Белки транспорта кремния SIT

Петрова, Дарья Петровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Белки транспорта кремния SIT
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Белки транспорта кремния SIT"

На правах рукописи

ПЕТРОВА Дарья Петровна

БЕЛКИ ТРАНСПОРТА КРЕМНИЯ SIT

03.01.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

1 7 \М 2012

Новосибирск - 2012

005043719

Работа выполнена в Лимнологическом институте СО РАН

Научный руководитель:

д.х.н., профессор, академик Грачев Михаил Александрович

Официальные оппоненты:

Нетёсов Сергей Викторович, д.б.н., профессор, чл.-корр. РАН Новосибирский государственный университет, проректор по научной работе

Бондарь Александр Анатольевич, к.х.н.

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, старший научный сотрудник

Ведущая организация:

Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН

Защита состоится «1» июня 2012 г. в 10:00 часов на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 на базе Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автореферат разослан « » _ _2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета к.х.н., доцент

Коваль В. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Диатомовые водоросли (Bacillariophyta) - одноклеточные фотосинтезирующие эукариотические организмы, по некоторым данным число их видов может достигать 105-106 (Mann, 1994; Round, 1996). В современных водоемах разного типа диатомеи являются одной из наиболее распространенных групп микроводорослей. Морские диатомеи играют важную роль в биосфере, обеспечивая до 20% органического вещества Земли (Nelson et al., 1995), что сопоставимо с первичной продукцией тропических лесов (Field et al., 1998).

Отличительной чертой диатомеи является их клеточная стенка, построенная из аморфного кремнезема. Кремнистый панцирь диатомовых водорослей - один из примеров микро- и наноструктурированного природного материала. Виды диатомей классифицируются согласно симметрии панцирей и их тонкой структуре, представленной порами, выростами, шипами. Формирование кремнистых панцирей диатомей происходит внутри клетки в специализированной органелле - везикуле отложения кремнезема (Silica Deposition Vesicle - SDV) (Drum, Pankratz, 1964; Reimann, 1964). Механизмы, регулирующие у диатомей процессы захвата кремния из водной среды, его внутриклеточного транспорта к SDV и отложения биогенного кремнезема, остаются неизвестными. Современная молекулярная биология пока не может объяснить, как диатомеи преобразуют закодированную в геномах информацию в конструкцию кремнистых панцирей.

Важным достижением в молекулярной биологии диатомовых водорослей было открытие нового класса мембранных белков - транспортеров кремния (Silicon Transporters - SITs) (Hildebrand et al., 1997)*.

Первая работа была выполнена на морском центрическом виде Cylindrotheca fusiformis. Следующей диатомеей, у которой был обнаружен ген sit, была пресноводная пеннатная диатомея Synedra acus (Грачев и др., 2002). В дальнейшем гены sit изучали параллельно в нескольких лабораториях мира. Однако до настоящего времени ни один белок SIT не был выделен в чистом виде и не подвергнут экспериментальным структурно-функциональным исследованиям.

'Имеются два подхода, относящиеся к участию элементов в природных процессах. В геохимии принято обозначать именно элемент, который участвует в том или ином геохимическом цикле, например, говорить о круговороте кремния. Форма, в которой элемент участвует в процессе, зачастую точно не известна. В настоящей работе мы говорим о транспорте кремния, понимая, что в действительности из окружающей среды в клетку поступает не кремний, а свободная кремниевая кислота (Si(OH)4), а створка диатомей построена не из кремния, а из кремнезема (БЮг-пНгО).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было исследование белков SIT.

Были поставлены следующие задачи:

1. Провести сравнительный анализ предсказанных аминокислотных последовательностей белков SIT.

2. Выявить консервативные мотивы и дать анализ имеющихся гипотез о связи структуры белков SIT с их функцией.

3. Обнаружить белок SIT в протеоме S. acus subsp. radians путем иммуноблоттинга и разработать метод его выделения с помощью иммунохроматографии.

4. Расшифровать последовательность нуклеотидов полноразмерного гена sit S. acus subsp. radians с использованием техники геномного пиросеквенирования.

Научная новизна. Методом иммуноблоттинга белок SIT впервые обнаружен в протеоме диатомовой водоросли. В геноме S. acus subsp. radians впервые определена полная нуклеотидная последовательность гена sitl, для этого была использована техника пиросеквенирования. Впервые проведен биоинформационный анализ широкого круга аминокислотных последовательностей белков SIT диатомовых и некоторых хризофитовых водорослей, выявлены их консервативные особенности, которые, по-видимому, имеют значение для осуществления их функций.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты, полученные в работе, позволяют планировать ведение дальнейших исследований в двух направлениях:

1 - Эксперименты по химической модификации белков SIT в составе живой клетки, например, при воздействии алкилирующими агентами, про которые известно, что они ингибируют транспорт кремния и рост диатомей. Воспользовавшись этим методом, можно будет попытаться идентифицировать точку алкилирования, выделив для этих целей алкилированный белок в чистом виде; изучить действие бифункциональных реагентов для расшифровки взаимоположения элементов вторичной структуры белка SIT.

2 - Наработать расшифрованный в работе полный ген sitl для использования в бесклеточной системе, что позволит препаративно синтезировать белок SIT2, встроенный в мембрану и находящийся в нативном состоянии. Имея такой препарат, будет возможно получить информацию о белке SIT с помощью метода ЯМР, а также предпринять попытку кристаллизации белка для его рентгено-структурного анализа. Подобные

возможности являются принципиально важными в связи с тем, что белки SIT не имеют близких аналогов среди белков живых систем.

Разработанный метод выделения белков из биомассы S. acus subsp. radians может быть рекомендован для исследования протеомов других диатомовых водорослей. Полученные антисыворотки против белка SIT были использованы в нашей совместной работе с Бедошвилли Е.Д. и Лихошвай Е.В. и позволили впервые обнаружить белок SIT на ультратонких срезах диатомеи S. acus subsp. radians методом иммуноэлектронной микроскопии.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Международном симпозиуме «Живая клетка диатомей» (Иркутск, 2004), Международном рабочем совещании по клеточной физиологии «Transport mechanisms across cell membranes: channels and pumps» (Санкт-Петербург, 2004), 2-ом Российском симпозиуме «Химия и биология пептидов» (Санкт-Петербург, 2005), 9-ой Школе диатомологов России и стран СНГ «Морфология, систематика, онтогенез, экология и биогеография диатомовых водорослей» (Борок, 2005), 1(9)-ой Международной конференции молодых ботаников (Санкт-Петербург, 2006), 19th International Diatom Symposium (Иркутск, 2006), 4-ом съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008) и 5-ой Верещагинской байкальской конференции (Иркутск, 2010).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 14 научных работ, в том числе 6 статей в изданиях из Перечня ВАК РФ.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, трёх глав (обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов исследования и обсуждения), заключения, выводов, списка литературы, который включает 131 источник, и 4 приложений. Работа изложена на 137 страницах, содержит 26 рисунков и 9 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Анализ аминокислотных последовательностей SIT, предсказанных по последовательностям нуклеотидов генов sit

На момент начала настоящей работы (2002 г.) в международной базе данных GenBank было опубликовано 8 генов и фрагментов генов sit четырех видов диатомей (Cylindrotheca fusiformis, Synedra acus, Phaeodactylum tricornutum и Chaetoceros muelleri).

Анализ выровненных аминокислотных последовательностей, предсказанных по последовательностям нуклеотидов этих генов, показал, что SIT-белки имеют сходства и различия по аминокислотным последовательностям. Консервативным мотивом оказалась последовательность

CMLD, находящаяся между 4 и 5 трансмембранными доменами и предложенная на роль одного из компонентов активного центра транспорта кремниевой кислоты (Грачев и др., 2002; Петрова, Грачев. Щербакова, 2004). Согласно высказанной гипотезе (Grachev et al., 2005) мотив CMLD в белках SIT связывает ион цинка, который, в свою очередь, служит акцептором кремниевой кислоты.

В рамках настоящей работы были вычислены и проанализированы профили гидропатии указанных выше аминокислотных последовательностей. Оказалось, что, несмотря на большое число аминокислотных замен, профили гидропатии фрагментов белков весьма сходны, при этом во всех молекулах мотив CMLD был обнаружен в гомологичных положениях между двумя гидрофобными областями на коротком участке с малым индексом гидропатии.

