Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы выключения каскада фототрансдукции и световая адаптация в палочках лягушки

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы выключения каскада фототрансдукции и световая адаптация в палочках лягушки"

На правах рукописи

АСТАХОВА

Любовь Александровна

МЕХАНИЗМЫ ВЫКЛЮЧЕНИЯ КАСКАДА ФОТОТРАНСДУКЦИИ И СВЕТОВАЯ АДАПТАЦИЯ В ПАЛОЧКАХ ЛЯГУШКИ

03.00.13. - Физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

0034В2 173

Санкт-Петербург 2009

003462173

Работа выполнена в лаборатории эволюции органов чувств (заведующий - доктор биологических наук В.И. Говардовский) Учреждения Российской академии наук Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН (Санкт-Петербург).

Научный руководитель:

кандидат биологических наук М.Л. Фирсов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Е.В. Казначеева кандидат биологических наук К.В. Большаков

Ведущее учреждение:

Институт физиологии им. И.П.Павлова

Защита состоится /О марта 2009 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 002.127.01 при Учреждения Российской академии наук Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, по адресу:

194223 Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, д. 44, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН.

Автореферат разослан 05"февраля 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета доктор биологических наук, профессор

Общая характеристика работы Актуальность проблемы

Среди сигнальных каскадов сенсорных систем наиболее изученным является каскад зрительной трансдукции, благодаря которому поглощение кванта света приводит к генерации нервного импульса. Вторичным посредником в каскаде фототрансдукции является циклический гуанозинмонофосфат (цГМФ). Его концентрация в наружных сегментах фоторецепторных клеток зависит от активности двух ферментов противоположного действия: гуанилатциклаза (ГЦ) синтезирует цГМФ, а фосфодиэстераза (ФДЭ) его гидролизует. При воздействии света запускается цепь биохимических превращений, активирующих ФДЭ, вследствие чего уровень цГМФ в наружном сегменте фоторецептора падает, и ионные каналы плазматической мембраны закрываются. Первым звеном каскада является зрительный пигмент родопсин, который возбуждается при поглощении фотона; родопсин активирует в-белок трансдуцин, а он в свою очередь катализирует гидролитическую активность ФДЭ.

Способность фоторецепторной клетки отвечать на световые стимулы восстанавливается, когда концентрация цГМФ в наружном сегменте возвращается к исходному уровню. Поскольку активность ГЦ в первом приближении от света не зависит, для этого необходимо, чтобы активность ФДЭ снизилась до темнового уровня. Обязательным условием снижения активности ФДЭ является инактивация родопсина и трансдуцина. Активность родопсина в значительной степени снижается за счет его фосфорилирования и окончательно выключается при связывании родопсина с аррестином. Комплекс трансдуцин-ФДЭ инактивируется самопроизвольно, в силу присущей а-субъединице трансдуцина ГТФазной активности. Трансдуцин гидролизует связанный с ним ГТФ до ГДФ, после чего комплекс трансдуцин-ФДЭ распадается и ФДЭ ингибируется. Инактивация родопсина регулируется обратными кальциевыми связями, в

то время как инактивация комплекса трансдуцин-ФДЭ до сих пор считалась кальций-независимой.

- Очевидно, что скорости активации и инактивации ФДЭ при световой стимуляции являются ключевыми параметрами, определяющими скорость развития и выключения фотоответа. Значения этих параметров неоднократно определялись ранее в экспериментах in vitro, однако полученные величины, как правило, плохо согласуются со скоростью развития и выключения фотоответа в интактных клетках. Так, скорость гидролиза г ГТФ, измеренная в биохимическом эксперименте на очищенном трансдуцине, оказалась слишком низкой и не соответствовала скорости восстановления темнового тока после вспышки в фоторецепторах клетках in vivo (Arshavsky" et al., 1987). Аналогичные противоречия возникли, и ,в отношении оценки скорости инактивации родопсина. В физиологических ■ условиях выключение родопсина происходит за время меньше секунды, а определение скорости этого процесса in vitro дает результат в минутном диапазоне (Wilden & Kuhn, 1982; Gorodovikova et al., 1994).

На сегодняшний день кинетика этих процессов в интактных фоторецепторных клетках не определялась. Фактором, затрудняющим измерение этих- параметров в живом фоторецепторе, является наличие отрицательных обратных кальциевых, связей, которые жестко регулируют скорость выключения основных участников каскада,-в результате чего параметры реакции существенно меняются в 'ходе ее протекания. В данной' работе это препятствие было преодолено применением методики так ; называемого «кальциевого клампа» (фиксации внутриклеточной концентрации Са2+), которая в сочетании со специальным алгоритмом вычислений позволила восстановить временной ход активности ФДЭ после светового стимула. Знание кинетики активации и инактивации ФДЭ позволило, в свою очередь, определить кинетику выключения родопсина и трансдуцина. Применение же фиксации внутриклеточной концентрации

Са'+ на различных уровнях позволило нам проследить зависимость скоростей выключения родопсина и трансдуцина от кальция в интактной клетке. В результате нами был сделан вывод о зависимости скорости выключения трансдуцина от внутриклеточной концентрации кальция. Цель работы

Исследовать кинетику инактивации основных участников каскада фототрансдукции - родопсина и трансдуцина - в интактных фоторецепторных клетках в условиях темновой и световой адаптации. Задачи работы

1. При помощи метода «кальциевого клампа» определить динамику активности фосфодиэстеразы в палочках лягушки при подаче ненасыщающих световых стимулов в отсутствии кальциевых обратных связей.

2. Оценить влияние световой адаптации и сопряженных с ней изменений внутриклеточной концентрации кальция на скорости инактивации родопсина и трансдуцина.

3. Определить, какой из процессов инактивации каскада является лимитирующим для скорости выключения фотоответа палочек лягушки на насыщающие световые стимулы.

Научная новизна результатов исследования

В данной работе нами впервые исследована скорость активации и инактивации светоиндуцированной активности фосфодиэстеразы в интактных палочках лягушки в условиях пемновой и световой адаптации. Показано, что световая адаптация в палочках лягушки ускоряет не только выключение родопсина, но и инактивацию трансдуцина. При интенсивных фоновых засветках такое ускорение каждого из процессов выключения может быть более чем 6-кратным. Этот результат заставляет пересмотреть существующие до сих пор представления о том, что выключение

трансдуцина не зависит от внутриклеточной концентрации кальция и световой адаптации.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Скорость инактивации трансдуцина, как и скорость фосфорилирования родопсина, находится под контролем световой адаптации. При интенсивных фоновых засветках оба этих процесса могут ускоряться более чем в 6 раз.

2. Величина ускорения обоих процессов выключения каскада фототрансдукции позволяет полностью объяснить уменьшение чувствительности, наблюдаемое при интенсивных фоновых засветках.

3. Ни фосфорилирование родопсина, ни инактивация трансдуцина не лимитируют, скорость выключения фотоответа на насыщающие стимулы в палочках лягушки. Процесс, лимитирующий скорость выключения насыщенных фотоответов, может быть гипотетически отождествлен со связыванием родопсина с аррестином.

Теоретическая и практическая значимость работы

Подробное исследование кинетики процессов выключения каскада позволило углубить наше понимание молекулярных механизмов фототрансдукции в темновых и светоадаптированных условиях. Выявленные закономерности могут оказаться полезными и для понимания работы других сигнальных каскадов, которые изучены в меньшей степени, чем каскад фототрансдукции.

Апробация работы и публикации результатов исследования

Основные материалы диссертации были доложены и обсуждены на VI Международном симпозиуме «Visionarium VI» (Твярмине, Финляндия, 2007), XX Съезде физиологического общества им. Павлова, (Москва, 2007 г), Международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 2007), IV Европейском Форуме по Нейробиологии FENS (Женева, 2008).

