволяет также предположить, что SIT может доставляться на диатотепум с помощью везикулярного транспорта и участвовать в переносе кремниевой кислоты из окружающей среды в пространство между панцирем и плазмалеммой.

9. Жизнь в стеклянном панцире

Способность усваивать кремний из окружающей среды и использовать его для внутриклеточного синтеза кремнистых элементов панцирей возникла в природе одновременно с появлением группы гетероконтов, к которым и относятся диатомовые водоросли (Mediin, Kachmarska, 2004). Однако среди всех гетероконтов только диатомеи используют эту возможность в полной мере -строят панцирь, закрывающий клетку полностью и постоянно, на всех этапах жизненного цикла. Одно из основных преимуществ, которое дает диатомовым водорослям прочный панцирь, - это возможность избежать выедания консументами или ограничить его (Hamm et al., 2003). Кремнистый панцирь у диатомовых водорослей функционален, и различия в его структуре видоспецифичны. Одним из примеров таких структур являются соединительные и разделительные шипы различной формы, синтезируемые клетками в зависимости от условий окружающей среды. Наряду с хлоропластом (которые у всех видов прижаты к периферии и изогнуты по поверхности клетки для обеспечения максимальной экспозиции) большой объем клетки может занимать вакуоль. Другие клеточные органеллы тесно прижаты друг к другу, располагаясь в узком свободном пространстве между клеточной стенкой и ядром, ядром и хоропластом, при этом эффективность взаимодействия между компонентами клетки, обеспечивается многочисленными инвагинациями и выпячиваниями, как, например, ядро у S. acus subsp. radians или митохондрии у С. muelleri. Кремнистый панцирь жесткий, сам по себе он не способен растягиваться -при увеличении объема клетки. Эта проблема решается тем, что он состоит из двух створок, которые перед делением могут раздвигаться, а клетку во время ее роста закрывают кремнистые поясковые ободки, которые синтезируются в строго определенное время.

ВЫВОДЫ:

1. Проведенное исследование строения клеток видов диатомовых водорослей из разных классов и филогенетических групп (центрических с радиальной симметрией Aulacoseira baicalensis и Thalassiosira proschkinae, центрических с биполярной симметрией Attheya ussurensis и Chaetoceros muelleri, пеннатной бесшовной Synedra acus subsp. radians и пеннатной шовной Cymbella ventricosa) выявило вариации в количестве аппаратов Гольджи, в количестве и строении митохондрий. Наибольшие различия показаны в строении хлоропластов - пиреноида и опоясывающей ламеллы.

2. Установлено, что у Aulacoseira baicalensis, доминирующей в весеннем фитопланктоне оз. Байкал, разделительные шипы конической формы появляются в подледный период в начале марта, и процент разделительных створок достигает наиболее высоких значений в начале июня при максимальной плотности популяции в фотическом слое открытой воды.

3. Исследование ультраструктуры клеток на разных стадиях морфогенеза элементов кремнистого панциря у Synedra acus subsp. radians показало, что после экзоцитоза дочерних створок одновременно с началом формирования первого пояскового ободка происходит деление хлоропластов.

4. Разработанный метод растворения кремнистого панциря не нарушает строение клеточных структур, позволяет получать ультратонкие срезы диатомовых водорослей стеклянным ножом и может быть применен для исследований клеток с помощью ПЭМ и ИЭМ.

5. Впервые несколькими методами иммуно-элекгронной микроскопии на примере Synedra acus subsp. radians установлена локализация белка SIT - в цитоплазме клеток, на мембранных структурах и на диаготепуме в районе ареол.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Еедошвили Е.Д.. Лихошвай Е.В., Грачев М.А. Ультраструктура диатомеи Synedra acus subsp. radians по данным трансмиссионной электронной микроскопии после мягкого растворения кремнезема II Изв. АН, Сер. Биол. 2007. №3. С. 367-371.

2. Еедошвили Е.Д.. Бондаренко H.A., Сакирко М.В., Ханаев И.В., Лихошвай Е.В. Изменение длины колоний планктонной диатомовой водоросли Aulacoseira baicalensis на разных стадиях годового цикла в озере Байкал // Гидробиол. журн. 2007. Т. 43, № 3. С. 81-89.

3. Петрова Д.П., Еедошвили Е.Д.. Шелухина И.В., Самуков В.В., Корнева Е.С., Верещагин А.Л., Попкова Т.П., Карпышев H.H., Лебедева Д.В., Клименков И.В., Лихошвай Е.В., Грачев М.А. Обнаружение белка транспорта кремниевой кислоты в клетках пресноводной диатомеи Synedra acus методами иммуноблотгинга и иммуноэлектронной микроскопии // Докл. АН. 2007. Т. 417, № 1.С. 113-116.

4. Likhoshway Ye.V., Sorokovikova E.G., Belykh O.I., Kaluzhnaya Ol.V., Belikov S.I., Bedoshvili Ye.D.. Kaluzhnaya Ok.V., Masyukova Ju.A., Sherbakova T.A. Visualization of the silicon biomineralizationin cyanobacteria, sponges and diatoms II Biosphere Origin and Evolution / Ed. by N. Dobretsov et al. - New York: Springer, 2008. P. 219-230.

5. Еедошвили Е.Л.. Попкова Т.П., Лихошвай E.B. Ультраструктура хлоропластов нескольких видов диатомовых водорослей из разных классов // Цитология. 2009. Т. 51, №4. С. 346-357.

Подписано в печать «23» августа 2010г.

Отпечатано в типографии ООО «Аспринт» 664003 г. Иркутск, ул. Сухэ-Батора, 18, оф. 67, тел. (3952) 742-887 Бумага офсетная, формат 60*90 1/16, усл. печ. л. 1,25 Печать RISO Тираж 130 экз. Заказ № 346

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бедошвили, Екатерина Джамбулатовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Систематика диатомовых водорослей.

1.2. Строение клетки диатомовых водорослей.

1.2.1. Кремнистый панцирь.

1.2.2. Структура панциря и функция отдельных его элементов.

1.2.3. Строение клетки в интерфазе.

1.3. Деление клетки.

1.3.1. Миграция клеточных органелл во время клеточного цикла.

1.3.2. Митоз.

1.4. Морфогенез створки.

1.4.1. Везикула отложения кремнезема.

1.4.2. Морфогенез створки у разных диатомей.

1.4.3. Процессы макроморфогенеза створки.

1.4.4. Микротрубочки и актин в морфогенезе створки

1.4.5. Транспорт кремния при морфогенезе створки

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Объекты исследований.