Анализ распределения положительно заряженных остатков лизина (К) и аргинина (R) показал, что они сосредоточены в основном в гидрофильных областях, а трансмембранные домены, непосредственно примыкающие к мотиву CMLD, не содержат остатков К и R. Была обнаружена интересная особенность белков SIT. Оказалось, что мотив CMLD расположен в необычно длинных предсказанных триптических пептидах длиной от 50 до 110 а.о. Анализ встречаемости триптических пептидов различной длины в 400 известных белках диатомовых водорослей, депонированных в GenBank, показал, что лишь 59 из них могут давать столь протяженные трипсиновые пептиды (рис. 1). Протяженные участки последовательностей а.о., не содержащие положительно заряженных остатков К и R могут формировать пору для беспрепятственного транспорта кремниевой кислоты. Остатки лизина и аргинина из-за высокого сродства к кремнезему (Kröger et al., 1999) могли бы блокировать транспорт кремниевой кислоты сквозь пору.

25 г

Пластидпые Непластнаиые

Длина триптических пептидов (и.о.)

Рнс. 1. Встречаемость трипсиновых пептидов для предсказанных по последовательностям нуклеотидов белков диатомовых водорослей. Вертикальными стрелками обозначены длинные трипсиновые пептиды белков SIT из C.fusiformis (1), S. acus (2) и С. muelleri (3).

В белках SIT, упомянутых выше четырех видов диатомей, был обнаружен еще один длинный триптический пептид, занимающий положение ближе к С-концу, который также может участвовать в формировании стенки транспортной поры.

В настоящее время (декабрь 2011 г.) в GenBank содержатся данные о фрагментах аминокислотных последовательностей 119 белков SIT из 58 видов диатомовых и 2 видов хризофитовых водорослей. Профили гидропатии белков хризофитовых и диатомовых водорослей оказались подобными (рис. 2), несмотря на значительное число аминокислотных замен. У белков SIT хризофитовых водорослей позиции 163-166 занимает мотив CMLD. Сходство профилей гидропатии, выявленное для столь широкого круга видов, очевидно, связано с тем, что все белки SIT имеют сходное расположение функционально значимых элементов в своих вторичных и третичных структурах, а наличие мотива CMLD у хризофитовых водорослей является дополнительным доводом в пользу его функциональной значимости.

Номер аминокислотного остатка

Рис. 2. Профили гидропатии гомологичных фрагментов предсказанных аминокислотных последовательностей 119 белков SIT из 58 видов диатомовых и 2 видов хризофитовых водорослей. Программа BioEdit. Нумерация аминокислотных остатков дана по последовательности CfSITl. Цистеин мотива CMLD имеет порядковый номер 163.

Анализ встречаемости белков SIT, содержащих мотив CMLD, показал, что в своем каноническом виде он встречается в 39 предсказанных аминокислотных последовательности SIT у 15 видов диатомей и 2 видов хризофитовых водорослей. Отметим, что последовательность CMLD имеется без исключения во всех белках SIT пресноводных пеннатных диатомей, в том числе и у S. acus subsp. radians.

Его гомолог, в котором на месте остатка L (лейцин) присутствует остаток I (изолейцин), представлен в 45 последовательностях из 27 видов. В некоторых случаях вместо мотива CMLD присутствуют мотивы HMID, MMLD, MMID, QMID и SMID. Метионин (М), серии (S), глутамин (Q), гистидин (Н) подобно цистеину, потенциально могут служить лигандами для иона цинка и благодаря этому участвовать в функции связывания кремниевой кислоты. В двух белках морской диатомеи Т. pseudonana (TpSITl и TpSIT2) вместо CMLD присутствует мотив AMID (А - остаток аланина). Алании не может служить лигандом для связывания иона цинка, поскольку в нем отсутствуют необходимые функциональные группы. Не исключено, что эти два белка выполняют другие функции.

В 2006 г. была высказана гипотеза (Thamatrakoln, Alverson, Hildebrand, 2006), что в состав активного центра транспортера кремния входят 4 мотива GxQ, которые связывают остаток кремниевой кислоты из окружающей водной среды. В рамках настоящей работы была проанализирована встречаемость мотива GxQ в 119 белках SIT. Сравнительный анализ показал, что наличие всех четырех мотивов GxQ не является консервативным признаком. Таким образом, эта гипотеза не выдержала проверки.

Рассмотренные выше последовательности аминокислот белков SIT являются предсказанными по нуклеотидным последовательностям генов. Наличие SIT в соответствующих протеомах не было показано.

Обнаружение белка SIT в протеоме S. acus subsp. radians и его выделение

Для того, чтобы выяснить связь структуры с функциями белков SIT и расшифровать молекулярные механизмы, обеспечивающие участие этих белков в транспорте кремния, необходимо провести комплекс исследований с помощью методов молекулярной биологии и биоорганической химии. Одной из задач настоящей работы была разработка метода, позволяющего извлечь из клеток S. acus subsp. radians ее как можно более полный протеом. Для исключения возможности потери белков за счет их сорбции на кремнеземе створок была применена техника растворения панцирей в 5 М NH4F, pH 5,0. Как видно из рисунка 3, обработка диатомей указанным реагентом при 4°С в течение 12 ч приводит к полному растворению кремнистых створок, при этом лизис клеток не происходит.

radians в 5 M NH4F при pH 5,0 (световая микроскопия). Цифрами указано время в мин.

Лишенные кремнистых створок клетки далее экстрагировали буфером, содержащим 52 мМ ß-меркаптоэтанол в 2%-ном растворе ДДС-Na / 250 мМ Трис-HCI, pH 8,8 при 37°С. В результате экстракции получен набор белков с широким диапазоном молекулярных масс - от 10 до 200 кДа. Стоит отметить, что при использовании коммерческого набора Total Protein Kit фирмы Bio-Rad для белковой экстракции на электрофореграмме выявлялся бедный спектр белков невысокой концентрации. Применение методов экстракции биомассы 2% ДДС-Na с нагреванием до 95°С также оказались малопродуктивными. Таким образом, разработанный метод оказался оптимальным для получения богатого набора белков протеома S. acus subsp. radians.

На основе данных о последовательности аминокислот белка SIT1 диатомеи S. acus subsp. radians, полученных ранее (Грачев и др., 2002) и в настоящей работе, руководствуясь рассчитанной вторичной структурой TmPred, были выбраны четыре потенциальные антигенные детерминанты, находящиеся во внемембранных участках (рис. 4). Для получения антисывороток против белков SIT B.B. Самуковым и др. (НПО «Вектор») были синтезированы пептиды Р1-Р4, мимикрирущие эти участки. Для обеспечения возможности коньюгации синтетических пептидов с альбумином в их С-концевые последовательности были введены остатки цистеина. В пептиде РЗ на месте остатка цистеина (компонента мотива CMLD) был введен остаток серина (S), чтобы избежать осложнений, вызванных легкой окисляемостью цистеина. Пептиды были очищены методом ВЭЖХ. В результате иммунизации восьми кроликов коньюгатами пептидов с БСА были получены соответствующие

а)

б)

YAE S Н PRALLFAPIС

.hpba4.r

ВНуТрЯКЛСЮЧНОС ПрОСТраDCTBO

CTGKPIESHEPPPJJA

Рис. 4. Схема расположения в клеточной мембране белка SaSITl: а) - расположение трансмембранных доменов и внемембранных участков по данным программы ТМНММ; б) -потенциальные антигенные детерминанты выделены жирным шрифтом; Р1-Р4 — синтетические пептиды, использованные для получения антисывороток.

антисыворотки: anti-Pia, anti-Plb, anti-P2a, anti-P2b, anti-P3a, anti-P3b, anti-P4a и anti-P4b. Антисыворотки были истощены в отношении БСА.

Проверку специфичности связывания антисывороток с антигеном проводили дот-блот анализом, используя в качестве отрицательного контроля клеточный лизат Е. coli. Следует отметить, что дод-блоттинг тормозился при преинкубации каждой из антисывороток с соответствующим синтетическим пептидом (Р1-Р4). По результатам раститровки, проведенной в дот-блот анализе, для дальнейшей работы были выбраны антисыворотки anti-Pia, anti-Plb, anti-P3a, anti-РЗЬ, и anti-P4b, которые давали положительный ответ с антигеном в белковом экстракте, полученном после растворения кремнистого панциря из диатомей, и не показали неспецифической реакции с лизатом Е. coli.

Анализ суммарного белкового экстракта S. acus subsp. radians, полученного в ходе работы, с использованием антисывороток anti-Pia, anti-Plb, anti-P3a, anti-РЗЬ, и anti-P4b, а так же смесью антисывороток (anti-Pia, anti-P3a и anti-P4a), позволил выявить антиген с массой 62-64 кДа (рис. 5).

Для препаративного выделения белка SIT был применен метод иммунной хроматографии. Антисыворотку anti-P3a сорбировали на бромциан-сефарозу, далее, согласно инструкции производителя, проводили иммунохроматографию и в результате при промывке колонки буфером 100 мМ Cf ljCOONa / 500 мМ NaCl,

«3 л es я я Xi

N т fi Т Т

cu а. ft. а. От а. а. Ci-

•д 'Z2 •■С "■С "•С •д te

s С е с с с с с

я CS ез я я я я я

IM ^ ЯЯЧвЯЯЯЯ^!»!

