Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Обмен кальция и кальциевая обратная связь в палочках сетчатки амфибий

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Обмен кальция и кальциевая обратная связь в палочках сетчатки амфибий"

Российская Академия Наук Институт эволюционной физиологии и биохимии имени И.М. Сеченова

На правах рукописи

КУЗЬМИН Дмитрий Георгиевич

ОБМЕН КАЛЬЦИЯ И КАЛЬЦИЕВАЯ ОБРАТНАЯ СВЯЗЬ В ПАЛОЧКАХ СЕТЧАТКИ АМФИБИЙ.

03.00.13. - физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2004

Работа выполнена в лаборатории эволюции органов чувств (заведующий -доктор биологических наук В.И. Говардовский) Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук В.И. Говардовский Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Г. Р. Каламкаров

доктор биологических наук Д.Б. Тихонов

Ведущее учреждение:

Институт проблем передачи информации РАН

Защита состоится 21 декабря 2004 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 002.127.01 при Институте эволюционной физиологи и биохимии им. И.М. Сеченова РАН по адресу: 194223 Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, д. 44, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института эволюционной физиологи и биохимии им. И.М. Сеченова РАН.

Автореферат разослан 11 ноября 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета ^ доктор биологических наук

М.Н. Маслова

200?-4

21т

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы: Диапазон интенсивностей света, в котором работает зрительная система человека, составляет 11 порядков, из которых 20 раз обеспечивает работа зрачка, а более 9 порядков перекрывают сетчатка и центральные механизмы. Этот диапазон обслуживается работой двух систем - палочковой и колбочковой. Обеспечивая приспособление зрения к различным уровням освещенности, каждая из систем способна к световой адаптации в своем рабочем диапазоне от 10-6 до 10 люкс у палочковой и от 10'3 до 105 люкс у колбочковой (Хартридж, 1952; Rodieck, 1998).

Процессы адаптации происходят на всех уровнях зрительной системы, а фоторецепторные клетки, являясь ее первым звеном, определяют работу всех последующих звеньев. Световая адаптация на уровне одиночных фоторецепторов обеспечивается процессами регуляции внутриклеточного каскада фототрансдукции. Несколько цепей отрицательной обратной связи, работающих через изменение внутриклеточной концентрации ионов Са2+, влияют на ряд компонентов каскада, подстраивая чувствительность клетки к условиям освещения (обзор Каламкаров, Островский, 2002). Многочисленные данные по биохимии, молекулярной биологии и электрофизиологии палочек, полученные в последние десятилетия, позволяют представить детальную схему каскада и должны позволить составить математическую модель, способную количественно воспроизвести ответы палочки на свет в широком диапазоне условий световой стимуляции. Примечательно, однако, что предпринятая недавно попытка построения такой модели (Nikonov et я1., 2000) оказалась удачной только частично. Модель удовлетворительно предсказывала ответы на вспышки света в условиях темновой адаптации, но совершенно не воспроизводила эффекты световой адаптации. Проблема заключается в невозможности состыковать в единой модели известные из экспериментов с кальций-чувствительными флуоресцентными красителями быстрые (секундные) изменения

цитоплазматической концентрации Са2+, при высокой скорости Са-управляемых реакций, с наблюдаемой медленной (десятки секунд) электрической активностью клетки, отражающей ход световой адаптации. Возможны два невзаимоисключающих пути разрешения имеющихся противоречий: либо кинетика светоиндуцированных изменений концентрации Са2+ гораздо медленнее той, что была до сих пор показана экспериментально, либо существуют неизвестные медленные механизмы регуляции каскада, не учитываемые существующей моделью. Как первое, так и второе предположения имеет ряд косвенных доводов в свою защиту, но убедительных экспериментальных данных в пользу того или другого нет.

Цель исследования. Выяснить кинетику кальциевой обратной связи в палочках и ее способность исчерпывающе объяснить феноменологию электрического ответа.

Задачи исследования.

1. Исследовать на палочках лягушки кинетику изменения внутриклеточной концентрации ионов Са2+ за времена развития световой адаптации.

2. Используя полученные данные об обмене свободного внутриклеточного кальция, построить математическую модель фототрансдукции в палочке, основываясь на собственных экспериментальных данных.

3. Исследуя модель, оценить вклад в световую адаптацию известных кальций-регудируемых реакций и их достаточность или недостаточность для полного описания механизма фототрансдукции и адаптации в палочках.

Научная новизна результатов исследования Показано, что светоиндуцированные изменения концентрации кальция в цитоплазме наружного сегмента палочки имеют двухфазную кинетику с постоянными времени фаз, отличающимися на порядок, что объясняется присутствием в фоторецепторе многокомпонентного Са2+-буфера. Полученные количественные параметры обмена кальция позволяют использовать их для

математического моделирования фототрансдукции и световой адаптации. Построенная с учетом двухфазной кинетики обмена Са2+ модель позволяет добиться наилучшего описания световой адаптации, по сравнению со всеми ранее существовавшими моделями фототрансдукции, и позволяет оценить вклад различных Са-зависимых механизмов в световую адаптацию палочки, Ограничения модели, не позволяющие добиться в ее рамках полного описания ответа на вспышки в состоянии световой адаптации, указывают на наличие неизвестных пока биохимических механизмов регуляции каскада фототрансдукции.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Суммарное количество кальция, освобождаемое из наружного сегмента палочки сетчатки лягушки Rana ridibunda при освещении, составляет 3.3108 ионов, что соответствует цитоплазматической концентрации 0.55 мМ. Кальций переносит 11% общего темнового тока.

2. Скорость выхода ионов Са2+ в слое фоторецепторов изолированной перфузируемой сетчатки, отражающая светоиндуцированные изменения цитоплазматической концентрации свободного Са?+, падает по двухэкспоненциальной кривой с постоянными времени 4.6 и 44 с и относительными амплитудами 58 и 42 %.

3. Количественная математическая модель процессов возбуждения и световой адаптации в палочках должна включать двухкомпонентный кальциевый буфер, состоящий из быстро- и медленнообмениваемой фракций для хорошего воспроизведения ответов на вспышки и ступеньки света в широком диапазоне условий стимуляции.

4. Модель с двухкомпонентным кальциевым буфером не в состоянии объяснить все особенности ответа на вспышки в состоянии световой адаптации, указывая тем самым на существование неизвестных пока биохимических механизмов регулирования каскада фототрансдукции.

Теоретическая и практическая значимость работы Полученные в работе данные об обмене ионов кальция в цитоплазме палочки и их учет в математической модели фототрансдукции позволяют разрешить противоречия в теории фототрансдукции, связанные с недоучетом реальной кинетики обмена кальция в фоторецепторной клетке. Построенная модель является инструментом для дальнейшего исследования и позволяет указать направление для новых экспериментальных работ. Результаты исследования могут использоваться в курсах лекций по общей физиологии и физиологии сенсорных систем в биологических и медицинских ВУЗах

Апробация работы. Результаты исследования доложены на международном симпозиуме по зрительной рецепции «Visionarium Ш» в Твярмине (Финляндия) в 2004 году, ХЕХ Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова, состоявшемся в Екатеринбурге в 2004 году, и конференции 'Transport mechanisms across cell membranes: channels and pumps", состоявшейся в Санкт-Петербурге в 2004 году.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 103 страницах, состоит из введения, четырех глав, включающих обзор литературы, описание методов исследования, изложение результатов и обсуждение результатов, выводов, списка литературы, включающего 127 источников. Диссертация иллюстрирована 2 таблицами и 19 рисунками.

Материалы и методы.

Эксперименты проводили на сетчатках озерных лягушках Rana ridibunda. Для изучения трансмембранных потоков ионов кальция через плазматическую мембрану палочек был использован метод регистрации концентрации Са2+ в межклеточном пространстве ион-селективным микроэлектродом на целом препарате сетчатки. Микроэлектроды (заполненитель селективного ствола - Ionophor Coctail A, #21048, Fluka) тестировались непосредственно перед экспериментом быстрой (<30 мс)

сменой потоков с концентрацией СаС12 1 мМ и 10 мМ, показывая во всех случаях постоянную времени не хуже 200-250 мс. Реакция электрода на 10-кратное изменение концентрации Са2+ составляла 25-28 мВ. Сопротивление селективного канала было 2-15 ГОм.

