Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Окислительно-восстановительная биотрансформация физиологически активных веществ под действием моноаминоксидаз

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Окислительно-восстановительная биотрансформация физиологически активных веществ под действием моноаминоксидаз"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. М.В.ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ ~

На правах рукописи

САБЛИН СЕРГЕЙ ОЛЕГОВИЧ

УДК ЭТТ. 152.143'14

ОгаОГОТЕЛЫЮ-ВОССТАНОВ1СТЕЛЫ{АЯ ШОТРАНСФОРМАШЯ ФЮИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ! ВЩЕСТВ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ЫОНОАМШЖСВДАЗ.

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертаций на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 1991

Работа выполнена в лаборатории нейрохимии Института физиологически активных веществ Академии наук СССР

Научные руководители: - . доктор химических наук, профессор С.Д.Варфоломеев кандидат химических наук, с.н.с. С.О.Бачурин

I

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, с.н.с. В.И.Муронец

доктор химических наук, с.н.с. Л.Д.Румп

/

! Ведущей организация:

Институт биохимии им. А.Н.Баха

Защита диссертации состоится "24" декабря 1991 г. в 17— часов на заседании специализированного ученого совета Д 053.05Л6 по химическим наукам при химическом факультете МГУ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического • факультета МГУ

Автореферат разослан "22" ноября 1991 г.

УченнИ секретарь специализированного совета кандидат химических наук

*

Актуальность проблемы. В последние года было установлено, что некоторые эндогенные и экзогенные низкомолекулярше органические соединения способны моделировать у человека 2 экспериментальных кивотшх нейропатологичэскиэ состояния, близкие по своим клиническим, биохимическим и патологическим характеристикам к идиопагичзскш формам известных леврологичвских заболеваний. Использование таких модельных нейротокскноз .позволяет исследовать механизм развития нвйродегеяэративвых процессов с начальных стадий, разработать новые направленные подхода к фармакологической коррекции, ранней диагностике . и возможному прадуггрэвдешв подобных заболеваний.

Особый интерес в этом плане привлекает изучение действия 1-метил-4^нил-1,2,3,б-тетратадропиридина (МИЛ),'вызывающего у человека и некоторых лабораторных. животных развитии эксперишн- . тального паркинсонизма. В мозге МФТП подвергается бяоактивации под действием фермента моноаюшоксэдазн (МАО), я эта стадия является пусковой'в цепи реализации его нейротропннг свойств. По этой причине ключевым • вопросом в исследования действия МФТП-подобных веществ является изучение закономерностей их биоактивации,под действием МАО.

Соединения типа ШШ являются новым классом субстратов МАО. Процесс дегидрогенизации этих соединений год действием МАО имеет ряд особенностей го сравнению с катализом градационных для МАО реакций окислительного дезаминирсваяия. Выявление и изучение этих различий представляет самостоятельный фундаментальный интерес исследования.

Целью данной работы явилось изучение основных кинетических и структурно-функциональных закономерностей биотраноформации ШЕЛ и ого аналогов под действием МАО.

1

Научная вовизна. Выявлена новая груша • субстратов дегкдрогеназной функции МАО в ряду производных МТС, определена их специфичность в отношении различных форм фермента. Провэдэн анализ влияния структуры соединений на стабильность дигидропири-дшшевого мзтвболита, a raxse на их субстратные свойства, в результате которого выявлены параметры структуры, определяли?® субстратные свойства подобны! соединений в отношенви МАО-Б.

На основе разработанного подхода установлен кинетический механизм инактивации МАО в процессе окисления аналогов МЕГП. Показано, ' что нейротоксические свойства в ряду блшкайшх гомологов МФТП определяются аффектгвностью иг биозрансформации под действием МАО.

