Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Очистка, физико-химические и регуляторные свойства изоформ сукцинатдегидрогеназы из штаммов Sphaerotilus natans с разным типом метаболизма при органо- и миксотрофном росте

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Очистка, физико-химические и регуляторные свойства изоформ сукцинатдегидрогеназы из штаммов Sphaerotilus natans с разным типом метаболизма при органо- и миксотрофном росте"

На правах рукописи

005051866

Ву Тхи Лоан

ОЧИСТКА, ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ И РЕГУЛЯТОРНЫЕ СВОЙСТВА ИЗОФОРМ СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ИЗ ШТАММОВ БРНАЕЛОТК, £/5 ЫА ТАЫБ С РАЗНЫМ ТИПОМ МЕТАБОЛИЗМА ПРИ ОРГАНО- И МИКСОТРОФНОМ РОСТЕ

Специальность 03.01.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 ч ДПР ¿013

Воронеж-2013

005051866

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Воронежский государственный университет» (ФГБОУ ВПО «ВГУ»).

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Епринцев Александр Трофимович

Официальные оппоненты: Наквасина Марина Александровна

доктор биологических наук, доцент, Воронежский государственный университет, профессор кафедры биофизики и биотехнологии

Семенова Елена Васильевна

кандидат биологических наук, Воронежская государственная медицинская академия им. H.H. Бурденко, доцент кафедры организации фармацевтического дела и клинической фармации

Ведущая организация: Институт биохимии и физиологии

микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Защита состоится «оК> » апреля 2013 года в часов на заседанш

Ученый секретарь диссертационного совета

2013 года■^Syf

X ^/Грабович Маргарита Юрьевна

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Сукцинатдегидрогеназный ферментный комплекс (сукцинат : акцептор-оксидоредуктаза, сукцинат-убихинон-редуктаза) является энзимом, служащим одновременно компонентом дыхательной цепи и цикла Кребса, обеспечивающий трансэлиминирование двух атомов водорода от янтарной кислоты с образованием фумарата (Игамбердиев, Фалалеева, 1994). Сукцинатдегидрогеназа (СДГ, КФ 1.3.5.1), являясь поли функциональным ферментом, выполняет функции комплекса II ЭТЦ, катализирует реакцию цикла трикарбоновых кислот и участвует в одном из этапов глюконеогенеза (утилизируя сукцинат, образуемый в глиоксилатном цикле) (Епринцев, Попов, 1999). Известно, что трансформация биохимических процессов происходит с помощью ферментов, причем в этих сложных процессах участвуют изоферменты. У бактерий, которые часто меняют направление метаболических процессов, осуществляя адаптивную реакцию, редко встречается изоферментный полиморфизм (Хочачка, Сомеро, 1977). Ранее в нашей лаборатории была установлена структурная перестройка малатдегидрогеназной системы, обеспечивающая вариабельность метаболических потоков у серобактерий (Епринцев и др., 2007). Значение сукцинатдегидрогеназы в механизмах осуществления адаптивной реакции клеточного метаболизма практически не известно. Особый интерес представляет исследование ферментативной регуляции метаболизма у бактерий 5. лаГа/к, являющихся умеренными термофилами и способными в зависимости от типа питательной среды осуществлять органотрофный или миксотрофный рост (Епринцев и др., 2011). Бактерии Б.пагапБ штамма Д-507 выделены из природных термальных сероводородных источников. Бактерии штамма Д-380 относятся к мезофиллам и являются типичными обитателями антропогенных экосистем, использующих только органотрофный тип питания (Гриднева и др., 2009). Ранее было показано, что малатдегидрогеназная ферментная система в процессе посттрансляционной модификации формирует димерную структуру (обеспечивающую функционирование ЦТК) или тетрамерную (функционирующую в глиоксилатном цикле). Выявлено, что не только тип питания может влиять на структуру и характеристики ферментов. Показано, что регулирование активности фермента путем трансформации изозимного состава белков может осуществлять температурный фактор. Для

\ .

сукцинатдегидрогеназного ферментного комплекса подобных исследований не обнаружено. В связи с этим определенный интерес вызывает изучение структурно-функциональных особенностей сукцинатдегидрогеназы в бактериях S.natans при разном типе питания.

Целью данной работы являлось получение гомогенных препаратов изоформ СДГ из бесцветных серобактерий S. natans при разных условиях роста и изучение их структурно-функциональных и регуляторных свойств.

В соответствии с заданной целью были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать с помощью маркерных ферментов цикла Кребса и глиоксилатного пути особенности трансформации углеводного метаболизма у разных штаммов S. natans при органотрофном и миксотрофном питании.

2. Выявить с помощью электрофореза в полиакриламидном геле изоферментный состав сукцинатдегидрогеназной ферментной системы у штамма Д-507 и штамма Д-380 бесцветной серобактерии Sphaerotilus natans.

3. Осуществить с помощью многостадийной схемы очистку изоформ сукцинатдегидрогеназы из разных штаммов и получить электрофоретически гомогенные препараты исследуемых бактерий.

4. Изучить четвертичную структуру изоформ сукцинатдегидрогеназы из разных штаммов S. natans в условиях органо- и миксотрофного питания.

5. Установить значения констант Михаэлиса и рН-оптимума для окисления сукцината изоформами СДГ исследуемых штаммов бактерий.

6. Исследовать влияние температуры на скорость ферментативной реакции и термостабильность изоформ СДГ из штаммов Д-507 и Д-380.

7. Выяснить влияние АТФ и АДФ на функционирование высокоочищенных препаратов изоформ сукцинатдегидрогеназы.

8. Изучить регуляторные свойства различных ионов на функционирование изоформ сукцинатдегидрогеназы из S.natans.

