Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Оплодотворяющая способность спермиев и их биохимические показатели в средах с применением эталона

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Оплодотворяющая способность спермиев и их биохимические показатели в средах с применением эталона"

ЕРЕВАНСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

МЕЛКСШН ЖАННА СЕРГЕЕВНА

ПЛОДОТВОРШЦАЯ СПОСОБНОСТЬ СПЕРМИЕВ И ИХ БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ В СРЕДАХ С ПРИМЕНЕНИЕМ ЭТАНОЛА

(03.00.04 - биохимия)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ереван - 1991

Работа выполнена в лаборатории кафедры акушерства Ереване! го ордена "Знак Почета" зоотехническо-ветеринарного института.

Научный руководитель - доктор ветеринарных наук, профессор

заслуженный деятель науки Арм.ССР А.О.Манасян

Консультант по биохимии - доктор биологических наук

Р.Г.Камалян

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор

С.С.Оганесян

кандидат биологических наук Ю.В.Тадевосян

Ведущее учреждение - Ереванский ордена Трудового Красного Знамени государственный медицинский институт имени Мхитара Гераци

Защита диссертации состоится "30" 1991 г.

в I М-часов на заседании специализированного совета К 055.01.08 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при Ереванском ордена Трудового Красного Знамени государственном университете 375049, Ереван, ул.Мравяна I, Ереванский госуниверситет, биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета.

Автореферат разослан "_

ЩЦнЯЛЬА 1991г.

Ученый секретарь

специализированного совета, р

кандидат отологических наук --'Л.Г.Ананян

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность теш. В странах с культурным жквотноводст-ом широко применяется осеменение овцематок и коров спермой, сох-аненной как при плюсовых температурах (2-4°С), так и в глубоко-хлааденном состоянии (-196°С). Это позволяет быстро наращивать енетпческий потенциал при выведении новых пород во всех видах елекции, включая крупномасштабную. В этих условиях синтетические реды и способы охлавдения сперт приобретают решающее значение, чеными, специалистами-практиками нашей страны разработаны и пред-[ожены для широкого применения синтетические среды, которые посто-нно совершенствуются и подвергаются значительной модернизации. 1меется достаточно данных о сохранении разбавленной спермы быка и ¡арана при плюсовых температурах, хотя удовлетворительную переяи-¡аемость в таких разбавителях удается поддерживать лишь в течение )дного-двух дней. Следует отметить, что результативность искусст-¡енного осеменения значительно снижается при использовании спермы, (ранившейся более 24 часов при плюсовых температурах. Остается по-греянему на низком уровне оплодотворяемость маток от применения сриоконсервированной спермы. Исходя из этого, надо признать, что цальнейшее совершенствование технологии длительного хранения сперли быка и барана по-прежнему остается актуальным.

1.2. Цель и задачи исследований. Цель работы - совершенствование технологии сохранения половых гамет барана и быка путем разработки универсальной защитной среды для разбавления и последующего хранения спермы как при положительных (2-4°С), так а отряцатель-шх температурах (-196°С).

Поскольку эдноЗ из главных задач в области теорсгл?9сетх г

прикладных исследований по замораживанию спермы является изучение механизмов криоповреадений и изыскание новых криопротехторов, в з? дачи исследований входило:

1. Изучить влияние этанола и этанолашна как потенциальных мембранных стабилизаторов на дыхательную активность и физиологические свойства спермиев.

2. Разработать новый метод оценки качества спермы.

3. Разработать новый вариант защитной среды дугя заыораживанш спермы барана и быка и испытать ее в производственных условиях.

1.3. Научная новизна работы.

1. Разработаны новые универсальные защитные среды для краткосрочного и длительного сохранения спермы барана и быка при плюсовых (2-4°С) и минусовых (-196°С) температурах.

2. Впервые в состав сред для разбавления и сохранения спермы барана и быка в качестве стабилизатора мембранных фосфолипидов и криопротектора введен этанол, способствующий повышению биологической полноценнооти спермы и результативности искусственного осеменения овцематок и коров.

3. Изучен уровень активности сукцинатдегидрогеназы в сперыия: барана путем подсчета количества гранул формазана в митохондриях головок половых клеток.

1.4. Основные положения, выносимые автором на защиту.

1. Применение новых биологических сред для краткосрочного и длительного хранения спермы барана и быка.

2. Определение дыхательной активности (сукцинатдегидрогеназы спермиев.

3. Стимулирование этанолом оплодотворяющей способности спершев. '

1.5. Практическая ценность работы. Разработанные этанол-цит-)атпая и этанол-лалтозо-жлто-тао-цитратно-глкцериновая среды дяя сраткосрочного и длительного гранения спермы барана и бнка позволяют :

1. Сохранить на более высоком уровне биологическую полноцен-юсть спермиев и прогнозировать их оплодотворяющую способность.

