Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ОБРАЗОВАНИЕ МЕТАНА ПО ОДНОУГЛЕРОДНОМУ ПУТИ В СООБЩЕСТВАХ МИКРООРГАНИЗМОВ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ОБРАЗОВАНИЕ МЕТАНА ПО ОДНОУГЛЕРОДНОМУ ПУТИ В СООБЩЕСТВАХ МИКРООРГАНИЗМОВ"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР . ■• 1 . ' '' . - ■ • ~ • ": • . .. ■ ■■ 1 ^ ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ .',/. ч V

v

'На правах рукописи иларионов Сергей, Александрович "."••" ' - удк 579 [851.11 :12-{-852.13: 14] 017.82.

образование метАна .

по одноуглеродному пути в сообществах микроорганизмов.

Специальность 03.00.07 — микробиология . .

, .. - Авторефер ат диссертации на. соискание.ученой степени кандидата биологических наук- ■ ■'

Москва — 1985 г.

: ■ Работа выполнена в Институте микробиологии АН СССР. ~

.'Научный руков6дйтель:-\члё]1-корреспондент АН- СССР,:, профессор ; А. Заварзин. " > ; ; ~ : : . а л

- - ; ■ : / Официальные оппоненты: .

доктор биологических наук В. И. Дуда, ■;;'..;" "^ ' доктор биологических*1 наук, профессор--,. Д. Г." Звягинцев,' _

. -- .Ведущая' организация — Институт биохимик и фпзиоло-. гии микросфганнзмоп АН СССР, \ -

Защита состоится « > , Ч 19$э Г.'

'ъ ЦМ час- ^ мни. на заседании специализированного.совета1 . \ Д 002.64.01 при Институте, микробиологии АН СССР по адре-• . су: 117312, г. Москва, В-312, Проспект 60-летия Октября, д. 7, корп. 2. . V " ':" -О"

' С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Инсти-. тута микробиологии1 АН СССР. . ч • ■ - ^ . •.' '■ ^:

'' Автореферат разослан'«^'?.» 1985 г.

Ученый секретарь ■ специализированного совета -- :: - . Л. Н: Москаленко

... д к н 1мг;.

Актуальность^ рроб,памы. Процесс метанобразованин является одним вэ основных анаэробных микробиологичес ких процессов при минерализации органического вещества в природе; В последнее время он привлекает.большое внимание у юных и специалистов в связи о проблемой создания безотходных производств, очистки сточных вод и использования вторичнш возобновляв^ ясточвяков энергии. Этот процесс является результатом жизнедеятельности сообщества микроорганизмов. Основным источником органического вещества, подвергающегося микробиологическому воздействии на первом, этапе, являются биополимеры, Их разложение осуществляется поэтапно,.рядом специа- * лизированных микроорганизмов. Основными продуктами сбраживания ^биополимеров являются органические кислоты, спирты, углекислый газ и водород^ В работе В,А.Бонч-ОсмоловскоЯ (Бонч-Осмоловокая, 1973) Оштпоказано, что при анаэробной разложении - неллшоза основными промежуточшши продуктами являются лакгат, пропяонат, ацетат к водород* Однако известно, что'сбраживание некоторых биополимеров происходит о образованием таких одяоуглеродних соединений» как формиат* метанол а иетидированьне шины.

4 В йавеЯ работе мы изучали процесс образования кетзва из од-ноуглеродных соединений как накопительными, так и чистыми культурами, . ."

:■' Данная работа являетсяпродолжением цикла работ Отдела лвто-трофных микроорганизмов по неученая вопроса образования метана микробными сообществами, которые бшш начаты Т.Н.Жжлиной и В.А»£онч-Ссмо*овской. -V 1 : " г

11аль зарачи исследования. Цель» настоящей работы явдяат-г ся исследование особенностей.процесса образования метанл аэ фор-

1 Мгаск.с,!., ;.

млата, метанола и натиллрошшных аминов; определенно^надувное групп микроорганизмов а характера их вэо1шоотношен»1; ,

Коякритлне задачи исследования заключались1в оледуцвди.

I. Исследование и0р<1<У10гйи к физиологии михрофлор», домянд-рушоя при образовании метана иэформйата, иотниолл к меткднро-ванних омкиор. '

Ввдоление чисгш культур анаэробных микроорганизмов, использующие одаоуглеродные^ с оадине н ия; нзучонко ях мор^югви, ультрагоякой отруктури и Аизиалого-ошохимичисми осооопнсотея.

3. Соэ&чняо лноорнтсричх моделей, воспроизводящих ПрврОДНыЯ и рот оо овразошнил метана из одноугле(юдни* соединений,

Научжш иорйзия ройотн. Выделен в чистую культуру к опиоав новый вид термофильный оргв-

ккзи, образуема метан из 4«1*»атй«

Показано, что в рдде термофильных биоценозов прпцеос образования на тл на из метонола осувдствллет сия тройная ассопэдцкя мгх-рооргйКйзмов. Биделапы.б чистую культуру и оаяслны осношшо ком-; сонекты ассоциации: с1овгг141шя гь*то*и1о1гарЫсшв и^Ьапо-

и1«л4оаи1слг,>рмс1*в. Свойства в с сш ^ация изучены аа комбинированной культуре, соото^ывй из двух части*. Показано, что ассоциация основана не мехвндлюм переносе водороде.

