Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Очистка и физико-химические свойства продуктов генов 9,10, 11, 12 и WAC бактериофага Т4

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Очистка и физико-химические свойства продуктов генов 9,10, 11, 12 и WAC бактериофага Т4"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВИРУСОЛОГИИ имени Д.И.ИВАНОВСКОГО

На правах рукописи

УДК 578.811.1:577.112.083

ЗУРАБИИВИЛИ ТЕЙМУРАЗ ГЕОРГИЕВИЧ

" ОЧИСТКА И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПРОДУКТОВ ГЕНОВ 9,10,11,12 И ИАС БАКТЕРИОФАГА Т4 "

03.00.03. - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва - 1993 т.

Работа выполнена в НИИ Вирусологии им.Д.И.Ивановского РА

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук, профессор Месянжинов,

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор химических наук Шибнев, В.А. кандидат биологических наук Флуер, ф.С.

ВЕДУЩЕЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ: Институт биохимии им.А.Н.Баха

Защита состоится " " ^ ^ ^ 1993 года на засе,

специализированного Совета Д 001.20.01 при НИИ Вируео. им.Д.И.Ивановского РАМН (12309, Москва, ул.Гамалеи, 16).

Автореферат разослан " " марта 1993 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ Вирусол им.Д.И.Ивановского РАШ.

Учёный секретарь Специализированного Совета кандидат медицинских наук

А.М.Жукоеский

I. ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

1.1. Актуальность проблемы. Конструирование гибридных :ов, содержащих иммунологически компетентные эпитопы виру-человека с помощью белковой инженерш - перспективное нап-:ение биотехнологии для создания нового поколения эффектив-диагностических препаратов и вакцин.

За последние годы появились ряд публикаций, в которых по-ша перспективность использования нитчатых бактериофагов I М13 в качестве векторов для поверхностной презентации эк-¡нных полилептидов. В ближайшее время появится возможность гчения на основе селекции с помощью фага М13 моноклональных ¡тел человека против вирусов человека и животных. Такая юлогия может заменить существующие сложные и трудоёмкие >ды, основанные на гибридомах.

В лаборатории молекулярной генетики Института вирусологии гктурные белки фага Т4 используются как модели для изучения шизмов белкового фолдинга. Кроме того на основе фага Т4 *ан вектор для экспонирования антигенных детерминант виру-человека (Ефимов,В.П. 1993).

Для развития работ по изучению фолдинга белков и белковой энерии целесообразно расширить спектр структурных белков а Т4.

В лаборатории молекулярной генетики впервые определена пеотидная последовательность генов 6-14, кодирующая струк-ные белки фага и созданы эффективные системы их экспрессии илипов.А.Г. 1992). Для изучения структурных и функциональ-свойств продуктов этих генов, а также гибридных молекул, данных на их основе, было необходимо разработать технологию паративного выделения высокоочиценных препаратов.

1.2. Цель и задача работы. Основная цель работы состояла зучении физико-химических свойств структурных белков бакте-фага Т4, что является необходимым этапом для последующего ведения белковой инженерии. Для достижения этой цели нами и поставлены следующие задачи:

1. Разработать простой метод для препаративного выделения ельных структурных белков Фага Т4.

2. Изучить физико-химические свойства продуктов г< 9, 10, 11, 12 и WAC (фибритин) бактериофага Т4;

а) установить и уточнить молекулярные массы методами ( кового электрофореза в ПААГ с SDS и в неденатурирующих усл< ях и равновесного центрифугирования; определить изоэлектрде кие точки.

б) исследовать вторичную структуру перечисленных белке молекул с применением метода спектрального анализа - кругоз дихроизма, а также с помощью калориметрии изучить термодинг ческие параметры денатурации и установить количество терме намических доменов.

3. Разработать методы кристаллизации некоторых из изу^ ных белков фага Т4.

1.3. Научная новизна и практическая ценность работа

' В настоящей работе с применением адсорбционной хромат рафии разработан простой метод для препаративного выделени? очистки биологически активных рекомбинантных белков бакте{ фага Т4.

Получены новые сведения фундаментального характера:

1) Методом кругового дихроизма изучена вторичная струе ра пг9,10,11 и WAC (фибритин).

2) С помощью калориметрии показано, что пг9 и nrll m не менее двух структурных доменов.

3) Впервые выращены кристаллы белка продукта гена 9, г годные для рентгеноструктурного анализа и получены наборы г ракционных данных с разрешением 2.8 А.