Практическое значение работы. Выявленные соединения группы сгильбазола могут рассматриваться в качестве "базисной" структуры для конструирования "pro-drug" - систем химической доставки лекарственных препаратов в мозг. Разработан кинетический подход, позволявдий дискриминировать различные механизмы инактивации фермента. Кинетический параметр (7), отражающий эффективность биотрансформации, может быть использован для оценки нейротоксичэских свойств новых соединений.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ. 4

Апробация работы.- Результаты работы были доложены на: 14 мездународном конгрессе по биохимии (Чехословакия, Прага, 1938); международном симпозиуме "Molecular Basis of Action or Bloactlve Substances on Beïiavlour" (Таллинн, 1989); 8 совещании европейского нейрохимического общества (Лейпциг, 1990); 4 международном . симпозиуме по ашноксидазам (Зап. Германия, Вврцбург, 1990); 3 международной конференции "Neurotoxins 1л

2

Neurobiology" (Уругвай, Периапожс, 1991); конференции Нью-Йоркской Академии Наук "Neurotoxlnes and Their Potential Role In Neurodegeneratlon" (Филадельфия, 1991); а также на ряде других международных и всесоюзных конференциях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (главы 2 и 3), обсуждения результатов (глава 4), экспериментальной части (глава 5), выводов, списка цитируемой .литературы и прилокения. Диссертация изложена' на 129 страницах машинописного текста, включая 7 схем, 22 рисунков и 11. таблиц. Список цитируемой литературы состоит из 147 литературных источников.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЗДШИЕ

1. -рН-завискмость стационарной кинетики реакции дегидрогенизации МФТИ, катализируемой МАО.

Для выявления - особенностей катализа . МАО реакций дегидрогенизации были проведены сравнительные исследования стационарной кинетики окисления И и традиционного субстрата формы Б фермента бензиламина в зависимости -от pH среды. Цель дащого этапа работы заключалась в том, чтобы выявить возможные различия катализа МАО реакций окислительного дезаминирования и дегидрогенизации и найти адекватное кинетическое описание рН-зашсимости кинетических параметров исследованных соединений.

Вйд графика функции • 7 в случае бензиламина (Рис.1.А) свидетельствует о том, что существует по крайней мере два кинетически различимых каталитически активных состояния фермент-субстратного комплекса. Для интерпретации полученных результатов, о учетом литературных данных о том, что с ферментом связывается

3

I-

А ^ 4

Рис.1. А.Б.В. рН-завжлость иаракетров У л К Сензилашша (о) и КФТП (с ). Г. рН-завзазюсть параметров Кт 4-|еашширвдтша (о ) и Ш1 (о). Творепиеско кривые построены по уравнениям 1-4.

исключительно депро5Е1нрованаая форма молекулы субстрата, предложена кенэишэсгся схема, ошсывазщая рН-зависикость МАО (Схема 1).

cat,

К

мгб ,—^ евб ез

Ли

ев

бн г + я+

, Схема 1

в результате математической обработки получаем

= + ^о+^лн^) " гва+га^/кч^лн*]) (1)

Шт = х^Кд + 13(нш^/ко) + 1г(1+ш+]/ка) -

- ^(ЧШ^/КЧ^/Ш^) (2)

- 1в(1 + [Н+)/К0) - 7б(1+[Н+]/Ка) (3)

Теоретические кривШе, построенше по уравнениям (1) - (3) хорошо совпадают с экспериментальными точками при значениях рК7= 6.2, р>1.5 и р<1 (для бензиламина и МИЛ, соответственно), рКа<б.О и рКь>9.0 (ограниченность диапазона рН, в котором фермент находится в активном состоянии не позволила с достаточной точностью определить последние три параметра: в областях рН выше 9.0 наблюдается необратимая денатурация МАО) (Рйс.1.А.Б.В).

В соответствии со схемой 1 вид графика для констант Михаэлиса в условиях эксперимента определяется увеличением концентрации депротонировавной формы молекулы субстрата с возрастанием рН. Различный вид графиков функций параметров максимальной скорости для бензиламина л МФГП отражает, вероятно, различия в соотношении скоростей полуреакций восстановления и реокисления фермента в процессах трансформация этих субстратов. Согласно такому предположению ионизация функциональной группы фермента, которой соответствует параметр р^, правде всего. сказывается на второй голуреакции, скорость которой ниже, по сравнению с первой, в случае бензиламина и выше - в случае МФШ.

Подтверждением реализации модели, описываемой схемой 1, является характер зависимости от рН константы конкурентного обратимого ингибитора активности МАО 4-фенилпиридина (Еис.'1.Г), значение рК аминогруппы которого равно 5.2. Во всем исследованном диапазоне рН данное соединение находится в депротонированной форме, в отличие от бензиламина и МФШ (рК= 9.2 и 11), и целиком.