По материалам диссертации опубликовано 3 тезисов докладов на российских и международных конференциях и 1 статья в рецензируемом международном журнале.

Струюура диссертации

Диссертация изложена на 112 страницах и состоит из введения, четырех глав (обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения результатов), выводов и списка литературы (включает 107 источников). Диссертация иллюстрирована 31 рисунком и 3 таблицами. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование проводили на изолированных палочках лягушки Rana ridihunda. Животные подвергались декапитации после адаптации в темноте в течение 12 часов. Глаза лягушек препарировались, затем из глазного бокала выделяли сетчатку, из которой готовили суспензию одиночных фоторецепторов. Все манипуляции проводились при тусклом красном свете и при инфракрасной подсветке.

Изучение работы каскада фототрансдукции проводили путем анализа токовых ответов на световые стимулы. Регистрация тока одиночных палочек проводилась при помощи всасывающей микропипетки (Baylor et al., 1979). Для изучения кинетики выключения компонентов каскада без вмешательства кальциевых обратных связей был применен метод «кальциевого клампа», т.е. фиксации концентрации Са2+ внутри наружного сегмента палочки в течение десятков секунд. Основная идея этого метода состоит во временном прекращении входящих в клетку и исходящих из клетки кальциевых потоков. Метод «кальциевого клампа» реализовывался при помощи системы быстрой смены растворов. Палочки во время экспериментов исходно находились в проточной камере с нормальным раствором Рингера (90 мМ NaCl, 2,5 мМ KCI, 1,6 мМ MgCl2, ЮмМ глюкозы, 1,05 мМ СаС12, 5 мМ NaHC03, 5 мМ HEPES, 0,05 мМ ЕДТА; 50 мг/л БСА); для записи фотоответов без вмешательства кальциевых обратных связей наружный сегмент палочки перемещали на 30-40 секунд в раствор «Са2+ -кламп» (90 мМ CholCl, ЮмМ

7

глюкозы, 0,04 мМ СаС12, 5 мМ CholHC03,5 мМ HEPES, 2 мМ ЕГТА; 50 мг/л БСА). В растворе «Са2+-кламп» расчетная концентрация свободного Са2+ составляла 3,4 нМ; натрий в этом растворе замещен холином (Chol). В растворе такого состава откачка кальция через Ка/Са,К-обменник блокируется, из-за отсутствия в омывающей среде ионов натрия; низкая концентрация, .кальция в наружной среде практически устраняет электрохимически^ градиент для кальция, в результате чего вход кальция в клетку также, прекращается. Основываясь на предположении о блокировке кальциевых обратных связей, по нормированным ответам вычислялся временной ход светоиндуцированной активности ФДЭ. Сначала из нормированного ответа вычислялся временной ход изменения концентрации цГМФ по формуле: .

сС (,) = (1 -^'-V' (1))

' - f Гшах

где cG(t) - концентрация цГМФ в наружном сегменте, ^/Ненормированный ответ, п - кооперативность каналов.

Изменение концентрации цГМФ происходит за счет его синтеза ГЦ (ait)), и его шдродиза ФДЭ (ßd+ß(t)):

(2)

^¡Ü = a(t)-lßä+ß(t)].cG(t) dt

где ad- темновая активность гуанилатциклазы, ßd- темновая активность ФДЭ и ß(t) - светоиндуцированная активность ФДЭ. В отсутствии кальциевых обратных связей ait ) -comt = a d ~ ß* Исходя из этого, светоиндуцированную активность ФДЭ вычисляли по формуле:

.......'7:

Измерение необходимого для расчетов параметра ßd проводили путем аппликации IBMX (изобутилметилксантина) и дальнейшей оценки изменения темнового тока (метод предложен Hodgkin & Nunn, 1988).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Измерение темповой активности ФДЭ

Параметр Д^ (темновая активность ФДЭ), необходимый для вычисления светоиндуцированной активности ФДЭ, определялся экспериментально для палочек лягушки К.псИЪипйа. Метод оценки Дг был основан на аппликации раствора с 1ВМХ, который ингибирует активность ФДЭ в палочках. Наблюдаемый при этом резкий рост темнового тока отражал собой нарастание [цГМФ]1П в результате его синтеза гуанилатциклазой (ГЦ). При условии постоянства внутренней концентрации кальция, скорость работы ГЦ в начальный период после аппликации 1ВМХ позволяет определить скорость работы ФДЭ в исходном темновом равновесном состоянии. Однако при росте [цГМФ]ш дополнительно открывается большое число каналов, через которые входит кальций, способный снижать активность ГЦ, что может приводить к недооценке ее исходной активности. Поэтому протокол эксперимента предусматривал перемещение палочки сначала в раствор «Са-кламп», а затем - на короткое время - в раствор «Са-кламп»+0,5 мМ 1ВМХ.

Изменение темнового тока определяется активностью ГЦ в степени п, где п - кооперативность катионных каналов. В настоящем исследовании мы принимали п=3; т.о., из начального участка изменения темнового тока извлекался кубический корень, а Д* вычисляли по углу наклона полученной прямой. Процедура определения Д* проиллюстрирована на Рис.1. Среднее значение Дг для 4 исследованных клеток составило 8,3±2,2 с"1.

Ьс

Рис.1. Экспериментальная оценка темновой активности ФДЭ (/у. а - запись насыщеннЬго ответа в растворе «Са-кламп» и последующее перемещение в «Са-кламп»+01.5 мМ 1ВМХ. б - подробно показан участок резкого роста темнового тока в ответ на аппликацию 1ВМХ. б - кривая, полученная из крйвой-Ьосле нормирования на величину насыщенного ответа и извлечения кубического корня, аппроксимирована прямой. Угол наклона аппроксимирующей кривой дает величину Д*.

Исследование временного хода светоиндуцированной активности ФДЭ

Для исследования временного хода светоиндуцированной активности ФДЭ палочки на короткое время (25-40 с) перемещались в раствор «Са2+-кламп», где регистрировался ответ на стимул малой интенсивности, а затем начальный участок ответа на стимул насыщающей интенсивности (начальный участок насыщенного ответа был необходим, чтобы определить темновой ток в растворе «Са2+-кламп» для последующей нормировки на него). На Рис.2а показан типичный ненасыщенный ответ, записанный в растворе «Са2+-кламп», и для сравнения на него наложен ответ на стимул

такой же интенсивности в нормальном растворе. На графике видно, что в условиях фиксированного внутриклеточного кальция ответ имеет большую амплитуду, максимум достигается позднее, а задний фронт его более пологий, чем у ответа в нормальном растворе Рингера. Все эти признаки характерны для отсутствия кальциевых обратных связей. Далее из ответов, полученных в растворе «Са2+-кламп», проводили вычисление светоиндуцированной активности ФДЭ по алгоритму, описанному в разделе «Материалы и методы» (уравнения (1) - (3)). На Рис.26 показана типичная кривая светоиндуцированной активности ФДЭ.

Рис.2, а - Ответы палочки на стимул одинаковой интенсивности в нормальном растворе Рингера (кривая 1) и в растворе «Са2+-кламп» (кривая 2). б - кривая светоиндуцированной активности ФДЭ, вычисленная из ответа (2), записанного в условиях «Са2+-клампа».

Для количественного описания кривых светоиндуцированной активности ФДЭ проводилась их аппроксимация различными способами. Можно предположить, что простейшее описание волны активности ФДЭ при ответе на световую вспышку (см. Рис.3) должно выражаться разностью двух экспонент вида:

У( О = А

ехр( - ^—- ехр( - ^—'А т. г,

(4),

где А - коэффициент пропорциональности, 1о - задержка, Т1 и т2 - постоянные времени процессов выключения каскада.

