Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Обнаружение трихомонад и хламидий в клинических образцах при помощи полимеразной цепной реакции

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Обнаружение трихомонад и хламидий в клинических образцах при помощи полимеразной цепной реакции"

РГ Б ОД 1 О ФЕЙ 1ЯЙ7

Чурамов Алексей Аркадьевич

ОИ1АРУШШЕ ТИСШОНАД И ХШЩДИЙ В КЛИНИЧЕСКИХ ОБРАЗЦАМ ПРИ ПОШЩН ПОЛШЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕЛКЩШ

03.00.07 - иккробнологня

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Саратов - 1997

- я -

Раёота ишлкнзиа в Российском таучна-исаяздоваязяьасоу прохшвочуынои иискшуте "1><тро5"

Научиие руководители

доктор биологических наук, профессор Полоз Ю.А., доктор медицинских наук, профессор Суворов А.П.

Официальные о п п о и о и 7 и:

доктор медицинских наук, профессор, васлукенный деятель науки Р2 Самойлова Л.В.,

член-корреспондент АЕН. доктор медицинских наук, профессор ВЕеденко И.Г.

Ведутая организация: Ставропольский иауто-иоошгдовтель-сзшй прошвочуыний иисшмут

Защита состоится "Ус/" марта 1997 г. в </0 часов на ааседании специаливированного ученого совета Д 074.32.01 при ■ Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" (410071 г. Саратов, ул. Университетская, 46)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке РосНИПЧИ "Микроб".

Автореферат разослан ••_•• февраля 1997 г.

Ученый секретарь специализированного совета,

доктор биологических наук, профессор . Г.А. Ксрнеев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

В последние годы серьёзной проблемой становится широкое, распространение труднодиагносцируемых инфекций урогенитального тракта, вызываемых хламидиями и трихсмонадами. Эти заболевания являются, по данным ВОЗ (1984, 1995), основной причиной бесплодия, а также фактором, приводящим к таким осложнениям, как внематочная беременность, неонатальная смертность.

Диагностика хламидисза, даже в хорошо оснащенных лабораториях, затруднительна, вследствие того, что при бактериоскопии хла-мидии (тельца Провачека) выявляются не более чем у 15-20Z неле-чившихся больных. Бактериологические методы, основанные на выделении культуры длительны и трудоёмки, могут быть выполнены лишь в единичных научных центрах и при этом не обеспечивают 100% выявляемое» хламидий (Ильин И.И. 1991; Rasmussen S. et al.l„91). Способы, основанные на иммунофяуоресценгном анализе, не отличаются хорошей специфичностью вследствие нестандартности выпускаемых наборов, хотя и могут достигать чувствительности до 90% по сравнению с посевами на культуру клеток (Скрипкин ¡O.K. с соавт., 1996). Методы серологической диагностики не рекомендуют к широкому применению в связи с низкой иммуногенностью хламидий, высокой частотой ложнополохительных результатов (Овчиннучов Н.М., Делекторский В.В., 1985). Лабораторная диагностика трихомонадной инфекции обычно строится на бактериологическом анализе, который позволяет выявить возбудителя не более, чем в 60% случаев заболевания (Riley D.E.et al.1992).

Таким образом, практическое отсутствие доступных и достоверных методов детекции хламидий и трихомонад, позволяющих осуществлять своевременный диагноз и необходимый контроль за распространенностью этих инфекции,. делает актуальным создание и внедрение в практику новых диагностических тест-систем, основанных на современных достижениях медицинской науки. .

В конце 80-х годов разработан новый способ детекции микроорганизмов - полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая в настоящее время стада основой нового направления в диагностике инфекционных заболеваний. Метод основан на обнаружении специфичного участка ДНК искомого микроорганизма. Главными преимуществами ЩР являются высокая специфичность и разрешающая способность, позволяющая обнаруживать 100 и менее микробных клеток в 1 мл без этапа культивирования.