2.2. Химический анализ.

2.3. Световая микроскопия.

2.4. Сканирующая электронная микроскопия.

2.5. Просвечивающая электронная микроскопия.

2.6. Иммуно-электронная микроскопия.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Ультраструктура клеток нескольких видов диатомовых водорослей разного систематического положения.

3.1.1. Thalassiosira proschkinae.

3.1.2. Aulacoseira baicalensis.

3.1.3. Chaetoceros muelleri.

3.1.4. Attheya ussurensis.

3.1.5. Synedra acus subsp. radians.

3.1.6. Cymbella ventricosa.

3.2. Изменение морфологии колоний планктонной диатомовой водоросли Aidacoseira baicalensis на разных стадиях годового цикла в озере Байкал.

3.3. Морфогенез элементов панциря S. acus subsp. radians на разных стадиях клеточного цикла.

3.4. Метод мягкого растворения кремнистого панциря фтористым аммонием для исследования ультраструктуры клетки.

3.5. Локализация антигенных детерминант белка SIT в клетках S. acus subsp. radians методом иммуно-электронной микроскопии.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Формирование разделительных шипов - реакция вида A. baicalensis на изменение условий окружающей среды.

4.2. Особенности ультраструктуры клеток диатомовых водорослей в зависимости от их формы и размера

4.3. Детали строения хлоропластов у исследованных видов

4.4. Детали строения пиреноидов у представителей разных филогенетических клад.

4.5. Особенности морфогенеза панциря у Synedra acus subsp. radians.

4.6. Достоинства предложенного метода подготовки препаратов диатомей для ПЭМ.

4.7. Сравнение методов ИЭМ и результатов, полученных с их помощью.

4.8. Возможная роль белка SIT в морфогенезе створки

4.9. Жизнь в стеклянном панцире.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительное исследование ультраструктуры диатомовых водорослей из разных классов методами световой и электронной микроскопии"

Диатомовые водоросли - автотрофные эукариотические одноклеточные организмы, населяющие все влажные или покрытые водой поверхности и открытые воды (Round, Crawford, Mann, 1990, p. 4). Они играют важную роль в биосфере Земли - на долю диатомей, обитающих в мировом океане, приходится 20% глобальной первичной продукции органического вещества (Ragueneau et al., 2000).

Диатомеи, количество известных видов которых достигает нескольких десятков тысяч, а с учетом криптических форм может быть увеличено до 105-106 (Mann, 1994; Round, 1996; Mann, 1999), объединены в отдел (филум) BACILLARIOPHYTA. Классическая систематика диатомей основана на морфологии их кремнистого панциря, и главным методом исследования долгое время являлись СМ и СЭМ. Недавно на основе анализа нуклеотидных последовательностей ядерных генов 18S рРНК и генов хлоропластов была предложена новая классификация (Mediin, 1997; Mediin, Kaczmarska, 2004; Mediin, 2009). Для поддержки молекулярной филогении были использованы данные о строении клетки — особенности ультраструктуры хлоропластов, количество и расположение аппаратов Гольджи и некоторые другие признаки (Mediin, Kaczmarska, 2004).

Актуальность темы

Диатомовые водоросли благодаря способности формировать кремнистый панцирь с тонкими структурами нанометрового размера привлекают внимание специалистов различных профилей, которое активизировалось с развитием нанотехнологий. Исследования процесса отложения кремнезема у диатомовых водорослей ведутся с 60-х годов прошлого века. Были описаны специфические органеллы отложения кремнезема (SDV; Reimann, 1964; Drum, Pankratz, 1964) и везикулы транспорта кремния (STV; Schmid, Schultz, 1979). Недавно было открыто семейство белков SIT у морских диатомей (Hildebrand et al., 1997; Hildebrand, Dahlin, Volcani, 1998), а затем и у пресноводных (Грачев и др., 2002; Щербакова и др., 2005), способных транспортировать кремний в виде кремниевой кислоты из водного окружения внутрь клетки. Однако локализация белка SIT пока не определена, механизмы формирования видоспецифических кремнистых структур неизвестны, вопросы внутриклеточного транспорта кремния остаются дискуссионными (Medlin, 2002; Schmid, 2003; Medlin, 2004; Schmid, 2005; Thamatrakoln, Hildebrand, 2007; Vrieling et al., 2007; Grachev, Annenkov, Likhoshway, 2008; Thamatrakoln, Hildebrand, 2008; Thamatrakoln, Kustka, 2009).

Имеющиеся данные о строении клеток диатомовых водорослей разрозненны и не охватывают все крупные систематические таксоны (порядки, семейства) BACELLARIOPHYTA, поэтому новые данные об ультраструктуре диатомовых водорослей, представляющих различные классы, актуальны как для выяснения механизмов, определяющих морфогенез кремнистых структур, так и для систематики диатомей.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы было выявление особенностей строения клеток и морфогенеза кремнистых панцирей нескольких видов диатомовых водорослей, принадлежащих к основным таксономическим группам.

Были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать ультраструктуру клеток диатомовых водорослей, принадлежащих к известным классам (центрических с радиальной симметрией, центрических с биполярной симметрией, пеннатных бесшовных и пеннатных шовных) и к разным филогенетическим кладам (1, 2аи2Ъ).

2. Исследовать морфогенез кремнистых панцирей в природной популяции в течение годового цикла и в лабораторной культуре на разных стадиях клеточного цикла для некоторых видов.

3. Разработать метод мягкого растворения кремнистых панцирей, не повреждающий ультраструктуру клеток.

4. Локализовать белок транспортер кремния (SIT) в клетках одного из видов диатомей различными методами ИЭМ.

Научная новизна. Описаны особенности строения клеточных органелл диатомовых водорослей Thalassiosira proschkinae Makarova, Anlacoseira baicalensis (К. Meyer) Simonsen, Attheya ussurensis Stonik, Orlova et Crawford, Chaetoceros muelleri Lemraermann, Synedra acus subsp. radians (Kiitzing) Skabitsclievsky, Cymbella ventricosa Agardli. Впервые показано, что формирование разделительных створок, потенциально обеспечивающих расселение вида, начинается в подледной стадии развития Aulacoseira baicalensis и наиболее активно происходит при максимальной плотности клеток в популяции. Впервые произведена внутриклеточная визуализация белка SIT.

