Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Обнаружение новой 5mC-зависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазы BisI и установление её субстратной специфичности

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Обнаружение новой 5mC-зависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазы BisI и установление её субстратной специфичности"

На правах рукописи

Землянская Елена Васильевна

ОБНАРУЖЕНИЕ НОВОЙ 5шС-ЗАВИСИМОЙ САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ДНК-ЭНДОНУКЛЕАЗЫ И УСТАНОВЛЕНИЕ ЕЁ СУБСТРАТНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ

03.01.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 5 НОЯ 2012

Кольцове-2012

005054986

005054986

Работа выполнена в Обществе с ограниченной ответственностью «СибЭнзайм», г. Новосибирск

Научный руководитель:

Дегтярев Сергей Харитонович, доктор биологических наук, профессор, ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», заведующий отделом производства и применения средств ПЦР-диагностики вирусных и риккетсиозных заболеваний

Официальные оппоненты:

Нетесова Нина Александровна, доктор биологических наук, ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», заведующая отделом разработки средств ПЦР-диагностики вирусных и риккетсиозных заболеваний

Татьков Сергей Иванович, доктор биологических наук, Учреждение РАН Институт цитологии и генетики СО РАН, ведущий научный сотрудник

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, г. Москва

Защита состоится «14» декабря 2012 г. в 9-00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: р.п. Кольцово, Новосибирского района, Новосибирской области, 630599; тел: (383) 336-74-28

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Автореферат разослан «9» ноября 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор

^/''¿А^^г/'- Трошкова Галина Павловна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Аюуальность темы

Метилзависимые сайт-специфические ДНК-эндонуклеазы (МД-эндонуклеазы, от английского «methyl-directed») - это немногочисленная группа ферментов, которые специфически расщепляют только метилированную ДНК. Среди них различают N'6-метиладенин- и 5-метилцитозинзависимые ферменты. МД-эндонуклеазы являются малоизученным, но очень интересным объектом, как для фундаментальных исследований, так и с точки зрения практического использования. Изучение механизма действия МД-эндонуклеаз и их способности специфически узнавать и гидролизовать модифицированную ДНК представляет большой интерес для установления общей картины функционирования сайт-специфических ДНК-эндонуклеаз. Важным также представляется изучение роли этой группы ферментов в функционировании бактериальной клетки, которая в настоящее время не совсем ясна.

Следует также отметить большой потенциал практического применения МД-эндонуклеаз в биотехнологии и эпигеномике для решения целого ряда различных задач. При этом наибольший интерес вызывают 5шС-зависимые ферменты, способные узнавать определенную метилированную последовательность ДНК и однозначно расщеплять ее в фиксированной позиции. Это связано с возможностью использования этих ферментов для изучения статуса метилирования ДНК у высших организмов (в том числе у человека), у которых именно 5-метилцитозиновые основания являются эпигенетическим маркером.

Учитывая ограниченное количество известных в настоящее время биохимически охарактеризованных представителей данной группы ферментов, обнаружение и изучение новых 5-метилцитозинзависимых сайт-специфических эндонуклеаз, способных однозначно гидролизовать ДНК, является актуальной задачей.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы явилось обнаружение и изучение свойств новой 5шС-зависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазы, способной узнавать и расщеплять метилированную последовательность ДНК 5'-GCNGC-373'-CGNCG-5\ В задачи настоящего исследования входило:

1. Получение субстрата для 5шС-зависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазы путем клонирования гена ДНК-метилтрансферазы M.Fsp4Hl из

Flavobacterium species 4H, узнающей и модифицирующей последовательность 5'-GCNGC-3', и определение положения 5-метилцитозина в метилированной последовательности.

2. Проведение скрининга бактерий из различных природных изолятов на наличие фермента, расщепляющего ДНК полученной плазмиды, и выявление продуцента 5тС-зависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазы, узнающей и гидролизующей только метилированную ДНК.

3. Характеризация штамма-продуцента 5тС-зависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазы, отработка методов его культивирования.

4. Очистка новой 5тС-зависимой сайт-специфической эндонуклеазы и определение оптимальных условий функционирования фермента.

5. Определение субстратной специфичности и места гидролиза ДНК эндонуклеазой.

6. Установление возможности практического использования новой 5шС-зависимой сайт-специфической эндонуклеазы в молекулярно-биологических исследованиях.

Научная новизна и практическая ценность работы

Впервые получена рекомбинантная плазмида pFsp4HIl, несущая ген С5-ДНК-метилтрансферазы M.Fsp4HI, модифицирующей последовательность 5'-GCNGC-3\ Определена нуклеотидная последовательность вставки и установлены характеристики гена ДНК-метилтрансферазы M.Fsp4HI. Получен препарат рекомбинантной ДНК-метилтрансферазы M.Fsp4HI и показано, что фермент модифицирует сайт узнавания с образованием последовательности 5'-G(5mC)NGC-373'-CGN(5mC)G-5'.

Впервые выявлен бактериальный штамм Bacillus subtilis ТЗО, являющийся продуцентом 5шС-зависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазы Bisl. Впервые получен препарат фермента, определены его субстратная специфичность и позиция расщепления ДНК. Показано, что фермент Bisl узнает последовательность нуклеотидов 5'-G(5mC)|NGC-373'-CGNt(5mC)G-5' и расщепляет ДНК в строго фиксированной позиции, как указано стрелками. Bisl - это первая 5-метилцитозинзависимая эндонуклеаза, для которой показан сайт-специфический характер расщепления ДНК, свойственный для эндонуклеаз рестрикции второго типа. В работе также впервые проведен анализ субстратной специфичности эндонуклеазы Bisl, и показана зависимость активности этой эндонуклеазы от «рисунка» метилирования сайта узнавания.

Впервые предложен способ, и экспериментально показана возможность использования новой 5шС-зависимой сайт-специфической эндонуклеазы BisI в молекулярно-биологических исследованиях для сайт-специфического расщепления протяженных неметилированных молекул ДНК.

Основные положения, выносимые на защиту

Рекомбинантная плазмида pFsp4HIl содержит метилированные последовательности 5 '-G(5mC)NGC-3 73 '-CGN(5 mC)G-5'. Бактериальный штамм Bacillus subtilis ТЗО продуцирует 5тС-зависимую сайт-специфическую ДНК-эндонуклеазу.

5шС-зависимая сайт-специфическая эндонуклеаза BisI узнает метилированную последовательность ДНК 5'-G(5mC)J.NGC-373'-CGN|(5mC)G-5' и расщепляет ее в фиксированной позиции, как указано стрелками.

5шС-зависимая сайт-специфическая эндонуклеаза BisI способна расщеплять последовательность 5'-GCNGC-373'-CGNCG-5' с различным количеством и расположением модифицированных оснований, при этом каноническим сайтом узнавания эндонуклеазы является метилированная последовательность 5'-G(5mC)NGC-373'-CGN(5mC)G-5'.

Эндонуклеаза BisI может быть использована для сайт-специфического расщепления протяженных неметилированных молекул ДНК.

Апробация работы и публикации

Материалы исследований по теме диссертации представлены на следующих российских и международных конференциях: «1-ая Международная научно-практическая конференция «Медбиотек-2005» (Москва, 2005), «Международная конференция «Биология - наука XXI века» (Москва, 2012). По материалам диссертации опубликованы три печатные работы.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из семи разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список литературы». Работа изложена на 92 страницах машинописного текста и включает 18 рисунков и 2 таблицы. Список цитируемой литературы содержит 131 ссылку.

Вклад автора в диссертационную работу

Все основные эксперименты, проведенные в работе, а также анализ полученных результатов выполнены автором лично. Эксперименты по клонированию и микробиологические исследования проводились совместно с сотрудниками ООО «СибЭнзайм».

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Получение рекомбинантной плазмиды, несущей ген ДНК-метилтрансферазы M.Fsp4HI

При скрининге бактериальных штаммов на предмет выявления сайт-специфической эндонуклеазной активности в качестве субстратов обычно используют стандартные фаговые и плазмидные ДНК с известной нуклеотидной последовательностью, которые, как правило, не метилированы. Для поиска 5тС-зависимой сайт-специфической эндонуклеазы мы планировали использовать в качестве субстрата препарат плазмидной ДНК, несущей ген ДНК-метилтрансферазы из системы рестрикции-модификации (РМ) Fsp4HI. Ферменты РМ системы Fsp4HI из бактериального штамма Flavobacterium species 4Н узнают нуклеотидную последовательность 5'-GCNGC-3'. Для клонирования гена fsp4HIM в клетках Escherichia coli ER 2267 была получена геномная библиотека (порядка 15000 клонов), содержащая встроенные в плазмидный вектор pUC19 EcoRI-фрагменты хромосомы Flavobacterium species 4Н. Селекция клонов, содержащих ген ДНК-метилтрансферазы M.Fsp4HI, проводилась, основывалась на устойчивости целевых рекомбинантных плазмид к расщеплению эндонуклеазой рестрикции (ЭР) Fsp4HI. Часть клонов, выросших на среде с ампициллином после трансформации компетентных клеток Е. coli ER 2267 продуктами гидролиза ДНК геномной библиотеки эндонуклеазой Fsp4HI, несла плазмиды, устойчивые к расщеплению ЭР Fsp4HI, а, значит, содержащие ген функционально активной ДНК-метилтрансферазы данной РМ системы. Показано, что все эти клоны содержат также специфическую эндонуклеазную активность, свойственную ЭР Fsp4HI. Таким образом, полученные рекомбинантные штаммы E.coli содержали плазмиду с полным опероном РМ системы Fsp4HI. Плазмидная ДНК, выделенная из одного штамма и названная pFsp4HIl, содержала вставку длиной около 5 т.п.н. Было проведено определение нуклеотидной последовательности встроенного фрагмента.

Анализ нуклеотидной последовательности вставки выявил несколько открытых рамок трансляции (ОРТ), две из которых оказались достаточно протяженными для того, чтобы кодировать гены РМ системы (ОРТ1, район 862-2088, и ОРТ2, район 2085-3215) (рис.1). Соответствующие нуклеотидные и аминокислотные последовательности депонированы в банке данных GenBank (Асс. number EMBL Data Bank DQ848673). Обе открытые рамки трансляции направлены одинаково и перекрываются друг с другом на 4 п.н.

Рис. 1. Схема расположения открытых рамок трансляции, соответствующих генам ДНК-метилтрансферазы и эндонуклеазы рестрикции из системы РМ Рзр4Н1.