9. Разработать способ длительного хранения препаратов изоформ сукцинатдегидрогеназы, выделенных из штаммов Д-507 и Д-380 S. natans.

Научная новизна. Показано, что в условиях органотрофного роста у S.natans функционируют две изоформы сукцинатдегидрогеназы у штамма Д-507 и одна форма у штамма Д-380. Анализ ферментативной активности маркерных энзимов свидетельствует, что в условиях миксотрофного роста индуцируется у исследованных бактерий штамма Д-507 глиоксилатный цикл.

Получены в электрофоретически гомогенном состоянии три формы сукцинатдегидрогеназы из 5.ла?ал5 при разных условиях питания. Установлена четвертичная структура всех изоформ, представляющая гетеротетрамер. Каталитические и регуляторные характеристики у изоформ, осуществляющих функционирование цикла трикарбоновых кислот, имеют близкие значения. Установлены термодинамические характеристики изоформ

сукцинатдегидрогеназы и их термостабильность.

Практическая значимость. Результаты диссертационной работы расширяют и углубляют знания о структурно-функциональных характеристиках изоформ сукцинатдегидрогеназы в бактериях БрЬаегоШт пагапз при разных типах питания. Полученные гомогенные препараты сукцинатдегидрогеназы могут найти применение в научно-исследовательских работах, как вспомогательный энзим для изучения других ферментов. Предлагаемый способ хранения обеспечивает широкое использование препаратов изоформ сукцинатдегидрогеназы в лабораторной практике. Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении лекций по биохимии, спецкурсах по энзимологии, биохимическим механизмам адаптации прокариот, а также при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.

Основпые положения, выносимые па защиту.

1. Бактерии БрИасгоШт па1ат штамм Д-507 характеризуются мобильным типом обмена веществ, о чем свидетельствует изменение ферментативной активности маркерных энзимов. Трансформация метаболизма (индукция глиоксилатного цикла) у бактерий штамма Д-507 вызывается сменой органотрофного роста на миксотрофный.

2. Получены электрофоретически гомогенные препараты изоформ сукцинатдегидрогеназы из разных штаммов бактерий 5.л atans. Установлено, что изоформы СДГ состоят из четырех различных по молекулярной массе субъединиц, то есть молекула энзима представляет собой гетеротетрамер.

3. Выявлены две изоформы СДГ в бактериях штамма Д-507 при органотрофном и миксотрофном типе роста. У бактерий штамма Д-380 функционирует только одна изоформа исследуемого фермента.

4. На гомогенных препаратах сукцинатдегидрогеназы, выделенных из

разных штаммов, исследованы регуляторные особенности функционирования данной ферментной системы. В частности, показано наличие активирующего эффекта функционирования СДГ, вызываемого ионами хлора.

5. Проанализированы различные варианты хранения изоформ сукцинатдегидрогеназы с использованием стабилизаторов белковой молекулы и низких температур. Наиболее высокая сохранность активности СДГ характерна при их хранении в условиях низкой температуры (-78 °С). Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях. Они были представлены на межрегиональных конференциях, посвященных памяти A.A. Землянухина «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов» (Воронеж, 2010, 2011, 2012 гг), на 15 международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (2011), ежегодных научных сессиях, отчетных конференциях преподавателей и сотрудников Воронежского государственного университета (2011-2012гг.).

Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 8 публикациях - 7 статьях и 1 тезисе.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (170 источников). Иллюстрационный материал включает 6 таблиц и 40 рисунков.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В качестве объекта исследования были использованы бактерии Sphaerotilus natans штамм Д-507, выделенные из обрастаний, образованных бесцветными нитчатыми микроорганизмами. Выделение микроорганизмов было осуществлено из умеренно термального сульфидного источника Краснодарского края (г. Горячий Ключ). Штамм Д-380 Sphaerotilus natans был выделен из аэротенков очистных сооружений для бытовых сточных вод (г. Воронеж). Культура бактерий Sphaerotilus natans была предоставлена из коллекции микроорганизмов сотрудниками научной лаборатории кафедры

биохимии и физиологии клетки ВГУ.

Состав питательных сред для культивирования микроорганизмов.

Культивирование бактерий осуществляли в питательной среде, содержащей следующие компоненты (мг/л): МН4С1 - 300; №2НР04х7Н20 -34,4; ¡У^504х7Н20 - 22,5; СаС12- 27,5; КН2Р04- 8,5; К2НР04 - 21,5; пептон -500; дистиллированная вода; рН среды 7,5. Для культивирования БрНаегоШт пШапз в миксотрофных условиях в питательную среду добавляли тиосульфат в концентрации 1 г/л.

Определение активности сукцинатдегидрогеназы. Для определения активности СДГ культуры клеток бактерий разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора УЗДН-2Т при мощности 500 Вт и частоте 22 кГц в течение 2,5 мин в ледяной бане с последующим добавлением Тритона X-100 4,02% (0,002% к объёму гомогената). Затем гомогенат центрифугировали при 3000 g в течение 5 мин. Супернатант использовали для выделения мембранной фракции путем центрифугирования при 12000^ в течение 15 мин. Полученный осадок ресуспендировали в 2 мл 10 мМ Трис-НС1-буфера, рН 7.8, содержавшего 2 мМ сукцината натрия и 0.01% Тритона Х-100, и использовали для измерения активности фермента.

Определение активности ключевых Ферментов_НТК и

глиоксилатного цикла. О функционировании малатдегидрогеназной системы (КФ 1.1.1.37) судили с помощью спектрофотометрического измерения изменений оптической плотности реакционных смесей на СФ-56 и Бресогс! иУ-УК при 340 нм (Климова, Епринцев, 2008). Измерение активности фумаратгидратазы (КФ 4.2.1.2) осуществляли методом, основанным на учете разности поглощения лучей при X = 240 нм малатом по сравнению с фумаратом (Землянухин А.А., Землянухин Л.А., 1996).