Состав раствора Рингера в мМ: NaCl, 100; КС1, 2,5; MgCl2, 1; СаС12, 1; NaHCO3, 10; глюкоза, 10; HEPES, 10, рН 7,2-7,5, аспартат натрия 5-20. Сетчатка помещалась в перфузионную камеру так, что растворы, омывающие рецепторную и витреальную стороны, были изолированы друг от друга Через раствор, омывающий рецепторную сторону, пропускалась смесь 95%О2 + 5% СО2. Макроэлектродами, соединенными с растворами, отводился суммарный трансретинальный электрический ответа -электроретинограмма

Микроэлектрод перемещался вертикально при помощи электромеханического микроманипулятора (DC3314, WPI, США). Точность позиционирования электрода составляла ±0.5 мкм. Сигнал от микроэлектрода усиливался и фильтровался (частота среза 5-20 Гц) при помощи двухканального усилителя Axoprobe 1A (Axon Instruments, США) с входным сопротивлением RM »1015 Ом. Возможность независимой компенсации входной емкости и перекрестной емкости между каналами у этого усилителя позволяла получить электрическую постоянную времени регистрации <20 мс при практически полном устранении артефакта от синфазного сигнала

Для вычисления светоиндуцированного нетто-выхода ионов Са2+ через мембрану наружного сегмента использовались два математических подхода При первом из них выход определялся как сумма изменения содержания иона во внеклеточном пространстве между наружными сегментами, диффузионного потока из слоя наружных сегментов в омывающий раствор и потока из слоя наружных сегментов во внутренние слои сетчатки. Диффузионные потоки рассчитывались из решения двух

сингулярных задач диффузии с граничными условиями - концентрациями Са2+ у вершин и оснований наружных сегментов соответственна Во втором случае для расчета выхода решалась регулярная задача диффузии, требующая знания концентрации в промежуточной точке, а граничными условиями являлась концентрация Са2+ у вершин и оснований наружных сегментов.

Фототок одиночных палочек лягушки Rana ridibunda регистрировался при помощи всасывающего микроэлектрода Световая стимуляция и сбор данных проводились при помощи управляющей компьютерной программы LabView (National Instruments, США). При стимуляции длительными засветками, перед выключением ступеньки подавалась яркая насыщающая вспышка Это давало возможность точно определить установившийся стационарный уровень тока, исключая возможную ошибку, связанную с дрейфом электродов. Сигнал подвергался аналоговой фильтрации (фильтр низких частот с частотой среза 30 Гц). При необходимости в дальнейшем могла применяться дополнительная цифровая фильтрация.

Система дифференциальных уравнений, составляющая ядро математической модели, решалась при помощи программы Mathcad 2001 Professional (MathSoft, США), использующей метод Рунге-Кутта четвертого порядка.

Результаты.

При нахождении микроэлектрода в слое фоторецепторов, между референтным каналом и раствором на поверхности сетчатки регистрируется рецепторный потенциал (рис. 1, б). Видно, что через ~1 с после включения стимула разность потенциалов в рецепторном канале достигает максимума, а затем частично возвращается к темновому уровню, отражая процесс световой адаптации. При дальнейшем погружении микроэлектрода в сетчатку

амплитуда рецепторного потенциала непрерывно увеличивается. Ион-селективный электрод регистрирует повышение внеклеточной концентрации Са2+ (верхние кривые) и ее возвращение к темновому уровню после выключения стимула, с небольшим овершутом (на рисунке не показан).

Рис. 1. Кальциевые (а) и электрические (б) ответы палочки на ступеньки света длительностью 20 с, отводимые на глубинах 0, 30, 60, 100 мкм в сетчатке.

Цифры около кривых - глубина погружения микроэлектрода в мкм. «0» примерно соответствует вершинам наружных сегментов. Отметка стимула внизу верхней панели. Усреднения от 6 до 10 записей.

При нахождении микроэлектрода у кончиков наружных сегментов (глубина 0 мкм) электрический ответ практически отсутствует, но наблюдается значительное повышение концентрации Са2+, которое вызвано его выходом из фоторецепторов и диффузией в омывающий раствор. Самый большой и быстрый кальциевый ответ регистрируется на глубине около 30 мкм, т.е. в

середине слоя наружных сегментов палочек. На границе слоя фоторецепторов, вблизи их синаптических окончаний (глубина 100 мкм) ответ имеет небольшую амплитуду, медленный фронт и длительную (-2.5 с) латентность, указывая, что наружные сегменты являются единственным источником Са2+ в своем слое в течение ответа. С использованием данных о внеклеточном пространстве в различных слоях препарата (оцененном по внеклеточному сопротивлению), по записям временного хода концентрации у вершин и оснований наружных сегментов можно определить светоиндуцированный поток Са2+ через мембрану наружного сегмента Пример такого расчета приведен на рис. 3. Кривые, рассчитанные по диффузионным потокам из слоя наружных сегментов и по решению уравнения диффузии в этом слое, достаточно близки друг к другу, особенно если учесть упрощающие предположения, которые приходится делать при расчете.

свет 40 с

Рис. 3. Сравнение двух методов расчета светоиндуцированного трансмембранного потока. 1 - расчет диффузионных потоков, 2 - решение уравнения диффузии в слое наружных сегментов.

Средняя величина потока в пике составляет 52 ± 12 пикомоль Са2+ с-1см-2 сетчатки, или 2.6±0.610-17 мольс1 на палочку (среднее ±95% доверительный интервал; сетчатка лягушки содержит 2106 палочек/см2). Поскольку начальный нетто-поток Са2+ из наружных сегментов после

полного закрытия каналов темнового тока равен его потоку внутрь в темноте, можно определить, что темновой ток, переносимый ионами Са2+, составляет 1.6107 ионовс1, или 5.2 пА на палочку. Это составляет около 11% всего темнового тока (49±5 пА на палочку, среднее из 11 препаратов). Полное количество Са2+, выходящего из палочек при длительном насыщающем стимуле, может быть получено интегрированием по времени кривой скорости выхода. Оно равно 6.6-108 ионов, или 0.55 мМ в пересчете на объем цитоплазмы наружного сегмента. Поскольку концентрация свободного Са2+ составляет около 0.5 мкМ, видно, что около 99.9% обмениваемых ионов связано с внутриклеточными буферными системами,

О 10 20 30 40 50

время, с

Рис. 3. Усредненная по четырем препаратам кривая скорости светоиндуцированного выхода Са2+ в ответ на ступеньку света (кривая с шумом). Включение света в момент 0. Гладкая кривая - приближение двумя экспонентами, экстраполированное к моменту включения. Параметры аппроксимации: постоянные времени 4.6 и 43.7 с, относительные амплитуды 58 и 42%. Левая шкала ординат - скорость выхода, правая - внутриклеточная концентрация свободного Са2+ в предположении, что исходная (темновая) концентрация Са2+ составляет 0.5 мкМ.

В кинетике светоиндуцированного выхода Са2+ в ответ на ступеньку света (рис. 3) четко различаются две фазы с постоянными времени 4.6 с и 44 с. Обмен между свободной фракцией и несколькими типами мест связывания

с различной емкостью и скоростью обмена ионов должен быть ответственен за многокомпонентную кинетику выхода Са2+ из палочек при освещении. Быстрая фаза выхода, соответствующая быстрообмениваемой фракции внутриклеточного Са2+, равна 6.810-17 моль, или 4.1-107 ионов на палочку, обеспечивая буферность (отношение связанной и свободной фракций) около 140. Она составляет около 12% всего обмениваемого кальция в наружном сегменте. Остальные 88% представлены более прочно связанной фракцией (возможно, неоднородной), ответственной за медленное освобождение на свету. Как следует из известных свойств Ша/К,Са обменника, скорость откачки Са2+ из наружного сегмента прямо пропорциональна его свободной концентрации в цитоплазме (Ьа§паёо й а1., 1992). Поэтому можно заключить, что падение цитоплазматического уровня Са2+ в ответ на свет происходит двухфазно, с постоянными времени фаз, отличающимися примерно на порядок (~ 4 и 40 с).

Математическая модель Фототрансдукции и адаптации в палочке

Чтобы проверить, достаточно ли только учета двухфазной кинетики обмена кальция, полученной в наших измерениях, для полного описания фототрансдукции и световой адаптации, была построена детальная математическая модель фотоответа Эта модель включает все твердо установленные механизмы активации и регуляции фототрансдукционного каскада.