Первая рамка длиной 1227 п.н. кодирует полипептид из 408 аминокислотных остатков с предсказанной молекулярной массой 47134 Да. Анализ аминокислотной последовательности потенциального белкового продукта ОРТ1 показал его принадлежность к классу С5 ДНК-метилтрансфераз: в первичной структуре белка выявляются все 10 консервативных мотивов, характерных для ДНК-метилтрансфераз данного класса, при этом, как и у большинства других С5-метилтрансфераз, между восьмым и девятым консервативными мотивами расположен вариабельный участок, который, как полагают, ответствен за специфическое связывание ДНК (рис. 2). Таким образом, первая рамка, по-видимому, представляет собой ген ДНК-метилтрансферазы М.Рзр4Н1.

Вторая рамка длиной 1131 п.н. кодирует полипептид из 376 аминокислотных остатков, при анализе аминокислотной последовательности которого значительной гомологии с другими белками обнаружено не было. Однако отсутствие сколько-нибудь значительной гомологии первичных структур, за исключением некоторых изошизомеров, характерно для эндонуклеаз рестрикции И-го типа. Таким образом, поскольку других подходящих по длине рамок, которые могли бы кодировать специфическую эндонуклеазу, во вставке нет, а рекомбинантная бактерия проявляет специфическую эндонуклеазную активность, вторая рамка трансляции,

fsp4HIM (862-2088)

fsp4HIR (2085-3215)

4942 bp

м.рзр4нх <зсшс М.ЫаСХХ оснос Н.НаеХХ насосу м.ньах ее®: М.ЗвоХХ ССЫСЗС М.МгрХ ССбО

----------------------------------------------------------------------------------------МХЕХКБК 7

---------------------------------МТШ1А*Т1КШ(ЕЕЕ1,ВВтаЕЕЕАБА1.0Ь8КУ<30ВТХЕЯКЕЕСЕТКРТОЛЕЬКАУ11>ЕРВТРРтемг! 67

М.Рвр48Х <ИНОС Н.ЫаОН ОСКбС К.НйеН ЯВСОСУ

м.ньах есвс М.ЗвоХХ ССКОО М.МэрХ СССО

М. Рар4НХ <5СШС М.ЫаПХХ оснсс М.НаеН ВЭСвСУ М.НЬаХ вС(5С

м.ввои ссшо м.марх сева

м. Рвр4нх ескас и.Ыаих зеяво

М.ИавХ! йвсгсу

м.кьах осас М.ЗвоХХ сснвс М.МарХ ссво

287 К - ЕКвХЮХ РУУККВ-НОУУР^ЬТСГКХЗХЦТУУеМКОТУАИЕ.....81

193 ГЗККОООКРУУТ8ЕК!1КЕЕС«ЬК»ККТтЮТТУО«Ет'УУЕЕ.....¿аезнот

зтэтршурыввька-КЕЬЗзхткоурурзх-миаихзок.......УЗАЬРУЗС!

198 РВгЕ7ЕВ1,У1тк|!ЬУИ-ТК|Е1ВвТТРХ'га!1в1-Ув1Са0аСЕЕХУ|Т«в1А1|

2«! ХВТОМКУТХ,ЗСА1.ЮгаН<)|ш|......ьтеАААаЕ0Р0У01.Е----моют

290 ЗВУТО-У313ЕНЬ0К8УХРк|-ВОаКР8ЬХСКНТТСАУКТ1<У----- ЙТУНКХС"!

мозаЕюге'РбххювЕВ-1| метв^кнурйьтузав:

иачаа$У1т.фтв----

уяеш РАхта0У1,ОТ10к |КУУХ1ЙЗЕ11.1ЕвКв8Ы-

М.Р»р4НХ «ЖЗС 37»

м. ЫаШХ аензе 28«

М.НаеН КвСвСУ 272 ЯРУЭЙ

М.НЬаХ зсвс 293 Г? ГУХ

м.заохх сскоо 14«

м.мврх сена 372

|1ЕуЩ.................468

¡ишигрге...............317

:ЗКХМ®П4АТМСХУ0АХ<г1,31Л0 319

Ъекру............И?

¡хвцЬв---------------зм

ТкТУКОдЗРОЕНРЕЬЕ^У 4X6

Рис. 2. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей С5 ДНК-метилтрансфераз из различных систем рестрикции-модификации. Десять консервативных мотивов отмечены волнистой линией и расположены по порядку от I до X.

по-видимому, соответствует гену эндонуклеазы рестрикции Fsp4HI (рис. 1).

Плазмида pFsp4HI 1 была использована для дальнейшего субклонирования. Был отобран фрагмент Bpul4I (сайт узнавания 5'-TT|CGAA-3') длиной порядка 1,8 т.п.н., содержащий ОРТ1, который был встроен в плазмиду pMTL22 по сайту Bsa29I (сайт узнавания 5'-ATJ.CGAT-3'). Полученная плазмида, названная pFsp4H12, оказалась устойчивой к расщеплению ЭР Fsp4HI, но клон, содержащий ее, не проявляет специфической эндонуклеазной активности. Это означает, что вставка содержит ген функционально активной ДНК-метилтрансферазы M.Fsp4HI, и не содержит полноразмерного гена эндонуклеазы рестрикции Fsp4HI.

2. Определение позиции модифицируемого основания

ДНК-метилтрансферазу M.Fsp4HI выделяли из штамма Е. coli, несущего рекомбинантную плазмиду pFsp4HI2 с геном fsp4HIM. Чтобы определить, какое из двух цитозиновых оснований в сайте узнавания модифицирует ДНК-метилтрансфераза, анализировали включение тритиевой метки при метилировании ДНК ферментом в присутствии [3H]-SAM. Для этого синтетический олигонуклеотидный дуплекс, содержащий расположенные рядом сайты узнавания ДНК-метилтрансферазы M.Fsp4HI (GCNGC) и эндонуклеазы рестрикции подтипа IIS BstF5I (GGATG2/0) (рис. ЗА), метилировали ферментом M.Fsp4HI в присутствии

А 5' CTCGGATG CAiGCATTGCACCTGTC 3 ' 24 нт

3 ' GAGCCTAC t GT CGTAÄCGTGGACAG 5 ' 24 нт

Б 1164 срт 469 срт

10 НТ 5 ' CTCGGATGCA GCATTGCACCTGTC 3 ' 14 нт

8 нт 3 1 GAGCCTAC GTCGTAACGTGGACAG 5 ' 16 НТ

132 ерш 2886 срт

Рис. 3. Определение модифицируемого основания в сайте узнавания М.Рзр4Н1. А -структура олигонуклеотидного дуплекса. Б - включение тритиевой метки в одноцепочечные фрагменты ДНК, полученные после расщепления олигонуклеотидного дуплекса ЭР Вз1Б51. Сайт узнавания метилазы М.Б5р4Н1 выделен жирным шрифтом, сайт узнавания ЭР Вз1Р51 подчеркнут, место расщепления ДНК ЭР Вз1Р51 указано стрелками.

[3H]-SAM, далее [3Н]-меченый дуплекс расщепляли ЭР BstF5I, продукты реакции разделяли путем денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле и определяли количество радиоактивной метки в каждом из четырех одноцепочечных фрагментов ДНК. Результаты измерений приведены на рис. ЗБ. Видно, что тритиевая метка включается преимущественно во фрагменты длиной 10 и 16 нт. Такая картина может наблюдаться только в том случае, если метилтрансфераза M.Fsp4HI модифицирует первый цитозин узнаваемой последовательности, таким образом, метилированная ДНК содержит модифицированные сайты 5'-G(5mC)NGC-3'.

3. Обнаружение и характеристика штамма-продуцента новой эндонуклеазы, специфически расщепляющей ДНК плазмиды pFsp4HIl

Плазмиду pFsp4HIl, полученную в результате клонирования гена ДНК-метилтрансферазы M.Fsp4HI, использовали наряду с другими ДНК-субстратами для скрининга бактериальных штаммов на предмет выявления сайт-специфической эндонуклеазной активности. При исследовании мезофильных бактериальных штаммов, выделенных из образцов почвы, было обнаружено, что один из штаммов продуцирует эндонуклеазу, которая не гидролизует стандартные вирусные и плазмидные ДНК, используемые для нахождения и определения активности эндонуклеаз рестрикции (ДНК фагов X, Т7, аденовируса-2, плазмид pUC19 и pBR322), но специфически расщепляет ДНК плазмиды pFsp4HIl, которая метилирована по сайтам 5'-GCNGC-3', благодаря содержащемуся в ней гену метилтрансферазы M.Fsp4HI.

Штамм имеет следующие культурально-морфологические и физиолого-биохимические характеристики. На среде Лурия-Бертрани образует белые, зернистые, непрозрачные, слегка выпуклые, круглые колонии с ровными краями 4 мм в диаметре. Клетки подвижные, палочковидные, размером 1х(3-5) мкм, одиночные, в парах или в коротких цепочках. Образуют эллиптические центрально-расположенные споры без разбухания спорангия. Грамположительные. Не способны к анаэробному росту, каталазоположительные, оксидазоотрицательные. Растут при температуре 10-40°С. Оптимальная температура роста 30°С, pH 7,0-7,2. По совокупности морфологических и биохимических свойств, а также на основании анализа нуклеотидной последовательности фрагмента гена 16S рибосомальной РНК штамм был определен как Bacillus subtilis Т30. Продуцируемая им эндонуклеаза названа Bisl.

4. Выделение новой эндонуклеазы BisI и определение оптимальных условий гидролиза ДНК

Вследствие невысокой целевой эндонуклеазной активности в биомассе клеток нами была разработана специальная схема очистки фермента BisI. Выделение проводили из грубого клеточного экстракта посредством колоночной хроматографии с использованием в качестве сорбентов 80 мл фосфоцеллюлозы Р-11, 50 мл DEAE-целлюлозы, 7 мл фосфоцеллюлозы Р-11, 3 мл гепарин-сефарозы и 1,5 мл аффинного сорбента CPG-2000 Oligo. Последний представляет собой иммобилизованные на стекле олигонуклеотиды, в первичной структуре которых присутствует сайт 5'-GCNGC-3' (5' TGGATGCAGCGCTTCG-p), с присоединенной комплементарной цепью (5' GAAGCGCTGCATCCA 3'). Использование аффинного сорбента CPG-2000 Oligo на заключительном этапе хроматографической очистки позволило получить препарат фермента BisI, свободный от примесных эндо- и экзонуклеазной, а также фосфатазной активностей.

В результате проведенного выделения было получено 1,75 мл препарата эндонуклеазы BisI с удельной активностью 500 ед/мл. За единицу активности (ед) принимали минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК плазмиды pFsp4HIl в течение 1 часа при температуре 37°С в 50 мкл реакционной смеси. Выход составил 20 единиц активности на грамм сырой биомассы.