Практическая и теоретическая значимость работы. Данные об изменении морфологии колоний доминирующего в озере Байкал вида Aidacoseira baicalensis могут иметь практическое применение в мониторинге за его экосистемой и при построении палеоклиматических реконструкций. Данные об ультраструктуре клеток диатомовых водорослей важны для понимания эволюционных процессов, лежащих в основе формирования крупных таксонов этой группы водорослей. Визуализация белка SIT важна для исследований, направленных на выявление его роли в механизмах, определяющих особенности морфогенеза кремнистых структур. Метод мягкого растворения кремнистого панциря позволяет получать данные о строении клеток диатомей без применения алмазного ножа и исследовать внутриклеточную локализацию белков методами преэмбеддинга. Получены новые фундаментальные данные о строении клеток диатомовых водорослей, которые могут быть использованы в курсах лекций по цитологии.

Основные защищаемые положения:

1. Признаки ультраструктуры хлоропластов широко варьируют у диатомовых водорослей, принадлежащих ко всем филогенетическим группам.

2. Формирование разделительных створок у диатомовой водоросли Aulacoseira baicalensis наиболее активно происходит при переходе популяции в планктонную фазу годового цикла.

3. В клеточном цикле Synedra acus subsp. radians образование первого I пояскового ободка и деление хлоропластов происходят после экзоцитоза сформировавшейся створки.

4. Метод мягкого растворения кремнистого панциря пригоден для исследования ультраструктуры клеток диатомовых водорослей.

5. Антигенные детерминанты белка SIT локализованы в районе ареол и в цитоплазме.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены на конференциях: "The living diatom cell" (Irkutsk, September 17-22, 2004); The 19th International Diatom Symposium (Lystvyanka, August 28 - September 2, 2006); IX-ой Международной конференции молодых ботаников (Санкт-Петербург, 21-26 мая, 2006); IV-ом съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 11-15 мая, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них 4 статьи в рецензируемых журналах и 1 глава в монографии на английском языке. В диссертационную работу вошли исследования, поддержанные Программой Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» (гранты № 10.3, 10.4, 22.3, 6.3), грантом Президента РФ НШ-4738.2006.4, интеграционным проектом СО-ДВО РАН № 58 и выполненные в рамках темы фундаментальных исследований № 6.1.1.10 «Контроль морфогенеза кремнистых структур на геномном и клеточном уровне», номер гос. регистрации 01.2.00703351 (Приоритетное направление 6.1. «Биология развития и эволюция живых систем». .Программа 6.1.1. «Биология развития и эволюция живых систем»).

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 122 страницах, состоит из введения, 4 глав, списка литературы (169 источников, из них 151 на иностранных языках) и приложения; содержит 2 текстовые таблицы, 36 рисунков, включающих 125 микрофотографий.

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Бедошвили, Екатерина Джамбулатовна

выводы

1. Проведенное исследование строения клеток видов диатомовых водорослей из разных классов и филогенетических групп (центрических с радиальной симметрией Aulacoseirci baicalensis и Thalassiosira proschkinae, центрических с биполярной симметрией Attheya ussurensis и Chaetoceros muelleri, пеннатной бесшовной Synedra acus subsp. radians и пеннатной шовной Cymbella ventricosa) выявило вариации в количестве аппаратов Гольджи, в количестве и строении митохондрий. Наибольшие различия показаны в строении хлоропластов - пиреноида и опоясывающей ламеллы.

2. Установлено, что у Aulacoseira baicalensis, доминирующей в весеннем фитопланктоне оз. Байкал, разделительные шипы конической формы появляются в подледный период в начале марта, и процент разделительных створок достигает наиболее высоких значений в начале июня при максимальной плотности популяции в фотическом слое открытой воды.

3. Исследование ультраструктуры клеток на разных стадиях морфогенеза элементов кремнистого панциря у Synedra acus subsp. radians показало, что после экзоцитоза дочерних створок одновременно с началом формирования первого пояскового ободка происходит деление хлоропластов.

4. Разработанный метод растворения кремнистого панциря не нарушает строение клеточных структур, позволяет получать ультратонкие срезы диатомовых водорослей стеклянным ножом и может быть применен для исследований клеток с помощью ПЭМ и ИЭМ.

5. Впервые несколькими методами иммуно-электронной микроскопии на примере Synedra. acus subsp. radians установлена локализация белка SIT -в цитоплазме клеток, на мембранных структурах и на диатотепуме в районе ареол.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бедошвили, Екатерина Джамбулатовна, Иркутск

1. Бедошвили Е.Д., Лихошвай Е.В., Грачев М.А. Ультраструктура диатомеи

2. Synedra acus subsp. radians по данным трансмиссионной электронной микроскопии после мягкого растворения кремнезема // Изв. АН, Сер. Биол. 2007. - № 3. - С. 3 67-3 71.

3. Бедошвили Е.Д., Попкова Т.П., Лихошвай Е.В. Ультраструктурахлоропластов нескольких видов диатомовых водорослей из разных классов // Цитология. 2009. - Т. 51, № 4. - С. 346-357.

4. Бедошвили Е.Д., Бондаренко H.A., Сакирко М.В., Ханаев И.В., Лихошвай

5. Е.В. Изменение длины колоний планктонной диатомовой водоросли Aulacoseira baicalensis на разных стадиях годового цикла в озере Байкал // Гидробиол. журн. 2007. - Т. 43, № 3. - С. 81-89.

6. Вассер С.П., Кондратьева Н.В., Масюк Н.П. Водоросли: Справочник.

7. Киев: Наукова думка, 1989. — 608 с.

8. Вотинцев К.К., Мещерякова А.И., Поповская Г.И. Круговороторганического вещества в озере Байкал. — Новосибирск: Наука, 1975. -188 с.

9. Грачев М.А. О современном состоянии экологической системы озера

10. Байкал. Новосибирск: Издательство СО РАН, 2002. - 156 с.

11. Грачев М.А., Деникина H.H., Беликов С.И., Лихошвай Е.В., Усольцева

12. М.В., Тихонова И.В., Аделынин Р.В., Клер С.А., Щербакова Т.А. Элементы активного центра белков транспорта кремниевой кислоты в диатомовых водорослях // Молекуляр. биол. 2002. - Т. 36, № 4. -С. 379-681.

13. Лихошвай Е.В., Масюкова Ю.А., Щербакова Т.А., Петрова Д.П., Грачев М.А. Обнаружение гена транспорта кремниевой кислоты у хризофитовых водорослей // Докл. АН. 2006. - Т. 408, № 6. - С. 845849.