Дифференциальные уравнения (1-5) вместе с уравнениями (6) и (7) и начальными условиями (8 и 9) составляют математическую модель фототрансдукции и адаптации в палочке. Решением системы являются функции <Щ, Сф), Са(), описывающие соответственно число

активированных молекул родопсина, число активированных молекул фосфодиэстеразы (ФДЭ), концентрацию свободного цГМФ, концентрацию свободного и связанного с медленнообмениваемым буфером кальция в ответ

на стимуляцию - активацию родопсина со скоростью Щ (Я*с). Все параметры модели, их определения и размерности сведены в таблицу 1.

Л

<Ш*(1) Л

+-

1 ЦСа(1)/Кш)п«

"(О

Л Вес 1+(Са(0/^)

сою

-)

= к+. Са(1) ■ (В^-Сав(1))-к_ ■ Сав(/)

ш

где

у«(0

Са(0

Условия темнового равновесия, при / - 0:

1) отсутствие обесцвеченного родопсина (Л*(0) = 0) и, как следствие,

2) отсутствие активированной фосфодиэстеразы (Е*(0) = 0);

3) скорости синтеза и гидролиза цГМФ уравновешены, т.е. йсО( 0)/& = 0,

Баш__я сС(°) (8);

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

(7)

4) Скорости входа и выхода кальция уравновешены, т.е, йСи(0)/& = 0,

1, .

сС{6Г- +(Кс0п

с(?(0)"

. к.

— к

сСтш ^сбтах

' Лхяи

Са(0) Са(0)+Ка

1 + (Ся(0 )1КШ

Знание концентрации цГМФ еО(,) позволяет рассчитать временной ход изменений темнового тока, используя уравнение (6), и провести сравнение с экспериментальными записями фотоответа

Таблица 1. Параметры модели. Определения и размерности. Значения.

3 постоянная Фарадея, Клмоль-1 96500 96500

X,, число Авогадро, моль-1 6 1023 6 1023

Ууу1о объем цитоплазмы наружного сегмента, л

максимальный ток через каналы при насыщающей концентрации цГМФ, А 2.610-8 1.7410-8

!са доля темнового тока, переносимого ионами Са2+ 0.16 0.165

•ж* максимальный обменный ток при насыщающей концентрации Са2+, А 5.2 10-12 6.610-12

Кх полунасыщающая концентрация Са2+ для обменника, М 1.5 10-6 1.5 10-6

¥Б буферная сила быстрообмениваемого цитоплазматического буфера для Са2+ 200 170

втах суммарная концентрация медленно обмениваемого буфера в цитоплазме, М 9.5- 10- 4 1.7- 10-3

Кг константа скорости связывания с медленно обмениваемым буфером для Са2+, М,Лс'1 0.08 0.09

к+1 константа скорости диссоциации медленно обмениваемого буфера для Са2+, с1 0.5 0.2

КЯтах максимальная константа скорости инактивации Я* (при нулевой 21 1 концентрации Са }, с 25 15

кЛтт минимальная константа скорости инактивации Я* (при высокой концентрации Са2+), с'1 2.5 4.5

КСаЯ полунасыщающая концентрация ионов Са2+ для регуляции инактивации Я*, М 3 • 10-7 3.5- 10-7

"с,К коэффициент Хилла для регуляции инактивации И* 2 1

скорость активации ФДЭ полностью -1 активированным родопсином, с 180 180

кЕ константа скорости самоинактивации ФДЭ,с-1 0.35 —

Рйагк скорость гидролиза цГМФ в темноте, Мс-1 1.95' 10-5 2 ' 10-5

кса1 каталитическая активность одной субъединицы ФДЭ, с-1 2200 2200

К полунасыщающая концентрация цГМФ для ФДЭ, М 1' 10-5 1 ' 10-5

всв буферная сила цитоплазмы для цГМФ 1 1

®тах максимальная активность ГЦ (при нулевой концентрации Са2+), Мс-1 2.5' 10-5 2.5 ' 10-5

Отгап минимальная активность ГЦ (при высокой концентрации Са2+), Мс-1 2.5' 10-7 7.5' 10-7

Ксус полунасыщающая концентрация ионов Са2+ для регуляции ГЦ, М 2.3' 10-7 2.35 ' 10-7

пус коэффициент Хилла для регуляции ГЦ 4 4

К минимальное значение полунасыщающей концентрации цГМФ для регуляции проводимости каналов, М 1.3' 10-5 1.3 ' 10-5

Ксвтях максимальное значение полунасыщающей концентрации цГМФ для регуляции проводимости каналов, М 3.2' 10-5 3.2 ' 10-5

к Сам полунасыщающая концентрация Са2+ для регуляции сродства каналов к цГМФ, М 1 ' 10-7 4 ' 10-8

ПСаМ коэффициент Хилла для регуляции сродства каналов к цГМФ 1 1

пса коэффициент Хилла для регуляции проводимости каналов 2 2

кЕтах(*) максимальная скорость самоинактивации ФДЭ (при нулевой концентрации Са2+), с-1 — 1.3

^ЕттО минимальная скорость самоинактивации ФДЭ (при высокой концентрации Са2+), с-1 — 0.078

К, (*) полунасыщающая концентрация Са2+ для регуляции ФДЭ, М — 3.4 ' 10-7

пЕ (*) коэффициент Хилла для регуляции ФДЭ — 3

(*) Параметры, помеченные звездочками в первой колонке, относятся к расширенной модели (уравнение 10 в тексте).

Объем цитоплазмы (V ) рассчитывался как половина измеренного полного объема наружного сегмента (0.8 пл у палочки, выбранной для моделирования). Один из ключевых параметров модели - константа скорости инактивации ФДЭ (кЕ) - оценивался экспериментально с использованием анализа, предложенного Пеппербергом и др. (РеррегЪег§ е! а1., 1992; №копоу е! а1., 1998). Как оказалось, у Я.гШ1Ьыпйа зависимость времени нахождения ответа в насыщении от натурального логарифма интенсивности вспышки существенно нелинейна, что делает анализ неточным. Приближение начального участка зависимости прямой дает для разных клеток значение кЕ = 0.2 - 0.5 с-1. Остальные параметры выбирались в ходе подгонки модели к экспериментальным записям фототока Диапазон их возможных значений известен из независимых биохимических и физиологических экспериментов на палочках амфибий.

Рис.4. Экспериментальные (кривые с шумом) и модельные (гладкие кривые) электрические и кальциевые ответы Параметры модели в третьем столбце Таблицы 1. Ответы нормированы на максимальную амплитуду. а - воспроизведение в модели серии ответов палочки на 10 мс вспышки света 30,76,193 и 770 изомеризации (Я*) в состоянии темновой адаптации. Задержка стимула 200 мс.

б - воспроизведение моделью серии ответов на длительные ступеньки света Интенсивность ступенек 480,1210,3070,7640 и 19300 Я*с \ Линия под кривыми - отметка стимула.

в - изменение концентрации свободного Са2+ в цитоплазме наружного сегмента после мгновенного закрытия светорегулируемых каналоа Экспериментальные данные те же, что на рис. 3.

Модель с двухкомпонентным обменом Са2+, как и ранее описанная модель с однокомпонентным обменом (Жому е1 а1., 2000), хорошо предсказывает стационарные уровни тока, устанавливающиеся к 120 с после включения фона (рис. 4, б). В то же время суженная до однокомпонентного буфера (Втх = 0) модель на нашем объекте не в состоянии удовлетворительно воспроизвести даже серию ответов на вспышки в состоянии темновой адаптации. Учет двухкомпонентности обмена Са2+ оказался необходимым для такого описания (рис. 4, а). Существенным прогрессом модели с двукомпонентным обменом кальция является воспроизведение кинетики перехода к новым уровням, т.е. временного хода световой адаптации (Рис. 4, б), который совершенно не воспроизводится при Втх = 0, как это было отмечено и Никоновым с соавторами. Параметры изменения цитоплазматической концентрации свободного Са2+, полученные из нашей модели, оказались близкими к определенным экспериментально (Рис. 4, б). Модель также точно предсказывает величину темнового тока палочки при/с, лежащей в экспериментально измеренном диапазоне (Таблица 1). Следует отметить, что темновой ток в модели не является свободным параметром, а определяется в результате вычисления из уравнения (6) при / = 0.

Несмотря на успех модели в описании ответов на вспышки и ступеньки света в состоянии темновой адаптации, она не позволяет правильно предсказать ответы на вспышки, поданные на постоянном световом фоне (Рис. 5, левая колонка). Модельные ответы имеют меньшую амплитуду, находятся в насыщении дольше, чем экспериментальные, и возвращаются к исходному уровню медленнее.