— 250

— ISO

Мм**

— 100

50 — ^В — 50

— 37

Рис. 5. Градиентный гель-электрофорез суммарной белковой фракции S. acus, полученной после растворения кремнистого панциря (окраска Кумасси) и иммуноблоггинг с антителами против синтетических пептидов (смесь - anti-Pia, anti-P3a и anti-P4a; М - маркеры молекулярной массы).

pH 4,0, получили белок, который при гель-электрофорезе дал единственное детектируемое при окраске серебром пятно в районе молекулярных масс 62-64 кДа (рис. 6).

1 2 3 4 5

Рис. 6. Выделение белка SIT из суммарного белкового экстракта S. acus subsp. radians методом имунной хроматографии с антисывороткой anti-РЗа. Градиентный гель-электрофорез, окраска серебром. М - маркер 50 «*■*» молекулярной массы; 1-5 - последова-

тельные фракции, полученные в Я 7 •*«**» результате элюции колонки буфером 100

мМ CH3COONa / 500 мМ NaCl, pH 4,0.

Выявление гена sil2 в геноме S. actis subsp. radians и его анализ

Одной из задач настоящего исследования было получение полноразмерного гена sit S. acus subsp. radians для его последующего использования в молекулярно-биологических исследованиях. Расшифрованный ранее Т.А. Щербаковой и Ю.А. Масюковой (Лимнологический институт Сибирского отделения РАН) ген sit (FJ263063), который мы будем далее называть Sas/71, содержал на 5'-конце кодон GTT, кодирующий валин (V); стартовый кодон, кодирующий аминокислоту метионин (М) в нем найти не удалось. На З'-конце присутствует стоп-кодон TAG. Имелись основания предполагать, что этот ген не является полноразмерным и может содержать нерасшифрованную нуклеотидную последовательность, расположенную «левее» упомянутого выше валинового кодона. Для поиска полноразмерного гена Saj//1 была применена техника полногеномного пиросеквенирования. Высокомолекулярная ДНК была выделена из аксеничной культуры диатомеи S. acus subsp. radians. Библиотеку геномной ДНК для пиросеквенирования получали из 500 нг ДНК по стандартному протоколу фирмы Roche для секвенирования с реактивами серии Titanium (Rapid library preparation method manual, http://\vww.my454.com). Секвенирование проводили на пиросеквенаторе Roche Genome Sequencer GS FLX. Для сборки контигов были взяты последовательности, длина которых варьировала от 300 до 500 п.н. Сборку проводили с использованием ассемблера Newbler (Miller, Koren, Sutton, 2011) со стандартными настройками.

Пиросеквенирование (два раунда) и биоинформационньтй анализ полученных данных проведены в совместной работе с Ю.П. Галачьянцем и К.В. Хабудаевым (Лимнологический институт Сибирского отделения РАН). Контиг (37183) длинной 1069 п.н. имел высокое сходство с опубликованным ранее фрагментом последовательности гена, который дальше будем называть Sa^ftl (FJ263063). Предсказанная аминокислотная последовательность найденного фрагмента не содержала стартового метионина, имела по сравнению с фрагментом белка SaSITl единичную делецию и три точечные замены аминокислот (рис. 7).

Отличие вновь расшифрованного гена, который обозначен, как Sas/il', может быть либо результатом неточностей секвенирования, либо следствием того, что ген sitV является членом семейства генов, кодирующих белки SIT 5. acus subsp. radians. Наряду с фрагментом гена Sasitl', в одном из контигов (16677) длинной 2942 п.н. был обнаружен новый ген, сходный с геном Sas/il, который мы обозначили как Sas/72.

Поиск гена в контигах проводили по референсной последовательности Sas/71. Анализ предварительной сборки генома с помощью программного пакета Blast с параметрами blastn и е-value < 10"9 выявил сходную с Saj//1 последовательность. Трансляция контига (16677) по всем рамкам считывания позволила найти непрерывную аминокислотную последовательность длиной 587 а.о. На расстоянии 17 а.о. с N-конца этой аминокислотной последовательности находится предположительно стартовый остаток метионина (М) белка SaSIT2. На З'-конце гена был обнаружен терминирующий кодон TGA, а вслед за ним - некодирующий участок. Последним аминокислотным остатком белка SaSIT2 является глутаминовая кислота (Е), кодируемая кодоном GAG. Общая длинна белка SaSIT2 при такой интерпретации составляет 570 а.о. (рис. 7).

Аминокислотная последовательность, кодируемая геном Sasit2, содержит мотив CMLD в положении, гомологичном положению этого мотива в белках SaSITl, SaSITl' и других SIT - между двумя трансмембранными доменами. Протяженность не содержащего остатков R и К трипсинового пептида в SaSIT2 с мотивом CMLD составляет 75 а.о. Выявлены еще два трипсиновых пептида, имеющих длину 44 и 42 а.о. Таким образом, белок SaSIT2 сохраняет все предположительно важные для проявления его функций структурные особенности. Мотивы GxQ, предложенные Таматраколыг и др. (Thamairakoln, Alverson, Hildebrand, 2006) на роль участников активного центра транспорта кремния, в белке SaSIT2 найдены в четырех положениях.

Белки SaSITl, SaSITl' и SaSIT2 в гомологичных положениях содержат большое число (356) идентичных а.о. (рис. 7), на перекрывающихся участках аминокислотные последовательности оказались высоко сходными (84%), а.о. были идентичными в 71% положений. Эти последовательности демонстрируют сходство профилей гидропатии в перекрывающейся области. С-концевая часть белка SaSIT2 оказалась короче по сравнению с С-концевой последовательностью SaSITl. Она не содержит coil-coiled мотивов. Число трансмембранных доменов SaSIT2, по расчетам программ SOSUI (Durbin et al., 1998), TmPred (Hofmann, Stoffel, 1993), HMMTOP (Tusnddy, Simon, 1998) и TMHMM server v. 2.0 (Krogh et al., 2001), составило 12 (табл. 1), мотив CMLD локализован между 6 и 7 трансмембранными доменами и находится вне клетки, что подтверждает его возможную значимость в связывании кремниевой кислоты из окружающей среды.

SaSITl SasITl1 SaSIT2

SaSITl SaSITl SaSIT2

■ I ■ • 45

. I . . 55

MFIVARIASP TYGKDDANIF GISDGFQSFL NSGLTGAVIT TVIGSLAWRI IASSFPLAFL

CSGAWVLGRF SNPLIYIIIR VCLVLESVGI CSGAWVLGRF

VCLVbENVGI

. I . . 95

■ I

наружу EVYLEGAEKH

115 TSEPVTRRDG

NKLIAGYQPD NKLIAGYQPD EVYLEGAERH TSAPVTKRDK

SaSITl SaSITl SaSIT2

125 DIDRLLTVFK

135 145

FIYSSALLVL CLIIVHAAMF

155 ===== внутрь TTQTTSGADF

DIDIAMTTVK YLYSTGLLVF SVVIVMSAMF TQSTKIAND"

GLHPAVSFLI GLHPAVSFLI -AHPAVAFFL

FWFLIIWLAM FWFLIIWLAM FWFLIVWLAM

. I

185 наружу MEGGQGALVG MEGGQGALVG MEGGQGCLIG

LQPVDRALYA LQPVDKALYA LKPIDKSLYK

----I----|

205

ESHPRALLRA ESHPRALLNT DSHKVTYTNC

PltAH NGDNME KLAHNGDNME MLAHKGDNME

RFIVGRQYLV RFIVGRQYLV RFIVGRQFLV

VLVITVINLM VLVITVINLM VLVITVINLC

SaSITl SaSITl SaSIT2

SaSITl SaSITl1 SaSIT2

SaSITl SaSITl SaSIT2

SaSITl SaSITl' SaSIT2

245 = внутрь GSAVKGATVL GSAVKGATVL GSSLKHAKVL

----I----|

GLPQVMNDIF GLPQVMNDIF GLDDTVTEIF

LGNGLAMILT LGNGLAMILT LGSGVAMILT

INNYFMLFTS INNYFMLFTS INTYFMLMTT

YVSYGIEFSG YVSYGIEFSG YVSLGIEFSG

----I----I

315

LLHCVYLVQM LLHCVYLVQM LLHAVYLVQI

----I .... I

325

IFSKITGKPI IFSKITGKPI VFSKITGKPI

. I

335 внутрь ESNEPPRNAA ESNEPPRNAA ESNEPPRSAV

365 375

AVTLVALFDG ^KT-MWDGVPP AVTLVALFDG KTGMWDGVPP AVTIVALFDR KTSMYDGVPP

----I----|

385

YVSVIILFIL YVSVIILFIL YVSVIVFFVL

QNLFFWARVI QNLFFWARV I QNLFFWARV F

• • • . I----I

MSVAILCFCL MSVAILCFCL VSLVILSFSL

KAWGMMEGM MAWGMMECSi MCWGMMEGM

405 внутрь QIALFAWNM QIALFAWNM QIALFAVINL

PEEELRNSPI PEEELRNSPI PECELXNYSM

. . I . . 435

AYANCQLTFA GQNLQAFLIG AYANCQLTFA GQNLQAFLIG ASKNCTLAFQ GTNLQSFLIG

----I----|

445

RQIFVATCMF RQIFVATCMF RQIFVATCMF

IVARIASPTY IVARIASPTY WARIASPSY

. I .