2. Исключить желток куриного яйца при сохранении спермы в условиях 2-4°С и снизить его объем до 2% при сохранении спермы при -196°С.

3. При осеменении овцематок спермой, разбавленной в новом и базовом вариантах при 2-4°С,. экономический -эффект в опытной группе после получения приплода в перерасчете на одну овцематку составляет 1,68 руб., при осеменении же овцематок и коров спермой, замороженной в открытых гранулах, экономический эффект составляет соответственно 0,59 руб. и 8,77 руб.

4. Предложено использование дешевого, эффективного, недефицитного компонента - этанола.

1.6. Апробация. По материалам диссертации сделаны сообщения: на расширенном заседании кафедры акушерства, гинекологии и искусственного осеменения с.-х. животных Ереванского зоотехническо-ветери-нарного института, на объединенном заседании кгфедры биохимии и научно-исследовательской лаборатории сравнительной и эволюционной биохимии биологического факультета EI7.

1.7. Публикаций результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 8 статей.

1.8. Внедрение результатов исследований. Проведена производственная проверка этаноловых сред при искусственном осеменении овец и коров в хозяйствах Раздаяского, Ехегнадзорского и Арталат-

ского районов Армении и внедрение этанол-нитратной среда в Раздан-ском районе.

1.9. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста, состоит из общей характеристики работы, обзора литературы, материала и методик исследований, результатов собственных исследований, их обсуждения, расчета экономической эффективности, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Сшсок литературы включает 93 названия цитируемых литературных источников. Диссертация содержит 21 таблицу.

2. Материал и методы исследований. Экспериментальные исследования проводились на 10 баранах- и 2 быках-производителях Мхчян-ской станции искусственного осеменения республики Армения и 4 баранах-производителях при кафедре акушерства, гинекологии и искусственного осеменения Ереванского ордена "Знак Помета" зооветеринарно] института. Лабораторные исследования проводились на кафедре и на Мхтанской госплемстанции.

Производственные испытания проводились на овцематках в совхозах Разданского и Ехегнадзорского районов, а на коровах - в колхозе Мхчян Арташатского района.

За опытный период с 1986-1989гг. всего использовано 14950 спермодоз барана и быка. В экспериментальных целях испытаны 5800 спермодоз, из которых 2560 - быка и 3240 - барана. Для производственных испытаний получено 9150 спермодоз, которыми были осеменены 270 коров и 8880 овцематок.

Выполнены физиологические, морфологические и биохимические исследования спермиев в средах с применением этанола. Параллельно исследовалась сперма в контрольных средах без этанола. Использовалась сперма здоровых животных и подвергалась разбавлению и хране-

;ию как при плюсовой температуре (2-4°С), так и после глубокого загораживания (-196°С) и оттаивания.

Разбавленную сперму баранов (1:4) балбасской и северокавказ-:кой пород, быков (1:10) - голштинофризской порода подвергали изу-гению на подвижность, выживаемость, с установлением процента спер-лиев с неповрежденной акросомой после их выдержки, а также после оттаивания криоконсервированной спермы.

Оценку качества спермы проводили согласно общепринятым методам.

2.1. Методика количественного определения сукпинатдегижюге-ггазы в митохондриях головок спермиев барана (по Р.П.Нарписсову. 1969). Для выявления сукцинатдегидрогеназы инкубационную средг готовили следующим образом: в 10 мл дистиллированной вода растворяли 540 мг сукцината натрия. Затем добавляли 10 мл I/I5M фосфатного буфера (рН-7,2) и 10 мл раствора п-нитротетразолия фиолетового ( I мг/мл). Б этой смеси растворяли 13 мг сухого трилона Б (динатрие-вой соли этилендааминтетрауксусной кислоты), рН доводили до 7,2, прибавляя дистиллированную воду до общего объема в 40 мл. Эту порцию раствора использовали для обработки 40-50 мазков. Она пригодна для употребления в течение 1-2 недель при хранении в холодильнике.

Для представления энзиматической активности в числовых выражениях от мазков каждой среда (базовой и новых) трехдневного хранения на 45 препаратах подсчитывали количество гранул формазана в 150 головках спермиев под поляризационно-интерференционным микро- ^ скопом при увеличении 15x40.

2.2. Методика полярографического измерения дыхания спермиев. Дыхательную активность спермиев регистрировали с помощью платинового электрода на полярографе марки ¿Р-7. В основе метода лежат

электрические измерения, а именно измерения силы тока, возникшего в результате восстановления кислорода на катоде при наложении на микроэлектроды определенного напряжения. Величина этого тока зависит от напряжения на электродах и от концентрации кислорода в раст воре.