практическая шпность Показано, что оря ана-

эробном всоользовялал млглйола метзногеиеэ сопровождается овразо-мниаы ацетата. Это отрицательно ьяияет на скорость и стабильность процесса, Получвнныв данние мо1,ут <3ыть использованы двдре-гудяцаи процессов в ферментерах при производстве.деогоээ. *

Вадаленяые чгстме кудьтуры ыетаногвнвых а ацвтогвиных бактерий могут быть исаользовачы дня провйдания Овохдмэтвспах, вкввыо^ логических в апологическая исследований. ""■*

с1о!>1г1(11шп ^п«гпк1ви*<»*мрЫвия> может быть рекомендовав как

продуцент, фактораШ, яаллицегосй модифширо тонной Формой витамина оОрааоьинив которого достигает мяг/г сухой биомассы/ Апробация twi^orfj. Материалы диссертации 0или долотвян на Вов-совэноы соьощаиик "АнаороОтш микроорганизмы" (г.Пушино, iübür.); нп БсесошноП itoHi¡ojniKimti "Термов нлпшо миздюоргшшзми в природе л «[чжтлкв нп родного, хозяйств»" (г. Москва, lyt*3r.); «п конференции Ш РасиуЛлихпнскоП на yv i s о-те оро гкчсс ко й конференции молодах уч&нах-макробиодогов '"Гшологла, культинщюмти» и использование микроорганизме!) (бакт«р»й, гриЗои, водорослей) р народной хозяГ.стае" (г.Твижонт, ноябрь 1903 г. J; 17 хон>}оре»цпи по хпмяя к применению . п0род>иной (г.ь'ропап, 1у01г.).

Пу<*яикоиии» Ооноян»« каторсплы диссертации опуЛлкхпюны в левяп печатни! работах.

Работы. Диссертация состоит из оводоняя, Иглпв, здклочонед» ви во до в к списка литературы. Мягориллы изло-кш.Мй ¡ZO страницах машинописного текста, вклтед 9 таблиц, в 51 риоунок. Список литературы содержит ппимоновя-

вдй риОот - на русском к 21£ на иностранных яэщщх.

Месу? про роде нкп ооДотц. Работе проводилось в Институте мик-робвологя» АК СССР » Отделе лятйтрофншг микроорганизмов'(заведующей Стдедом - член-хорреспонденг АЛ СССР, npcuf-ecc^p Г.А.Зэмрэил), £ ряде случаев лаЗоритсрцие исследования проводились оовместно о £.Д.воач-Осмодовско8. Т.Н.Хилиной, Б.И.Чудиной. Т.Н.ЕГазиной, ВЛ.Вихоммш « Н.И.Звйп«воЙ4

"■■."--'..'Л ОоЬШЫ И ИСТОДЫ КССХК20ВА1МЯ * -' \ . .

• Мвтвривломддя КАделвндянвкоймгвльныэс культур метен образую- ' ■ях микроорганизмов служшш: донные отложвиад р.П«орх* (Иоскоь-_ скаяобластъ), осадок ме «потекла Оа^сзрахжвашио аавоэа ярусного

* рогатого скота, сам навоз КРС, а такие тврмофадьаьй альго-бактериален ьЛ мат из кшо&еры четырех зон (Камчатка). ;*, ^ ■

Кроив того, в работе' были:использованы чистые культуры>ва-эройщц; микроорганизмов: uothanosoroina vacuolata была получена ОТ Т.Н.2КЛИН0Й, Clostridium рееtiaof«ng«n taue -:0t В.И.ДУЛИ, De aiil f ot ömaculum nigrificana ОТ Т.П.НаЗЕШОЙ , 0 Также СИИбвОТЯ-чаокая культура "Неthanobac 111 uе jcu*aeoeo*il" - От В.С.Панщава.

Выделение к культивирована, чиотых и накопительных культур осуществляли согласно методам работы с анаэробными михроорганиз-ыаш (2влкка, Заварзш, 1978). Контроль за окаодитедьво-воостано-вительнш оотенадалом производили о помощью реэаэурииа, . 4

Для ¿выделения и культивирования анаэробных шосрооргаиизмов, исвользуеыых'-в работа, променяли среду Пфешшга (РГ«йа1в, 1965) с добавлением микроэлементов Лигшзрта (Pfeonlg, Lippert, 1966), Частую культуру Cloatrlälusn th«rmoautotrophicu* 2-99 вадя аа ораде Пфешшга с S ид/л иетансиа алдс 5г/л глюкози." г

Пересев в культивирование частих культур «а танобраэупцах организмов iietbanobacterlms fornieioun И Uetbanobaoterlua therao-f ortaioicum осуществляли также im среде Пфеннига с 5 г/л формата натрия.

Инкубацию меэофильаых культур производили при тендера турах 20-00°С; термофильные ымкроорганизмы культивировали при теипера-турэх 55-€0°С« ■ ■ ••

Продувку н заполнение газовой фазы посуды для культивирования аяаэробных ыикроорганизыо в осуществляли отданной от следов * киолорода углекислотой. В некоторых случаях для количестванаоЙ оценки содержания газов а проба иеаользовалиыатод внутреннего стандарте: в качестве индикаторного газа использовали кряятод*' Культааяровэнка аиаоробных микроорганизмов проводили'-.в про— ö;tptwx ХангеЯта емкость» 15 шг, в яптнчиых флаконах объемом 30,

50,100 мл, а также в шшшх Оутилкох омнооуь» 0,5 л.

Определенно оптической плотности бактериальной суспензии производили на спектрофотометре "Спокол""при длина волны 600 им.