В настоящее время за рубежом разработаны параметры ЩР для детекции возбудителей ряда заболеваний, передающихся половых путем (ЭППП). ЮиШЬ В. с соавт.(1939) и позднее 2ауас1а С. с со-авт. (1991) сообщили о разработке ЩР для специфичной амплификации ДНК-матриц хламидий. В 1992 году Шеу Б. с соавт. применили ЩР для амплификации фрагмента ДНК трихомонад. Данные литературы по ПЦР-диагностике урогенитального хламидиоза и трихомониааа разноречивы и не позволяют сделать однозначный вывод о преимуществе какого-либо метода предварительной обработки проб. Не решён вопрос о выборе оптимальных праймеров (ДНК-мишени). Работ по применению ЩР для исследования различных клинических образцов при диагностике трихомониаза в доступной литературе вообще нет. До сих пор нет ясности в вопросе о возможности использования ЩР в качестве критерия излеченности больных. Поэтому вполне актуальной представляется разработка и клиническая апробация, основанных на ЩР, методических подходов, для обнаружения трихомонад и хламидий в материале от больных, а также сравнение этого генодиагностического метода с традиционными способами лабораторной диагностики данных инфекций.

Цель работы '.„...

Определение наиболее , эффективных методических подходов для лабораторной диагностики трихомониаза' и урогенитального хламидио-еа с помощью ЩР.

Основные задачи исалодовакия

1. Сконструировать олигонуклеотидные праймеры и разработать оптимальные параметры ГЩР для специфичной амплификации ДНК-матриц трихомонад и хламидий.

2. Оценить эффективность различных способов предварительной обработки исследуемого методом ПНР материала от больных урогени-тальными ЗППП: соскобов со слизистых уретры и цервикального канала, осадка мочи.

3. Сравнить чувствительность и специфичность ЩР и других методов лабораторной диагностики трихомониаза и урогенитального хдамидиоэа.

4. Определить оптимальные сроки обследования методом ЩР больных трихомониазом и урогенитальным хламидиозом; оценить возможность использования метода для контроля эффективности лечения.

Научная новизна

Разработаны параметры ЩР для детекции Trichomonas vaginalis с праймерами на основе повторяющейся последовательности ДНК трихомонад. Продемонстрирована возможность эффективного использования праймеров на основе плазмиды хламидий для выявления возбудителя хламидиоза методом ЩР.

Установлено, что наиболее универсальным методом подготовки исследуемого с помощью ЩР клинического материала: соскобов со слизистых оболочек уретры и цервикального канала, осадка мочи -от больных трихомониазом и урогенитальным • хламидиозом является лизис клеток гуанвдингиоцианатом с нуклеосорбцией ДНК на силика-геле с размером частиц 0,5-10,0 мш. •

Показано преимущество диагностической точности ЩР по сравнению с традиционными методами лабораторной диагностики трихомониаза (бактериоскопия и культуральный метод) и урогенитального хламидиоза: прямым иммунофлуоресцентным анализом (ПИФ) и иммуно-ферментным анализом (ИФА). Отмечено 100% совпадение результатов, полученных с использованием ЩР и культураяьного метода при детекции С. trachomatis.

Получены данные, свидетельствующие о всеможности применения

ЩР для контроля эффективности проводимой терапии и в качестве критерия излеченности трихомониаза и урогенитального хламидиоза. Показано, что .больных следует обследовать с применением метода ЩР не ранее, чем через 14 дней после окончания курса лечения.

Практическая значимость

Разработанные методические подходы для детекции трихомонац и хламидий при помощи ЩР в клиническом материале изложены в учебно-методических рекомендациях "Диагностика и лечение инфекционных заболеваний моче-половой сферы негонококковой этиологии", изданных типографским способом департаментом здравоохранения Саратовской области и Саратовским Государственным медицинским университетом. Предложенные оригинальные методики подтверждены пятью удостоверениями на рационализаторские предложения выданными Саратовским медицинским университетом: N2022 "Устройство для промывания уретры", N2024 "Устройство для лечения уретритов", N2043 "Устройство для комбинированного эндовагинального и эндоцервикального электрофореза", N2051 "Способ обнаружения уро-генитального хламидиоза", N2081 "Способ лечения урогенитального хламидиоза у мужчин". На разработанное устройство для промывания уретры получено свидетельство на полезную модель ВНИИ Государственной патентной экспертизы (N96113993/20 от 10.07.96 г.)

Основные положения, в ¡¿носимые на защиту

1. Предложенные олигонуклеотидные праймеры на основе повторяющейся последовательности ДНК Т.vaginalis и фрагмента плазмиды С.trachomatis обеспечивают специфичную амплификацию соответствующих "V нукдеогидных последовательностей и могут быть использованы в ЩР для детекции трихомонад и хламидий в клиническом материале.

