Обмен холестерина в гепатоцитах при развитии алиментарной гиперхолестеринемии и механизмы действия пробукола и фибратов

Косых, Владимир Алексеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Обмен холестерина в гепатоцитах при развитии алиментарной гиперхолестеринемии и механизмы действия пробукола и фибратов
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Обмен холестерина в гепатоцитах при развитии алиментарной гиперхолестеринемии и механизмы действия пробукола и фибратов"

На правах рукописи

косых

Владимир Алексеевич

ОБМЕН ХОЛЕСТЕРИНА В ГЕПАТОЦИТАХ ПРИ РАЗВИТИИ АЛИМЕНТАРНОЙ ГИПЕРХОЛЕСТЕРИНЕМИИ И МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ ПРОБУКОЛА И ФИБРАТОВ

03.00.04-Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва-2000

Работа выполнена в лаборатории метаболизма липопротеидов Научно-исследовательского института экспериментальной кардиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса Минздрава Российской Федерации

Официальные оппоненты: доктор биологически наук, профессор Вадим Зиновьевич Ланкин доктор биологических наук, Татьяна Ивановна Торховская доктор биологических наук, Олег Михайлович Панасенко

Ведущее учреждение: Научно-исследовательский институт Экспериментальной медицины РАМН { 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12)

Защита диссертации состоится " " .мс< р 2000 г. в i 1 час.

на заседании диссертационного совета Д 074.22.02 в РКНПК МЗ РФ по адресу: 121552, Москва, 3-я Черепковская ул., д. 15А, корпус 7.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РКНПК МЗ РФ ( Москва, 3-я Черепковская ул., Д.15А).

Автореферат разослан "_"_2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

/1 Г)

кандидат биологических наук / Т.И. Венгерова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Общепринято, что среди основных факторов риска развития атеросклероза гиперхолестеринемии ( ГХС ) принадлежит ведущая роль {Аничков, 1956; Климов, 1995; Чазов, 1998; Grundy а. Denke, 1990; Grundy, 1990). Многочисленные экспериментальные, эпидемиологические и клинические исследования показывают, что развитие ГХС обусловлено как нерациональным питанием, так и генетическими факторами (Климов, 1995; Чазов, 1998; Grundy а. Denke, 1990; Grundy, 1990 ; Ordovas et al., 1995; 1998). К основным показателям нерационального питания, способствующим увеличению уровня холестерина (ХС) в плазме относятся: избыточное потребление ХС и насыщенных жирных кислот (ЖК), а также высокая калорийность пищи.

Печени принадлежит ведущая роль в поддержании нормального уровня ХС в плазме, и достигается это за счет скоординированной регуляции в печени нескольких процессов; (а) синтеза холестерина; (б) поглощения и катаболизма липопротеидов (ЯП); (в) продукции пипопротеидов очень низкой плотности (ЛОНП); (г) окисления ХС до желчных кислот и их удаления в составе желчи ( Dietschy et al., 1993 ). Известно, что основной причиной развития алиментарной ГХС является снижение в печени активности специфических ЛНП-рецепторов, осуществляющих выведение из кровотока апо B-содержащих ЛП, обогащенных свободным и этерифицированным ХС (Brown a. Goldstein, 1986; Grundy а. Denke, 1990; Dietschy et at.,1993). Механизмы регуляции экспрессии гена этого рецептора пищевым ХС были детально изучены в ставших уже классическими работах Нобелевских лауреатов Гольдштейна и Брауна ( Brown a. Goldstein, 1986 ; 1997). В последние годы проводятся аналогичные исследований по выяснению роли пищевых липидов и ХС в регуляции секреции апо В-содержаших ЛП и синтеза желчных кислот, а также вкладе этих процессов в развитие алиментарной ГХС. Если гиперпродукция апо B-содержащих ЛП может приводить к развитию ГХС, то стимуляция синтеза желчных кислот в печени и их последующая экскреция с желчью может являться одним из основных механизмов защиты от развития ГХС (Danielsson etat., 1975; Vlachcevic et al., 1994; Schwartz etal., 1998).

Экспериментальные и клинические исследования, выполненные к началу этой работы, не позволили сделать однозначных выводов о стимуляции пищевым

ХС продукции ЛОНП печенью и о ее вкладе в развитие ГХС (Davis et at., 1983; Roth etal., 1983; McKinnon et al., 1985; Kroon et ai, 1986; Grundy, 1990). В то же время в многочисленных исследованиях на крысах было установлено, что пищевой ХС стимулирует синтез желчных кислот и активирует ХС-7а-гидроксилазу (ХС-7а-ОН), и тем самым запускается механизм защиты от развития ГХС ( Vlachcevic et al., 1994; Schwartz et al., 1998). Однако, до настоящего времени остается открытым вопрос о наличии этого механизма в защите от развития алиментарной ГХС у человека и у некоторых видов животных.

Все еще недостаточно изучен вопрос о причинах различной индивидуальной чувствительности к пищевому ХС и вкладе в этот феномен таких процессов обмена ХС как синтез желчных кислот, продукция ЛОНП, а также обратный транспорт ХС (Веуепеп et al., 1987 Clarkson et al., 1990; Ordovas et al., 1995 ). Результаты этих исследования во многом будут способствовать созданию новых гипохолестеринемических препаратов с избирательным механизмом действия.

В последнее время клинической практикой было подтверждено, что статины не являются универсальными препаратами для лечения всех форм дислипопротеидемий у человека (Farmer, 1998; Durrington a. Illingworth, 1998). В этой связи возобновился интерес к другим до недавнего времени широко используемым гиполипидемическим препаратам, включая фибраты (Staels et al., 1998 ) и пробукол ( Панкин и соавт., 1991 ; Лупанов и соавт., 1993; Yokoi et al., 1997). Установлено, что фибраты являются наиболее эффективными при лечении гипоальфалипопротеидемии и гипертриглицеридемии (ГТГ), сопряженной с неинсулин-зависимым диабетом (NCEP, 1993). К положительному терапевтическому эффекту фибратов относят не только снижение уровня апо B-содержащих ЛП в плазме ( Olsson a. Lang, 1978; Tikkanen, 1992 ), но и увеличение содержания ХС-ЛВП и их основных апо; ало А-1 и апо A-Il ( Bard et al., 1992 ; Staels a. Auwerx, 1997; 1998), играющих ключевую роль в системе обратного транспорта ХС и обеспечивающих защиту от ИБС ( Fielding a.Fielding, 1995). Лишь в последние годы наметился существенный прогресс в понимании молекулярных механизмов действия фибратов ( Staels a. Auwerx, 1997; Staels et al, 1998). В экспериментах на крысах было показано, что фибраты стимулируют пролиферацию пероксисом и активируют пероксисомальные ферменты, передавая сигнал на уровень генов через специфический рецептор (PPARa), являющийся транскрипционным фактором

(Dreyer et al., 1992). Эти данные позволили нам высказать и экспериментально проверить гипотезу, что изменение фибратами содержания основных аполипопротеинов ЛОНП (ano В и ano C-III) и ЛВП { ano A-I и ano A-ll) может быть связано с изменением в печени уровней экспрессии генов этих ano.

Помимо фибратов, к препаратам с комплексным и положительным эффектом при лечении сердечно-сосудистых заболеваний и атеросклероза относится пробукол, обладающий умеренным гипохолестеринемическим, выраженным антиоксидантным и прямым антиатеросклеротическим действием. Гипохолестеринемический эффект пробукола, как установлено, связан с увеличением клиренса ЛНП печенью и стимуляцией обратного транспорта ХС через воздействие на различные этапы этого процесса (Лякишев и соавт., 1995; DISP, 1989; Ying et al, 1990 ). В то же время оставалось неизвестным его влияние на ключевой процесс выведения ХС из кровотока - синтез желчных кислот. Решению этих проблем и была посвящена настоящая работа.

В последние годы подавляющее большинство исследований по этой проблематике проведены на крысах или культивируемых гепатоцитах крысы, являющихся самыми распространенными и доступными моделями для научных и прикладных исследований. В то же время достоверно установлено, что результаты, полученные на крысах в большинстве случаев нельзя экстраполировать на человека и возникает необходимость в проведении самостоятельных исследований на гепатоцитах человека. (Gibbons, 1994; Staels a. Auwerx, 1997; Staels a. Auwerx, 1997; Schwarz et al, 1998). В этой связи настоящая работа выполнена на первичных культурах гепатоцитов человека и кролика, которые являются наиболее подходящими моделями как для изучения метаболизма холестерина и ЛП в печени человека, так и для выяснения механизма действия лекарственных препаратов (Косых и соавт., 1989; Kosykh et al., 1987; Gibbons, 1994; Staels et al., 1995). Цели исследования.

А. Изучить в эксперименте обмен холестерина в гепатоцитах в ответ на пищевую холестериновую нагрузку, приводящую к развитию гиперхолестеринемии. Б. Выяснить механизмы гиполипидемического действия фибратов и пробукола. Задачи исследования:

1. Изучить воздействие пищевого ХС на продукцию ЛОНП гепатоцитами и выяснить роль этого процесса в развитии у кроликов ГХС, индуцированной. как чистым ХС, так и ХС, содержащим продукты его автоокисления.

2. Исследовать влияние ЛП с различным липидным составом на продукцию ЛОНП культивируемым гепатоцитами. Определить изменения в уровне ano В мРНК и секреции ano В под влиянием ЛП с различным липидным составом, а также эстерифицированного и свободного ХС.

3. Выявить особенности в метаболизме ХС в гепатоцитах кроликов с различной чувствительностью к развитию алиментарной ГХС.

4. Изучить воздействие рХМ, (5-ЛОНП и ЛВПг на синтез желчных кислот в культивируемых гепатоцитах кролика и человека.

5. Выяснить механизм воздействия пробукола на синтез желчных кислот в культивируемых гепатоцитах кролика.

6. Изучить воздействие фибратов на продукцию гепатоцитами основных аполипопротеинов ЛОНП и ЛВП:

A. определить изменения в секреции ano В и внутриклеточном уровне ano В мРНК под влиянием безафибрата.

Б. выяснить влияние фибратов на уровень экспрессии гена ano C-lil в печени крыс и культивируемых гепатоцитах крысы и человека.

B. исследовать воздействие фибратов на уровень экспрессию генов ano A-I и ano Á-II в культивируемых гепатоцитах человека.

Научная новизна работы.

Впервые было показано, что гиперпродукция гепатоцитами частиц ЛОНП может является одной из основных причин развития ГХС у кроликов, содержавшихся на обогащенном ХС корме. У кроликов, получавших как чистый, так и содержащий продукты автоокисления ХС (около 5%), в равной мере увеличивается секреция гепатоцитами частиц ЛОНП. Наличие продуктов автоокисления ХС в корме, с высоким содержанием ХС, вызывает значительное увеличение секреции частиц ЛОНП, обогащенных ЭХС, что может быть причиной относительно быстрого развития ГХС у кроликов.

В исследованиях in vitro было показано, что избыточное поступление в культивируемые гепатоциты нейтральных липидов в составе обогащенных ТГ рХМ

и обогащенных ХС ЛП (Р-ЛОНП и ЛНП) приводит к увеличению количества секретируемых клетками частиц ЛОНП. Увеличение продукции ano В осуществляется на посттранскрипционном уровне. Установлено, что как вновь-синтезированные ЭХС, так и свободный ХС способны стимулировать продукцию ano В-содержащих ЛП гепатоцитами человека.

Впервые было установлено, что в основе феномена устойчивости части популяции кроликов к развитию алиментарной ГХС может лежать как относительно высокая и устойчивая к пищевой нагрузке базальный скорость синтеза желчных кислот, так и относительно высокий уровень секреции гепатоцитами ano Е, который обеспечивает более эффективный обратный транспорт ХС в печень. В то же время повышенная чувствительность кроликов к развитию алиментарной ГХС может быть обусловлена относительно низкой базальной скоростью синтеза желчных кислот и значительным ее снижением при пищевой ХС нагрузке, в результате чего увеличивается секреции обогащенных ЭХС ЛОНП и уровень ХС в плазме.

В экспериментах in vitro установлено, что в отличие от крыс, нагрузка гепатоцитов кролика и человека липидами рХМ приводит не к увеличению, а к снижению синтеза желчных кислот, тогда как частицы (3-ЛОНП и ЛВПг, участвующие в обратном транспорте ХС, стимулируют этот процесс независимо от видовой принадлежности клеток. ЛВПг, добавленные одновременно с рХМ в культуру гепатоцитов, способны значительно нивелировать эффект подавления рХМ синтеза желчных кислот, что подтверждает предположение о ключевой роли ЛВПг в обратном транспорте ХС и в поддержании нормального уровня ХС в плазме при пищевой нагрузке ХС. В экспериментах in vitro показано, что ингибирование синтеза желчных кислот пищевыми ХС и липидами в гепатоцитах является характерной и существенной отличительной особенностью кролика и человека, поскольку у крысы в этих условиях отмечается стимуляция синтеза желчных кислот. Подавление рХМ синтеза желчных кислот может быть следствием увеличения внутриклеточного содержания ЖК, а также уменьшения пула ХС, используемого для синтеза желчных кислот.

Пробукол и а-токоферол в терапевтической концентрации стимулируют

синтез желчных кислот в культивируемых гепатоцитах кролика и человека. Установлен механизм стимуляции пробуколом синтеза желчных кислот.

Получены принципиально новые данные по механизмам плейотропного воздействия фибратов на метаболизм липидов и аполипопротеинов в гепатоцитах. Показано, что фибраты: а) снижают секрецию гепатоцитами частиц ЛОНП, не оказывая влияние на транскрипцию ano В гена; б) снижают в печени экспрессию гена ano C-III на транскрипционном уровне, в результате чего может активироваться гидролиз ТГ-богатых ЛП и ускоряться их выведение из кровотока печенью; в) увеличивают уровень экспрессии генов ano А-1 и ano A-Il в гепатоцитах человека, что приводит к увеличению содержания этих ano в плазме.

Научно-практическая значимость работы.

Полученные результаты означают, что развитие алиментарной ГХС связано не только со снижением активности ЛНП рецепторов в печени, но и с увеличением продукции печенью частиц ЛОНП. Одним из основных механизмов устойчивости кроликов и , по-видимому, человека к пищевой нагрузке ХС является относительно высокая базальная скорость синтеза желчных кислот. Это создает базу для целенаправленного изучения указанных изменений в метаболизме липидов в печени человека, особенно среди пациентов с высоким риском ИБС и с умеренной ГХС, а также разработки новых лекарственных препаратов, способных избирательно стимулировать синтез желчных кислот и подавлять продукцию ЛОНП печенью. Полученные данные по механизму стимуляции пробуколом синтеза желчных кислот свидетельствуют о необходимости поиска новых более эффективных аналогов пробукола, стимулирующих систему обратного транспорта ХС и оказывающих минимальное побочное влияние на синтез ano А-1 в гепатоцитах. Экспериментальные результаты по стимуляции окисленными производными ХС продукции печенью частиц ЛОНП, обогащенных ЭХС, и их вовлеченности в развитие ГХС важно учитывать при решении вопросов диетотерапии и профилактики ГХС у человека.

Использованные в работе методические подходы исследования на уровне генов открыли новый этап в изучении механизмов действия гиполипидемических препаратов. Полученные по механизмам действия фибратов данные закладывают основу для выявления липидных (ЖК и др.) факторов питания и создания нового поколения фармакологических препаратов, избирательно регулирующих

экспрессию ключевых генов метаболизма ЛП в печени. В работе экспериментально обосновано использование фибратов для коррекции дислипопротеидемий, связанных как с увеличением продукции частиц ЛОНП (гиперлипидемии), так и со снижением продукции ano А-1 печенью {гипоальфалипопротеидемии). Апробация диссертации состоялась 7 октября 1999 г. на заседании Ученого совета Института экспериментальной кардиологии РКНПК МЗ РФ. Основные результаты работы были представлены на различных Российских и Международных конгрессах, симпозиума и конференциях, в том числе на: 2-ом Российском национальном конгрессе" Человек и Лекарство" (Москва, 1995 г.); 1-ой Всероссийской конференции по проблемам атеросклероза (Москва, 1999 г.); на 6-ом и 7-ом международном симпозиуме по метаболизму липидов (Дрезден, 1988; 1991г.); 3-ей международной конференции по метаболизму липидов (Дижон, 1990 г.); 55-ой (Брюгге, 1990 г.), 57-ой (Лиссабон, 1991 г.), 59-ой (Ницца, 1992 г.), 62-ой (Иерусалим, 1993 г.) конференциях Европейского Общества по изучению атеросклероза; Х-ом международном симпозиуме по атеросклерозу (Монреаль, 1994 г.); 66-ом конгрессе Европейского Общества по изучению атеросклероза (Флоренция 1996 г.); 13-ом международном симпозиуме " Влияние лекарств на метаболизм липидов " (Флоренция 1998 г.), 71-ой научной сессии американской ассоциации кардиологов (Даллас, 1998 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 43 работы, в том числе 18 статей в отечественных академических изданиях и 25 статей в международных изданиях.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 6-ти глав литературного обзора, главы , посвященной материалам и методам, 5-ти глав, посвященных результатам собственных исследований и их обсуждению, выводов и списка литературы. Работа изложена на 222 страницах, содержит 26 таблиц и 38 рисунков. Список литературы включает 311 источников, из которых 16 опубликовано в отечественных и 295 в международных изданиях.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные животные. В работе использовали кроликов самцов породы Шиншилла весом 2,5-3 кг и крыс самцов линии Вистар весом 250—300г. Кроликов

содержали на стандартном рационе. В течение различного периода времени им ежедневно пер орально вводили добавки: контрольной группе - оливковое масло (0,5 мл/kr веса), экспериментальная группа получала очищенный холестерин ( ЧХС) или старый коммерческий ХС, содержащий 5% продуктов его автоокисления (ОХС), основу которых составляли 7р-оксихолестерин, 7-кетохолестерин, холестан-зр,5а,б(5-триол в виде суспензии в оливковом масле (0,2 г ХС/0,5 мл оливкового масла на кг веса) ( Kosykh et al., 1989; 1993). Крысы получали в течение различного периода времени фибраты, включенные в стандартный корм (вес/вес) в указанных дозах (Staels et al., 1995; 1999).

Культура клеток. Гепатоциты выделяли методом перфузии раствором коллагеназы целой печени крысы согласно (Berry a. Friend, 1976) или доли печени кролика и человека согласно ( Kosykh et al., 1985; Lee et al., 1992) и культивировали 24 часа до поведения экспериментов в среде, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки и антибиотики. Затем гепатоциты инкубировали в течение различного периода времени в культуральной среде, содержащей различные концентрации испытуемых агентов и без них. Для определения синтеза липидов и белков в культуру клеток добавляли радиоактивные предшественники. Отдельные эксперименты проводили на культуре клеток гепатобластомы человека - Hep G2. Липопротеиды. Различные классы ЛП выделяли из плазмы и культуральной среды препаративным ц/ф по методу (Lindgren, 1975). Ремнанты хиломикрон получали после инкубации хиломикрон с гепаринизированной плазмой, обогащенной пипопротеидлипазой (ЛПЛ) (Mahley et al., 1981) и выделяли методом

иммуноаффинной хроматографии (Kosykh et al., 1991). Меченые холестерин ( С)-олеатом ЛВП2 получали согласно ( Pittman et al., 1987).

Аналитические методы. Общий ХС, ТГ в плазме и ЛП определяли энзиматически используя наборы Sigma и Medix. В отдельных случаях ХС и ЭХС определяли методом газожидкостной хроматографии ( Ellsworth et al., 1986); фосфолипиды - по фосфору согласно ( Bartlett, 1959). Концентрации различных апо в культуральной среде определяли иммуноферментативным методом ( ELISA ); апо В согласно (Kosykh et al., 1985 ), апо C-tll и апо С-И согласно (Staels et al., 1995; 1999), апо A-I и апо A-Il по методу (VuDac.et al., 1996). Липиды клеток и ЛП экстрагировали по методу (Bligh a. Dyer, 1959), разделяли методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии и количественно определяли денситометрией согласно ( Schmitz et

al., 1984). Аполиполротеины ЛП разделяли методом электрофореза в градиенте ПААГ (3-20% акриламида ) в присутствии Ds-Na (Laemli, 1972). В отдельных экспериментах содержание желчных кислот определяли методом газожидкостной хроматографии (Miettinen, 1982). Общую фракцию клеточной РНК выделяли по методу ( Chomczynski a. Sacchi, 1987). Нозерн и дот блотгинг клеточной РНК со специфическими кДНК зондами проводили по методу (Low et al., 1988). Авторадиограммы количественно анализировали сканирующей денситометрией и значения содержания специфических мРНК нормслизовали к содержанию АКО мРНК и ГАФДГ мРНК (Staels et at., 1989; Vu Dac et al., 1998). Рекомбинантные плазмиды, используемые для проведения трансфекции клеток были приготовлены и предоставлены сотрудниками лаборатории проф. Б.Стаелза из ин-та Пастера, (Лилль, Франция). Hep G2 клетки трансфецировали различными плазмидами как описано (Vu Dac et al., 1998). Активность хлораминофеникол-ацил-трасферазы (CAT) определяли по методу Gorman et al. ( 1982 ). Выделение ядер из гепатоцитов и определение скорости транскрипции проводили согласно ( Nevíns, 1987 ).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 1. ВЛИЯНИЕ ХОЛЕСТЕРИНА НА ПРОДУКЦИЮ ЧАСТИЦ ЛОНП ГЕПАТОЦИТАМИ КРОЛИКА И ЧЕЛОВЕКА.