Интенсивность функционирования аконитатгидратазы (КФ 4.2.1.3) измеряли при длине волны 240 нм (Епринцев и др., 2007). Активность изоцитратдегидрогеназы (КФ 1.1.1.42) определяли при 340 нм (Романова, 1980). Определение активности изоцитратлиазы (КФ 4.1.3.1) проводили, учитывая разницу экстинкции при X = 324 нм комплекса, образующегося после взаимодействия фенилгидразина, присутствующего в реакционной среде, и образующегося глиоксилата (Епринцев и др., 2007). Для определения активности цитратсинтазы (КФ 4.1.3.7) использовали специфический метод

(Климова, Епринцев, 2008). Активность малатсинтазы (КФ 4.1.3.2) измеряли при X = 412 нм. Метод основан на спектрофотометрическом определении скорости появления тиоловых групп свободного СоА, регистрируемого с помощью реактива Эллмана. Образующийся меркаптид-ион имеет максимум поглощения при длине волны 412 нм (Климова, Епринцев, 2008).

Определение количества белка. Общее количество белка определяли по методу Лоури с соавт. (Lowry et al., 1951).

Схема очистки сукцинатдегндрогеназы из Svhaerotilus natans. Очистку фермента осуществляли в несколько стадий при температуре 0-4°С. Клетки разрушали с помощью ультразвука. После фракционирования сульфатом аммония проводили гель-фильтрацию на колонке (1,5 х 20 см), заполненной сефадексом G-25 («Pharmacia», Швеция). Ионообменную хроматографию осуществляли на ДЭАЭ-целлюлозе («Whatman», Англия). Фермент десорбировали с колонки градиентом концентрации KCl от 20 до 150 мМ. Гель-хроматографию на колонке с сефадексом G-200 проводили для определения молекулярной массы нативной молекулы СДГ.

Проведение электрофоретических исследований. Аналитический электрофорез. Электрофоретические исследования проводили по методике Дэвиса (Davis, Ornstain, 1959). Универсальное окрашивание белков осуществляли нитратом серебра. Для специфического проявления множественных молекулярных форм СДГ использовали тетразолиевый метод (Климова, Епринцев, 2008).

Определение молекулярной массы субъединиц СДГ. Для определения молекулярной массы СДГ методом электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия пользовались детергентной системой, описанной в 1970 году Лэммли (Laemmly, 1970).

Исследование кинетических характеристик и регуляции активности фермента. Кинетические свойства фермента изучали на электрофоретически гомогенных препаратах. Определение констант Михаэлиса осуществляли с использованием программ линейной аппроксимации по методу наименьших квадратов методом Лайнуивера-Берка (Диксон, Уэбб, 1982; Келети, 1990; Варфоломеев, 1999).

Статистическая обработка экспериментальных данных. Опыты проводили в трехкратной биологической и пятикратной аналитической повторностях. В

таблицах и на рисунках даются результаты типичных опытов, причем каждое значение есть среднее арифметическое из трех определений. Для определения достоверности результатов исследований применяли метод вариационной статистики. Полученные данные обрабатывали с использованием стандартных статистических методов с помощью критерия Стьюдента (Лакин, 1990).

АКТИВНОСТЬ КЛЮЧЕВЫХ ФЕРМЕНТОВ ЦТК И ГЛИОКСИЛАТНОГО ПУТИ В БАКТЕРИЯХ 5. ЫАТА№ ПРИ РАЗНЫХ ТИПАХ ПИТАНИЯ Исследовали штамм Д-507, который в зависимости от источника углерода обладал органотрофным типом питания или миксотрофным. В качестве образца органотрофного роста использовали штамм Д-380 исследуемой бактерии. Измерялась активность ферментов, функционирующих только в цикле трикарбоновых кислот (сукцинатдегидрогеназа и фумаратгидратаза), в глиоксилатном цикле (изоцитратлиаза и малатсинтаза), а также ферменты «общие» для обоих метаболических путей (малатдегидрогеназа, аконитаза, цитратсинтаза). Величины активности ферментов у БрИаегоШиз пасам в разных условиях питания и при использовании двух штаммов, отличающихся по типу

Рис. 1. Величина общей и удельной активностей сукцинатдегидрогеназы (1,2) и фумаратгидратазы (3,4) при различном типе питания S. natans I - органотрофный рост штамма Д-507, II - миксотрофный рост штамма Д-507, III - органотрофный рост штамма Д-380

Рис. 2. Величина общей и удельной активностей изоцитратлиазы (1,2) и малатсинтазы (3,4) при различном типе питания Sphaerotilus natans I - органотрофный рост штамма Д-507, II - миксотрофный рост штамма Д-507, III - органотрофный рост штамма Д-380

Изменение уровня активности сукцинатдегидрогеназы и фумаратгидратазы мало зависело от типа питания. Анализ значений активности маркерных ферментов глиоксилатного пути изоцитратлиазы и малатсинтазы указывает на определенные отличительные особенности. Так, максимальная величина активности этих энзимов обнаруживается у штамма Д-507 при миксотрофном питании (рис. 2).

ИЗОФЕРМЕНТНЫЙ СОСТАВ СДГ БАКТЕРИЙ 5. ЫА ТАШ ШТАММ Д-507 И Д-380 ПРИ ОРГАНОТРОФНОМ И МИКСОТРОФНОМ РОСТЕ С помощью электрофореза в 7,5% ПААГ с последующим специфическим окрашиванием на активность СДГ в бесцветных серобактериях 5. лаГал5 были обнаружены две изоформы в штамме Д-507 при органотрофном и миксотрофном питании. Величина электрофоретической подвижности выявленных изозимов составляла 0,34 (СДГО и ОД (СДГ2) (рис.3). Наличие двух изоформ СДГ может быть связано с полифункциональностью исследуемой ферментной системы.