5

участвует во взаимодействии с ферментом. В результата, согласно «•эмэ 1, его константа кнгибировашя не зависит от рН. Таким образом, рН-зависиюсть окисления бензилашна и МФШ под действием МАО-Б списывается единой кинетической схемой, причем во взаимодействии участвует* одни и те ш ионогенные группы фермента. Данные литературы позволяют предположить, что грушами, имеющими значения рК равные 6.2 и выше 9.0, являются Н1 восстановленного изоаллоксазинового ядра флавина и аминогруппа остатка лизина.

Реализация механизма, описываемого схемой 1, предполагает, что с ферментом связывается свободная, депротонированная форма молекулы субстрата. В то яе врем' известно, что заряженный продукт окисления ЮГП, 1-метш1-4-фенилпиридин (Ш>П), является конкурентным . ингибитором МАО. Для выявления особенностей взаимодействия подобных соединений с ферментом была изучена рН-зависимость константы ингибирования активности МАО-Б метаболитом Ш1 (Рис.1 .Г). Формально, такому виду зависимости соответствует следующая схема 2 и

V Ш . > Ш ЕГ

2

Схема 2 .

математическая обработка которой приводит к уравнению

1(ВЗ{набл= ^ + 28(пка/т*1) - 1в(1+кь/ш+]) (4)

Теоретическая кривая, построенная по уравнению (4) хорошо соответствует экспериментальным точкам при следующих значениях параметров: рКа= 6.82, рКь= 8.5 (Рис.1.Г). Предположительно, группами, имевдиш такие значения рК, являются имидазол остатка гистидина и тиольная группа остатка цистеина.

Таким образом, в процессах взаимодействия с ферментом даяе взаимоконкуренгшл лигаддов принимав^ участив различные функциональные группы активного центра МАО.

6

2. Производные 1,2,3.б-тетрагидросгильбазола как новая груша субстратов дзгидрогеназной: функции МАО.

С целью выяснения структурно-кинетических закономерностей катализа МАО процессов дегидрогенизации было проведено сравнительное исследование стационарной кинетики образования 2,3-дигидропиридиниевых метаболитов в ряду 4-эрил- (МАТП) и

с

•4-арилвинил (МТС) производных 1-метил-1,2,3,6-тетрагидрошридина. Необходимо отметить, что стильбазольные аналоги ШГП ранее исследоваЕЫ не были. Вместе с тем, изучение этой группы соединений представляет фармакологический интерес, так как некоторые из них известны в качестве протекторов антихолинэргнческих агентов.

2.1. Спектрально-кинетические закономерности биотрансформации ШГП и его аналогов.

Все исходные соединения характеризуются пиком поглощения в . УФ области спектра (230-325 нм). Дегидрогенизация соединений (1)-(17), (71), (VII), (Х)-(ЭТ1) (Табл.1) сопровождалась сходными изменениями в спектрах поглощения. Появление полосы поглощения, соответствулцей 2,3-дигидропирядишевому продукту, происходило в более длинноволновой области спектра (330-500 нм), а затем наблюдалось появление новой полосы в промежуточной области по отношению к шкам субстрата и 2,3-дигидропиридиния (285-450 нм). Заметные изменения в спектре поглощения в процессе окисления соединение (IX) наблюдались только после 30 часов его инкубации с ферментом.

В зависимости от природа соединения стабильность 2,3-дигид-ропиридиниевого продукта заметно изменяется. Для выявления особенностей структуры по программе ШР2 (пакет "РСКОБЕЬ") были проведены расчеты по оптимизации геометрии молекул исследованных

7

соадяветша. Установлено, что ста&аьной конфэрг.-.ацип проззводзнг стальбазола соотвзтетвует планаряая структура. Их ацзтплановкй. аналог иг,;еет лянэНнуа структуру, причел Оарьер вращения воггрут тройной связи разэн О. В молекулам ЫЯГП, его пара- н ыата-сролзводЕЫИ (санЕльны^ к тетрагщ;ошрздзЕовыа (ИИ) гшагыазтн позорнуты друг оглосптольно друга ка угол 25°±5° (гйШ и его пара пооц^воднкз) к 4-0°±5с (с-Мэ-^УШ) (Енс.2). орто лропзводзг!.

Еах-галь угле (гг.) о^г^г;;- 1: 5С°.. оарыз;' врадезга. Аосг-сзотьо Е^оо.; (12 :кг:;Л:о1ь;.