14. Поповская Г.И., Генкал С.И., Лихошвай Е.В. Диатомовые водорослипланктона озера Байкал: Атлас-определитель. — Новосибирск: Наука, 2002.- 168 с.

15. Руководящий документ 52.24.382-95. Методические указания по определению ортофосфатов в природных и очищенных сточных водах. — Ростов-на-Дону, 1995. — 10 с.

16. Руководящий документ 52.24.433-95. Методические указания по определению кремния в природных и очищенных сточных водах. — Ростов-на-Дону, 1995. — 8 с.

17. Седова Т. В. Основы цитологии водорослей. Ленинград: Наука, 1977. —172 с.

18. Седова Т.В. Кариология водорослей. Санкт-Петербург: Наука, 1996. —386 с.

19. Скабичевский А.П. К биологии Melosira baicalensis II Русский гидробиол.журн. 1929. - Т. 8. - С. 93-114.

20. Скабичевский А.П. Планктонные диатомовые водоросли пресных вод.

21. М.: Изд-во Московского университета, 1960. — 345 с.

22. Щербакова Т.А., Масюкова Ю.А., Сафонова Т.А., Петрова Д.П.,

23. Верещагин А.Л., Минаева Т.В., Аделыпин Р.В., Трибой Т.И., Стоник

24. И.В., Айздайчер Н.А., Козлов М.В., Лихошвай Е.В., Грачев М.А. Консервативный мотив CMLD в белках транспорта кремниевой кислоты у диатомовых водорослей // Молекуляр. биол. — 2005. — Т. 39, №2.-С. 303-316.

25. Anderson L.W., Medlin L.K., Crawford R.M. An investigation of cellcomponents of Actinocyclus subtilis (Bacillariophyceae) // J. Phycol. — 1986. -Vol. 22.-P. 466-484.

26. Annenkov V.V., Patwardhan S.V., Belton D., Danilovtseva E.N., Perry C.C. A new stepwise synthesis of a family of propylamines derived from diatom silaffins and their activity in silicification // Chem. Commun. 2006. — Vol. 14.-P. 1521-1523.

27. Brezina V., Ettle H. Eine komplexe cytologische Darstellungsmethode fur Untersuchungen des Lebenszyclus von Kieselalgen (Diatoma hiemale var. mesodon) // Mikroskopie. 1975. - Vol. 31. - P. 291-293.

28. Chiappino M.L., Volcani B.E. Studies on the biochemistry and fine structureof silica shell formation in diatoms VII. Sequential cell wall development in the pennate Naviculapelliculosa II Protoplasma. 1977. - Vol. 93. - P. 205221.

29. Coleman A.W. Diversity of plastid DNA configuration among classes ofeukaryote algae // J. Phycol. 1985. - Vol. 21. - P. 1-16.

30. Cox E.J. The use of chloroplasts and other features of the living cell in the• • thtaxonomy of naviculoid diatoms // Proceedings of the 6 Symposium on

31. Recent and Fossil Diatoms / Ed. by R. Ross. — Koenigstein: Koeltz, 1981. — P.115-133.

32. Cox E.J. Variation within the genus Pinnularia Ehrenb.: further evidence forthe use of live material in diatom sistematics? / Proceedings of the 9th Internatiaonal Diatom Symposium / Ed. by F.E. Round. Koenigstein: Koeltz, 1988.-P. 437-444.

33. Cox E.J., Kennaway G.M. Studies of valve morphogenesis in pennate diatoms:investigating aspects of cell biology in a systematic context // Proceedings of the 17th International Diatom Symposium / Ed. by M. Poulin. Ottawa: Biopress, 2004. - P. 35-48.

34. Crawford R.M. The protoplasmic ultrastructure of the vegetative cell of

35. Melosira varians C.A. Agardh. // J. Phycol. 1973. - Vol. 9. - P. 50-61.

36. Crawford R.M. The auxospore wall of the marine diatom Melosiranummuloides (Dillw.) C. Ag. and related species // Br. Phycol. J. — 1974. — Vol. 9.-P. 9-20.

37. Culture collection of algae and protozoa: Catalogue of strains / Ed. by A.S.

38. Thompson, J.C. Rhodes, I. Pettman. Kendal: Titus Wilson and Son, 1988. -164 p.

39. Davey M.C., Crawford R.M. Filament formation in the diatom Melosiragranulata II J. Phycol. 1986. - Vol. 22. - P. 144-150.

40. Dawson P. Observation of some forms of Gomphonema parvulum Kutz. III.

41. Frustule formation // J. Phycol. 1973. - Vol. 9. - P. 353-365.

42. Drum R.W. The cytoplasmic fine structure of the diatom Nitzschia palea II J.

43. Cell Biol. 1963. - Vol. 18. - P. 429-440.

44. Drum R.W. Light and electron microscope observations of the tube dwellingdiatom Amphipleura rutians (Trentepohl) Cleve // J. Phycol. 1969. — Vol. 5.-P. 21-26.

45. Drum R.W., Pankratz S. Pyrenoids, raphes, and other fine structure in diatoms

46. Am. J. Bot. 1964. - Vol. 51. - P. 401-418.

47. Drum R.W., Pankratz S., Stoermer E.F. Electronmicroscopy of diatom cells //

48. Diatomeenschalen im electronenmikroschen Bild. Lehre: J. Cramer Verlag, 1966.-Plates 514-613.

49. Edgar L.A. Fine structure of Caloneis 1 amphisbaena

50. BACILLARIOPHYCEAE) // J. Phycol. 1980. - Vol. 16. - P. 62-72.

51. Edgar L.A. Mucilage secretions of moving diatoms // Protoplasma. 1983.1. Vol. 118.-P. 44-48.

52. Edgar L.A., Pickett-Heaps J.D. Ultrastructural localisation of polysaccharidesin the motile diatom Navicula cuspidata II Protoplasma. 1982. - Vol. 113. -P. 10-22.

53. Fisher H., Robl I., Sumper M., Kröger N. Targeting and covalent modificationof cell wall and membrane proteins heterologously expressed in the diatom Cylindrotheca fnsiformis (BACILLARIOPHYCEAE) // J. Phycol. 1999. -Vol. 35.-P. 113-120.