В результате экспериментов по оптимизации условий функционирования нового фермента было показано, что эндонуклеаза BisI наиболее активна при температуре 30-42°С, нагрев реакционной смеси выше 50°С приводит к резкому снижению активности фермента. Эндонуклеазная активность BisI максимальна при высоких значениях pH реакционного буфера (8,5 - 9,5), что отличает новый фермент от подавляющего большинства известных сайт-специфических эндонуклеаз, которые проявляют максимальную активность в диапазоне pH 7,0 - 8,5. Оптимальная концентрация одновалентных ионов (в составе солей KCl или NaCl) для проявления эндонуклеазной активности BisI находится в диапазоне от 100 до 200 мМ, ионов Mg2* - от 10 до 30 мМ. Кроме того, в экспериментах по оптимизации условий реакции показано, что активность эндонуклеазы BisI не зависит от присутствия в реакционной смеси АТФ и SAM. В соответствии с полученными данными, все дальнейшие эксперименты по гидролизу ДНК эндонуклеазой BisI проводили при 37°С в буфере следующего состава: 10 мМ Трис-HCl (pH 9,0), 10 мМ MgCh, 150 мМ KCl, 1 мМ дитиотреитол.

5. Определение нуклеотидной последовательности, узнаваемой эндонуклеазой В1$1

Специфичность эндонуклеазы В1э1 определяли, анализируя картины специфического гидролиза различных ДНК. В качестве субстратов использовали стандартные вирусные и плазмидные ДНК (фагов X и Т7, аденовируса-2, риС19, рВЯ322), используемые для нахождения и определения активности эндонуклеаз рестрикции, а также плазмидные ДНК, содержащие клонированные гены некоторых бактериальных метилаз, модифицирующих цитозиновые основания в ДНК (М.Р$р4Н1 метилирует ДНК с образованием последовательности 5'-С(5тС)ЫСС-3', М.НзрА1 модифицирует ДНК с образованием последовательности 5'-С(5шС)ОС-3', \lFauIA и М.Раи1В метилируют ДНК образованием последовательностей 5'-С(5шС)СОС-3' и 5'-С(5тС)ССС-3', соответственно). Результаты экспериментов показали, что фермент В1з1 специфически расщепляет только ДНК плазмиды рр5р4НП, которая метилирована по сайтам 5'-ССНСС-3'. В случае остальных субстратов, как метилированных, так и немодифицированных, гидролиз ДНК не происходит. Полученные данные свидетельствуют, что фермент В^ обладает специфичностью к определенной последовательности ДНК, содержащей 5-метилцитозиновые основания.

Расщепление ДНК плазмиды рБвр-ШП происходит с образованием большого числа фрагментов (рис. 4, дорожки 7, 12), что свидетельствует о множественном присутствии сайтов узнавания в первичной структуре плазмиды. Длины фрагментов, получающиеся в результате расщепления плазмиды рРзр4Н11 ферментом О ¡эГ, совпадают с расчетными при расщеплении ДНК по метилированным сайтам 5'-С(5шС)ЫСС-3' (рис 4Б). Для подтверждения предполагаемого сайта узнавания фермента ДНК плазмиды р!_ГС19 была исчерпывающе метилирована ДНК-метилтрансферазой М.р5р4Ш, модифицирующей первое цитозиновое основание последовательности 5'-ОСКОС-3'. Из рис. 4А видно, что ДНК плазмиды р!_ГС19 устойчива к действию фермента В1в1, но расщепляется ЭР р5р4Н1. Тогда как ДНК плазмиды риС 19, модифицированная ферментом М.Рзр4Н1, наоборот, устойчива к действию ЭР Рзр4Н1, но расщепляется эндонуклеазой В1й1. Сравнение электрофоретических картин расщепления ДНК позволило установить, что гидролиз модифицированной плазмиды р!_1С19 приводит к образованию фрагментов с длинами, соответствующими длинам фрагментов, образующихся при расщеплении той же немодифицированной плазмидной ДНК ЭР р5р4Н1 (рис. 4А). Полученные данные

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

А Б

Рис. 4. Сравнение длин фрагментов, образуемых при расщеплении плазмидных ДНК, линеаризованных ЭР BamHI, эндонуклеазами BisI и Fsp4HI. А - электрофорез в 2% агарозном геле. Дорожки: 1-3 - ДНК pUC19, соответственно: интактная, обработанная эндонуклеазой BisI, обработанная ЭР Fsp4HI; 4-6 - ДНК pUC19, метилированная ферментом M.Fsp4HI, соответственно: обработанная эндонуклеазой Bis!, обработанная ЭР Fsp4HI, интактная; 7-9 - ДНК pFsp4HI, соответственно: обработанная эндонуклеазой BisI, обработанная ЭР Fsp4HI, интактная; 10 - маркер молекулярного веса 1 КЬ со следующими длинами фрагментов ДНК (т.п.н.): 10; 8; 6; 5; 4; 3x2; 2,5; 2; 1,5; 1x3; 0,75; 0,5x2; 0,25. Б -электрофорез в 1% агарозном геле. Справа указаны расчетные длины фрагментов в п.н., образующихся при расщеплении ДНК pFsp4HIl по сайтам 5'-G(5mC)NGC-3'. Дорожки: 11 -маркер молекулярного веса 1 КЬ; 12-14 - ДНК pFsp4HI, соответственно: обработанная эндонуклеазой BisI, обработанная ЭР Fsp4HI, интактная.

доказывают, что новая эндонуклеаза BisI узнает и расщепляет метилированную последовательность 5'-G(5mC)NGC-3'.

Способность эндонуклеазы BisI узнавать и гидролизовать последовательность 5'-G(5mC)NGC-3' подтвердилась также в экспериментах по расщеплению синтетических олигонуклеотидных ДНК-дуплексов, содержащих метилированную и неметилированную последовательность 5'-GCNGC-3' в одинаковом нуклеотидном окружении. Ниже приведены структуры соответствующих олигонукпеотидов (сайты 5'-GCNGC-3' подчеркнуты):

L7 5' GAGTTTAGCGGCTATCGATCT 3' L8 5 ' AGATCGATAGCCGCTAAACTC 3 ' L9 5 ' GAGTTTAG(5mC)GGCTATCGATCT 3 ' LIO 5' AGATCGATAG(5mOCGCTAAACTC 3' LU 5 ' GAGTTTAG(5mOAGCTATCGATCT 3' L12 5' AGATCGATAG(5mQTGCTAAACTC 3'.

Из электрофореграммы, приведенной на рис. 5, видно, что BisI действительно расщепляет только ДНК-дуплексы, содержащие метилированные сайты 5'-G(5mC)NGC-3' (дорожки 6 и 9) и не расщепляет ДНК, содержащую ту же неметилированную последовательность (дорожка 3).

Рис. 5. Расщепление олигонуклеотидных дуплексов эндонуклеазами BisI и Fsp4HI. [j2P]-меченные олигонуклеотиды отмечены "*". Дорожки: 1-3 - L7*/L8 (сайт 5'-GCGGC-3'), соответственно: интактный, обработанный ЭР Fsp4HI, обработанный эндонуклеазой BisI; 4-6 -L9*/L10 с сайтом 5'-G(5mC)GGC-3', соответственно: интактный, обработанный ЭР Fsp4HI, обработанный эндонуклеазой BisI; 7-9 -LI 1*/L12 с сайтом 5'-G(5mC)AGC-3', соответственно: интактный, обработанный ЭР Fsp4HI, обработанный эндонуклеазой BisI.

6. Исследование чувствительности МД-эндонуклеазы BisI к 4шС-метилированию сайта узнавания

При определении нуклеотидной последовательности, узнаваемой эндонуклеазой BisI, были использованы метилированные ДНК-субстраты, содержащие 5-метилцитозиновые основания, однако в природе цитозиновые основания могут быть также метилированы в положении N4. Для определения чувствительности фермента BisI к К4-метилцитозину были проведены эксперименты по расщеплению олигонуклеотидных дуплексов, содержащих метилированную последовательность 5'-G(4mC)NGC-3'. Ниже приведены структуры используемых олигонуклеотидов (сайты 5'-GCNGC-3' подчеркнуты):

1234 56789

Щттш-т^ш ■

С5 5' ССТТСТАСТТТАО[5шОООСАТТСАТТСТСАССАСС 3' С5' 5' СОТОСТОАОААТСААТС(5тС)СОСТАААОТАСАДОС 3' N4 5' ОСТТСТАСТТТАШтСШеСАТТСАТТСТСАССАСО 3' N4' 5' СОТСОТОАОААТСААТО(4шС)СОСТАААОТАСААОС 3'. Из электрофореграммы на рис. 6 видно, что эндонуклеаза В1э1 гидролизует дуплекс, содержащий метилированную последовательность 5'-С(5тС)ЫСС-3' (дорожка 2), но не 5'-0(4тС)ЫСС-3' (дорожка 4). Таким образом, фермент В1з1 является 5шС-зависимой эндонуклеазой.

Рис. 6. Расщепление метилированного сайта узнавания, содержащего С5- и Ш-метилцитозиновые основания, эндонуклеазой В1э1. [32Р]-меченные олигонуклеотиды отмечены знаком "*". Дорожки: 1-2 -дуплекс С5*/С5' с сайтом 5'-С(5шС)ОСС-3', соответственно: интактный, обработанный эндонуклеазой В1з1; 3-4 - дуплекс Н4*/Н4' с сайтом 5'-0(4шС)ССС-3', соответственно: интактный, обработанный эндонуклеазой В1з1.

7. Определение места гидролиза ДНК эндонуклеазой BisI

Позиции гидролиза ДНК в сайте узнавания были установлены с помощью определения длин фрагментов, образующихся при расщеплении синтетического олигонуклеотидного дуплекса L9/L10, содержащего метилированную нуклеотидную последовательность 5'-G(5mC)NGC-3', ферментом BisI. На рис. 7 приведены результаты гидролиза [32Р]-меченных олигонуклеотидных дуплексов L7*/L8 и L9*/L10 эндонуклеазами BisI и Fsp4HI. Дуплексы имеют одинаковую первичную структуру и отличаются только метилированием цитозинового основания в сайте 5'-G(5mC)NGC-3' в обеих цепях дуплекса L9/L10. В качестве маркера молекулярного веса использовали продукты частичного гидролиза тех же дуплексов экзонуклеазой III из E.coli.

Сравнение длин фрагментов, образующихся при гидролизе этих субстратов специфическими эндонуклеазами, указывает на то, что BisI расщепляет меченую цепь метилированного дуплекса так же, как Fsp4HI расщепляет меченую цепь неметилированного дуплекса. Для проверки позиции расщепления второй цепи был

Рис. 7. Определение позиции гидролиза ДНК эндонуклеазой Bisl. [J~P]-Me4eHHbie

олигонуклеотиды отмечены "*". ЕхоШ экзонуклеаза III Е. coli. Дорожки: 1-4 - дуплекс L7*/L8 с сайтом 5'-GCGGC-3', соответственно: интактный, обработанный эндонуклеазой Bisl, обработанный ЕхоШ, обработанный ЭР Fsp4HI; 58 - метилированный дуплекс L9*/L10 с сайтом 5'-G(5mC)GGC-3', соответственно: обработанный эндонуклеазой Bisl, обработанный ЕхоШ, обработанный ЭР Fsp4HI, интактный.