Анализ модели показывает, что в ее рамках описать ответы на вспышки в состоянии световой адаптации с сохранением согласия с «темноадаптированными» ответами нельзя.

Рис. 5. Для воспроизведения ответов на вспышки умеренной яркости в состоянии световой адаптации необходимо ввести в модель регуляцию времени жизни ФДЭ*. Левая колонка-экспериментальные ответы и ответы модели без регуляции выключения ФДЭ*, правая колонка - то же с регуляцией (параметры модели - в третьей колонке Таблицы 2). Ответы на вспышки 1040 R* на фоне 480 R*c-1 (а), 12100 R* на фоне 1210 R*c-1 (б), 12100 R* на фоне 3070 R*c-1 (в) и 40700 R* на фоне 7640 R*c-1 (г).

Необходимо ввести дополнительный механизм регуляции, мишенью которого должен быть самый медленный процесс, определяющий скорость выключения ферментативного каскада Согласно установившемуся мнению (и в нашей модели), таким процессом является инактивация ФДЭ* (Lyubaisky et al., 1996; Sagoo, Lagnado, 1997). Поскольку о биохимической природе такого гипотетического механизма ничего неизвестно, мы ввели его в модель как кальций-зависимый. По аналогии с остальными кальциевыми регуляциями в палочке, активация выключения ФДЭ* при понижении [Са2+] описывается как

<1Е*(1)

^£тах ^Етш * до

(10)

л - - — 1+(Сс(/) / К%

Медленная регуляция инактивации ФДЭ (расширенная модель, Таблица 1, колонка 4) не сказывается на качестве описания ответов на вспышки в состоянии темновой адаптации, но позволяет близко воспроизвести кинетику ответов на относительно слабые вспышки на постоянном световом фоне (Рис. 5, правая колонка). Модель также хорошо воспроизводит ответы на включение ступенек света Кинетика светоиндуцированных изменений концентрации свободного Са2+ в такой модели оказалась даже ближе к результатам измерений при помощи ион-селективных электродов, чем в модели без регуляции. Однако ни одна из моделей, в том числе и модель с медленной регуляцией выключения ФДЭ, не воспроизводит ответы на выключение фонового освещения - на модельных ответах присутствует значительный овершут, практически отсутствующий в экспериментальных записях.

Рис. 6. Даже модель с регуляцией времени жизни ФДЭ не воспроизводит ответы на яркие насыщающие вспышки на фоне, а - вспышка 31400 Я* на фоне 480 Я^-1 а - 78600Я* на фоне 1210 Я^-1 б - 78600 Я* на фоне 1210 Я*е-1 в -10000 Я* на фоне 3070 Я*е-1 г - 257000 Я* на фоне 7640 Я*е-1

Кроме того, существует значительное расхождение между моделью и экспериментом для ярких насыщающих вспышек на фоне - модельные ответы быстрее экспериментальных и имеют более крутой задний фронт, завершающийся овершутом (Рис. 6).

Таким образом, математическая модель фототрансдукции, учитывающая экспериментально установленную двухфазную кинетику обмена кальция, хорошо воспроизводит ответы на вспышки света, поданные в темноте, и временной ход световой адаптации палочки в широком диапазоне условий стимуляции. Для описания эффектов световой адаптации на ответы на вспышки умеренной интенсивности в модель необходимо ввести гипотетическую регулировку скорости выключения активированной ФДЭ. Некоторые особенности световой адаптации, однако, не находят своего объяснения в рамках созданной модели, что говорит о существовании дополнительных неизвестных механизмов регуляции в каскаде фототрансдукции. Модель указывает направление дальнейших экспериментальных исследований по идентификации этих механизмоа

Выводы.

1. Светоиндуцированный выход ионов Са2+ из наружных сегментов интактных палочек изолированной сетчатки лягушки Rana ridibunda исследован при помощи ион-селективного микроэлектрода, введенного в слой фоторецепторов. Суммарное количество кальция, освобождаемое из наружного сегмента при освещении, составляет 3.3-108 ионов, что соответствует цитоплазматической концентрации 0.55 мМ. Кальций переносит 11% общего темнового тока.

2. Скорость выхода, отражающая изменения цитоплазматической концентрации свободного Са2+, падает по двухэкспоненциальной кривой с постоянными времени 4.6 и 44 с и относительными амплитудами 58 и 42 %,

что обусловлено наличием как минимум двух буферных систем для Са2+, с различными скоростями обмена со свободной фракцией,

3. Построена наиболее детальная из известных математическая модель процессов возбуждения и световой адаптации в палочках. Модель исследована в применении к фотоответам палочек Я. ridibunda.

4. Для хорошего воспроизведения ответов на вспышки и ступеньки света, поданные в темноте, модель должна включать двухкомпонентный кальциевый буфер, состоящий из быстро- и медленнообмениваемой фракций, подобный обнаруженному в экспериментах с ион-селективными электродами.

5. Для воспроизведения ответов на вспышки умеренной яркости в состоянии световой адаптации в модель необходимо ввести гипотетическое ускорение инактивации комплекса трансдуцин-фосфодиэстераза, но даже расширенная модель не воспроизводит ответы палочки на выключение фонового освещения и на яркие вспышки, поданные на фоне. Это указывает на существование дополнительных, не идентифицированных пока биохимически механизмов регуляции каскада фототрансдукции

Список работ, опубликованных по материалам диссертации'

1. Говардовский В.И., Кузьмин Д.Г. Светоиндуцированный выход ионов Са2+ и кинетика кальциевой обратной связи в палочках сетчатки// Сенсорные системы. 1999. т. 13. №3. с. 206-215.

2. Кузьмин Д.Г., Травников СВ., Фирсов М.Л., Говардовский В.И. Математическое моделирование фототрансдукции и световой адаптации в палочках сетчатки лягушки// Сенсорные системы. 2004. т. 18. № 4. с. 305-

Подписано в печать 09.11.2004. Формат 60x84/16. Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии ЗАО «КопиСервис». Печать ризографическая. Заказ № 1/911. П. л. 1.25. Уч.-изд. 1.25. Тираж 70 экз.

ЗАО «КопиСервис», 194017, Санкт-Петербург, Скобелевский пр., д. 16 тел.: (812) 234 4333

РНБ Русский фонд

2005-4 21745

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кузьмин, Дмитрий Георгиевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Цель и задачи исследования.

Научная новизна результатов исследования.

Основные положения, выносимые на защиту.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Апробация работы.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Фототрансдукция и феномен световой адаптации в фоторецепторах.

1.2. Обмен ионов Са2+ в фоторецепторах. Свойства каналов, обменника и буфера.

1.2.1. Общее содержание Са в наружных сегментах.

1.2.2. Каналы.

1.2.3. Обменник.

1.2.4. Обмен кальция и кинетика светоиндуцированных изменений его внутриклеточной концентрации.

1.2.5. Системы связывания кальция в наружном сегменте.

1.3. Механизмы регуляции каскада фототрансдукции ионами Са2+.

1.3.1 Регуляция каналов.

1.3.2. Регуляция гуанилатциклазы.

1.3.3. Кальциевая регуляция фосфорилирования родопсина.

1.3.4. Гипотетические механизмы регуляции каскада.

1.4. Временной ход процессов адаптации. Сопоставление биохимических и физиологических данных.

Глава 2. МЕТОДЫ.

2.1. Препарат.

2.2. Измерение внеклеточной концентрации Са2+ при помощи ион-селективного микроэлектрода.

2.3. Обработка результатов измерений внеклеточной концентрации Са

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Измерение светоиндуцированного выхода ионов кальция при помощи ион-селективного микроэлектрода.

9 3.2. Математическая модель фототрансдукции и адаптации в палочке.

3.3. Фотоответы одиночной палочки.

3.4. Диапазон значений параметров модели.

3.5. Исследование математической модели.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Кинетика светоиндуцированных изменений цитоплазматической концентрации Са2+ в интактных фоторецепторах.

4.2. Математическая модель фототрансдукции и адаптации в палочках лягушки.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Обмен кальция и кальциевая обратная связь в палочках сетчатки амфибий"

Актуальность проблемы.