54. Ford C.W., Percival E. Carbohydrates of Phaeodactylum tricornutum. Part II.

55. A sulphated glucuronomannan // J. Chem. Soc. 1965. - Vol. 1298. - P. 7035-7041.

56. Geitler L. Der Formwechsel der pennaten Diatomeen // Archive fur

57. Protistenkunde. 1932. - Vol. 76. - P. 1-226.

58. Geitler L. Der Chromatophorenbau der Diatomeen Gyrosigma attenuatum und

59. Nitzschia sigmoidea // Beihefte zum Botanische Centrakblatt. 1937. - Vol. 57.- P. 425-431.

60. Geitler L. Morphologische, entwicklungsgcshichtliehe und systematische

61. Notizen über einige Süsswasseralgen // Österreichische Botanische Zeitschrift.-1959.-Vol. 106.-P. 159-171.«

62. Geitler L. Die Zweiteiligkeit der Chromatophoren bei den Diatomeen und

63. Chrisophyceon // Österreichische Botanische Zeitschrift. 1967. - Vol. 114. -P. 183-188.

64. Geitler L. Die plasticshe Verformung reich gegliederter Chromatophorenwührend der Zellteilung und die Zellorganisation von Cocconeis II Österreichische Botanische Zeitschrift. 1972. - Vol. 120. - P. 207-212.

65. Geitler L. Die Lage des Chromatophors in Beziehung zur Systematik von

66. Cym bella-Arten (Bacillariophyceae) // PL Syst. Evol. 1981. - Vol. 138. - P. 153-156.

67. Gibbs S.P. The route of entry of cytoplasmically synthesized proteins intochloroplasts of algae possessing chloroplast ER // J. Cell Sci. 1979. - Vol. 35.-P. 253-266.

68. Gibbs S.P. The chloroplast endoplasmic reticulum: structure, function andevolutionary significance // Int. Rev. Cytol. 1981. - Vol. 72. - P. 49-99.

69. Giri B.S. Mitosis in diatoms // Cytology, genetics and molecular biology ofalgae / Ed. by B.R. Chaundary, S.B. Agrawanal. Amsterdam: Academic Publishing. - 1996. - P. 167-172.

70. Gordon R., Drum R.W. The chemical basis for diatom morphogenesis // Int.

71. Rev. Cytol. 1994. - Vol. 150. - P. 243-372, 421-422.

72. Grachev M.A., Annenkov V.V., Likhoshway Ye.V. Silicon nanotechnologiesof pigmented heterokonts // BioEssays. 2008. - Vol. 30. - P. 328-337.

73. Granum E., Myklestad S.M. Mobilization of (3-1,3-glucan and biosynthesis ofamino acids induced by NH4+ addition to N-limited cells of the marine diatom Skeletonema costatum (BACILLARIOPHYCEAE) // J. Phycol. 2001.-Vol. 37.-P. 772-782.

74. Granum E., Myklestad, S.M. A simple combined method for determination of3.1,3-glucan and cell wall polysaccharides in diatoms // Hydrobiologia. —2002.-Vol. 477.-P. 155-161.

75. Griffits D.J. The pyrenoid and it's role in algal metabolism // Science

76. Progress, Oxford. 1980. - Vol. 66. - P. 537-553.

77. Hamm C.E., Merkel R., Springer O., Jurkoitc P., Maier C., Prechtel K.,

78. Smetacek V. Architecture and material properties of diatom shells provide effective mechanical protection // Nature. 2003. - Vol. 24. - P. 841-843.

79. Hasle G.R. The "mucilage pore" of pennate diatoms // Nov. Hedw. Beih.1974.-Vol. 45.-P. 167-193.

80. Hempel F., Felsner G., Maier U.G. New mechanistic insights into proteintransport across the second outermost plastid membrane of diatoms // Mol. Microbiol. 2010. - Vol. 76. - P. 793-801.

81. Hempel F.„ Bullmann L., Lau J., Zauner S., Maier U.G. ERAD-derived preprotein transport across the second outermost plastid membrane of diatoms//Mol. Biol. Evol. -2009. Vol. 26.-P. 1781-1790.

82. Herth W. The site of /?-chitin fibril formation in centric diatoms. II. The chitinforming cytoplasmic structures // J. Ultrastruct. Res. 1979. - Vol. 68. - P. 16-27.

83. Herth W., Barthlott W. The site of J3-chitin fibril formation in centric diatoms.

84. Pores and fibril formation // J. Ultrastruct. Res. 1979. - Vol. 68. - P. 615.

85. Higgins M.J., Molino P., Mulvaney P., Wetherbee R. The structure and nanomechanical properties of the adhesive mucilage that mediates diatom-substratum adhesion and motility // J. Phycol. 2003. - Vol. 39. - P. 11811193.

86. Hildebrand M., Dahlin K., Volcani B.E. Characterization of a silicontransporter gene family in Cylindrotheca fusiformis: sequences, expression analysis, and identification of homologs in other diatoms 11 Mol. Gen. Genet. -1998.-Vol. 260.-P. 480-486. "

87. Hildebrand M., Volcani B.E., Gassmann W., Schroeder J.I. A gene family ofsilicon transporters // Nature. 1997. - Vol. 385. - P. 688-689.

88. Hoagland K.D., Rowoski J.R., Gretz M.R., Roener S.C. Diatom extracellularpolymeric substances: function, fine structure, chemistry, and physiology // J. Phycol. 1993. - Vol. 29. - P. 537-566.

89. Holdsworth R.H. The presence of a crystalline matrix in pyrenoids of thediatom Achnanthes brevipes II J. Cell Biol. 1968. - Vol. 37. - P. 831-837.

90. Holmes R.W. Lauderia annulata a marine centric diatom with an elongatebilobed nucleus //J. Phycol. 1977. - Vol. 13. - P. 180-183.

91. Hoops H.J., Floyd G.L. infrastructure of the centric diatom Cyclotellamenenginiana: vegetative cell and auxospore development // Phycologia. -1979. Vol. 18. - P. 424-435.

92. Jeffrey S.W., Vesk M. Effect of blue-green light on photosynthetic pigmentsand chloroplast structure in the marine diatom Stephanopyxis turns II J. Phycol. 1977. - Vol. 13 - P. 271-279.

93. Jenks A., Gibbs S.P. Immunolocalisation and distribution of form II

94. RUBISCO in the pyrenoid and chloroplast stroma of Amphidinium carteraecmd form I RUBISCO in the symbiont-derived plastids of Peridinium foliaceum (DINOPYCEAE) // J. Phycol. 2000. - Vol. 36. - P. 127-138.

95. Jewson D.H., Khondker M., Rahman M.H., Lowry S. Auxosporulation of thefreshwater diatom Aulacoseira herzogu in Lake Banani, Bangladesh // Diatom Res. 1993. - Vol. 8. - P. 403-418.