R* ЕЕ2=£> Ta-GTP PDE* edsesS»

PDE(t)= exp(-t/ Ti) -expf-t/тг)

exp(-t/ ri)

exp(-t/ T2)

Рис.3. Схема активации и инактивации ФДЭ при ответе палочки на одиночный световой стимул. Родопсин (R*) активируется, а затем выключается в простейшем предположении по одноэкспоненциальному закону с постоянной времени Т]. Трансдуцин (Т) выключается также по одноэкспоненциальному закону с постоянной времени т2. Вся кривая активности ФДЭ формируется этими двумя процессами выключения и может быть описана разностью двух экспоненциальных функций с постоянными времени Т] и т2. Обозначения: R* - возбужденный родопсин, Та - а-субъединица трансдуцина, GTP - гуанозинтрифосфат, PDE -фосфодиэстераза, ть х2 - постоянные времени процессов выключения.

Некоторые полученные кривые активности ФДЭ при подгонке их двухэкспоненциальной функцией (4) демонстрировали хорошее качество такой аппроксимации {Рис. 4а), но для большинства кривых не удавалось найти хорошую двухэкспоненциальную аппроксимацию. На рис. 46 показан пример того, когда предложенная программой Slide в качестве наилучшей двухэкспоненциальная подгонка является совершенно

неудовлетворительной. Поскольку к большинству кривых светоиндуцированной активности ФДЭ было невозможно применить адекватную двухэкспоненциальную подгонку, задний фронт кривых аппроксимировали одноэкспоненциальной функцией (см. Рис.4в). Как и в данном примере, задний фронт всех анализируемых кривых ФДЭ хорошо описывался одной экспонентой. Важно отметить, что задний фронт кривой ФДЭ всегда формируется самым медленным процессом, следовательно, т3.ф.

позволяет охарактеризовать наиболее медленный процесс выключения ненасыщенного ответа. Среднее значение т3.ф. составило 1,5±0,6 с (N=7).

Рис.4. Аппроксимация кривых светоиндуцированной активности ФДЭ разными способами. а - пример удачной аппроксимации двухэкспоненциальной функцией вида /?(0 = А ■ (ехр(Чг - /0) / т,) ~ ехр(—(/ - г0) / г2)). б - пример неадекватной аппроксимации двухэкспоненциальной функцией другой кривой ФДЭ (такая ситуация наблюдалась для большинства кривых ФДЭ); в - подгонка заднего фронт той же кривой {б) одноэкспоненциальной функцией вида /?(/)= С -ехр( -(/ - /0)/г).

Анализ кривых активности ФДЭ в условиях световой адаптации (при фоновых засветках)

Для оценки влияния световой адаптации на процессы выключения каскада фототрансдукции метод «Са2' -клампа» был также применен в условиях фоновых засветок разной интенсйвности. На папочку подавали непрерывный фоновый свет, закрывающий от 10% до 75% каналов наружного сегмента, а затем, не выключая фоновой засветки, перемещали на несколько десятков секунд в раствор «Са2+-кламп». Таким образом [Са2+]щ фиксировался на новом, более низком уровне,' соответствующем определенной степени световой адаптации, причем степень световой адаптации прямо пропорционально зависела от интенсивности подаваемой фоновой засветки.

На Рис.5 показана кривая активности ФДЭ, полученная в условиях фоновой засветки, наложенная на темновую кривую ФДЭ для той же палочки. Этот график демонстрирует типичную картину - все полученные в условиях фоновых засветок кривые ФДЭ значительно ускорялись относительно «темновых» кривых ФДЭ для тех же клеток.

Рис. 5. Кривая светоиндуцированной активности ФДЭ, полученная в условиях световой адаптации (фоновая засветка закрывала 25% каналов наружного сегмента) (1), наложена для сравнения на «темновую» кривую активности ФДЭ (2).

Большинство кривых активности ФДЭ, полученных как в темновых, так и в светоадаптированных условиях, не поддавалось аппроксимации единой функцией для всей кривой. Поэтому для оценки изменений кинетики процессов выключения под действием световой адаптации проводили индивидуальное сравнение передних и задних фронтов темновых и светоадаптированных кривых. Такой анализ проиллюстрирован на Рис.6. Для заднего фронта сравнивались значения постоянной времени экспоненты нисходящего участка (б). Поскольку передние фронты кривых ФДЭ не описываются простыми функциями, для оценки их ускорения определялось время полунарастания кривой до максимума (^.з)- Такой анализ показал, что при переходе от темновых условий к условиям световой адаптации происходит ускорение как переднего, так и заднего фронта кривых ФДЭ,

1.2

1

причем кривые ускоряются тем больше, чем выше интенсивность фоновой засветки.

Рис.6. Оценка ускорения переднего и заднего фронтов кривых ФДЭ при переходе от темновых к светоадаптированным условиям, а - оценка времени «полунарастания» кривой ФДЭ (^.г) (черная кривая - темновые условия, темно-серая — фоновая засветка, закрывающая 36% каналов, светло-серая -фоновая засветка, закрывающая 73% каналов); б - сравнение постоянных времени экспоненты, описывающей задний фронт кривых (т3.ф.).

В анализ темновых и светоадаптированных кривых ФДЭ были включены 7 клеток. У всех этих клеток было отмечено ускорение переднего и заднего фронтов кривых активности ФДЭ, в соответствии с примером на Рис.6. Обобщенные данные по ускорению переднего и заднего фронтов кривых ФДЭ по всем протестированным клеткам представлены на Рис. 7. Видно, что передние фронты имеют тенденцию ускоряться при световой адаптации в большей степени, чем задние фронты кривых ФДЭ

Рис.7. Зависимость ускорения переднего и заднего фронта кривых активности ФДЭ от интенсивности фоновой засветки. Каждая точка представляет собой среднее значение по всем исследованным клеткам±СО. Ускорение выражено как число раз относительно темновых кривых ФДЭ для каждой клетки. Обозначения: 1ТемнЯф0н - отношение темнового тока палочки к току, протекающему при фоновой засветке.

Таким образом, анализ влияния фоновой засветки на кинетику инактивации ФДЭ показал, что у всех тестируемых клеток при световой адаптации ускоряется как передний, так и задний фронт кривых ФДЭ. Это свидетельствует о том, что оба процесса выключения каскада -фосфорилирование родопсина и инактивация трансдуцина - ускоряются при переходе к условиям световой адаптации. Ранее считалось, что при фоновых засветках ускоряется только выключение родопсина, поскольку установленным является тот факт, что снижающаяся при фоновых засветках внутриклеточная концентрация кальция [Са2+];„ регулирует работу родопсинкиназы, фосфорилирующей родопсин (Макто еЬ а1., 2004). В то же время до сих пор преобладало мнение о том, что скорость выключения трансдуцина не зависит от [Са2+]щ и наличия фоновой засветки (ЬуиЬагеку е1 а1., 1996). Однако результаты настоящего исследования указывают на то, что в палочках лягушки скорость выключения трансдуцина также зависит от наличия фоновой засветки.

Критическая постоянная времени выключения каскада т0

Одной из задач данного исследования было сопоставить скорости процессов, формирующих кривую светоиндуцированной активности ФДЭ, с критической постоянной времени т0, вычисляемой по наклону так называемой кривой Пепперберга. При анализе Пепперберга записывается набор насыщенных ответов палочки на стимулы возрастающей интенсивности, и далее строится зависимость времени пребывания ответа в насыщении от логарифма интенсивности стимула. Пример построения кривой Пепперберга для палочки лягушки показан на Рис.8.