1.1. Влияние холестерина пищи на секрецию ЛОНП гепатоцитами кролика.

К началу проведения наших исследований было известно, что не только ХС но и продукты автоокисления ХС, образующиеся в пище при хранении и термической ее обработке, оказывают влияние на различные процессы обмена ХС в клетках печени и потенцируют развитие атеросклероза у животных (Сагоян и соавт., 1983; Brown et al.,1975; Drevon et al., 1980; Statte et al., 1984; Peng a. Taylor, 1984; Sorci-Thomas et al., 1987; Grundy a. Denke, 1990). В то же время роль пищевого ХС и продуктов автоокисления ХС в регуляции секреции частиц ЛОНП печенью оставалась мало изученной.

На первом этапе мы воспроизвели результаты, ранее полученные другими авторами (Сагоян и соавт., 1983). Так было показано, что через 1,5 месяца потребления с кормом ХС, содержащего около 5% окисленных производных ( ОХС), у кроликов развивалась выраженная ГХС, тогда как у животных, получавших ХС очищенный от продуктов его окисления (ЧХС) отмечалось лишь умеренное

увеличение уровня ХС в плазме (Табл. 1). В то же время спустя 3 месяца уровень ХС в плазме кроликов, получавших ЧХС, достигал таких же значений, как и у второй экспериментальной группы. Из этого следует, что наличие оксипроизаодных ХС способно ускорить развитие выраженной ГХС у кроликов, не оказывая существенного влияния на степень развития ГХС. Выраженная ГХС у ОХС-кроликов сопровождалась через 1,5 месяца значительно существенным (3-кратным), по сравнению с ЧХС-кроликами, увеличением в плазме уровня ano В, то есть концентрации частиц ß-ЛОНП (Kosykh et al., 1989), что согласуется с данными работ других авторов, показавших что степень развития ГХС у кроликов прямо коррелирует с уровнем ß-ЛОНП (Albrecht a. Schuler, 1965; Mckinnon et al., 1985; Ueno et al., 1985).

Табл. 1. Концентрация холестерина в плазме кроликов, содержавшихся на стандартном и обогащенном чистым и окисленным холестерином корме

Продолжитель- стандартный корм ность кормления_контроль_

1,5 месяца 60 ± 8

3 месяца 64 ±12

обогащенный холестерином корм чистый ХС окисленный ХС

мг/дл

160 ± 30a 700 ± 110a®

780 ± 190a 870 ± 230a

Представлены средние ± ошибки среднего. Каждая группа включала по В животных, а -Р< 0,01; достоверность отличий в сравнении с контрольной группой, б -Р< 0,01; достоверность отличий между экспериментальными группами.

Для того, чтобы выяснить роль продукции ЛОНП и вклад этого процесса в развитие алиментарной ГХС у двух экспериментальных групп кроликов, нами использовался хорошо зарекомендовавший подход, при котором из печени животных, содержавшихся на обогащенном ХС корме, выделялись гепатоциты и в условиях первичной культуры регистрировались метаболические показатели клеток, которые в течение несколько дней сохраняли свойства, присущие им in vivo (Davis et al., 1979; Whiting et al., 1989).

Мы исследовали некоторые процессы обмена ХС в культивируемых гепатоцитах, полученных от этих животных через 1,5 месяца кормления - в период максимальной разницы в уровне ХС.в плазме (Табл. 1).

Определение нейтральных липидов в культивируемых гепатоцитах, выявило драматическое (в 24 раза) увеличение содержания эфиров холестерина в ОХС-гепатоцитах, тогда как в ЧХС-клетках отмечалось лишь 2-кратное их увеличение. При этом содержание ТГ увеличивалось в равной степени (в 1,8 раза) в гепатоцитах обеих экспериментальных групп. Массивное накопление ЭХС в ОХС-гепатоцитах сопровождалось более значительным, по-сравнению с ЧХС-гепатоцитами, увеличением синтеза ЭХС (Kosykh et al., 1989). Причину этих различий можно объяснить тем, что продукты окисления ХС более эффективно, чем сам ХС стимулируют фермент АХАТ, катализирующий этерификацию ХС (Brown et al., 1975; Drevon et al., 1980; Nelson et al., 1981; Slotteetal., 1984).

Было показано, что секреция ano В и суммарного белка в составе ЛОНП гепатоцитами животных, получавших как ЧХС, так и ОХС, увеличивалась в 2 раза, по-сравнению с клетками контрольной группы (Табл. 2). Эти данные означают, что потребление кроликам как чистого ХС, так и содержащего окисленные производные ХС, увеличивает количество секретируемых частиц ЛОНП. При этом, наличие продуктов автоокисления ХС в корме не оказывает существенного влияния на продукцию частиц ano В-содержащих ЛП.

Таким образом, нам впервые удалось показать, что пищевая ХС нагрузка приводит к увеличению количества секретируемых гепатоцитами частиц ЛОНП. Эти данные были подтверждены в работах других авторов в экспериментах на изолированной печени крыс и хомяков, длительно получавших ХС с кормом (Fungwe et al., 1992; Chen et al., 1996). Другой важный результат заключается в том, что ускоренное массивное накопление ЭХС в гепатоцитах ОХС-животных с выраженной ГХС, сопровождается увеличением секреции частиц ЛОНП, обогащенных ЭХС. В то же время ЧХС-гепатоциты секретируют обычные по липидному составу ЛОНП (Табл.2). Эти результаты хорошо согласуются с литературными данными, из которых следует, что при развитии выраженной алиментарной ГХС в печени кроликов отмечается увеличение активности АХАТ, сопровождаемое гиперсекрецией ЭХС в составе ЛОНП ( Salen et al., 1983; Daughertyetal., 1985; McKinnon et al., 1986).

Следует отметить, что в этой работе о скорости секреции ЛОНП гепатоцитами мы судили по накоплению ЛОНП в среде культивирования, поскольку

Таблица 2. Секреция аполипопротеинов и липидов ЛОНП культивируемыми гепатоцитами кроликов, содержавшихся на стандартном и обогащенном ХС корме.

Белок Апо В ТГ ХС ЭХС ТГ/апо В ХС/апо В ЭХС/апо В

_ЛОНП_

мкг I мг клеточного белка

Контроль 2,0+0,2 1,3+0,1 9,7+1,1 2,0±0,2 3,2+0,7 7,3 1,5 2,4 Чистый

холестерин 3,8±0,7а 2,3+0,2а 18,1±1,7а 2,9+0,2" 3,4±0,5 8,0 1,3 1,5* Окисленный

хлестерин 4,2±0,8а 2,6+0,33 18,5+2,5" 4,7±0,7а6 17,0+1,8аб 7,2 1,Эа6 7,5а6

Гепатоциты инкубировали в бессывороточной среде Игла в течение 18 часов. ЛОНП выделялись препаративным ультрацентрифугированием и определяли концентрацию апо В и нейтральных липидов. Представлены средние ± ошибки среднего; каждая группа состояла из 4 животных, а- Р< 0,01; достоверность отличий в сравнении с контрольной группой . б- Р< 0,01; достоверность отличий между экспериментальными группами.

вклад другого процесса - захвата виовь-синтезированных Г10НП гепатоцитами в изменение концентрации этих частиц в среде составлял менее 5% ( Kosykh et al., 1989).

Отсутствие различий в скорости секреции частиц ЛОНП гепатоцитами двух экспериментальных групп через 1,5 месяца потребления обогащенного ХС корма свидетельствует о наличие другого механизма, лежащего в основе значительного увеличения (в 2-3 раза) уровня частиц ЛОНП в плазме кроликов, получавших ОХС, по сравнению с ЧХС-животными (Kosykh et al., 1989). Выявленное несоответствие в содержании ano В ЛОНП в плазме животных и в среде первичной культуры можно объяснить тем, что в отличие от условий in vitro, уровнь ano B-содержащих ЛП в плазме животных зависит не только от скорости их секреции, но от скорости их клиренса клетками печени. Мы предположили, что при пищевой нагрузке ОХС активность В/Е-рецепторов и поглощение ß-ЛОНП гепатоцитами снижается в большей степени, чем при потреблении ЧХС. (Kovanen et al., 1981; Brown а. Goldstein, 1986). Проверка этого предположения подтвердила, что ОХС-гепатоциты, перегруженные ЭХС, менее эффективно, чем ЧХС-гепатоциты связывают и деградируют иод-меченые ß-ЛОНП (Волгушев и соавт., 1991). Следует также отметить, что к важному механизму, который, по-видимому, вовлечен в быстрое увеличение содержания ХС и ß-ЛОНП в плазме ОХС-кроликов относится снижение продуктами автоокисления ХС синтеза желчных кислот. Несмотря на отсутствие прямых доказательств in vivo, нами и другими авторами на первичной культуре гепатоцитов удалось показать, что некоторые продукты автоокисления ХС (7-кетохолестерин и 7р-оксихопестерин) подавляют синтез желчных кислот (Новиков и соавт., 1990; Stone et al.,1985).

Суммируя полученные данные можно сделать заключение, что избыточное потребление ХС кроликами приводит к увеличению количества секретируемых печенью частиц ЛОНП, что может являться одной из основных причин развития умеренной алиментарной ГХС. Отмечаемое через 1,5 месяца кормления драматическое увеличение уровня ХС в плазме ОХС-кроликов, по сравнению с ЧХС-животными, по крайней мере отчасти, обусловлено гиперсекрецией гепатоцитами обогащенных ЭХС частиц ЛОНП.

1.2. Влияние липидов ЛП на продукцию ano В-содержащих ЛП культивируемыми гепатоцитами кролика и человека.

Эксперименты, проведенные in vivo не позволили нам сделать однозначный вывод о прямой стимуляции пищевым ХС продукции частиц ЛОНП печенью, поскольку невозможно отделить эффект ХС от сопутствующего влияния других пищевых и гуморальных факторов, а также синтезирующихся желчных кислот.

В этой связи нами была in vitro смоделирована ситуация пищевой нагрузки, характеризующаяся накоплением ХС и других липидов в клетках печени. Для этого гепатоциты инкубировали с чистыми препаратами ТГ-богатых рХМ, в составе которых, как известно, ХС и другие липиды пищи доставляются из кишечника в печень. Для сравнения были использованы ХС-богатые частицы ( [5-ЛОНП, ЛНП ), которые секретируются печенью и формируются в плазме при пищевой ХС нагрузке и осуществляют обратный транспорт ХС в печень (Ross a. Zilversmit, 1977; Daugherty et al.,1988; Gudmundsen et al., 1993).

Для того, чтобы выяснить влияют ли липиды ЛП на продукцию ano В и если влияют, то на каком уровне осуществляется эта регуляция, первичные гепатоциты кролика и Hep G2 клетки инкубировали с рХМ и ХС-богатыми ЛП ((3-ЛОНП и ЛНП ) и определяли синтез, накопление нейтральных липидов в клетках, а также секрецию ano В и внутриклеточное содержание ano В мРНК. В результате 18-часовой инкубации клеток с рХМ отмечалось значительное накопление всех классов нейтральных липидов (ТГ, ХС и ЭХС) и дозозависимая стимуляции синтеза ТГ; при этом синтез ЭХС не изменялся. В отличие от рХМ, [З-ЛОНП и ЛНП индуцировали накопление ХС и его эфиров, не оказывая влияние на содержание ТГ. При этом были отмечены значительная (в 1.8 раза) стимуляция синтеза ЭХС и лишь слабый стимулирующий эффект на синтез ТГ (Kosykh et al., 1988, 1991). Важно подчеркнуть, что независимо от состава накапливающихся в клетках нейтральных липидов во всех случаях отмечалось значительное увеличение секреции ano В гепатоцитами, при этом содержание мРНК в клетках не изменялось (Рис, 1).

, Таким образом, нейтральные липиды ЛП стимулируют продукцию ano В и осуществляют это не на транскрипционном, а по-видимому, на трансляционном и/или посттрансляционном уровне. В последующем эти результаты были подтверждены в работах других авторов, и in vivo было установлено, что

посттрансляционный уровень является основным в регуляции пищевыми липидами продукции апо В печенью ( Dashti, 1992; Tanaka et al., 1993; Thompson et al., 1996).

Ano В Ano В секреция мРНК

Апо В секреция

Апо В мРНК

Рис. 1. Влияние рХМ, ß-ЛОНП и ЛНП на секрецию апо В и содержание апо В мРНК в культивируемых гепатоцитах кролика (А,Б) и HepG2 клетках (В). Клетки преинкуЗировали 24 часа в среде Игла, содержащей 10% ДСЧ (контроль) и добавленные рХМ (50 мкг белка/мл), ЛНП (100 мкг белка/мл) и ß-ЛОНП (100 ыкг белка/мл). Затем клетки три раза промывали средой и культивировали 18 часов в среде Игла, содержащей 10% ДСЧ и определяли концентрацию апо В в среде и апо В мРНК в клетках. Приведены средние ± ошибки среднего трех повторов. *-Р<0,05; достоверность отличий в сравнении с контролем.

На основании полученных данных мы предположили, что избыточное

поступление ХС и ЭХС в гепатоциты является достаточным условием для

увеличения количества продуцируемых клетками частиц ЛОНП. Для выяснения роли

вновь-синтезированных ЭХС в стимуляции продукции апо B-содержащих ЛП нами

был использован специфический ингибитор фермента АХАТ (Sandoz, 58-035).

Добавление в среду культивирования гепатоцитов кролика ß-ЛОНП (100 мкг

белка/мл) приводило к увеличению в 1,8 раза синтеза ( С)-ЭХС и в 2 раза секреции апо В (Рис.2). Добавление ингибитора АХАТ (5мкг/мл) к клеткам, инкубируемым в присутствии ß-ЛОНП (100 мкг белка/мл), в значительной мере нейтрализовало стимулирующий эффект ß-ЛОНП на этерификацию ХС и существенно (на 26%) снижало секрецию ano В (Рис. 2). Важно отметить, что если клетки не подвергались воздействию ß-ЛОНП, то ингибитор АХАТ не оказывал

значительного влияния на базальный синтез ЭХС и секрецию ano В. Эти данные означают, что вновь-синтезированные ЭХС являются одним из основных стимуляторов продукции ало В-содержащих ЛП частиц в условиях избыточного поступления ХС в печень (Kosykh et al., 1988; 1991). Наряду с этим, нами было установлено, что сам ХС, растворенный в этиловом спирте и добавленный в первичную культуру гепатоцитов человека способен также стимулировать секрецию ano В-содержащих ЛП (Kosykh et al., 1985).

ce *

Ш £

а. * L-

Ш 2 О

1.00.80.60.4 0.2

D Контроль

g + ß-ПОНП (100 мкг/мл)

+ ß-ЛОНП (100 мкг/мл) ™ + S мкг\мл (Sandoz, 58-035) а

■Ь

О ф

н ш ж Н

■о т

O-tx

А.

М О

- 100 -г

(Ú

50 £

- 200

150

АПОВ

<14С)-ЭХС

Рис.2. Влияние ß-ЛОНП и АХАТ ингибитора на секрецию ano В и синтез эфиров холестерина в культивируемых гепатоцитах кролика.

Клетки преинкубировали 24 часа в среде Игла, содержащей 10% ДСЧ (контроль) и добавленные ß-ЛОНП ( 100 мкг белка/мл) или ингибитор АХАТ - 58-035, Sandoz (5 мкг /мл} Затем клетки три раза промывали средой и инкубировали в течение

часов в среде, содержащей комплекс (14С)-олеат-альбумин и определяли 14

включение ( С)-олеата в ТГ и ЭХС клеток и концентрацию ano В в среде.Представлены данные одного воспроизводимого эксперимента из трех проведенных экспериментов. Представлены средние ± ошибки среднего трех повторов, а- Р<0,05; достовернсть отличий в сравнении с контролем. 6- Р<0,05; достоверность различий между эксл. группами.

Достигнутый в последние годы существенный прогресс в понимании регуляции процесса продукции частиц ЛОНП позволил предложить возможные механизмы стимуляции ХС и ЭХС этого процесса (Huff a. Burnett, 1997). Выяснено, что трасмембранный перенос синтезируемой молекулы ano В в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) является критическим этапом в процессе посггрансляционной

регуляции продукции этого ano (Yao a. McLeod, 1994). При этом микросомальный белок - МБП, осуществляющий перенос ТГ и ЭХС с внешней на внутреннюю поверхность ЭР, формирует ядро нейтральных лилидов и является ключевым фактором в формировании частицы ЛП. В том случае, если у вновь-синтезируемой молекулы ano В нет возможности связаться с липидным ядром (нарушено его формирование), то трансмембранный перенос становится невозможным и молекула ano В подвергается протеолизу. Использование селективных ингибиторов синтеза ЭХС, а также МБП (Gordon, 1997) приводит к снижению количества формируемых липидных ядер и, соответственно, секретируемых ЛП. В настоящее время считается, что МБП контролирует число секретируемых ano В-содержащих частиц. Получены данные, что ХС способен стимулировать трасмембранный перенос синтезируемой молекулы ano В, увеличивая экпрессию гена МБП на транскрипционном уровне (Hagen et al., 1994; Lin et al., 1995).

Новые представления о роли нейтральных липидов и МБП в регуляции продукции ano B-содержащих ЛП создали хорошую основу для разработки нового класса гиполипидемических препаратов - ингибиторов АХАТ и МБП.

Суммируя полученные нами результаты можно сделать заключение, что в условиях пищевой ХС нагрузки поступающий в гепатоциты в составе рХМ свободный и этерифицированный ХС способны стимулировать продукцию печенью ano В- содержащих ЛП.

Глава 2. МЕТАБОЛИЗМ ХОЛЕСТЕРИНА В ГЕПАТОЦИТАХ КРОЛИКОВ С РАЗЛИЧНОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬЮ К РАЗВИТИЮ АЛИМЕНТАРНОЙ ГХС.

Выяснение причин, лежащих в основе индивидуальной чувствительности у животных и человека к развитию ГХС при пищевой ХС нагрузки, проводилось в многочисленных экспериментальных и клинических исследованиях (Beynen et al., 1987 ; Grundy, 1990 ; Ordovas et al., 1998). Однако роль в этом явлении таких процессов как продукция желчных кислот и ЛОНП печенью, а также обратный транспорт ХС, на момент проведения наших исследований оставалась мало изученной.

Содержание холестерина в плазме кроликов с различной чувствительностью к развитию ГХС.

Уже через 1 неделю содержания кроликов на корме, обогащенном ХС, у

части животных - гиперреактивных (около 10 %) уровень ХС в плазме увеличивался

в 2 раза, по сравнению животными, получавшими стандартный корм, тогда как у

другой части кроликов - гипореактивных (около 10%) содержание ХС в плазме не

изменялось (Табл. 3). У подавляющей части т.н. нормореактивных кроликов (около

80 %) уровень ХС достигал промежуточных значений и составлял 81 ± 18 мг/дл.

Перевод на стандартный корм нивелировал разницу в уровне ХС в плазме гипо- и

гиперреактивных животных. В то же время, через 10 недель содержания

гиперреактивных кроликов на обогащенном ХС корме уровень ХС в плазме

увеличивался в 15 раз, тогда как у гипореактивных кроликов он поднимался лишь в

2 раза, по сравнению с животными, получавшими стандартный корм (Табл. 3).

Табл. 3. Концентрация холестерина в плазме кроликов, содержавшихся 1 и 10 недель на стандартном и обогащенном ХС корме.