Ход эксперимента

За 20-30 минут до начала опыта на электроды подается рабочее напряжение (0,6 И), что необходимо для лучшей стабилизации их рабо ты. За это время ячейка, заполненная реакционной смесью, прогревается в термостатируемой камере до 26°С. Затем с помощью регулятора чувствительности, при включенной мешалке подбирается нужный уровень записи на ленте самописца. Выждав, когда на ленте пропишется не уклоняющаяся в стороны линия, в инкубационную среду вносится среда со сперматозоидами, затем добавляется данитрофенол.

Суспензии инкубируются при температуре 28°С в течение 2 минут в I мл инкубационного состава (в мМ/мл): сахароза - 100 мМ, KHgPO^ - 1,5 мМ, КС1 - 60 мМ, трис-HCl - 1,5 мМ, рН - 7,45. рН среда инкубации доводили с помощью растворов НС1 и КОН.

В качестве субстрата окисления использовали янтарную кислоту в количестве 10 мМ. Добавки делали сразу до погружения среды в ячейку. Среду инкубации и эти компоненты готовили на дважды перегнанной дистиллированной воде.

Потребление кислорода спермиями регистрировали в различных метаболических состояниях:

1. Дыхание в присутствии субстрата окисления - v^.

2. Разобщенное дыхание спермиев, стимулируемое присутствием динитрофенола. Потребление кислорода спермиями, рассчитанное в еда ницу времени, т.е. скорость дыхания, выраженная в НГАТД^/сек, прс

- 7 -

а вводится по следующей формуле:

потребление кислорода = V = -а:А'10,

где А - исходная концентрация кислорода в НГАТ/л

(известно, что' в I л среды при 26°С и атмосферном давлении 760 мл рт.ст. растворено 500 мМ А02- В условиях Еревана, где атмосферное давление ниже 680, содержание О2 в I мл раствора соответственно составляет 450 МА0£);

а - проекция наклонной данного участка подпрограммы, см;

В - общая длина регистрационной шкалы, см;

в - время дыхания спермиев, сек.

■ 2.3. Разработка среды для глубокого замораживания спермы баранов- и быков-производителей. С целью разработки среды дая хранения спермы баранов- и быков-производителей в условиях кидкого азота были подобраны различные концентрации глицерина, лактозы и желтка куриного яйца. В результате многочисленных опытов составлено 25 вариантов испытуемых сред.

При разработке защитной среда для глубокого замораживания спермы барана основой послужила лактозо-желточно-гуммиарабико-трис-цитратно-глицериновая среда, предложенная Е.М.Платовым, а для крио-консервации спермы быков-производителей - лактозо-яелточно-глицери-новая среда.

2.4. Производственное испытание. Задача производственной проверки заключалась в испытании разработанных сред при 2-4°С и -196°С на определенном поголовье овцематок и коров и определении экономической эффективности от их применения при искусственном осеменении животных.

Производственную проверку проводили по схемам, представленных в таблицах 2.1 и 2.2.

Таблица 2.1

Схема производственной проверки для баранов-производителей

Температура хранения спермы Варианты Незамороженная сперма Года Поголовье гол.

базовый глшозо-желточно-цнтратная 1986 1987 1988 730 980 382

2-4°С этанол-цитратная этаноламин-цитратная 1986 748 722

новый этанол-цитратная этаноламин-цитратная 1987 ' 386 373

этанол-цитратная этаноламин-цитратная 1988 771 384

этанол-цитратная 1989 1352

Замороженная сперма

-196°С базовый лактозо-келточно-гуммиара- бино-трис-цитратно-глице- риновая 1988 1000

новый этанол-лахтозо-желточно-цитратно-глицериновая 500

Таблица 2.2

Схема.производственной проверки для быков-производителей

Температура хранения спермы Варианты Криопротекторы Год Осеменен коров

-196°С базовый новый лактозо-желточно-глицериновый этанол-лактоэо-желточно-цитратно-глицериновый 1988 120 150

Первые опыты по осеменению овец были поставлены в колхозе 'Раздан" Разданского района на 1500 животных, затем - в совхозе 'Алаларс" того же района соответственно на 1739 и 1537 овцематках. Зсе поголовье было осеменено спермой, разбавленной и сохраненной зри 2-4°С. Животные были клинически здоровы и имели среднюю упитанность. Поголовье овец делили на опытные и контрольную группы и в сезон осеменения отмечали специальной краской на разных частях туловища. Овцематок в охоте отбирали ежедневно по утрам в течение 20 дней и осеменяли в течение дня однократно спермой в дозе 0,1 мл, сохраненной в зтанол-цитратной, этаноламин-цитратной и глюкозо-келточно-цитратном разбавителях. Овцематки, пришедшие в охоту, утром следующего дня обязательно осеменялись вторично. Для осеменения в опытах использовали аякуляты с концентрацией не ниже 2,5 млрд/мл и подвижностью не менее 8 баллов.