2. Способ выделения ДНК-мишеней 'с помощью лизиса гуанидин-тиоциалатом с нуклеосорбцией на силикагеле эффективен при детекции методом ЩР Т. vaginalis и С. trachomatis в соскобах со слизистых оболочек уретры и цервикального канала, а также в осадке

первой порции мочи.

3. Основанный на ПИР способ обнаружения трихомонад превосходит по своей разрешающей способности бактериоскопию и культу-ральный метод, ПЦР позволяет осуществлять лабораторную диагностику уроге.читального хламидиоза с большей точностью по сравнению с иммунофлуоресцентным (детекция антигена) и иммуноферментным (выявление антител) методами и сопоставим с культуральним методом обнаружения С.trachomatis.

4. ПЦР может быть использована для контроля эффективности лечения и в качестве критерия излеченности трихомониаза и уроге-нитального хламидиоза.

Апробация работы и кублтаацш

Материалы диссертации были представлены на I Международной конференции молодых ученых "Актуальные вопросы современной медицины" (Бишкек, 1994); на I Международной региональной конференции по СПИД и СПИД-ассоциированным инфекциям (Санкт-Петербург, 1994); на научной конференции "Проблемы новаторской деятельности учёных, изобретателей и других творческих работников в условиях реформирования экономики" (Саратов, 1996); на VII Российском съезде дерматологов и венерологов (Казань, 1996); на итоговых заседаниях Ассоциации дерматовенерологов Саратовской области (1994, 1995 г.), Ассоциации медицинской лабораторной диагностик Саратовской области (1994), итоговой научной конференции РосНИП-ЧИ "Микроб" (1995)

Основные результаты диссертации изложены в б опубликованных работах. Список публикаций приводится в конце автореферата.

Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из введения и пяти глав, включающих обзор литературы, описание материалов и методов, результаты собственных исследований, а также общего заключения и выводов. Работа изложена на 102 страницах машинописного текста и иллюстрирована 10 рисунками и 11 таблицами. Список литературы содержит 110 цитируемые работы, из них 94 - статьи зарубежных авторов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

I. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Обследовано 799 человек (587 мужчин и 212 женщин). У мужчин исследовали осадок первой порции мочи. В ряде случаев делали соскоб слизистой оболочки переднего отдела уретры. У женщин исследовали соскоб слизистой оболочки цервикального канала.

1ЩР проводили на программируемом термоциклере фирмы "Био-ком" (Россия). Реакционную смесь готовили, добавляя к буферу для Taq-полимеразы 0.2 мМ каждого дНТФ, 12-40 пМ каждого из пары праимеров, 1,5 ед Taq-полимеразы "Биомастер" (Россия) и 10-20 мкл образца. Учет результатов ЩР осуществляли с помощью электрофореза в '¿X агароэном геле. Окрашивание гелей для учёта ампли-фицированной ДНК в проходящем ультрафиолетовом свете производили бромистым этидием (0,5 мкг/мл). Анализ молекулярной структуры праймеров проводили с использованием компьютерной программы Vector NT i 3.0 (InîorMax Inc. 1994,1995).

При подготовке проб (очистке ДНК-матриц) методом лизиса гу-анидинтиоцианатоы с нуклеосорбцией на силикагеле исследуемые образцы суспендировали в 100 мкл дистиллированной воды и смешивали с равным объёмом визирующего буфера следующего состава: силика-гель - 120 мг/мл, GuCSN - 6 M,' ЭДТА - 0,2 M, тритон Х-100 - 2,6 мг/мл, NaOH - 0,3 M, инкубировали при 65°С в течение 10 мин, периодически встряхивая на вортексе для лучшей сорбции ДНК. После окончания лизиса образец центрифугировали 30 сек при 12000g и осадок суспендировали в 300 мкл 4M раствора GuCSN. Нуклеосорбент промывали дважды 'с использованием центрифугирования в буфере г Трис-НС1 (рН 7,3) - 10 мМ, NaCl - 59 мМ, этанол - БОХ. На последней стадии осадок ресуспендировали в 20 мкл бидистиллированной воды и инкубировали 7 мин при 55°С, периодически встряхивая на вортексе. Пробы центрифугировали в течение 1 мин и водную фазу использовали в ПЦР.