96. Kaluzhnaya 01. V. Valve morphogenesis in the centric diatom Cyclotellabaicalensis II Proceedings of the 19th International Diatom Symposium / Ed. by Ye. Likhoshway. Bristol: Biopress Limited, 2008. - P. 31-38.

97. Kaluzhnaya 01.V., Likhoshway Y.V. Valve morphogenesis in an araphiddiatom Synedra acus subsp. radians II Diatom-Res. 2007. - Vol. 22, №1,-P. 81-87.

98. Kilham P. Ecology of Melosira species in the Great Lakes of Africa // Large1.kes. USA: Springer-Verlag, 1990. - 691 p.

99. Kilham P., Kilham S.S., Hecky R.E. Hypothesized resource relationshipsamong African planktonic diatoms // Limnol. Oceanogr. 1986. - Vol. 31. — P. 1169-1181.

100. Kociolek J.P., Stoermer E.F. Chromosome number in diatoms: a review //

101. Diatom Res. 1989. - Vol. 4. - P. 47-54.

102. Kociolek J.P., Sicko-Goad L., Stoermer E.F. Cytoplasmic fine structure of two

103. Encyonema species // Proceedings of the 11th International Diatom

104. Symposium / Ed. by J.P. Kociolek. San-Francisco: California Academy of Sciences, 1990. - P. 235-245.

105. Kröger N., Sumper M. Diatom cell wall proteins and tlie cell biology of silicabiomineralization // Protist. 1998. - Vol. 149. - P. 213-219.

106. Kröger N., Wetherbee R. Pleuralins are involved in theca differentiation in thediatom Cylindrotheca fusiformis II Protist. 2000. - Vol. 151. - P. 263-273.

107. Kröger N., Bergsdorf C., Sumper M. Frustulins: domain conservation in aprotein family associated with diatom cell wall // Eur. J. Biochem. 1996. -Vol. 239.-P. 259-264.

108. Kröger N., Deutzmann R., Sumper M. Polycationic peptides from diatombiosilica that direct silica nanosphere formation // Science. 1999. - Vol. 286.-P. 1129-1132.

109. Kröger N., Deutzmann R., Bergsdorf C., Sumper M. Species-specificpolyamines from diatoms control silica morphology // Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A.- 2000. Vol. 97. - P. 4133-14138.

110. Kröger N., Lehmann G., Rachel R., Sumper M. Characterization of a 200-kDaprotein that is specifically associated with a silica-based substructure of the cell wall // Eur. J. Biochem. 1997. - Vol. 250. - P. 99-105.

111. Kröger N., Lorenz S., Brunner E., Sumper M. Self-assembly of highlyphospliorylated silaffins and their function in biosilica morphogenesis // Science. 2002. - Vol. 298. - P. 584-586.

112. Kutschern U., Niklas K. J. Endosymbiosis, cell evolution, and speciation //

113. Theory Biosci. 2005. - Vol. 124. - P. 1-24.

114. Lauterborn R. Untersuchugen über Bau, Kernteilung und Bewegung der

115. Diatomeen. Leipzig: Verlag Engelmann, 1896. - 165 p.

116. Leadbeater B.S.C. 1986. Scale case construction in Synura petersenii Korsch.

117. Chrysophyceae) // Chrysophytes: Aspects and Problems / Ed. by J. Kristiansen, R.A. Andersen. Cambrige: University Press, 1986. - P. 121131.

118. Li C.W., Volcani B.E. Studies on the biochemistry and fine structure of silicashell formation in diatoms. VIII. Morphogenesis of the wall in the centric diatom, Ditylum brightweilli!! Protoplasma. 1985. - Vol. 124. - P. 10-29.

119. Likhoshway Ye.V., Sorokovikova E.G., Belykh O.I., Kaluzhnaya 01.V.,

120. Lund J.W.G. An artificial alteration of the seasonal cycle of the planktondiatom Melosira ilalica (Ehr.) Kiitz. ssp. subarctica II J. Ecol. 1971. - Vol. 59.-P. 521-533.

121. McFadden G.I. Primary and secondary endosymbiosis and the origin ofplastids // J. Phycol. 2001. - Vol. 37. - P. 951-959.

122. McKay R.M.L., Gibbs S.P. Composition and function of pyrenoids:cytocheinical and immunocytochemical approaches // Can. J. Bot. 1991. -Vol. 69.-P. 1040-1052.

123. McKay R.M.L., Gibbs S.P., Vaughn K.C. RuBisCo activase is present in thepyrenoid of green algae // Protoplasma. 1991. - Vol. 162. - P. 38-45.

124. Mague T.H., Friberg E., Hugues D.J., Morris I. Extracellular release of carbonby phytoplankton: a physiological approach // Limnol. Oceanogr. 1980. -Vol. 25.-P. 262-279.

125. Mann D.G. The origins of shape and form in diatoms: the interplay betweenmorphogenetic studies and systematics // Shape and form in plants and fungi / Ed. by D.S. Ingram, A.J. Hudson. London: Academic Press, 1994. - P. 17-38.

126. Mann D.G. Chloroplast morphology, movements and inheritance in diatoms //

127. Cytology, genetics and molecular biology of algae / Ed. by B.R. Chaundhary, S.B. Agrawal. Amsterdam: SPB Academic Publishing, 1996. - P. 249-274.

128. Mann D.G. The species concept in diatoms // Phycologia. 1999. - Vol. 38.1. P. 437-495.

129. Manton I., Stosch H. A. Observations on the fine structure of the male gameteof the marine centric diatoms Lithodesmium undulatum // J.R. Microsc. Soc. -1966.-Vol. 85.-P. 119-134.

130. Martin-Jezequel V., Hildebrand M., Brzezinski M.A. Silicon metabolism indiatoms: implication for growth // J. Phycol. 2000. - Vol. 36. - P. 821-840.

131. Medlin L.K. Evolution of the diatoms — a total approach using morphology, molecules and geology. Report of the Workshop June 1-2, 1997 // Diatom Res. 1997.-P. 371-379.

132. Medlin L.K. Why silica or better yet why not silica? // Diatom Res. 2002. -Vol. 18.-P. 453-459.

133. Medlin L.K. Comment in reply to Schmid (2003) "The evolution of the silicified diatom cell wall revisited" // Diatom Res. - 2004. - Vol. 19. - P. 345-351.