Осеменение нриоконсервированной спермой проводили в совхозе "Агаракадзор" Ехегнадзорского района. Свежеполученную сперму баранов-производителей делили на 2 части - опыт и контроль. В качестве базового варианта служила лактозо-желточно-гуммиарабико-трис-цит-ратно-глицериновая среда. Разбавленную сперму (1:4) зквилибрирова-ли в течение 2 часов. По истечении этого времени сперму замораживали в открытых гранулах по 0,2 мл на фторопластовой пластине в парах жидкого азота. Гранулн хранили в сосудах Дьюара. Подвижность спервдев определяли сразу же после замораживания, затем по истечении 10 и 28 дней. Для этого оттаивали по одной грануле с каждой группы во флаконах с 2,9$ раствором лимоннокислого натрия в водяной бане при температуре 40-42°. Сперму, имеющую подвижность ниже 4 баллов, выбраковывали. Осеменение проводили в течение 20 дней однократно в дозе 0,15-0,20 мл. Учет результатов ягнения проводили

только по первому осеменению, т.е. учитывали только тех маток, которые были осеменены в первые 20 даей.

Научно-производственный опыт по осеменению коров был поставлен на двух группах - по 150 (опыт) и 120 (контроль) в каждой. Koi тролем служила лактозо-желточно-глицериновая среда.

Полученный цифровой материал обрабатывали по методике Н.П.Плс хинского (IS69) с применением программируемой электронно-вычислительной машины EC-I036.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Действие компонентов сред-разбавителей на Физиологические свойства спешиев. Задача заключалась в изучении действия компонентов сред на физиологические свойства спермиев как при 2-4°С, так и -196°С.

В связи с поставленной задачей на основании подбора различных компонентов было составлено 12 вариантов сред дня сохранения спермы в условиях 2-4°С.

В первой серии опытов была испытана глюкозо-желточно-цитрат-ная среда с заменой цитрата натрия этанолом - в одном случае и этаноламином - в другом. В последующих опытах из глюкозо-желточно-этаноловой и глюкозо-желточно-этаноламиновой сред исключались глюкоза - в одном случае, а в другом - желток и в третьем - глюкоза и желток одновременно. В серии дальнейших опытов испытывали сочетг ние цитрата натрия с этанолом и этаноламином в различных концентрг циях, без санирующих средств.

Результаты сравнительного испытания различных сред при 2-4°С показали, что наиболее благоприятное действие на физиологические свойства свежеразбавленной спермы оказывает содержание в среде

,05 мл этанола (или этаноламина) и 2,8 г цитрата натрия, на осно-ании чего и был определен состав сред для разбавления и сохранена спермы барана:

. вода дистиллированная, мл - 100 этанол, ш - 0,05

цитрат, г - 2,8

. вода дистиллированная, т - 100 этаноламин, мл - 0,05

цитрат, г -2,8

Среды нейтрализовались насыщенным раствором янтарной кислоты, .к. для поддержания энергетического потенциала спермиев -и нормаль-ого протекания энергопоставляющих процессов она является наиболее ффективным дыхательным субстратом.

При изыскании защитных сред для сохранения спермы барана и ыка в условиях глубокого замораживания бшго составлено 24 вариан-а сред. При этом базовой средой для спермы баранов-производителей луяила лактозо-желточно-гуммиарабико-трис-цитратно-глицериновая рода, а для быков-производителей - лактозо-желточно-глицериновая.

Основываясь на полученных результатах, мы пришли к выводу, что птимальный вариант состава среды при замораживании спермы барана : быка включает следующие ингредиенты: вода дистиллированная, ил -.00, лактоза, г. - 11,5, цитрат натрия, г - 1,0, глицерин, мл - 4,0, 1танол, мл - 0,5, желток куриного яйца, мл - 2,0.

3.2. Количественное определение сукгошатдегидрогеназы в мито-:ондриях спермиев барана. Сперши содержат значительное количество гатохондрий, участвующих в образовании, накоплении и трансформации шергии. Отсюда целостность митохондрий и мембраны являются одним гз важнейших показателей сохранности биологических и физиологиче-ясих функций спермиев. Одним из дыхательных ферментов, прочно

встроенным во внутреннюю мембрану митохондрий, является сукцинатд€ гидрогеназа - наиболее активная из дегкдрогеназ. Больше всего ее содержится в спермиях барана. Наряду с этим установлено, что у прс изводителей с высокой ферментативной активностью проявляется и нас высшая оплодотворяющая способность спермиев. Отсюда можно заключит что интенсивность обменных процессов в половых клетках оказывает существенное влияние на их биологическую акт::вность. Сукцшатдегщ рогеназа в процессе окисления сукцината обеспечивает введение эле! тронов в систему терминального окисления, в наибольшей мере обусловливая оптимальную для оплодотворения интенсивность метаболичес-дах процессов.

Исходя из вышеизложенного, мы изучали уровень активности сук-цинатдегидрогеназы в спермиях барана путем подсчета количества грг нул формазана в митохондриях головок половых клеток. Данные обобще ны в таблице 3.1.