20%

у = 1.901д(х) + 24.05

0.0001 |д(интенсивность)

0.001

Рис.8. Набор насыщенных ответов на стимулы возрастающей интенсивности (а), и построенная в результате их анализа кривая Пепперберга (б). На графике а толстой черной линией указан критерий для определения времени пребывания ответа в насыщении (20% восстановления).

Среднее значение т0 для девяти, клеток, у которых был проведен анализ Пепперберга, составило 1,8±0,4 с. Мы сравнили полученное значение ти с постоянной времени заднего фронта темновьгх кривых ФДЭ (т3.ф), соответствующей скорости самого медленного процесса выключения ненасыщенного фотоответа. Среднее значение т3.ф. (1,5±0,6 с) и среднее т0 (1,8±0,4 с) статистически неразличимы. Однако поведение кривых Пепперберга в условиях фоновых засветок (см. Рис.9) свидетельствует о том,

что скорость процесса выключения каскада, соответствующего т0, не изменяется при фоновых засветках, поскольку наклон кривых Пепперберга остается постоянным.

0.00001 0.0001 0.001 0.01 0.1 1д (интенсивность)

ф 3

и га х о к г о а а

♦ темнота

Фоновая Д Фоновая

засветка 47%

засветка 73%

Рис.9. Кривые Пепперберга, снятые на одной палочке в темноте и при двух фоновых засветках различной интенсивности. Полученные значения тр приведены на графике.

Хотя при включении фоновых засветок наклон кривых Пепперберга не изменяется, происходит параллельный сдвиг кривых вправо, который отражает собой уменьшение чувствительности фоторецептора. Так на Рис.9. фоновая засветка, закрывающая 47% каналов, привела к сдвигу кривой приблизительно на 1,3 порядка («20-кратное падение чувствительности), а фоновая засветка, закрывающая, 73% каналов, - к сдвигу на 1,9 порядка (~80-кратное падение чувствительности). Уменьшение чувствительности фоторецептора может происходить либо при уменьшении коэффициента усиления каскада фототрансдукции, либо за счет ускорения выключения каскада. Чтобы определить, изменяется ли коэффициент усиления при

переходе от темновых к светоадаптированным условиям, был проведено сравнение начальной фазы насыщенных ответов, записанных в темноте и при разных фоновых засветках (Рис. 10). Результат анализа данных показал, что коэффициент усиления не меняется при переходе от темноты к фоновым засветкам. Следовательно, изменение чувствительности может полностью объясняться ускорением процессов выключения/Наши данные о том, что оба процесса выключения при фоновых засветках ускоряются максимально до 47, раз хорошо согласуются с таким существенным уменьшением чувствительности при адаптации к ярким фоновых засветкам (до 80 раз) и позволяют полностью его объяснить.

Л □ а о „ □

♦ темнота д фоновая засветка 45% и фоновая засветка 73%

0.15

t, с

Рис.10. Сравнение коэффициента* усиления каскада в темновых условиях и в условиях световой адаптации. Наложены начальные участки нормированных насыщенных ответов на стимул одинаковой интенсивности в темновых условиях и при двух разных фоновых засветках. Экспериментальные кривые

аппроксимированы функцией /(r) = 1 - ехр( -—'■-—-(/ - i0)2), где Int -

интенсивность стимула, to - задержка развития ответа, а - коэффициент усиления каскада.

Таким образом, в палочках лягушки при световой адаптации наряду с фосфорилированием родопсина ускоряется также и инактивация трансдуцина. Вопрос о механизме, посредством которого световая адаптация

может влиять на время жизни активного трансдуцина, остается не выясненным. Одной из возможных мишеней может служить комплекс ГЮ89-1, который ускоряет гидролиз ГТФ на а-субъединице трансдуцина (Та), поскольку в литературе имеются данные о том, что фосфорилирование комплекса 13X389-1 регулируется ионами Са2+ (ВакэиЬгаташап е1 а1., 2001), а также, что степень фосфорилирования 1Ш89-1 уменьшается на свету (Wensel, 2002).

Открытым также остается вопрос о том, какому процессу соответствует критическая постоянная времени выключения насыщенных ответов тс в палочках лягушки. Наши данные указывают на то, что ни фосфорилирование родопсина, ни инактивация трансдуцина не могут быть отождествлены с ти, поскольку оба они ускоряются при фоновых засветках, а тс остается неизменной. Возможное объяснение может состоять в том, что то соответствует скорости связывания фосфорилированного родопсина с аррестином. В этом случае можно предположить такую схему: при интенсивностях ниже насыщающих вклад связывания родопсина с аррестином в формирование волны фотоответа очень мал, он не лимитирует выключения ответа, а формирует низкоамплитудный «хвост» кривых активности ФДЭ. Основной же вклад в формирование волны ненасыщенных фотоответов вносят фосфорилирование родопсина и инактивация трансдуцина. Когда интенсивность стимулов увеличивается и ответы становятся насыщенными, два основных процесса выключения успевают завершиться до того, как клетка выйдет из насыщения. Тогда критической становится скорость связывания родопсина с аррестином, и именно она определяет величину тр. В настоящее время процесс связывания аррестина с родопсином считается кальций-независимым, что хорошо согласуется с независимостью наклона кривой Пеппероерга от световой адаптации.

выводы

1. В палочках лягушки под контролем световой адаптации находится не только скорость фосфоршшрования возбужденного родопсина, но и скорость выключения трансдуцина.

2. Максимальное наблюдаемое в экспериментах ускорение каждого из этих двух процессов составляет 6,5 раз, что позволяет полностью объяснить десенсетизацию, наблюдаемую в палочках лягушки при фоновых засветках.

3. Скорость процесса, лимитирующего выключение насыщенных ответов, не изменяется при световой адаптации. Ни фосфорилирование родопсина, ни инактивация трансдуцина не лимитируют выключение насыщенных ответов в палочках лягушки. Гипотетически лимитирующим процессом для выключения насыщенных ответов является связывание аррестина с родопсином.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Астахова Л.А. Фирсов М.Л., Говардовский В.И. фосфорилирование родопсина и выключение трансдуцина, - лимитируют ли они скорость выключения каскада фототрансдукции?//Тез. докладов XX съезда физиологического общества им. И.П.Павлова. - Москва. - 2007. - С. 13.

2. Астахова Л.А., Фирсов М.Л., Говардовский В.И. Кинетика инактивации родопсина и трансдуцина in vivo в палочках лягушки R.ridibunda.//Te3. докладов международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». - Пущино. - 2007. - С. 147-149.

3. Astakhova L.A., Firsov M.L, Govardovskii V.l. Both Rhodopsin and transdusin shut-offs are under light adaptation control in frog rods.// 6th FENS Abstr. - Geneva (Switzerland). - 2008. - V.4 - 054.2

4. Astakhova L.A., Firsov M.L., Govardovskii V.l. Kinetics of turn-offs of frog rod phototransduction cascade.// J Gen Physiol. - 2008. - V.132. - P. 587-

Подписано в печать 29.01.2009. Формат 60x84/16 Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии ЗАО «КопиСервис». Печать ризографическая. Заказ № 1/0129. : П. д. 1.0. Уч.-изд. л. 1.0. Тираж 70 экз.

ЗАО «КопиСервис» Адрес: 197376, Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, д. 3. тел.: (812) 327 5098

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Астахова, Любовь Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы.

Цель и задачи исследования.

Основные положения, выносимые на защиту.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Апробация работы и публикации результатов исследования.

Глава 1. Обзор литературных данных.

1.1. Структура фоторецепторов.

1'.2.Механизм фототрансдукции.

1.3. Усиление сигнала в каскаде фототрансдукции.

1.4.Механизмы выключения каскада фототрансдукции.

1.5. Общие представления о световой адаптации фоторецепторов.