проведен аналогичный эксперимент с использованием тех же дуплексов, но радиоактивная метка была включена в другую цепь (L8*/L7 и L10*/L9). Длины фрагментов, образующихся при гидролизе ДНК ферментами Bisl и Fsp4HI, также совпали. Таким образом, Bisl гидролизует ДНК в сайте узнавания как показано стрелками:

5 ' - G (5mC) iN G С - 3 1 3' - С G NT (5mC) G - 5'.

8. Определение канонического варианта метилирования сайта узнавания МД-эндонуклеазы Bisl

Чтобы оценить влияние «рисунка» метилирования сайта узнавания на возможность гидролиза ДНК эндонуклеазой Bisl, были проведены эксперименты по расщеплению ДНК, содержащей последовательность 5'-GCNGC-3' с различным количеством и расположением 5-метилцитозиновых оснований. Существуют девять различных вариантов метилирования последовательности 5'-GCNGC-3'. Три из них обладают палиндромной симметрией, при которой расположение метилированных оснований в верхней цепи соответствует таковому в нижней цепи. Еще три варианта представлены полуметилированными сайтами, в которых 5-метилцитозиновые основания присутствуют только в одной из цепей узнаваемой последовательности. В остальных случаях модифицированные основания представлены в обеих цепях, но их расположение различается (непалиндромное метилирование).

В качестве субстрата были использованы синтетические олигонуклеотидные дуплексы, содержащие последовательность 5'-GCNGC-3' с различным количеством и

1 2 3 4 5 6 7 8

щцт

распределением метилированных цитозиновых оснований. Выбор олигонуклеотидного дуплекса в качестве субстрата обусловлен сложностью получения плазмидной, фаговой или иной природной ДНК, содержащей нужную последовательность с необходимыми вариантами метилирования. Использованные в эксперименте олигонуклеотидные субстраты имеют одинаковую первичную структуру, разница заключается лишь в метилировании сайта 5'-GCNGC-3':

1 5' GCTTGTACTTTAG(5mC)GGCATTGATTCTCACCACG 3'

1 с 5' CGTGGTGAGAATCAATG(5mC)CGCTAAAGTACAAGC 3'

2 5' GCTTGTACTTTAGCGG(5mC)ATTGATTCTCACCACG 3'

2с 5' CGTGGTGAGAATCAATGCCG(5mC)TAAAGTACAAGC 3'

3 5'GCTTGTACTTTAG(5mOGG(5mC)ATTGATTCTCACCACG 3'

3с 5' CGTGGTGAGAATCAATG(5mOCG(5mC)TAAAGTACAAGC 3'

4 5'GCTTGTACTTTAGCGGCATTGATTCTCACCACG 3'

4c 5' CGTGGTGAGAATCAATGCCGCTAAAGTACAAGC 3'.

Из электрофореграмм, представленных на рис. 8, видно, что гидролизу подвергаются дуплексы, содержащие сайт узнавания с любым из описанных выше вариантов метилирования, при этом позиция расщепления ДНК эндонуклеазой BisI остается неизменной. Устойчивым к действию BisI оказался лишь ДНК-дуплекс 4/4с, содержащий немодифицированную последовательность 5'-GCNGC-3'. Это означает, что метилзависимая сайт-специфическая эндонуклеаза BisI расщепляет обе цепи узнаваемой последовательности 5'-GC|NGC-373'-CGN|CG-5', содержащей от одного до четырех 5-метилцитозиновых оснований в любых позициях. Таким образом, необходимым и достаточным условием для гидролиза ДНК эндонуклеазой BisI является присутствие как минимум одного 5-метилцитозинового основания в любой позиции узнаваемой последовательности.

Из электрофореграмм, представленных на рис. 8, видно, что при расщеплении эндонуклеазой BisI сайта узнавания с различными вариантами метилирования степень гидролиза ДНК варьирует в широких пределах. Очевидно, что фермент расщепляет метилированный сайт узнавания 5'-GCNGC-3' с различной эффективностью в зависимости от варианта метилирования. Для выявления оптимального субстрата определяли временную зависимость доли расщепленных цепей ДНК-дуплексов с девятью возможными вариантами метилирования.

Полученные результаты представлены на рис. 9 и 10. Из рисунков видно, что наиболее эффективно расщепляется сайт узнавания, в котором метилированы

\

и о 0—000^.00

2 С С! 3 ~

Рис. 8. Расщепление эндонуклеазой В1б1 олигонуклеотидных дуплексов, содержащих последовательность 5'-ОСКОС-3' с различными вариантами метилирования. А -расщепление олигонуклеотидных дуплексов, в которых последовательность 5'-ССКОС-3' содержит не более одного 5-метилцитозина в каждой цепи (умеренное метилирование сайта узнавания). Б - расщепление олигонуклеотидных дуплексов, содержащих последовательность 5'-ССЫОС-3', хотя бы в одной из цепей которой метилированы оба цитозина (избыточное метилирование сайта узнавания). [^Р]-меченные олигонуклеотиды отмечены "*". Минус (-) обозначает, что в реакционную смесь не добавляли эндонуклеазу.

внутренние цитозиновые основания (5'-0(5тС)Ы0С-373'-ССЫ(5шС)0-5'). Это палиндромный вариант метилирования, и гидролиз обеих цепей происходит с одинаковыми скоростями (данные не приводятся). При непалиндромном расположением двух 5-метилцитозинов (5'-0(5тС)Ы0С-373'-(5тС)01ЧСС-5') узнаваемая последовательность расщепляется медленнее. Еще менее эффективно гидролизуется полуметилированный сайт узнавания, в котором внутреннее цитозиновое основание метилировано только в одной из цепей (5'-0(5тС)ШС-373'-С0МС0-5') (рис. 9). При расщеплении избыточно метилированных дуплексов (то есть содержащих хотя бы в одной из цепей узнаваемой последовательности два метилцитозиновых основания) также наблюдается снижение эффективности гидролиза ДНК эндонуклеазой В1з1 по сравнению с субстратом, содержащим метилированную последовательность

о

О 10 20 30 40

Время, мин

Рис. 9. Временная зависимость доли ВЫ-расщепленных дуплексов с умеренным метилированием. -•- 1*/1с, --■-- 1*/2с, -А-2с*/1, -■- 1*/4с, -▲- 4с*/1, 2*/2с, -□- 2*/4с, --4с*/2.

0 10 20 30 40

Время, мин.

Рис. 10. Временная зависимость доли В1з1-расщепленных дуплексов с избыточным метилированием. -♦- 1*/1с, -•- 1*/Зс, -А- 3*/1с, -■- 3*/3с, - -- 3*/4с, -о-- 4с*/3, - - 3*/2с, -о- 2с*/3.

5'-G(5mC)NGC-373'-CGN(5mC)G-5', причем сайт узнавания, в котором метилированы оба внутренних и один наружный цитозин расщепляется эффективнее, чем тот, в котором метилированы два наружных и один внутренний цитозин, а также чем полуметилированный сайт 5'-G(5mC)NG(5mC)-373'-CGNCG-5' (рис. 10). Наименьшая эффективность гидролиза ДНК эндонуклеазой BisI наблюдается при расщеплении узнаваемой последовательности, в которой модифицированные основания занимают только наружное положение (5'-GCNG(5mC)-373'-(5mC)GNCG-5' и 5'-GCNG(5mC)-373'-CGNCG-5') (рис. 9). Таким образом, каноническим будем считать вариант метилирования, при котором модифицированы два внутренних цитозиновых основания в сайте узнавания BisI, поскольку он обеспечивает наибольшую скорость расщепления ДНК-субстрата.

Интересно, что при расщеплении эндонуклеазой BisI субстрата, содержащего сайт узнавания BisI с четырьмя 5-метилцитозиновыми основаниями, после быстрого образования некоторого количества продукта реакции его дальнейшего накопления с течением времени не происходит (рис. 10). Это свойство МД-эндонуклеазы BisI требует дополнительного изучения, однако можно предположить, что при взаимодействии эндонуклеазы с таким субстратом происходит инактивация фермента в результате образования прочного комплекса с продуктом реакции.

9. Возможность практического использования МД-эндонуклеазы BisI в молекулярно-биологических исследованиях

Одной из особенностей эндонуклеазы BisI является способность расщеплять полуметилированный сайт узнавания, в котором модифицирована только одна цепь, не разрушая при этом ДНК, не содержащую 5-метилцитозиновых оснований. Благодаря этому свойству, помимо потенциальной возможности использовать 5шС-зависимую сайт-специфическую эндонуклеазу BisI в эпигенетических исследованиях, представляется возможным применять этот фермент для расщепления двуцепочечных молекул ДНК в произвольно выбранном сайте с последовательностью нуклеотидов 5'-GCNGC-3' внутри. Это достигается благодаря формированию уникального полуметилированного сайта узнавания эндонуклеазы BisI на молекуле ДНК, в которой последовательности 5'-GCNGC-3' не содержат 5-метилцитозиновых оснований, путем присоединения к двуцепочечной молекуле ДНК олигонуклеотида, комплементарного сайту-мишени и содержащего метилированную последовательность 5'-G(5mC)NGC-3'. В этом случае специфичность гидролиза обеспечивается специфичностью гибридизации, а также отмеченными выше

свойствами эндонуклеазы. Согласно предлагаемой схеме осуществили гидролиз заданной последовательности 5'-GCNGC-3' на двуцепочечной ДНК плазмиды pUC19. ДНК плазмиды содержит 19 сайтов 5'-GCNGC-3'. Для расщепления выбрали сайт 5'-GCTGC-3', расположенный в районе 254-258 п.н. Для присоединения к двуцепочечной ДНК использовали комплементарные разным цепям сайта-мишени олигонуклеотиды с метилированными сайтами 5'-G(5mC)NGC-3' (подчеркнуты): pl: 5' CATTCAGG(5mC)TGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCG 3' р2: 5' CAGTTGCG(5mC)AGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATG 3'.