Контрольные Гипореактивные Нормореактивные Гиперреактивные

стандарт, корм 1 неделя 57 ± 8 ( п = 10 )

10 недель 54 ±12 (п = 10)

мг ХС/дл обогащенный ХС корм 54 ± 6 81+ 18а 120 ±20аб

( п = 8 ) ( п = 64 ) ( п = 8 )

стандарт.корм 48 ±8 66+10

( п = 4) (п = 4)

10 недель 61+11 (п=10)

обогащенный ХС корм 108 ±30а ( п = 4 )

912 ±65 (п = 4)

аб

Представлены средние ± ошибки среднего; п - число животных в каждой группе. Контроль - кролики (общая выборка), содержавшиеся на стандартном корме. а-Р< 0,05; достоверность отличий в сравнении с контрольной группой, б - Р < 0,05; достоверность отличий между гипо-и гиперреактивными кроликами.

Липидный состав гепатоцитов и секреция липидов в составе ЛОНП.

Содержание свободного и этерифицированного ХС в культивируемых гепатоцитах и скорость секреции ЭХС в составе ЛОНП увеличивались относительно контроля в значительно большей степени в клетках гиперреактивных, чем гипореактивных кроликов (Ройгег е! а1., 1993). Эти результаты находятся в хорошем соответствии с ранее полученными данными, из которых следует, что

увеличение внутриклеточного пула ХС сопровождается стимуляцией секреции обогащенных ЭХС ЛОНП. При этом скорость секреции ХС прямо коррелирует с содержанием в клетках свободного и этерифицированного ХС (Hornick et al., 1983; Makkinnon et al., 1985).

Синтез желчных кислот в культивируемых гепатоцитах кроликов при содержании на стандартном и обогащенном ХС корме.

Нами были подтверждены данные Whiting et al. (1989), из которых следует, что в отличие от крысы и других видов животных, основной (более 95%) желчной кислотой, синтезируемой в гепатоцитах кролика является холевая кислота, при этом хенодеоксихолевая кислота синтезируется лишь в незначительных количествах (Podrez et al., 1993). По скорости синтеза холевой кислоты в гепатоцитах кролика можно судить о всем процессе. В этой связи первичную культуру гепатоцитов кролика стали рассматривать в качестве очень удобной и простой модели для исследования регуляции синтеза желчных кислот. (Whiting et al., 1989).

В результате исследований было установлено, что в гепатоцитах гипореактивных кроликов, содержавшихся на стандартном корме, скорость синтеза холевой кислоты была значительно (в 1,7 раза) выше, чем в клетках гиперреактивных и контрольных животных (Рис.3). Содержание животных в течение 10 недель на обогащенном ХС корме приводило к значительному (на 40 %) снижению синтеза холевой кислоты в клетках гиперреактивных животных, тогда как в клетках гипореактивных животных достоверного эффекта не отмечалось.

Эти результаты означают, что высокая базальная скорость синтеза желчных кислот у гипореактивных кроликов и ее стабильность в условиях длительной пищевой нагрузки ХС сопряжена с устойчивостью к развитию алиментарной ГХС. Напротив, низкая эффективность окисления ХС в желчные кислоты в печени гиперреактивных кроликов и ее дальнейшее снижение в условиях пищевой нагрузки приводит к накоплению ХС в гепатоцитах и стимуляции секреции ЭХС в составе ЛОНП, что способствует развитию выраженной ГХС (Podrez et al., 1993). Эти данные были подтверждены в последующих работах других авторов, проведенных на кроликах ( Poortman et al., 1993; Xu et al., 1995 ).

5 м

О S 1.2

Ь£ о . .

,slO 1.0

§ с 0.8

Ш 2

¡1"

<0 * 0-4

Ш 2,

X 0.2

О 0.0

А Б А Б А

Гиперреактивные Гипореактивные Контрольные

Рис.3. Синтез холевой кислоты в культивируемых гепатоцитах экспериментальных групп кроликов, получавших стандартный и обогащенный ХС корм в течение 10 недель. Гепатоциты инкубировали 24 часа в среде Игла, содержащей 10% ЭТС; монослой клеток отмывали и инкубировали еще 24 часа в среде без сыворотки и определяли концентрацию холевой кислоты методом газожидкостной хроматографии. Каждая группа состояла из 4-х животных. Представлены средние d ошибки среднего, а- Р<0,05- между А и Б группой; б-Р < 0,05 - в сравнении с гиперреактивной группой.

Важно отметить, что у крыс обогащенный ХС корм и богатые ХС ЛП стимулируют как синтез желчных кислот, так и экспрессию гена ХС-7а-ОН, являющегося ключевым ферментом в этом процессе, и тем самым обеспечивают выведение избыточного ХС из организма (Vlahceivic et al., 1994). Следовательно, в отличие от крыс, у кроликов пищевой ХС не запускает этот компенсаторный механизм выведения пищевого ХС из печени и кровотока. Молекулярные механизмы, лежащие в основе существующих индивидуальных различий в эффективности синтеза желчных кислот пока не установлены (Chiang a. Stroup, 1994; Schwartz et al., 1998). В ряде работ было показано, что у кроликов устойчивость к пищевому ХС не исчерпывается высокой эффективностью синтеза желчных кислот, и может быть также обусловлена высокой активностью В/Е-рецепторов и низкой активностью АХАТ в печени ( Overturf et al., 1990 ; LooseMitchell et al., 1991 ).

А - стандартный корм Б - обогащенный ХС корм

В подавляющем большинстве исследований, проведенных на человеке, не удалось обнаружить стимуляцию синтеза желчных кислот и индукцию ХС-7а-ОН в ответ на высокую нагрузку пищевым ХС. По-видимому, у человека подобно кролику и хомяку ХС-7а-ОН плохо индуцируется пищевым ХС (Connor a. Lin., 1974; Schwartz et al., 1998). Предполагают, что у человека устойчивость к развитию ГХС в значительной степени может обеспечиваться низкой эффективностью всасывания ХС пищи в кишечнике (Quintao et al., 1971 ; Connor a. Lin., 1974).

Секреция ano E культивируемыми гепатоцитами гипо- и гиперреактивных кроликов.

Существуют два процесса, участвуя в которых ano Е может влиять на содержание ХС в плазме: 1) выведение печенью из кровотока атерогенных ЛОНП через В/Е- и Е-рецепторы; 2) обратный транспорт ХС в составе ЛВП2 (Mahley, 1988; Mahley a. J i, 1999). Поскольку печень является одним из основных источников ano Е в организме, в этой части исследования была определена скорость секреции de novo синтезируемого ano Е. Для этого гепатоциты инкубировали в течение 18 часов в бессывороточной среде, содержащей 10 14

мкКи/мл ( С)-леицина. Затем среду лиофилизовали, белки разделяли методом электрофореза и определяли включение метки в ano Е. Из результатов, представленных в табл. А следует, что гепатоциты гипореактивных кроликов синтезируют в 2 раза больше ano Е, чем клетки гиперреактивных животных, при этом отличий в секреции альбумина не отмечено.

Табп. 4. Секреция альбумина и ano Е в общей белковой фракции гепатоцитами гипо- и гиперреактивных кроликов, содержавшихся 10 недель на обогащенном ХС

корме._

Контрольные Гипореактивные Гиперреактивные (стандартный корм)

х103 имп./мин/мг белка клеток

АпоЕобщ. 18,2 ±1,3 41,1 ± 2,2a® 19,3 ±1,6

альбумин 452,7 + 30,8 4 419,4 + 29,0

Представлены средние ± ошибки среднего трех экспериментов, а-Р< 0,05; достоверность отличий в сравнении с контрольной группой. б-Р< 0,05; достоверность отличий между экспериментальными группами.

Для того, чтобы выяснить сопряжено ли увеличение синтеза ano Е гепатоцитами гипореактивных кроликов с изменением уровня ano E-богатых ЛВП в плазме, был проведен анализ апобелкового состава фракции ЛВП (1,063< d<1,125 г/см3), выделенной из плазмы гипо- и гиперреактивных кроликов. Было установлено, что во фракции ЛВП гипореактивных кроликов содержание ano Е увеличено в 1,5-3 раза,-по сравнению с ЛВП, выделенными из плазмы гиперреактивных животных. Увеличение уровня обогащенных ano Е ЛВП в плазме гипореактивных кроликов может вносить позитивный вклад в явление устойчивости к развитию ГХС в ответ на пищевую нагрузку. Об этом свидетельствуют многочисленные экспериментальные и клинические данные последних лет (Ordovas et al., 1998; Mahley a. Ji, 1999). В частности, было показано, что в отличие от контрольных мышей, трансгенные мыши с высоким уровнем экспрессии гена ano Е приобретают устойчивость к развитию алиментарной ГХС (Shimano et al., 1992).

Таким образом, феномен гипореактивности у кроликов может быть обусловлен, по крайней мере отчасти, высокой скоростью секреции ano Е печенью, связанным с этим увеличением уровня ano E-содержащих ЛВП и эффективности обратного транспорта ХС.

Глава 3. ВЛИЯНИЕ ЛИПИДОВ ЛП НА СИНТЕЗ ЖЕЛЧНЫХ КИСЛОТ В КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ГЕПАТОЦИТАХ КРОЛИКА И ЧЕЛОВЕКА.

Для того, чтобы детализировать эффект пищевых липидов на синтез желчных кислот, в этой части работы изучалось влияние рХМ на этот процесс на первичной культуре гепатоцитов человека и нормореактивных кроликов. Для сравнения были использованы обогащенные ХС ЛП (р-ЛОНП и ЛВПг). Эксперименты проводили по спедующей схеме: гепатоциты инкубировали 18 часов в среде Игла, содержащей различные добавки: рХМ, (5-ЛОНП, ЛВП2, ЖК в комплексе с альбумином и по окончании инкубации в культуральной среде определяли концентрацию желчных кислот.

Инкубация гепатоцитов кролика и человека с рХМ приводила к дозозависимому внутриклеточному накоплению ХС, ТГ и ЭХС (Kosykh et al., 1991; 1994). При этом увеличение внутриклеточного содержания нейтральных липидов рХМ сопровождалось снижением синтеза желчных кислот (Рис. 4).

3 о

¡41

* С ■з: « о®.

СО р

¡В

« 2

« О

5 -4 -

1 -

Таурохслиевая к-та а

Концентрация ЯП: рХМ (150 мкг ХС/мл) (3-ЛОНП (150 мкг ХС/мл) ЛВП2 (180 мкг ХС/мл)

'Ж ' -"У

Рис. 4. Влияние липопротеидов на синтез конъюгированной холевой кислоты в гепатоцитах кролика.

Представлены результаты одного воспроизводимого эксперимента из двух проведенных экспериментов. Представлены средние ± ошибки среднего трех повторов, а- Р<0,05 , достоверность отличий в сравнении с контролем; 6- Р< 0,05, в сравнении с эффектом рХМ.

Важно отметить, что существенных различий в эффекте рХМ на синтез желчных кислот в гепатоцитах человека и кролика не обнаружено (КоэукЬ е1 а1., 1994). В отличие от рХМ, обогащенные ХС ЛП ((3-ЛОНП и ЛВПг) и осуществляющие обратный транспорт ХС в печень увеличивают синтез желчных кислот в гепатоцитах кролика и человека. В чем причина этого различия? Данные о том, что рХМ, в отличие от (3-ЛОНП и ЛВП2 , при высоких концентрациях индуцируют внутриклеточное накопление ТГ {КозукЬ е1 а1„ 1991), позволили предположить, что ингибирующий эффект рХМ может быть обусловлен воздействием ЖК. Проверка этой гипотезы показала, что инкубация гепатоцитов с олеиновой и пальмитиновой кислотами приводит к снижению синтеза желчных кислот (Эггитоу е! а1., 1991). Следовательно, избыточное поступление ЖК в составе рХМ в гепатоциты кролика по крайней мере отчасти объясняет отмечаемое снижение синтеза желчных кислот.

Вместе с этим существует другое объяснение этого эффекта, основанное на возникающем под воздействием рХМ дефиците пула ХС, который преимущественно используется в гепатоцитах в процессе синтеза желчных кислот (Kosykh et al., 1991; 1994). Так, принято считать, что субстратом для синтеза желчных кислот является преимущественно de novo синтезированный ХС и ХС-ЛВП2 (Einorsson et ah, 1979; Davis et al., 1983; Ford et al., 1985; Herscovitz et al, 1985). При этом существует мнение, что холестерин, поступающий в гепатоциты в составе рХМ, преимущественно используется в другом процессе - в формировании частиц ЛОНП для выведения избыточного количества ТГ. Учитывая это и наши данные, что рХМ значительно ингибируют синтез ХС, можно предположить, что дефицит вновь-синтезированного ХС и недостаточное его восполнение поступающим в гепатоциты ХС-ЛВПг ведет к подавлению синтеза желчных кислот.

Нами было также показано, что совместная инкубация гепатоцитов с физиологическими концентрациями рХМ и ЛВПг значительно нейтрализует ингибирующий эффект рХМ на синтез желчных кислот (Рис.4). Эти результаты подтверждают, что ЛВПг принадлежит ведущая роль в стабилизации скорости синтеза желчных кислот в гепатоцитах кролика и человека в условиях пищевой ХС нагрузки. Эта часть данных не противоречит результатам, ранее полученным на гепатоцитах крысы, из которых следует, что богатые ХС ЛП (ß-ЛОНП, ЛНП, ЛВПг) стимулируют синтез желчных кислот (Ford et al., 1985; Mackinnon et al., 1987; Davis et al., 1987). Однако, в экспериментах, проведенных на гепатоцитах крысы было установлено, что богатые ТГ рХМ также способны стимулировать синтез желчных кислот (Fry et al., 1990). В продолжении этих работ в исследованиях на крысах выявлен стимулирующий эффект пищевой ХС нагрузки на транскрипцию гена фермента ХС-7а-ОН ( Vlahceivic et al., 1994; Horton et a!., 1995). Таким образом, данные, полученные на крысах и кроликах, свидетельствуют о наличии существенных различий в регуляции липидами пищи синтеза желчных кислот у этих животных (Kosykh et al., 1991; Poortman et al., 1993; Xu et al., 1995;), Пока неизвестно, связаны ли эти внутривидовые отличия с некоторыми особенностями в общем метаболизме ХС у кролика и человека с одной стороны и крысы, с другой, или с дефектом в регулируемом ХС элементе в гене промотора ХС-7а-ОН кролика

и человека и/или дефектом в факторах транскрипции, взаимодействующих с этим элементом (Schwartz et al„ 1998).

Суммируя полученные в этой части работы данные можно сделать заключение, что подавление синтеза желчных кислот у кроликов при пищевой ХС нагрузке связано с воздействием липидов (ТГ и ХС) рХМ на этот процесс в гепатоцитах. В отличие от гепатоцитов крысы, гепатоциты кролика и человека в ответ на избыточное поступление ХС в составе рХМ не способны увеличить синтез желчных кислот. По-видимому, основная часть пищевого ХС выводится из гепатоцитов вместе с ТГ в составе ЛОНП, что может приводить к увеличению уровня ХС и ТГ в плазме и развитию гиперлипопротеидемии. Следовательно, от эффективности функционирования системы обратного транспорта ХС в составе ЛВП и его окисления в желчные кислоты будет во многом зависить уровень ХС в плазме в ответ на пищевую ХС нагрузку.

Глава 4. ВЛИЯНИЕ ПРОБУКОЛА НА СИНТЕЗ ХОЛЕСТЕРИНА И ЖЕЛЧНЫХ КИСЛОТ В ГЕПАТОЦИТАХ КРОЛИКА.

Общепризнанно, что одним из перспективных подходов к лечению ГХС является стимуляция обратного транспорта ХС в печень с последующим его окислением и выведением из организма в виде желчных кислот. Однако до настоящего времени все еще не созданы препараты специфически стимулирующие этот процесс. В то же время накоппено достаточно данных , что пробукол оказывает воздействие на различные этапы системы обратного транспорта ХС (Sirtori et а!., 1988; Gwynne, 1988; Hayek et al., 1991). Вопрос о влиянии пробукола на синтез желчных кислот до проведение этой работы оставался открытым.

Проверку гипотезы о возможном влиянии пробукола на синтез желчных кислот и участии ЛВПг в этом процессе проводили на первичной культуре нормореактивных гепатоцитов кролика. Принимая во внимание тот факт, что пробукол обладает выраженной антиоксидантной активностью, в качестве препарата сравнения мы использовали широко известный антиоксидант - а-токоферол. В настоящей работе изучали воздействие пробукола на синтез

желчных кислот, секрецию ano Е и захват ХС ЛВПг культивируемыми гепатоцитами кроликов.

Синтез ХС и желчных кислот культивируемыми гепатоцитами.

Инкубация гепатоцитов в среде, содержащей пробукол (100 мкМ), приводила к снижению синтеза ХС, тогда как а-токоферол стимулировал этот процесс (Лакеев и соавт., 1993). Снижение пробуколом синтеза ХС сопровождалось значительным увеличением внутриклеточного содержания свободного и этерифицированного ХС, тогда как а-токоферол в той же концентрации не влиял на этот показатель. Эти данные позволили предположить, что пробукол стимулирует поглощение ХС в составе ЛП. Действительно, в серии экспериментов была выявлена стимуляция пробуколом поглощения ХС-ЛВПг гепатоцитами ( Лакеев и соавт., 1993).

Инкубация гепатоцитов с ЛВПг (250 мкг белка/мл) в течение 48 часов приводила к стимуляции синтеза конъюгированной холевой кислоты на 20-27%. В присутствии пробукола (100 мкМ) и ЛВПг наблюдалось дальнейшее увеличение синтеза желчной кислоты (Табл. 5). Полученные данные означают, что одним из механизмов стимуляции пробуколом этого процесса является увеличение доставки ХС в клетку в составе ЛВПг.

Влияние пробукола на секрецию ano Е и захват ЛВП?.

Данные о том, что для проявления стимулирующего эффекта пробукола требуется достаточно продолжительный период инкубации (24-48 часов), позволили нам предположить, что под влиянием пробукола в среду секретируется

какой-то фактор (наиболее вероятно ano Е), который увеличивает захват ЛВПг.

Чтобы это проверить, меченую ( С)-лейцином белковую фракцию, секретируемую гепатоцитами в бессывороточную среду в течение 24 часов в присутствии и в отсутствии препарата, разделяли методом электрофореза в ПААГ и определяли эффективность включения метки в ano Е. В результате было установлено, что пробукол (100 мкМ) стимулировал секрецию ano Е в 1,5-3 раза. По данным денситометрии электрофореграмм апобелков ЛВПг установлено, что ЛВП2 , преинкубированные с гепатоцитами в среде с пробуколом (100 мкМ),

содержали в 2-3 раза больше ano Е, чем ЛВПг , преинкубированные с клетками, но без препарата. (Лакеев и соавт., 1993). Показано, что сформировавшиеся в присутствии пробукола ano E-содержащие ЛВПг более эффективно, чем ЛВПг , образовавшиеся в отсутсвии пробукола, поглощаются клетками рецептор-опосредованным путем. Для выяснения молекулярного механизма стимуляции пробуколом синтеза ano Е потребуются дополнительные исследования.

Табл. 5. Влияние пробукола на синтез конъюгированной холевой кислоты культивируемыми гепатоцитами в присутствии ЛВПг.

Таурохолевая к-та Гликохолевая к-та

Эксп. 1. Контроль

+ ЛВПг ( 250 мкг/мл) + ЛВПг (250 мкг/мл) + пробукол (100 мкМ)

Эксп.2. Контроль

+ ЛВПг (250 мкг/мл) + ЛВПг (250 мкг/мл)+ пробукол (100 мкМ)

мкг/мг клеточного белка

1,04 + 0,10 0,55 + 0,05

% от контроля

120 + 4'

174 ±11

127 + 7°

аб

163+11

аб

2,93 ±0,25 1,29 + 0,10

% от контроля

125 + 5

166 ±7'

аб

117 + 13

140 + 0,11'

Представлены средние ± ошибки среднего трех повторов, а - Р < 0,05; достоверность отличий в сравнении с контролем, б-Р < 0,05; достоверность отличий в сравнении с ЛВПг. Значения контроля приняты за 100%.

Следует особо отметить, что наряду с положительным влиянием пробукола на систему обратного транспорта ХС в печень, выявлен его негативный эффект, выражающийся в снижении секреции ano A-I печенью (Hayek et al., 1991). В результате этого, как считают, уровень ЛВП в плазме пациентов, получающих пробукол значительно снижается ( Durrington et al., 1985; Franceschini et al., 1989), что может приводить к увеличению риска развития сердечно-сосудистых заболеваний (Vega a. Grundy, 199В). По этой причине в последние годы пробукол в основном используется в качестве гиполипидемического препарата в комбинации с

другими препаратами, особенно фибратами, которые способны в значительной степени нейтрализовать негативный эффект пробукола на ЛВП и существенно усилить общий гиполипидемический эффект ( Нуралиев и соавт., 1997; 1998 ).