Бактериологический анализ при обнаружении T. vaginal is и исследования прямым иммунофл'уоресцентным методом при исследова-

нии на С.trachomatis выполняли в соответствии с "Методическими материалами по этиологии,, эпидемиологии, клинике, диагностике, лечению и профилактике болеэней, передаваемых половым путём" (утверждены учёным советом ЦНИКВИ МЗ и МП Р1> 13.12.1994 . г.). Культивирование хламидий осуществляли в культуре клеток Мак-Кой. Результаты культивирования оценивали с помощью прямого иммуноф-луоресцентного~метода.

Ш. РАЗРАБОТКА УСЛОВИЙ ПЦР ДЛЯ. ОБНАРУЖЕНИЯ ДНК-МАТРИЦ

ТРИХОМОНАД И ХЛАМИДИЙ.

На первом этапе исследований в экспериментах с ДНК или чистой культурой трихомонад и хламидий нами были апробированы прай-меры, описанные другими авторами. В результате было -показано, что олигону!слеогидные затравки на основе случайно клонированной нунклеотидной последовательности Т.vaginalis, предложенные в работе Riley D.E. с соавт. (1992), хотя и обеспечивают амплиф..кацио ДНК трихомонад, не пригодны для работы с клиническими образцами из-за образования неспецифичных ампликонов с геномной ДНК. Хорошие результаты были получены нами с праймерами TY3-TV7, описанными Kengne Р. с соавт.(1994), соответствующими повторяющейся последовательности три?(омонадной ДНК. В ПЦР имело место образовгчие 'только .специфичного продукта (размером 300 п.н.).

Одним из наиболее вакных .моментов при выборе пралмеров, является анализ их структуры для определения возможности образования нежелательных вторичных структур,- в первую очередь, димеров праимеров. С целью подбора наиболее оптимального нуклеотвдного состава затравок нами, с применением программы Vector NTI 3.0 (InforMax Inc. 1994, 1935), был проведен компьютерный анализ нуклеотиднсй последовательности, описанной Кепчпе.Р. с соавт (1994), в результате которого были выбраны другие праймеры (обозначены Т1-Т2), теоретически образующие меньшее число нежелательных вторичных структур при самоотжиге, чей олигонуклеотиды TV3-TV7. Нуклеотидный состав лраймеров Т1-Т2:

Т1- Б'-ЦГА'АДА ИГ ГТЦ ITA 11ВД ТЦА Г-3' ;

12- 5'-АТТ ТДТ ГТГ ЦДГ ТДТ ТЦА АГТ АТГ-ЗЧ Реакцию"проводили в следующем температурном режиме: 92°С-1 мин, 53°С-1 мин, 72°С-2 мин. Всего 35 циклов. Концентрация хлорида магния во всех случаях составляла 1,5 мМ. Размер амплифицирован-ного фрагмента 298 п.и.

В экспериментах с различными концентрациями культуры Т.vaginalis, ДНК лимфоцитов и тотальной ДНК E.coli, N. gonorrhoeae, С.trachomatis, U.urealitica, М.hominis была доказана специфичность ЩР с праймерами 11-12. Чувствительность реакции составляла величину порядка 10-100 м.к. в пробе.

В экспериментах по подбору оптимальных праймеров для детекции С.trachomatis, с учётом литературных данных, тестировали олигснуклеотиды на основе хромосомного гена МОМР: СН1-СН2 (Say cid а С. et al., 1991) и криптической плазмиды хламидий: С1-С2 (Lucotte Q. et al.,1992). Исследования проводили как с препаратами ДНК хламидий, так и с материалом от больных. Обе пары праймеров обеспечивали, при учете реакции с помощью окраски ДНК бромистым эти-дием, специфичное выявление порядка 0,1 пг ДНК, или 10-100 микроорганизмов.

В экспериментах по оценке пригодности праймеров для анализа материала от больных обследовано 36 мужчин (исследовали соскобы со слизистой оболочки уретры)'и 56 женщин (соскобы со слизистой оболочки цервикального канала)- всего 92 пациента. Во всех случаях одновременно тестировали СН1-СН2 и С1-С2 олигозатравки. В результате с праймерами СН1-СН2 положительный ответ был получен в 38 случаях, с С1-С2 у 40 больных. При этом положительные и отрицательные результаты совпадали во всех случаях за исключением двух,, ктда специфичный ЩР-продукт образовывался только с С1-С2 праймерами.