1.6. Роль кальция в световой адаптации.

1.7. Обмен кальция между наружным сегментом фоторецепора и окружающей средой в темноте и на свету.

1.8. Мишени, на которые влияет изменение концентрации кальция в наружном сегменте фоторецептора.

1.9. Феномен световой адаптации фоторецепторов.

1.10. Поиск дополнительных механизмов регуляции фототрансдукции.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Экспериментальный материал.

2.2. Экспериментальная установка.

2.3. Изготовление микропипеток.

2.4.Поиск и фиксация одиночных палочек в микропипетке.

2.5.Система световой стимуляции.:.

2.6. Программа для управления стимуляцией и записи ответов.

2.7.Первичная обработка результатов.

2.8.Система быстрой смены омывающего раствора.

2.10. Методика кальциевого клампа. Состав растворов.

2.11. Метод вычисления временного хода активности ФДЭ из нормированного клампированного ответа.

2.12. Измерение темновой активности фосфодиэстеразы.

Глава 3. Результаты.

3.1. Измерение темновой активности ФДЭ.

3.2.Проверка качества фиксации внутриклеточной концентрации кальция.

3.3.Исследование временного хода светоиндуцированной активности ФДЭ.

3.3.1 Протокол эксперимента.

3.3.2. Выбор значения кооперативное™ каналов для расчетов.

3.3.3. Анализ кривых светоиндуцированной активности ФДЭ в темновых условиях (в отсутствии фоновых засветок).

3.3.4 Особенности экспериментальной процедуры и вычислений при извлечении кривых активности ФДЭ в условиях световой адаптации (при фоновых засветках).

3.3.5 Анализ кривых активности ФДЭ в условиях световой адаптации (при фоновых засветках).•.

3.4. Измерение критической постоянной времени выключения каскада то.

3.4.1 Критическая постоянная времени выключения каскада td в темновых условиях '

3.4.2 Анализ кривых Пепперберга и критической постоянной времени то в условиях фоновых засветок.

3.5. Независимость коэффициента усиления от световой адаптации.

Глава 4. Обсуждение.

4.1 Эффективность клампирования внутриклеточной концентрации кальция.

4.2 Ускорение инактивации родопсина и выключения трансдуцина при световой адаптации.

4.3 Критическая постоянная времени то не соответствует ни фосфорилированию родопсина, ни инактивации трансдуцина в палочках лягушки.

4.4 Ускорение инактивации трансдуцина и снижение чувствительности при фоновых засветках.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы выключения каскада фототрансдукции и световая адаптация в палочках лягушки"

Актуальность проблемы

Среди сигнальных каскадов сенсорных систем наиболее изученным является каскад зрительной трансдукции, благодаря которому поглощение кванта света приводит к генерации нервного импульса. Считается, что основные компоненты этого каскада и их взаимосвязи уже известны. Поглощение квантов света молекулами родопсина запускает цепь биохимических реакций, вследствие которых происходит гиперполяризация фоторецепторной клетки. Вторичным посредником в этом сигнальном пути является циклический гуаназинмонофосфат (цГМФ). Его концентрация в наружных сегментах фоторецепторных клеток зависит от активности двух ферментов, имеющих противоположные функции: гуанилатциклаза (ГЦ) синтезирует цГМФ, а фосфодиэстераза (ФДЭ) его гидролизует. При воздействии света запускается цепь биохимических превращений, активирующих ФДЭ, вследствие чего уровень цГМФ в наружном сегменте фоторецептора падает, и ионные каналы плазматической мембраны закрываются. Первым звеном каскада является зрительный пигмент родопсин, который возбуждается при поглощении фотона; родопсин активирует О-белок трансдуцин, а он, в свою очередь катализирует гидролитическую активность ФДЭ.

Способность фоторецепторной клетки отвечать на световые стимулы может восстановиться только в том случае, если концентрация цГМФ в наружном сегменте вернется к исходному уровню. Для этого необходимо, чтобы уровень активности ФДЭ пришел к темновому уровню, а для этого должны быть инактивированы родопсин и трансдуцин. Активность родопсина в значительной степени снижается за счет его фосфорилирования и окончательно выключается при связывании родопсина с аррестином. Комплекс трансдуцин-ФДЭ инактивируется, когда трансдуцин гидролизует ГТФ до ГДФ. Инактивация каскада и восстановление темнового уровня тока регулируется обратными связями, опосредуемыми внутриклеточной концентрацией кальция.

Таким образом, скорости активации и инактивации ФДЭ при световой стимуляции являются ключевыми параметрами, определяющими скорость развития и выключения фотоответа. Однако на сегодняшний день практически величины этих параметров не определены в физиологических условиях (т.е. в интактных фоторецепторных клетках). Определение скоростей активации и выключения ФДЭ в условиях in vitro дает значения, которые плохо согласуются со скоростью развития и выключения фотоответа в интактных клетках. Так, скорость гидролиза ГТФ, измеренная в биохимическом эксперименте на очищенном трансдуцине, оказалась слишком низкой и не соответствует скорости восстановления темнового тока после вспышки в фоторецепторных клетках in vivo. (Arshavsky et al., 1987).

Аналогичные противоречия возникли и в отношении оценки скорости инактивации родопсина. В физиологических условиях выключение родопсина происходит за время меньше секунды, а определение скорости этого процесса in vitro дает результат в минутном диапазоне (Wilden & Kuhn, 1982; Gorodovikova et al., 1994).

В связи с этим для дальнейшего углубления знаний о работе каскада фототрансдукции представляется важным определение параметров инактивации родопсина и трансдуцина в интактных фоторецепторных клетках. Фактором, который затрудняет измерение этих параметров в живой фоторецепторной клетке, является наличие отрицательных обратных кальциевых связей, которые жестко регулируют скорость выключения основных участников каскада. В данной работе была применена методика так называемого «кальциевого клампа» (т.е. фиксации внутриклеточного уровня Са2+), которая в сочетании со специальным алгоритмом вычислений позволила восстановить временной ход активности ФДЭ после световой вспышки. А кривая светоиндуцированной активности ФДЭ в свою очередь определяется кинетикой выключения родопсина и трансдуцина.

Цель и задачи исследования

Цель данной работы состояла в исследовании скоростей инактивации основных участников каскада фототрансдукции — родопсина и трансдуцина -в интактных клетках; для этого решались следующие задачи:

1. При помощи метода кальциевого клампа оценить параметры кривых активности ФДЭ в палочках лягушки при подаче ненасыщающих световых стимулов в отсутствии кальциевых обратных связей.

2. Выяснить, каким образом влияет световая адаптация и сопряженные с ней изменения внутриклеточного уровня кальция на скорости инактивации родопсина и трансдуцина.

3. Определить, какой из процессов инактивации каскада является лимитирующим для скорости выключения фотоответа палочек лягушки на насыщающие световые стимулы.

В данной работе нами впервые исследована скорость активации и инактивации светоиндуцированной активности фосфодиэстеразы в интактных палочках лягушки в условиях- темновой и световой адаптации. Показано, что световая адаптация в палочках лягушки ускоряет не только выключение родопсина, но и инактивацию трансдуцина. При интенсивных фоновых засветках такое ускорение каждого из процессов выключения может быть более чем шестикратным. Этот результат заставляет пересмотреть существующие до сих пор представления о том, что выключение трансдуцина не зависит от внутриклеточной концентрации кальция и световой адаптации.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Скорость инактивации трансдуцина, как и скорость фосфорилирования родопсина, находится под контролем световой адаптации. При интенсивных фоновых засветках оба этих процесса могут ускоряться более чем в 6 раз.

2. Величина ускорения обоих процессов выключения каскада фототрансдукции позволяет полностью объяснить уменьшение чувствительности, наблюдаемое при интенсивных фоновых засветках.