Рис. 3. Специфическое проявление сукцинатдегидрогеназы из бесцветных серобактерий ЗрЬаегоШиБ па1апз при различном типе питания: (а) органотрофный рост штамма Д-507; (б) - миксотрофный рост штамма Д-507; (в) органотрофный рост штамма Д-380.

1,2 — полоса ферментативной активности; Р — фронт красителя.

Интересно, что у штамма Д-380 5. ла^алх, способного расти только при условиях органотрофного питания, обнаружена только одна изоформа энзима с 0,30 (СДГ3). Функция этого изоэнзима у данного микроорганизма связана, по-видимому, с катализом ферментативной реакции в ЦТК. Ранее в нашей лаборатории было показано, что штамм Д-380 обладает только димерной

формой малатдегидрогеназы, функционирующей в цикле Кребса (Бпринцев и др., 2011).

ОЧИСТКА ИЗОФОРМ СДГ ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ БАКТЕРИЙ Для получения в высокоочищенном состоянии изоформ СДГ из 5.лайл5 (штамм Д-507) в условиях органотрофного и миксотрофного питания использовали многостадийную очистку (табл.1). Наиболее эффективной стадией очистки являлась ионообменная хроматография, позволившая разделить изоформы сукцинатдегидрогеназы. Особый интерес вызывала очистка СДГ из 5. па1апя (штамм Д-380), так как на электрофореграммах обнаруживалась только одна изоформа фермента в гомогенате этого штамма. Использование четырехстадийной очистки позволило получить высокоочищенный препарат СДГ с удельной активностью 12,54. При этом степень очистки фермента составляла 55 раз, а выход равнялся 12 %. Применение ионообменной хроматографии позволило выявить только один пик, обладающий сукцинатдегидрогеназной активностью.

Таблица 1.

Стадии очистки изоформ сукцинатдегидрогеназы из 5. лайл5 (штамм Д-507) _при миксотрофном питании (п=3, р<0,05) __

Стадия очистки Объём, мл Общая активность, Е Общий белок, мг Удельная активность, Е/мг белка Выхо д% Степень очистки

Гомогенат 4,5 6,55 23,45 0,279 100 1

Фракционирование сульфатом аммония 3,0 6,31 6,95 0,908 96 3,2

Гель-фильтрация на сефадексе в-25 2,5 6,0 5,85 1,026 91 3,6

Хроматография наДЭАЭ- 1 2 0,67 0,053 12,642 10 45,3

целлюлозе 2 2 0,91 0,065 14,0 14 50,2

ИССЛЕДОВАНИЕ НА ГОМОГЕННОСТЬ ПОЛУЧЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ Гомогенность полученных препаратов изоформ сукцинатдегидрогеназы определяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с

последующей окраской нитратом серебра. Было показано, что после ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе получены гомогенные препараты, о чем свидетельствует наличие одной белковой полосы для сукцинатдегидрогеназы из разных штаммов 5. лайл5 (рис. 4).

I II Ш

11 й !> о в 6

Рис. 4. Электрофореграммы очищенных препаратов СДГ из БрИавгоШиз па1апэ штамм Д-507 при миксотрофном росте (I, II) и штамм Д-308 (III):

(а) - специфическое проявление, (б) - окрашивание универсальным красителем нитратом серебра; 1 - белковая полоса с - 0,10 (СДГ2), 2 - белковая полоса с - 0,34 (СДП), 3 - белковая полоса с - 0,30 (СДГ3); Р - фронт

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ И СУБЪЕДИНИЧНОГО СТРОЕНИЯ ИЗОФОРМ СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

Молекулярная масса иативных молекул СДГ. Значения молекулярной массы нативной формы СДГ определяли гель-хроматографией на сефадексе О-200. Величина этого показателя для изоформы с = 0,34 (СДП) составляла 154 кДа, для СДГ2 - 159 кДа. Для штамма Д-380 значение молекулярной массы единственной изоформы с = 0,30 (СДГ3) равнялось 152 кДа (табл.2). Анализ литературных данных показывает, что молекулярная масса бактериальной СДГ находится в пределах значений, описанных для других объектов (Епринцев и др., 2010; Шульц, Ширмер, 1982).

Молекулярная масса субъединиц изоформ СДГ.

Электрофоретическое исследование в присутствии додецилсульфата натрия позволило измерить значение молекулярной массы субъединиц СДГ2 в БрИавгоШиз ла?ал5 Д-507 при органотрофном питании. Полученные величины этого показателя составили: 70,8; 35,0; 31,8; и 16,2 кДа (табл.2). Значения молекулярной массы субъединиц изоформы СДГ! равнялись 71,2; 37,0; 32,5; 17,5. Для измерения величины молекулярной массы субъединиц СДГ3 из 5.

Таблица 2.

Величины молекулярной массы нативной молекулы сукцинатдегидрогеназы и субъединиц из Sphaerotilus natans (n=3, р<0,05)

Показатель S. natans Д-507 (органотрофный рост) S. natans Д-507 (миксотрофный рост) S. natans Д-380 (органотрофный рост)

Молекулярная масса нативной молекулы 154 159 152

Количество субъединиц 4 4 4

Молекулярная масса субъединиц А 70,8 71,2 72,0

В 35,0 37,0 34,5

С 31,8 32,5 29,4

D 16,2 17,5 16,0

natans штамм Д-380 использовали построение калибровочной кривой с помощью маркерных белков.

Как видно из полученных данных (табл.2), величины молекулярной массы колебались у разных субъединиц от 72 до 16 кДа. Значение этого показателя для субъединицы А равнялось 72,0; для субъединицы В - 34,5; для субъединицы С -29,4; для субъединицы D - 16.