Нами было установлено, что наряду с лробуколом, а-токоферол также стимулирует секрецию желчных кислот. Однако, в отличие от пробукола, а-токоферол реализует свой эффект другим способом. Добавление его в среду культивирования гепатоцитов не вызывает увеличение внутриклеточного содержания ХС и его эфиров и не изменяет скорости накопления ХС ЛВПг. В то же время в присутствии экзогенного ХС плазмы а-токоферол стимулирует синтез ХС (Лакеев и соавт., 1993). На основании литературных данных о том, что в качестве субстрата для синтеза желчных кислот гепатоцитами используется de novo синтезируемый ХС (Bjorkhem et al., 1979; Einarsson et al., 1979), а также полученных нами результатов можно сделать заключение, что а-токоферол стимулирует синтез желчных кислот опосредовано через стимуляцию синтеза ХС . Наши результаты согласуются с данными, полученными в экспериментах на кроликах, в которых было показано, что а-токоферол стимулирует активность ХС-7а-ОН в печени и это приводит к умеренному снижению уровня ХС в плазме животных (Phonpanichrasamee et al., 1990).

Глава 6. ВЛИЯНИЕ ФИБРАТОВ НА ПРОДУКЦИЮ ГЕПАТОЦИТАМИ ЧЕЛОВЕКА АПОЛИЛОПРОТЕИНОВ ЛОНП и ЛВП.

В отличие от пробукола, фибраты увеличивают уровень ХС-ЛВП, ano A-I и ano A-Il ЛВП в плазме и являются более эффективными гиполипидемическими препаратами, снижающими уровень ало B-содержащих ЛП (ЛОНП и ЛНП) у пациентов с нормолипидемией и с различными типами гиперлипидемий (Olsson а. Lang, 1978; Kohlmeier a. Schliert, 1982). Несмотря на их широкое использование в клинической практике, молекулярные механизмы их гиполипидемического действия до последнего времени оставались мало изученными.

На основании данных, что фибраты увеличивают уровень экспрессии нескольких генов, кодирующих ферменты, вовлеченные в процесс ß-окисления ЖК в пероксисомах ( Locket al., 1989; Dreyeret al., 1992), нами была проверена гипотеза о способности фибратов оказывая воздействие на экспрессию генов ano В, ano С-III, ano A-I, ano А-И в печени, которое в итоге и приводит к наблюдаемым в плазме

пациентов изменениям в содержании основных аполипопротеинов и метаболизме ЛП.

Большая часть исследований проходила в сотрудничестве с лабораторией проф. Б. Стаелза (институт Пастера, Франция). 6.1. Влияние фибратов на продукцию ano В-содержащих ЛП.

Хорошо известно, что гиполипидемическое действие фибратов связано со стимуляцией липопротеидлипазы (ЛПЛ), катализирующей гидролиз ТГ ЛОНП, в результате чего ускоряется клиренс ЛОНП печенью ( Kohlmeieret al., 1982), а также со снижением секреции печенью ТГ в составе ЛОНП ( Ginsberg et al., 1979).

Нами было впервые установлено, что безафибрат способен в терапевтической концентрации (10 мкМ) снижать секрецию ano В и основных классов нейтральных липидов - ТГ, ХС, ЭХС ЛОНП культивируемыми гепатоцитами человека (Табл. 6). При этом снижение секреции ano В не сопровождалось изменением уровня специфической мРНК (Kosykh et al., 1987; Staels et al., 1995). Это означает, что, безафибрат снижает количество секретируемых клетками печени человека ano В-содержащих ЛП и регуляция безафибратом продукции ano В осуществпяется на посттранскрипционном уровне. Наряду с этим эффектом отмечалось ингибирование синтеза ТГ, ХС и ЭХС в гепатоцитах, в результате чего снижалась секреция de novo синтезированных липидов в составе ЛОНП (Kosykh et al., 1987). Эти данные были подтверждены в работах других авторов. Так было показано, что фибраты снижают секрецию ano В Hep G2 клетками (Baru-Tana et al., 1988; Lamb et al., 1993), ингибируют синтез ЭХС в печени экспериментальных животных ( Shand a. West, 1994 ) снижают активность ацетил-КоА карбоксилазы

(Asieduet al., 1995) и ацетил-КоА синтетазы ЖК ( Blake et al., 1990) . Снижение активности ферментов, вовлеченных в синтез ЖК, приводит к истощению пула ЖК, утилизирующихся в процессе синтеза ТГ и ЭХС ( Rustan et al., 1992), которые, как известно, являются стимуляторами секреции ЛОНП.

Полученные данные позволили сделать заключение, что в основе снижения секреции ano В-содержащих ЛП безафибратом, лежит ингибирование синтеза ТГ и ЭХС, являющихся необходимыми компонентами для формирования и секреции ano В-содержащих ЛП (Huff a. Burnett, 1997).

Таблица 6. Влияние безафибрата на секрецию ano В и нейтральных липидов в составе ЛОНП гепатоцитами человека

фракция ЛОНП (d< 1,006 г/ см3)

фракция ЛПП+ЛНП (1,006<сК1,063 г/см3)

Ало В

ТГ

ХС

ЭХС

Ano В

Эксп.1. контроль

безафибрат (ЮмкМ) % ингибирования Эксп.2. контроль

безафибрат (ЮмкМ) % ингибирования

мкг/мг клет. белка/18 час 0,72±0,05 39,3+4,2 6,9+0,7

1,5+0,1

0,58+0,06a 23,5+3,6* (20%) (40%)

4,7+0,4а 1,2±0,1а (32%) (20%)

1,06+0,08 27,1±2,1 4,8±0,3 1,2±0,2

0,62+0,04" 19,2±1,4а 3,1+0,3а 0,8±0,1а (42%) (29%) (35%) (33%)

0,08±0,02 0,07±0,03 0,12+0,04 0,08±0,02

Гепатоциты инкубировали в бессывороточной среде Игла с и без добавления безафибрата в течение 18 часов. ЛОНП и ЛПП+ЛНП фракции выделяли препаративным ультрацентрифугированием и определяли концентрацию апо В и нейтральных липидов. Представлены средние + ошибки среднего трех повторов, а - Р <0,05,достоверность отличий в сравнении с контролем.

Понижение фибратами уровня ЛОНП в плазме может быть связано не только с подавлением секреции ЛОНП печенью, но и с изменением концентрации плазменных (ко) факторов, в частности ало C-III , участвующего в гидролизе и/или клиренсе ТГ-богатых ЛП частиц в плазме. Литературные данные свидетельствуют, что ano C-III ингибирует гидролиз ТГ, осуществляемый ЛПЛ и печеночной липазой и тем самым снижает захват ТГ-богатых ЛП печенью ( Wang et al., 1985; Ginsberg et al., 1986). Исследования на трансгенных животных показали, что содержание ТГ в плазме прямо коррелирует с уровнем ano C-III и экспрессии гена ano C-III в печени. Эти данные убедительно доказывают прямое участие ano C-III в развитии ГТГ (Ito et al., 1990). В этой связи мы попытались выяснить влияние фибратов на уровень экспрессии гена ano C-III на крысах и на культивируемых гепатоцитзхкрысы и человека.

6.2. Влияние фибратов на уровень экспрессии гена ano C-III в гепатоцитах крысы и человека.

Содержание крыс самцов в течение 14 дней на стандартном корме, в который добавлялся фенофибрат ( 0.5% от веса корма) вызывает значительное снижение ТГ в плазме, сопровождаемое более чем 6-кратным снижением содержания в печени ano C-lll мРНК и значительным увеличением сдержания мРНК пероксисомального фермента АКО, используемого в качестве положительного контроля (Рис. 5). Ранее было установлено, что у грызунов фибраты, являясь индукторами системы р-окисления ЖК в печени, увеличивают уровень экспрессии нескольких генов, кодирующих ферменты пероксисом, что приводит к пролиферации пероксисом (Lock et al., 1989; Auwerx, 1993). Дополнительные эксперименты показали, что другие фибраты, включая кпофибрат и гемфиброзил, вызывают аналогичные, но менее выраженные эффекты, чем фенофибрат (Staels et al., 1995).

Эти результаты означают, что фибраты оказывают негативное влияние на экспрессию гена ano C-III в печени крысы. Полученные in vivo данные нашли подтверждение в проведенных нами экспериментах на первичной культуре гепатоцитов крысы. Так, добавление в культуральную среду на 24 часа различных концентраций фенофибрата приводило к дозозависимому снижению содержания ano C-III мРНК и увеличению уровня АКО мРНК (Staels et al., 1995; Andersson et al., 1999).

•28S

-18S

АПО С-lll мРНК

Щ Pf !#

I__._11-

КОНТРОЛЬ ФФ

АПО C-III

АКО

Рис.5. Фенофибрат снижает уровень триглицеридов в плазме и содержание ano C-III мРНК в печени крыс.

Крысы ( самцы весом 250 г ) получали в течение 14 дней фенофибрат с кормом (0,5% вес/вес). А - уровень ТГ в плазме и ano C-III мРНК в печени контрольных получавших фенофибрат животных. Представлены средние ± ошибки среднего трех повторов* - Р<0,05; достоверность отличий в сравнению с контролем. Б -Нозен бпот. 10 мкг общей РНК наносилось в лунку для злектрофоретического разделения РНК. После переноса РНК на нейлоновую мембрану проводили гибридизацию с кДНК зондами, специфическими для крысиной ano С-Ш и АКО мРНК. Положение полос 18S и 28S рибосомальной РНК показано на блоте.

Чтобы выяснить регулирует ли фенофибрат экспрессию гена ano С-lll на транскрипционном уровне была определена скорость транскрипции гена ano С-lll. Эксперименты проводили на первичной культуре крысиных гепатоцитов, проинкубированных 24 часа с фенофибратом, затем выделяли ядра клеток и

инкубировали их со смесью нуклеотидов, включая меченый Р-уридин. На рис. 6 представлены авторадиоргамма после проведенного дот блоттинга и диаграмма после количественной денситометрии пятен авторадиограммы. Из полученных данных следует, что скорость транскрипции гена ano С-lll в 2 раза снижалась в ядрах, изолированных из гепатоцитов, обработанных фенофибратом, по сравнению с контрольными клетками, тогда как этот показатель для гена АКО увеличивался более чем 5 раз.

Аналогичные данные по ano С-lll были получены на первичной культуре гепатоцитов человека. Однако, в отличие от гепатоцитов крыс, в гепатоцитах человека уровень экспрессии гена пероксисомального фермента АКО не изменялся

А. Диаграмма

Б. Авторадиограмма

■ КОНТРОЛЬ □ фф

Cnn I™I

-а >

АКО

АПО C-III

ВЕКТОР

АПО C-III АКО

КОНТРОЛЬ ФФ

Рис. 6. Фенофибрат снижает скорость транскрипции гена ano C-III и увеличивает скорость транскрипции гена АКО. Б. Авторадиограмма дот блота после проведенного " nuclear run-on" анализа; А. Диаграмма , полученная в результате проведенной количественной сканирующей денситометрии. Эксперимент был проведен на культивируемых крысиных гепатоцитах , проинкубированных в течение 9 часов в среде без и с фенофибратом (500 мкМ). Определение скорости транскрипции генов проводили согласно (Navins, 1987). Представлены данные одного воспроизводимого эксперимента из трех проведенных экспериментов.

(Staels et al., 1995), что указывает на межвидовые отличия в способности фибратов индуцировать ферменты пероксисом . Эти результаты лодтверздают ранее высказанные предположения, что в печени человека фибраты не оказывают существенного влияния на ферменты р-окисления ЖК (Reddy et al., 1982) и не вызывают связанного с этим побочного действия. Таким образом, наши результаты показывают, что регуляция экспрессии гена ano C-III у человека осуществляется независимо от индукции генов, кодирующих пероксисомальные ферменты.

В настоящее время считается, что в основе снижения фибратами уровня экспрессии гена ano C-III лежат по крайней мере два механизма ( Hertz et al., 1995 ). Ранее было установлено, что фибраты активируют транскрипционный фактор -PPARa, который связываясь со специфическим регулируемым участком на ДНК активирует экспрессию генов ряда пероксисомальных ферментов ( Dreyer et al., 1992 ). В работе с фибратами Hertz et al. ( 1995 ) показали, что PPARa, являясь умеренным активатором транскрипции гена апо C-III, конкурирует с сильным активатором транскрипции этого гена - HNF-4 за связывание с регулируемым

элементом - СЗР в промоторе гена, и тем самым снижает экспрессию гена ano C-III. Наряду с этим показано, что фибраты снижают уровень экспрессии гена транскрипционного фактора HNF-4.

Из клинических и экспериментальных данных следует, что ano С-Ш вовлечен в регуляцию ano Е-опосредованого клиренса ТГ-богатых ЛП, Снижение содержания ano C-III в этих ЛП приводит к их более эффективному выведению из кровотока клетками печени (Malmendier et al., 1989; Staels et al., 1998). Таким образом, снижение фибратами уровня экспрессии гена ano C-III лежит в основе одного из потенциальных молекулярных механизмов их гиполипидемического действия. Поскольку PPARa опосредует эффекты не только фибратов, но и полиненасыщенных ЖК на экспрессию гена ano C-III , в настоящее время разрабатываются подходы для снижения уровня экспрессии гена ало C-III in vivo пищевыми ЖК, что может иметь огромное значение для диетотерапии ГТГ.

6.3. Влияние фибратов на уровень экспрессии генов ano A-I и ano A-II в гепатоцитах человека.

Влияние фибратов на секрецию белков и внутриклеточное содержание специфических мРИК в гепатоцитах человека.

Многочисленные эпидемиологические, клинические и экспериментальные данные демонстрируют, что снижение уровня ЛВП в плазме людей и животных приводит к увеличению риска развития атеросклероза и ИБС (Vega а. Grundy, 1996). Известно, что фибраты увеличивают уровень ЛВП и их основных апобелков: ano A-I и ano А-И (Lussler-Сасап et ai., 1989; Bard et al., 1992). Из экспериментальных данных следует, что ano A-I принадлежит ключевая роль в защите от развития атеросклероза (Barter, 1993; Vega a. Grundy, 1996). До последнего времени оставался невыясненым механизм(ы) увеличения фибратами содержания этих апобелков в плазме.

В настоящем исследовании нам впервые было показано, что увеличение уровня ano A-I и ano A-II в плазме человека под влиянием фенофибрата обусловлено его прямым воздействием на продукцию ano А-1 и ano A-II гепатоцитами и не является следствием изменения их захвата клетками печени, а также состава и содержания липидов в плазме. Инкубация гепатоцитов человека в течении 72 часов в среде, содержащей 500 мкМ фенофиброевой

кислоты, приводит к значительному увеличению секреции ano А-1 и ano A-II. Следует отметить, что секреции ano А-1 стимулируется в меньшей степени, чем ano A-II. (Рис.7).

Ano А-1 Ano A-II тРанс" феррин

Ano А-1

ъжтт|р

Трансфер-ЮАЖЙИМВ

рин

О 100 500 Фенофиброевая кислота (мкМ)

Рис. 7. Влияние фенофиброевой кислоты на секрецию ало A-I, ano A-Il, трансфертна (А) и содержание мРНК (Б) е культивируемых, гепатоцитах человека. А. Гепатоциты инкубировали в среде, содержащей 100 мкМ , 500 мкМ фенофиброевой кислоты или растворитель DMSO (контроль) в течение 72 часов. Определение концентрации ano A-I, ano A-Il и трансферрина в среде проводили иммуноферментным методом. Представлены средние ± ошибки среднего трех повторов. *- Р<0,05; достоверность отличий в сравнении с контролем. Б. Нозерн блот. 10 мкг общей РНК наносилось в лунку для электрофоретического разделения РНК. После переноса РНК на нейлоновую мембрану проводили гибридизацию со специфическими кДНК зондами. Положение полос 18S и 28S рибосомальной РНК показано на бпоте.

Увеличение секреции ano A-I и ano A-II сопровождается увеличением внутриклеточного содержания специфических мРНК ( Vu Dacet al., 1995; Gervois et al., 1998). В отличие от ano А-1 и ano А-И, секреция трансферрина и внутриклеточное содержание специфической мРНК не изменяется под воздействием фенофибрата (Рис.7). Отсутствие эффекта фенофибрата отмечено также на секрецию других плазменных белков, включая альбумин, гаптоглобин, церулоплазмин, что свидетельствует о специфичности действия фенофибрата ( Bertholou et al., 1996 ).

Поскольку фенофибрат оказывает значительно более выраженное стимулирующее действие на секрецию ano A-Il, чем на ano А-1, изучение воздействия фибрата на транскрипционном уровне проводилось на ano А-И гене.

Для этого была получена конструкция, созданная на основе плазмиды, содержащей ген хлораминофеникол-ацил-трасферазы (CAT), контролируемый промотором ano A-II гена человека. Этой конструкцией (аро A-II-CAT) трансфецировали Hep G2 клетки и инкубировали их в присутствии фенофибрата. В качестве контроля использовали HepG2 клетки, трансфецированные конструкцией созданной на основе плазмиды, содержащей ген CAT, контролируемый встроенным промотором вируса саркомы Рауса. Об уровне экспрессии генных конструкции судили по активности CAT. Из представленных на Рис. 8 данных следует, что под воздействием 500 мкм фенофибрата аро A-II-CAT активность увеличивалась в 1.5 раза. Активное производное фибратов Wy- 14643 в концентрации 100 мкМ увеличивало активность ano A-II-CAT в 2 раза. CAT активность контрольной плазмиды не изменялась при идентичных условиях (Vu Dac et al., 1995). Эти результаты означают, что фибраты увеличивают продукцию ano A-Il в печени человека на уровне транскрипции.

< О

ш s н

м <

к с о

о. ух о а

I-

150-

125-

100-

*%%%

КОНЦЕНТРАЦИЯ ВЕЩЕСТВ ( х 10 М)

Рис. 8. Концетрационная зависимость влияния фенофиброевой кислоты (ФФ) и Wy-14643 на уровень экспрессии гена ало A-II-CAT.

HepG2 клетки трансфецировали плазмидой, содержащей конструкцию, включающую CAT вен, управляемый фрагментом ano A-II промотора (-911 - +160). Трансфецированные клетки инкубировали с указанными концентрациями фенофиброевой кислоты и Wy-14643 и определяли активность CAT. Значения представлены в виде средних ± стандартное отклонение трех повторов. *-Р<0,001, достовернсть отличий в сравнению с контролем.

В последующем аналогичные данные, свидетельствующие о стимуляции фибратами экспрессии гена ano А-1 на транскипционном уровне, были получены на культуре гепатоцитов и на трансгенных животных (Berthou et al.,1996). Молекулярный механизм регуляции фибратами экпрессии генов ano А-1 и ano A-Il был детально исследован французскими учеными в совместно проведенных с нами работах (Vu Dac et al., 1996 ; Vu Dac et al., 1998). Так, в промоторе ano A-I и ano A-ll генов человека были идентифицированы регулируемые PPARa участки и показано, что индукция фибратами экспрессии этих генов опосредуется взаимодействующим с этими участками PPARa.

Таким образом, собственные и литературные данные показывают, что фибраты увеличивают в печени человека уровень экспрессии обоих генов апо ЛВП, что приводит к увеличению уровня апо A-I и апо А-И в плазме человека. Увеличивая уровень экспресси гена апо А-1 в печени и содержание апо А-1 в плазме человека фибраты оказывают положительное терапевтическое воздействие при гипоальфапипопротеидемии и атеросклерозе (NCEP, 1993; Staels et al., 1998). Делать окончательный вывод о значении увеличения фибратами уровня ano A-II в плазме человека еще преждевременно, поскольку роль ano A-II в развитии атеросклероза у человека еще до конца не выяснена.

ВЫВОДЫ

1. Увеличение секреции гепатоцитами частиц липопротеидов очень низкой плотности (ЛОНП ) в ответ на потребление кроликами обогащенного холестерином (ХС ) корма является, наряду со снижением активности ЛНП-рецепторов, ведущей причиной развития алиментарной ГХС.

2. Наличие продуктов автоокисления холестерина в обогащенном ХС корме не приводит к дальнейшему увеличению количества секретируемых гепатоцитами кроликов частиц ЛОНП, по-сравнению с животными, получавшими неокисленный ХС. В тоже время, потребление кроликами корма, содержащего ХС и продукты его автоокисления, вызывает усиленное накопление ХС и его эфиров в гепатоцитах,

сопровождающееся увеличением секреции обогащенных эфирами холестерина ЛОНП, что может быть причиной быстрого развития алиментарной ГХС.