^ ■ Анализ газов производили методом'газовой хроматографии на хрош io графе ДХМ-8:.Ц с де то ктором по т^плоароводдости или пла-манно-иоикзациоШ)ш па колонках с Порапаком Q и молекулярным ситом 131., ■ ;

■■. Измерение содержания матааола производили методом бюсромат-но го окисления, или гаэохроматографически.

Содержание^формиота определили на газовом хроматограф Д&'иММчД с примененном детектора по теплопроводности на колонке с ПсШ1сор0ом-1.

Содержания ацетата и других жирных кислот определяли методом перевода эткх кислох в их метиловые эфгрц ОМрагкмова и др., I97X).

Ультратонкук структуру Ооктерий изучали методом Рейнольдов'-(BoyKOlde, 1963).

: Содержание сероводорода определяли иодоме тричасним титрованием (Резников и др.-,'1970).

Идентификацию метаncwJpaзукищх микроорганизмов сроизвоцйлм в некоторых случаях с использованием люминесцентного микроскопа "Лшам-Х" (Edwarde; MoBride, 1975, Doddeaa, Vögele, 1973).

v РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ OECTImSHIÜ

Яами.<Зшго исследовано более 200 аакопитсльншс мманоЗраэу»-щих культур,;использувщих форшшт, метанол к метиламин в двух температурных интервалах от 20 до 40°С и от 50 до ТО'Ъ. Истачна-ками .выделения накооительаых культур «Зцяи: донные отложен ля реки; измельченный гомогениэероващшЗнашз крупного рогатого сестя.

осадок ме га танка для сбраживания навоза и альго-чЗантериальЕВЙиат.

I. Изучение накопительных и адстнх культур., образующих

метен из формиата . , _

На среде с форта том во всех изучаемых иа копите льпих культурах доминирующим микроорганизмом был ладочковядаый организм о раэшрами клеток 0,3-0,5x1,5-6,0 мкм. :

Совместно с Т.Н.Яклияой было выделено и описано два вида £оркиатиспользуодих метанобразуювдах бактерия. При.исследования . "зависимости роста выделенных штаммов от.темаературы, бшго уста- . новленс, что «езофильный шташ. г-281 рос в интервале температур 23-45°С с. оптимумом . 36°С, а термофильный штамм г-245> - в интерн-вале температур от 40 до 65°С о оптимумом 55°С. Изучение зависимости роста этих организмов от рЗ среды показало, что штамм г-245 развивается в.интервалерН 6,0-8,7 с оптимумом в области 7,0^-8,0, а штамм г-гв! растет при тек ве значениях рН, что я штаюа г-243 однако оптимум рН его более низкий г 6,6-7,0,

Методом газовой хроматографии-било установлено, что использована* формиата и образование метана обоими штаммами стехиомот-рнчески соответствует уравнении:

4НС00Ыа СК4 ♦ С02 + ЗВа^СО^

Различными были ::иш> скорости использования субстрата. Так, штамм г-245 использовал I нМ формиат за дв&а суток, а шташ 2-281 - тахое же количество формяата за четверо суток (рис.1,2),

"На основании отмеченных различий» прежде всего термофйлад, штамм 2-245 отнесен:к*вовому виду М«*ЬапоЪаог*г1иш *ЬегтоГогш1-о1оит. * . '. ■ '■ '

всоон <мМ)

1,0

0,8 0,6

0,2

сн4

ХмМ) I

ОП600

0,2

0,08

ода ; • ' •

/у \ 0,05 \ 0,02

Р9

3,0

'А

6,0 7.0

6,0

4 5 Время, суткя

Ряс.Х рост ыеэобильного метавобразующего микроорганизма

Голв1о1вгш г-281 на среде Пфеннига; I - использование форшата*. 2 - кзмекакие оптической плотности; 3 - изменение рН среды; 4 - образован«« матана.

НСООН ; С&

[ШУ .

0,08« э:

/ е.

0.*

г-г

Браня,* сутки

Рис.2 Рост термофильного маганобраэуацаго шскрооргаийэма . . . К»1ЬашЪао]Ьег1ит -1Ьеги10Гота1.с1аит 2*245 Вв йредв Пфеннига: I - потребление формяата; 2 - изменение • рЯ срелы; 3 - изменение одтячэской гзотяосги; .'' 4 - образование метана. •

2. Накопительные культуры,.образующие мотон из :'

'тганола и метиламина " ■ *

На среде о метиламином в накопительных культурах, расту идах вр* температурах 20-10°С, основными метанобраэушшш микроорганизмами с!или кокковадныо оргииизмн, относящиеся к роду Methonoearoi-na. В пробах, инокулпроDüиных илом реки эвтрифного типа, культивируемых при с0-60°С на среде о метиламином, доминирующем бил также кокковый организм, морфологически сходный с бактериями, прштд-. ложй'диюа к ролу «вtuanosanoino, n, очевидно, являющиеся тормо- . фвльяой метоносарцияой. • "■,.'■'■'

Из образцов, отоорапных в.кальдере Узок (Камчатка), било про-ана'лзировзно около 50 проб, ипо ку лдро ванн их с формвдтои, метанолом и метиламином при теше ра тура 55°С.Ни в одной из проб, за-сгялних на средо о метиламином, образование метана не наблюдалось

Анализ накопительных метанобразуадах культур, использующих ыэтаьал, показал, что в интервале температур от 20 до 40°С, как и при росте на метиламине, доминирует, микроорганизмы,.принадлежащие к роду apUia&oeaccine, ' Однако в некоторых накопительных культурах, растущих ыз ыаvaпола.'При культивировании кы наблюдали посте певяо замену кокковой метан ocí разу оде й микрофлоры на палочковидную В пробах, ияокулнровананх альго-бактереальным матом на среде < метанолом а культивируемых при температуре 55°С, процесс метан-образования осуществляла микробнаяассоциация, в которой можно! -было различить несколько форм микроорганизмов.