Наши данные позволяют сделать заключение, что в исследуемой выборке проб от пациентов не было штаммов хламидий, лишенных плазмиды и, что праймйры на основе плазмиды обеспечивают более высокую чувствительность реакции. Этот вывод совпадает с мнением ряда авторов о предпочтительности использования плазмиды в ка-

- il -

честве ДНК-мишени, вследствие ее мвогокопийности (Comanducci M. et al., 1990; Скрипкин Ю.К. с соавт., 1996). Проведённый компьютерный анализ подтвердил пригодность олигонуклеотидов С1-С2 для 1ЩР-анализа. Нуклеотидный состав праймеров С1-С2:

Cl- 5'-ТТЦ 1ЩЦ ТТГ ТАА ТТЦ ГТТ ГЦ-3\

С2- 5'-ТАГ ТАА ЦТГ ЦЦА ЦТТ ЦАТ ЦА-3'.

Параметры реаквди были аналогичны описанным выше для праймеров Т1-Т2, за исключением температуры откига, которая в данной случае составляла 55°С. Размер амплифицированного фрагмента 201 п.н.

IV. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ РАЗЛИЧНЫХ СПОСОБОВ ПОДГОТОВКИ КЛИНИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ ПРИ ДЕТЕКЦИИ ТРИХОМОНАД И ХЛАМИДИЙ МЕТОДОМ ПЦР

После разработки параметров ПЦР для специфичной детекции Т.vaginalis и С.trachomatis нашей следующей задачей была апробация известных способов выделения и очистки ДНК s плане их пригодности для ПЦР-анализа проб, исследуемых на наличие трихомонад и хламидий: соскобов со слизистой оболочки цервикального канала и уретры, а также осадка мочи. Использовали три принципиальнс отличных подхода:

1) лизис неионными детергентами с протеиназой К, как описав в работах Rasmussen S.J. et al., (1993) и Гараниной С.Б. с соавт. (1994);'

2) щелочной лизис с фенол-хлороформовой экстракцией и оса? дением ДНК этанолом (модификация Norkina O.V. et al., 1994);

3) лизис гуанидинтиоцианатом с нуклеосорбцией на силикате. (Boom R. с соавт. ,1990). Использовали силикагели марки: ЛСХЛ—254 Россия (размер частиц 2-10 мкм) и Silica S5631, Sigma (разме частиц 0,5-10 мкм).

V больных ЗПЛП обычно исследуют соскобы со слизистых обол чек. Мы поставили перед собой задачу изучить возможность ПЦР-ан лиза при тестировании не только ссюкобов, но и осадка-мочи.

В предварительных экспериментах по детекции трихомонад

соскобах со слизистой оболочки цервикального канала и осадке" мочи, искусственно инфицированных Т.vaginalis, было показано, что все три способа подготовки проб обеспечивают одинаковый уровень чувствительности: 50 м.к./мл.

При сравнительном использовании вышеуказанных методов для исследования клинических проб, были получены данные, позволившие определиться в выборе способа первичной обработки.

В результате выполнения 169 анализов соскобов со слизистой оболочки уретры и осадка мочи у мужчин было получено 49 положительных результатов (на обе инфекции), при этом отмечено 6 ложно-отрицательных ответов в случае использования для обработки проб мочи лизирующих буферов с протеинааой И. Это происходило в случаях высокого содержания солей в моче. Данный способ не обеспечивал полноценной очистки проб с высоким содержанием фосфатов и оксалатов. Наилучшие результаты со всеми тестируемыми обгектами были получены при использовании метода нуклеосорбции с гуанидин-тиоцианатом.

На наличие С.trachomatis исследовали 92 образца осадка мочи, соскобов со слизистой оболочки уретры мужчин и 56 проб соскобов со слизистой оболочки цервикального канала женщин. При этом было получено 36 положительных результатов. В случае применения для подготовки проб метода лизиса гуанйдинтиоцианатом с нуклеосор-бентом ЛСЯ-254 имели место 4 ложноотрицательных ответа. На основании полученных данных было сделано заключение, что эта марка силикагеля имеет недостаточную сорбционную активность в отношении плагмидной ДНК, являющейся в данном случае ДНК-мишенью. Си-ликагель Silica S5631 обеспечивал лучшую сорбцию (отсутствие локных результатов), очевидно, за счёт более оптимального размера частиц. Учитывая, что при ПНР-анализе на трихомонады (ДНК-мишень - хромосома) этот нуклеосорбент бил также эффективен, он был использован нами во всех последующих исследованиях.