Таблица 3.1

Активность сукцинатдегидрогеназы в митохондриях спермиев барана (п = 50)

Количество гранул в головке спермия

Я Среди

дни хранения

I

П

Ш

I Этанол-

8,52±0,20 7,82±0,24 7,1610,23 Р<0 01 Р<0,02 Р< 0,001

2 Этаноламин-цитратная (новая)

8,10±0,23 7,42+0,24 6,66±0,21 Р > 0,25 Р> 0,25 Р< 0,05

3 Глюкозо-

желточно-цитратная (базовая)

7,68±0,23 6,94^.0,24 6,02^0,21

Данные таблицы свидетельствуют о более высокой выработке энергии в этанол-цитратной и этаноламин-цитратной средах по сравнению с глюкозо-келточно-цитратной средой. Отмечается также некоторое повышение активности сунцинатдегндрогеназы при наличии этанола по сравнению с этаноламином.

Таким образом, этаноламин и, в г^обенности, этанол путем лучшей энергизации митохондрий должны, по-видимому, способствовать

»

повышению активности и оплодотворяющей способности спермиев.

3.3. Определение дыхания спермиев методом полярографии. Известно, что в оценке качества спермы с.-х. животных важным критерием является синтез макроэргов (АТФ).

Уровень АТФ и функциональное состояние энергетической системы имеют высокую связь с подвижностью и оплодотворяющей способностью спермиев (А.Д.Курбатов, 1988). В связи с этим изучалось влияние предложенных сред на энергетическую характеристику половых клеток полярографическим методом регистрации потребления кислорода.

Дыхание спермиев регистрировали в инкубационной смеси, состав которой приведен в разделе "Материал и метода".

Потребление кислорода спермиями регистрировали как в пробе с добавлением дшштрофенола, так и без него.

В ходе исследований было выявлено, что добавление акцептора фосфата (АД5), а также субстратов окисления не оказывало никакого влияния на дыхание сиершев, что, по-видимому, связано с наличием богатого эндогенного фона субстратов в клетках.

В связи с этил был использован 2,4-динитрсфенол - разобпитель окислительного фосфорилирования, как стимулятор дыхательной активности.

Данные по дыхательной активности спермиев в различных апроби-

руемых средах приведены в таблице 3.2.

Таблица 3.2

Показатели скорости дыхания спермпев в различных средах (НГАТ 0?/сек мг белка)

Дай исследований по мере хранения

Среды I П Ш I П Ш

-да ' +да

Этанол-цитратная 2,31* (новая) 0Д2 Р<0,002 1.65* 0,17 Р<0,01 1,23* 0,12 Р< 0,001 2,72* 0,12 Р<0,001 2,07* 0,18 Р<0,01 1,54* 0,14 Р< 0,001

Этаноламин- цитратная (новая) 2,14* 0,13 Р> 0,05 1/-7± 0,15 Р<0,05 0,90* 0,15 Р> 0,05 2,55* 0,13 ?< 0,02 1,84* 0,11 Р<0,05 1,27* 0,21' Р> 0,05

Глюкозо-жел-точно-цитрат-ная (базовая) 1,701 0,18 0,96* 0,17 0,55* 0,12 2,04* 0,16 1,34* 0,18 0,71* 0,30

Выявлено, что независимо от срока хранения среды, дыхание спермпев в присутствии динитрофенола статистически достоверно (Р< 0,001) превышает таковое в отсутствии разобщителя, что само по себе может свидетельствовать о сопряженности процессов окислительного фосфорилирования.

Несмотря на ослабление окислительной способности половых клеток по мере увеличения срока хранения от I до 3 суток, дыхание

клеток, сохраненных в средах с этанолом и этаноламином, было наибо-п

лее высоким по сравнению с базовой средой.

Полученные данные свидетельствуют о том, что этанол и этанол-амин способствуют более эффективному использованию энергетических ресурсов, не исключено их использование в качестве субстратов дыхания. Однако, более вероятна оптимизация функциональной деятельности плазматических и митохондриалышх мембран спермиев через стаби-

лизацию их структуры путем изменения фосфолипидного микроокружения.

Результаты доведенных исследований позголяют считать, что разработанные наш среды могут успешно использоваться в практике искусственного осеменения.

3,4. Результаты научно-производственного опыта осеменения овцематок и коров спермой, сохраненной при 2-4°С и -196°С. Результаты научно-производственного испытания разработанных сред.дая сохранения спермы в условиях 2-4°С приведены в таблице 3.3.

Оплодотворяемость маток, осемененных спермой, разбавленной этанол-цитратной средой, была выше (73,4-78,6$), чем в этансяамин-цитратной (71,5-74,5$), т.е. в опытных группах процент оплодотво-ряемости по годам регистрировался от 12 до выше, чем в контрольных группах. •

Выход ягнят от каждых 100 овец в 1986-1987 гг. был практически одинаков с незначительным перевесом в опытных хрушах, а в 1988 г. в опытной группе на 10 ягнят было больше, чем в контроле.