3. Избыточное поступление нейтральных липидов в составе обогащенных ТГ ремнантов хиломикрон (рХМ) и обогащенных ЭХС ЛП (р-ЛОНП и ЛНП) в гепатоциты человека и кролика в условиях in vitro стимулирует секрециию частиц ЛОНП. Установлено, что регуляция продукции аполипопротеина В (ano В) ЛОНП осуществляется на посттранскрипционном уровне и в качестве стимуляторов его продукции выступают свободный и этерифицированный ХС.

4. Повышенная чувствительность кроликов к развитию алиментарной ГХС сопряжена с низкой базальной скростью синтеза желчных кислот, значительным ее снижением при пищевой нагрузке ХС и увеличением секреции ЭХС-ЛОНП. К характерным особенностям метаболизма ХС у кроликов, устойчивых к развитию алиментарной ГХС, относятся: а) высокая и устойчивая к пищевой нагрузке ХС базальная скорость синтеза желчных кислот в гепатоцитах; б) высокий уровень секреции ano Е гепатоцитами и увеличение содержания в плазме ano Е-содержащих ЛВП, осуществляющих обратный транспорт ХС.

5. Ремнанты хиломикрон подавляют синтез желчных кислот в культивируемых гепатоцитах кролика и человека, что согласуется с эффектом обогащенного ХС корма на синтез желчных кислот у кроликов. В качестве ингибиторов синтеза желчных кислот могут выступать основные компоненты рХМ - олеиновая и пальмитиновая кислоты. В отличие от рХМ, ЛВПг. осуществляющие обратный транспорт ХС в печень, стимулируют синтез желчных кислот, и тем самым обеспечивают поддержание нормального уровня ХС в плазме при пищевой нагрузке.

6. Ответ гепатоцитов кролика и человека на избьлочную доставку в них пищевого ХС не сопровождается увеличением синтеза желчных кислот как в крысиных гепатоцитах. Процесс синтеза желчных кислот у кролика и человека, в отличие от крысы, следовательно, не играет определяющей роли в компенсаторной реакции, направленной на снижение внутрипеченочного уровня ХС

и его выведения из организма, что является одной из причин большей подверженности кролика и человека к развитию алиментарной ГХС.

7. Пробукол и а-токоферол в концентрациях сравнимых с терапевтическими дозами стимулируют синтез желчных кислот в культивируемых гепатоцитах кролика. Этот эффект опосредован увеличением внутриклеточного содержания ХС -субстрата для ХС-7а-гидроксилазы - ключевого фермента биосинтеза желчных кислот. В отличие от а-токоферопа, обеспечивающего приток ХС в клетку за счет стимуляции синтеза ХС, действие пробукола связано со стимуляцией синтеза и секреции ano Е, ассоциация которого с ЛВПг приводит к увеличению рецептор-зависимого захвата этих частиц гепатоцитами.

8. Безафибрат в концентрациях сравнимых с терапевтическими дозами подавляет секрецию частиц ЛОНП культивируемыми гепатоцитами человека, снижая продукцию апо В на посттранскрипционном уровне. Этот эффект опосредован ингибированием безафибратом синтеза ТГ и ЭХС, являющихся незаменимыми компонентами для формирования частиц ЛОНП.

9. Фибраты в терапевтической концентрации снижают уровень экспрессии гена ano C-III в печени крыс и культивируемых гепатоцитах крысы и человека. В отличие от гепатоцитов крысы, в клетках человека этот эффект не сопровождается побочным воздействием на метаболизм липидов в печени, проявляющимся в увеличении уровня экспрессии генов пероксисомальных ферментов. Полученные результаты означают, что гипотриглицеридемическое действие фибратов может быть связано с уменьшением уровня экспрессии гена ano C-III, снижением содержания ano C-III в частицах ЛОНП и сопряженным с этим увеличением клиренса этих липопротеидов печенью.

10. Увеличение фибратами содержания ano A-I и ano A-II в плазме человека обусловлено увеличением скорости транскрипции генов ano A-I и ano А-И в гепатоцитах человека. Стимуляция фибратами экспрессии гена ano A-I в печени может рассматриваться в качестве положительного терапевтического воздействия этих препаратов при лечении дислипопротеидемии и атеросклероза.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Kosvkh V.A.. Preobrazhenski S.N., Fuki I.V., Zaikina O.E., Tsibulski V.P.,Repin V.S.and Smirnov.V.N. Cholesterol can stimulate secretion of apoprotein В by cultured human hepatocytes. Biochim.Biophys.Acta, 1985; 836: 385-389.

2. Kosvkh V.A.. Preobrazhenski S.N., Ivanov V.O.,Tsibulski V.P., Repin V.S. and Smirnov.V.N. High-affinity assosiation and degradation of 125 l-labeled low density lipoprotein by human hepatocytes in primary culture. FEBS Lett., 1985; 183:17-20.

3. Подрез E.A.. Косых В.А.. Новиков Д.А., Викторов А.В., Репин B.C. Влияние безафибрата на секрецию липопротеидов культивируемыми гепатоцитами человека. Бюллетень Всесоюзного Кардиологического Научного Центра АМН СССР, 1986, N2, стр.49-54.

4. Kosvkh V.A.. Podrez Е.А., Novikov D.K., Victorov A.V.,Dolbin AG., Repin V.S.and Smirnov V.N. Effect of bezafibrate on lipoprotein secretion by cultured human hepatocytes. Atherosclerosis, 1987; 68; 67-76.

5. Kosykh V.A. and Preobrazhenski S.N. Liver Cells In The Catabolism Of LDL And DeNovo Formation Of VLDL.Soviet Scientific Revines, section "Cardiology", v.1 Human atherosclerosis.Eds.E.I. Chazov and V.N. Smirnov, Harwood Academic Publishers GmbH. 1987, p. 121-132

6. Sudarickov A.. Berestetskava Yu.V., Kosvkh V.A.. Surguchov A.P. Cloning of rabbit apolipoprotein В gene fragment and its application for gene expression analysis under dietary conditions. Biomed. Biochim. Acta, 1987; 46: S699-S702.

7. Kosvkh V.A., Surguchov A.P., Podres E.A., Novikov D.K., Sudarickov A.B., Berestetskaya Yu.V., Repin V.S., Smirnov V.N. VLDL apoprotein secretion and apo-B m RNA level in primary culture of cholesterol-loaded rabbit hepatocytes. FEBS Lett., 1988; 232: 103-106.

8. Kosvkh V.A., Surguchev A.P., Repin V.S., Smirnov V.N. 7-ketocholesterol inhibits VLDL secretion by cultured human and rabbit hepatocytes. Biochim. Biophys. Res. Commun., 1988; 153: 1116-1121.

9. Kosvkh V.A., Podrez E.A., Novikov D.K., Volgushev S.A., Victorov A.V., Repin V.S., Smirnov V.N. Very low density lipoprotein secretion by cultured hepatocytes of rabbits fed purified or autoxidized cholesterol. Lipids, 1989; 24:109-115.

10. Babaev V.R., Kosykh V.A.. Tsibulski V.P., Ivanov V.O., Repin V.S., Smirnov V.N. Binding and Uptake of Native and Modified Low-Density Lipoproteins by Human Hepatocytes in Primary Culture. Hepatology, 1989; 10: 56-60.

11. Kosvkh V.A., Podrez E.A., Novikov D.K., Volgushev S.A.,Victorov A.V., Repin V.S., Smirnov V.N. Effects of khellin and timefurone on secretion and catabolism of

lipoproteins by cultured rabbit and human hepatocytes. Intern. J. Pharmaceutics, 1989; 57: 223-227.

12. Косых В.А.. Подрез E.A., Новиков Д.К., Волгушев С.А. Первичная культура гепатоцитов - модель для изучения метаболизма липопротеидов в печени человека. В кн: Атеросклероз человека, ред. Е.И. Чазов, В.Н. Смирнов, Наука, Москва, 1989, стр.71-90.

13 Бабаев В.Р., Косых В.А. Анализ связывания и поглощения нативных и модифицированных липопротеидов низкой плотности клетками печени человека в первичной культуре. Бюлл. эксперим. биоп.мед., 1989, N1, стр.102-104.

14. Подрез Е.А., Косых В А. Судариков А.В., Берестецкая Ю.В., Фуки И.В., Сургучев А.П., Репин B.C. 7-кетохолестерин ингибирует секрецию липопротеидов очень низкой плотности культивируемыми гепатоцитами человека и кролика. Доклады АН СССР, 1989, том 305, N 3, стр.61-65

15. Victorov АV., Kosvkh V.A. Lipopolysaccharide toxin can directly stimulate the intracellular accumulation of lipids and thier secretion into medium in the primary culture of rabbit hepatocytes. FEBS Lett., 1989; 236: 155-153..

16. Sviridov D.D., Safonova I.G., Pavlov M.Y., Kosykh V.A.. Podrez E.A., Antonov A S., Fuki I.V., Repin V.S. Inhibition of cholesterol synthesis by lovastatin tested on six human cell cultupes in vitro. Lipids, 1990; 25:177-179.

17 Репин B.C., Косых BA. Современные представления о механизмах гиполипидемического действия монокалинов и фибратов (обзор). Химико-фармакол. журнал, 1990, N 8, стр.5-8.

18. Волгушев С.А., Косых В.А, Подрез Е.А.. Новиков Д.К., Фуки И.В., Карпов Р.С., Репин B.C. Влияние келлина и таймурона на секрецию и катаболизм липопротеидов культивируемыми гепатоцитами человека и кролика. Биохимия, 1990, том 55 вып.2, стр 346-351.

19. Новиков Д.К., Косых В. А., Трахт И.Н., Подрез Е.А., Репин В.С . Влияние ремнантов хиломикрон на метаболизм холестерина в культивируемых гепатоцитах кролика: продукция липопротеидов очень низкой плотности и желчных кислот. Биохимия, 1990, том 55, вып.10, стр. 1902-1910.

20. Новиков Д.К., Косых В.А., Антонов И.В., Лакеев Ю.В.,Репин B.C. Изучение ЛВП2-зависимого синтеза желчных кислот в культуре гепатоцитов кролика: эффекты оксипроизводных холестнрина. Бюлл. эксперим. биол.мед., 1990, N9, стр.267-269.

21. Smirnov V.N., Kosykh V.A., Novikov D.K., Repin V.S. VLDL and bile acid production by cultured rabbit hepatocytes: Effect of chylomicron remnants, beta-VLDL and HDL2. 3rd International Workshop on Lipid Metabolism, 1990 Dijon, France; John Libbey and company Ltd, 1991, 51-54.

22. Smirnov V.N., Hoeg J.M., Kosykh V.N.. Monge J.C.. Repin V.S., H.B. Brewer, r. Modulation of apo В mRNA levels and apo В secretion in human hepatocytes and HepG2 cells by low density lipoproteins and free cholesterol. In: Control of Blood Cholesterol, 55th Meeting of the European atherosclerosis Society, Brugge-Belgium, May 17-19, 1990, p.86.

23. Kosykh V.A., Novikov D.K., Trakht I.N., Podrez E.A., Victorov A.V., Repin VS., Smirnov V.N. Effect of chylomicron remnants on cholesterol metabolism in cultured rabbit hepatocytes: -very low density lipoprotein and bile acid production. Lipids, 1991; 26: 799-805.

24. Волгушев С.А., Косых В.А., Подрез E.A., Новикоа Д.К., Карпов Р.С. Влияние окисленных производных холестерина на поглощение и деградацию бета-липопротеи1ов очень низкой плотности гепатоцитами человека и кролика. Бюлл. эксперим. биол.,1991, том 111, N3, 254-256.

25. Волгушев С.А., Косых В.А., Подрез Е.А., Новиков Д.К., Карпов Р.С., Репин B.C. Влияние чисього и долго хранившегося коммерческого холестерина на связывание липолротеинов очень низкой плотности гепатоцитами кроликов. Бюл. экспер. биол., 1991, том 111, 3, 250-252.

26. Podrez Е.А.. Kosvkh V.A.. Lakeev Y.V., Kosenkov E.I., Mambetisaeva E.T., Repin V.S., Smirnov V.N. and Miettinen T.A. Bile acids and VLDL production by cultured hepatocytes of hyper- and hyporesponsive rabbits. In: Molecular biology of atherosclerosis, John Libbey and company Ltd , 1992,163-165.

27. Лакеев Ю.В.. Косых В А.. Косенков Е.И.. Новиков В.Н., Лебедев А.В., Репин B.C. Впияние природных и синтетических антиоксидантов - полигидроксмнафтохинонов на метаболизм холестерина в культивируемых гепатоцитах кролика. Бюлл. эксперим. биол.мед., 1992, том 112, N 3, стр.266-272.

28. Podrez Е.А., Kosvkh V.A., Lakeev Yu.V., Kosenkov E.I., Mambetisaeva E.T., Repin VS., Smirnov V.N., Miettinen T.A. Bile acids and VLDL production by cultured hepatocytes of rabbits hypo- or hyperresponsive to dietary cholesterol. Lipids, 1993; 28: 709-713.

29. Лакеев Ю.В., Косых В.А., Косенков И.Е., Цибульский В.П., Тихомиров О.Ю., Антонов И.А., Репин B.C. Пробукол и а-токоферол стимулируют синтез желчных кислот в культивируемых гепатоцитах кролика. Биохимия, 1993, том 58, стр. 406 -415.

30. Мамбетисаева Э.Т., Косых В.А., Мишарин А.Ю., Косенков И.Е., Подрез Е.А., Репин B.C.. Влияние новых синтетических производных холестерина на метаболизм холестерина в культивируемых гепатоцитах кролика. Биохимия, 1993, том 58, вып.7, стр. 1126-1132.

31. Мамбетисаева Э.Т., Косенков Е.И., Подрез Е.А., Самуилов Я.Д., В.А.Косых. Влияние пробукола и его нового аналога на метаболизм холестерина и липопротеидов в культивируемых гепатоцитах кролика. Биохимия, 1994, том 59, вып. 1, стр. 118-125.

32. Даутова Г.С. Косых В.А.. Репин B.C., Камбург Р.А. Влияние диметил-(имидазол-1-ил) метансульфоновой кислоты на экспериментальный атерогенез у кроликов. Эксперим. и клин, фармакол., 1994, том 57, N 5, стр. 21-24.

33. Kosvkh V.A., Novikov D.K., Kosenkov E.I. Effects of chylomicron remnants on cholesterol and bile acid synthesis in cultured human and rabbit hepatocytes. Atherosclerosis, 1994; 109: 197.

34. Даутова Г.С., Косых В.А., Репин B.C., Камбург P.M., Ибрагимов О Б. Влияние ксимедона на метаболизм холестерина и экспериментальный атеросклероз у кроликов. Эксперим. и клин, фармакол., 1995, том 58, N1, стр. 25-29.

35. Staels В., Vu-Dac N.. Kosvkh V.. Fruchart J.-C., Dallongeville J., Auwerx J.: Fibrates down-regulate apolipoprotein C-lll expression by a mechanism independent of peroxisomal enzyme induction. A potential mechanism for the hypolipidemic action of fibrates. J. Clin. Invest., 1995; 95:705-712

36. Vu-Dac N., Schoonjaas K., Kosvkh V., Dallongeville J., Fruchart J.-C., Staels В., Auwerx J. Fibrates increase human apolipoprotein A-ll expression through activation of the peroxisome proliferator-activated receptor. J. Clin.Invest., 1995; 96:741-750

37.Vu-Dac N., Schoonjans K., Kosvkh V.. Dallongeville J., Staels В., Auwerx J.. Retinoids increase human apolipoprotein A-ll expression through activation of the retinoid X receptor but not the retinoic acid receptor. Mol. Cell Biol., 1996;16:3350-3360.

38. Малюгин A.B., Новиков Д.К., Косых В.А., Косенков Е.И., Медведева Н.В., Валентинова Н.В., Штейншнейдер А.Я, Мишарин А.Ю. Ингиьирование биосинтеза холестерина в гепатоцитах кролика Зр-( \л/-гидроксиапкокси)-холест-5-енами. Биоорган, химия, 1996, том 22, N 7, стр.541-547.

39. Малюгин А.В.. Штейншнейдер А.Я., Косых В.А., Алки К., Лафонт Ю., Мишарин А.Ю. Стерипцеллозольвы - регуляторы метаболизма холестерина в изолированных гепатоцитах кролика. Биоорган, химия, 1996, том 22, N 8, стр.606610.

40.Vu-Dac N., Gervois P., Pineda-Torra I., Fruchart J.-C., Kosvkh V., KooistraT., Princen H.M.G., Dallongeville J., Staels B. Retinoids increase human apo C-lll expression at the transcriptional level via the retinoid X receptor. Contribution to the hypertriglyceridemic action of retinoids. J.CIin.lnvest., 1998; 102:625-632.

41. Gervois P., Vu-Dac N., Chopin-Delannoy S., Kosvkh V., Fruchart J.-C., Staels B. Fibrates repress rat apo A-l gene expression by increasing REV-ERBa expression via PPARoc interacting with a novel PPAR response element. Abstract from the 71 st scientific sessions, Dalas, Texas, Nov. 8-11, Circulation (suppl.) 1998; 98:1-125

42. Andersson Y., Lefebvre A.-M., Martin G., Sechkin A.V., Kosvkh V.. Fruchart J.-C., Auwerx J., Staels В.; Developmental and pharmacological regulation of apolipoprotein C-

II gene expression. Comparison with apo C-l and apo C-lll gene regulation. Atheroscler. Throm. Vase. Biol., 1999; 19: 115-121.

43. Gervois P., Delannoy S.-C., Fadel A.. KosvkhV.. Fruchart J.-C., LaudetV. and B.Staels. Fibrates increase human Rev-erba expression in liver via a novel PPAR responsive element. Mol.Endocrinol., 1999; 13:400-409.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АКО - ацил КоА оксидаза

ano - аполипопротеины

АХАТ - ацетил-холестерин-ацетилтрансфераза

ГАФДГ - глютамин- ацил-фосфатдегидрогеназа

ГТГ - гипертриглицеридемия

ГХС - гиперхолестеринемия

ДСЧ - делипидированная сыворотка человека

Ds-Na - додесилсульфат натрия

ЖК - жирные кислоты

ИБС - ишемическая болезнь сердца

ЛВП - липопротеиды высокой плотности

ЛП -липопротеиды

ЛНП - липопротеиды низкой плотности ЛОНП - липопротеиды очень низкой плотности ЛПЛ - липопротеидлипаза ЛХАТ - лецитин-холестерин-ацилтрансфераза

МБП - микросомальный белок-переносчик эфиров холестерина и триглицеридов ОХС- окисленный холестерин

ОХС -кролики - кролики, содержавшиеся на обогащенном окисленным ХС корме ПААГ - полиакриламидный гель рХМ - ремнанты хиломикрон ТГ - триглицериды

CAT - хлорамфеникол-ацил-трансфераза

ХС - холестерин

ХС-7а-ОН - холестерин 7а-гидроксилаза

ХС-ЛНП - холестерин липопротеидов низкой плотности

ЧХС - чистый холестерин

ЧХС-кролики - кролики, содержавшиеся на обогащенном чистым ХС корме ЭХС - эфиры холестерина

Отпечатано в отделе оперативной печати Геологического ф-та МГУ Тираж70 экз. Заказ № IЧ

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Косых, Владимир Алексеевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

ГЛАВА 1. РОЛЬ ПЕЧЕНИ В МЕТАБОЛИЗМЕ ХОЛЕСТЕРИНА В ОРГАНИЗМЕ.

1.1. Общие сведения о метаболизме липидов в организме.

1.2. Общие сведения о метаболизме холестерина в гепатоцитах и механизмах компенсации избыточного поступления пищевого холестерина в печень.

1.3. Обратный транспорт холестерина.

ГЛАВА 2. ВЛИЯНИЕ ЛИПИДОВ ПИЩИ НА РАЗВИТИЕ ГИПЕРЛИПИДЕМИИ.

2.1. Алиментарная ГХС у животных.

2.2. Алиментарная ГХС у человека.

2.3. Алиментарная ГТГ у человека.

ГЛАВА 3. РОЛЬ ЛИПИДОВ ПИЩИ В РЕГУЛЯЦИИ МЕТАБОЛИЗМА

ЛИПИДОВ ПЕЧЕНИ.

3.1.1 .Характеристика ЛП, продуцируемых печенью.

3.1.2.Продукция ЛОНП гепатоцитами.

3.1.3. Роль нейтральных липидов в регуляции продукции аполипопротеина В.

3.1.4.Механизм регуляции ano В продукции нейтральными липидами.

3.1.5. Продукция ЛВП гепатоцитами.

3.2. Регуляция активности холестерин-7а-гидроксилазы и синтеза желчных кислот.

ГЛАВА 4. МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ РАЗЛИЧИЯ МЕЖДУ ГИПО- И ГИПЕРРЕАКТИВНЫМИ ИНДИВИДУУМАМИ.