3. Ни фосфорилирование родопсина, ни инактивация трансдуцина не лимитируют скорость выключения фотоответа на насыщающие стимулы в палочках лягушки. Процесс, лимитирующий скорость выключения насыщенных фотоответов, может быть гипотетически отождествлен со связыванием родопсина с аррестином.

Теоретическая и практическая значимость работы

Подробное исследование кинетики процессов выключения каскада позволило углубить наше понимание молекулярных механизмов фототрансдукции в темновых и светоадаптированных условиях. Выявленные закономерности могут оказаться полезными и для понимания работы других сигнальных каскадов, которые изучены в меньшей степени, чем каскад фототрансдукции.

Апробация работы и публикации результатов исследования

Основные материалы диссертации были доложены и обсуждены на следующих научных конференциях:

• VI Международном симпозиуме «Visionarium VI» (Твярмине, Финляндия, 2007)

• XX Съезде физиологического общества им. Павлова, (Москва, 2007 г)

• Международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 2007).

• VI Европейском Форуме по Нейробиологии FENS (Женева, 2008). 7

По материалам диссертации опубликовано 3 тезисов докладов на российских и международных конференциях и 1 статья в Journal of General Phisiology.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Астахова, Любовь Александровна

Выводы

1. В палочках лягушки под контролем световой адаптации находится не только скорость фосфорилирования возбужденного родопсина, но и скорость выключения трансдуцина.

2. Максимальное наблюдаемое в экспериментах ускорение каждого из этих двух процессов составляет 6,5 раз, что позволяет полностью объяснить десенсетизацию, наблюдаемую в палочках лягушки при фоновых засветках.

3. Скорость процесса, лимитирующего выключение насыщенных ответов, не изменяется при световой адаптации. Ни фосфорилирование родопсина, ни инактивация трансдуцина не лимитируют выключение насыщенных ответов в палочках лягушки. Гипотетически лимитирующим процессом для выключения насыщенных ответов является связывание аррестина с родопсином.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Астахова, Любовь Александровна, Санкт-Петербург

1. Ames JB, Dizhoor AM, Ikura M, Palczewski К, Stryer L. Three-dimensional structure of guanylyl cyclase activating protein-2, a calcium-sensitive modulator of photoreceptor guanylyl cyclases.// J Biol Chem. 1999 Jul 2;274(27): 19329-19337

2. Arshavsky VYu , Antoch MP, Philippov PP. On the role of transducin GTPase in the quenching of a phosphodiesterase cascade of vision.// FEBS Lett. 1987. 224(1): 19-22

3. Arshavsky VYu, Bownds MD. Regulation of deactivation of photoreceptor G protein by its target enzyme and cGMP.//Nature. 1992 357:416-7.

4. Arshavsky Vyu, Lamb TD, Pugh EN. G-proteins and phototransduction.// Annu Rev Physiol. 2002;64:153-87. Review

5. Baylor D.A., Lamb T.D. Yau K.-W. The membrane current of single rod outer segment. //J. Phisiolog., 1979. V.288 p. 589-611.

6. Baylor DA, Lamb TD, Yau KW. Responses of retinal rods to single photons.// J Physiol. 1979. 288:613-634.

7. Baylor DA, Nunn BJ, Schnapf JL. The photocurrent, noise and spectral sensitivity of rods of the monkey Macaca fascicularis. //J Physiol. 1984. 357:575-607.

8. Bennett N, Sitaramayya A. Inactivation of photoexcited rhodopsin in retinal rods: the roles of rhodopsin kinase and 48-kDa protein (arrestin). Biochemistry. 1988 Mar 8;27(5): 1710-5.

9. Berstein G, Blank JL, Jhon DY, Exton JH, Rhee SG, Ross EM. Phospholipase C-beta 1 is a GTPase-activating protein for Gq/11, its physiologic regulator.//Cell. 1992;70:411-8.

10. Burns ME, Mendez A, Chen J, Baylor DA. Dynamics of Cyclic GMP Syntesis in retinal rods. // Neuron. 2002 36:81-91.

11. Calvert PD, Govardovskii VI, Arshavsky VY & Makino CL. Two temporal phases of light adaptation in retinal rods. //J.Gen.Physiol. 2002. 119, 129145.

12. Cervetto L, Lagnado L, Perry RJ, Robinson DW, McNaughton PA. Extrusion of calcium from rod outer segments is driven by both sodium and potassium gradients.//Nature. 1989. 337:740-743

13. Chen CK, Burns ME, He W, Wensel TG, Baylor DA, Simon MI. Slowed recovery of rod photoresponse in mice lacking the GTPase accelerating protein RGS9-1.// Nature. 2000 403:557-60

14. Chen CK, Inglese J, Lefkowitz RJ, Hurley JB. Ca(2+)-dependent interaction of recoverin with rhodopsin kinase. //J Biol Chem. 1995; 270:18060-18066.

15. Chen J., Makino CL, Peachey NS, Baylor DA and Simon MI. Mechanism of rodopsin inactivation in vivo as revealed by COOH-terminal truncation mutant.//Science 267: 374-377, 1995

16. Dizhoor AM, Hurley JB. Regulation of Photoreceptor Membrane Guanylyl Cyclases by Guanylyl Cyclase Activator Proteins. //Methods. 1999; 19:521531.

17. Dizhoor AM, Lowe DG, Olshevskaya EV, Laura RP, Hurley JB. The human photoreceptor membrane guanylyl cyclase, RetGC, is present in outer segments and is regulated by calcium and a soluble activator. //Neuron. 1994;12:1345-52

18. Dizhoor AM, Olshevskaya EV, Henzel WJ, Wong SC, Stults JT, Ankoudinova I, Hurley JB. Cloning, sequencing, and expression of a 24104kDa Ca(2+)-binding protein activating photoreceptor guanylyl cyclase. //J Biol Chem. 1995; 270:25200-25206.

19. Dizhoor AM, Ray S, Kumar S, Niemi G, Spencer M, Brolley D, Walsh KA, Philipov PP, Hurley JB, Stryer L. Recoverin: a calcium sensitive activator of retinal rod guanylate cyclase. //J Biol Chem. 1994 Nov 25;269(47):29765-70

20. Doan T, Mendez A, Detwiler PB, Chen J, Rieke F. Multiple phosphorylation sites confer reproducibility of the rod's single-photon responses. //Science. 2006; 313:530-533.

21. Erickson MA, Lagnado L, Zozulya S, Neubert TA, Stryer L, Baylor DA. The effect of recombinant recoverin on the photoresponse of truncated rod photoreceptors .//Proc Natl Acad Sci USA. 1998;95:6474-6479

22. Fain GL and Schroder WH. Calcium content and calcium exchange in dark-adapted toad rods// J Physiol. 1985 November; 368: 641-665.

23. Fain GL, Lamb TD, Matthews HR, Murphy RL. Cytoplasmic calcium as the messenger for light adaptation in salamander rods.//J Physiol. 1989 Sep;416:215-43.

24. Fain GL, Lamb TD, Matthews HR, Murphy. Cytoplasmic calcium as the messenger for light adaptation in salamander rods.// J Physiol. 1989; 416:215-43.

25. Fain GL, Matthews HR, Cornwall MC, Koutalos Y. Adaptation in vertebrate photoreceptors./ZPhysiol Rev. 2001.81:117-151. Review.

26. Fesenko EE, Kolesnikov SS and Lyubarsky AL. Induction by cyclic GMP of cationic conductance in plasma membrane of retinal rod outer segment.//Nature 313: 310-313. 1985

27. Fesenko EE, Kolesnikov SS, Lyubarsky AL. Direct action of cGMP on the conductance of retinal rod plasma membrane.//Biochim Biophys Acta. 1986 Apr 25;856(3):661-71

28. Firsov ML, Kolesnikov AV, Golobokova EY, Govardovskii VI. Two realms of dark adaptation.//Vision Res. 2005 Jan;45(2): 147-51.