С целью выяснения оплодотворяющей способности спермы барана, замороженной в этанол-лактозо-желточно-цитратно-глицериновой среде был поставлен научно-производственный опыт в совхозе "Агаракадзор" Ехегнадзорского района.

Результаты производственного испытания этаноловой среды при сохранении спермы в условиях -196°С приведены в таблице 3.4.

Данные таблицы 3.4 показывают, что оплодотворяемость маток, осемененных этанол-лактозо-желточно-цитратно-глицериновой средой по сравнению с контрольной повышается на 5,6/?.

В дальнейших исследованиях ставилась задача выяснить, не оказывает ли какого-либо отрицательного влияния сохранение спермы в разработанных средах на потомство.

Таблица 3.3

Показатели научно-производственного испытания разработанных сред при 2-4°С

Годы Осеменено овце- Количество маток спермой, осемененных разбавленной? ; овцематок Объягнилось овцематок % оплодо- Получено ягнят

всего в т.ч. двойни творения всего от 100 обьяг-нивпахся маток

Этанол-цитратной (новая) 748 549 21 73,4 570 103,8

1986 Этаноламин-цит-ратной (новая) 722 520 14 . 72,0 534 102,7

Глюкозо-желточно-цитратагой (базовая) 730 426 10 58,3 436 102,3

Этанол-цитратной (новая) 386 290 16 75,1 • 306 105,5

1987 Этаноламин-цит-ратной (новая) 373 265 10 71,5 275 103,7

Глзокозо-желточнсн • цитратной (базовая) 980 588 7 60,0 595 101,2

Этанол-цитратной (новая) 771 606 85 78,6 691 114,0

1988 .Этаноламин-цит-ратной (новач) 384 286 25 74,5 311 108,7

Глюкозо-желточно-цитратной (базовая) 382 237 . 10 62,0. 247 104,2

1989 Этанол-цитратной (новая) 1352 1037 128 76,7 1165 112,3

СП I

Таблица 3.4

Результаты научно-лроизводетвепного испытания зтанол-лактозо-желточно-цитратно-глицериновой среды

Получено ягнят

Наименование сред

Л

О И О М

к о о о

СО 6-1 ч ь

М Й Э оз

Ф 3 Э з

3 <В и) И е§

о д о

О О

си

о Ч о

м «

Ч о

« в

о л сй

и X) д

ф о

о «

я о Й

О X

м ^ ^

о

Этанол-лактозо-желточно-•дитратно-глицещновая (новая)

500 334 66,8

354 106,0

Тактозо-желточно-гумми-

фабико-трис-цитратно- 1000 612 61,2 620 101,3 ■■лицериновая (базовая)

Для выяснения этого вопроса проводили взвешивание ягнят при юждении и при отбивке.

Результаты по отдельным годам исследований приведены в таблицах 3.5, 3.6, 3.7.

Данные четырехлетнего взвешивания показали, что независимо от способа хранения спермы барана и применения предлагаемых компонентов во вновь разработанных средах, не установлено каких-либо замет-лых отклонений в живом весе ягнят при рождении и последующем развитии приплода.

Результаты "многочисленных исследований показали, что зтанол-лактозо-зшлточно-питратно-глицериновая среда, разработанная с целью сохранения спермы барана в условиях -1Эе°С, вполне применима для спермы быка.

Исходя из вышеизложенного, был поставлен научно-производствен-1ый опыт по осеменению коров.

Таблица 3.5 Живая масса ягнят в различных грушах опыта

Осеменение овцематок спермой, разбавленной:

^-N « Ы IOI

"В . ¿ g S PTï Я 8 8

д § 5о Ï й бй о § и й Ч 5

m aj н M go Чхэ ti tfw <в g рч m

« g кот Ваз œ^ мо, й-о i «а

ЕН $ W=g § EVsl I «Я О-О

о о ¿к 4« А к 7&W m&S'-'

О a g—' о о со В 41 о о » ей«

Р4 а ак ОЙ Зби - в —

в п Î Ь gg ¿aS

Ч> Ф Cd Эго ОСП ИМО ИОЫЙ

m

го со сон к р, » и L „,____

о в но gin сЗРр, §Е»ыЗ

m а гор, ЧЯ но® 4h3W

и Я ч> ti Ci

1 п 2732 1120 1278 354 620

R 0 Р4 1 íí+m 3,58± 0,14 3,57¿ 0,03 3,57¿ 0,02 3,58± 0,02 3,65¿ 0,02

Ф й 1 п 2636 1085 1238 343 601

ы о W a М+т 20,37¿ 0,10 20,46¿ 0,15 20,09¿ 0,17 I9,8I± 0,23 20,25¿ 0,13

Эффективность .осеменений учитывали по результатам определения стельности через 60-90 дней после первого осеменения и по отелу.