. Способ подготовки проб'методом фенол-хлороформовой экстракции с преципитацией ДНК этанолом был применён для обработки 306 проб (из них 87 с положительным ответом на трихомонады или хлами-дии), при этом отмечено семь ложноотрицательных ответов. Причиной

их может быть ингибирующее действие остатков фенола на Taq-поли-меразу или потеря ДНК на этапе осаждения этанолом. С учётом этого, а также относительной трудоёмкости способа, данный подход, на наш взгляд, не может быть рекомендован при массовых обследованиях.

Таким образом, нами разработана следующая схема анализа: исследуют осадок первой порции мочи у мужчин, соскобы со слизистой оболочки цервикального канала у женщин; пробы обрабатывют методом лизиса гуанидинтиоцианатом с нуклеосорбентом Sillca S5631; в качестве праимеров используют олигонуклеотиды Т1-Т2 для Т.vaginalis и С1-С2 для С.trachomatis. Особое внимание заслуживают данные о возможности анализа проб мочи вместо соскоба со слизисто! оболочки уретры у мужчин. Эта неинвазивная( процедура значительнс упрощает процесс забора материала.

V. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПЦР-АНАЛИЗА ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ МАТЕРИАЛА ОТ

БОЛЬНЫХ

Всего за период выполнения работы методом ПЦР было обследовано 799 пациентов, обратившихся амбулаторно с симптомами ЗППП или без признаков болезни, желающих обследоваться в связи с подозрением на возможность заболевания. В таблице приводятся данные по количеству случаев обнаружения Т.vaginalis и С.trachomatis, независимо от вида исследуемого материала и топическоп диагноза. Кроме этого, была обследована контрольная группа здоровых детей в возрасте от 5 до 11 лет. С праймерами Т1-Т2 С1-С2 исследовали осадок мочи; всего 40 определений. При этом во всех случаях был получен отрицательный результат.

Известный интерес представляет информация о частоте ассоци рованной трихомонадно-хламидийной инфекции: у 51,9Z мужчин 45,22 женщин больных трихомониазом одновременно регистрировало урогенитальный хламидиоз. В то же время, среди больных хламидис зом трихомониаз встречался у 177. мужчин и 24,7% женщин. Это cbv детельсгвует о высокой вероятности одновременного наличия хлам!

длиной инфекции при выявлении Т.vaginalis.

Таблица

Данные по выявлению методом 1ЩР С.trachomatis и Т.vaginalis у обследованных пациентов.

1 1 Пол Общ. кол-во обследованных г......1 С. tra- 1 chôma- | tis (+)| 1 1 T.vaginal is <+) ......-% « 1 С.trachomat. |и T.vaginal. 1 (+) 1 % 1

|Муж. 587 159 1 27,1 52 8,8 1 27 4,6 1

|Жен. 212 77 1 36,3 42 19,В 1 19 9.0 i

|0тр. 1 контроль 1(мук) 1 40 0 ! • 0 0 0 1 о 1 1 1 1 0 1 1 1

Отмечена высокая частота скрытых Форм обеих инфекций. Так, у обследованных женщин с отсутствием внешних проявлений ЗППП хламидии были обнаружены в 22,7% случаев, а трихомонады у 4,5% (у мужчин 14,2% и 0,8%, соответственно). Наши наблюдения подтверждает точку зрения о важной роли асимптомных носителей инфекций в распространении этих заболеваний.

В процессе выполнения настоящей работы, исследования материала от пациентов выполнялись как с помощью ПЦР, так и с привлечением других, традиционных методических подходов: бактериос-копического, культурального и иммунологического. Полученные результаты повволили получить представление о диагностической точности использованных способов. Так, чувствительность бактериос-копического метода; при детекции Т.vaginalis составляет у мужчин - 41,2%, у женщин - 60,9%, культурального - при первичном высеве

- 52,9% и 60.9Z, соответственно. При повторных высевах частота обнаружения трихомонад возростала до 82,4% у мужчин и 78,3% у женщин. Случаев обнаружения Т.vaginalis культуральный методом с одновременно отрицательным ответом в ПЦР не было.