Езд^г^— рзгуль^е!^ 'ижхо^.у.- поздно ".О/ .".о. ч.ю сссои:^: сгр^чсг^::. оо:-.-. .¿.г'::?-; .

сгах^Гс^зс'г;: ¡'.з^аиз:";.:.с.^, Е^^З-а-С;:

сопой-ЭН^Л з^ао^здгэ:::^,

д.~,г: ггао^зБодз^- кйзьогззле (погглло ю; ПРЕД&ЙШГС еаикога) -создааз2Е&ч Г ксхорнг степень соаряхзлзх еьсоольызя. Ь ¿лзло^улаг: Ц£ТП пр£ уаоллчгппн дкадрального утла изздг цэеельещ; е '1'е1ратдропзрндщ105Шй $раи«энт£и^ степень сопршашЕ уменьшается и принимает наизпынке значения у орто .производных. Соотвзтствуздш образом меняется е стабильность дыгадрошрЕданае-вого продукта. Нарупэшэ сопряжения, вызванного введением тройкой связи кезду фэшлъши и тетрагидрощридиновын фрагментами, в случае ацетиленового аналога стилъбазола тшшэ приводит к дестабилизации продукта даухэлэктронпого окисления.

2.2. Специфичность производных ЫТС е КИП в отношении различных форм МО.

Кинетика дегидрогенизации соединений (1)-(Ш) и (V) хорошо описывается уравнением í¿axaэлиca-Meнтeн- В случав пара производных МИЛ е соединений группы стилъбазола, наблюдается

8

Jk

Di, _______i'

Di_^

Рис. 2. Геометрия молекул производных ИО и НАТП.

более сложная кинетика, которая формально моевт быть охарактзризована двумя парами кинетических параметров Еш г У для низких и высоких начальных концентраций субстрата. Причем

I

бензил амин, специфический, субстрат МАО-Н, обратимо и конкурентно иитибирует окисление '-соединений (1)-(Ш) и (Y) во всем исследованном диапазоне концентраций субстрата, остальных соединений - только в области их низких концентраций. Значения констант ингибирования Kj бензиламином близки для всех соединений (0.34±0.15 нМ) и практически совпадали со значениями Кт для бензиламина (0.43±0.1 мМ). Серотонин не влияет на окисление МОТП и его орто и мета производных, но ингибируег реакцию окисления соединений (IV), (VI), (VII) и (Z)-(XVÍ) в области их высоких концентраций, причем значения констант ингибирования (2.Т±0.1 кМ)

таете совпадали со значениями константы Шхаэлиса для серотонина

*

(2.5±0.1 №). Эти результаты давт основание предположить, что

9

Таблица 1. Кшетичёские параметры бнотрансформации аналогов К5ФТП под действием иАО. V - максимальная скорость в (3) от скорости окисления ИШ; е3 и ер - коэффициенты молярного

поглощения субстрата к 2,3-дигидропиридгниевого продукта

И'

Но Е МАО Б-типа МАО А-тша ев{Х)

№ V V кЫ-1см" "1 (ЕМ)

т Р1х 330 100 - - 13.0(270) 13.0(343)

II о-КоР11 65 458 - - 5.0(230) 12.8(330)

III т-КеРа 55 92 - - 10.6(245) 21.2(350)

IV р-ИеЙ1 25 8.3 5.1 95 14.0(249) 24.0(360)

V о-ЫеОРЬ 200 117 - - 8.0(230) 17.4(370)

VI р-НеОРЬ. (о) 10 0.5 2.6 0.8 13.2(257) 15.6(380)

VII чО/— <0.1 0.34 5.0 132 19.0(316) 47.0(334)

VIII (ОУ^о- <0.1 1.6 >10 >50 25.0(270) 18.0(367)

IX Ые-к( ^-СН-СК- - - - - - (265) - (325)

И'

X н 3.4 0.25 1.6 9.38 29.0(282) 24.0(383)

XI о-Не 9.0 0.44 8.0" 11.6 23.0(278) 28.0(384)

XII о-МеО 10 1.3 11.0 31.4 17.0(277) 22.0(406)

XIII р-Ме 0.47 0.08 1.25 0.62 25.0(285) 24.0(393)

XIV р-КеО 1.2 0.29 5.3 1.69 27.0(288) 28.0(400)

XV р-Я(Ме)2 0.5 0.05 1.4 0.29 17.0(317) 13.0(500)

XVI р-Р 2.0 2.1 1.3 5.1 22.0(279) 10.0(390)

окисление первой группы соединений осуществляется той формой МАО, которая специфична к бензиламину, окисление второй группы .