. . I . . 495

485

GLTGAVITTV IGSLAWRIIA GLTGAVITTV IGSLAWRIIA GLTGAIITTL IGSLAWRIIA

465 наружу GKDBAMIFGI GKDDANIFGI GSDDANIFGV

■ I •

. ... I .... I 475

SDGFQSFLNS SDGFQSFLNS SDGFQTFLNT

SSFPLAFLSN SSFPLAFLSN SSFPVAFLSN

PLIYIIIRVC

PLIYII----

PLIYFIIRVC

525 наружу LVLESVGICS

LLLDAIGLCS

. . I . . 535

GAWVFGRFNK AAWLLALIHK

■ I

I ■

. I

LIAGYQPDEV YLEGAERHTS QLVGFQIDEV YIG---KPSE

565 APVTKRDKDM RAAAEKAVDE

. . I . . 575

DIAMTTVKYL ELAQE-----

585 YSTGLLVFSV

595 VIVMSAMFTQ

SaSITl SaSITl SaSIT2

605 615

QTEIANDAHP AVALLFVLVS

625 FIWJARLMME

635 GGSGWLDRFL

Рис. 7. Аминокислотные последовательности белков SaSITl, SaSITl' и SaSIT2 диатомовой водоросли S. acus subsp. radians. Серым цветом выделены консервативные участки, черным -мотив CMLD; === - трансмембранные домены.

Таблица 1. Структурные характеристики полных последовательностей белков SIT диатомовых водорослей.___ ___

Вид Условное обозначение Протяженность, а.о. Масса, кДа Coil-coiled домен Число трансмембранных доменов по TmPred CMLD или его гомологи

С. fusiformis CfSITl 548 60,6 + 10 CMLD

05IT2 543 59,5 + 10 CMLD

СБГГЗ 557 61 + 10 CMLD

СЄГГ4 548 60,5 + 10 CMLD

СЙГГ5 538 59,5 + 10 CMLD

N. alba NaSIT 549 60,8 + 10 CMLD

Р.tricornutum PtSITl 512 55,4 - 10 CMLD

PtSIT2-l 506 M,9 - 10 CMLD

PtSIT2-2 506 54,9 - 10 CMLD

P1SIT3 599 65 - 10 CMLD

P£SIT4 512 55,3 - 10 CMLD

T.pseudonana TpSITl 517 55,8 - 10 AMID

TpSIT2 528 57,2 - 10 AMID

TpS[T3 565 62,1 - 10 CMID

S.costatum ScSIT 508 55,4 - 10 CMLD

S. acus subs. radians SaSIT2 570 62,4 - 12 CMLD

К настоящему времени в GenBank опубликовано 15 аминокислотных последовательностей полноразмерных белков SIT из 6 видов диатомей (Hildebrand et al., 1997; Hildebrand, Dahiin, Volcani, 1998; Armbrust et al., 2004; Thamatrakoln, Alverson, Hildebrand, 2006; Sapriel et al., 2009). Проведенный нами филогенетический анализ показал, что пять белков SIT из С. fusiformis формируют отдельный кластер (рис. 8). Четыре из пяти SIT Р. tricornutum также формируют отдельную группу, а один (PtSIT3) с высокой будстреп-под-держкой кластеризуется с определенной в настоящей работе последовательностью SaSIT2. PtSIT3 и SaSIT2 оказались наиболее сходными и по профилям гидропатии аминокислотных последовательностей (рис. 9).

G9 100

57(—I

ssl_

»fC

AAD13804 CfSITI

AAD13305 CtSrrS

AAD13803 CfSfTS AADI330S CTSfT2 100** AAD13S07 CfSIT4

AEB3l817N3Srr

100|EEC-)WS7PtSrr4 IACOS5491 PtSITI ACJ65493 PtSIT2-2 10a'ACJ6S432PtStT2-1

- A85S1S2T TpSIT3

-ABB81824 ScSIT

CABB3l32STpSrr2 __ ABB3i325Tpsm

-SaSIT2

- ACJS5434 PtSfT3

Рис. 8. Филогенетический анализ белков SIT методом ближайших соседей. В узлах дерева -бутстреп-значения, полученные при п = 1000 реплик. CfSIT - С. fusiformis; NaSIT — N. alba; PtSIT — P. tricomutum:; ScSIT - S. coslatum; SaSIT — S. actis subs, radians-, TpSIT- Т. pseudoncma.

Номер аминокислотного остатка

Рис. 9. Профили гидропатии предсказанных аминокислотных последовательностей БаЭГП (красная линия) и КБГГЗ (синяя линия). Нумерация аминокислотных остатков дана по последовательности СЕ5ПТ.

выводы

1. Установлено, что профили гидропатии предсказанных аминокислотных последовательностей у всех 119 исследованных белков SIT из 58 видов диатомовых и из 2 видов хризофитовых водорослей сходны по расположению максимумов, минимумов и интенсивности пиков на перекрывающихся участках. Во всех белках SIT, за двумя исключениями, имеется консервативный мотив CMLD, либо его функциональный аналог.

2. Показано, что все белки SIT содержат протяженные участки длиной 42110 а.о. без остатков лизина и аргинина. Эти, не содержащие положительно заряженных аминокислотных остатков, участки могут быть частью транспортной поры, по которой молекулы кремниевой кислоты свободно перемещаются из окружающей среды внутрь клетки.

3. Разработан метод получения суммарного белка из биомассы диатомей, основанный на растворении кремнистых панцирей в 5 М NH4F при pH 5,0, который дает широкий спектр белков с молекулярными массами от 10 до 200 кДа.

4. На предсказанной аминокислотной последовательности белка SaSITl Synedra acus были выбраны четыре потенциальные антигенные детерминанты. Кроличьи антитела против синтетических пептидов, мимикрирующих эти детерминанты, позволили впервые для диатомей обнаружить белок SIT в протеоме методом иммуноблоттинга и выделить его из суммарного белка методом иммунохроматографии.

5. С использованием техники геномного пиросеквенирования у S. acus subsp. radians впервые обнаружен ген нового белка SIT - SaSIT2 - массой 62,4 кДа с 12 трансмембранными доменами, консервативным мотивом CMLD, входящим в состав протяженного участка (75 а.о.), не содержащего остатков лизина и аргинина. Профиль гидропатии белка SaSIT2 аналогичен профилям гидропатии других белков SIT.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Петрова Д. П., Калюжная О. В., Костюковская А. О. Изучение растворения панцирей диатомовых водорослей in vitro II Бюлл. ВСНЦ РАМН. -2004. -№7. -С. 133-135.

2. Щербакова Т. А., Масюкова Ю. А., Сафонова Т. А., Петрова Д. П., Верещагин А. Л., Минаева Т. В., Адельшин Р. В., Трибой Т. И., Стоник И. В., Козлов М. В., Лихошвай Е. В., Грачев М. А. Консервативный мотив CMLD в белках транспорта кремниевой кислоты у диатомовых водорослей // Молекулярная биология. —2005. —Т. 39. —С. 269-280.

3. Лихошвай Е. В., Масюкова Ю. А., Щербакова Т. А., Петрова Д. П., Грачев М. А. Обнаружение гена транспорта кремниевой кислоты у хризофитовых водорослей // Доклады Академии наук. -2006. -Т. 408. -С. 1-5.

4. Петрова Д. П., Бедошвили Е. Д., Шелухина И. В., Самуков В. В., Корнева Е. С., Верещагин А. Л., Попкова Т. П., Карпышев Н. Н., Лебедева Д. В., Клименков И. В., Лихошвай Е. В., Грачев М. А. Обнаружение белка транспорта кремниевой кислоты в клетках пресноводной диатомеи Synedra acus методами иммуноблоттинга и иммуноэлектронной микроскопии // Доклады Академии наук. -2007. -Т. 417. -С. 113-116.