Результаты настоящей работы будут использованы для рас тия белковой инженерии, а также в исследованиях по белког фолдингу.

7.4.Основные положения, выносимые на защиту:

1.Хроматография на гидроксилапатите позволяет препарат но выделять из экстракта клеток, инфицированных мутантом (J

белок фибритин, а также рекомбинантные белки пг9,10,11 и бактериофага•Т4 с высокой степенью чистоты.

2.Белки пг9 и фибритин по своим физико-химическим свойс-наиболее подходящее для проведения работ по белковой ин-

рии.

3.Показана возможность получения кристаллов белка пг9 одных для построения трёхмерной структуры молекулы этого а.

I.5.Структура и объём диссертации. Работа состоит из вве-я, обзора литературы, экспериментальной части, результатов едований и их обсуждения, еыводов и списка цитированной ратуры (136 наименований). Диссертация изложена на 113 яйцах машинописного текста, содержит 26 рисунков и 2 таб-

I.6.Апробация работы. Результаты исследований были предс-ены на всесоюзном симпозиуме по химии белков (Тбили-990), на международном симпозиуме "100 лет вирусологии" Петербург,1992) и на симпозиуме биофизического общества (США, 1993).

I.'/.Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 печат-работы.

II.СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ.

11.1.Метод препаративного выделения рекомбинантных белков 10,11 и У АС. Для оценки перспективности белка для белковой нерии необходимо предварительное подробное изучение его ко-химических свойств. В связи с этим основной задачей яв-ся разработка методов получения чистых белковых препара-

Игвестно, что выделение и очистка каждого отдельного бел-ребует особых условий; нужно признать, что до настоящего •?ни процесс Еыделенкя белков носит эмпирический характер.

- А -

Разработанные технологии по очистке белков, которые пользуются в коммерческих целях, часто не доступны в откры публикациях. Однако, ясно, что при очистке многих белков, лученных методами генной инженерии, имеются большие потери конечный их выход составляет обычно от 2% до 10%.

Для выделения нативных пг12 и nrWAC фага ТА, мы инфици вали культуру клеток E.coll двойным амбер-мутантом фага ТА генам 6 и 23 (СеЛиванов,Н.А., 1982), а для их очистки мы пы лись использовать различные методы хроматографии. В проце работы мы нашли, что очистку nrWAC можно проводить на адсо ционном носителе - гидроксилапатите (ГАП). Белок пг12 необ тимо связывался с гидроксилапатитом, поэтому нами были под раны условия для выделения этого белка на ионообменн DEAE-Sephacel фирмы " Pharmacia ".

1 23 456 7 8 9 (0 „ 12 1 3 14

-«как

Рис.1.3лектрофоретический анализ фракций ь риьул1л' разделения белковой смеси с нативным и рекомбинант nrWAC на гидроксилапатите; ячейки 1-4, 6-8 содержат р личные фракции нативного nrWAC (фибритин); 9-натиЕ nrWAC после рехроматографии; в качестве маркёроЕ в яч ках 5,10,14- фаг Т4; 11-экстракт E.coli-, 12-экстр E.coll после экспрессии рекомбинантным nrWAC; 13- рек бинантный nrWAC после очистки на ГАП.

К моменту разработки нами метода очистки нативного фибрина гидроксилапатите в нашей лаборатории были созданы вы-эффективные экспресеионные системы для наработки отдельных ов фага Т4. Количество белкового продукта достигало более 20% от общего количества белка. Такая система позволила расширить возможности разработанного нами метода хроматог-и белков на ГАП (рис.1).