При сравнении ПЦР-аналиьа с другими методами лабораторной диагностики урогенигального хламидиоза были получены данные, свидетельствующие, что чувствительность прямого иммунофлуоресцентно-го метода по сравнению с ПНР составляет 65,5%, иммуноферментного анализа сыворотки крови на IgG - 89,7%, IgA - 89,7%. Специфичность иммунофлуоресцентного анализа - 82,4%, иммуноферментного на Igö - 47,1%, IgA - 82,4%, соответствено. Наши результаты совпадают с данными, полученными в последнее время другими авторами, . с снижении чувствительности иммунофлуоресцентного метода детекции хламидий до 60% и менее при низком числе микробных тел в материале (Скрипкин Ю.К., 1996). Для подтверждения результатов ПЦР, в ряде случаев, при несоответствии данных, полученных с помощью различных методов, нами был применён культуральный метод обнаружения С.trachomatis. При этом отмечено 100% совпадение результатов, полученных при высеве на культуру клеток, и ПЦР.

Таким образом, ПЦР-анализ обеспечивал большую чувствитель ность и специфичность по сравнению с другими испытанными способа ми лабораторной диагностики трихомониаза и урогенитального хлами диоза. Культуральный метод, обладающий высокой диагностическс точностью при детекции хламидий из-за сложности и длительное] анализа уступает ПЦР и может быть, рекомендован поэтому только качестве контрольного теста.

При внедрении любого диагностического теста важно определить не только его эффективность как способа обнаружения болезни, но и возможность применения для контроля эффективности лечения, в качестве критерия излеченности. В специальном исследова нии, проведенном на 136 больных урогенитальным хламидиозом и 5 больных трихомониазом материал для ПЦР-анализа брали спустя 1-дня, 7 дней, 14 дней, 1 месяц, 2 месяца после окончания курс лечения. Полученные данные позволяют сделать заключение, что пр использовании разработанных нами вариантов ГЩР-аналиэа на трихс

монады и хламидии, через 1-7 дней после окончания курса лечения в материале от больных продолжают присутствовать ДНК микроорганизмов, выявляемая в реакции амплификации. Спустя 14 дней, в случае действительного излечения, реакция становится отрицательной. Таким образом, 14 дней - оптимальный срок обследования методом ПЦР, после окончания курса лечения.

В данной ■работе впервые был проведён анализ возможности применения ЩР-диагностики для обнаружения возбудителей ЗППП при исследовании клинического 'материала. Разработанные модификации ЩР и этапа подготовки проб, проверенные на большой выборке обследованных больных могут быть взяты за основу при компоновке диагностических ПЦР-тест-систем для детекции Т.vaginal is и С.trachomatis.

ВЫВОДЫ

1. В экспериментах на клиническом материале показано важное значение способа обработки проб для получения достоверных результатов. Установлено, что наиболее универсальным методом подготовки материала (соскобов со слизистых оболочек, осадка мочи) является лизис клеток гуанидинтиоцианатом с нуклеосорбцией ДНК на силикателе.

2. Разработаны параметры ЩР для детекции Т.vaginalis. Подобран оптимальный нуклеотидный состаЕ праимеров на основе повторяющейся последовательности ДНК трихомонад. Чувствительность метода составляет 50-100 м.к./мл.

3. Показана большая чувствительность ЩР в. случае применения праймеров на основе плаамиды хламидий. При обследовании 92 больных с урогенитальными ЗППП, с положительными анализами на . хламидии штаммов, лишенных плазмвды обнаружено не.было, что позволяет рекомендовать использовать данные праймеры для детекции С.trachomatis..

4. Продемонстрирована возможность использования в качестве объекта исследования при лабораторной диагностике трихомониаза и

урогаштального хламидиоза осадка мочи. Предложенные способы обнаружения Т.vaginalis и С.trachomatis в пробах мочи, обеспечивают такую же чувствительность, как анализы соскобов со слизистой оболочки уретры.

Ь. При определении диагностической точности различных методов обнаружения трихомонад по сравнению с ПЦР показано, что чувствительность бактериоскопического метода составляет у мужчин -41,2%, у женщин - 60,9%, культурального - при первичном высеве -52,9% и 60,97., при повторных высевах - 82,4% и 78,3%, соответственно.