10

соединений происходит под действием обеих форм фермента (Табл.1 ).

2.3. Соотношения структура-активность (субстратная) в реакции дегидрогенизации, катализируемой МАО.

Анализ данных таблицы 1 позволяет выявить некоторые закономерности катализа различными формами МАО в зависимости от структуры субстрата. Taie, введение заместителя в пара положение молекула, а такт® винилыюго "мостика" кезду фекальным и тэтрагзвдрспирадиновым фрагмента?® (при переходе от соединений группы !ЛАТП к î-iTC) впзнзает значительное уменьшение значений параметра К . Подобная 1:ода£зкация структуры приводит к изменению ао крайней кет» двух фззическях параметров молекулы. С одной стороны, увеличивается параметр гидрофоблостн. С другой стороны, происходят из'лэноние геометрического размера молекулы. Так как Mïïl s ЫГС являются достаточно "ггесткши" структурами, описанная вида кодафакацяя приводит к увеличению расстояния ыедду наиболее удаленными друг от друга атомами молекулы, которое можно условно назвать "линейным размером" молекулы.

Для шявления количественной взаимосвязи мезду структурой и субстратными свойствами исследованных соединений были расчитаны параметры, отражапще "линейный размер" и липсфильность их молекул. Определение лшгофильности было выполнено двумя способами. Согласно первому для кавдой молекулы расчитан логарифм распределения октанол-вода (%) по ВС(ВЕР) схеме (метод Крамера). Согласно второму - была определена неполярная область поверхности молекулы (NP), расчитанная по программе "PCMODEL". Геометрические параметры D1, D2 и БЗ (Рис.2) измерены (в А) для наиболее устойчивых конформаций молекул.

Корреляционные уравнения, связывающие физические параметры

11

молекул со значениями констант Кихаэжса для МАО-Б, были составлены с помощью метода наименьших квадратов (Табл.2). Сравнение статистических параметров полученных уравнений свидетельствует о том, что связывание субстрата с МАО-В существенно лучше описывается геометрическими параметрами. Причем высокие значения 1фитеркя Фишера в случае исследованных соединений свидетельствуют о практически функциональной зависимости констант Михаэлиса от параметров геометрии. Несколько лучшая корреляция в случае параметра 1)3, отражает, вероятно, тог факт, что Сб-атом фрагмента ТШ является реакционным центром молекулы субстрата и участвует таким образом во взаимодействии с функциональными грушами активного центра фермента на стадии

Таблица 2. Корреляционный уравнения, связывающие физические . параметры молекул субстратов и значения констант Ыихаэлиса в процессе окисления формой В МАО, полученные для соединений 1-П, Х-ХТ1 (ур. 1-3,5,6) и бензилаыина (ур. 4). II - коэффициент корреляции, Р - критерий ®шера, ББ - стандартное отклонение.

N0 Уравнение Е ЭБ ?

1 -1е(к,_)= 0.530 ш - о.65 ^ (±0.046) (±0.50) 0.960 0.273 129.5

2 -1ё(к„,)= 0.528 22 + 0.10 ^ (±0.046) (±0.44) 0.960 0.271 130.5

3 -1е(К_)= 0.523 1)3 + 0.35 111 (±0.043) (±0.38) 0.965 0.253 150.9

4 -^(К_)= 0.500 СЗ + 0.62 111 (±0.97) (±0.33) 0.968 0.259 180.2

5 -15(К_)= 1.38 X + 1.5 ^ (±0.49) (±1.3) 0.649 0.739 8.0

6 -1я(К„)= 0.021 КР - 4.0 ^ (±0.006) (±2.4) 0.752 0.640 14.3

образования фэрмэнт-субстратного комплекса. Последнее прздполохеназ хоропо согласуется с литературни/Ш данннма о том, что рэзкция на С5 ато?*.э является скорость лимитярузщеЗ стадией процесса депздрсгзнеташЕ; WME я его аналогов.