ИССЛЕДОВАНИЕ КАТАЛИТИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК ИЗОФОРМ СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ С помощью специального метода обработки данных рассчитаны значения К„ для изоформ сукцинатдегидрогеназы. Кинетические константы (Км) окисления сукцината, определенные по Лайнуиверу-Берку, равнялись: для изоформы СДГ2 0,615 мМ, для СДГ1 0,531 мМ (штамм Д-507). Интересно отметить, что константы Михаэлиса, определенные для данных изоформ СДГ из S. natans, оставались примерно такими же при разных условиях выращивания бактерий (рис.5). Величина константы Михаэлиса СДГ3 из штамма Д-380 равнялась 0,416 мМ.

Сравнительный анализ полученных значений Км показывает, что наибольшее сродство к сукцинату характерно для фермента СДГ3 из штамма Д-380 и быстродвижущейся изоформы СДГ] из штамма Д-507. Данные формы СДГ, по-видимому, обеспечивают функционирование цикла трикарбоновых кислот. Ранее в наших исследованиях сообщалось, что S. natans штамм Д-380

характеризуется интенсивным функционированием ЦТК и отсутствием глиоксилатного цикла при органотрофном росте (Епринцев и др., 2007).

Рис.5. Определение значений Км по сукцинату для СДГ из 5. пагапБштамм

Д-507:

(А) - изоформа (СДГ2), (Б) - изоформа (СДГ,).

ВЛИЯНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ИОНОВ ВОДОРОДА И ТЕМПЕРАТУРЫ

НА АКТИВНОСТЬ ИЗОФОРМ СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ Полученные в нашей работе данные свидетельствуют, что изоформа СДГ, выделенная из 5. ла£алх штамм Д-380 (СДГ3), при органотрофном росте проявляет максимальную активность при значениях рН = 7,0, а другие исследуемые изоформы СДГ из штамма Д-507 имели рН-оптимум 7,2.

Результаты определения температурного оптимума для изоформ СДГ из 5. лэйл5 приведены в таблице 3. Повышение температуры от 5 до 45-52 °С коррелирует с интенсификацией каталитического действия изоформ фермента. Скорость окисления сукцината в этом интервале температур возрастает в 8-10 раз. Величина температурного оптимума для фермента СДГ из штамма Д-380 составляет 45 °С, для СДГ! - 47 °С и СДГ2- 52° С. При дальнейшем повышении температуры наблюдается резкое снижение активности фермента. При значениях температуры 70 °С наступает сильная денатурация ферментативной молекулы. Анализ данных по исследованию влияния температурного фактора на скорость ферментативного окисления сукцината показывает, что термодинамические параметры изученных изоформ сукцинатдегидрогеназы, выделенных из бактерий 5. ла£зл5, отличаются незначительно. Тем не менее, можно выделить близость значений этих показателей для изоформы СДГ1 из штамма Д-507 и СДГ3 из штамма Д-380 (табл. 3). Аналогичное сходство характерно и для других термодинамических характеристик.

Таблица 3.

Величины термодинамических показателей изоформ сукцинатдегидрогеназы,

выделенных из БрИаегоМиз па^пя при разных условиях питания __(п=3, р<0,05)__

Показатель Я. па1апБ Д-507 (органотрофный рост) 5. ла?зл5 Д-507 (миксотрофный рост) 5. лаСал^ Д-380 (органотрофный рост)

Величина температурного оптимума, 1 °С 47 52 45

Энергия активации, кДж 2,9 4,5 3,2

Температурный коэффициент, (Зю 1,9 1,56 1,88

В частности, энергия активации для СДГ]ИЗ штамма Д-507 (органотрофный рост) близка по своему значению к этому показателю, установленному для фермента из штамма Д-380 (органотрофный рост). Кроме того, количественные значения температурного коэффициента для изоформы СДГ из бактерии Я. па1ат штамм Д-507 и штамма Д-380 в условиях органотрофного роста близки.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТИ СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

Термостабильность изоформы СДГ2 из штамма Д-507 при миксотрофном росте отличалась от данной характеристики для других изоформ (рис. 6). Менее стабильной по отношению к температурной экспозиции оказалась изоформа СДГ] из штамма Д-507 при органотрофном росте. Семидесятиградусная экспозиция практически полностью инактивировала данную форму СДГ.

Таким образом, сравнительный анализ термостабильности изоформ сукцинатдегидрогеназы из разных штаммов свидетельствует, что значение этого показателя у фермента, выделенного из умеренно термофильных бактерий 5. ла^алх, находится примерно на одном уровне. В то же время можно отметить определенные тенденции сходства термостабильности для фермента (СДГ3) из штамма Д-380 и изоформы СДГ: из штамма Д-507, культивируемых в органотрофных условиях. По нашему мнению, данные изоформы обеспечивают функционирование одного и того же процесса - цикла трикарбоновых кислот.

Рис.6.

Термостабильность м едленно движущейся изоформы сукцинат-дегидрогеназы (СДГ2) из 5. ла£алз штамм Д-507

РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ИЗОФОРМ СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ Влияние АТФ и АДФ на активность СДГ. Влияние физиологических концентраций АДФ на активность СДГ может быть обусловлено зависимостью ее функционирования от энергетического статуса клетки (Епринцев и др., 2010). Таким образом, полученные высокоочищенные препараты сукцинатдегидрогеназы из 5. лаГал5 штаммов Д-507 и Д-380 открыли возможность для исследования механизма регуляции активности фермента энергетическими эквивалентами бактериальной клетки. В наших опытах проводилось изучение действия различных концентраций АТФ на интенсивность функционирования изоформ сукцинатдегидрогеназы из штаммов Д-507 и Д-380. Действие АТФ на активность изоформ изучалось на фоне разных

концентраций сукцината (2 мМ, 4 мМ и 10 мМ).