Для дальвеШэай рПотанами была выбрана наиболее , активная: накопительная культура ОД-5, ' ■' 1- V

Таким образом, в несоленых водоемах формиат в иетиламин во-пользуется аалосредственно штанобразующдыя-бактериями. Метанол же мождт чпп;*£ьэоьптьоя дмбо палочковидными ассоциациями, либо S

даганосарциной. В термофильных накопительных культурах, иаокулированных альго-бактеоиальнш мегом, ыэганшг вспадьзовался лшь палочковидной ассоциацией,

3. Исследование термофильной палочковидной метанобраэуэдей ■ ассоциация, растущей на метаноле

Рост накопительной культуры №4-5 на метаноле сопровождался образованием метана я значительным снижением рН среды. Весь цикл развития накопительно^ культуры занимал околд двух недель» После продолжительной лаг-фоэы (около 3-3 суток культивирования) про- * песо сбраживания метанола резко активизировался. Основной прирост биомассы происходил в течение 2-3 суток й коррелировал с образованием метана и снижением рН среда до 4,5 {рис.3}.

Последуя состдо яультуральноД жидкости методом газо-жидкоот-ьой хроматографии, мы установили» что причиной снижения рН является процесс образования ацетата.

Термофильная накопительная метанобреэующая культура Ш-5, выделенная из ольго-бактериальяого мата, оказалась интересна вша и тем, что имела большое сходство с .ассоциацией Ноишооъ&оillus

опиоонноВранэв как чистая культура <Паншсава, Пчелкяйа, 1969), выделенной из ацетонобутнловой барда.

Изучение микроскопической картины термальной метанобразу»-пей накопительной культуры i&t-S показало, что она пре дет aiuiae т вссопизшо палочковидных микроорганизмов, в которой можно было выделить не менее пяти форм, а именно] X - толстые палочки о округлыми концами, расположенные вод углом друг к другу: 2 - более мелкие палочки с Ляастящаик влгаочекияшгЭ - тонкие палочки, иногда-переходящие в нити; 4 - толстые палочки, образуйте споры, ^уорвецевцней'в ультрефеолегоеои свете обладала ляшь^длияные - :-'..■ -.-.■■ .. ■ 9

ОП600 СН4 Ш 0,8

рН

8 10 12 14 У . "Время; сути«

Рио.З Развитие термофильной метанобразующвй культуры Ш-5 на метаноле) I - биомасса; 2 - штан; 3 - рН среда.

ОПеда сн4 (мИ) рВ

0,8

°*4 0.2

0,5

■ О

Г * » I

. Г

7,0

6,0.

5,0 4,0

е В 10 12 14

Время, оуяиг\

Рио.4 Действие попшушшна на разгитие термофильной

ме-ганоЗразукавЙ культуры Ш-5 на метаноле: X - йкомясса; '¿- - метан; 3 - рИ-среди. . ■

гонкие лалочк». на обрвзуюцге опор.

Копотьзуя свойство антибиотиков ингибировать рост аубакте- * РВЙ, ВО НО ВЛИЯТЬ на рост арХебОКТСрВЙ (Ваитвга а« а!.. 1973)» мы решила проверять, участвуют ли иотвнныв бактерии в ироцесое сбраживания метанола до мэгана. Оказалось, что в присутствии натриевой ооли бензилпешщниизша в концентрации I г/л рост накопительной культуры на метаноле резко снижался: прирост биомассу уменьшался да 922, образование метана - на 79^ (рис.4),

После трех пересевов на средас пенициллином культура полностью утрачивала способность к оОрэзовошш мотам.

При посеве накопительной культуры на среде П$«няига о водородно-углекислотной смесью, она образовывала метан, причем добавление в культураяьную жидкость натриевой ооли бенэюшеааили-: ляна существенно на влияло на образование метана из водорода я углекислоты. Основной формой микроорганизмов* испольэушкх водо- • родно-углекислотную смесь, как в присутствии антебнотяка, так я без него, были длинные тонкие палочки, еввтяв$!еся в ультрафиолете. . . При роста термофильной метанобраэующай накопительной культуры Ш-5 на метаноле происходит - выявление в кудьтуралькую жидкость уксусной кислоты, которая является субстратом некоторых метаноб-, разушл* бактерий. Культивирование М1-5 ва среде с ацетатом в ' присутствии внтнОиотеха после продолжвтельной латч^азы равной ' 18-20 суткам приводило к слабому образованию явтаиа и незначительному росту культуры.

; Морфологически оцвтат-испольэуицай организм был сходен с

М1«пвоее««1еит, который был недавне выделен н они-. . Сан Кожевниковой и Ягодиной (1962).