29. Frins S, Bonigk W, Mtiller F, Kellner R, Koch K-W. Functional Characterization of a Guanylyl Cyclase-activating Protein from Vertebrate Rods. 1996; 271; 8022-8027

30. Gorodovikova EN, Philippov PP. The presence of a calcium-sensitive p26-containing complex in bovine retina rod cells.//FEBS Lett. 1993;335:277-279

31. Gray-Keller MP, Detwiler PB. Ca2+ dependence of dark- and light-adapted flash responses in rod photoreceptors. //Neuron. 1996; 17:323-231.

32. Gray-Keller MP, Detwiler PB.The calcium feedback signal in the phototransduction cascade of vertebrate rods.//Neuron. 1994 13(4):849-861

33. Gray-Keller MP, Polans AS, Palczewski K, Detwiler PB. The effect of recoverin-like calcium-binding proteins on the photoresponse of retinal rods.//Neuron. 1993; 10:523-531.

34. Gurevich W, Gurevich EV. The molecular acrobatics of arrestin activation.//Trends Pharmacol Sci. 2004 Feb; 25(2): 105-11.

35. Hamer,R.D. 2000a. Computational analysis of vertebrate phototransduction: combined quantitative and qualitative modeling of dark- and light-adapted responses in amphibian rods. Vis Neurosci 17:679699.

36. Hamer,R.D. 2000b. Analysis of Ca^-dependent gain changes in PDE activation in vertebrate rod phototransduction. Mol Vis 6:265-286.

37. Hamer,R.D., S.C.Nicholas, D.Tranchina, P.A.Liebman, and T.D.Lamb. 2003. Multiple steps of phosphorylation of activated rhodopsin can account for the reproducibility of vertebrate rod single-photon responses. J Gen Physiol 122:419-444.

38. Hamer,R.D., S.C.Nicholas, D.Tranchina, T.D.Lamb, and J.L.Jarvinen. 2005. Toward a unified model of vertebrate rod phototransduction. Vis Neurosci 22:417-436.

39. Haynes L.W. Permeation and block by internal and external divalent cations of the catfish cone photoreceptor cGMP-gated channel. //J Gen Physiol. 1995 Sep;106(3):507-23. PMID: 8786345.

40. Haynes LW, Yau KW. Single-channel measurement from the cyclic GMP-activated conductance of catfish retinal cones.//J Physiol. 1990;429:451-81.

41. He W, Cowan CW, Wensel TG. RGS9, a GTPase accelerator for phototransduction.//Neuron. 1998 1:95-102

42. Hodgkin AL McNaughton PA, Nunn BJ. The ionic selectivity and calcium dependence of the light-sensitive pathway in toad rods.// J Physiol. 1985. 358:447-468.

43. Hodgkin AL, McNaughton PA, Nunn BJ, Yau KW. Effect of ions on retinal rods from Bufo marinus, //J Physiol. 1984 May; 350:649-80

44. Hsu YT, Molday RS. Interaction of calmodulin with the cyclic GMP-gated channel of rod photoreceptor cells. Modulation of activity, affinity purification, and localization.// J Physiol. 1994; 269:29765-29767.

45. Hsu YT, Molday RS. Modulation of the cGMP-gated channel of rod photoreceptor cells by calmodulin.//Nature. 1993 361:76-79

46. Hu G, Jang F, Cowan CW, Wensel TG, and Palczewski K. Phosphorylation of RGS9-1 by an endogenous protein kinase in rod outer segments. J Biol Chem2001. 276:22287-22295.

47. Jones GJ. Light adaptation and the rising phase of the flash photocurrent of salamander retinal rods. //J Physiol. 1995;487:441-51.

48. Kawamura S, Hisatomi O, Kayada S, Tokunaga F, Kuo CH. Recoverin has S-modulin activity in frog rods. //J Biol Chem. 1993;268:14579-14582.

49. Kennedy MJ, Lee KA, Niemi GA, Craven KB, Garwin GG, Saari JC, Hurley JB. Multiple phosphorylation of rhodopsin and the in vivo chemistry underlying rod photoreceptor dark adaptation. //Neuron. 2001 Jul 19;31(1):87-101.

50. Korenbrot JI and Miller DL. Cytoplasmic free calcium concentration in dark-adapted retinal rod outer segments.// Vision Res. 1989;29:939-48.

51. Krispel CM, Chen CK, Simon MI, Burns ME. Prolonged photoresponses and defective adaptation in rods of Gbeta5-/- mice.//J Neurosci. 2003;23:6965-6971.

52. Krispel CM, Chen D, Melling N, Chen YJ, Martemyanov KA, Quillinan N, Arshavsky VY, Wensel TG, Chen CK, Burns ME. RGS expression ratelimits recovery of rod photoresponses.//Neuron. 2006 Aug 17;51(4):409-16.

53. Lagnado L, Baylor DA. Calcium controls light-triggered formation of catalytically active rhodopsin.//Nature. 1994; 367:273-277.

54. Lagnado L.; Cervetto L.; McNaughto P.A. Calcium homeostasis in the outer segments of retinal rods from the tiger salamander.//J.Physiol 1992; 455:111-145

55. Lamb TD, Puhg En Jr. A quantitative account of the activation steps involved in phototransduction in amphibian photoreceptors.//J Physiol. 1992 Apr;449:719-58.

56. Lolely RN and Racz E. Calcium modulation of cyclic GMP synthesis in rat visual cells. //Vision Ras 1982; 22: 1481-1486

57. Lyubarsky AL, Chen C, Simon MI, Pugh EN. Mice lacking G-protein receptor kinase 1 have profoundly slowed recovery of cone-driven retinal responses.// J Neurosci. 2000 Mar 15;20(6):2209-17.

58. Lyubarsky, AL, Nikonov SS, Pugh ENJr. The kinetics of inactivation of the rod phototransduction cascade with constant Ca2+i. //J. Gen. Physiol. 1996. 107: 19-34

59. Makino CL, Dodd RL, Chen J, Burns ME, Roca A, Simon MI, Baylor DA. Recoverin regulates light-dependent phosphodiesterase activity in retinal rods.//J Gen Physiol. 2004; 123:729-41. Erratum in: J Gen Physiol. 2005 Jul; 126(1):81.

60. Makino ER, Handy JW, Li T, Arshavsky VY. The GTPase activating factor for transducin in rod photoreceptors is the complex between RGS9 and type 5 G protein beta subunit.//Proc Natl Acad Sci USA. 1999. 96:1947-52.

61. Marks PW, Maxfield FR. Preparation of solutions with free calcium concentration in the nanomolar range using l,2-bis(o-aminophenoxy)ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid. Anal. Biochem. 1991. V.193: p.61-71

62. Matthews G, Watanabe S. Properties of ion channels closed by light and opened by guanosine 3',5'-cyclic monophosphate in toad retinal rods. .// J Physiol. 1987.389:691-715

63. Matthews HR. Effects of lowered cytoplasmic calcium concentration and light on the responses of salamander rod photoreceptors.//! Physiol. 1995 Apr 15;484 ( Pt 2):267-86.

64. Matthews HR. Static and dynamic actions of cytoplasmic Ca2+ in the adaptation of responses to saturating flashes in salamander rods.//J Physiol. 1996 Jan 1 ;490 (Pt 1):1-15.