134. Medlin L.K. Diatoms (BACILLARIOPHYTA) // The Timetree of life / Ed. by S.B. Hedges, S. Kumar. Oxford: Oxford University Press, 2009. - P. 127-130.

135. Medlin L.K., Kaczmarska I. Evolution of the diatoms: V. Morphological and cytological support of the major clades and taxonomic revision // Phicologia. 2004. - Vol. 43. - P. 245-273.

136. Mereschkowsky C. Über Natur und Ursprung der Chromatophoren im Pflanzenreiche //Biol. Centralbl. 1905. - Vol. 25. -P. 593-604.

137. Myklestad S. Production of carbohydrates by marine planktonic diatoms. I. Comparison of nine different species in culture // J. Exp. Mai*. Biol. Ecol. -1974.-Vol. 15.-P. 261-274.

138. Myklestad S., Haug A., Larsen B. Production of carbohydrates by the marine diatom Chaetoceros affinis var. willei (Gran) Hustedt. II. Preliminary investigation of the extracellular polysaccharide // J. Exp. Mar. Biol. Ecol. -1972.-Vol. 9.-P. 137-144.

139. Olcada M. Recent studies on the composition and the activity of algal pyrenoid // Progress in Phycological research / Ed. by F.E. Round, D.J. Chapman-Bristol: Biopress, 1992.-P. 117-138.

140. Oliver C. Immunocytochemical Methods and Protocols. Totowa: Humana Press, 1999.-P. 341-345.

141. Osada K. Cell division and valve formation in Euntomoeneis species I I Abstracts of 16th International Diatom Simposium, Athens. 2000. - P. 105.

142. Pickett-Heaps J.D. Post mitotic cellular reorganisation^ the diatom Cymatopleura solea: the role of microtubules and the microtubule centre // Cell Motil. Cytoskeleton. 1991. - Vol. 18. - P. 279-292.

143. Pickett-Heaps J.D. Cell division and morphogenesis of the centric diatom Chaetoceros decipiens (Bacillariophiceae) II. Electron microscopy and a new paradigm for tip growth // J. Phycol. 1998. - Vol. 34. - P. 995-1004.

144. Pickett-Heaps J.D., Kowalski S.E. Valve morphogenesis and the microtubule center of the diatom Hantzschia amphioxis II Eur. J. Cell Biol. 1981. - Vol. 25.-P. 150-170.

145. Pickett-Heaps J.D., Carpenter J., Koutoulis A. Valve and seta (spine) morphogenesis in the diatom Chaetoceros peruvianus Brightwell // Protoplasma. 1994. - Vol. 181. - P. 269-282.

146. Pickett-Heaps J.D., Hill D., Wetherbee R. Cellular movement in the centric diatom Odontella II J. Phycol. 1986. - Vol. 22. - P. 334-339.

147. Pickett-Heaps J.D., Schmid A.-M.M., Edgar L.A. The cell biology of diatom valve formation // Progress in Phycological Research / Ed. by F.E. Round, D.J. Chapman. Bristol: Biopress, 1990. - P. 1-168.

148. Pickett-Heaps J.D., Colin S., Schmid A.-M.M., Tippit D.H. Valve morphogenesis in Surirella (Bacillariophiceae) // J. Phycol. 1988 - Vol. 24.-P. 35-49.

149. Pickett-Heaps J.D., Wetherbee R., Hill D. Cell division and morphogenesis of the labiate process in the centric diatom Ditylum brightwellii II Protoplasma. 1988. - Vol. 143. - P. 139-149.

150. Poulsen N., Kroger N. Silica morphogenesis by alternative processing of silaffins in the diatom Thalassiosira pseudonanci II J. Biol. Chem. 2004. -Vol. 279. - P. 42993-42999.

151. Poulsen N., Sumper M., Kroger N. Biosilica formation in diatoms: Characterization of native silaffin-2 and its role in silica morphogenesis // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2003. - Vol. 100. - P. 12075-12080.

152. Raska I. Electron microscopic immunocytochemistry with colloidal gold. -Pr. Czehosl. Acad. Sci., Inst. Exp. Med., 1988. 110 p.

153. Reimann B.E.F. Deposition of silica inside a diatom cell // Exp. Cell Res. -1964. Vol. 34. - P. 605-608.

154. Reynolds E.S. The use of lead citrate at high pH as an electronopaque stain in electron microscopy // J. Cell Biol. 1963. - Vol. 17. - P. 208-212.

155. Romankevich E.A. Geochemistry of organic matter in the ocean. Berlin: Springer, 1984.-334 p.

156. Rosen B.H., Lowe R.L. Physiological and ultrastructural responces of Cyclotella menenghiniana (Bacillariophyta) to light intensity and nutrient limitation I I J. Phycol. 1984. - Vol. 20. - P. 173-183.

157. Ross R., Sims P.A. The fine structure of the frustule in centric diatoms: atsuggested terminology // Br. Phycol. J. 1972. - Vol. 7. - P. 139-163.

158. Round F.E. What characters define diatom genera, species and infraspecific taxa?//Diatom Res. 1996.-Vol. 11.-P. 203-218.

159. Round F.E., Crawford R.M., Mann D.G. The diatoms. Bristol: Cambridge University Press, 1990. - 747 p.

160. Schmid A.-M.M. Influense of environmental factors on the development of the valve in diatoms // Protoplasma. 1979. - Vol. 99. - P. 99-115.

161. Schmid A.-M.M. Wall morphogenesis in Thalassiosira eccentrica as a result of valve-modelling // Proceedings of the 7th International Diatom Symposium / Ed. by D.G. Mann. Koenigstein: Koeltz, 1984. - P. 47-70.

162. Schmid A.-M.M. The spesial Golgi-ER-mitohondrium unit in the diatom genus Coscinodiscus II PI. Syst. Evol. 1987. - Vol. 158. - P. 211-223.

163. Schmid A.-M.M. Geitler's Plattenband in Synedra ulna in the light of TEM investigations // PI. Syst. Evol. 1989. - Vol. 164. - P. 239-252.

164. Schmid A.-M.M. Aspects of morphogenesis and function of diatom cell walls with implication for taxonomy // Protoplasma. 1994. - Vol. 181. - P. 4360.

165. Schmid A.-M.M. Value of pyrenoids in the systematics of the diatoms: their• thmorphology and ultra structure II Proceedings of the 16 International Diatom Symposium I Ed. by A. Economou-Amilli. Athens: Amvrosiou Press, 2001.-P. 1-32.