Рис. 11. Расщепление эндонуклеазой BisI ДНК плазмиды pUC19, линеаризованной ЭР Dril, по сайту 5'-GCNGC-3' в районе 254-258 п.н. Дорожки: 2 — линеаризованная ДНК pUC19; 3 — линеаризованная ДНК pUC19, обработанная эндонуклеазой BisI; 4 — линеаризованная ДНК pUC19 с присоединенными метилированными олигонуклеотидами; 5 -линеаризованная ДНК pUC19 с присоединенными метилированными олигонуклеотидами, обработанная эндонуклеазой BisI; 1 и 6 - маркер молекулярного веса 1 КЬ со следующими длинами фрагментов ДНК (т.п.н.): 10; 8; 6; 5; 4; 3x2; 2,5; 2; 1,5; 1x3; 0,75; 0,5x2; 0,25.

Для комплементарного присоединения олигонуклеотидов ДНК плазмиды, линеаризованной эндонуклеазой рестрикции Dril (сайт узнавания GACNNNJ.NNGTC), инкубировали совместно со 100-кратным избытком олигонуклеотидов при 95°С в течение 5 мин, после чего помещали в лед.

На рис. 11 представлена электрофореграмма продуктов расщепления ДНК плазмиды pUC19 с присоединенными олигонуклеотидами и без них эндонуклеазой BisI. Видно, что ДНК расщепляется ферментом BisI только после комплементарного присоединения к ней метилированных олигонуклеотидов. При этом образуются два фрагмента ДНК, длины которых соответствуют ожидаемым при расщеплении ДНК плазмиды в районе 254-258 п.н. (1242 п.н. и 1444 п.н.). Таким образом, показана возможность применения на практике предложенного способа сайт-специфического расщепления ДНК.

выводы

1. Проведено клонирование генов РМ системы Fsp4HI из Flavobacterium species 4Н и получена плазмида pFsp4HIl, в которой все последовательности 5'-GCNGC-3' метилированы с образованием сайтов 5'-G(5mC)NGC-373'-CGN(5mC)G-5'.

2. В результате скрининга бактерий из различных природных изолятов на наличие ферментов, расщепляющих ДНК плазмиды pFsp4HIl, выявлен штамм Bacillus subtilis ТЗО - продуцент 5шС-зависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазы BisI, узнающей и расщепляющей последовательность 5'-G(5mC)NGC-373'-CGN(5mC)G-5' и не расщепляющей неметилированную ДНК.

3. Определены культурально-морфологические и физиолого-биохимические характеристики штамма-продуцента 5тС-зависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазы. Установлены оптимальная температура (30°С) и pH среды (7,0-7,2) для культивирования бактериальных клеток.

4. Предложен метод аффинной очистки эндонуклеазы BisI на ДНК-сорбенте, содержащем иммобилизованные олигонуклеотиды. С помощью последовательных хроматографических стадий очистки получен препарат ДНК-эндонуклеазы BisI с активностью 500 ед/мл, свободный от примесей нуклеаз и фосфатаз. Определены оптимальные условия гидролиза ДНК ферментом BisI: температура 37°С; pH 9,0; концентрация моновалентных ионов (KCl) 150 мМ.

5. Установлено, что BisI расщепляет последовательность ДНК 5'-G(5mC)J.NGC-373'-CGNt(5mC)G-5' в строго фиксированной позиции, как показано стрелкой.

6. Показано, что фермент BisI способен расщеплять различные варианты метилированной последовательности 5'-GCNGC-373'-CGNCG-5', в которой меняется как количество, так и положение 5-метилцитозинов. Наиболее эффективно расщепляется последовательность 5'-G(5mC)NGC-373'-CGN(5mC)G-5', которая является каноническим сайтом узнавания BisI.

7. На основании способности BisI расщеплять полуметилированный сайт узнавания 5'-G(5mC)NGC-373'-CGNCG-5' предложена схема использования эндонуклеазы BisI для сайт-специфического расщепления протяженных неметилированных молекул ДНК, и экспериментально показана применимость данной схемы на практике.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Чмуж Е.В.. Каширина Ю.Г., Томилова Ю.Э., Чернухин В А., Охапкина С.С., Гончар ДА., Дедков B.C., Абдурашитов М.А., Дегтярев С.Х. 2007. Клонирование генов, сравнительный анализ структуры белков системы рестрикции-модификации Fsp4HI и биохимическая характеристика рекомбинантной ДНК-метилтрансферазы M.Fsp4HI. Молекулярная биология, т. 41, № 1, с. 43-50.

2. Дегтярев С.Х., Чмуж Е.В.. Абдурашитов М.А., Каширина Ю.Г., Дедков B.C., Томилова Ю.Э., Мезенцева Н.В., Гончар Д.А. Штамм бактерий Bacillus subtilis - продуцент эндонуклеазы рестрикции Bisl. Патент РФ №2270859 С1, опубл. 27.02.2006, Бюл. № 6.

3. Чмуж Е.В.. Каширина Ю.Г., Томилова Ю.Э., Мезенцева Н.В., Дедков B.C., Гончар Д.А., Абдурашитов М.А., Дегтярев С.Х. 2005. Новая эндонуклеаза рестрикции Bis I из Bacillus subtilis ТЗО узнаёт метилированную последовательность ДНК 5'-G(5mC)|NGC-3\ Биотехнология, № 3, с. 22-26.

ТЕЗИСЫ МАТЕРИАЛОВ КОНФЕРЕНЦИЙ

1. Чмуж Е.В., Каширина Ю.Г., Томилова Ю.Э., Мезенцева Н.В., Дедков B.C., Гончар Д.А., Абдурашитов М.А., Дегтярёв С.Х. 2005. Материачы 1-й Международной научно-практической конференции «Медбиотек-2005», Москва, с. 128-129.

2. Землянская Е.В., Дегтярев С.Х. 2012. Материалы научной конференции «Биология — наука XXI века», Москва, с. 292-294.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает благодарность сотрудникам ООО «СибЭнзайм» к.б.н. Гончару Д.А. за помощь в клонировании генов, к.б.н. Абдурашитову М.А. за помощь в компьютерном анализе аминокислотных и нуклеотидных последовательностей, к.б.н. Дедкову B.C. за помощь в проведении микробиологических исследований, к.б.н. Чернухину В.А. за помощь в экспериментальной работе и ценные замечания. Автор также благодарит Каширину Ю.Г. за помощь в выделении ферментов, Томилову Ю.Э. и Болтенгаген A.A. за помощь в экспериментальной работе.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Система РМ

МД-эндонуклеаза -

ЭР

метилзависимая сайт-специфическая ДНК-эндонуклеаза эндонуклеаза рестрикции система рестрикции-модификации

4шС

5шС

С5-метилцитозин Ы4-мстилцитозин

Трис АТФ

т.п.н.

нт.

п.н.

SAM

нуклеотид

пары нуклеотидов

тысяча пар нуклеотидов

8-аденозил-Ь-метионин

трис-(гидроксиметил)аминометан

аденозинтрифосфат

ОРТ

открытая рамка трансляции

Подписано в печать 07.11.2012 г. Печать цифровая. Бумага офсетная. Формат 60x84/16. 1 печатный лист Тираж 100 экз. Заказ № 119.

Отпечатано в типографии «Срочная полиграфия» ИП Малыгин Алексей Михайлович 630090, Новосибирск, пр-т Академика Лаврентьева, 6/1, оф. 104 Тел. (383) 217-43-46, 8-913-922-19-07

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Землянская, Елена Васильевна

Список сокращений.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. СУБСТРАТНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ И СВОЙСТВА МЕТИЛЗАВИСИМЫХ САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКИХ ДНК-ЭНДОНУКЛЕАЗ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

2.1. РАЗНООБРАЗИЕ И РАСПРОСТРАНЕНИЕ МД-ЭНДОНУКЛЕАЗ.

2.2. СУБСТРАТНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ МД-ЭНДОНУКЛЕАЗ.

2.2.1. Классификация по характеру сайта узнавания и позиции расщепления ДНК.

2.2.2. Типы узнаваемых модификаций ДНК.

2.2.3. Узнаваемая последовательность нуклеотидов.

2.2.4. «Рисунок» мет ил ирован ия ДНК-субстрата.

2.3. СВОЙСТВА МД-ЭНДОНУКЛЕАЗ.

2.3.1. Зависимость активности от ионов двухвалентных металлов.

2.3.2. Зависимость активности от НТФ.

2.3.3. Зависимость активности от количества сайтов узнавания.

2.3.4. Эндонуклеазная активность in vitro.

2.4. РОЛЬ МД-ЭНДОНУКЛЕАЗ В БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ.

2.5. ПРИМЕНЕНИЕ МД-ЭНДОНУКЛЕАЗ.

2.5.1. МД-эндонуклеазы в эпигенетических исследованиях.

2.5.2. МД-эндонуклеазы в биотехнологии и молекулярно-биологических исследованиях.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Обнаружение новой 5mC-зависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазы BisI и установление её субстратной специфичности"

Сайт-специфические ДНК-эндонуклеазы - это ферменты, которые расщепляют молекулу ДНК, делая ограниченное количество разрывов в результате узнавания специфической нуклеотидной последовательности. К ним относятся широко распространенные среди прокариотических организмов эндонуклеазы рестрикции (ЭР), а также хоминг-эндонуклеазы, транспозазы и некоторые репарационные эндонуклеазы, устраняющие неспаренные основания у прокариот. Среди большого разнообразия известных в настоящее время сайт-специфических ДНК-эндонуклеаз метилзависимые ферменты, способные специфически узнавать и расщеплять только метилированную ДНК, составляют немногочисленную группу. Некоторые авторы относят их к эндонуклеазам рестрикции - огромному семейству сайт-специфических ДНК-эндонуклеаз, которые расщепляют чужеродную ДНК при ее проникновении в бактериальную клетку [Roberts et aL, 2003]. Тем не менее, метилзависимые ферменты отличаются по своим свойствам (и, вероятно, функциям) от классических эндонуклеаз рестрикции, и далее мы будем рассматривать их как самостоятельную группу ферментов.

Среди метилзависимых ДНК-эндонуклеаз различают Ыб-метиладенин-и 5-метилцитозинзависимые ферменты. Первым был описан более 30 лет назад фермент Dpnl, который узнает тетрануклеотидную палиндромную последовательность G(6mA)jTC и расщепляет ее, как указано стрелкой [Lacks and Greenberg, 1975]. Абсолютно все обнаруженные до сих пор N6-метиладенинзависимые ДНК-эндонуклеазы имеют ту же специфичность, то есть Dpnl является прототипом этих ферментов. 5-метилцитозинзависимые ДНК-эндонуклеазы были охарактеризованы позднее, и наиболее известной среди них является эндонуклеаза МсгВС, которая была описана еще в 80-х годах прошлого столетия [Raleigh and Wilson, 1986]. Этот фермент узнает пару сайтов R(mC), разделенных неспецифическим участком длиной 30-3000 п.н., и вносит двуцепочечный разрыв на расстоянии 30-35 п.н. от одного из узнаваемых элементов [Raleigh, 1992; Sutherland et al., 1992; Stewart and

Raleigh, 1998; Panne et al., 1999]. В отличие от Dpnl и его аналогов позиция расщепления ДНК эндонуклеазой МсгВС неоднозначна, что приводит к образованию случайного набора продуктов реакции в результате ферментативного гидролиза субстрата.