4.1. Общая характеристика гипо- и гиперреактивности к пищевому холестерину.

4.2. Уровень общего холестерина и ЛП в плазме.

4.3. Всасывание пищевого холестерина в кишечнике.

4.4. Регуляция синтеза холестерина в печени и периферических тканях.

4.5. Экскреция стеролов с желчью.

4.6. Рецептор-опосредованное поглощение ЛНП печенью.

4.7. Продукции ЛОНП печенью.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Косых, Владимир Алексеевич

ВЫВОДЫ

1. Увеличение секреции гепатоцитами частиц липопротеидов очень низкой плотности ( ЛОНП ) в ответ на потребление кроликами обогащенного холестерином ( ХС ) корма является, наряду со снижением активности ЛНП-рецепторов, ведущей причиной развития алиментарной ГХС.

2. Наличие продуктов автоокисления холестерина в обогащенном ХС корме не приводит к дальнейшему увеличению количества секретируемых гепатоцитами кроликов частиц ЛОНП, по-сравнению с животными, получавшими неокисленный ХС. В то же время, потребление кроликами корма, содержащего ХС и продукты его автоокисления, вызывает усиленное накопление ХС и его эфиров в гепатоцитах, сопровождающееся увеличением секреции обогащенных эфирами холестерина ЛОНП, что может быть причиной быстрого развития алиментарной ГХС.

3. Избыточное поступление нейтральных липидов в составе обогащенных ТГ ремнантов хиломикрон (рХМ) и обогащенных ЭХС ЛП (Р-ЛОНП и ЛНП) в гепатоциты человека и кролика в условиях in vitro стимулирует секрециию частиц ЛОНП. Установлено, что регуляция продукции аполипопротеина В (ano В) ЛОНП осуществляется на посттранскрипционном уровне и в качестве стимуляторов его продукции выступают свободный и этерифицированный ХС.

5. Ремнанты хиломикрон подавляют синтез желчных кислот в культивируемых гепатоцитах кролика и человека, что согласуется с эффектом обогащенного ХС корма на синтез желчных кислот у кроликов. В качестве ингибиторов синтеза желчных кислот могут выступать основные компоненты рХМ - олеиновая и пальмитиновая кислоты. В отличие от рХМ, ЛВП2, осуществляющие обратный транспорт ХС в печень, стимулируют синтез желчных кислот, и тем самым обеспечивают поддержание нормального уровня ХС в плазме при пищевой нагрузке.

6. Ответ гепатоцитов кролика и человека на избыточную доставку в них пищевого ХС не сопровождается увеличением синтеза желчных кислот как в крысиных гепатоцитах. Процесс синтеза желчных кислот у кролика и человека, в отличие от крысы, следовательно, не играет определяющей роли в компенсаторной реакции, направленной на снижение внутрипеченочного уровня ХС и его выведения из организма, что является одной из причин большей подверженности кролика и человека к развитию алиментарной ГХС.

7. Пробукол и а-токоферол в концентрациях сравнимых с терапевтическими дозами стимулируют синтез желчных кислот в культивируемых гепатоцитах кролика. Этот эффект опосредован увеличением внутриклеточного содержания ХС -субстрата для ХС-7а-гидроксилазы - ключевого фермента биосинтеза желчных кислот. В отличие от а-токоферола, обеспечивающего приток ХС в клетку за счет стимуляции синтеза ХС, действие пробукола связано со стимуляцией синтеза и секреции апо Е, ассоциация которого с ЛВПг приводит к увеличению рецептор-зависимого захвата этих частиц гепатоцитами.

9. Фибраты в терапевтической концентрации снижают уровень экспрессии гена апо С-111 в печени крыс и культивируемых гепатоцитах крысы и человека. В отличие от гепатоцитов крысы, в клетках человека этот эффект не сопровождается побочным воздействием на метаболизм липидов в печени, проявляющимся в

191 увеличении уровня экспрессии генов пероксисомальных ферментов. Полученные результаты означают, что гипотриглицеридемическое действие фибратов может быть связано с уменьшением уровня экспрессии гена ano C-III, снижением содержания ano C-III в частицах ЛОНП и сопряженным с этим увеличением клиренса этих липопротеидов печенью.

10. Увеличение фибратами содержания ano A-I и ano A-II в плазме человека обусловлено увеличением скорости транскрипции генов ano A-I и ano A-II в гепатоцитах человека. Стимуляция фибратами экспрессии гена ano A-I в печени может рассматриваться в качестве положительного терапевтического воздействия этих препаратов при лечении дислипопротеидемии и атеросклероза.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Косых, Владимир Алексеевич, Москва

1. Аничков H.H. Некоторые итоги и перспективы экспериментального изучения атеросклероза артерий. В: Атеросклероз и инфаркт миокарда. Медгиз .М. 1956.

2. Климов А.Н., Никульчева Н.Г. Липиды, липопротеины и атеросклероз. Санкт -Петербург. Питер. 1995; стр. 3-68.

3. Косых В.А., Подрез Е.А., Новиков Д.К., Волгушев С.А. Первичная культура гепатоцитов модель для изучения метаболизма липопротеидов в печени человека. В кн: Атеросклеро человека, ред. Е.И. Чазов, В.Н. Смирнов, Наука, Москва, 1989, стр.71-90.

4. Ланкин В.З., Рогинский В.А., Тихазе А.К. и др., Антирадикальные и антиоксидантные свойства пробукола и его структурных аналогов в процессе окисления ненасыщенных фосфолипидов в нативных и искуственных мембранах. Доклады АН СССР, 1996; 351, стр. 554-557.

5. Лупанов В.П., Лякишев A.A., Творогова М.Г. и др. Влияние длительного приема фенбутола на обмен липидов у больных ишемической болезнью сердца. Кардиология 1993; No 4 , стр. 19 -22.

6. Лякишев A.A., Лупанов В.П., Смирнов Л.Д. Гиполипидемический препарат пробукол ( механизм действия, гиполипидемические эффекты и клинические исследования). Хим.-фарм. журнал. 1995; 10: 3-8.

7. Мамбетисаева Э.Т., Е.И.Косенков, Е.А.Подрез, Я.Д.Самуилов, ВАКосых. Влияние пробукола и его нового аналога на метаболизм холестерина и липопротеидов в культивируемых гепатоцитах кролика. Биохимия, 1994, т.59, вып.1, стр. 118-125.

8. Новиков Д.К., Косых В.А., Антонов И.В., Лакеев Ю.В.Репин B.C. Изучение ЛВПг-зависимого синтеза желчных кислот в культуре гепатоцитов кролика: эффекты оксипроизводных холестенрина. Бюлл. эксперим.биол.мед., 1990, N9, стр.267-269.

9. Титов В.Н. Конформация аполипопротеина В-100 структура и функциональная классификация липопротеинов низкой плотности. Биохимия, 1996. том. 61. N 1. стр. 3-23.

10. Титов В.Н. Кругооборот холестерина в транспорте триглицеридов и действие пробукола. Вопр. мед. химии 1995; том. 41, стр. 2-8.

11. Тихазе А.К., Панкин В.З., Михин В.П., Ревенко В.М., Лупанов В.П. Антиоксидант пробукол как регулятор интенсивности процессов свободнорадикального окисления липидов в крови больных коронарным атеросклерозом. Тер. Архив. 1997; 9: 35-45

12. Чазов Е.И. История изучения атеросклероза: истины, гипотезы и спекуляции. Тер. архив, 1998; том. 10, стр. 9-16.

13. Aarsland, A., and R. Berge. Peroxisome proliferating sulphur- and oxy-substituted fatty acid analogues are activated to acyl coenzyme A thioesters. Biochem. Pharmacol., 1990; 41: 53-61.

14. Aburatani H., Matsumoto A., Kodama Т., Takaku F., Fukazawa C., Itakura H. Increased levels of messenger ribonucleic acid for apolipoprotein E in the spleen of probucol-treated rabbits. Am. J. Cardiol., 1988; 62: 60B-65B.

15. Accad M., and R.V. Farese Jr. Cholesterol homeostasis: A role for oxysterols. Curr. Biol., 1998; 8:R601- R604

16. Alexander C.A., Hamilton R.L., Havel R.J. Subcellular localization of В protein of plasma lipoprotein in rat liver, 1976; 69:241-263.

17. Angel В., Einarsson K. Bile Acids and Lipoprotein Metabolism. In: Bile Acids and Atherosclerosis, edited by Grundy S.M., Raven Press, New York, 1986; 15: 48-52.

18. Austin M.A., Breslow J.L., Hennekens C.H., Buring J.E., Willett W.C., Krauss R.M. Low density lipoproteins and risk of myocardial infarction, JAMA, 1988; 260: 1917-1922.

19. Auwerx, J. Regulation of gene expression by fatty acids and fibric acid derivatives: an integrative role for peroxisome proliferator activated receptors. Horm. Res. (Basel). 1993; 38:269-277.

20. Auwerx, J., P. Leroy, and K. Schoonjans. Lipoprotein lipase: recent contributions from molecular biology. Crit. Rev. Clin. Lab. Sci., 1992; 29: 243-268.

21. Babaev V.R., Kosykh V.A., Tsibulsky V.P., IvanovV.O., Repin V.S., Smirnov V.N. Binding and Uptake of Native and Modified Low-Density Lipoproteins by Human Hepatocytes in Primary Culture. Hepatology, 1989; 10: 56-60.

22. Babirak, S. P., B. S. Brown, and J. D. Brunzell. Familial combined hyperlipidemia and abnormal lipoprotein lipase. Arterioscler. Thromb., 1992; 12: 1176-1183.

23. Balfour J.A.,McTavish D„ Heel R.C. Drug, 1990; 40: 260-268.

24. Barbaras, R., P. Puchois, J. C. Fruchart, and G. Ailhaud. Cholesterol efflux from cultured adipose cells is mediated by Lp(A-l) particles but not by Lp(A-ll) particles. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987; 142: 63 69.

25. Barnhart J.W., Li D.L. and Cheng W.D. The effect of probucol on cholesterol transport in cultured rat hepatocytes. Am. J. Cardiol., 1988; 62: 52B-56B.

26. Bar-Tana,J., G. Rose-Kahn, B. Frenkel, Z. Shafer, and M. Fainaru. 1988 Hypolipidaemic effect of beta, beta'- methyl-substituted hexadecanedioic acid (MEDICA 16) in normal and nephrotic rats.J. Lipid Aes., 1992; 29: 431-441.

27. Barter P. High density lipoproteins and reverse cholesterol transport. Curr. Opin. Lipidol., 1993;4:210-217.

28. Bartlett G.R. Phosphorus assay in column chromatography, J.Biol. Chem., 1959; 234: 466-468.

29. Basu S.K., Goldstein J.L., Brown M.S. Independent pathways for secretion of cholesterol and apolipoprotein E by macrophages. Science, 1983; 219: .871-873.

30. Beg Z.N., Stonic J.A., Hoeg J.M., Demosky S.J., Brewer H.B. Phosphorylation of human apolipoprotein Al. Arteriosclerosis, 1987; 7: 502a.

31. Berry, M. N. and D. S. Friend. 1969. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells. A biochemical and fine structural study. J. Cell. Biol., 1969; 43:506520.

32. Berudt J., Gaumert R., Still J. Mode of action of the lipid lowering agents clofibrate and BM 15.075 on cholesterol biosynthesis in the rat liver. Atherosclerosis, 1978;.30: 147-153.

33. Betteridge D.J. Lipids, diabetes and vascular disease. The time to act. Diabet Med., 1989; 6: 195-218.

34. Beynen A.C., Katan M.B., Van Zutphen L.F.M. Hypo- and hyperresponders: Individual differences in response of serum cholesterol concentration to changes in diet. Adv. Lipid Res., 1987; 22:115-125.

35. Beynen A.C., Boohaard A., Van Laack H.L.J.M., Katan M.B. Cholesterol metabolism in two strains of rats with high or low response of serum cholesterol to a cholesterol-rich diet. J. Nutr., 1984; 114: 1640-1651.

36. Beynen A.C., Katan M.B., Van Zutphen L.F.M. Plasma lipoprotein profiles and arylesterase activities in two inbred strains of rabbits with high or low response of plasma cholesterol to dietary cholesterol. Comp. Biochem. Physiol., 1984; 79: 401-406.

37. Beynen A.C., Meijer G.W., Lemmens A.G., Glatz J.F.C., Versluis A., Katan M.B., Van Zutphen L.F.M. Sterol balance and cholesterol absorption in inbred strains of rabbits hypo-or hyperresponsive to dietary cholesterol. Atherosclerosis, 1989; 77:151-157.

38. Beynen, M. C., and M. B. Katan. Reproducibility of the variations between humans in the response of serum cholesterol to cessation of egg consumption. Atherosclerosis, 1985; 57: 19-31.

39. Bhattacharyya A.K., Eggen D.A. Feedback regulation of cholesterol biosynthesis in rhesus monkeys with a variable hypercholesterolemic response to dietary cholesterol. J. Lipid Res., 1981; 22: 16-23.

40. Bhattacharyya A.K., Eggen D.A. Mechanism of the variability in plasma cholesterol response to cholesterol feeding in rhesus monkeys. Artery, 1983; .11: 306-326.

41. Bird D.A., Tangirala R.K., Fruebis J., Stenberg D., Wiztum J.L., and W. Palinski.

42. Bjorkhem I., Blomstrand R., Svensson L. Effect of different dietary triglycerides on 7a-hydroxiiation of cholesterol and other mixed-function oxidations. J.lipid Res., 1978; 19:359-369.

43. Bjorkhem I., Lewenhaupt A. Preferential utilization of newly synthesized cholesterol as a substrate for bile acid synthesis. An in vivo study using O-inhalation technique. J. Biol. Chem., 1979;254:5252-5257.

44. Bjorkhem I., Gustafsson J. On the conversion of cholesterol into allocholic acid in rat liver. Eur.J. Biochem., 1971; 18: 207-213.

45. Blake, W. L., and S. D. Clarke. Suppression of rat hepatic fatty acid synthase and S14 transcription by dietary polyunsaturated fat. J. Nutr., 1990; 120: 1727-1729.

46. Bligh E.G., Dyer W.J. A rapid method for total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Biophys., 1959; 37: 911 -917.

47. Bonanome, A., and S. M. Grundy. Effect of dietary stearic acid on plasma cholesterol and lipoprotein levels. N.Engl.J.Med., 1988; 318: 1244-1248.

48. Boogerts J.R., McNeal M.M., Archambault J.R., Davis R.A. Expression in cultured hepatocytes of in vivo carbohydrate induced changes in lipogenesis and apolipoprotein synthesis. Fed. Proceed., 1982; .41: 1217-1222.

49. Borchardt, R. A., and R. A. Davis. Intrahepatic assembly of very lo density lipoproteins. Rate of transport out of the endoplasmic reticulum determines rate of secretion. J. Biol. Chem., 1987; 262: 16394-16402.

50. Bradford R.H., Goldberg A.C., Schonfeld G., Knopp R.H. Double-blind comparison of bezafibrate versus placebo in male volunteers with hyperlipoproteinemia. Atherosclerosis, 1992; 92: 31-40.

51. Breckenridge, W. C.,J. A. Little, G. Steiner, A. Chow, and M. Poapst. Hypertriglyceridemia associated with deficiency of apolipoprotein C-ll. N. Engl. J. Med., 1978; 298: 1265-1273.

52. Brown M.S., Dana S.E., Goldstein J.L. Cholesterol ester formation in cultured human fibroblasts. Stimulation by oxigenated sterols. J.Biol.Chem., 1975; 250: 4025-4027.

53. Brown M.S., Goldstein J.L. Receptor-mediated endocytosis. Insights from the lipoprotein receptor system.- Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1979; 76: 3330-3337.

54. Brown M.S. and J.L.Goldstein. The SREBP pathway: regulation of cholesterol metabolism by proteolysis of a membrane-bound transcription factor. Cell, 1997; 89: 331-340.

55. Brown M.S., Goldstein J.L. A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis. Science, 1986; 323: 34-47.

56. Brown M.S., Goldstein J.L. Lipoprotein receptors in the liver. Control signals for plasma cholesterol traffic. J. Clin. Invest., 1983; 72:743-747.

57. Cardot, P.,J. Chambaz, D. Kardassis, C. Cladaras, and V. I. Zannis. Factors participating in the liverspecific expression of the human apolipoprotein A-ll gene and their significance for transcription. Biochemistry, 1993; 32: 9080-9093.

58. Carlson, L. A. L. E. Bottiger, and P-E. Ahfeldt. Risk factors for myocardial infarction in the Stockholm prospective study: a 14-year followup focusing on the role of plasma triglyceride and cholesterol. Acta Med. Scand., 1979; 206: 351-360.

59. Casteels M., Schepers L., Eldere J.V., Eyssen H.J., Mannaerts G.P. Inhibition of 3a,7a, 12a-trihydroxy-5(3-cholestanoic acid oxidation and of bile acid secretion in rat liver by fatty acids. J.Biol.Chem., 1988; .263: 4654-4661.

60. Chambaz, J., P. Csrdot, D. Pastier, V. I. Zannis, and C. Cladaras. Promoter elements and factors required for hepatic transcription of the human Apo A-ll gene. J. Biol. Chem., 1991; 266:11676-11685.

61. Chen J., Song W., Redinger R.N. Effect of dietary cholesterol on hepatic production of lipids and lipoproteins in isolated hamster liver. Hepatology, 1996; 24: 424-434.

62. Chiang J.Y., Stroupe D. Identification and characterization of a putative bile acid-responsive element in cholesterol 7a-hydroxylase gene promoter. J.Biol.Chem., 1994, v.269, p. 17502-17507.

63. Chirgwin, J.M., A.E. Przybyla, R.J. MacDonald, and N. J. Rutter. Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease. Biochemistry, 1979; 18:5294-5299.

64. Chomczynski, P. and N. Sacchi. Single step method for RNA isolation by acid guanidinium-thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Bioch., 1987; 162: 156-159.

65. Clarkson T.B., Lofland H.B., Bullock B.C., Goodman H.O. Genetic control of plasma cholesterol. Studies on squirrel monkeys. Arch. Path., 1971; 92: 37-45.

66. Cohan L., Boerwinkle E. Structure, function and molecular genetics and epidemiology of apolipoprotein B. Semin Liver Dis., 1992; 12: 311-320

67. Coleman R. Biochemistry of bile secretion. Biochem.J., 1987; 244: 249-261.

68. Connor W.E., Lin D.S. The intestinal absorption of dietary cholesterol by hypercholesterolemic (Type II) and normocholesterolemic humans. J. Clin. Invest., 1974; 73: 1062-1069.

69. Cortner J.A., Coates P.M., Ngoc-Anh Le, Cryer D.R., Ragni M.C., Faulkner A., LangerT. Kinetics of chylomicron remnant clearance in normal and in hyperlipoproteinemic subjects. J.Lipid Res., 1987;28:195-206.

70. Cox, D. N., 3V. C. Breckenridge, and J. A. Linle. Inheritance of apolipoprotein C-ll deficiency with hipertriglyceridemia and pancreatitis. N. Engl J. Med., 1978; 299: 14211424.

71. Craig, W. Y., R. Nutik, and A. D. Cooper. Regulation of apoprotein synthesis and secretion in the human hepatoma HepG2 cells. The effect of exogenous lipoprotein. J. BioL Chem., 1988; 263: 13880-13890.

72. Crouse J.R., Grundy S.M. Evaluation of a continuous isotope feeding method for measurement of cholesterol absorption in man. J. Lipid Res., 1978; 19: 967-971.

73. Dashti N. Synthesis and secretion of nascent lipoprotein particles. Prog.Lipid Res., 1991; 30: 219-230.

74. Dashti N., Wolfbauer G., Koren., Knowles B.B. and Alaupovic P. Biochem. Biophys. Acta, 1984; 794: 373-384.

75. Dashti, N. The effect of low density lipoproteins, cholesterol, and 25-hydroxycholesterol on apolipoprotein B gene expression in HepG2 cells. J. Biol. Chem., 1992.; 267: 71607169.

76. Dashti, N., D. L. Williams, and P. Alaupovic. Effects of oleate and insulin on the production rates and cellular mRNA concentrations of apolipoproteins in HepG2 cells. J. Lipid Res., 1989; 30: 1365-1373.

77. Daugherty A., Lange L.G., Sobel., Schonfeld G. Aortic accumulation and plasma clearance of p-VLDL and HDL: effect of diet induced hypercholesterolemia in rabbits. J.Lipid Res., 1985; 26:955-963.