Достаточно хоропал ксррзляцня от этих параметров наблюдается тск-з длл ^увкцго ^ксгоакжса сясоросал в отесезеня НДО ®зр.\э Б (11=0,5•£, 7=56),

Г сл^грэ яссг-тргсгт! сзротагя^оусндсзЕО/! ЕКХЕБЕОСТН ¡LkО (с.т:: .:.} гг. гаогадоагсг. Е»

ос.?.:; л .г-г;.-;:: го'тгта зроогрглс^гзгЕ^:,

СГ;ТС:СЗ"КТ:8 cyCO'Vp'rí"^ " ^Г.Т'ГГГ.",.: Т^^П-^ОГ-'ОрП"; CIÍO'^C'OTCf! ГОУЗГ-'З

патза^етра структура -

З.'Кгслэдозазиэ езгг ■»дзйств'з» с "Ш проззводнкх 7-карболЕиа.

По:.пзго создшгеЕй! группы стлльбазола з качества субстратов МАО бпля исследованы производные 7-кзрбодша (XYTI-2X). Соединения данной группы кояно рассматривать как экзогенные аналоги р-карболяноз - продуктов деградации триптофана.

<Х fe líe Вг

® d d d

\_/ Ч / \ / \ /

К "Tí "Tí "Tí

lili lía líe Me líe

XVII ZVJII ЕЕ XX

Спектрофотометрическим и полярографическим (с использованием

электрода Кларка) методами показано,' что соединения (XVII)-(XX)

не окисляются МАО, но конкурентно обратимо ингибируют окисление

бензилачина (Кх= ОЛ, 0.34, 0.35, 0.18 мМ, для XVII, XVIII, XIX и XX, соответственно).

4. Механизм инактивации МАО в реакции дегидрогенизации.

4.1. Дискриминация возможных механизмов инактивации фермента.-

Процесс биотрансформации ЫЕГП и его аналогов сопровождается необратимой инактивацией фермента. В общем случае, для простейшей кинетической схемы инактивация фермента в ходе реакции может протекать по различным механизмам (Табл.3). Описанные в литературе подходы для дискриминации различных ■ механизмов инактивации фермента в ходе реакции для анализа реакций окисления аналогов МФШ не применимы, поскольку относительно низкая

Таблица 3. Возможные механизмы инактивации фермента.

Е К к г-Е5 Е + Р -«- Е, --ЕР 1 зб

N0 стадия инактивации д _ йР/сИ = вЕ/аг

1 к /К оа* ■? [Б] а/(а+1)

2а ■ к" Е + Я —В{ К

26 Ч ■25 —Е{ к-

За к" Е + Р —^ Е^ , а_1 1с"

36 Ч ЕР —Е1 к ./К в а-1 4*4

стабильность дигидропяридиниэвых продуктов реакции не позволяет с достаточной точностью оценить предельную конверсию субстрата. Наш был предлокен метод дискриминации механизмов, основанный на изучении зависимости отношения скоростей накопления продукта и инактивации фермента (0э от функции степени

конверсии субстрата (аз (1БЗо-[РЗ)/£РЗ) (Табл. 3). Использование данного подхода в условиях, когда образуются исключительно 2,З-дигддропиридиниэвнв продукты, позволяет подробно исследовать механизм инактивации МАО в процессе окисления аналогов МФТИ.

4.2. Идентификация механизма инактивации МАО в процессе окисления аналогов МИЛ. Роль биотрансформации в проявлении вейродегене-ратввных свойств гомологичных структур.

Изучение механизма инактивации МАО проводились для . серии блияайшх' гомологов МИЛ - его орто-, мета- и пара-метилызых производных. Цель данного этапа работы заключалась в том, чтобы с одной стороны установить механизм инактивации фермента, с другой стороны, выявить вклад этой стадии в процесс биотрансформации в зависимости от структуры субстрата. Так как первые три из этих соединений окисляются исключительно МАО-В, все эксперименты относятся именно к данной форме фермента. Исследования пара толильного гомолога ИШ проводились в области его концентраций, когда катализ формой А был несущественным.