Долгое время МсгВС являлся единственным изученным представителем 5-метилцитозинзависимых сайт-специфических ДНК-эндонуклеаз. Однако за последние 5-7 лет были обнаружены и охарактеризованы более десятка ферментов этого типа, узнающих различные метилированные последовательности ДНК. Прогресс в открытии и изучении 5-метилцитозинзависимых ДНК-эндонуклеаз во многом связан с бурным развитием эпигенетических исследований и возможностью использования этих ферментов для изучения статуса метилирования ДНК у высших организмов (в том числе у человека), у которых именно 5-метилцитозиновые основания являются эпигенетическим маркером. При этом наибольший интерес вызывают ферменты, способные узнавать определенную метилированную последовательность ДНК и однозначно расщеплять ее в фиксированной позиции. Учитывая ограниченное количество известных в настоящее время биохимически охарактеризованных представителей данной группы ферментов, обнаружение и изучение новых 5-метилцитозинзависимых сайт-специфических эндонуклеаз, способных однозначно гидролизовать ДНК, является актуальной задачей.

Целью данной работы явилось обнаружение и изучение свойств новой 5тС-зависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазы, способной узнавать и расщеплять метилированную последовательность ДНК 5 ' -GCNGC-3 '/3 '-CGNCG-5 '.

В задачи настоящего исследования входило:

1. Получение субстрата для 5шС-зависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазы путем клонирования гена ДНК-метилтрансферазы M.Fsp4HI из Flavobacterium species 4Н, узнающей и модифицирующей последовательность 5'-GCNGC-3', и определение положения 5-метилцитозина в метилированной последовательности.

2. Проведение скрининга бактерий из различных природных изолятов на наличие фермента, расщепляющего ДНК полученной плазмиды, и выявление продуцента 5шС-зависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазы, узнающей и гидролизующей только метилированную ДНК.

3. Характеризация штамма-продуцента 5шС-зависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазы, отработка методов его культивирования.

4. Очистка новой 5шС-зависимой сайт-специфической эндонуклеазы и определение оптимальных условий функционирования фермента.

5. Определение субстратной специфичности и места гидролиза ДНК эндонуклеазой.

6. Установление возможности практического использования новой 5шС-зависимой сайт-специфической эндонуклеазы в молекулярно-биологических исследованиях.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Землянская, Елена Васильевна

ВЫВОДЫ

1. Проведено клонирование генов РМ системы Fsp4HI из Flavobacterium species 4Н и получена плазмида pFsp4HIl, в которой все последовательности 5'-GCNGC-3' метилированы с образованием сайтов 5'-G(5mC)NGC-373'-CGN(5mC)G-5\

2. В результате скрининга бактерий из различных природных изолятов на наличие ферментов, расщепляющих ДНК плазмиды pFsp4HIl, выявлен штамм Bacillus subtilis ТЗО - продуцент 5тС-зависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазы BisI, узнающей и расщепляющей последовательность 5'-G(5mC)NGC-373'-CGN(5mC)G-5' и не расщепляющей неметилированную ДНК.

3. Определены культурально-морфологические и физиолого-биохимические характеристики штамма-продуцента 5тС-зависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазы. Установлены оптимальная температура (30°С) и pH среды (7,0-7,2) для культивирования бактериальных клеток.

4. Предложен метод аффинной очистки эндонуклеазы BisI на ДНК-сорбенте, содержащем иммобилизованные олигонуклеотиды. С помощью последовательных хроматографических стадий очистки получен препарат ДНК-эндонуклеазы BisI с активностью 500 ед/мл, свободный от примесей нуклеаз и фосфатаз. Определены оптимальные условия гидролиза ДНК ферментом BisI: температура 37°С; pH 9,0; концентрация моновалентных ионов (KCl) 150 мМ.

5. Установлено, что BisI расщепляет последовательность ДНК 5'-G(5mC)|NGC-373'-CGNT(5mC)G-5' в строго фиксированной позиции, как показано стрелками.

6. Показано, что фермент BisI способен расщеплять различные варианты метилированной последовательности 5'-GCNGC-373'-CGNCG-5', в которой меняется как количество, так и положение 5-метилцитозинов. Наиболее эффективно расщепляется последовательность 5'

G(5mC)NGC-373'-CGN(5mC)G-5', которая является каноническим сайтом узнавания Bisl.

7. На основании способности Bisl расщеплять полуметилированный сайт узнавания 5'-G(5mC)NGC-373'-CGNCG-5' предложена схема использования эндонуклеазы Bisl для сайт-специфического расщепления протяженных неметилированных молекул ДНК, и экспериментально показана применимость данной схемы на практике.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе была выявлена новая 5тС-зависимая сайт-специфическая ДНК-эндонуклеаза BisI из бактериального штамма Bacillus subtilis ТЗО, изучены ее субстратная специфичность и возможность использования в молекулярно-биологических экспериментах. МД-эндонуклеаза BisI гидролизует ДНК по последовательности 5'-G(5mC)J,NGC-S'/S'-CGNKSmQG-S' как указано стрелкой и не расщепляет неметилированную ДНК. Новый фермент является первой охарактеризованной 5тС-зависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазой, которая расщепляет ДНК в строго определенном положении относительно узнаваемой последовательности, что характерно для эндонуклеаз рестрикции второго типа. BisI и другие МД-эндонуклеазы, открытые впоследствии, являются новым и многообещающим инструментом для эпигенетических исследований.

Детальное изучение субстратной специфичности нового фермента показало, что для расщепления ДНК эндонуклеазой BisI достаточно присутствия хотя бы одного 5-метилцитозинового основания в любой позиции в одной из цепей в сайте узнавания 5'-GCNGC-373'CGNCG-5'. При этом максимальная скорость расщепления субстрата достигается лишь в случае палиндромного метилирования внутренних цитозиновых оснований в сайте узнавания (канонический субстрат).

Способность эндонуклеазы BisI расщеплять только модифицированную нуклеотидную последовательность независимо от количества и расположения метилированных оснований в сайте узнавания (несмотря на то, что эффективность гидролиза субстратов с различными узорами метилирования варьирует в широких пределах) интересна таюке в сравнении с субстратной специфичностью эндонуклеаз рестрикции, которая обычно определяется двумя параметрами: последовательностью нуклеотидов, узнаваемых ферментом, и позицией расщепления ДНК. В случае метилзависимых сайт-специфических эндонуклеаз, как, в частности, показано на примере фермента В1з1, появляется третий параметр -количество и расположение метилированных нуклеотидов в сайте узнавания.

В настоящей работе также показана возможность использования новой эндонуклеазы В1з1 в молекулярно-биологических исследованиях для олигонуклеотид-направленного гидролиза протяженных ДНК.

76

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Землянская, Елена Васильевна, Кольцово

1. Акишев А.Г., Гончар Д.А., Абдурашитов М.А., Дегтярев С.Х. 2011. Эпигенетическое типирование малигнантных клеточных линий человека с помощью Bis- и GlaI-ПЦР анализа. Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, 1, 5-16.

2. Белавин П.А., Дедков B.C., Дегтярев С.Х. 1988. Метод определения эндонуклеаз рестрикции в колониях бактерий. Прикл. Биохим. Микробиол., 24, 121-124.

3. Гончар Д.А., Акишев А.Г., Дегтярев С.Х. 2010. BisI- и GlaI-ПЦР анализ новый метод исследования метилированных участков ДНК. Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, 6, 5-12.

4. Дегтярев С.Х., Белавин П.А., Шишкина И.Г., Зарытова В.Ф., Гаврюченкова Л.П., Морозов С.М. 1989. Иммобилизованные олигонуклеотиды как аффинные сорбенты для эндонуклеаз рестрикции. Биоорган. Химия, 15, 358-362.

5. Дегтярев С.Х., Речкунова Н.И. 1988. Определение чистоты препаратов эндонуклеаз рестрикции. Изв. Сиб. Отд. Акакд. Наук СССР, 14, 102105.

6. Кирсанова О.В., Баскунов В.Б., Громова Е.С. 2004. Эндонуклеазы рестрикции типа IIE и IIF, взаимодействующие с двумя участками узнавания в ДНК. Молекулярная биология, 38, 886-900.

7. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984.

8. Определитель бактерий Берджи. Под ред. Хоулта Дж. и др.: 9-е издание в 2-х томах: Пер. с англ. под ред. акад. РАН Г.А. Заварзина. М., 1997.

9. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985.

10. Репин В.Е., Дегтярев С.Х. 1992. Сравнение экспресс-методов анализа микроорганизмов на наличие активности сайт-специфических эндонуклеаз рестрикции. Прикл. Бгюхгш. Микробиол., 28, 152-155.

11. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. Под ред. Н.С. Егорова. М., 1995.

12. Чернухин В.А., Килева Е.В., Томилова Ю.Э., Болтенгаген A.A., Дедков

13. Чернухин В.А. , Наякшина Т.Н., Абдурашитов М.А., Томилова Ю.Э., Мезенцева Н.В., Дедков B.C., Михненкова H.A., Гончар Д.А., Дегтярев

14. C.Х. 2006. Новая эндонуклеаза рестрикции Glal узнаетметилированную последовательность 5'-G(5mC)AGC-3\1. Биотехнология, 4, 31-35.

15. Чернухин В.А., Наякшина Т.Н., Тарасова Г.В., Голикова JI.H., Акишев

16. A.Г., Дедков B.C., Михненкова H.A., Дегтярев С.Х. 2009. Штамм бактерии Paracoccus carotinifaciens ЗК продуцент сайт-специфической эндонуклеазы Pes I. Патент РФ №2377294 Cl.

17. Чернухин В.А., Томилова Ю.Э., Чмуж Е.В., Соколова О.О., Дедков

18. B.C., Дегтярев С.Х. 2007а. Сайт-специфическая эндонуклеаза Blsl узнает последовательность ДНК 5'-G(5mC)NAGC-3' и расщепляет ее с образованием 3'-выступающих концов. Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имениЮ. А. Овчинникова, 3, 28-33.

19. Янулайтис A.A., Марцинкявичене Л.Ю., Пятрушите М.П. 1982. Специфическая эндонуклеаза из Caulobacter fusiformis, расщепляющая только метилированную ДНК. Докл. Акад. наук СССР, 262, 241-244.

20. Abdurashitov М.А., Chernukhin V.A., Gonchar D.A., Degtyarev S.Kh. 2009. Glal digestion of mouse y-satellite DNA: study of primary structure and ACGT sites methylation. BMC Genomics, 10, 322.