Диапазон интенсивностей света, в котором работает зрительная система человека, составляет 11 порядков, из которых 20 раз обеспечивает работа зрачка, а более 9 порядков перекрывают сетчатка и центральные механизмы (Хартридж, 1952; Rodieck, 1998). Этот диапазон обслуживается работой двух систем - палочковой и колбочковой. Первая способна работать при предельно низких освещенностях, вызывая зрительное ощущение при попадании всего нескольких квантов на ограниченную область сетчатки (Hecht et al., 1942), вторая нуждается в высоком уровне освещенности, приблизительно на три порядка выше (Graham, 1966). Световая адаптация - приспособление зрения к различным условиям освещенности. Наличие двух систем и переход к колбочковому зрению при высоких яркостях освещения являются механизмом адаптации зрительной системы в целом, при этом каждая из систем способна к световой адаптации, обеспечивая свой рабочий диапазон

Г Л С освещенностей от 10" до 10 люкс у палочковой и от 10" до 10 люкс у колбочковой.

Процессы адаптации происходят на всех уровнях зрительной системы, а фоторецепторные клетки, являясь первым звеном зрительной системы, определяют работу всех ее последующих звеньев. Световая адаптация на уровне одиночных фоторецепторов обеспечивается процессами регуляции внутриклеточного каскада фототрансдукции. Несколько цепей отрицательной обратной связи, работающих через изменение внутриклеточной концентрации ионов Са2+, влияют на ряд компонентов каскада, подстраивая чувствительность клетки к условиям освещения. Среди внутриклеточных сигнальных схем, работающих через G-белок, фототрансдукционный каскад в палочках является на сегодняшний день наиболее изученным. Многочисленные данные по биохимии, молекулярной биологии и электрофизиологии палочек, полученные в последние десятилетия, позволяют представить детальную схему каскада и определить вклад отдельных его компонентов в процессы передачи возбуждения и световой адаптации.

Столь детальный уровень знаний о механизмах фоторецепции должен позволить составить математическую модель, способную количественно воспроизвести ответы палочки на свет в широком диапазоне условий световой стимуляции. Примечательно, однако, что предпринятая недавно попытка построения такой модели (№копоу е1 а1., 2000) окончилась по сути неудачей. Модель удовлетворительно предсказывала ответы на вспышки света в условиях темновой адаптации, но совершенно не воспроизводила эффекты световой адаптации. Главной проблемой оказалась невозможность состыковать в единой модели известные из экспериментов с ион-чувствительными красителями быстрые (секундные) изменения цитоплазматической концентрации Са2+ и высокие скорости Са-управляемых реакций с наблюдаемой медленной (десятки секунд) электрической активностью клетки, отражающей ход световой адаптации. Возможны два невзаимоисключающих пути разрешения имеющихся противоречий: либо кинетика светоиндуцированных изменений концентрации Са2+ гораздо медленнее той, что была до сих пор показана экспериментально, либо существуют неизвестные медленные механизмы регуляции каскада, не учитываемые существующей моделью. Как первое, так и второе предположения имеет ряд косвенных доводов в свою защиту, однако прямых экспериментальных данных в пользу того или другого нет.

Цель и задачи исследования.

Целью работы было выяснить кинетику кальциевой обратной связи в палочках и ее способность исчерпывающе объяснить феноменологию электрического ответа, для чего:

1. Исследовать на палочках лягушки кинетику изменения внутриклеточной концентрации ионов Са2+ за времена развития световой адаптации.

2. Используя полученные данные об обмене свободного внутриклеточного кальция, построить математическую модель фототрансдукции в палочке, основываясь на собственных экспериментальных данных.

3. Исследуя модель, оценить вклад в световую адаптацию известных кальций-регулируемых реакций и их достаточность или недостаточность для полного описания механизма фототрансдукции и адаптации в палочках.

Научная новизна результатов исследования.

Показано, что светоиндуцированные изменения концентрации кальция в цитоплазме наружного сегмента палочки имеют двухфазную кинетику с постоянными времени фаз, отличающимися на порядок, что объясняется присутствием в фоторецепторе многокомпонентного Са -буфера. Полученные количественные параметры обмена кальция позволяют использовать их для математического моделирования фототрансдукции и fs i световой адаптации. Построенная с учетом двухфазной кинетики обмена Са модель позволяет добиться наилучшего описания световой адаптации, по сравнению со всеми ранее существовавшими моделями фототрансдукции, и позволяет оценить вклад различных Са-зависимых механизмов в световую адаптацию палочки. Ограничения модели, не позволяющие добиться в ее рамках полного описания ответа на вспышки в состоянии световой адаптации, указывают на наличие неизвестных пока биохимических механизмов регуляции каскада фототрансдукции.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Суммарное количество кальция, освобождаемое из наружного сегмента палочки сетчатки лягушки Rana ridibunda при освещении, составляет 3.3-108 ионов, что соответствует цитоплазматической концентрации 0.55 мМ. Кальций переносит 11% общего темнового тока.

2. Скорость выхода ионов

Са2+ в слое фоторецепторов изолированной перфузируемой сетчатки, отражающая светоиндуцированные изменения цитоплазматической концентрации свободного Са2+, падает по двухэкспоненциальной кривой с постоянными времени 4.6 и 44 с и относительными амплитудами 58 и 42 %.

3. Количественная математическая модель процессов возбуждения и световой адаптации в палочках должна включать двухкомпонентный кальциевый буфер, состоящий из быстро- и медленнообмениваемой фракций для хорошего воспроизведения ответов на вспышки и ступеньки света в широком диапазоне условий стимуляции.

4. Модель с двухкомпонентным кальциевым буфером не в состоянии объяснить все особенности ответа на вспышки в состоянии световой адаптации, указывая тем самым на существование неизвестных пока биохимических механизмов регулирования каскада фототрансдукции.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Полученные в работе данные об обмене ионов кальция в цитоплазме палочки и их учет в математической модели фототрансдукции позволяют разрешить противоречия в теории фототрансдукции, связанные с недоучетом реальной кинетики обмена кальция в фоторецепторной клетке. Построенная модель является инструментом для дальнейшего исследования и позволяет указать направление для новых экспериментальных работ. Результаты исследования могут использоваться в курсах лекций по общей физиологии и физиологии сенсорных систем в биологических и медицинских ВУЗах.

Апробация работы.

Результаты исследования доложены на международном симпозиуме по зрительной рецепции «Visionarium III» в Твярмине (Финляндия) в 2004 году, XIX Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова в Екатеринбурге в 2004 году и конференции "Transport mechanisms across cell membranes: channels and pumps" в Санкт-Петербурге в 2004 году.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Кузьмин, Дмитрий Георгиевич

ВЫВОДЫ.

•л .

1. Светоиндуцированный выход ионов Са из наружных сегментов интактных палочек изолированной сетчатки лягушки Rana ridíbunda исследован при помощи ион-селективного микроэлектрода, введенного в слой фоторецепторов. Суммарное количество кальция, освобождаемое из наружного сегмента при освещении, составляет 3.3-108 ионов, что соответствует цитоплазматической концентрации 0.55 мМ. Кальций переносит 11% общего темнового тока.

2. Скорость выхода, отражающая изменения цитоплазматической концентрации свободного Са , падает по двухэкспоненциальной кривой с постоянными времени 4.6 и 44 с и относительными амплитудами 58 и 42 %, что обусловлено наличием как минимум двух буферных систем для Са , с различными скоростями обмена со свободной фракцией.

3. Построена наиболее детальная из известных математическая модель процессов возбуждения и световой адаптации в палочках. Модель исследована в применении к фотоответам палочек R. ridibunda.

4. Для хорошего воспроизведения ответов на вспышки и ступеньки света, поданные в темноте, модель должна включать двухкомпонентный кальциевый буфер, состоящий из быстро- и медленнообмениваемой фракций, подобный обнаруженному в экспериментах с ион-селективными электродами.

5. Для воспроизведения ответов на вспышки умеренной яркости в состоянии световой адаптации в модель необходимо ввести гипотетическое ускорение инактивации комплекса трансдуцин-фосфодиэстераза, но даже расширенная модель не воспроизводит ответы палочки на выключение фонового освещения и на яркие вспышки, поданные на фоне. Это указывает на существование дополнительных, не идентифицированных пока биохимически механизмов регуляции каскада фототрансдукции.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кузьмин, Дмитрий Георгиевич, Санкт-Петербург

1. Быков К.А., Томилин Н.В. Фотоиндуцированный выход ионов кальция из фоторецепторных мембран сетчатки лягушки в средах различного ионного состава // Физиологический журнал СССР им. И.М. Сеченова. 1981. - Т. 67. - С. 652-656.