Таким ой разом, исследование герлгофильлоЯ мв твкоб разуицвй , напспитвльмой культура доказало ^ что процесс образовано) метека жэ метанола явядатся результатом деятельности ассоциации

микроорганизмов. Ыетанобраэумцвй организм, входшциПв ассоциацию, является типичным аредставителем рода llethanobacterluo. Аорга-вигм, образующий метав из ацетата, является, по-ввдимоыу, видом Methaaothrix tbemoaftetlcum. •

* 4. Выделение чистых культур мвтанобраэущкх микроорганизмов из накопительной культуры Ц'4-5 и микробной ассоциации "Metbeaobeclllue fcueaeeéoTii*

Из термофильной накопительной культуры г<М-а имикробаой ассо-цнашш и,1шгпвоеотИ намибыли выделены в чистую нультуру метаа-обраэувдие бактерии; растущие на минеральной среде Пфенвигас во-дородно-утлекислотной смесью. Выделение вели с добавлением в среду ■а -бвнзяяпешщшишна. После семи пересевов, методом разведения, виши получены чистые культуры водородиопольэупдях ыеганобраэуицах микроорганизмов. Из накопительной культуры ММ-5 dan выделав штамм 2-1901, а из микробной ассоциации и.1сигт*<з«ат11 - штамм z-1201.

Эти штаммы предеtsejihw собой несаоровые, неподвижные, варьирующие по длине палочкя, иногда соединенные в цепочки о* IQ до 100 шш длиной, которые во osoetL морфологии не отличались от организма llethanoba»t* rlus thermoeutotropiilouie AZ, списанного Зейкуоом В Вольфом (zeikus, tolf«, 1э72), Единствеиным субстратом роста ' штэшов является водородно-углекислотная смесь. От U.-themoauto-irophioua аз штаммы г-120) я z-1901 отличались ляль болеенаэ-хим температурным оптимумом я характером соединения клеток в цепочкиÜoэтому ати штаммы были Стнеоены к виду Uetbaaobaoterlwa ♦he rnoaut о * горЫоия.

5. Выделение матил&трефного компонента из термофильной метанобр#з£ВДей культуры МК-5

Выделеме ватилотро^кого организма производили в пробирках Хангейта на минеральной среде с метпнолом и органическими добавками - дрожжевым экстрактом и триптиказоа.

' ' Клетки метилогрофнох-о микроорганизма предет^шш»>т собой длинные Цапочки диаметром и длиной 4,3-3,3 мкм с терминально расположенными овальными спорами до 2 мкм » диаметру. Споры выдерживай* нагревание до Х00°С в течение 1$ минут, Мор^юдогая микроорганизма изменяется в зависУиости от субстрлта культивирования. При роете на плотной огаркзовьпной сроде о метанолом развитие микроор-гааязмов заканчивалось почти 100£-ним сдорообразовшшеы. Во время роста организма на глокозе он приобретавг тенденции, к нитчатому росту я обраэованшамяйи-клвток.Орголиэм растет хоыо орган о троено да арабинозе, коилозе.глюкозе, макнозе, ромноэе, сахарозе. мальтозе, лактозв.целдобиозв, глицерине,- сорбите или хемолитотрофно, используя водородно-углекислотную смесь или окись углерода. Кроме того, организм обладает способность» расти на о дноу где родных соединениях: метаноле, формяате и мегллашне, ИетялотрофныЗ микроор-гвкизй не используот дляовоего роста дульцйт, целлюлозу, пектин, бетаин, пируват, бутазол^дропанол, этанол, буткрат, пропионат, ацетат* Единственным продуктом брожения как одноуглеродных, так и деугих оойдинвний являетоя ацетат,

МетилотрофаыЙ организм развивался при температурах 43-75°С о оптимумом около 56°С, оптимум рН среда соответствует 5,7. По своим характеристикам оа соответствует! термофильному метилотрофн^му мик-росрганизму сгов^^ил ^ъвпюйичо^рЫчхий «х ах., 1981)

И был отнесен нами к данному виду со штаммовим индексом' £-99.

Таким образом, из термофильной метанобрпэушей культуры 1.14-5

бнля выделены метанобразуадай микроорганизм мв*ЬапоЬао»ег1ит 4Ьегаоаиго г го ил г-1901, используюскй для своего роста водо-родно-угл«кислотну» смесь, и «атилотрофныИ организм О1ов*г1й1лш •»Ьвгтойи^горЫсш) 2-99, осущесгалямоагй сбраживание метанола» Однако было неясно, каких образом продуцировался водород в мкх-робной оссоцхигдак КД-Б, за спет которого происходил рос» аоеиио-ЬгорЫсия 2-1901, ведь метилотрофный организм » чистоЕ культуре был способеа образовывать лишь следа водорода, которых бшго то недостаточно для рос та мз танобразу щего организма и образование км метана. Поэтому нами бил поставлен опыт по рвас-, СОЦИашш С, 1Ьвтаоаи1; о* горЫс ига 2-99 И Ы.^втераи^ЪгорЫсап . 2-1901» которой должен б ыл дзть ответ на вопрос, саособенли мв-тилотрсфшй организм образовывать в достаточном количество водород, необходимый для роста и развития меганобразуикего организма.

С, Реасссдаашвд металотроякого микроорганизма С1ов*г1й1ит •кьвгштжо* горы сши 2-99 с метанобразующим мякроорга-; низком к«июпоЪао*ет1иа *Ьегооаи<о*гор1Исиа 2-1901

Било показано, что бгларная культура этих микроорганизмов образует на среде ОДеннкга с 5 мл/л метанола до 5 мкм на, мл среда : метена* что соответствует 18,75 газовой фазы. Опыт проводился в пробирках 1аигойта при температура 55-60°С. Бремя инкубирования соотвотствддело 14 суткам. *■ • '

Таким образом, полученная нами комбинированная культура . представляет собой модель природной всооциацаи, образ унией метан кз метанола. Кроме того,- она является примером спнтрефной ассоциации , основанное па межвидовом переносе водорода.