Вид графиков зависимости р от а (Еис.З) свидетельствует о том, что инактивация МАО в процессе окисления соединений (1)-<ГУ) осуществляется в результате взаимодействия фермента с продуктом реакции. Из тангенса угла наклона прямых (7), который представляет собой соотношение каталитического и инактивационного путей, были расчитаны эффективные константы инактивации

15

Рис.3. Зависимость параметра р от функции степени конверсии субстрата а для соединений (1)-(1У).

Таблица 4. Кинетические и инактивавдонные параметры окисления ШТП и его толильных гомологов под действием МАО-Б (ошибки экспериментально определяемых параметров не превышали 10%)

Субстрат *т V ТЪилЫ'Ч

МИН-1 мкМ

бензиламин 200 430 0.46 - -

I 60 330 0.18 30 6300

II 270 65 4.3 205 22000

1П 55 55 1.1 610 1800

IV • 5 25 0.2 125 1600

(Табл.4). Дискриминировать механизмы 3(а) и 3(6) не представляется возмохнш, однако данные литературы. свидетельствуют в пользу того, что инактивация МАО-Б протекает через стадию образования комплекса фермент-продукт.

16

Величина константа инактивации значительно различается для исследованных соединений. Следовательно, вклад ингибированпя фермента в процесс биокоявереш субстратов приводит к тому, что окисление соединений, имевдих равные (IV) и более высокие (III) значения каталитических параметров (ltcat/Kra) по сравнении с ШШ, будет происходить с меньшой т>е дельными степенями их конверсии. В результате концентрация шридшиевых метаболитов в тканях мозга

ч

будет определяться комбинацией каталитического ж кнактивационвого процессов, нлп эффективностью биозрансфорглациз, количественным Енракениэм которой является параметр (7). Максимальные значения этот параметр принимает' в случае орто-толильного аналога ШЭД, специфические нейродвгенератиннне свойства которого внранены наиболее ярко. Для неактивянх пара и мета аналогов значения (7) в несколько раз нигэ, по- сравнению с МФТП. Поскольку характер изменения значений этого паремзтра хорошо согласуется с порядком изменения паркинсоногенвых свойств в ряду исследованных соединений, в случаях, когда различия в действии' веществ на стадиях взаимодействия с дофаминовым переносчиком и НАДН-оксвдазсй незначительны, этот параметр (7) может быть использован в качестве критерия потенциальной эффективности нейротрошого действия соединений.

вывода

1. Исследована 'кинетика процесса дегидрогенизации, катализируемого МАО, в широком ряду производных ТТЛ. Изучена pH-зависимость этого процесса.

2. Выявлена новая груша вейроактившх соединений (МТС), проявляющих субстратную активность в отношении МАО в процессе

17

дегидрогенизации. На основании спектрально-кинетического анализа биотрансформации МТС и Щ.И1 сделано предположение об определяющем значении степени сопряжения молекулы в стабильности дигидропиридашэвого метаболита.

3. Исследована специфичность производных MATH и МТС в отношении различных форм МАО.

4. Проведен анализ влияния структуры соединения на его субстратные свойства. Выявлена корреляция между геометрическими параметрами структуры соединений и их субстратными свойствами в отношении Б формы МАО.

5. Разработан теоретический пбдход и установлен кинетический механизм инактивации МАО в ходе окисления ЫАТП, представляющий собой ингибирование фермента дагидропиридиниевым продуктом реакции. Определены кинетические параметры этого процесса.

6. Показано, что различия в селективных нейродегенератинных свойствах близких гомологов МФТП определяются эффективностью их биотрансформацш под действием МАО. Параметр 7 (эффективность биотрансформацш) предложено использовать для оценки потенциальных нэйротройных свойств соединений.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Бачурин С.О., Саблин С.О., Дубова' Л .Т. Каталитические свойства МАО в реакции дегидрогенизации физиологически активных арклтет-рагидрогшридинов. // "71 Всесоюзный симпозиум по инженерной внзимологшг. Тезисы докладов. Вильнюс, окт. 1988.- ч.1с.85.

2. Bachurin S.O., Lernrantova К.Н., SolyakOT L.S., Sablln S.O., Tkacheiiko S.S. Different neurochemical mode of action of pyrldlnium herbicides. //Neurocliemlstry International.- 1988.-•7.13.- Suppl.1- р.в5.

3. Лермонтова Н.Н., Серкова Т.П., Саб-шн С.О., Бачурин с.о. Различия в Еейротсксичзсхих свойствах пиридинсодэрзшщих пестицидов. //В сб.: "Химия и технология пиридинсодержащих пестицидов".- 198S.- вып.2.-- с.103-104.