2. Говардовский В.И., Быков К.А., Скачков С.Н. Светоиндуцированный выход ионов Са2+ из фоторецепторов и «кальциевая гипотеза» зрительного возбуждения // Биологические мембраны. 1987. - Т. 4. - С. 600-612.

3. Каймачников Н.П., Колесников С.С., Мякишев А.С. Модельное исследование регуляции фототрансдукции внутренним кальцием // Сенсорные системы. 1992. - Т. 6. - С. 13-17.

4. Каймачников Н.П., Колесников С.С., Мякишев А.С. Роль Са2+-зависимой деактивации родопсина в адаптации фоторецепторов. Модельное исследование // Сенсорные системы. 1993. - Т. 3. - С. 79-92.

5. Каламкаров Г.Р., Островский М.А. Молекулярные механизмы зрительной рецепции // М.: Наука. 2002. - С. 279.

6. Фирсов M.JL, Говардовский В.И. Световая адаптация фоторецепторов: смысл и механизмы // Сенсорные системы. 2001. - Т. 15.-С. 101-113.

7. Хартридж Г. Современные успехи физиологии зрения // М.: Издательство иностранной литературы. 1952.

8. Ames J.B., Porumb Т., Tanaka Т., Ikura М., Stryer L. Amino-terminal myristoylation induces cooperative calcium binding to recoverin // J. Biol. Chem. -1995. V. 270. - P. 4526-4533.

9. Arshavsky V.Y., Lamb T.D., Pugh E.N. G proteins and phototransduction // Ann. Rev. Physiol. 2002. - V. 64. - P. 153-187.

10. Bader C.R., Bertrand D., Schwartz E.A. Voltage-activated and calcium-activated currents studied in solitary rod inner segments from the salamander retina //J. Physiol. 1982. -V. 331. - P. 253-284.

11. Barnes S. After transduction: response shaping and control of transmission by ion channels of the photoreceptor inner segments // Neuroscience. 1994. - V. 58. p. 447-459.

12. Bauer P.J. Cyclic GMP-gated channels of bovine rod photoreceptors: affinity, density and stoichiometry of Ca -calmodulin binding sites // J. Physiol. 1996. -V. 494. - P. 675-685.

13. Baylor D.A., Lamb T.D., Yau K.W. The membrane current of single rod outer segment // J. Physiol. 1979. - V. 288. - P. 589-611.

14. Burns M.E., Mendez A., Chen J., Baylor D.A. Dynamics of cyclic GMP synthesis in retinal rods // Neuron. 2002. - V. 36. - P. 81-91.

15. Burns M.E., Lamb T.D. Visual transduction by rod and cone photoreceptors // In The Visual Neurosciences. Ed. Chalupa L.M., Werner L.S. Cambridge, MA: MIT Press. - 2003. - Chapter 16. - P. 215-233.

16. Calvert P.D., Ho T.W., Le Febvre Y.M., Arshavsky V.Y. Onset of feedback reactions underlying vertebrate rod photoreceptor light adaptation // J. Gen. Physiol. 1998. - V. 111 - P. 39-51.

17. Calvert P.D., Makino C.L. The time course of light adaptation in vertebrate retinal rods // In Photoreceptors and Calcium. Ed. Baehr W., Palczewski K. -Kluwer Academic/Plenum Publishers and Landes Bioscience. 2002. - P. 37-60.

18. Calvert P.D., Govardovskii V.I., Krasnoperova N., Anderson R.E., Lem J., Makino C.L. Membrane protein diffusion sets the speed of rod phototransduction // Nature. 2001. - V. 411. - P. 90-94.

19. Calvert P.D., Govardovskii V.I., Arshavsky V.Y., Makino C.L. Two temporal phases of light adaptation in retinal rods // J. Gen. Physiol. 2002. - V. 119. - P. 129-145.

20. Cervetto L., Lagnado L., Perri R.J., Robinson, McNaughton P.A. Extrusion of calcium from rod outer segments is driven by both sodium and potassium gradients // Nature. 1989. - V. 337. - P. 740-743.

21. Chen C.K., Inglese J., Lefkowitz R.J., Hurley J.B. Ca2+-dependent interaction of recoverin with rhodopsin kinase // J. Biol. Chem. 1995. - V. 270. - P. 1806018066.

22. Chen C.K., Burns M.E., He W., Wensel T.G., Baylor D.A., Simon M.I. Slowed recovery of rod photoresponse in mice lacking the GTPase accelerating protein RGS9-1 // Nature. -2000. V. 403. - P. 557-560.

23. Chen C., Nakatani K., Koutalos Y. Free magnesium concentration in salamander photoreceptor outer segments // J. Physiol. 2003. - V. 553. - P. 125135.

24. Dizhoor A.M., Lowe D.G., Olshewskaya E.V., Laura R.P., Hurley J.B. The human photoreceptor membrane guanilyl cyclase, RetGC, is present in outer segments and is regulated by calcium and a soluble activator // Neuron. 1994. -V. 12.-P. 1345-1352.

25. Dizhoor A.M., Hurley J.B. Inactivation of EF-hands makes GCAP-2 a constitutive activator of photoreceptor guanylyl cyclase by preventing a Ca -induced "activator to - inhibitor" transition // J. Biol. Chem. - 1996. - V. 271. - P. 19346-19350.

26. Erickson M.A., Lagnado L., Zozulya S., Neubert T.A., Stryer L., Baylor D.A. The effect of recombinant recoverin on the photoresponse of truncated rod photoreceptors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1998. V. 95. - P. 6474-6479.

27. Fain G.L., Shroder W.H. Calcium content and calcium exchange in dark-adapted toad rods // J. Physiol. 1985. - V. 368. - P. 641-665.

28. Fain G.L., Lamb TD, Matthews HR, Murphy RL. Cytoplasmic calcium as the messenger for light adaptation in salamander rods // J. Physiol. 1989. - V. 416. -P. 215-243.

29. Fain G.L., Matthews H.R., Cornwall M.C., Koutalos Y. Adaptation in vertebrate photoreceptors // Physiological Reviews. 2001. -V. 81.-P. 117-151.

30. Fesenko E.E., Kolesnikov S.S., Lyubarsky A.L. Induction by cyclic GMP of cationic conductance in plasma membrane of retinal rod outer segment // Nature. -1985.-V. 313.-P. 310-313.

31. Forti S., Menini A., Rispoli G., Torre V. Kinetics of phototransduction in retinal rods of the newt Triturus cristatus II J. Physiol. 1989. - V. 419. - P. 265295.

32. Gorczyca W.A., Polans A.S., Surgucheva I.G., Subbaraya I., Baehr W., Palczewski K. Guanylyl cyclase activating protein. A calcium-sensitive regulator of phototransduction// J. Biol. Chem. 1995. - V. 270. - P. 22029-22036.

33. Gordon S.E., Dowling-Park J., Zimmerman A.L. Modulation of the cGMP-gated ion channel in frog rods by calmodulin and an endogenous inhibitory factor // J. Physiol. 1995. - V. 486. - P. 533-546.

34. Govardovskii V.I., Calvert P.D., Arshavsky V.Y. Photoreceptor light adaptation. Untangling desensitization and sensitization // J. Gen. Physiol. 2000. -V. 116.-P. 791-794.

35. Graham C.H. Some fundamental data // In: Vision and vision perception. Ed. Graham C.H. New York, London, Sydney: John Wiley & Sons, Inc., - 1966. - P. 68-80.

36. Gray-Keller M.P., Detwiler P.B. The calcium feedback signal in the phototransduction cascade of vertebrate rods // Neuron. 1994. - V. 13. - P. 849861.

37. Hecht S., Shlaer S., Pirenne M.H. Energy, quanta, and vision // J. Gen. Physiol. 1942.-V. 25.-P. 819-840.

38. Hackos D.H., Korenbrot J.I. Divalent cation selectivity is a function of gating in native and recombinant cyclic nucleotide-gated ion channels from retinal photoreceptors // J. Gen. Physiol. 1999. - V. 113. - P. 799-817.

39. Hamer R.D., Tyler C.W. Phototransduction: modeling the primate cone flash response // Vis. Neurosci. 1995. - V. 12. - P. 1063-1082.

40. Hamer R.D. Computational analysis of vertebrate phototransduction: combined quantitative and qualitative modeling of dark- and light-adapted responses in amphibian rods // Vis. Neurosci. 2000. - V. 17. - P. 679-699.