2 час то Я культуре с. »¡звгтогипс^горМеил 2-99 образует лишь , ело доске количеств» ьодорода».так как процесс образований водогот

да из метанола чистой культурой энергетически невыгодаа. в присутствии же метанобразуетего организма количество образованного с.thermoautоtTophlcuo 2т9Э,.водорода возрастает настолько, что может обеспечить рост я ыетаногенез ii.-thennoautotrophtcum г-1301. Это явление характерно .для ейитрофных' взаимоотношений ко аду бактериями. Вместе с тем, рассматриваемая ассоциация отличается от опиоанных облигатяых синтрофкых ассоциаций, например, Syntropho-tacter *olinil (Boohe, Bryaji1;, 1980) тем, ЧТО С.tftenpoautotro-phioun Z-99 может расти на метаноле и в чистой культуре.

Для того чтобы' понять,', является ли перенос водорода от 0. thenBomitotrophloum 2-99к - К. thermoautetroplilcum 2-1901 специфическим процессом, мы заменили йгатанобразувдяй микроорганизм на:другой, облвгатао-аиаэробный. микроорганизм, способный использовать; водород-оульфатредуцирущий микроорганизм D.nlerlfloaas-781.

В этой вновь созданной асоо]хиацйи кежду c.thermo&utotrophi-eum 2-99 и D.nlgrlficene-7ai мы наблюдали образование сероводорода в среднем до 54,6 иг/л rs*V Следует отметить, что D.nigrt-fioane не использует в качестве энергетического субстрата ацетат; в донном случае им являлся только водород. Поэтому исключалась возможность роста оульфатредуцируящего организма за счат какого-либо другого субстрата, В этом эксперименте нам впервые удалось продемонстрировать межвидовой транспорт водорода между гомоацетаг-кым организмом н грам-положительным сульфатредуцирующим микроорганизмом в ассоциации, растущей аа метаноле,

Таким образом, атот эксперимент показал, что сул1фатрвдуци-рушцм организмыпринадлежащие.* роду Deeuifatomaoulum, могут учаот^вать в 1фирода»а асооцйациях, подобных рассматриваемой, в конкурировать за использование водород» с водородиспользувдиш микроорганизмами. '

7. Синтез корриноидов к других титра пи рроль них соединенна

термофильным гомоацатагдым микроорганизмом

■ '.'с-З

С. therooüutotropMoun 1-99

Известно, что миогио ацетогешше микроорганизмы образуют корршюиды{БцховскиЙ, Зайцева, 1у03),

Совместно с БЛ.Биховским и Н.И,Зайцевой {Институт биохимии им.Баха) нцгси била проверена возможность синтеза коррипокдов у C.thermoautotrophicuni 2-99. 1>ило показ ti но, что образование кор- . риноидов происходит активнее при росте c.thermoautotrophitun Z-99 на средо с ко та но л ом и достигает 2200,0 мкг/г. При росте на глюкозе, даже о добивлонием в среду <<} -аминолевулвновой кислоты «о-АЛК), лвдлщеКся стимулятором синтеза корриноидов, выход их состлаг.пл 247 мкг/г. Это более ч«м в 6 раз при пересчете но I л среды и в 14,6 раз» при пересчета на I г сухой биомассы меныю, чем при росте с.th«rtaoautotroptvlouu z-99 на метаноле;

При исследовании спектров поглощения шаноформы выделенного корриноидов были зарегистрированы максимумы при 3G2 км, 41э вы, SLÜ км и 5нм. Последний пик абсорбции характерен для иуклео-тидсодержзпшх соединений аналогов витамина 8j¡¿*

Хроматография на бумаге корриноидз, выделенного из экстрактов c.therBftautotropbicum 2-99» выявила отличие его как от истинного витамина Bj2« к от фактора Ш. Исходя из литературных данных (uöiiriegi «t ai., 1932), можно предположить, что корридоад, синтезируемый С. th«rmosuíotropi»louj» Z-99. лредегнвляет собой фактор Шм. ' . .. ..

Изучение состава внеклеточных тетрапирролов, синтезируемых 0,tber-i3»u\otrophlouni j-99, показало, что их незначительное накопление происходит лиль при культивировании на среде с глюкозой, в добавление ¿ -АПК в среду усаливало их образование. По своей.

отруктуре эти внеклеточные тетрапирроли являются производными уро-порфирина-Ш, иосста1 ювлоинимя в^'-лозицйях пиррольиых колац Л а Б, Спектры поглощения флуоресценция этих татрапирролов напоминают производные сирогидрохлорина,

8. Определение путей использования метанола в процессе ■ , о на эрой но р. деструкции о помощью ингибиторов матаногенеза -

При внгабировании процесса образования метана в «роде происходит накопление ого продшоствонников. В качестве ингибиторов могут быть использованы хлорзамесснние а нал о га ме тана, а также бромагипсуяьфэновал кислота- Нами било исслсдовано влияние этих ингибитороила накопление метанола в иле подмосковной раки Пехорки, '.-■'■'* При использования 5 г/л бромэта'ксульфоновой кислоты, являющейся специфическим ингибитором метзнобразовааия, ми получили лишь незначительное и кратковрекешюе увеличение концентрации метанола (рис.5). По нашему мнению, причиной этого могло служить использование метанола.неметаногенной микрофлорой.