5. Верещагин А. Л., Глызина О. Ю., Башарина Т. Н., Сафонова Т. А., Латышев С. А., Корнева Е. С., Петрова Д. П., Анненков В. В., Даниловцева Е. Н., Чебыхин Е. П., Волокитина Н. А. Культивирование пресноводной диатомеи Synedra acus в столитровом фотобиореакторе и оценка состава биомассы // Биотехнология. -2008. -№ 4. -С. 55-63.

6. Shishlyannikov S. М., Zakharova Yu. R., Volokitina N. A., Mikhailov I. S., Petrova D. P., Likhoshway Ye. V. A procedure for establishing an axenic culture of the diatom Synedra acus subsp. radians (Kiitz.) Skabitsch. from Lake Baikal // Limnology and Oceanography: Methods. -2011. -V. 9. -P. 478-484.

Благодарности. Автор выражает благодарность акад. М.А. Грачеву за постановку задачи и внимание к работе, Ю.Р. Захаровой, С.М. Шишлянникову и H.A. Волокитиной за предоставление биомассы клеток, Ю.П. Галачьянцу за участие в пиросеквенировании, К.В. Хабудаеву за аннотирование генов, Ю.А. Масгоковой за получение последовательностей генов sit, Ол.В. Калюжной за совместную работу по отработке метода растворения панцирей диатомей, Г.И. Филипповой за подбор литературы, к.б.н. Т.А. Щербаковой и к.б.н. И.В. Клименкову за полезные советы и д.б.н. Е.В. Лихошвай за ценные замечания и помощь в оформлении работы. Работа выполнена при поддержке Программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», проект 6.3.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Петрова, Дарья Петровна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Роль кремния в живых организмах.

1.2. Общая характеристика диатомовых водорослей.

1.3. Систематика диатомей.

1.4. Общий план строения панцирей диатомей.

1.5. Морфогенез элементов панцирей.

1.6. Белки, предложенные на роль участников морфогенеза элементов кремнистых панцирей.

1.7. Белок транспорта кремния - 81Т.

1.8. Гипотеза макропиноцитоза.

1.9. Гипотеза транспортирующих частиц - БТУ.

1.10. Гипотеза об участии аквапоринов в морфогенезе кремнистых панцирей диатомей.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Объект исследования.

2.2. Выбор условий растворения панцирей диатомовых водорослей.

2.3. Выделение суммарной белковой фракции после удаления кремнистых панцирей 5 М МН4Г при рН 5,0.

2.4. Последовательная экстракция белков из клеток диатомовых водорослей.

2.5. Электрофорез в полиакриламидном геле с ДДС-№.

2.6. Использованные антисыворотки.

2.7. Иммуноблоттинг.

2.8. Иммунохроматография.

2.9. Дот-блот анализ.

2.10. Выделение ДНК.

2.11. Подготовка библиотеки ДНК и пиросеквенирование

2.12. Аннотация гена sit.

2.13. Оценка длины фрагментов трипсинового гидролиза белков диатомовых водорослей.

2.14. Анализ аминокислотных последовательностей белков

2.15. Филогенетический анализ.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Анализ аминокислотных последовательностей SIT, предсказанных по последовательностям нуклеотидов генов sit.

3.2. Обнаружение белка SIT в протеоме S. acus subsp. radians и его выделение.

3.3. Выявление и анализ гена sit! в геноме S. acus subsp. radians.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Белки транспорта кремния SIT"

1996). В современных водоемах разного типа диатомеи являются одной из наиболее распространенных групп микроводорослей. Морские диатомеи играют важную роль в биосфере, обеспечивая до 20% органического вещества Земли (Nelson et al., 1995), что сопоставимо с первичной продукцией тропических лесов (Field et al., 1998).

Отличительной чертой диатомей является их клеточная стенка, построенная из аморфного кремнезема. Кремнистый панцирь диатомовых водорослей - один из примеров микро- и наноструктурированного природного материала. Виды диатомей классифицируются согласно симметрии панцирей и их тонкой структуре, представленной порами, выростами, шипами. Формирование кремнистых панцирей диатомей происходит внутри клетки в специализированной органелле - везикуле отложения кремнезема (Silica Deposition Vesicle - SDV) (Drum, Pankratz, 1964; Reimann, 1964). Механизмы, регулирующие у диатомей процессы захвата кремния из водной среды, его внутриклеточного транспорта к SDV и отложения биогенного кремнезема, остаются неизвестными. Современная молекулярная биология пока не может объяснить, как диатомеи преобразуют закодированную в геномах информацию в конструкцию кремнистых панцирей. Важным достижением в молекулярной биологии диатомовых водорослей было открытие нового класса мембранных белков - транспортеров кремния (Silicon Transporters - SITs) (Hildebrand et al.,

1997)*.

Имеются два подхода, относящиеся к участию элементов в природных процессах. В геохимии принято обозначать именно элемент, который участвует в том или ином геохимическом цикле, например, говорить о круговороте кремния. Форма, в которой элемент участвует в процессе, зачастую точно не известна. В настоящей работе мы говорим о транспорте кремния, понимая, что в действительности из окружающей среды в клетку поступает не кремний, а свободная кремниевая кислота (Si(OH).»), а створка диатомей построена не из кремния, а из кремнезема (SiCVnl^O).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было исследование белков SIT.

Были поставлены следующие задачи:

1. Провести сравнительный анализ предсказанных аминокислотных последовательностей белков SIT.

2. Выявить консервативные мотивы и дать анализ имеющихся гипотез о связи структуры белков SIT с их функцией.

3. Обнаружить белок SIT в протеоме S. acus subsp. radians путем имму-ноблоттинга и разработать метод его выделения с помощью иммунохромато-графии.

4. Расшифровать последовательность нуклеотидов полноразмерного гена sit S. acus subsp. radians с использованием техники геномного пиросек-венирования.

Научная новизна. Методом иммуноблотинга белок SIT впервые обнаружен в протеоме диатомовой водоросли. В геноме S. acus subsp. radians впервые определена полная нуклеотидная последовательность гена sit2, для этого была использована техника пиросеквенирования. Впервые проведен биоинформационный анализ широкого круга аминокислотных последовательностей белков SIT диатомовых и некоторых хризофитовых водорослей, выявлены их консервативные особенности, которые, по-видимому, имеют значение для осуществления их функций.

2 - Наработать расшифрованный в работе полный ген sitl для использования в бесклеточной системе, что позволит препаративно синтезировать белок SIT2, встроенный в мембрану и находящийся в нативном состоянии. Имея такой препарат, возможно будет получить информацию о белке SIT с помощью метода ЯМР, а также предпринять попытку кристаллизации белка для его рентгеноструктурного анализа. Подобные возможности являются принципиально важными в связи с тем, что белки SIT не имеют близких аналогов среди белков живых систем.

Разработанный метод выделения белков из биомассы S. actis subsp. radians может быть рекомендован для исследования протеомов других диатомовых водорослей. Полученные антисыворотки против белка SIT были использованы в нашей совместной работе с Бедошвилли Е.Д. и Лихошвай Е.В. и позволили впервые обнаружить белок SIT на ультратонких срезах диато-меи S. acus subsp. radians методом иммуноэлектронной микроскопии.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международном симпозиуме «Живая клетка диатомей» (Иркутск, 2004), Международном рабочем совещании по клеточной физиологии «Transport mechanisms across cell membranes: channels and pumps» (Санкт-Петербург, 2004), 2-ом Российском симпозиуме «Химия и биология пептидов» (Санкт-Петербург, 2005), 9-ой Школе диатомологов России и стран СНГ «Морфология, систематика, онтогенез, экология и биогеография диатомовых водорослей» (Борок, 2005), 1(9)-ой Международной конференции молодых ботаников (Санкт-Петербург, 2006), 19th International Diatom Symposium (Иркутск, 2006), 4-ом съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008) и 5-ой Верещагинской байкальской конференции (Иркутск, 2010).

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Петрова, Дарья Петровна

выводы

1. Установлено, что профили гидропатии предсказанных аминокислотных последовательностей у всех 119 исследованных белков SIT из 58 видов диатомовых и из 2 видов хризофитовых водорослей сходны по расположению максимумов, минимумов и интенсивности пиков на перекрывающихся участках. Во всех белках SIT, за двумя исключениями, имеется консервативный мотив CMLD либо его функциональный аналог.

2. Показано, что все белки SIT содержат протяженные участки длиной 42110 а.о. без остатков лизина и аргинина. Эти не содержащие положительно заряженных аминокислотных остатков участки могут быть частью транспортной поры, по которой молекулы кремниевой кислоты свободно перемещаются из окружающей среды внутрь клетки.