4. Bachurln S.O., Sablln S.O., Dubova b.G. Monoamine Oxidase (MAO) Catalysis of Dehydrogenation Reaction of Physiologically Active Aryltetrahydropyridines (TH?). //Abatr. 14th Int. Congress of Biochemistry, Czechoslovakia, Prague, June 1988.-V.IT.-p.118. •

5. Tkachenko S.E., Kalashnitov V.V., lermontova N.N.,Sablln S.O., Bachurln S.O. Comparative Study of Pyrldlniuin Herbicides Neurotoxicity Mechanism. //Pestycydy.- 1988.- No.3.- p.93.

6. Бачурин C.O., Саблин C.O., Гришина Г.В., Гайдарова E.JI., Дубова Л.Г., Зубов Н.Д. ' Каталитическая биотрансформация физиологически -активных 1-метил~4-арил-1,2,3,6-тетрагидропири-данов под действием моноаминокстдазы. //Биоорганическая химия.-1989,- т.15.- с.620-626.

Т. Bachurln S.O., Sablln S.O., Dubova I.G. Monoamine oxidase (MAO) catalysis of byconversion о1 1-methyl-4-aryl-1,2,3,6-tetrahydropyrldlnea to physiologically active metabolites. // Blocatalysls.- 1990.- v.4.- p.63.

8. Bachurln S.O., Lermontova N.N., Sablln S.O., Solyakov b.S. Molecular basis of selective neurotropic activity of bloactlve 4-aryltetrahydropyrldlDe derivatives. //Abst. Int. Symp. "Molecular Baala of Action of Bloactlve Substances on Behavior" Tallinn, July 1939,- p.8.

9. Ткаченко C.E., Калашников B.B., Калашникова И.С., Мухин C.B., Саблин 0.0., Лермонтова Н.Н., Соляков Л.С., Бачурин С.О. Направленный синтез физиологически активных 4-арил и 4-стирил-

19

шрвдинов и их гидрированных производных. //В сб.: Всесоюзный семинар "Химия физиологически активных соединений". Тезисы докладов. Черноголовка, 1989.- с.229.

10. Bachurln S.O., SolyaKor L.S., Sablln S.O., Lennontova N.N., Tkaciienko S.E. Molecular basis oi discrepancies in neurotoxic properties among l-aethyl-4-aryl-i ,2,3.6-tetrahycLrcpyrldlnes (MTB). //In: Eur. Soc. Heurochem. 8th General 'Meeting. Leipzig. July 23-27, 1990.- p.137.

11. Sablln S.O., Bachurin S.O., Tiiachenko S.E. Stylbazole analogues of ЫРТР as monoamine oxidase (МАО) substrates. //In: 4th. Int. Amine Oxidase Workshops. Abstr. Wurzburg (West Geroany). July 1990.

12. Sablln S.O., Bachurln S.O., Kcachenko S.E. Stylbazole analogues oi ЫРТР as monoamine oxidase (МАО) substrates. // J. Neural Transm.-1990.- Suppl.32.- p.119-122.

13. Саблин C.O., Ткаченко C.E., Бачурин C.O. Исследование связи структура-активность в процессах дегидрогенизации аналогов 1-М9тад-4-ф8НШ-1,2,3,6-тезрагидропиридина (1Ш) под действием моноаминоксвдазы (МАО). //Докл. АН СССР.- 1991.- т.318.- Но.1.-с.228-231.

14. Bachurln S.O., Lenaontova N.N., Sablln S.O., Solyakov X.S., Tkachenlco S.E. Biochemical basis of molecular activity of ЫРЕР-llke' neurotoxlnes. //In: 3rd. Int. .Symp. "Neurotoxins In Neurobiology". Plriapolis, Uruguay, March 16-20, 1991.- p.1.

15. Bachurln S.O."; lermohtova N.N., Sablln S.O., Solyakov L.S., TKachenko S.E. Biochemical basis of structural1 electlvity of MPTP-like neurotoxicity. //In: Abst. Conf. H.Y. Academy of Sei. "Neurotoxines and Their Potential Bole In Neurodegeneration". Philadelphia, May 6-8, 1991.- PI-4.

20