166. Schmid A.-M.M. The evolution of the silicified diatom cell wall revisited // Diatom Res.-2003.-Vol. 18.-P. 191-195.

167. Schmid A.-M.M. The wall and membrane systems in diatoms: comment in reply to Medlin (2004) // Diatom Res. 2005. - Vol. 19. - P. 211-216.

168. Schmid A.M.-M., Crawford R.M. Ellerbeckia arenaria (Bacillariophyceae): formation of auxospores and initial cells // Eur. J. Phycol. 2001. - Vol. 36. - P. 307-320.

169. Schmid A.M.-M., Schultz D. Wall morphogenesis in diatoms: deposition of silica by cytoplasmic vesicles // Protoplasma. 1979. - Vol. 100. - P. 267288.

170. Schmid A.-M.M., Borowitzka M.A., Volcani B.E. Morphogenesis and biochemistry of diatom cell walls // Cytomorphogenesis in Plants. Cell Biology monographs / Ed. by O. Kiermayer. Vienna, New York: SpringerVerlag, 1981.-P. 63-97.

171. Schmid A.-M.M., Eberwein R.K., Hesse M. Pattern morphogenesis in cell wall of diatoms and pollen grains: comparison // Protoplasma. 1996. - Vol. 193.-P. 144-173.

172. Smith M. A. The effect of heavy metals on the cytoplasmic fine structure of Sceletonema costatum (Bacillariophyta) // Protoplasma. 1983. - Vol. 116. -P. 14-23.

173. Stoermer E.F., Pankratz H.S., Bowen C.C. Fine structure of the diatom Amphipleura pellucida. II. Cytoplasmic fine structure and frustule formation // Am. J. Bot. 1965. - Vol. 52. - P. 1067-1078.

174. Stosch H.A. Structural and histochemical observation on the organic layers ofiLthe diatom cell wall // Proceedings of the 6 Symposium on Recent and Fossil Diatoms / Ed. by R. Ross. Koenigstein: Koeltz, 1981. - P. 231-252.

175. Stosch H.A., Reimann B.E.F. Subsilicea fragillarioides gen. et spec, nov., eine Diatomee (Fragillariaceae) mit vorwiegend organischer Membran // Nova Hedwigia, Beih. 1970. - Vol. 31. - P. 1-36.

176. Sumper M. A phase separation model for the nanopatterning of diatom biosilica // Science. 2002. - Vol. 295. - P. 2430-2432.

177. Sumper M. Biomimetic patterning of silica by long-chain polyamines // Angew. Chemie. 2004. - Vol. 116. - P. 2301-2304.

178. Sumper M., Kröger N. Silica formation in diatoms: the function of long-chain polyamines and silaffins // J. Mater. Chem. 2004. - Vol. 14. - P. 20592065.

179. Taylor D. L. Ultrastructure of Cocconeis diminuta Pantocsek 11 Archive für Mikribiologie. 1972. -Vol. 31. - P. 136-145.

180. Thamatrakoln K., Hildebrand M. Approaches for functional characterization of diatom silisic acid transporters // J. Nanosci. Nanotech. 2005. - Vol. 5. -P. 1-9.

181. Thamatrakoln K., Hildebrand M. Analysis of Thalassiosira pseudonana silicon transporters indicates distinct regulatory levels and transport activity trough the cell cycle // Eucaryotic Cell. 2007. - Vol. 6. - P. 271-279.

182. Thamatrakoln K., Hildebrand M. Silicon uptake in diatoms: a model for saturable and nonsaturable uptake kinetitics and the role of silicon transporters // Plant Physiol. 2008. - Vol. 146. - P. 1397-1407.

183. Thamatrakoln K., Kustka A.B. When to say when: can excessive drinking explain silicon uptake in diatoms? // BioEssays. 2009. - Vol. 31. - P. 322327.

184. Tiffany M.A. Valve morphogenesis in the marine diatom Gephyria media (Bacillariophyceae) // Diatom Res. 2002. - Vol. 17. - P. 391-400.

185. Tippit D.H., Pickett-Heaps J.D. Mitosis in the pennate diatom Surirella ovalis II J. Cell Biol. 1977. - Vol. 73. -P. 705-727.

186. Tippit D.H., Pickett-Heaps J.D., Leslie R. Cell division in two large pennate diatoms Hantzschia and Nitzschia. III. A new proposal for kinetochore function during prometaphase II J. Cell Biol. 1980. - Vol. 86. - P. 402-416.

187. Tschermak-Woess E. Über aufallendeStrukturen in den Pyrenoiden einiger Naviculoideen // Österreichische Botanische Zeitschrift. 1953. - Vol. 100. -P. 160-178.

188. Uriz M J., Turon X., Becerrro M.A., Agell G. Silica deposition in demosponges: spiculogenesis in Cvambe crambe // Cell Tissue Res. 2000. -Vol. 301.-P. 299-309.

189. Van de Meene A.M.L., Pickett-Heaps J.D. Valve morphogenesis in the centric diatom Proboscia alata Sundstrom // J. Phycol. 2002. - Vol. 38. -P. 351-363.

190. Van de Poll W., Vrieling E.G., Gieskes W.C. Localisation and expression of frustulins in the pennate diatoms Cylindrotheca fusiformis, Navicida pellicosa, and Navicula salinarum (Bacillariophyceae) // J. Phycol. 1999. — Vol. 35.-P. 1044-1053.

191. Van den Hoek C., Mann D.G., Jahns H.M. Algae. Bristol: Cambridge University Press, 1997. - 627

192. Volcani B.E. Role of silicon in diatom metabolism and silicification // Biochemistry of Silicon and Related Problems I Ed. by G. Bendz, I. Lindqvist. New York: Plenum Press, 1978. - P. 177-204.

193. Volcani B.E. Cell wall formation in diatoms: morphogenesis and biochemistry // Silicon and Siliceous Structures in Biological Systems / Ed. by T.L. Simpson, B.E. Volcani. New York: Springer-Verlag, 1981. -P. 157-200.

194. Waterkeyn L., Bienfait A. Localisation et rôle des ß-l,3-glucanes (callose et chrysolaminarine) dans le genre Pinnularia (Diatomées) // La Cellule. — 1987.-Vol. 74.-P. 198-226.

195. Whatley J.M., Whatley F.R. Chloroplast evolution // New Phytol. — 1981. — Vol. 87. P. 233-247.

196. Zurzolo C. Bowler C. Exploring bio inorganic pattern formation in diatoms. A story of polarized trafficking // Plant Physiol. 2001. - Vol. 127. -P. 1339-1345.