В процессе работы, для подбора оптимальных условий раздел и белков, мы проверили разные буферные системы. Были апро-шаны К, Иа фосфатные и Тг1з-НС1 буферы от 10 мМ до 200 мМ. [учшие результаты фракционирования были получены при 100 мМ ;-НС1 (рН 8.0). Было установлено, что применение этого бу-I с ионной силой ниже 100 мМ приводит к расширению основа-пика, т.е. к разбавлению препарата. При хрсмагографирова-с использованием буфера более чем 100 мМ ухудшалась форма а за счёт появления в згой фракции дополнительных белков. ?товый буфер "А" содержал: 100 мМ Тг1з-НС1 (рН 8.0), 10~4 М ,1.0 мМ РМЗр, 0,02% №аИз. Во время работы было изучено яние рН буферного раствора на прочность адсорбции исследуе-о белка на ГАП. Оказалось, что при рН 7.2 пг9, пгЮ, пг11 и АС элюируются с колонки при промывании носителя стартовым ером. Ввиду того, что продукты генов 9,10 и фибритин адеор-уются при рН 8.0 на поверхности ГАП более прочно, то для их 'ирования необходимо было повышение ионной силы. С этой :ью мы применили буфер "В" следующего состава: 100 мМ з-НС! (рН 8.0), 10~4 М ДТТ, 1.0 мМ РМБР, 0,02% ИаИз, 0.5 М '. Использование 0.5 М ИаР по сравнению с 0.5 М №аС1 для ло-¡ения ионной силы буфера значительно увеличивало выход бел-В ряде случаев для получения особо чистых препаратов мы вводили рехроматографию на гидроксилапатите в аналогичных ювиях., Разработанный метод позволил нам получить белки с щёнтрацией от 0.3 мг/мл - 1.0 мг/мл, чистота которых по жтрофореграмме достигала ^99% (рис.1). При этом белки чаемо освобождались от примесей нуклеиновых кислот.

Экстракты бактерий из 1.0 литра клеточной культуры с зкс-эссированными продуктами генов 9, 10, И и фибритин фага Т4,

количество которых достигало от 50 мг до 80 мг от общего кс чества белка, мы суспендировали в 10 мл буфере "А" и высеш ли сульфатом аммония 35% от насыщения при 4°С в течение часов. После центрифугирования при 7 ООО об/мин, при 4°С, течение 40 мин, белковый преципитат суспендировали в 10 мл го же буфера. Для удаления рибосом и ДНК в белковую смесь бавляли стрептомицин сульфата Иа, затем белковую смесь фрак онировали на ГАП. Очищенные, таким образом, белки были приг ны для спектрального анализа.

Отработанная нами технология очистки нативного фибрит позволила нам за один циюг хроматографии выделять рекомбин ные белки из экстракта 1.0 литра клеточной культуры Е.со! препаративных количествах: фибритин (пг№АС), пг9 до 30 мг пг11 до 15 мг (рис.1 и 2).

11.1. Изучение спектров кругового дихроизма белков проводили совместно с канд. физ.- мат. наук С.Ю.Веньяминовьн Институте белка РАН. С помощью метода КД нами были иеследов; нативный фибритин, а также рекомбинантные продукты генов 9,: 11 и ШС. Некоторые результаты этих исследований на прим< пг9 отражены на рис.3-5 и в таблице N 1. Молекулы фибрит] высокоструктурированы и содержат около 90% «-спиралей. В мо. кулах пг9 и пгЮ преобладает в-структура и относительно низ} содержание «-спиралей. Из таблицы видно, что расчёты, про! денные двумя различными методами, отражают соотношение элем« тов вторичной структуры пг9, пгЮ и пг11, которые хорошо сс ласуютея между собой. Кривые КД в далекой (184 нм-250 нм) области для исследованных белков продуктов генов 9, 10 и имеют вид характерный для белков имеющих низкое содержав ос-спиралей и высокое содержание е-етруктуры. В ближней УФ с ласти (240 нм-ЗЮ нм) спектры КД имеют достаточно болЬую ак литуду с четко выраженной тонкой структурой, что говори! том, что все эти белки имеют хорошо развитую вторичную стру туру. По кривым плавления фибритина установлено, что обрат мость термоденатурации белкового раствора для пгЭДАС зависит концентрации пг\МС. При с-0.5 мг/мл обратимость -80%, а при 1.5 мг/мл обратимость -50%.

1 2 3 4 5 67 8 S10ul2i3

с.2.Эдектрофоретический анализ отдельных фракций содержащих рекомбинантные белки: пг 9 и nrll в 10% ПААГ с SDS после разделения на ГАП; ячейки: 1 - белковая смесь с nrll; 2 - пропуск; 3,4 - очищенный nrll; 5 - бактериофаг Т4; 6-8 фракции, полученные при очистке nrll; 9 - клетки E.coli с пг9 после экспрессии; 10 - очищенный пг9; 11 - 13 фракции, полученные при очистке пг9;

По кривым плавления всех трёх белков: пг9, пгЮ и nrll ювидно, что они, при выбранных нами условиях, подвергаются .'обратимой тепловой денатурации. Эта необратимость вызвана 'регацией при высокой температуре и сопровождается при этом Зразованием агрегационной и-структуры. Кривые для белков пг9 пгЮ сильно изменяются с.изменением температуры, а кривые КД злка гена И меняются незначительно при увеличении температу-j до 80°С. Во всех случаях, после охлаждения в кювете, раст-зры имеют сильную опалесценцию из-за агрегации.