5 ■

Е мл

П7Г 15 3 1 2 3

111Й

0 3 6 10 В 25 [АТФ], мкм

Рис. 7. Влияние АТФ на функционирование сукцинатдегидрогеназы (СДГО из ла/алх штамм Д-507 в условиях органотрофного питания (концентрация сукцината 1 - 2 мМ; 2-4 мМ; 3 - 10 мМ)

Экспозиция(ымн)

Как видно из полученных данных (рис.7), АТФ в разных концентрациях вызывал неодинаковое действие на активность энзимов. Практически не наблюдалось влияние этого кофермента на функционирование изоформ сукцинатдегидрогеназы из штаммов Д-507 и Д-380, культивируемых в органотрофных условиях. По нашему мнению, эти изоформы обеспечивают функционирование важнейшего энергетического процесса цикла трикарбоновых кислот. Определенное активирующее действие АТФ вызывал в концентрации 6 и 10 мкМ на работу изоформы сукцинатдегидрогеназы из штамма Д-507 при миксотрофном росте.

Исследование действия другого энергетического эквивалента клетки на активность сукцинатдегидрогеназы показало, что его низкие концентрации (2 мкМ) не вызывают значительного эффекта по изменению функционирования фермента. Полученные данные (рис.8) свидетельствуют, что АДФ при концентрации больше 5 мкМ оказывает активирующее действие на работу ферментной системы.

Рис. 8. Влияние АДФ на функционирование сукцинатдегидрогеназы (СДГ[) из 5. ла?ал5 штамм Д-507 в условиях органотрофного питания (концентрация сукцината 1-2 мМ; 2 -5 мМ)

о : 6 ш М ЯЛ [йШ^отг-з

Наибольший эффект усиления активности обнаружен для изоформ, осуществляющих функционирование цикла трикарбоновых кислот, к которым можно отнести изоформу СДГ! из штамма Д-507 и СДГ3 из штамма Д-380 в условиях органотрофного роста. При концентрации АДФ 10 мкМ обнаружено индуцирование активности сукцинатдегидрогеназы в 1,8-1,9 раза для обоих штаммов. Анализ полученных данных позволяет выявить меньшую эффективность АДФ на функционирование изоформ сукцинатдегидрогеназы из штамма Д-507 при миксотрофном росте.

Влияние различных солей на активность сукцинатдегидрогеназы. Анализ

действия различных солей на каталитическую активность СДГ позволяет говорить о том, что активирующий эффект на фермент проявляет ион СГ, поскольку содержащие его соли интенсифицируют работу исследуемого фермента (рис.9). Увеличение активности сукцинатдегидрогеназы в присутствии ионов СГ можно объяснить специфической химической модификацией белковой молекулы фермента (РаБ-Ра^а а а!., 1998).

203 1 3

KCl NaCl NH/.'I KjSOj N\i,SO, Zu M» MhSO,

(CH,COO)t (CHjCOO),

Рис. 9. Влияние различных солей на активность изоформ СДГ из бактерий Sphaerotilus natans:

1 - изоформа СДГ[ из штамма Д-507 (органотрофный рост);

2 - изоформа СДГ2 из штамма Д-507 (миксотрофный рост);

3 - изоформа СДГз из штамма Д-380.

УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ ИЗОФОРМ СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ИЗ РАЗНЫХ ШТАММОВ 5. NATANS Проанализированы различные варианты хранения изоформ сукцинатдегидрогеназы с использованием стабилизаторов белковой молекулы и низких температур. Наилучшая сохранность активности ферментов характерна при их хранении в условиях низкой температуры -78 °С. Через два месяца экспозиции фермента в этих условиях сохраняется 80-85% от первоначальной активности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования свидетельствуют о том, что бактерии Sphaerotilus natans характеризуются мобильным типом обмена веществ. Анализ ферментативной активности маркерных энзимов показывает, что трансформация метаболизма (индукция глиоксилатного цикла) характерна

только для бактерий штамма Д-507 и вызывается сменой органотрофного роста на миксотрофный. Подобной картины не обнаружено для клеточного метаболизма штамма Д-380, характеризующегося исключительно органотрофным типом питания (Гриднева и др., 2009). Изоферментный состав исследуемых бактерий также проявляет строгую специфичность. Только в бактериях штамма Д-507 функционируют две изоформы СДГ. Причем изоформа СДГ2 с Rf 0,10, отсутствующая у штамма Д-380, в значительно большем количестве идентифицируется на электрофореграммах при миксотрофном росте. Ранее было показано, что при миксотрофном росте у данного типа бактерий синтезируется тетрамерная форма малатдегидрогеназы (Епринцев и др., 2010), что, по нашему мнению, свидетельствует об индукции глиоксилатного пути. Используя многостадийную схему очистки, получены электрофоретически гомогенные препараты сукцинатдегидрогеназы из разных штаммов бактерий 5. natans. При органотрофном типе питания штамма Д-507 выделены две изоформы с удельной активностью 22 Е/мг белка (СДГ2) и 14 Е/мг белка (СДГ0- При миксотрофном росте удельная активность СДГ] составляла 12,6 Е/мг белка, а СДГ2 - 14,0 Е/мг белка. Из бактерий штамма Д-380 получена одна изоформа (СДГ3) с удельной активностью 12 Е/мг белка. Использование гель-хроматографии на сефадексе G-200, денатурирующего электрофореза позволило установить особенности структурной организации сукцинатдегидрогеназной ферментной системы из S. natans в различных условиях культивирования. Все выявленные в данных бактериях изоформы состоят из четырех субъединиц, молекулярная масса которых варьирует от 72 до 16 кДа. Другие характеристики исследуемой ферментной системы имели более значимые отличия. Так, изоформы, выделенные из бактерий при разных типах питания, обладали разным сродством к сукцинату. Изоформа СДГ| обладала большим сродством к сукцинату (Км = 0,531 мкМ), чем СДГ2 (К„ = 0,615 мкМ), выделенные из штамма Д-507. Большинство исследователей указывают, что сукцинатдегидрогеназа из различных организмов подчиняется кинетике Михаэлиса-Ментен, хотя значение Км варьирует в значительной степени (Moll, ¿chafer, 1991). Сравнительный анализ термостабильности изоформ сукцинатдегидрогеназы из разных штаммов свидетельствует, что значение этого показателя у фермента, выделенного из умеренно термофильных бактерий S. natans, находится примерно на одном уровне. В то же время можно отметить определенные тенденции сходства термостабильности для фермента (СДГз) из штамма Д-380 и изоформы (СДГ]) из штамма Д-507, культивируемых