Для того чтобы'подлостью закнгибировать потребление метанола в донных осадках реки эвтрофидаро ва ни ого типа, наш бил использован хлороформ в концентрации 100 мкл/л. Используя его, нами било получено постоянное увеличение количества метанола в анализируемых пробах (риа,б). ■ ■■■■--.:; ' ;

Таким оЗрааоц, использование нами двух,различных по характеру действия сагабвторов показало:

I) в иде асследусмеИ нами раки в процессе анаэробной даструк-даш происходи постоянное образование метаноле;

а) потрвбленмвиетаиода¡осуществляется не только метшюгенни-¿ш бакт«р*яма, ао в представйтчдяьщ пеыетаногонней >4Лкрс*}-гори.

СН.,ОН СН4 (м,Ч)

£ иЯ)

О Л1 од

О.Х ¿34567 8 9 Время» аутки

Рас.5 Накопление метанола в донных отложениях р.Пехорки под действие» ингибитора ме та ноб ра эо пан ия 2-бромэгансуль-фоиовой кислоты (СЭС) в концентрации 5 г/л: I - образование мгтаяа; 2 - изменение концентрации ыетавола.

Стрелка указывает момент введения пробы.

СйуОЫ СНД (,m¡¿) ■

(М;А ) 3.0

2,3 2,0

1.0

0,5

О ...I • 2, 3 4 5 ,: Время, сутки

Накопление метанола в доавкх отложениях р.Пехорка под двЯствхеы ингибитора шгэнобраэования хлороформа в концелграоти 100 ыкл/д; 1 - образование метане; 2 - образованна метанола. Стрелка указкваатношат ■. ■:'' ■ введения: ингибитора. . .'•.. • : . • .. ..:• •'

Рве .6

3 А К Л D Ч SUME •

Образование метана,яэ одноуглеродкых соединеняй кмеот важное теоретическое и практическое*Значение, Jíc;q совсем недавно счита-, дооь, что осноышми источниками метана во всех экологических на-где-происходит анаэробное раллоление органического веввотва, являются ацетат и водррод-углекнслотиая смесь. Метанол долгое вре-ия не привлекал внимания ксслодовятелоЛ как воамохний-естес'^ен-вый субстрат метаногенеза; Однако, последние исследования п этой области показывают, что.в морских экосистемах мотаногеноэ может осуществляться за счет мот/толи а метилированных аминов .(Oreo-laud «tel., 1932), Этот факт подтверждается каличиомв этих системах специализированной мотинобразуюкоЗ микрофлоры, испольэу-шая дня метаногенеза только метанол в метилированные ашшы (2и-дина, 1983; Sowers, Ferry, 1983).

Наши данные показывают; что метанол постоянно образуотсд при анаэробной деструкции органического вещества, о чем свидетельствуют результаты, полученные нами при ингябировании метаногенеза а донных осадках реки .эвтрофиого типа.

■ Как известно, агентом образования метана из метано, а при температурах 20-40°С является Matbanoaawina ар. При изучений .ивтаногеяеза из метаиола в интерпало темпертур 50-70°С нами было показано» что метанол может преврасдатьсл в метан сквтро^яой ассоциацией, Штанол в этой ассоцкацзш сбраживается гоыоацетатным микроорганизмом до ацетата н'водорода, служащего субстратом для штавобраауюаего организма. : ,

Исследование комбшшрованнойкультура микроорганизмов cioe-: trldlum tb*nnoautc.tropMoua z-99 И Hath&nobaotarlum tbarnoauto» . trophloum 2-1901 показало, что способность к образованию водорода из метанола Cloetrl-Uum thermoautotrophicua z-99 npiiodpe—

Орпшичоское

ВОЩОСТПО /

У

А

Зормият

(14 ^ ЬвооЬао гег1ит Гопп1с1вцт

I

Пег ЬавоЬ ос г® Пит

* Ь в пио ? огт 1о 1сио

СИ,

У

матанол

метилированныв ашшы

ввго!па ер.

С1оз»г1 <31«» ■Р.

И,

ОЦОТЙТ

Ьнегвг!иш

У

С Чл

ер.

I +

СН,

ер.

СН.,

МвгЬаоо-омго1пи ер.

СН.

Рис.7 Воиштмыа путл озрлзомккя метана микроорганизмами, осу&истьал»кеимк сЗрпжитнио органического вещества в просновощшх экосистемах. ■

тает только в присутствия водородисоользукцаго микроорганизма, .которым может быть мзтанобраэушдай или сульфатредуциругщкй ©рга-. низи. Поэтому между двумя Чтима группами микроорганизмов возможна ковкуреация за потребление метанола. V

~ Иосдедованио накопительных ыэтаяобразующих культур на фор-ыйаи," инокулируеиых пробами из пресноводйых водоемов, показало, что-в вшрокоц интервале* температур ст 20 до 70*Ъ мегаяогеиэз аз формвато ооуп¥зствдя»г" исключительно палочковидные микроорганизмы, принадяежа(вивйродуив*Ьлп(>Ъас«чзг1шя.'