УФ спектры поглощения всех четырёх белков имеют вид, ха-актевдый для нопмяльных белков.

Рио.З.Спектр кругового дихроизма рекомбинантного пг9 в О Ма-фосфатном буфере, рН 7.3 при 10°С в дальней (А ближней (В) УФ областях.

Прецизионные калориметрические измерения пг9 и пгИАС ф< Г4 показали, что пг9 не является единой кооперативной систе1 и содержит два термодинамических доменов (рис.5), а пгУ/АС с< тоит, вероятно, из 7 доменов.

Белок пг11 также не является,единой кооперативной сис. мой и содержит не менее двух доменов. По теплоёмкости при ж ких температурах можно судить о полной структурированное белка; С20 с- 1.3 лж/г. град. Удельная теплота плавления Ь 36.0 ^г.град. Белок сильно агрегирует после денатурации.

Рис.4. УФ спектр поглощения продукта гена 9 в 0.1 M Na Ph, рН 7.3.

П.2. Аналитическое изоэлектрофонусирование в полиакрила-щом геле. Для определения изозлектрической точки пг9, пгЮ, "11 и фибритина изоэлектрофокусирование проводили с помощью эибора " Phast System " ГШведия) и методики описанной в руко-эдстве " Phast System Development Technique, Pharmacia, гзультаты эксперимента отражены в таблице N 2.

11.3.Кристаллизацию белков мы проводили совместно с дип-омником физико-технического Института Стрелковым, C.B. мето-ом висячей капли с сульфатом аммония в качестве осадителя при азных рН.

Капля объемом от 5.0 мкп до 20.0 мкл содержала 6.0 мг/мл 'чищенного белка гена 9 фага Т4. При определении содержания >елка в растворе мы использовали значение коэффициента зкс-■инкции пг9, которая рассчитана из независимого поглощения

GPOS, t.M Naf. pu 7.S. cil.2 n4.nl

Рис.5. Зависимость избыточной молярной парциальной теплоёмкости от температуры для пг9; приведены пики теплопоглощения, соответствующие последовательным стадиям денатурации, а также соответствующая рассчётная теплоёмкость белка; условия эксперимента: О.1 M К - Na Ph, рН 7.5.

имеющихся остатков тирозина (9 на мономер) и триптофана (2 на мономер) и равна 0.77. Исходный раствор хранили при 4° С в течение нескольких месяцев. При этом белок сохранял гомогенность на злектрофореграммах в полиакриламидном геле с SDS-ом и без SDS.

В различных опытах " нижний буфер " различался как по составу, так и по молярное™. Из-за значительно более еысокой молярности " нижнего буфера " по сравнению с буфером исходного

ТАБЛИЦА N 1

Элементы вторичной структуры четырех белков, рассчитанные двумя методами

пг 9 пг 10 пг 11 пг ШС

).16 0.11+0.01 0.08 0.10+0.02 0.23 0.21Ю.01 0.82 0.91+0.03

).66 0.72Ю.01 0.60 0.56Ю.02 0.20 0.35+0.01 0.00 0.00+0.00

).02 0.13Ю.01 0.08 0.28Ю.02 0.17 0.11+0.01 0.00 0.00+0.00

3.17 0. ОЗЮ. 02 0.25 0.06+0.03 0.41 0.32Ю.01 0.18 0.09+0.05

^агж 1973 Ргоуепс!!. 1931 1978 РгоуепсЬ. 1981 Уапе 1978 РгоуепсЬ. 1931 Уат^ 1978 Ргоуепс)"). 1931