65. McCarthy ST, Younger JP, Owen WG. Free calcium concentrations in bullfrog rods determined in the presence of multiple forms of Fura-2.// Biophys J. 1994; 67:2076-2089

66. McNaughton PA, Cervetto L. and Nunn BJ. Mesaurments of intracellular free calcium concentration in salamander rods.//Nature. 1986. 322: 261263

67. Mendez A, Burns ME, Roca A, Lem J, Wu LW, Simon MI, Baylor DA, Chen J. Rapid and reproducible deactivation of rhodopsin requires multiple phosphorylation sites.//Neuron. 2000 Oct;28(l): 153-64.

68. Murnick JG, Lamb TD. Kinetics of desensitization induced by saturating flashes in toad and salamander rods.// J.Physiol. 1996. 495:1-13

69. Nakatani K, Koutalos Y, Yau KW. Ca2+ modulation of the cGMP-gated channel of bullfrog retinal rod photoreceptors. //J Physiol. 1995;484:69-76

70. Nakatani K, Yau KW Calcium and magnesium fluxes across the plasma membrane of the toad rod outer segment.// J Physiol. 1988; 395: 695-729.

71. Nikonov S, Engheta N, Pugh EN Jr. Kinetics of recovery of the dark-adapted salamander rod photoresponse.//J Gen Physiol. 1998 Jan;l 11(1):7-37.

72. Nikonov S, Lamb TD, Pugh EN. The role of steady phosphodiesterase activity in the kinetics and sensitivity of the light-adapted salamander rod photoresponse.J Gen Physiol. 2000;116:795-824.

73. Ohguro H, Van Hooser JP, Milam AH, Palczewski K. Rhodopsin phosphorylation and dephosphorylation in vivo. //J Biol Chem. 1995; 270:14259-14262.

74. Palczewski K, Subbaraya I, Gorczyca WA, Helekar BS, Ruiz CC, Ohguro H, Huang J, Zhao X, Crabb JW, Johnson RS, et al. Molecular cloning and characterization of retinal photoreceptor guanylyl cyclase-activating protein.//Neuron. 1994 13:395-404.

75. Palczewski K. G protein-coupled receptor rhodopsin. //Annu Rev Biochem. 2006;75:743-67.

76. Palczewski K, Buczylko J, Kaplan MW, Polans AS, Crabb JW. Mechanism of rhodopsin kinase activation. //J Biol Chem. 1991, 266(20): 12949-55.

77. Pepperberg DR, Cornwall MC, Kahlert M, Hofmann KP, Jin J, Jones GJ, Ripps H. Light-dependent delay in the falling phase of the retinal rod photoresponse. //Vis Neurosci. 1992 Jan;8(l):9-18.

78. Rao VR, Oprian DD. Activating mutations of rhodopsin and other G protein-coupled receptors.// Annu Rev Biophys Biomol Struct. 1996;25:287-314. Review

79. Ratto GM, Payne R, Owen WG, Tsien RY. The concentration of cytosolic free calcium in vertebrate rod outer segments measured with fura-2.//J Neurosci. 1988; 8:3240-3246

80. Rieke F, Baylor DA. Origin of reproducibility in the responses of retinal rods to single photons. Biophys J. 1998 Oct;75(4): 1836-57.

81. Rodiec RW. The first step in seeing. Hardcover. Sinauer Assosiates, Incorporated. 1998. p.620

82. Sagoo MS and Lagnado L. G-protein deactivation is rate-limiting for shut-off of the phototrunsduction cascade.// Nature 389: 392-395

83. Sampath AP, Matthews HR, Cornwall MC, Bandarchi J, Fain GL. Light-dependent Changes in Outer Segment Free-Ca2+ Concentration in Salamander Cone Photoreceptors //J. Gen. Physiol. 1999.113: 267-277

84. Sampath AP, Matthews HR. Cornwall MC, Fain GL. Bleached Pigment Produces a Maintained Decrease in Outer Segment Ca2+ in Salamander Rods. // J.Gen.Physiol 1998. Ill: 53-64

85. Smith WC, Milam AH, Dugger D, Arendt A, Hargrave PA, Palczewski K. A splice variant of arrestin. Molecular cloning and localization in bovine retina.//J Biol Chem. 269(22): 15407-15410. 1994

86. Somlyo AP and Walz B. Elemental distribution in Rana pipiens retinal rods: quantitative electron probe analysis.// J Physiol. 1985 January; 358: 183-195.

87. Tamura T, Nakatani K, Yau KW. Calcium feedback and sensitivity regulation in primate rods// J Gen Physiol. 1991. 98(1):95-130.

88. Tanaka JC, Furman RE, Cobbs WH, Mueller P. Incorporation of a retinal rod cGMP-dependent conductance into planar bilayers.//Proc Natl Acad Sci USA. 1987 Feb;84(3):724-8

89. Taylor WR, Baylor DA. Conductance and kinetics of single cGMP-activated channels in salamander rod outer segments.//J Physiol. 1995 Mar 15;483 (Pt 3):567-82.

90. Torre V, Matthews HR, Lamb TD. Role of calcium in regulating the cyclic GMP cascade of phototransduction in retinal rods.//Proc Natl Acad Sci U S A. 1986; 83(18): 7109-7113.

91. Tsang SH, Burns ME, Calvert PD, Gouras P, Baylor DA, Goff SP, Arshavsky VY.Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo. Science. 1998 282:117-21.

92. Vishnivetskiy SA, Raman D, Wei J, Kennedy MJ, Hurley JB, Gurevich W.Regulation of arrestin binding by rhodopsin phosphorylation level. J Biol Chem. 2007 Nov 2;282(44):32075-83. Epub 2007 Sep 11.

93. Wensel TG. RGS9-1 phosphorylation and Ca2+. 2002. Adv Exp Med Biol 514:125-129.

94. Whitlock GG & Lamb TD. Variability in the time course of single photon responses from toad rods: termination of rhodopsin's activity.//Neuron. 1999 Jun;23(2):337-51.

95. Wilden U. Duration and amplitude of the light-induced cGMP hydrolysis in vertebrate photoreceptors are regulated by multiple phosphorylation of rhodopsin and by arrestin binding.//Biochemistry. 1995; 34(4): 1446-54.

96. Wilden U.; Kuhn,H. Light-dependent phosphorylation of rhodopsin: number of phosphorylation sites.//Biochemistry. 1982;21:3014-3022.

97. Woodruff ML, Bownds MD. Amplitude, kinetics, and reversibility of a light-induced decrease in guanosine 3',5'-cyclic monophosphate in frog photoreceptor membranes.//J Gen Physiol. 1979 73:629-653.

98. Woodruff ML, Janisch KM, Peshenko IV, Dizhoor AM, Tsang SH, and Fain GL. Modulation of phosphodiesterase6 turnoff during background illumination in mouse rod photoreceptors. J Neurosci 2008.28:2064-2074.

99. Xu J, Dodd RL, Makino CL, Simon MI, Baylor DA, Chen J. Prolonged photoresponses in transgenic mouse rods lacking arrestin.//Nature 389: 505-509, 1997

100. Yau KW, Nakatani K, Guanosine 3',5'-cyclic monophosphate-activated conductance studied in a truncated rod outer segment of the toad.// J Physiol. 1988. 395:731-53

101. Yau KW, Nakatani K. Electrogenic Na-Ca exchange in retinal rod outer segment.// Nature. 1984 311:661-3.

102. Кузьмин Д.Г., Травников C.B., Фирсов M.JI., Говардовский В.И. Математическое моделирование фофторансдукции и световой адаптации в палочках сетчатки лягушки.//Сенсорные системы. 2004; 18: с. 305-316.

103. Фирсов M.JL, Говардовский В.И.Световая адаптация фоторецепторов: смысл и механизмы.//Сенсорные Системы. 2001 т. 15, № 2, с. 102-115.