в органотрофных условиях. Нуклеотидные коферменты АТФ и АДФ являются важным регулирующим фактором функционирования сукцинатдегидрогеназы в растительных и животных клетках. АТФ в разных концентрациях вызывал неодинаковое действие на активность энзимов. Практически не наблюдалось влияние этого кофермента на функционирование изоформ сукцинатдегидрогеназы (СДП) из штамма Д-507 и СДГ3 из штамма Д-380, культивируемых в органотрофных условиях. По нашему мнению, эти изоформы обеспечивают функционирование цикла трикарбоновых кислот. Исследование действия другого энергетического эквивалента клетки на активность сукцинатдегидрогеназы показало, что АДФ при концентрации больше 5 мкМ оказывает активирующее действие на работу ферментной системы. Наибольший эффект усиления активности обнаружен для изоформ, осуществляющих функционирование ЦТК, к которым относится изоформа СДГ1 из штамма Д-507 и единственная форма (СДГ3) из штамма Д-380 в условиях органотрофного роста. При концентрации АДФ 10 мкМ обнаружено индуцирование активности сукцинатдегидрогеназы в 1,8-1,9 раза для обоих штаммов. Анализ полученных данных позволяет выявить меньшую эффективность действия АДФ на функционирование изоформы сукцинатдегидрогеназы (СДГ2) из штамма Д-507 при миксотрофном росте. Данная изоформа исследуемого фермента, по нашему мнению, функционирует в глюконеогенезе, обеспечивая утилизацию янтарной кислоты, образующейся в глиоксилатном цикле. Аналогичные результаты по влиянию физиологических концентраций АДФ на активность

сукцинатдегидрогеназы могут быть обусловлены зависимостью его функционирования от энергетического статуса клетки (Епринцев и др., 2010).

Было изучено действие различных солей на активность изоформ сукцинатдегидрогеназы, что может играть важную роль в регуляции активности данного фермента. Для СДГ известно множество модулирующих ее активность веществ. Активирующими агентами считаются изоцитрат, ß-оксимасляная кислота, а-глицерофосфат, ионы К+, Са2+, SO42", Вг\ СГ. Степень активации анионами изучаемого фермента уменьшается в ряду СГ, SO42", Вг\ СН3СОО". Ингибиторами СДГ являются щавелевоуксусная кислота, оксалаты, 2-оксоглутарат, дикарбоновые кислоты, пирофосфаты, хиноны, бикарбонат-ионы (Землянухин A.A., Землянухин JI.A., 1995).

Полученные результаты показывают, что активатором работы СДГ, выделенной из разных штаммов бактерии S. natans, является соль KCl. В присутствии этой соли в среде активность фермента возрастала в 2 раза

относительно контрольного уровня. Анализ действия различных солей на каталитическую активность СДГ позволяет говорить о том, что активирующий эффект на фермент проявляет ион СГ, поскольку он входит в состав всех солей, присутствующих в среде, где происходила интенсифи-кация работы фермента. Увеличение активности сукцинатдегидрогеназы в присутствии ионов СГ можно объяснить специфической химической модификацией белковой молекулы фермента (Рав-Ра^а е1 а1., 1998).

Рис.10. Гипотетическая схема участия изоформ сукцинатдегидрогеназы в регуляции метаболических процессов у БрИавгоШиз па1апз при органотрофном и миксотрофном культивировании

Таким образом, с помощью разработанной нами многостадийной схемы очистки получены гомогенные препараты изоформ СДГ из бактерий 5.лагалз. Анализ кинетических характеристик, физико-химических свойств и особенностей регуляции изоформ исследуемого фермента позволил разработать гипотетическую схему участия СДГ в переключении метаболических потоков у 5. ла?ал5 при разных условиях культивирования.

При органотрофном типе питания у штаммов Д-507 и Д-380 функционирование важнейшего энергетического пути обеспечивается изоформами СДГ] и СДГ3. При миксотрофном культивировании бактерий

штамма Д-507 индуцируется глиоксилатный цикл (рис.10). На одном из этапов глюконеогенеза, обеспечивающем утилизацию янтарной кислоты, образованной в глиоксилатном цикле (Игамбердиев, 1990), функционирует вторая изоформа СДГ2. Кроме того, сукцинатдегидрогеназная ферментная система может катализировать реакции, направленные на синтез аминокислот.

ВЫВОДЫ

1. Сравнительный анализ изменения активности маркерных ферментов ЦТК и глиоксилатного цикла позволяет заключить, что у штамма Д-507 S. natans при миксотрофном типе питания индуцируется анаболический путь (глюконеогенез). Следовательно, у данных серобактерий возможна трансформация метаболических потоков в зависимости от типа питания.