Результаты осеменения коров приведены в таблице 3.8.

Из таблицы видно, что у осемененных коров спермой, сохраненной при -196°С, этанол-лактозо-желточно-цитратно-глицериновой средой , стельность повышена на 7,7%.

Отсюда можно заключить, что разработанная среда является пригодной дая криоконсервации спермы барана и быка и вполне может бып использована в практике искусственного осеменения.

Таблица 3.6

Выживаемость ягнят от рождения до отбивки в различных грушах опыта

Осеменение овцематок спермой, разбавленной:

ятятиг-ля«тлч<\- лактозо-желточ-

Вочпагт этанол- этаноламин- глюкозо-жел- жнот^мгат- но-гуммиарабико-

Годы нитратной цитратной точно-цитрат- патно^гжтгепи- трис-цитратно-

взвешивания (новая) (новая) ной (базовая) новой (нстая) гл^цершовой

гол. % гол. % гол. % гол. % ' гол. %

При рождении 570 100 534 100 436 100 ' -

При отбивке 548 96,1 520 97,3 421 96,5

При рождении 306 100 275 100 595 100

При отбивке 293 95,8 266 96,7 580 97,4

При рождении 691 100 311 100 247 100 354 100 620 100

При отбивке 669 96,8 299 96,1 237 95,9 343 96 »8 601 96,9

При рождении 1165 100

При отбивке 1126 96,6

Таблица 3.7

Изменение живой массы ягнят от рождения до отбивки в различных грушах опыта

Рлчпялт этанол-Го*1 взвешвания

Осеменение овцематок спермой, разбавленной:

этаноламин-цитратной (новая)

глюкозо-жел-точно-цитрат-ной (базовая)

этанол-лактозо-желточно-цит-ратно-глицери-новой (новая)

лахтозо-желточ-но-гуммиарабико-трис-цитратно-глицериновой (базовая)

гол. М+т гол. М+т гол. М+т гол. М+гв гол. м+т

1986 При При рождении отбивке 570 548 > 3,59 ¿0,02 20,94 ¿ОД 534 520 3,57 ¿0,02 21,44 ±0,1 436 421 3,57 ¿0,02 20,22 ¿0,32 •

1987 При При рождении отбивке 306 293 3,56 ¿0,57 20,13 ¿0,13 275 266 3,51 ¿0,06 20,67 ±о,хз 595 580 3,59 ¿0,02 20,29 ¿о,п

1988 При При рождении отбивке 6911 669 3,64 ¿0,02 20,33 ¿0,10 311 299 . 3,65 ±0,02 ' 20,05 ±0,23 247 237 3,56 +0,02 19,78 ¿0,08 354 343 3,58 ±0,02 19,81 ¿0,23 620 3,65 ±0,02 601 20,25 ±0,13

1989 При При рождении отбивке 1165; 1126 3,55 ¿0,02 20,10 ±0,09

го о

Таблица 3.8

Результаты научно-производственного опыта осеменения коров 1фиоконсервированной спермой

Протекторы Осеменено голов Стало стельными % стельности

Этанол-лактозо-желточно-цитратно-глицериновый (новый) 150 99 66,0

Лактозо-желточно-глице-риновый (базовый) 120 70 58,3

3.5. Производственная проверка и экономическая эффективность. Влияние этаноловой среды на оплодотворяющую способность спер-миев было проверено при искусственном осеменении овцематок и коров.

В качестве нового варианта служили этанол-цитратная и этанол, лактозо-желточно-цитратно-глицериновая среды. В качестве базового варианта служили глюкозо-желточно-цитратная, лактозо-желточно-гум-миарабико-трис-цитратно-глицериновая и лактозо-желточно-глвдерино-вая среды. Данные научно-производственных опытов приведены в таблице З.Э.

Таблица З.Э

Данные научно-производственного опыта осеменения овцематок и коров незамороженной и замороженной спермой за 1988г.

Среды Осеменено овцематок Объягнилось овцематок % оплодотворения

I 2 3 4

Незамороженная сперма

Этанол-цитратная (новая) 384 286 74,5

Глюкозо-желточно-цитратная

(базовая) 382 237 62,0

Таблица 3.9 (продолжение)

Этанол-лакто зо-желточно-ЦИ'

Лактозо-желточно-гуммиа-рабико-трис-цитратно-глицериновая (базовая)

Замороженная сперма

500 334 66,8

1000 612 61,2

Осеменено Стало %

коров стельными стельности

Этанол-лактозо-желточно-цитратно-глицериновая (новая)

Лактозо-желточно-глице-риновая (базовая)

150 120

99 70

66,0 58,3

Б результате производственной проверки этаноловых сред в опытной группе процент оплодотворяемости овцематок, осемененных незамороженной спермой после первого осеменения повысился на 12,5%, а замороженной - на 5,6$, у коров же процент стельности при осеменении замороженной спермой - на 7,7/5.