41. Hamer R.D., Nicholas S.C., Tranchina D., Liebman P.A., Lamb T.D. Multiple phosphorylation of activated rhodopsin can account for the reproducibility of vertebrate rod single-photon responses // J. Gen. Physiol. 2003. - V. 122. - P. 419-444.

42. Haynes L.W., Kay A.R., Yau K.W. Single cyclic GMP-activated channel activity in excised patches of rod outer segment membrane // Nature. 1986. - V. 321.-P. 66-70.

43. Haynes L.W. Permeation and block by internal and external divalent cations of the catfish cone photoreceptor cGMP-gated channel // J. Gen. Physiol. 1995. - V. 106. - P. 507-523.

44. Hodgkin A.L., McNaughton P.A., Nunn B.J. Measurements of sodium-calcium exchange in salamander rods // J. Physiol. 1987. - V. 391. - P. 347-370.

45. Hodgkin A.L., Nunn B.J. The effect of ions on sodium-calcium exchange in salamander rods // J. Physiol. 1987. - V. 391. - P. 371-398.

46. Hsu Y.T., Molday, R.S. Modulation of the cGMP-gated channel of rod photoreceptor cells by calmodulin // Nature. 1993. - V. 361. - P. 76-79.

47. Huppertz B., Weyand I., Bauer P.J. Ca binding capacity of cytoplasmic proteins from rod photoreceptors is mainly due to arrestin // J. Biol. Chem. 1990. -V. 265.-P. 9470-9475.

48. Jones G.J. Light adaptation and the rising phase of the flash photocurrent of salamander retinal rods // J. Physiol. 1995. - V. 487. - P. 441-451.

49. Kamiyama Y., Ogura T., Usui S. Ionic current model of the vertebrate rod photoreceptor // Vision Res. 1996. - V. 36. - P. 4059-4068.

50. Karpen J.W., Brown R.L., Stryer L., Baylor D.A. Interactions between divalent cations and the gating machinery of cyclic GMP-activated channels in salamander retinal rods // J. Gen. Physiol. 1993. - V. 101. - P. 1-25.

51. Kawamura S. Rhopdopsin phosphorylation as a mechanism of cyclic GMP phosphodiesterase regulation by S-modulin // Nature. 1993. - V. 362. - P. 855857.

52. Kawamura S., Kuwata O., Yamada M., Matsuda S., Hisatomi O., Tokunaga F. Photoreceptor protein S26, a cone homologue of S-modulin in frog retina // J. Biol. Chem. 1996. - V. 271. - P. 21359-21364.

53. Kennedy M.J., Lee K.A., Niemi G.A., Craven K.B., Garwin G.G., Saari J.C., Hurley J.B. Multiple phosphorylation of rhodopsin and the in vivo chemistry underlying rod photoreceptor dark adaptation // Neuron. 2001. - V. 31. - P. 87101.

54. Klenchin V.A., Calvert P.D., Bownds M.D. Inhibition of rhodopsin kinase by recoverin. Further evidence for a negative feedback system in phototransduction // J. Biol. Chem. 1995. - V. 270. - P. 16147-16152.

55. Knopp A., Rueppel H. Ca2+ fluxes and channel regulation in rods of albino rat // J. Gen. Physiol. 1996. - V. 107. - P. 577-596.

56. Koch K.W., Stryer L. Highly cooperative feedback control of retinal rod guanylate cyclase by calcium ions // Nature. 1988. - V. 334. - P. 64-66.

57. Korenbrot J.I., Miller D.L. Cytoplasmic free calcium concentration in dark-adapted retinal rod outer segments // Vis. Research. 1989. - V. 29. - P. 939-948.

58. Koutalos Y., Nakatani K., Tamura T., Yau K.W. Characterization of guanilate cyclase activity in single retinal rod outer segments // J. Gen. Physiol. 1995. - V.106.-P. 863-890.

59. Koutalos Y., Nakatani K., Yau K.W. The cGMP phosphodiesterase and its contribution to sensitivity regulation in retinal rods // J. Gen. Physiol. 1995. - V. 106.-P. 891-921.

60. Koutalos Y., Yau K.W. Regulation of sensitivity in vertebrate rod photoreceptors by calcium // Trends Neurosci. 1996. V. 19. - P. 73-81.

61. Krispel C.M., Chen C.K., Simon M.I., Burns M.E. Novel form of adaptation in mouse retinal rods speeds recovery of phototransduction // J. Gen. Physiol. 2003. -V. 122.-P. 703-712.

62. Lagnado L., Cervetto L., McNaughton P.A. Ion transport by the Na-Ca exchange in isolated rod outer segments // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988. - V. 85. - P. 4548-4552.

63. Lagnado L., Cervetto L., McNaughton P.A. Calcium homeostasis in the outer segment of retinal rods from tiger salamander // J. Physiol. 1992. - V. 455. - P. 111-142.

64. Lagnado L., Baylor D.A. Calcium controls light-triggered formation of catalytically active rhodopsin //Nature. 1994. - V. 367. -P. 273-277.

65. Lamb T.D, Pugh E.N. A quantitative account of the activation steps involved inphototransduction in amphibian photoreceptors // J. Physiol. 1992. - V. 449. - P. 719-758.

66. Lasater E.M. Membrane properties of distal retinal neurons // Progress in retinal research. Ed. Osborne N., Chader. G. Oxford - New York - Seoul - Tokyo: Pergamon Press. - 1991. - V. 11. - Chapter 9. - P. 215-246.

67. Li J.D., Gallemore R., Govardovskii V.I., Steinberg R.H. Calcium gradients and light-evoked calcium changes outside rods in the intact cat retina // Visual Neurosci. 1994. -V. 11. - P. 753-761.

68. Lolley R.N., Racz E. Calcium modulation of cyclic GMP synthesis in rat visual cells // Vision Res. 1982. - V. 22. - P. 1481-1486.

69. Lyubarsky A., Nikonov S., Pugh E.N. The kinetics of inactivation of the rod phototransduction cascade with constant Ca2+ // J. Gen. Physiol. 1996. - V. 107.- P. 19-34.

70. Makino C.L., Dodd R.L., Chen J., Burns M.E., Roca A., Simon M.I., Baylor D.A. Recoverin regulates light-dependent phosphodiesterase activity in retinal rods // J. Gen. Physiol. 2004. - V. 123. - P. 729-741.

71. Matthews H.R., Murphy R.L.W., Fain G.L., Lamb T.D. Photoreceptor light adaptation is mediated by cytoplasmic calcium concentration // Nature. 1988. -V. 334. - P. 67-69.

72. Physiol. 1997. - V. 109. - P. 141-146.• 94

73. Matthews H.R., Fain G.L. A light-dependent increase in free Ca concentrationin the salamander rod outer segment // J. Physiol. 2001. - V. 532. - P. 305-321.

74. Matthews H.R., Cornwall M.C., Crouch R.K. Prolongation of actions of Ca2+ early in phototransduction by 9-demethylretinal // J. Gen. Physiol. 2001. - V. 118 -P. 377-390.

75. McCarthy S.T., Younger J.P., Owen W.G. Free calcium concentrations in bullfrog rods determined in the presence of multiple forms of Fura-2 // Biophys. J.- 1994. V. 67. - P. 2076-2089.

76. McCarthy S.T., Younger J.P., Owen W.G. Dynamic, spatially nonuniform calcium regulation in frog rods exposed to light // J. Neurophysiol. 1996. - V. 76. -P. 1991-2004.

77. McLaughlin S., Brown J. Diffusion of calcium ions in retinal rods: a theoretical calculation // J. Gen. Physiol. 1981. - V. 77. - P. 475-487.

78. Mendez A., Burns M.E., Roca A., Lem J., Wu L.W., Simon M.I., Baylor D.A., Chen J. Rapid and reproducible deactivation of rhodopsin requires multiple phosphorylation sites // Neuron. 2000. - V. 28. - P. 153-164.

79. Miller J.L., Korenbrot J.I. Kinetics of light-dependent Ca fluxes across the plasma membrane of rod outer segments // J. Gen. Physiol. 1987. - V. 90. - P. 397-425.

80. Miller J.L., Korenbrot J.I. Cytoplasmic free calcium concentration in dark-adapted retinal rod outer segments // Vision Res. 1989. - V. 29. - P. 939-948.

81. Miller J.L., Korenbrot J.I. Differences in calcium homeostasis between retinal rod and cone photoreceptors revealed by the effects of voltage on the cGMP-gated conductance in intact cells // J. Gen. Physiol. 1994. - V. 104. - P. 909-940.