21. Aertsen A., Faster D., Michiels C.W. 2005. Induction of Shiga toxin-converting prophage in Escherichia coli by high hydrostatic pressure. Appl. Environ. Microbiol., 71, 1155-1162.

22. Aertsen A., Michiels C.W. 2005a. SulA-dependent hypersensitivity to high pressure and hyperfilamentation after high-pressure treatment of Escherichia coli Ion mutants. Res. Microbiol., 156, 233-237.

23. Aertsen A., Michiels C.W. 2005b. Mrr instigates the SOS response after high-pressure stress in Escherichia coli. Mol. Microbiol., 58, 1381-1391.

24. Aertsen A., Tesfazgi Mebrhatu M., Michiels C.W. 2008. Activation of the Salmonella typhimurium Mrr protein. Biochem. Biophys. Res. Commun., 367, 435-439.

25. Aertsen A., Van Houdt R., Vanoirbeek K., Michiels C.W. 2004. An SOS response induced by high pressure in Escherichia coli. J. Bacteriol., 186, 6133-6141.

26. Avner P., Heard E. 2001. X-chromosome inactivation: counting, choice and initiation. Nature Rev. Genet., 2, 59-67.

27. Bair C.L., Black L.W. 2007a. Exclusion of glucosyl-hydroxymethylcytosine DNA containing bacteriophages. J. Mol. Biol., 366, 779-789.

28. Bair C.L., Black L.W. 2007b. A type IV modification dependent restriction nuclease that targets glucosylated hydroxymethyl cytosine modified DNAs. J. Mol. Biol., 366, 768-778.

29. Bair C.L., Rifat D., Black L.W. 2007. Exclusion of glucosyl-hydroxymethylcytosine DNA containing bacteriophages is overcome by the injected protein inhibitor IPI*. J. Mol. Biol., 366, 779-789.

30. Bao Y., Higgins L., Zhang P., Chan S.H., Läget S., Sweeney S., Lunnen K., Xu S.Y. 2008. Expression and purification of Bmrl restriction endonuclease and its N-terminal cleavage domain variants. Protein Expr. Purif., 58, 42-52.

31. Bernhelmer H.P. 1979. Lysogenic pneumococci and their bacteriophages. J. Bacteriol., 138, 618-624.

32. Bickle T.A., Kruger D.H. 1993. Biology of DNA restriction. Microbiol. Rev., 57, 434-450.

33. Bird A. 2002. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev., 16, 6-21.

34. Bujnicki J.M. 2001. Understanding the evolution of restriction-modification systems: Clues from sequence and structure comparisons. Acta Biochim. Pol., 48, 935-967.

35. Bujnicki J.M., Radlinska M., Rychlewski L. 2000. Atomic model of the 5-methylcytosine-specific restriction enzyme McrA reveals an atypical zinc finger and structural similarity to PPaMe endonucleases. Mol. Microbiol., 37, 1280-1281.

36. Bujnicki J.M., Rychlewski L. 2001. Identification of a PD-(D/E)XK-like domain with a novel configuration of the endonuclease active site in the methyl-directed restriction enzyme Mrr and its homologs. Gene, 267, 183191.

37. Cantalupo G., Bucci C., Salvatore P., Pagliarulo C., Roberti V., Lavitola A., Bruni C.B., Alifano P. 2001. Evolution and function of the neisserial dam-replacing gene. FEBS Letters, 495, 178-183.

38. Casadesus J., Low D. 2006. Epigenetic gene regulation in the bacterial world. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 70, 830-856.

39. Chambers S.P., Prior S.E., Barstow D.A., Minton N.P. 1988. The pMTLwc cloning vectors. I. Improved pUC polylinker regions to facilitate the use of sonicated DNA for nucleotide sequencing. Gene, 68, 139-149.

40. Collier J. 2009. Epigenetic regulation of the bacterial cell cycle. Chit. Opin. Microbiol., 12, 722-729.

41. Cowan J.A. 1998. Metal activation of enzymes in nucleic acid biochemistry. Chem. Rev., 98, 1067-1088.

42. Crampton N., Roes S., Dryden D.T.F., Rao D.N., Edwardson J.M., Henderson R.M. 2007. DNA looping and translocaton provide an optimal cleavage mechanism for the type III restriction enzymes. EMBO J., 26, 3815-3825.

43. Dila D., Sutherland E., Moran L., Slatko B., Raleigh E.A. 1990. Genetic and sequence organization of the mcrBC locus of Escherichia coli K-12. J. Bacteriol., 172, 4888-4900.

44. Dryden D.T., Murray N.E., Rao D.N. 2001. Nucleoside triphosphate-dependent restriction enzymes. Nucleic Acids Res., 29, 3728-3741.

45. Dunn D.B., Smith J.D. 1955. Occurrence of a new base in the deoxyribonucleic acid of a strain of Bacterium coli. Nature, 175, 336-337.

46. Ellis D.J., Dryden D.T., Berge T., Edwardson J.M., Henderson R.M. 1999. Direct observation of DNA translocation and cleavage by the EcoKI endonuclease using atomic force microscopy. Nat. Struct. Biol., 6, 15-17.

47. Fukasawa T. 1964. The course of infection with abnormal bacteriophage T4 containing non-glucosylated DNA on Escherichia coli strains. J. Mol. Biol., 9, 525-536.

48. Fukuda E., Kaminska K.H., Bujnicki J.M., Kobayashi I. 2008. Cell death upon epigenetic genome methylation: a novel function of methyl-specific deoxyribonucleases. Genome Biol, 9, R163.

49. Furuta Y., Abe K., Kobayashi I. 2010. Genome comparison and context analysis reveals putative mobile forms of restriction-modification systems and related rearrangements. Nucleic Acids Res., 38, 2428-2443.

50. Gallagher L.A., McKevitt M., Ramage E.R., Manoil C. 2008. Genetic dissection of the Francisella novicida restriction barrier. J. Bacteriol., 190, 7830-7837.

51. Gast F.U., Brinkmann T., Pieper U., Kruger T., Noyer-Weidner M., Pingoud A. 1997. The recognition of methylated DNA by the GTP-dependentrestriction endonuclease McrBC resides in the N-terminal domain of McrB. Biol. Chem., 378, 975-982.

52. Heitman J., Model P. 1987. Site-specific methylases induce the SOS DNA repair response in Escherichia coli. J. Bacteriol., 169, 3243-3250.

53. Hotchkiss R.D. 1948. The quantitative separation of purines, pyrimidines, and nucleosides by paper chromatography. J. Biol. Chem., 168, 315-332.

54. Ishikawa K., Fukuda E., Kobayashi I. 2010. Conflicts targeting epigenetic systems and their resolution by cell death: novel concepts for methyl-specific and other restriction systems. DNA Res., 17, 325-342.

55. Janscak P., MacWilliams M.P., Sandmeier U., Nagaraja V., Bickle T.A. 1999. DNA translocation blockage, a general mechanism of cleavage site selection by type I restriction enzymes. EMBOJ., 18, 2638-2647.

56. Janulaitis A., Klimasauskas S., Petrusyte M., Butkus V. 1983. Cytosine modification in DNA by Bcnl methylase yields N4-methylcytosine. FEBS Lett., 161, 131-134.

57. Kelleher J.E., Raleigh E.A. 1991. A novel activity in Escherichia coli K-12 that directs restriction of DNA modified of CG dinucleotides. J. Bacteriol., 173, 5220-5223.

58. Klimasauskas S., Nelson J.L., Roberts R.J. 1991. The sequence specificity domain of cytosine-C5 methylases. Nucleic Acids Res., 19, 6183-6190.

59. Kobayashi I. 2001. Behavior of restriction-modification systems as selfish mobile elements and their impact on genome evolution. Nucleic Acids Res., 29, 3742-3756.

60. Kosinski J., Feder M., Bujnicki J.M. 2005. The PD-(D/E)XK superfamily revisited: identification of new members among proteins involved in DNAmetabolism and functional predictions for domains of (hitherto) unknown function. BMC Bioinfonnatics, 6, 172.

61. Kruger T., Wild C., Noyer-Weidner M. 1995. McrB: a procariotic protein specifically recognizing DNA containing modified cytosine residues. EMBO J., 14, 2661-2669.

62. Lacks S., Greenberg BJ. 1975. A deoxyribonuclease of Diplococcus pneumoniae specific for methylated DNA. Biol. Chem., 250, 4060-4066.

63. Lagunavicius A., Sasnauskas G., Halford S.E., Siksnys V. 2003. The metal-independent type lis restriction enzyme Bfil is a dimer that binds two DNA sites but has only one catalytic centre. J. Mol. Biol., 326, 1051-1064.

64. Lehman I.R., Pratt E.A. 1960. On the structure of the glucosylated hydroxymethylcytosine nucleotides of coliphages T2, T4 and T6. J. Biol. Chem., 235, 3254-3259.

65. Liu G., Ou H.-Y., Wang T., Li L., Tan H., Zhou X., Rajakumar K., Deng Z., He X. 2010. Cleavage of phosphorilated DNA and methylated DNA by Type IV restriction endonuclease ScoMcrA. Plos Genetics, 6, 1-13.

66. Lu L., Patel H., Bissler J.J. 2002. Optimizing Dpnl digestion conditions to detect replicated DNA. Biotechniques, 33, 316-318.

67. Madden T.L., Tatusov R.L., Zhang J. 1996. Applications of network BLAST server. Methods Enzymol., 266, 131-141.

68. Marinus M.G., Casadesus J. 2009. Roles of DNA adenine methylation in host-pathogen interactions: mismatch repair, transcriptional regulation, and more. FEMSMicrobiol Rev., 33, 488-503.

69. Methytransferases: Quality controls. In: New England BioLabs Catalogue. 2006. New England Biolabs, Inc. 32 Tozer Road Beverly, MA 01915-5599, USA.

70. Morison I.M., Reeve A.E. 1998. A catalogue of imprinted genes and parent-of-origin effects in humans and animals. Hum. Mol. Genet., 7, 1599-1609.

71. Muckerman C.C., Springhorn S.S., Greenberg B., Lacks S.A. 1982. Transformation of restriction endonuclease phenotype in Streptococcus pneumoniae. J. Bacteriol., 152, 183-190.

72. Mulligan E.A., Hatchwell E., McCorkle S.R., Dunn JJ. 2010. Differential binding of Escherichia coli McrA protein to DNA sequences that contain the dinucleotide m5CpG. Nucleic Acids Res., 38, 1997-2005.

73. Neuwald A.F., Aravind L., Spouge J.L., Koonin E.V. 1999. AAA+: A class of chaperone-like ATPases associated with the assembly, operation, and disassembly of protein complexes. Genome Res., 9, 2743.