78. Davignon J., Gregg R.E., Sing C.F. Apolipoprotein E polymorphism and atherosclerosis. Arteriosclerosis, 1988; 29: 397-429.

79. Davis R.A, Engelhorn S.H., Pangburn S.K., Weinstein D.B., Steinberg D. Very low density lipoprotein synthesis and secretion by cultured rat hepatocytes.- J.Biol.Chem., 1979; 254:2010-2016.

80. Davis R.A., Highsmith W.E., Malone-McNeal M., Archambault-Schexnayder J., Kuan J-C.W. Bile acid synthesis by cultured hepatocytes: inhibition by mevinolin but not by bile acids. J. Biol. Chem., 1983; 258: 4079-4082.

81. Davis R.A., Hyde P.M., Kuan J.-C.W., Malone-McNeal M., Archambault-Schexnayder J. Bile acid synthesis by cultured hepatocytes: regulation by cholesterol availability. J. Biol. Chem., 1983; 258: 3661-3667.

82. Davis R.A., Musso C.A., Lattier G.R. In: Enterohepatic Circulation of bile acids and sterol metabolism (Paumgartner G., Stiehl A., Gerok W. eds.), Lancaster, MTP Press, 1987, pp.37-45.

83. Davis R.A., McNeal M.M. Dietary cholesterol does not affect the synthesis of apolipoproteins B and E by rat hepatocytes. Biochem.J., 1985; 227: 29-35.

84. Davis R.A., Musso C.A., Maione-McNeal M., Lattier G.R., Hyde P.M., Archambault-Schexnayder J. Examination of bile acid negative feedback regulation in rats. J. Lipid Res., 1988; 29: 202-211.

85. Dietschy J.M., Wilson J.D Regulation of cholesterol metabolism (First of three parts).-N.Engl.J.Med., 1970; 282: 1128-1138.

86. Dietschy J.M., Wilson J.D. Regulation of cholesterol metabolism (Second of three parts).-N.Engl.J.Med., 1970; 282: 1179-1183.

87. Dixon, J. L., S. Furukawa, and H. N. Ginsberg. Oleate stimulates secretion of apolipoprotein B-containing lipoproteins from HepG2 cells by inhibiting early intracellular degradation of apolipoprotein B. J. Biol. Chem., 1991; 266: 5080-5086.

88. Doerner K.S., Gurley E.C., Vlahcevic Z.R., Hylemon P.B. Regulation of cholesterol 7a-hydroxylase expression by sterols in primaryrat hepatocyte cultures. J.Lipid Res., 1995; 36: 1168-1177.

89. Drevon C.A., Weinstein D.B., Steinberg D. Regulation of cholesterol esterification and biosynthesis in monolayer cultures of normal adult hepatocytes. J.Biol.Chem., 1980; 255: 9128-9137.

90. Dreyer, C., G. Krey, H. Keller, F; Givel, G. Helftenbein, and W. Wahli. Control of the peroxisomal |3-oxidation pathway by a novel family of nuclear hormone receptors. Cell, 1992; 68:879-887.

91. Durrington P.N., Newton R.S., Weinstein D.B., Steinberg D. Effects of insulin and glucose on very low density lipoprotein triiglyceride secretion by cultured rat hepatocytes. J.Clin.Invest., 1982; 70:63-72.

92. Eggen D.A. Cholesterol metabolism in groups of rhesus monkeys with high or low response of serum cholesterol to an atherogenic diet. J. Lipid Res., 1976; 17: 663-673.

93. Eggen, D. A. Cholesterol metabolism in nonhuman primates. In: Primates in Medicine. E. I. Goldsmith and J. Moor-Jankowski, editors. Karger, Basel, 1976, 267-299.

94. Eggen, D. A. Cholesterol metabolism in rhesus monkey, squirrel monkey, and baboon. J. Lipid Res., 1974; 15:139-145.

95. Egusa, G., W. F. Beltz, S. M. Grundy, and B. V. Hoivard. Influence of obesity on the metabolism ot' apolipoprotein B in humans. J. Clin. Inves!., 1985; 76: 596-603.

96. Eisenberg S. High density lipoprotein metabolism. J. Lipid Res., 1984; 25:1017.

97. Erickson S.K., Cooper A.D., Matsui S.M., Gould R.G. 7-Ketocholesterol. J.Biol.Chem., 1977; 252: 5186-5193.

98. Fielding C.J., Fielding P.E. Cholesterol transport between cells and body fluids: Role of plasma lipoproteins and the plasma cholesterol esterification system.- Med. Clin. North. Am., 1980;66:363-373.

99. Fielding C.J., Havel R.J. Lipoprotein lipase. Arch. Pathol., 1977; 101: 225-229.

100. Fielding, C.J., and P. E. Fielding. Molecular physiology of reverse cholesterol transport. J. Lipid Res., 1995; 36: 211-228.

101. Fidge N.H. High density lipoprotein receptors, binding proteins, and lipids. J.Lipid Res., 1999; 40: 187-201.

102. Ford R.P., Botham K.M., Suckling K.E., Boyd G.S. The effect of a rat plasma high-density lipoprotein subfraction on the synthesis of bile salts by rat hepatocytes monolayers. FEBS Lett., 1985; 179: 177-180.

103. Frenkel, B., J. Bishara-Shieban, and J. Bar-Tana. The effect of beta, beta'-tetramethylhexadecanedioic acid (MEDICA 16) on plasma very-low-density lipoprotein metabolism in rats: role of apolipoprotein C-lll. Biochem.J., 1994; 298: 409-414.

104. Fungwe T.V., Cagen L., Wilcox H.G. and M. Heimberg. Regulation of hepatic secretion of very low density lipoprotein by dietary cholesterol. J.Lipid Res., 1992; 33: 179-191.

105. Getz G.S., Diller P.M., Driscoll D.M., The functional regulation of apoprotein E biosynthesis. In: Atherosclerosis V11. N.H.Fidge and P.J.Nestel eds., Elsevier Sci. Publishers B.V. (Biomedical Division), 1986, p.307-311.

106. Gianturco S.H., Bradley W.A. Trigliceride-rich lipoproteins and their role in atherogenesis. Curr.Opin.Lipidol., 1992; 3: 324-328.

107. Ginsberg H., Le N.A., Mays C., Gibson J., Brown W.V. Lipoprotein metabolism in nonresponders to increased dietary cholesterol. Arteriosclerosis, 1981; 1: 463-470.

108. Glauman H., Bergstrand A, Ericsson J.L.E. J.Cell Biol., 1975, v. 64, p.356-377.

109. Glickman R.M., Sabesin S.M. Lipoprotein Metabolism. In: The Liver: Biology and Pathobiology (Arias J., Schachter D., Popper H., Schafritz D.A. eds.), 1982, Raven Press, New York, pp. 123-142.

110. Glickman R.M., Sabesin S.M. Lipoprotein Metabolism. In: The Liver: Biology and Payhobiology, third edition, edited by I.M.Arias, J.L. Boyer, N.Fausto, Raven Press, Ltd., New York, 1994, pp. 391-414.

111. Glomset J.A. The plasma lecithin-cholesterol-acyltraansferase reaction. J. Lipid Res., 1968; 9: 155-167.

112. Goldberg R.B., Mendez A. Probucol enhances cholesterol efflux from cultured human skin fibriblasts. Am. J. Cardiol., 1988; 62: 57B-59B.

113. Goldstein J.L., Brown M.S. Regulation of the mevalonate pathway. Nature,1990; 343: 425-430.

114. Goldstein, J.L., S.K. Basu, and M.S. Brown. Receptor-mediated endocytosis of low-density lipoprotein in cultured cells. Methods Enzymol., 1983; 98: 241-260.

115. Gorman, C. M., L. F. Moffat and B. H. Howard. Recombinant genomes which express recombinant chloramphenicol acetyl transferase in mammalian cells. Mol. Cell Biol., 1982; 2: 1044-1051.

116. Gotto, A. M., G. A. Gorry, J. R. Thompson, J. S. Cole, R. Trost, D. Yeshurun, and M. E. DeBakey. Relationship between plasma lipid concentrations and coronary artery disease in 496 patients. Circulation, 1977; 56: 875-883.

117. Grundy, S. M. Absorption and metabolism of dietary cholesterol. Annu. Rev. Nutr. , 1983; 3: 71-96.

118. Grundy S.M. Multifactorial etiology of Hypercholesterolemia. Arterioscler. Thromb., 1991; 11: 1619-1635.

119. Grundy S.M. Dietary influences on serum lipidsand lipoproteins. J.Lipid Res., 1990; 31: 1149-1172.

120. Grundy S.M., Mok H.Y.I. Chylomicron clearance in normal and hyperlipidemic man. J. Lipid Res., 1998, 39: 1079-1090.

121. Grundy S.M., Vega G.L. Influence of mevinolin onmetabolism of low density lipoproteins in primary moderate hepercholesterolemia. J.Lipid Res., 1985; 26: 1464-75.

122. Grundy, S. M., and G. L. Vega. Hypertriglyceridemia: causes and relation to coronary heart disease. Simin. Thromb. Hemostasis., 1988; 14: 149-164.

123. Haddad, I. A., J. M. Ordovas, T. Fitzpatrick and S. K. Karathanasis. Linkage, evolution, and expression of the rat apolipoprotein A-l, C-lll, and A-IV genes. J. Biol. Chem., 1986; 261:13268-13277.

124. Hara H., Yokoyama S. Role of apolipoproteins in cholesterol efflux from macrophages to lipid microemulsion: proposal of the putative model for the pre-0 high-density lipoprotein pathways. Biochemistry, 1992; 31: 2040-2046.

125. Hassan A.S., Gallon L.S., Yunker B.S., Subbiah M.T.R. Am. J. Clin. Nutr., 1982; 35: 546-550.

126. Havel, R. J., and R. S. J. Gordon. Idiopathic hyperlipidemia: metabolic studies in an affected family. J. Clin. Invest., 1960; 39: 1777-1790.

127. Havel, R.J., M.A. Eder, and J.H. Bragdon. The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum. J. Clin. Invest., 1955; 34:13451353.

128. Hedrick, C. C., L. W. Castellani, C. H. Warden, D. L. Puppione, and A. J. Lusis. Influence of mouse apolipoprotein A-ll on plasma lipoproteins in transgenic mice. J. Biol. Chem., 1993; 268:20676 -20682.

129. Hennessy L.K., Osada J., Ordovas J.M., Nicolosi R.J. J.Lipid Res., 1992; 33: 351-360.hepatocytes: very low density lipoprotein and bile acid production. Lipids, 1991; 26: 799-805.

130. Herscovitz H., Tietz A. The availability of different sources of cholesterol for bile acid synthesis by cultured chick embryo hepatocytes. Biochim.Biophys. Acta , 1985; 836: 321-334.

131. Hertz R., Bishara-Shiebau J., Bar-Tana J. Mode of action of peroxisome proliferators as hypolipidemic drugs: Suppression of apolipoprotein C-lll. J.Biol. Chem., 1995; 270: 13470-13475.

132. Heuman D.M., Hernandez C.R., Hylemon P.В., Kubaska W.M., Hartman С., VlahcevicZ.R. Regulation of bile acid synthesis. I. Effects of conjugated ursodeoxycholate and cholate on bile acid synthesis in chronic bile fistula rat. Hepatology, 1988;8:358-365.

133. Heuman D.M., VlahcevicZ.R., Bailey M.L., Hylemon P.B. Regulation of bile acid synthesis. II. Effect of bile acid feeding on enzymes regulating hepatic cholesterol and bile acid synthesis in the rat. Hepatology, 1988; 8: 892-897.

134. Higgins J.A., Hutson J.L. The roles of Goldgi and endoplastic reticulum in the sinthesis and assembly of lipoprotein lipids in rat hepatocytes. J.Lipid Res., 1984; 25: 1295-1305.

135. Higgins J.M., Fielding C.J. Lipoprotein lipase. Mechanism of formation of triglyceride-rich remnant particles from very low density lipoproteins and chylomicrons. Biochemistry, 1975; 14:2288-2292.

136. Hornick C.A., Kita Т., Hamilton R.L., Kane J.P., Havel R.J. Secretion of lipoproteins from the liver of normal and Watanabe heritable hyperlipidemic rabbits. Proc.Natl.Acad.Sei.USA, 1983; 80:6096-6100.

137. Horton J.D., Cuthbert J.A., Spady D.K. Regulation of hepatic 7a- hydroxylase expression and response to dietary cholesterol in the rat and hamster. J.Biol.Chem., 1995; 270: 5381-5387.

138. Hsu, I.C., M.M. Lipsky, K.E. Cole, C.H. Su, and B.F. Trump. Isolation and culture of hepatocytes from human liver of immediate autopsy. In Vitro, 1984; 21: 154-160.

139. Huff M.W. and J.R. Burnet. 3-Hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase inhibitors and hepatic apolipoprotein В secretion. Curr. Opin. Lipidol., 1997; 5: 138-145/

140. Hulcher F.H., Margolis R.D. Biochim. Biophys. Acta, 1982;712:242-249.

141. Janus, E. D., A. M. Nicoll, P. R. Turner, P. Magill, and B. Lewis. Kinetic bases of the primary hyperlipidemia: studies of apoB turnover in genetically defined subjects. Eur. J. Clin. Invest., 1980; 10: 161-172.

142. Jelinek D.F., Anderson S., Slaughter C.A., Russel D.W. Cloning and regulation of cholesterol 7a-hydroxylase, the rate- limiting enzyme in bile acid synthesis. J. Biol. Chem., 1990; 265: 8190-8197.

143. Johnson F.L., St.Clair R.W., Rudel L.L. Studies on the production of low density lipoproteins by perfused livers from non-human primates: effect of dietary cholesterol. J.Clin.Invest., 1983; 72: 221-236.

144. Johnson W.J., Nahlberg F.H., Rothblat G.H., and M.C. Phillips. Cholesterol transport between cells and high-density lipoproteins. Biochem. Biophys. Acta, 1991; 1085: 273298.

145. Jones M.P., Heuman D.M. Phisiological responses to increased dietary cholesterol: the case of the "egg" man. Hepatology, 1991;14:1291-1293.

146. Kalderon, B., R. Hertz, and J. Bar-Tana. Tissue selective modulation of redox and phosphate potentials by beta, beta'-methyl-substituted hexadecanedioic acid. Endocrinology, 1992; 131: 1629-1635.

147. Kandutsch A.A., Chen H.W., Heiniger H.J. Biological activity of some oxygenated sterols. Science, 1978; 201: 498-501.

148. Karathanasis, S. K., J. McPherson, V. I. Zannis and J. L. Breslow. Linkage of human apolipoproteins A-l and C-lll genes. Nature, 1983; 304: 371-373.

149. Katan М.В., Beynen A.C. Characteristics of human hypo- and hyperresponders to dietary cholesterol. Amer. J. Epidemiol., 1987; 125: 387-399.

150. Katan, M. В., M. C. Beynen, J. H. Devries, and A. Nobels. Existence of consistent hypo-and hyperresponders to dietary cholesterol in man. Am. J. Epidemiol., 1986;

151. Kempen H.J.M., Margreet P,M., Vos -Van Holstein M.P.M., De Lange J. Bile acids and lipids in isolated rat hepatocytes content, synthesis, and release as affected by cholestyramine treatment of the donor rats. J. Lipid Res., 1982; 23: 823-830.

152. Kern F. Physiological responces to increased dietary cholesterol: The case of the egg man. N.Engl.J.Med., 1991; 324 : 896-899.

153. Kesaniemi Y.A. Relevance of the reduction of triglycerides in the prevention of coronary heart disease. Curr. Opin. Lipid., 1998; 9: 871-974.

154. Kesaniemi Y.A., Ehnholm C., Miettinen T.A. Intestinal cholesterol absorption efficiency in man is related to apoprotein E phenotype. J.Clin.Invest., 1987; 80: 78-581.

155. Kesaniemi, Y. A., and S. M. Grundy. Increased low density lipoprotein production associated with obesity. Arteriosclerosis, 1983; 3: 170-177.

156. Kesaniemi, Y. A., W. F. Beltz, and S. M. Grundy. Comparisons of metabolism of apolipoprotein В in normal subjects, obese patients, and patients with coronary heart disease. J. Clin. Incest., 1985; 76: 585 595.

157. Keys, A., J. T. Anderson, and F. Grande. Serum cholesterol response to changes in the diet. IV. Particular saturated fatty acids in the diet. Metabolism, 1965; 14: 776-787.

158. Khoo C., Innerarity T.L., Mahley R.W. Obligatory role of cholesterol and apolipoprotein E in the formation of large cholesterol-enriched and receptor-active high density lipoproteins. J. Biol. Chem., 1985; 260: 11934 -11939.

159. Kita T. Oxidized lipoproteins and probucol. Curr. Opin. Lipidol., 1991; 2: 35-38.

160. Kita Т., Nagano Y., Yokode M., Ishii K., Kume N., Ooshima A.,Yoshida H., Kawai C. Probucol prevents the progression of atherosclerosis in WHHL rabbit, an animal model for familial hypercholesterolemia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987; 84: 59285931.

161. Kleinmay Y., Eisenberg S., Osshry Y., Gavish D., Stein O., Stein Y. Defective metabolism of hypertriglyceridemic low density lipoprotein in cultured human skin fibroblasts. J.Clin.Invest., 1985; 75: 1796-1803.

162. Kohlmeier MM Schlierf G. Mode of action of bezafibrate: a hypothesis. G.Crepaldi, H.Greten, G. Schettier, G.Baggio eds., Excepta Medica, Amsterdam, 1982 , p.93-110.

163. Kosykh V.A., Surguchev A.P., RepinV.S., SmirnovV.N. 7-ketocholesterol inhibits VLDL secretion by cultured human and rabbit hepatocytes. Biochim.Biophys.Res.Commun., 1988; 153:1116-1121.

164. Kosykh V.A., Podrez E.A., Novikov D.K., Volgushev A.V., Repin V.S., Smirnov V.N. Very low density lipoprotein secretion by cultured hepatocytes of rabbits fed purified or autooxidized cholesterol. Lipids, 1989; 24: 109-115.

165. Kosykh V.A., Podrez E.A., Novikov D.K., Volgushev S.A., Victorov A.V., Repin V.S., Smirnov V.N. Very low density lipoprotein secretion by cultured hepatocytes of rabbits fed purified or autoxidized cholesterol, Lipids, 1989; 24: 109-115.

166. Kosykh V.A., Novikov D.K., Kosenkov E.I. Effects of chylomicron remnants on cholesterol and bile acid synthesis in cultured human and rabbit hepatocytes. Atherosclerosis, 1994; 109: 197.

167. Kosykh V.A., Peobrazhenski, S.N., Fuki.l.V., Zaikina.O.E., Tsibulski,V.P.,Repin V.S.and Smirnov,V.N. Cholesterol can stimulate secretion of apoprotein B by cultured human hepatocytes. Biochim.Biophys.Acta, 1985; 836: 385-389.

168. Kosykh, V.A., E.A. Podrez, D.K. Novikov, A.V. Victorov, A.G. Dolbin, V.S. Repin, and V.N. Smirnov. Effect of bezafibrate on lipoprotein secretion by cultured human hepatocytes. Atherosclerosis, 1987; 68:67-76.

169. Kosykh,V.A., Preobrazhenski,S.N.,Ivanov,V.O.,Tsibulski,V.P.,Repin V.S.and125

170. Smirnov,V.N. High-affinity assosiation and degradation of l-labeled low density lipoprotein by human hepatocytes in primary culture. FEBS Lett., 1985;183:17-20.

171. Kovanen P.T., Brown M.S., Basu S.K., Bilheimer D.W., Goldstein J.L. Saturation and suppression of hepatic lipoprotein receptors a mechanism for the hypercholesterolemia of cholesterol-fed rabbits. Proc. Natl.Acad.Sci. USA, 1981; 78: 1396-1400.

172. Kowal, R. C., J. Herz, K. H. Weisgraber, R. W. Mahley, M. S. Brown, and J. L. Goldstein. Opposing effects of apolipoproteins E and C on lipopro- tein binding to low density lipoprotein receptor-related protein. J. Biol. Chem., 1990; 265: 10771-10779.

173. Krause B.R., Hartman A.D. J. Lipid Res., 1984; 25:97-110.

174. Kronfeld D.S., Johnson K., Dunlap H. Inherited predisposition of dogs to diet-induced hypercholesterolemia. J. Nutr., 1979; 109: 1715-1719.

175. Kroon P.A., DeMartino J.A., Thompson G.M., Chao J.-S. Molecular cloning of partial cDNAs for rabbit liver apolipoprotein B and the regulation of its mRNA levels by dietary cholesterol. Proc.Nat.Acad. Sci.USA, 1986; 83:5071-5075.