4. На предсказанной аминокислотной последовательности белка SaSITl Syn-edra acus были выбраны четыре потенциальные антигенные детерминанты. Кроличьи антитела против синтетических пептидов, мимикрирующих эти детерминанты, позволили впервые для диатомей обнаружить белок SIT в протеоме методом иммуноблоттинга и выделить его из суммарного белка методом иммунохроматографии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Предсказанные по нуклеотидным последовательностям генов аминокислотные последовательности белков транспорта кремния (SIT) у различных видов диатомовых и хризофитовых водорослей при анализе различными компьютерными программами идентифицируются как мембранные. Во всех последовательностях белков транспорта кремния консервативный мотив CMLD и его гомологи (CMID, MMID, SMID, QMID и HMID) занимают одинаковое положение между двумя гидрофобными областями. Наличие в большинстве исследованных SIT мотива CMLD и его возможных функциональных аналогов MMID, SMID, QMID и HMID дает дополнительные доводы в пользу высказанной ранее гипотезы о роли этого мотива в поглощении кремниевой кислоты (Grachev et al., 2005).

Профили гидропатии 119 белков SIT из 58 видов диатомовых водорослей, а также SIT из двух видов хризофитовых водорослей оказались сходными, несмотря на значительное число аминокислотных замен. Во всех предсказанных аминокислотных последовательностях была обнаружена интересная особенность - CMLD или его аналоги расположены в протяженном участке длиной от 50 до 110 а.о., не содержащем остатков лизина (К) и аргинина (R). Эти данные говорят о том, что трансмембранные домены, между которыми располагается мотив CMLD, являются наиболее вероятными кандидатами на роль элементов, формирующих пору для транспорта кремниевой кислоты, поскольку положительно заряженные остатки К и R имеют высокое сродство к кремнезему и могли бы блокировать его транспорт.

По результатам пиросиквенирования библиотеки геномной ДНК в геноме S. acus subsp. radians идентифицирован полноразмерный ген Sas//2 длиной 1713 п.о., кодирующий белок массой 62,4 кДа, который по сходству предсказанной аминокислотной последовательности, профилей гидропатии и вторичной структуре сходен с SIT белками из 58 видов диатомей, в том числе, с белком S. actis subsp. radians SaSITl.

Таким образом, в геноме S. acus subsp. radians присутствует семейство, по крайней мере, из двух генов sit. Семейства из 2-5 генов sit известны для большинства исследованных видов диатомей (Hildebrand, Dahlin, Volcani, 1998; Alverson, 2007; Sapriel et al., 2009).

Методом иммуноблоттинга с помощью поликлональных антисывороток к предсказанным нами антигенным детерминантам белка SIT1 в протео-ме диатомовой водоросли S. acus идентифицирован белок молекулярной массой около 62-63 кДа. Выделение белка SIT методом иммунохроматографии делает возможным его изучение методами физико-химической биологии.

Расшифровка последовательности нуклеотидов полноразмерного гена Sasit2 открывает перспективу получения нативного очищенного белка SIT в бесклеточной системе белкового синтеза и его исследования с помощью методов молекулярной биологии, в том числе, методами ЯМР и рентгено-структурного анализа.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Петрова, Дарья Петровна, Иркутск

1. Воронков М.Г., Кузнецов И.Г. Удивительные элементы жизни. — Иркутск, 1983.- 107 с.

2. Воронков М.Г., Кузнецов И.Г. Кремний в живой природе. Новосибирск: Наука, 1984. - 157 с.

3. Захарова Ю.Р., Адельшин Р.В., Парфенова В.В., Бедошвили Е.Д., Лихошвай Е.В. Таксономическая характеристика микроорганизмов, ассоциированных с культивируемой диатомеей Synedra acus из озера Байкал // Микробиология. 2010.-Т. 79, №5. -С. 688-697.

4. Лихошвай Е.В., Масюкова Ю.А., Щербакова Т.А., Петрова Д.П., Грачев М.А. Обнаружение гена транспорта кремниевой кислоты у хризофитовых водорослей // Докл. АН. 2006. - Т. 408, №6. - С. 845-849.

5. Петрова Д.П. Выделение белков из клеточной стенки диатомовых водорослей Synedra acus и Aulacoseira baicalensis II Мат-лы 1-ой (9-ой) Междунар. конф. молодых ботаников (Санкт-Петербург, 21-26 мая, 2006). Санкт-Петербург, 2006. - С. 311.

6. Петрова Д.П. Идентификация белка транспорта кремниевой кислоты в белковых фракциях из диатомовой водоросли Synedra acus II Сб. трудов 4-го съезда Росс, об-ва биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, IIIS мая, 2007). Новосибирск, 2008. - С. 482.

7. Поповская Г.И., Генкал С.И., Лихошвай Е.В. Диатомовые водоросли планктона озера Байкал: Атлас-определитель. Новосибирск: Наука, 2011. -192 с.

8. Саут Р., Уиттик А. Основы альгологии. М.: Мир, 1990. - 597 с.

9. Alverson A.J. Strong purifying selection in the silicon transporters of marine and freshwater diatoms // Limnol. Oceanogr. 2007. - Vol. 52, No. 4. - P. 14201429.

10. Agre P., Sasaki S., Chrispeels J. Aquaporins: a family of water channel proteins//Am. J. Physiol. 1993. - Vol. 265. - P. 461.

11. Agre P. Aquaporin Water Channels (Nobel Lecture) // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2004. - Vol. 24, No. 3. - P. 127-163.

12. Azam F., Hemmsingsen B.B., Volcani B.E. Role of silicon in diatom metabolism. V. Silicic acis transport and metabolism in the heterotrophic diatom Nitz-schia alba II Arch. Microbiol. 1974. - Vol. 97. - P. 103-114.

13. Becker В., Hoef-Emden K., Melkonian M. Clamydial genes shed light on the evolution of phototrophic eukaryots // BMC Evol. Biol. 2008. - Vol. 8. -Art. 203.-P. 1-18.

14. Bentley K., Cox E.J., Bentley PJ. Nature's Batik: a computer evolution model of diatom valve morphogenesis. // J. Nanosci. Nanotechnol. 2005. - Vol. 5, No. l.-P. 25-34.

15. Braun E.L., Philips N. Phylogenomic and secondary plastids: a look back and a look ahead // J. Phycol. 2008. - Vol. 44. - P. 2-6.

16. Brinker C.J., Scherer G.W. Sol-Gel Science: The Physics and Chemistry of Sol-Gel Processing. New York: Academic Press, 1990. - 908 p.

17. Bondarenko N.A., Timoshkin O.A., Ropstorf P., Melnik N.G. The under-ice and bottom periods in the life of Aulacoseira baicalensis (K. Meyer) Simonsen, a principal Lake Baikal alga // Hydrobiologia. 2006. - Vol. 568. - P. 107-109.

18. Brzezinski M.A., Olson R.J., Chisholm S.W. Silicon availability and cell-cycle progression in marine diatoms // Marine Ecology Progress Series. 1990. -Vol. 67.-P. 83-96.

19. Brzezinski M.A., Conley D.J. Silicon deposition during the cell cycle of Thalassiosira weissflogii (Bacillariophycea) determined using dual rhodamine 123 and propidium iodide staining // J. Physiology. 1994. - Vol. 30. - P. 45-55.

20. Cavalier-Smith T. Eukaryote kingdoms: seven or nine? // Biosystems. -1981.-Vol. 14.-P. 461-481.

21. Cavaler-Smith T. Principles of protein and lipid targeting in secondary sym-biogenesis: euglenoid, dinoflagellate, and sporozoan plastid origin and eukaryote family tree // J. Eukaryot. Microbiol. 1999. - Vol. 46. - P. 347-366.

22. Chisholm S.W., Azam R., Eppley R.W. Silicic acid incorporation in marine diatoms on lightrdark cycles: Use as an assay for phased cell division // Limnol. Oceanogr.- 1978.-Vol. 23, No. 3.-P. 518-529.

23. Darley W.M., Volcani B.E. Role of silicon in diatom metabolism. A silicon requirement for deoxyribonucleic acidsynthesis in the diatom Cylindrotheca fusiformis Reimann and Lewin // Exp. Cell Res. -1969. Vol. 58. - P. 334-343.

24. Denisova L.Ya., Befkova N.L., Tulokhonov 1.1., Zaichikov E.F. Bacterial diversity at various depths in the southern part of lake Baikal as revealed by 16S rDNA sequencing // Microbiology. 1999. - Vol. 68, No. 4. - P. 475-483.

25. Drum R.W., Pankratz S. Pyrenoids, raphes, and other fine structure in da-toms // Am. J. Bot. 1964. - Vol. 51. - P. 401-418.