Ые танобра зоваяиа в Накопи тельных культурах при низкой соле-ноотя о ватяд(игаяом осут90твляет' ,голько кокковая, микрофлора, от-"ноойщвяоя В РОДУ «♦♦Ьао«еап>1па. . •

■*'■■"■"' Таким образом, образование метака из $оркмата и метиламина в пакопятвльаых культурах мгафооргаЕйздюв, инонулировзшшх про-баця из пресноводных воточш:коэ, осуп;аствляег пспосредственно штваобразуадпячшро^лора, епекидлизярованвая к этш субстратам, Ойроэопопдо ыатала яэ мотанола ыйасис прьисходить двумя рязгмчвы-иг путямд — напооредотЕвндо^."«етаа<нгваами и оссощыщияия микроорганизмов. Исходя кэ «их даншгх»"к0ш10 составить схему« показы-васщуя путв обрагования метана из одноуглеродяшс соедашеняй (роо.7). ',/:

: выв од а

1,Образов*нЕЭ мвтава из одноуглеродных соединений может осуществляться как чистыми куль*урами'ме*анобраэупцих бактерий, тшгя ^рофншгаосощюци^ -

2. Основйша продуцентами метана язфоршата в преояоводнцх водоемах явяяптся М^гЬааоЪм^оНил Гогт1о1оша а ЫчгЬдасЪао\в-г1ит *1мп№>{ога1е1б(ш. '

гх

3. Исододовшшо многочислштшс ипконательных культур« рас- . туших при температурах 5Q-Cü°C на мотаноле и йнокуляровянных из различных врисноводних источшкоь, покпэплочто процесс нетан-обрпзояания и них осуп'.остюяотсп ипк различными Ридами отдельных метаiioöразуму микрооргшшзмои, так и бактериальными ассоциациями. Основными комненоитнми метоноорпдумцеП ассоциация, растущей на мотополо при токпоратурпх dO-ÍiÜ°C, яиляютсн гомоацетатпый мялроорганизм cioetrlälim th*rnonutotropbloua i-99 > метивобра-эуишЯ Организм Mothnnob<ic*«>rlue theraoautotrophlauai Х-1901,

4. Гомоацотппшй т«рм<ч{ильннй микроорганизм 01 о»tri<1.1 tu» thermoautotropbiouo) z-y> ййляйтсл продуцентом фактора Ш м,.который представляет собой млци^нцировмнну» $орму гштомияа Bjg.

5. Bnapsuo поwtзаил гт-шгшюстъ метамольной сулъфзгрвдугсиш В СПНТр04«0Й ti CCO ЦЙЯЦИИ Т»;'М<\}«Л1>НИХ MHKpOOprelUSAíOB - C1 Oft riel lúa tbemo&utgtroptUcu» 1-94 и D«eulf«tí)*»ctüui* nlertfleaae-731.

Список работ, опубликовании* no tetra диссертации

1. Вонч~Осмоло&скад К.А,, (¡лнрпоноь O.A. ООрвэовпшю метана из пектина комбинированной культурой Cloetwdtum р«ет1поГ«п>вв-tans и IfAtbanoenrclna »auuoltUft. МйКрОбООДОГКЯ ф 19Э2, Т.51, внп.3, о.413-415.

2. Мларионоя С.А, Образование хвтшш >з ыатапода термофильной ассоциацией палочковидных бактерий* Всесогояовсоведзнае . ■ •Анаэробвые мякрооргваизна*. Тезисы доклада. Пудамо. 1962, С.17. ■ .- -v...,''. /"ь'-- .г'^;':';-:

3. Хиляяа Т.Н., Иларионов С,А• • Выведение вчистую культуру^характеристика: lwthaaobeet«rluii th«r»afor*lotoum а. ер. В сб.:

"Термофильные ыккроорганизмы в природе.

22 . • •• . :..„.'< ■;..,:. Л -

а. практика «тройного:

жоаяйотва*.Твзйоидокладо, Москва, 19&Э, о.56. 4* Илвряонов С.А. Характеристика- cloetrldlu« z-99 термофильной ыатыотрофяой бактерии. В сб.: "Термофильные микроорганизмы в природ» « практике народного хозяйства"*. Тезисы доклада. Москве, 19Ö3, о.э5. б. HhuxHft Т.Н., БоЯч^Осмсдоцокая К.А., Иларнснов С.А.-Образование ctt4 я UgS из одноуглородных соедляенийассоцизциями . тормозплмшх анаэробных бакториП. В сб.: "Биология куль*иви-■ ромввя я кспользаванва микроорганизмов н народном хоэайот-вв'.Теэжеы до&хвдн. Ташкент, 10Ü3, о.¿4-55;

6. Холма Т.Н.,* Чудике, В.И.» Клярионов СЦ., Бонч-Осмоловокая S.A. Тор«ги(ил£лыа ыетонсОразувцие бактерии из метило тройных ассоциация "itothneoboeiliue Jrueneo»ovii". Микробиология« 1983, Т.SU, вып.2, «,32в-ЗСЦ.

7. Бшовскиа В Л.. Клариопоо С.А., Зайцева Я .И. Биосинтез хор-ркповдов и другкх тетрапиррольных соединенип ацетогенным клостридяеи. Прикладная биохимия в микробиология; 1Э64,

' T.2Q, ВЫП.1, С.Э-в. ' в, Ецхоьскхй ВЛ., Зайцева U.M.; Хвлкна Т.Н.. ЙларионовС.А., Кожевникова A.D., Ягодине Т^Г. Образование готрапгррольниг соединений oOiWat-eo апа?робнь«я бактериями, 1У Всесоюзная коцфоренцил по хюеш и применения пор^иринов. Тезисы докладов. Брехав, IS94, с .180. . ■ 9, 3алшш Т.Н., Илорионоа С.А, Еыдолониа а сравнительная характеристика форкзат-исзользуЕсга «отаковых Сактерий с ошзоа-азе» Uetbaaobeeterliia tb»mbformloieuia ер.лог. Цикробиоло-, na^JSM, С.785-7ЭД. V

Т-02877 от 1.01.05г.V : , £акоэ 445' у . Тир ЛОО ■ î> 4атно-мчотательное проазеосство DHH^lï . ;