74. Norris D.P., Brockdorff N., Rastan S. 1991. Methylation status of CpG-rich islands on active and inactive mouse X chromosomes. Mamm. Genome, 1, 78-83.

75. Oakes C.C., La Salle S., Robaire B., Trasler J.M. 2006. Evaluation of a quantitative DNA methylation analysis technique using methylation-sensitive/dependent restriction enzymes and real-time PCR. Epigenetics, 1, 146-152.

76. Oakes C.C., La Salle S., Trasler J.M., Robaire B. 2009. Restriction digestion and real-time PCR. Methods Mol. Biol., 507, 271-280.

77. Ohara-Nemoto Y., Tajika S., Sasaki M., Kaneko M. 1997. Identification of Abiotrophia adiacens and Abiotrophia defective by 16S rRNA gene PCR and restriction fragment length polymorphism analysis. J. Clin. Microbiol., 35, 2458-2463.

78. Orlowski J., Mebrhatu M.T., Michiels C.W., Bujnicki J.M., Aertsen A. 2008. Mutational analysis and a structural model of methyl-directed restriction enzyme Mrr. Biochem. Biophys. Res. Commun., 377, 862-866.

79. Panne D, Muller S.A., Wirtz S., Engel A., Bickle T.A. 2001. The McrBC restriction endonuclease assembles into a ring structure in the presence of G nucleotides. EMBOJ., 20, 3210-3217.

80. Panne D., Raleigh E.A., Bickle T.A. 1999. The McrBC endonuclease translocates DNA in a reaction dependent on GTP hydrolysis. J. Mol. Biol., 290, 49-60.

81. Pearson W.R., Lipman D.J. 1988. Improved tools for biological sequence comparison. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85, 2444-2448.

82. Pieper U., Brinkmann T., Kruger T.,Noyer-Weidner M., Pingoud A. 1997. Characterization of the interaction between the restriction endonuclease McrBC from E.coli and its cofactor GTP. J. Mol. Biol., 272, 190-199.

83. Pieper U., Pingoud A. 2002. A mutational analysis of the PD.(D/E)XK motif suggests that McrC harbors the catalytic center for DNA cleavage by the GTP-dependent restriction enzyme McrBC from Escherichia coli. Biochemistry, 41, 5236-5244.

84. Pieper U., Schweitzer T., Groll D.H., Gast F.-U., Pingoud A. 1999a. The GTP-binding domain of McrB: More than just a variation on common theme? J. Mol. Biol., 292, 547-556.

85. Pieper U., Schweitzer T., Groll D.H., Pingoud A. 1999b. Defining the location and function of domains of McrB by deletion mutagenesis. Biol. Chem., 380, 1225-1230.

86. Pingoud A., Fuxreiter M., Pingoud V., Wende W. 2005. Type II restriction endonucleases: structure and mechanism. Cell. Mol. Life Sei., 62, 685-707.

87. Pingoud A., Jeltsch A. 2001. Structure and function of type II restriction endonucleases. Nucleic Acids Res., 29, 3705-3727.

88. Ponting C.P., Kerr I.D. 1996. A novel family of phospholipase D homologues that includes phospholipid synthases and putative endonucleases: identification of duplicated repeats and potential active site residues. Protein Sei., 5, 914-922.

89. Posfai J., Bhagwat A.S., Posfai G., Roberts R.J. 1989. Predictive motifs derived from cytosine methyltransferases. Nucleic Acids Res., 17, 24212435.

90. Posfai J., Bhagwat A.S., Roberts R.J. 1988. Sequence motifs specific for cytosine methyltransferases. Gene, 74, 261-265.

91. Pozidis C., Vlatakis G., Bouriotis V. 1993. Sequence-specific DNA affinity chromatography: application of a group-specific adsorbent for the isolation of restriction endonucleases. J. Chromatogr., 630, 151-157.

92. Raghavendra N.K., Rao D.N. 2004. Unidirectional translocation from recognition site and a necessary interaction with DNA end for cleavage by type III restriction enzyme. Nucleic Acids Res., 32, 5703-5711.

93. Raleigh E.A. 1992. Organization and function of the mcrBC genes of Escherichia coli K-12. Mol. Microbiol., 6, 1079-1086.

94. Raleigh E.A., Wilson G. 1986. Escherichia coli K-12 restricts DNA containing 5-methylcytosine. Proc. Nad. Acad. Sci., 83, 9070-9074.

95. Raleigh E.A., Trimarchi R., Revel H. 1989. Genetic and physical mapping of the mcrA (rglA) and mcrB (rglB) loci of Escherichia coli K-12. Genetics, 122, 279-296.

96. Ramanathan S.P., van Aelst K., Sears A., Peakman L.J., Diffin F.M., Szczelkun M.D., Siedel R. 2009. Type III restriction enzymes communicate in ID without looping between their target sites. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106, 1748-1753.

97. Restriction endonucleases: Quality controls. In: New England Biolabs Catalogue. 2005-2006. New England Biolabs, Inc. 32 Tozer Road Beverly, MA 01915-5599, USA.

98. Revel H.R. 1967. Restriction of nonglucosylated T-even bacteriophage: Properties of permissive mutants of Escherichia coli B and K12. Virology, 31,688-701.

99. Roberts R.J., Belfort M., Bestor T., Bhagwat A.S., Bickle T.A., Bitinaite J., et al. 2003. A nomenclature for restriction enzymes, DNA methyltransferases, homing endonucleases and their genes. Nucleic Acids Res.,2>\, 1805-1812.

100. Roberts R.J., Vincze T., Posfai J., Macelis D. 2010. REBASE a database for DNA restriction and modification: enzymes, genes and genomes. Nucleic Acids Res., 38, D234-D236.

101. Robertson K. 2005. DNA methylation, human disease. Nature Rev. Genet., 6, 597-610.106. da Rocha S.T., Ferguson-Smith A.C. 2004. Genomic imprinting. Curr. Biol., 14, R646-R649.

102. Siwek W., Czapinska H., Bochtler M., Bujnicki J.M., Skowronek K. 2012. Crystal structure and mechanism of action of the N6-methyladenine-dependent type IIM restriction endonuclease R.DpnI. Nucleic Acids Res., 40, 7563-7572.

103. Smith C.L., Klco S.R., Cantor C.R. In: Genome analysis: A practical approach. Ed. Davies K. Oxford, UK: IRL Press. 1987.

104. Stewart F.J., Raleigh E.A. 1998. Dependence of McrBC cleavage on distance between recognition elements. Biol. Chem., 379, 611-616.

105. Studier F.W., Bandyopadhyay P.K. 1988. Model for how type I restriction enzymes select cleavage sites in DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 4677^1681.

106. Sukackaite R., Grazulis S., Tamulaitis G., Siksnys V. 2012. The recognition domain of the methyl-specific endonuclease McrBC flips out 5-methylcytosine. Nucleic Acids Res.,

107. Sutherland E., Coe L., Raleigh E.A. 1992. McrBC: a multisubunit GTP-dependent restriction endonuclease. J. Mol. Biol., 225, 327-358.

108. Tarasova G.V., Nayakshina T.N., Degtyarev S.Kh. 2008. Substrate specificity of new methyl-directed DNA endonuclease Glal. BMC Mol. Biol., 9, 7.

109. Tock M.R., Dryden D.T. 2005. The biology of restriction and antirestriction. Curr. Opin. Microbiol, 8, 466-472.

110. Vlatakis G., Bouriotis V. 1991. Sequence-specific DNA affinity chromatography: Application to the purification of EcoRI and Sphl. Anal. Biochem., 195, 352-357.

111. Wah D.A., Hirsch J.A., Dorner L.F., Schildkraut I., Aggarwal A.K. 1997. Structure of the multimodular endonuclease Fokl bound to DNA. Nature, 388, 97-100.

112. Waite-Rees P.A., Keating C.J., Moran L.S., Slatko B.E., Hornstra L.J., Benner J.S. 1991. Characterization and expression of the Escherichia coli Mrr restriction system. J. Bacteriol., 173, 5207-5219.

113. Wang L., Chen S., Xu T., Taghizadeh K., Wishnok J.S., Zhou X., You D., Deng Z., Dedon P.C. 2007. Phosphorothioation of DNA in bacteria by dnd genes. Nat. Chem. Biol., 3, 709-710.

114. Waterbury P.G., Rehfiiss R.P.,Carrol W.T., Smardon A.M., Faldasz B.D., Huckaby C.S., Lane M.J. 1989. Specific cleavage of the yeast genome at 5'-ATCGATCGAT-3'. Nucleic Acids Res., 17, 9493.

115. Weil M.D., McClelland M. 1989. Enzymatic cleavage of a bacterial genome at a 10-base-pair recognition site. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86, 51-55.

116. White S.R., Lauring B. 2007. AAA+ ATPases: achieving diversity of function with conserved machinery. Traffic, 8, 1657-1667.

117. Whitehead P.R., Brown N.L. 1985. A simple and rapid method for screening bacteria for type II restriction endonucleases: enzymes in Aphanothece halophytica. Arch. Microbiol., 141, 70-74.

118. Wilson G.G., Murray N.E. 1991. Restriction and modification systems. Annu. Rev. Genet., 25, 585-627.

119. Wilson W.W., Mebane E.W., Hoffman R.M. 1993. Creation of ultra-rare restriction sites in intact eucaryotic chromosomes mediated by bacterial methylases: an approach to sequencing and analyzing tumor and normal genomes. Anticancer Res., 13, 17-20.

120. Wion D., Casadesus J. 2006. N6-methyl-adenine: an epigenetic signal for DNA-protein interactions. Nat. Rev. Microbiol., 4, 183-192.

121. Wyatt G.R., Cohen S.S. 1953. The bases of the nucleic acids of some bacterial and animal viruses: the occurrence of 5-hydroxymethylcytosine. Biochem. J., 55, 774-782.

122. Xu S.-y., Corvaglia A.R., Chan S.-H., Zheng Y., Linder P. 2011. A type IV modification-dependent restriction enzyme SauUSI from Staphylococcus aureus subsp. aureus USA300. Nucleic Acids Res., 39, 5597-5610.

123. Yamada Y., Watanabe H., Miura F., Soejima H., Uchiyama M., Iwasaka T., Mukai T., Sakaki Y., Ito T. 2004. A comprehensive analysis of allelic methylation status of CpG islands on human chromosome 21q. Genome Res., 14, 247-266.

124. Yanisch-Perron C., Vieira J., Messing J. 1985. Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors. Gene, 33, 103-119.

125. Zheng Y., Cohen-Karni D., Xu D., Chin H.G., Wilson G., Pradhan S., Roberts R.J. 2010. A unique family of Mrr-like modification-dependent restriction endonucleases. Nucleic Acids Res., 38, 5527-5534.