Производя анализ экономической эффективности, учитывали как дополнительный приплод, так и разницу стоимости сред дня разбавления.

В расчете на одно животное условная экономическая эффективность от применения этаноловой среда составляет для овцематок при осеменении незамороженной спермой - 1,68 руб., замороженной -0,59 руб., для коров же - 8,77 руб.

ВЫВОДЫ

1. Защитные свойства среды для разбавления и хранения спермы барана ж быка могут быть усилены путем включения в ее состав этанола в качестве криопротектора и стабилизатора мембранных фосфоли-пидов спермиев, что представляет возможность сохранить на более высоком уровне биологическую полноценность половых клеток.

2. Среды с этанолом обладают высокой энергетической эффективностью, т.е. этанол может окисляться митохондриями, генерируя одновременно восстановительную энергию, используемую на поддержание структуры и ферментативной активности, а следовательно, и оплодотворяющей способности спермиев.

3. Осеменение овцематок и коров спермой, сохраненной в этано-ловой среде обеспечивает высокий процент оплодотворяеглости.

4. Применение разработанных сред не оказывает отрицательного влияния на качество полученного потомства.

5. Применение новых сред дает экономический эффект:

а) при использовании краткосрочного хранения спермы (2-4°С)

= 1,68 руб. (на одну овцематку) вследствие сокращения числа баранов-производителей, повышения оплодотворяемости маток, выхода ягнят и снижения себестоимости одной спермодозы;

б) при использовании длительного хранения спермы (~196°С)

Э2 = 0,59 руб. (на'одну овцематку) и Эд = 8,77 руб. (на одну корову) .

6. Сукцинатдегидрогеназа является показателем биологической полноценности спермиев, поэтому определение ее активности может служить критерием оценки качества спермы.

Практические предложения

С целью повышения технологичности и эффективности применения метода краткосрочного и длительного хранения спермы барана и быка рекомендуем:

а) дая разбавления и краткосрочного хранения спермы (2-4°С) среду следующего состава: вода дистиллированная, мл - ICO, цитрат натрия, г - 2,8, этанол, мл - 0,05. Разбавление 1:4;

б) дая глубокого замораживания спермиев при -196°С защитную среду следующего состава: вода дистиллированная, мл - 1Й0, лактоза, г - 11,5, цитрат натрия, г - 1,0, этанол, мл - 0,5, глицерин, мл - 4,0, желток куриного яйца, мл - 2,0;

в) для длительного хранения спермы при температуре -196°С рекомендуем ее разбавлять 1:4 (сперма баранов-производителей) и 1:10 (сперма быков-производителей) этанол-лактозо-желточно-цит-ратно-глицериновой средой и замораживать путем гранулирования на фторопластовой пластине. "Оттаивание грёнул проводить в водяной бане при температуре 40-42°С;

г) в качестве объективного практического метода для диагностики биологической полноценности спермиев предлагается способ определения актйвности сукцинатдегидрогеназы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации: >

1. Мелконян 2.С. Новая среда дая сохранения спермы барана //Тез.докл., научн.конф.молодых ученых и специалистов ЕрЭВИ, пост "Году мира". 1986. С. 24.

2. Манасян А.О., Мелконян Z.C. Дыхание спермиев в средах с нпзкоталекулярным амином //Тез. докл.научн.конф., посв.70-логко

Октября. 1987. С. 72.

3. Мелконян S.C., Манасян А.О. г Карапетян Т.Д., Камалян Р.Г. Новые среды для разбавления спермы баранов //Зоотехния. 1989.

№ 10. С. 61-63.

4. Мелконян Ж.С., Манасян А.О., Маркарян С.Г., Амбарданян I.A. Опыт применения глубокоохладденной спермы барана //Агропром: Наука и производство. 1989. № 12. С. 34.

5. Мелконян Ж.С., Манасян А.О., Амбарданян Л.А., Маркарян

С.Г. Новые среды для разбавления спермы баранов //Зоотехния. 1990. № II. С. 62.

6. Мелконян Н.С., Погосян Н.Г. Среда для сохранения спермы барана. Информационный листок. АрмНИИНТИ. 1990.

7. Мелконян Ж. С. Замораживание спермы быков-производителей' в яидком азоте. Информационный листок. АрмНИИНТИ. 1990.

8. Мелконян Н.С., Манасян А.О., Амбарданян Л.А. Этаноловая .среда для сохранения спермы барана. Информационный листок. АрмНИИНТИ. 1991.

Заказ Тярав iOO

Закаэ правят погписаво я печати ~f3.ÛÔ, В/

Форма* 60x84/16 объем печ. листов 6

Уч. язд. ляс* S Бесплатно.

375025 Ереван 25 у*. Абовяна 52

Отдел издательства а оперативной полиграфа» БрйЮГ-а