26. Durbin R., Eddy S.R., Krogh A., Mitchison G.J. Biological sequence analysis: Probabilistic models of proteins and nucleic acids. Cambridge: Cambridge University Press, 1998. - 356 p.

27. Epstein E. The anomaly of silicon in plant biology // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1994.-Vol. 91.-P. 11-17.

28. Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap//Evolution. 1985. -Vol. 39.-P. 783-791.

29. Field C.B., Behrenfeld M.J., Randerson J.T., Falkowski P. Primary production of the biosphere: integrating terrestrial and oceanic components // Science.1998.-Vol. 281.-P. 237-240.

30. Fischer H., Robl I., Sumper M., Kroger N. Targeting and covalent modification of cell wall andmembrane proteins heterologously expressed in the diatom Cy-lindrotheca fusiformis (Bacillariophyceae) // J. Phycology. 1999. - Vol. 35. - P. 113-120.

31. Frigeri L.G., Radabaugh T.R., Haynes P.A., Hildebrand M. Identification of proteins from a cell wall fraction of the diatom Thalassiosira pseudonana II Mol. Cell. Proteomics.-2006.-Vol. 5.-P. 182-193.

32. Grachev M., Sherbakova T., Masyukova Yu., Likhoshway Ye. A potentional Zinc-binding motif in silicic acid transport proteins of diatoms // Diatom Res. -2005. Vol. 20, No. 2. - P. 409-411.

33. Grachev M.A., Annenkov V.V., Likhoshway Ye.V. Silicon nanotechnolo-gies of pigmented heterokonts // BioEssays. 2008. - Vol. 30. - P. 328-337.

34. Gordon R., Aguda B.D. Diatom morphogenesis: natural fractal fabrication of a complex microstructure. // Proc. of Ann. Intern. Conf. of the IEEE, Engineering in Medicine and Biology Society. 1988. - Vol. 1. - P. 273-274.

35. Gordon R., Drum R.W. The chemical basis for diatom morphogenesis. Int. Rev. Cytol. 1994. - Vol. 150. - P. 243-372, 421-422.

36. Gordon R., Parkinson J. Potential roles for diatomists in nanotechnology // J. Nanosci. Nanotechnol. 2005. -Vol. 5.-P. 51-56.

37. Hall T.A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT // Nucleic Acids Symposium Series.1999.-Vol. 41.-P. 95-98.

38. Hamm C.E., Merkel R., Springer O., Jurkojc P., Maier C., Prechtel K., Sme-tacek V. Architecture and material properties of diatom shells provide effective mechanical protection // Nature. 2003. - Vol. 421. - P. 841 -843.

39. Hildebrand M., Yolcani B.E., Gassmann W., Schroeder J.I. A gene family of silicon transporters // Nature. 1997. - Vol. 385. - P. 688-689.

40. Hildebrand M., Dahlin K., Volcani B.E. Characterization of a silicon transporter gene family in Cylindrotheca fusiformis: sequences, expression analysis, and identification of homologs in other diatoms // Mol. Gen. Genet. 1998. - Vol. 260. - P. 480-486.

41. Hildebrand M. Diatoms, Biomineralization Processes, and Genomics // Chemical Reviews. 2008. - Vol. 108, No. 11. - P. 4855-4874.

42. Hofmann K., Stoffel W. TMbase A database of membrane spanning proteins segments //Biol. Chem. Hoppe-Seyler. - 1993. - Vol. 374. - 166 p.

43. Horner R.A., Ecology of sea ice microalgae. In: R.A. Horner (ed.) Sea ice biota. Boca Raton, Florida: CRC Press, 1985. - P. 83-103.

44. Kaluzhnaya Ol.V. Valve morphogenesis in the centric diatom Cyclotella baicalensis In: Ye.V. Likhoshway (ed.) Proceeding of the 19th International Diatom Symposium. Bristol: Biopress Limited, 2008. - P. 31-38.

45. Kaluzhnaya Ol.V., Likhoshway Ye.V. Valve morphogenesis in an araphid diatom Synedra acus subsp. radians II Diatom Res. 2007. - V. 22, No. 1. - P. 81-87.

46. Klammt C., Lohr F., Schäfer B., Haase W., Dötsch V., Rüterjans H., Glau-bitz C., Bernhard F. High level cell-free expression and specific labeling of integral membrane proteins // Eur. J. Biochem. 2004. - Vol. 271. - P. 568-580.

47. Klammt C., Schwarz D., Eifler N., Engel A., Piehler J., Haase W., Hahn S., Dötsch V., Bernhard F. Cell-free production of G-protein coupled receptors for functional and structural studies. // J. Struct. Biol. 2007. - Vol. 158. - P. 482493.

48. Kooistra W.H.C.F., Medlin L.K. Evolution of the diatoms (Bacillariophyta): IV. A reconstruction of their age from small subunit rRNA coding regions and the fossil record // Mol. Phylogenet. Evol. 1996. - Vol. 6. - P. 391-407.

49. Kozono D., Yasui M., King L.S., Agre P. Aquaporin water channels: atomic structure and molecular dynamics meet clinical medicine // J. Clin. Invest. 2002. -Vol. 109.-P. 1395-1399.

50. Krebs W.N., Gladenkov A.Yu., Jones G.D. Diatoms in oil and gas exploration In: J.P. Smol and E.F. Stoermer (eds.) The Diatoms. Applications for the Environmental and Earth Sciences. 2nd Edition. New York: Cambridge University Press, 2010.-P. 523-533.

51. Kröger N., Bergsdorf C., Sumper M. A new calcium binding glycoprotein family constitutes a major diatom cell wall component // The EMBO Journal. -1994. Vol. 13. - P. 4676-4683.

52. Kröger N., Bergsdorf C., Sumper M. Frustulin: domain conservation in a protein family associat with diatom cell walls // Eur. J. Biochem. 1996. - Vol. 239, No. 2.-P. 259-264.

53. Kröger N., Lehmann G., Rachel R., Sumper M. Characterization of a 200-kDa diatom protein that is specifically associated with a silica-based substructure of the cell wall // Eur. J. Biochem. 1997. - Vol. 250. - P. 99-105.

54. Kröger N., Deutzmann R., Bergsdorf C., Sumper M. Polycationic peptides from diatom biosilica that direct silica nanosphere formation // Science. 1999. -Vol. 286.-P. 1129-1132.

55. Kröger N., Deutzmann R., Bergsdorf C., Sumper M. Species-specific po-lyamines from diatoms control silica morphology // Proc. Nat. Acad. Sei. USA. -2000.-Vol. 97, No. 26.-P. 14133-14138.

56. Kröger N., Wetherbee R. Pleuralins are involved in theca differentiation in the diatom Cylindrotheca fusiformis H Protist. 2000. - Vol. 151. - P. 263-273.

57. Kröger N., Deutzmann R., Sumper M. Silica precipitating peptides from diatoms: The chemical structure of silaffin-lA from Cylindrotheca fusiformis II J. Biol. Chem. -2001. Vol. 276. - P. 26066-26070.

58. Kröger N., Lorenz S., Brunner E., Sumper M. Sell-assembly of highly phos-phorylated silaffins and their function in biosilica morphogenesis // Sience. 2002. -Vol. 298, No. 5593. - P. 584-586.

59. Kröger N., Poulsen N. Diatoms from cell wall biogenesis to nanotechnolo-gy // Annu. Rev. Genet. - 2008. - Vol. 42. - P. 83-107.

60. Krögh A., Larsson B., von Heijne G., Sonnhammer E.L. Predicting transmembrane protein topology with a hidden markov model: application to complete genomes // J. Mol. Biol. -2001. Vol. 305, No. 3. - P. 567-580.

61. Kruse E., Uehlein N., Kaldenhoff R. The aquaporins // Genome Biol. -2006. Vol. 7, Is 2. - Art. 206. - P. 1-7.

62. Mann D.G. The origins of shape and form in diatom: the interplay between morphogenetic studies and systematic: D.S. Ingram and A.J. Hudson (eds.) Shape and form in plants and fungi- London academic Press, 1994. P. 17-38.

63. Martin-Je' ze' quel V., Hildebrand M., Brzezinski M. A. Silicon metabolism in diatoms: Implications for growth // J. Phycol. 2000. - Vol. 36. - P. 821-840.

64. Medlin L.K. Why silica or better yet why not silica? Speculations as to why the diatoms utilize silica as their cell wall material // Diatom Res. 2002. - Vol. 17, No 2.-P. 453-459.

65. Medlin L.K., Kaczmarska I. Evolution of the diatoms: V. Morphological and cytological support for the major clades and a taxonomic revision // Phycologia. -2004.-Vol. 43.-P. 245-270.

66. Miller J.R., Koren S., Sutton G. Assembly Algorithms for Next-Generation Sequencing Data // Genomics. 2011. - Vol. 95. - P. 315-327.