82. Murnick J.G., Lamb T.D. Kinetics of desensitisation induced by saturating flashes in toad and salamander rods // J. Physiol. 1996. - V. 495. - P. 1-13.

83. Nakatani K., Yau K.W. Calcium and light adaptation in retinal rods and cones // Nature. 1988. - V. 334. - P. 69-71.

84. Nakatani K., Yau K.W. Calcium and magnesium fluxes across the plasma membrane of the toad rod outer segment // J. Physiol. 1988. - V. 395. - P. 695• 729.

85. Nakatani K., Koutalos Y., Yau K.W. Ca modulation of the cGMP-gated channel of bullfrog retinal rod photoreceptors // J. Physiol. 1995. - V. 484. - P. 69-76.

86. Nakatani K., Chen C., Koutalos Y. Calcium diffusion in rod photoreceptor outer segments // Biophys. J. 2002. - V. 82. - P. 728-739.

87. Nicholson C., Phillips J.M. Ion diffusion modified by tortuosity and volume fraction in the extracellular microenvironment of the rat cerebellum // J. Physiol. 1981.-V. 321.-P. 225-257.

88. Nikonov S., Encheta N., Pugh E.N. Kinetics of recovery of the dark-adapted salamander rod photoresponse // J. Gen. Physiol. 1998. - V. 111. - P. 7-37.

89. Nikonov S., Lamb T.D., Pugh E.N. The role of steady posphodiesterase activity in the kinetics and sensitivity of the light-adapted salamander rod photoresponse // J. Gen. Physiol. 2000. - V. 116. - P. 795-824.

90. Ohyama T., Hackos D.H., Frings S., Hagen V., Kaupp U.B., Korenbrot J.I. Fraction of the dark current carried by Ca through cGMP-gated ion channels of intact rod and cone photoreceptors // J. Gen. Physiol. 2000. - V. 116. - P. 735% 753.

91. Palczewski K., Polans A.S., Baehr W., Ames J.B. Ca2+-binding proteins in the retina: structure, function, and the etiology of human visual diseases // Bioessays. -2000.-V. 22.-P. 337-350.

92. Pepe I.M., Boero A., Vergani L., Panfoli I., Cugnoli C. Effect of light and calcium on cyclic GMP synthesis in rod outer segments of toad retina // Biochim. Biophys. Acta. 1986. -V. 889. - P. 271-276.

93. Pepperberg D.R., Cornwall M.C., Kahlert M., Hofmann K.P., Jin J., Jones G.J., Ripps H. Light-dependent delay in the falling phase of the retinal rod photoresponse // Vis. Neurosci. 1992. V. 8. - P. 9-18.

94. Perri R.J., McNaughton P.A. Response properties of cones from retina of the tiger salamander // J. Physiol. 1991. - V. 433. - P. 561-587.

95. Picones A., Korenbrot J.I. Permeability and interaction of Ca2+ with cGMP-gated ion channels differ in retinal rod and cone photoreceptors // Biophys J. -1995.-V. 69.-P. 120-127.

96. Ratto G.M., Payne R., Owen W.G., Tsien R.Y. The concentration of cytosolic free calcium in vertebrate rod outer segments measured with fura-2 // J. Neurosci. -1988.-V. 8,- P. 3240-3246.

97. Rebrik T.I., Kotelnikova E.A., Korenbrot J.I. Time course and Ca2+ dependence of sensitivity modulation in cyclic GMP-gated currents of intact cone photoreceptor // J. Gen. Physiol. 2000. - V.l 16. - 521-534.

98. Rebrik T.I., Korenbrot J.I. In intact mammalian photoreceptors, Ca2+-dependent modulation of cGMP-gated ion channels is detectable in cones but not in rods // J. Gen. Physiol. 2004. - V. 123. - P. 63-75.

99. Rieke F., Baylor D.A. Origin of reproducibility in the responses of retinal rods to single photons // Biophys. J. 1998. - V. 75. - P. 1836-1857.

100. Rispoli G., Sather W.A., Detwiler P.B. Visual transduction in dialysed detached rod outer segments from lizard retina // J. Physiol. 1993. - V. 465. -513-537.

101. Rodieck R.W. The first steps in seeing // Sunderland, MA: Sinaeur Associates, Inc. Publishers. 1998.

102. Sagoo M.S., Lagnado L. The action of cytoplasmic calcium on the cGMP-activated channel in salamander rod photoreceptors // J. Physiol. 1996. - V. 497. -P. 309-319.

103. Sagoo M.S., Lagnado L. G-protein deactivation is rate-limiting for shut-off of the phototransduction cascade // Nature. 1997. - V. 389. - P. 392-395.

104. Sampath A.P., Matthews H.R., Cornwall M.C., Fain G.L. Bleached pigment produces a maintained decrease in outer segment Ca2+ in salamander rods // J. Gen. Physiol. 1998. - V. 111. - P. 53-64.

105. Sampath A.P., Matthews H.R., Cornwall M.C., Bandarchi J., Fain G.L. Light-dependent changes in outer segment free-Ca2+ concentration in salamander cone photoreceptors // J. Gen. Physiol. 1999. - V. 113. - P. 267-277.

106. Schnetkamp P.P. Optical measurements of Na-Ca-K exchange currents in intact outer segments isolated from bovine retinal rods // J. Gen. Physiol. 1991. -V. 98.-P. 555-573.

107. Schnetkamp P.P., Szerencsei R.T. Intracellular Ca2+ sequestration and release in intact bovine retinal rod outer segments. Role in inactivation of Na-Ca+K exchange // J. Biol. Chem. 1993. - V. 268. - P. 12449-12457.

108. Schnetkamp P.P. How does the retinal rod Na-Ca+K exchanger regulate cytosolic free Ca2+? // J. Biol. Chem. 1995. - V. 270. - P. 13231-13239.

109. Sneyd J., Tranchina D. Phototransduction in cones: an inverse problem in enzyme kinetics // Bulletin of Mathematical Biology. 1989. - V. 51. - P. 749784.

110. Somlyo A.P., Walz B. Elemental distribution in Rana pipiens retinal rods: quantitative electron probe analysis // J. Physiol. 1985. - V. 358. - P. 183-195.

111. Torre V., Matthews H.R., Lamb T.D. Role of calcium in regulating the cyclic GMP cascade of phototransduction in retinal rods // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. -1986.-V. 83.-P. 7109-7113.

112. Tranchina D., Peskin C.S. Light adaptation in the turtle retina: embedding a parametric family of linear models in a single nonlinear model // Vis. Neurosci. -1988.-V. l.-P. 339-348.

113. Tranchina D., Sneyd J., Cadenas I.D. Light adaptation in turtle cones. Testing and analysis of a model for phototransduction // Biophys. J. 1991. - V. 60. - P. 217-237.

114. Woodruff M.L., Sampath A.P., Matthews H.R., Krasnoperova N.V., Lem J., Fain G.L. Measurement of cytoplasmic calcium concentration in the rods of wildtype and transducin knock-out mice // J. Physiol. 2002. - V. 542. - P. 843-854.

115. Yau K.W., Nakatani K. Electrogenic Na+-Ca2+ exchange in retinal rod outer segment // Nature. 1984. - V. 311. - P. 661-663.

116. Whitlock, G.G., Lamb, T.D. Variability in the time course of single photon responses from toad rods: Termination of rhodopsin's activity // Neuron. 1999. -V. 23.-P. 337-351.

117. Wen R., Oakley B. Ion-selective microelectrodes suitable for recording rapid changes in extracellular ion concentration // J. Neurosci. Meth. 1990. - V. 31. -P. 207-213.

118. Wilden U. Duration and amplitude of the light-induced cGMP hydrolysis in vertebrate photoreceptors are regulated by multiple phosphorylation of rhodopsin and by arrestin binding // Biochemistry. 1995. - V. 34. - P. 1446-1454.

119. Xu J, Dodd RL, Makino CL, Simon MI, Baylor DA, Chen J. Prolonged photoresponses in transgenic mouse rods lacking arrestin // Nature. 1997. - V. 389.-P. 505-509.

120. Zimmerman A.L., Baylor D.A. Cyclic GMP-sensitive conductance of retinal rods consists of aqueous pores // Nature. 1986. - V. 321. - P. 70-72.

121. Zimmerman A.L., Baylor D.A. Cation interactions within the cyclic GMP-activated channel of retinal rods from the tiger salamander // J. Physiol. 1992. -V. 449. - P. 759-783.