2. Обнаружены две изоформы (Rf 0,10 и 0,34) СДГ в бактериях штамма Д-507 при органотрофном и миксотрофном типах питания. У бактерий штамма Д-380 функционирует только одна изоформа исследуемого фермента с относительной электрофоретической подвижностью Rf 0,30.

3. С помощью многостадийной схемы очистки получены электрофоретически гомогенные препараты изоформ сукцинатдегидрогеназы из разных штаммов бактерий S. natans. При органотрофном и миксотрофном типе питания штамма Д-507 выделены две изоформы СДГ1 и СДГ2 с высокой удельной активностью. Из бактерий штамма Д-380 получена одна изоформа с удельной активностью 12 Е/мг белка.

4. Показано, что изоформы сукцинатдегидрогеназы состоят из четырех различных по молекулярной массе субъединиц, то есть сукцинатдегидрогеназа из S.natans является гетеротетрамером.

5. Выявлены кинетические и регуляторные свойства изоформ сукцинатдегидрогеназы. Величина рН оптимума для двух изоформ СДГ1 и СДГ2 из бактерий штамма Д-507 составила 7,2, а изоформа СДГ3 для бактерий штамма Д-380 - 7,0. Показано, что исследуемые изоформы подчиняются кинетике Михаэлиса-Ментен, причем значение Км для СДГ1 составляет 0,513 мМ, а для СДГт - 0,615 мМ. Для изоформы СДГ3 из бактерий штамма Д-380 характерно значение Ки 0,416 мМ.

6. Анализ термодинамических параметров (термостабильности, температурного оптимума и энергии активации) изоформ СДГ из S. natans

свидетельствует, что сукцинатдегидрогеназа из исследуемых бактерий обладает высокой термостабильностью. Установлено большое значение энергии активации для СДГ из умеренно термофильных организмов по сравнению с мезофильными, что свидетельствует о повышенной жесткости молекулы фермента, необходимой для его функционирования в экстремальном температурном режиме.

7. Выявлено, что значительный активирующий эффект на функционирование всех изоформ сукцинатдегидрогеназы оказывают ионы хлора, что может быть связано с известной специфической химической модификацией белковой молекулы исследуемого фермента.

8. Установлено, что АТФ и АДФ в исследуемых концентрациях (2-50 мкМ) вызывают регулирующий эффект активности сукцинатдегидрогеназы. При этом показано, что аденозинтрифосфорная кислота в значительно большей степени ингибирует активность изоформы СДГх у бактерий штамма Д-507 5. natans.

9. Проанализированы различные варианты хранения изоформ сукцинатдегидрогеназы с использованием стабилизаторов белковой молекулы и низких температур. Наиболее высокая сохранность активности ферментов характерна при их хранении в условиях низкой температуры -78 "С. Через два месяца экспозиции фермента в этих условиях сохраняется 80-85% от первоначальной активности.

10. Разработана гипотетическая схема участия различных изоформ сукцинатдегидрогеназной ферментной системы в бактериях S. natans при смене типов питания. При органотрофном росте у штамма Д-507 быстродвижущаяся изоформа СДГ1 (Rf 0,30) обеспечивает функционирование цикла Кребса. Вторая изоформа СДГ2 (Rr 0,10) участвует в функционировании анаболических процессов, в частности, в метаболизации сукцината, образующегося в глиоксилатном цикле при глюконеогенезе (миксотрофный рост).

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Физико-химические свойства МДГ системы микроорганизмов из разных экологических групп при смене типа питания / К.Д. Шихалиева [и др.] Н Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. ЦЧКИ. Воронеж. - 2010, вып.12. - С. 237-246.

2. Изоферментный состав СДГ из культуры бактерий БрИавгоШиБ пасапз штамм Д-507 /Т.Л. Ву [и др.] // Сборник тезисов 15 международной Пущинской школы-конференции молодых ученых. - Пущино. - 2011. - С. 92.

3. Каталитические характеристики изоформ СДГ из БрЬаегоШт па1ат Д-507 / Т.Л. Ву [и др.] // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. ЦЧКИ. - Воронеж. -2011, вып. 13. - С. 100-103.

4. Использование ионообменной хроматографии для получения сукцинатдегидрогеназы из бактерий ЗрЪаегоШиз паШъ штамм Д-507 / ТЛ. Ву [и др.] // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2011. - Том 11, № 6. - С.900-904.

5. Особенности функционирования СДГ у БрИасгоИЫ пагапБ Д-507 при разных типах питания /Т.Л. Ву [и др.] // Вестник Уральской медицинской академической науки. Тематический выпуск по микробиологии, иммунологии и биотехнологии. - 2011, № 4/1 (38). - С.25.

6. Определение молекулярной массы и субъединичного строения СДГ из бактерий БрИавгоШиз па1ат штамм Д-507 / Т.Л. Ву [и др.] // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. ЦЧКИ. - Воронеж. - 2012, вып. 14. - С. 47-52.

7. Влияние температуры и ионов водорода на активность МДГ из ЕЬойоуи1шп зСеррегя штамм А-20з / М.Ю. Чевердина [и др.] // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. ЦЧКИ. - Воронеж. - 2012, вып. 14. - С. 235-238.

8. Получение гомогенных препаратов изоформ СДГ из бактерий БрЬаегоШиз па(апз штамм Д-507 /ТЛ. Ву [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. -2012. - Том 48, №6 - С. 600-605.

Работы №4, №5, №8 опубликованы в изданиях, рекомендованных перечнем ВАК.

Подписано в печать 21.03.13. Формат 60*84 'Л6. Усл. печ. л. 1,4. Тираж 100 эга. Заказ 282.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии Издательско-полиграфического центра Воронежского государственного университета. 394000, Воронеж, ул. Пушкинская, 3