67. Noll F., Sumper M., Ilampp N. Nanostructure of diatom silica surface and biomimetic analogues // Nano Lett. 2002. - Vol. 2, No. 2. - P. 91-95.

68. Parker M.S., Mock T., Armbrust E.V. Genomic insights into marine micro-algae//Annu. Rev. Genet.-2008.-Vol. 42.-P. 619-645.

69. Parkinson J., Brechet Y., Gordon R. Centric diatom morphogenesis: a model based on a DLA algorithm investigating the potential role of microtubules //Biochim. Biophys. Acta. 1999. - Vol. 1452, No. l.-P. 89-102.

70. Pickett-Heaps J., Schmid A-M., Edgar L.A. The cell biology of diatom valve formation // In: F.E. Round and DJ. Chapman (ed.) Progress in Phycological Research. 1990.-Vol. 7.-P. 1-168.

71. Poulsen N., Sumper M., Kröger N. Biosilica formation in diatoms: Characterization of native silaffin-2 and its role in silica morfogénesis // PNAS. 2003. -Vol. 100, No 21.-P. 12075-12080.

72. Poulsen N., Kröger N. Silica Morphogenesis by alternative processing of si-laffms in the diatom Thalassiosira pseudonana II J. Biol. Chem. 2004. - Vol. 279, No. 41. - P. 42993-42999.

73. Reimann B.E.F. Deposition of silica inside a diatom cell // Exp. Cell. Res. -Vol. 34.-P. 605-608.

74. Richthammer P., Bormel M., Brunner E., van Pie K.-H. Biomineralization in diatoms: The role of silacidines // ChemBioChem. 2011. - Vol. 12. - P. 13621366.

75. Riley J.P., Skirrow G. Chemical Oceanography. New York: Academic Press, 1965.-Vol. 1,- 169 p.

76. Round F.E., Crawford R.M., Mann D.G. The diatom: morphology and biology of the genera. Bristol: Cambridge University Press, 1990. - 747 p.

77. Round F. What characters define diatom genera, species and infra-specific taxa? // Diatom Res. 1996. - Vol. 11, No. 1. - P. 203-218.

78. Saitou N., Nei M. The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees // Mol. Biol. Evol. 1987. - Vol. 4. - P. 406-425.

79. Safonova T.A., Aslamov I.A., Basharina T.N., Chenski A.G., Vereschagin A.L., Glyzina O.Yu., Grachev M.A. Cultivation and automatic counting of diatom algae cells in multi-well plastic plates // Diatom Res. 2007. - Vol. 22, No. 1. -P. 189-195.

80. Scala S., Carels N., Falciatore A., Chiusano M.L., Bowler C. Genome properties of the diatom Phaeodactylum tricornutum II Plant Physiol. 2002. - Vol. 129.-P. 993-1002.

81. Scheffel A., Poulsen N., Shian S., Kröger N. Nanopatterned protein microrings from a diatom that direct silica // PNAS. 2011. - Vol. 108, No. 8. - P. 3175-3180.

82. Schkoda P., Hechler A., Kessler H.G. Effect of minerals and pH on rheolog-ical properties and syneresis of milk-based acid gels // Intern. Dairy J. 1999. -Vol. 9.-P. 269-273.

83. Schmid A., Schulz D. Wall morphogenesis in diatom: depositions of silica by cytoplasmic vesicles // Protoplasma. 1979. - Vol. 10. - P. 268-288.

84. Simpson T.L., Volcani B.E. (eds.) Silicon and Siliceous Structures in Biological Systems. New York: Springer-Verlag New York, Inc., 1981. - p. 587.

85. Sims P. A., Mann D.G., Medlin L.K. Evolution of the diatoms: insights from fossil, biological and molecular data // Phycologia. 2006. - Vol. 45, No. 4. - P. 361-402.

86. Sorhannus U. A nuclear-encoded small-subunit ribosomal RNA timescale for diatom evolution // Mar. Micropaleontol. 2007. - Vol. 65. - P. 1-12.

87. Spirin A. High-throughput cell-free systems for synthesis of functionally active protein // Trenda Biotechnol. 2004. - Vol. 22. - P. 538-545.

88. Sullivan C.W. Diatom mineralization of silicic acid. II. Regulation of Si(OH)4 transport rates during the cell cycle of Navicula pelliculosa II J. Phycol. -1977.-Vol. 13.-P. 86-91.

89. Tesson B., Hildebrand M. Dynamics of silica cell wall morphogenesis in the diatom Cyclotella criptica: substructure formation and the role of microfilaments // J. Struct. Biol. 2010. - Vol. 169. - P. 62-74.

90. Thamatrakoln K., Hildebrand M. Approaches for functional characterization of diatom silicic acid transporters // J. Nanosci. Nanotechnol. 2005. - Vol. 5. - P. 1-9.

91. Thamatrakoln K., Alverson A., Hildebrand M. Comparative sequence analysis of diatom silicon transporter: toward a mechanistic model of silicon transport // J. Phycol. 2006. - Vol. 42. - P. 822-834.

92. Thamatrakoln K., Hildebrand M. Analysis of Thalassiosira pseudonana silicon transporters indicates distinct regulatory levels and transport activity through the cell cycle // Eucaryot. Cell. 2007. - Vol. 6, No. 2. - P. 271-279.

93. Thamatrakoln K., Hildebrand M. Silicon uptake in diatoms: a model for saturable and nonsaturable uptake kinetitics and the role of silicon transporters // Plant Physiol.-2008.-Vol. 146.-P. 1397-1407.

94. Thamatrakoln K., Kustka A.B. When to say when: can excessive drinking explain silicon uptake in diatoms? // BioEssays. 2009. - Vol. 31. - P. 322-327.

95. Thompson A.S., Rhodes J.C., Pettman I. Culture collection of algae and protozoa. Catalogue of strains. England: Natural Environment Research and Council, 1988.- 164 p.

96. Tiffany M.A. Valve morphogenesis in the marine araphid diatom Gephyria media (Bacillariophyceae) // Diatom Res. 2002. - Vol. 17. - P. 391-400.

97. Treguer P., Nelson D.M., Van Bennekom A.J., DeMaster D.J., Leynaert A., Queguiner B. The silica balance in the world ocean: A reestimate // Science. -1995.-Vol. 268.-P. 375-379.

98. Tusnady G.E., Simon I. Principles governing amino acid composition of integral membrane proteins: applications to topology prediction // J. Mol. Biol. -1998-Vol. 283.-P. 489-506.

99. Van de Poll W.H., Vrieling E.G., Gieskes W.W.C. Location and expression of frustulins in the Cylindrotheca fusiformis, Navicida pelliculosa, and Navicula salinarum (Bacillariophyceae) // J. Phycology. 1999. - Vol. 35. - P. 1044-1053.

100. Volcani B.E., Simpson T.L. Cell wall formation in diatoms: morphogenesis and biochemistry. In: Silicon and Siliceous Structures in Biological Systems. -Berlin: Springer-Verlag, 1981.-P. 157-200.

101. Vrieling E.G., Beelen T.P.M., Santen R.A.V., Gieskes W.W.C. Diatom silicon biomineralization as an inspirational source of new approaches to silica production // J. Biotechnol. 1999. - Vol. 70. - P. 39-51.

102. Vrieling E.G., Sun Q., Tian M., Kooyman P.J., Gieskes W.W.C., van Santen R.A., Sommerdijk N.A. Salinity-dependent diatom biosilicification implies an important role of external ionic strength // PNAS. 2007. - Vol. 104. - P. 1044110446.

103. Wernersson R. Virtual Ribosome a comprehensive DNA translation tool with support for integration of sequence feature annotation // Nucl. Acids Res. -2006.-Vol. 34.-P. 385-388.

104. Wilkins M.R., Lindskog I., Gasteiger E., Bairoch A., Sanchez J.-C., Hoch-strasser D.F., Appel R.D. Detailed peptide characterisation using PEPTIDEMASS- a World-Wide Web accessible tool //Electrophoresis. 1997. - Vol. 18. - P. 403-408.

105. Wistrand M., Sonnhammer E.L. Improved profile HMM performance by assessment of critical algorithmic features in SAM and HMMER // BMC Bioinfor-matics. 2005. - Vol. 6. - P. 1-10.

106. Zuckerkandl E., Pauling L. Evolutionary divergence and convergence in proteins: V. Bryson and H.J. Vogel (eds.) Edited in evolving genes and proteins by -New York: Academic Press, 1965. P. 97-166.

107. Zurzolo C., Bowler C. Exploring bioinorganic pattern formation in diatoms. A story of polarized trafficking // Plant Physiol. 2001. - Vol. 127. - P. 13391345.

Информация о работе