ТАБЛИЦА N 2

Экспериментально определенные и теоретически рассчитанные р! для белков

Р1 Эксперимент. Рассчитанные

пг ШС 4.03 + 0.02 4.39

пг 9 4.04 1 0.03 4.77

пг 10 3.71 ± 0.20 4.12

ПГ11 4.25 + 0.03 4.39

раствора белка принималось, что рН в капле близок к рБ " i него буфера ". В результате изменения рН и начальной кощу рации сульфата аммония в капле нам удалось вырастить кристг белка гена 9 (рис.6а) и двухмерные кристаллы nrll (рис.бв) га Т4. Наилучшие кристаллы лг9 размером ребра до 0.35 мм, торые затем использовались для предварительного рентгеност! турного анализа, были получены при рН 4.0 и 1.2 М сульфата мония при типичном начальном составе капли: 10 мкл раст] белка (концентрация 6.0 мг/мл) плюс 10 мкл " нижнего буфер; В этих условиях в капле зарождались единичные кристаллы i штук), их появление наблюдалось примерно через две недели 25°С, а еще через две недели их видимый рост прекращался, видно на рис.ба, эти кристаллы имеют дефекты внешней фо[ Результаты хорошо воспроизводимы. При изменении темпера! кристаллизации до 4°С при рН от 3.5 до 9.0 мы наблюдали toj образование аморфного осадка. Добавление 2.0 мМ EDTA в ио ный раствор при 25°С кристаллизации не улучшали габитуса к[ таллов.

Ыы также использовали раствор белка, при хроматографа кой очистке которого применяли Q.5X детергент Triton Х-: Неопределенное количество связанного детергента, по-видимс присутствовало и после диализа, о чем свидетельствовали да! спектрофотометрического измерения. Выращенные кристаллы этого раствора белка имели совершенную огранку и давали б< резкие дифракционные пики, чем кристаллы выращенные из с; дартного раствора, и, по-видимому, имели ту же проетранстз ную группу и параметры ячейки.

Полученные кристаллы (рис.ба) с размером до 0.35 мм о: сятся к пространственной группе R 32 с параметрами гексг нальной ячейки а-Ь-86.5 А и с-156.2 А.

Кристаллы различной величины, количества и качества удавалось получить только при рН 3.5 - 4.25, иногда уже ч£ двое суток. Судя по габитусу, все они принадлежат к о; пространственной группе. Твердая фаза чаще всего осавда. сначала в виде аморфного осадка, а затем появлялись криета. В диапазоне рН от 4.5 до 9.0 при увеличении концентрации ci фата аммония выпадал только аморфный осадок; теоретически ] можный переход которого в кристаллическую фазу не наблюдг даже через три месяца.

По полученным рентгенограммам процессии, исходя из правил юания. и симметрии плоскости ЪкО обратного пространства и :тояний между рефлексами, установлено, что при описанных )виях белок гена 9 фага Т4 кристаллизуется в пространствен-группе Я 32 с параметрами гексагональной ячейки а-Ь-86.5 А ■156.2 А. Это соответствует одной мономерной молекуле 31.0 !а независимую часть ячейки или 18 мономерам в элементарной же; отношение объема кристалла к массе, содержащегося бел-(Ущ) равно 1.77 А3/0. Используя типичное для белков значе-плотности 1.35 г/см3, из Ут можно оценить долю объема зталла, занимаемую белком, в 697,. Эта величина находится в хнем диапазоне значений наблюдаемых для белковых кристал-

Таким образом, кристаллы белка гена 9 бактериофага Т4 кованы достаточно плотно.

Средний по направлениям предел дифракции полученных нами сталлов равен, как минимум, 2.8 А.

II.4.Заключение. В результате изучения физико-химических |йств белков пг9, пгЮ,- пг11, пг12 и фибритин можно предва-'ельно оценить потенциальную возможность их применения в [ковой инженерии в качестве векторов для экспонирования эпи-гов вирусов человека и животных. Б принципе, молекула бел-носителя должна отвечать определённым требованиям, как то:

1. Нарабатываться в больших количествах экспрессионными системами;

2. Белок должен обладать хорошей растворимостью;

3. Встроенные последовательности эпитопа должны сохранять правильную конформацию;

4. Белок должен быть«устойчив к клеточным прогеазам.

Ввиду того, что изучаемые нами белки в разной степени вечают этим требованиям, мы рассмотрим каждый белок по-от-льности.

Использовать пгЮ и пг12 в качестве Еекторов для анти-нных детерминант вирусов человека нам не представляется воз-'Жным, т.к. оба продукта генов. пгЮ и пг12, при хроматогра-:и очищаются в меньших количествах, чем фибритин, пг9 и пг11.

Рис.6.Микрофотографии белковых кристаллов: а) пг9; в) пгП

э того для эффективной сборки активного белка пг12 необхо-5елок-помощник - пг57.