6. При диагностике урогенитального хламидиоза чувствительность прямого иммунофдуоресцентного метода по сравнению с ПЦР составляет 65,5Х, иммуноферментного анализа сыворотки крови на IgG - 89.7%, IgA - 89,7%, специфичность - 82,4%, 47,1% и 82,4%, соответствен. Отмечено 100% совпадение результатов ПЦР и культурального метода при анализе на хламидии.

7. Продемонстрирована возможность применения ПЦР для контроля эффективности лечения и в качестве критерия излеченности три-хомониаза и урогенитального хламидиоза. Определен оптимальны! срок обследования после окончания курса лечения: через 14 дней.

8. С использованием ПЦР показано, что частота трихомониаз, при бессимптомном течении, составляет у женщин - 4,5%, у мужчин 0,8%, урогенитального хламидиоза - 22,7% и 14,2%, соответственно Сочетанное инфицирование хламидиями при трихомониазе имеет мест у мужчин в 51,9%, у женщин в 45,2% случаев.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО .ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Chuiakov А.А., Popov Yu.A., Suvorov А.P., Kulichehko A.N. The use of polymerase chain reaction for diagnosis of aidsasso-clated infections.// In Abstr.lst Inern. regional.conf.on HIV infection.- Saint-Petersburg.- 1-4 March, 1994. - P.23.

2. Суворов А.П., Гольбрайх Е.Б., Ч/раков A.A., Аккузина О.П., Суворов С.А., Фрольцова H.A., Гасанова Т.А. Диагностика и лечение инфекционных заболеваний мочеполовой сферы негонококковой этиологии. (Учебно-методические рекомендации).// Изд-во Саратовского мед.ун-та. - 1934 г. - 19 С.

3. Чураков A.A. Молекулярно-генетический метод обнаружения трихомонад и хламидий в клиническом материале.// Сборник трудов СГМУ. - Саратов. - 1994. - С.42-43.

4. Чураков A.A., Куличенко А.Н., Попов Ю.А., Суворов А.П., Гаранина С.Б. Разработка методических подходов для обнаружения хламидий и трихомонад в клиническом материале при помощи полиме-разной цепной реакции.// В сб.: Актуальн.вопросы, совр.медицины.- Матер. Международной конф. молодых ученых. - Бишкек. -1994.- С.155 -156.

5. Чураков A.A., Куличенко A.A., Попов Ю.А., Гаранина С.Б. Способ подготовки клинического материала для обнаружения уроге-нитального хламидиоза.// В сб."Проблемы новаторской деятельности учёных, изобретателей и других творческих работников в условиях реформирования экономики"- Тез".докл.науч. конф.- Саратов.- 1996 - С.127-123.

6. Чураков A.A. Куличенко А.Н. Суворов А.П. ,. Гаранина С.'Б., Гасанова Т.А., Попов Ю.А., Скатин A.B. К диагностике урогени-тального хламидиоза. // В сб.:"Tee.докл. VII-Российского съезда ■ дерматологов и венерологов"- Казань.-"Медицина".-1996. -ч.III.-с.121-122. .

Приношу глубокую и искреннюю благодарность своим научным руководителям: доктору биологических наук, профессору Ю.А.Попову и доктору медицинских наук, профессору А.П.Суворову за чуткое руководство, постоянную поддержку, доброе и внимательное отношение при выполнении и оформлении данного исследования.

Приношу глубокую благодарность директору РосНИПЧИ "Микроб", докт.мед.наук., профессору, академику, засл.деят.науки ГО А.В.Наумову за предоставленную возможность проведения этой работы.

Выражаю искреннюю признательность своим основным соавторши, в сотрудничестве с которыми была выполнена экспериментальная часть работы: докт.мед.наук Л.Н.Куличенко, м.н.с. С.Б.Гараниной.

Считаю своим приятным долгом поблагодарить зав.дерматовенерологическим отделением военного госпиталя, канд. мед. науу Е.Б.Гольбрайха,' зав. лабораторным отделом Саратовского центра профилактики и борьбы со СПИЛ, канд.мед.наук Э.А.Федотова, зав. лабораторией Перинатального центра г.Энгельса

канд. биол. наук Т.А.Гасанову, врача МСЧ САЗ А. В. Скатина за методическую помощь, ценные советы и товарищескую поддержку.