К наиболее подходящим продуктам генов для белковой инже-и, на наш взгляд, можно причислить фибритин, как фибрил-ый белок, у которого большая часть молекулы экспонирована оверхности. Белок хорошо растворим, устойчив к клеточным еазам, он не существенен для сборки фага и в него можно аивать крупные фрагменты аминокислотных остатков (до 50 окислог). Фибритин интенсивно используется в лаборатории кулярной генетики в качестве модельной системы для изуче-механизмов белкового фолдинга суперспиральных белков. Пг 9 хорошо растворим, устойчив к клеточным протеазам, о выделять в больших количествах и в него встраивать про-нные последовательности аминокислот. Вероятно, на основе можно выращивать белковые кристаллы со встроенными антики детерминантами вирусов и не различимыми рецепторами. IK nrll фага Т4 также хорошо растворим, но менее устойчив к ■очным протеазам, его можно выделять в препаративных коли-■вах; легко кристаллизуется в двухмерные кристаллы. Поэтому :читаём, что пг9, nrll и фибритин являются наиболее подхо-ми белками для белковой инженерии с целью создания различ-препаратов.

III. ВЫВОДЫ

1. Разработан простой метод препаративного выделения бел-с помощью хроматографии на гидроксилапатите, позволяющий

гчать рекомбинантные белки - продукты генов 9,10,11 и WAC 5ритин) бактериофага Т4 высокой чистоты и в количестве от лг до 30 мг из 1.0 литра клеточной культуры E.coll, в зави-эсти от экспрессированного белка. Процесс очистки одного lía занимает 4-6 часов. Белки после очистки сохраняют биоло-эскую активность в тесте на комплементацию in vitro.

2. Изучены физико-химические свойства указанных белков:

а) установлены их изоэлектрические точки;

б) с помощью электрофореза в полиакриламвдном геле,, а же методом равновесного ульграценгрифугирования уточнены екулярные массы мономеров и установлены молекулярные массы

активного пг9, nrll и фибритина.

в) определены УФ спектры белков; ^г) методом кругового дихроизма изучена вторичная орг. зация белков, кодируемых генами 9, 10 и 11. Кривые КД : белков в далекой (180 нм -250 нм) УФ области характерны белков, имеющих низкое содержание а-епиралей и высокое со; жание з-структуры. Молекула фибритина высокоструктурирова] содержит около «-спиралей;

д) результаты прецизионной калориметрии указывают, пг9 и nrll содержат не менее двух термодинамических домено]

3. Впервые получены кристаллы молекул белка пг9- и Д1 мерные кристаллы nrll фага Т4. Предварительный рентгеност{ турный анализ кристаллов пг9 показал, что выращенные гексг нальные кристаллы стабильны под воздействием Х-лучей и ю пространственную группу R 32 с параметрами элементарной я* ки: а-Ь-86.5 А; с-156.2 А. Число молекул в независимой че элементарной ячейки равно 18; удельный объём кристалла - 1 A3/Da. Доля объема кристалла, занимаемая белком, состава 69%.

Получен полный набор дифракционных данных, пригодных определения пространственной структуры пг9 с разрешением 2.

4. В результате проведённых исследований выяснено, продукты генов 9, 11 и фибритин являются удобными моделями белковой инженерии с целью получения гибридных молекул сод жаших эпитопы вирусов человека.

материалам диссертации опубликованы:

Зурабишвили, Т.Г., 1992. " Очистка структурных белков бактериофага Т4 на гидрокеилапатите ". Сб.науч.трудов НИИ Вирусологии им.Д.И.Ивановского, РАМН. С. 74-7?.

Nepluev, I.V., Eflmov, V.P., Sobolev, B.N. ,

Zurabishvili, T.G., Strelkov, S.G., Rassulin. Y.Y., Sadykova, G.K. Pakhomova, A.V., Marusich, E.I. & Mesyanzhinov, V.V. 1992. Bacteriophage T4 as a model for protein engineering. Abstract on International symposium " 100 years of virology '* St. Petersburg, September 21-25. 75.

Селиванов, H.A., Прилипов. А.Г., Зурабишвили, Т.Г. Соболев, Б.Н., Ефимов, В.П., Мееянжинов, В.В. 1990. " Структурная организация и сборка белков бактериофага Т4, кодируемых поздними генами 9-12, WAC, 13-15 ". Всесоюзный симпозиум по химии белков. Тезисы докладов. Тбилиси, 1990. С. 19.

\lakhov, A.M., Trus, B.L. , Conway, J.F. , Simon, M.N., Zurabishvili, T.G., Mesyanzhinov, V.V., & Steven, A.C. 1993. Molecular structure & conformational swithcing of a viral adhesin. Biophis. Soci.. USA.

Ti n РГРК Зак.//87-100