176. Kroon P.A., Thompson G., Chao In.-S. p-Very low density lipoprotein in cholesterol-fed rabbits are of hepatic origin. Atherosclerosis, 1985; 56: 323-329.

177. Mackinnon A.M., Drevon C.A., Sand T.M., Davis R.A. Regulation of bile acid synthesis in cultured rat hepatocytes: stimulation by apoE-rich high density lipoproteins. J. Lipid Res., 1987; 28:847-855.

178. Mahley R.W. Alterations in plasma lipoproteins induced by cholesterol feeding in animals including man. In: Disturbances in lipid and lipoprotein metabolism (Dietschi J.M., Gotto A.M., Ontko J.A. eds.), Bethesda, Am. Physiol. Soc., 1978, pp.181-197.

179. Mahley R.W. Remnant lipoprotein metabolism: key pathways involving cell-surface heparan sulfate proteoglycans and apolipoprotein E. J. Lipid Res., 1999; 40: 1-16.

180. Mahley R.W., Hui D.I., Innerarity T.L., Weisgraber K.H. Two independent lipoprotein receptors on hepatec membranes of dog, swine, and man. Apo-B,E and apo-E receptors. J. Clin. Invest., 1981; 68: 1197-1206.

181. Mahley R.W., Hui D.Y., Innerarity T.L. Two independent lipoprotein receptors on hepatic membrnes of dog, swine, and man. J. Clin.Invest., 1981; 68: 1197-1206.

182. Malmendier, C. L., and C. Delcroix. Effects of fenofibrate on high and low density lipoprotein metabolism in heterozygous familial hypercholesterolemia. Atherosclerosis, 1985; 55: 161-169.

183. Mangelsdorf, D. J., and R. M. Evans. The RXR heterodimers and orphan receptors. Cell, 1995; 83: 841-850.

184. Mangrlsdorf, D.J, C. Thummel, M. Beato, P. Herrlich, G. Schutz, K. Umesono, B. Blumberg, P. Kasmer, E. Mark, P. Chambon, and R. Evans. The nuclear receptor superfamily: the second decade. Cell, 1995; 83: 835-839.

185. Manninen, V. Clinical results with gemfibrozil and background to the Helsinki Heart Study. Am. J. Cardiol., 1983; 52:35B -38B.

186. Maranhao R.C., and Quintao E.C.R. Long term steroid metabolism balance studies in subjects on cholesterol-free and cholesterol-rich diets: comparison between normal and hypercholesterolemic individuals. J. Lipid Res., 1983; 24: 167-173.

187. Marsh J.B. Lipoproteins in a nonrecirculating perfusate of rat liver. J. Lipid Res., 1974; 15: 544-550.

188. McKinnon A.M., Savage J., Gibson R.A., Barter P.J. Secretion of cholesteryl ester-enriched very low density lipoproteins by the liver of cholesterol fed rabbit. Atherosclerosis, 1985; 55: 145-155.

189. McMurry M.P., Connor W.E., Cerqueira M.T. The comparative reductions of the plasma lipids and lipoproteins by dietary polyunsaturated fats: salmon oil versus vegetable oils. Am. J. Clin. Nutr., 1982; 35: 741-744.

190. McPherson R., Hogue M., Milne R.W., Tall A.R., Marcel Y.L. Increase in plasma cholesteryl ester transfer protein during probucol treatment.-Arteriosclerosis, 1991; 11: 476-481.

191. Meijer G.W., Smit M.J., Van der Palen J.G.P., Kuipers F., Vonk R.J., Van Zutphen L.F.M., Beynen A.C. Hepatic and intestinal HMG-CoA reductase activity in inbred strains of rabbits hypo- or hyperresponsive to dietary cholesterol. J. Nutr., 1992; 134.

192. Meinkoth, J., and G. Wahl. Hybridization of nucleic acids immobilized on solid supports. Anal. Biochem., 1984; 138:267-284.

193. Melchior G.W., Baker H.N., Abee C.R., Roheim P.S. Density gradient characterization of the high density lipoproteins in cholesterol-fed hyper- and hyporesponding patas monkeys (Erythrocebus patas).- J. Lipid Res., 1984; 25: 979990.

194. Melin B., Keller G., Glass C,, Weinstein D.B., Steinberg D, Lipoprotein synthesis and secretion by cultured rat hepatocytes. Parallel inhibition of secretion of VLDL, HDL and albumin by monensin. Biochem. Biophys. Acta, 1984; 795: 574 578.

195. Mellies, M.J., E. A. Stein, P. Khoury, G. Lamkin, and C.J. Glueck. Effects of fenofibrate on lipids, lipoproteins and apolipoproteins in 33 subjects with primaiy hypercholesterolaemia. Atherosclerosis, 1987; 63: 57-64.

196. Miettinen T. Mode of action of a new hypocholesterolemic drug (DH-581) in familial hypercholesterolemia. Atherosclerosis, 1972; 15: 163-176.

197. Miettinen T.A. Gas-liquid chromatographic determination of fecal neutral sterols using a capillary column, Clin. Chim. Acta, 1982; 124: 245-248.

198. Miller N.E., Weinstein D.B., Steinberg D. Binding, internalization and degradation of high density lipoprotein by cultured normal human fibroblasts. J.Lipid. Res., 1977; 18:438-450.

199. Miller N.E., La Ville A., Crook D. Direct evidence that reverse cholesterol transport is mediated by high-density lipoprotein in the rabbit. Nature, 1985; 314: 109-115.

200. Milne R.W., Weech P.K., Blanchette L., Davignon J., Alaupovic P., Marcel Y.L. Isolation and characterization of apolipoprotein B-48 and B-100 very low density lipoproteins from type III hyperlipoproteinemic subject. J.Clin. Invest., 1984: 73: 816-823.

201. Mistry P., Miller N.E., Laker M., Hazzard W.R., Lewis B. Individual variation in the effects of dietary cholesterol on plasma lipoproteins and cellular cholesterol homeostasis in man. J. Clin. Invest., 1981; 67: 493-502.

202. Moberly, J. B., T. G. Cole, D. H. Alpers, and G. Schonfeld. Oleic acid stimulation of apolipoprotein secretion from HepG2 and Caco 2 cells occurs post-transcriptionally. Biochim. Biophys. Acta, 1990; 1042: 70-80.

203. Mok H.M.I., Von Bergmann K, Grundy S.M. Effects of interruption of entherohepatic circulation of biliary lipid secretion in man. Am. J. Dis. Dis., 1978; 23: 1067-1075.

204. Moos M., and D. Gallvitz. Structure of two human p-actin-related processed genes on which is located next to a simple repetitive sequence, EMBO J., 1983; 2:757-761.

205. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Meth., 1983; 65:55-63.

206. Motsumoto A., Aburatani H., Shibasaki Y., Kodama T., Takaku F., Itakura H. Cloning and regulation of rat apolipoprotein B mRNA. Biochim.Biophys.Res.Commun., 1987; 142: 92-99.

207. MottG.E., McMahan C.A., Kelley J.M., Mersinger-Farley C., McGill H.C. Responses of serum lipoproteins to dietary cholesterol and type of fat in baboons. Arteriosclerosis, 1981; 5: 337-344.

208. Murphy, M. C., A. Zampelas, S. M. Puddicombe, N. P. Furlonger, L. M. Morgan, and C. M. Williams. Pretranslational regulation of the expression of the lipoprotein lipase gene by dietary fatty acids in the rat. Br. J. Nutr., 1993; 70: 727-736.

209. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody, a new method of conjugation. J.Histochem. Cytochem., 1974; 22: 1084-1091.

210. Nelson J.A., Steckbeck S.R., Spenser T.A. Biosynthesis 24(S), 25 epoxycholesterol from squalene 2,3:22,23-dioxide. J.Biol.Chem., 1981; 256: 1067-1068.

211. Nervi F.O., Dietschy J.M. Ability of six different lipoprotein fractions to regulate the rate of hepatic cholesterogenesis in vivo. J. Biol. Chem., 1975; 250: 8704-8711.

212. Nestel P.I., Poyser A. Changes in cholesterol synthesis and excretion when cholesterol intake is increased. Metabolism, 1976;25:1591-1599.

213. Nestel P.J., Reardon M., Billington T. In vivo transfer of cholesterol esters from high density lipoproteins to very low density lipoproteins in man. Biochem. Biophys. Acta, 1979; 573: 403-407.

214. Nevis J.R. Isolation and analysis of nuclear RNA. Methods Enzymol., 1987; 152: 234-241.

215. Nicolosi, R. J., A. F. Stucchi, M. C. Kowala, L. K. Hennessy, D. M. Hegsted, and E. J. Schaefer. Effect of dietary fat saturation and cholesterol on LDL composition and metabolism. Arteriosclerosis, 1990; 10: 119-128.

216. Ockner R.K., Manning J.M., Pappenhausen R.B., Ho W.K.L. A binding protein for fatty acids in cytosol of intestinal mucosa, liver, myocardium and other tissues. Science, 1972; 177: 56-58.

217. Ogami, K., M. Hadzopoulou-Cladaras, C. Cladaras, and V. I. Zannis. Promoter elements and factors required for hepatic and intestinal transcription of the human apo 0111 gene. J. Biol. Chem., 1990; 265: 9808-9815.

218. Olivecrona, T., and G. Bengtsson-Olivecrona. Lipoprotein lipase from milk: the model enzyme in lipoprotein lipase research. In Lipoprotein Lipase. J. Borensztajn, editor. Evener Press, Chicago, IL.,1987, 1S 5S.

219. Olofsson S.-O., Bjursell G., Bostrom K., Carlsson P., Elovson J., Portter A.A., Reuben M.A., Bondjers G. Apolipoprotein B: structure, biosynthesis and role in the lipoprotein assembly process. Atherosclerosis, 1987; 68: 1-17.

220. Oram J.F., Brinton E.A., Bierman E.L. Regulation of high density lipoprotein receptor activity in cultured human skin fibroblasts and human arterial smooth muscle cells. J. Clin. Invest., 1983; 72: 1611-1621.

221. Ordovas J.M. and E.J. Schaefer. Genes, variation of cholesterol and fat intake and serum lipids. Curr. Opin. Lipidol., 1999; 10: 15-22.

222. Oro L., Carlson L.A., Olsson A., Poole P.H. Long term efficacy and safety of ciprofibrate in patients with primary hyperlipidemia. Curr.Ther.Res.Clin.Exp., 1992; 51: 750-761.

223. Osumi, T., H. Ozasa and T. Hashimoto. Molecular cloning of cDNA for at acyl-CoA oxidase. Biol. Chem., 1984; 259: 2031-2034.

224. Overturf M.L., Smith S.A., Hewett-Emmett D., Loose-Mitchell D.S., Soma M.R., Gotto A.M., Morrisett J.D. Development and partial metabolic characterization of a dietary cholesterol-resistant colony of rabbits. J. Lipid Res., 1989; 30: 263-273.

225. Overturf M.L., Smith S.A., Gotto A.M., Morrisett J.D., TewsonT., Poorman J., Loose-Mitchel D.S. Dietary cholesterol absorption and sterol and bile acid excretion in hypercholesterolemia-resistant white rabbits. J.Lipid Res., 1990; 31: 2019-2027.

226. Packard C.J., Clegg R.G., Dominiczak M.N., Lorimer A.R., Shepherd J. Effect of bezafibrate on apolipoprotein B metabolism in type 111 hyperlipoproteinemic subjects. J.Lipid Res., 1986; 27:930-938.

227. Packard C.J., McKinney L., Carr K., Shepherd J. Cholesterol feeding increases low density lipoprotein synthesis. J. Clin. Invest., 1983; 72: 45-51.

228. Pape, M. E., C. K., Castle., R. W. Murray. G. M. Funk, C. E. Hunt, and K. R. Marotti. ApoB metabolism in the cynomolgus monkey: evidenct for posttranslational regulation. Biochim. Biophys. Acta, 1991; 1086: 326-334.

229. Parsy D., V. Clavey, C. Fievet, I. Kora, P. Duriez and J.-C. Fruchart. Quantification of apolipoprotein C-lll in serum by noncompetitive immunoenzymometric assay. Clin.Chem, 1985; 31: 1632-1635.

230. Paterson J.R., Rumley A.G., Oldroyd K.G., Tait G.W., Smellie W.S.A., Packard C.J., Shepherd J., Lorimer A.R. Probucol reduces plasma lipid peroxides in man. Atherosclerosis, 1992; 97:63-66.

231. Pathasarathi S., Young S.G., Witztum J.L., Pittman R.C., Steinberg D. Probucol inhibits oxidative modification of low density lipoprotein. J. Clin. Invest., 1986; 77: 641644.

232. Pease R.J., and J.M.Leiper. Regulationof hepatic apolipoprotein-B-containig lipoprotein secretion. Curr.Opin.Lipidol., 1996, 7: 132-138.

233. Peng S.K., Phillips G.A., Xia G.Z., Morin R.J. Transport of cholesterol autoxidation products in rabbit lipoproteins. Atherosclerosis, 1987, 64: 1-6.

234. Peng S.-K., Taylor C.B. Cholesterol autooxidation, health and arteriosclerosis. Wld. Rev. Nutr. Diet, Karger, Basel, 1984, 1-24.

235. Peters J.M., Hennuyer N., Staels B., Fruchart J-C., Fievet C., Gonzalez F., and J. Auwerx Alteration in lipoprotein metabolism in peroxisome prliferator-activated receptor a-deficient mice. J.Biol. Chem., 1997; 272:27307-27312.

236. Pfeuffer M.A., Richard B.M. and Pittman R.C. Probucol increases selective uptake of HDL cholesteryl esters by Hep G2 human hepatoma cells. Arteriosclerosis, 1991; 11: 1527a.

237. Phonpanichrasamee C., Komaratat P., Wilairat P. Hypocholesterolemic effect of vitamin E on cholesterol-fed rabbit. Int. J. Vit. Nutr., 1990; 60: 240-244.

238. Poortman J.A., Buck R.A., Smith S.A., Overturf M.L. and D.S. Loose-Mitchell. Bille acid excretion and cholesterol 7a-hydroxylase expression in hypercholesterolemia-resistant rabbits. J.Lipid Res., 1993, 34: 1675-1685.

239. Preobrazhenski, S.N., V.O. Ivanov, I.V. Fuki, V.P. Tsibulski, A.M. Kameneva, V.S. Repin, and G.A. Ermolin. Enzyme-linked immunoreceptor assay of low-density lipoprotein receptor. Anal. Biochem., 1985; 149:269-275.

240. Puchois, P., A. Kandoussi, P. Fievet, J. L. Fourrier, M. Bertrand, E. Koren, and J. C. Fruchart. Apolipopmtein A-l containing lipoproteins in coronary artery disease. Atherosclerosis, 1987; 68:35-40.

241. Quintao E.C.R., Grundy S.M., Ahrens E.H.,Jr. Effects of dietary cholesterol on the regulation of total body cholesterol in man. J. Lipid Res., 1971; 12: 233-247.

242. Redding, C.M., and D. Steinberg. Studies of the synthesis and secretion of serum lipoproteins by rat liver slices. J. Clin. Invest., 1960; 39:1560-1569.

243. Redgrave T.G., Divine K.B., Roberts D.S.K., West C.E. Chylomicron metabolism in rabbits fed diets with or without added cholesterol. Atherosclerosis, 1976; 24: 501-508.

244. Reiser R., and Sidelman Z. Plasma lipid and lipoprotein response of humans to beef fat, coconut oil and sufflower oil.-Am. J. Clin. Nutr., 1985; 42: 190-197.

245. Rinning F., Pittman R.C. Regulation of the selective uptake of high density lipoprotein -associated cholesteryl esters by human fibroblasts and Hep G2 hepatoma cells. J. Lipid Res., 1988; 29: 1179-1194.

246. Rinninger F., Pittman R.C. Regulation of the selective uptake of high density using a capillary column. Clin, Chem. Acta, 1982; 124: 245 -250.

247. Roberts A., Thompson J.S. Inbred mice and their hybrids as an animal model for atherosclerosis research.- Atherosclerosis drug discovery (Day C.E. ed.), Plenum Publ. Corp., New York, 1976, pp.313-327.

248. Rubin, E. M., R. M. Krauss, E. A. Spangler,J. G. Verstuyft, and S. M. Clift. Inhibition of early atherogenesis in transgenic mice by human apolipoprotein A I. Nature., 1991; 353: 265-267.

249. Rubins H.B., Robins S.J. Effect of reduction of plasma triglicerides with gemfibrozil on high density lipoprotein cholesterol concentrations, J.Intern. Med., 1992; 231: 421426.

250. Rudel L., Deckelman ., Wilson M., Scobey M., and R. Anderson. Dietary cholesterol and down-regulation of cholesterol 7a-hydroxylase and cholesterol absorption in African green monkey. J.Clin.Invest., 1994; 93: 2463-2472.

251. Rudel L., Deckelman C., Wilson M., Scobey M., Anderson R. J.Clin. Invest., 1994; 93: 2463-2472.

252. Rudel L.L., Parks J.S., Johnson F.L., Babiak J. Low density lipoproteins in atherosclerosis.- J. Lipid Res., 1986; 27:465-473.

253. Rudel, L. L., J. S. Parks, and M. G. Bond. LDL heterogeneity and atherosclerosis in nonhuman primates. Ann. NY Acad. Sci., 1985; 454: 248-253.

254. Rustan, A. C., E. N. Christiansen, and C. A. Drevor. Serum lipids, hepatic glycerolipid metabolism and peroxisomal fatty acid oxidation in rats fed omega-3 and omega-6 fatty acids. Biochem.J., 1992; 283: 333-339.

255. Sato, R., T. Tanaka, A. Takatsuki, and T. Takano. Degradation of newly synthesized apolipoprotein B-100 in a pre-Golgi compartment. J. Biol. Chem., 1990; 265: 1188011884.

256. Schaffer J. E., and F. Lodish. Expression, cloning and characterization of a novel long chain fatty acid transport protein. Cell, 1994; 79: 427-436.

257. Schmitz, G., G. Assmann, and D.E. Bowyer. A quantitative densitometric method for the rapid separation and quantitation of the major tissue and lipoprotein lipids by highperformance thin-layer chromatography. J. Chromatogr., 1984; 307: 65-80

258. Schoonjans, K., B. Staels, P. Grimaldi, and J. Auwerx. Acyl-CoA synthetase mRNA expression is control- led by fibric-acid derivatives, feeding and liver proliferation. Eur. J. Biochem., 1993; 216: 615-622.

259. Schultz, J. R., J. C. Verstuyft, E. L. Gong, A. V. Viichols, and E. M. Rubin. Protein composition determines the antiatherogenic properties of HDL transgenic mice. Nature, 1993; 365: 762-764.

260. Schwartz M., E.G.Lund and D.W. Russell. Two 7a-hydroxylase enzymes in bile acid biosynthesis. Curr. Opin. Lipidol., 1998; 9: 113-118.

261. Scobey M.W., Johnson F.L., Rudel L.L. Delivery of high-density lipoprotein free and esterified cholesterol to bile by perfused monkey liver. Circulation, 1989; 80: 10701078.

262. Shand J.H., West D.W. The effects of clofibrate and bezafibrate on cholesterol metabolism in the liver of the male rat. Lipids, 1994; 29: 747-752.

263. Sherill B.C., Innerarity T.L., Mahley R.W. Rapid hepatic clearance of the canine lipoproteins containing only E apoprotein by a high affinity receptor: identity with chylomicron remnant transport process. J. Biol. Chem., 1982; 255: 11442.

264. Shore V.G., Shore B., Hart R.G. Changes in lipoproteins and properties of rabbit very low density lipoproteinson iduction of cholesteremia. Biochemistry, 1976; 13: 1579-1584.

265. Sirtori C.R., Sirtori M., Calabresi M., Francheschini G. Changes in high density lipoprotein subtraction distribution and increased cholesteryl ester transfer after probucol. Am.J.Cardiol., 1988; 62: 66B-72B.

266. Sirtori, C. R., and G. Franceschini. Effects of fibrates on serum lipids and atherosclerosis. Pharmacol. Ther., 1988; 37:167 -191.

267. Skrede, S., J. Bremer, R. K. Berge, and A. C. Rustan. Stimulation of fatty acid oxidation by a 3-thia fatty acid reduces triacylglycerol secretion in cultured rat hepatocytes. J. Lipid Res., 1994; 35: 1395-1404.

268. Slater H.R., Sepherd J, Packard C.J. Receptor-mediated catabolism and tissue uptake of human low-density lipoprotein in the cholesteros-fed, atherosclerotic rabbit. Biochim. Biophys. Acta, 1982; 713: 435-445.

269. Slotte J.P., Eckman S., Bjorkkerud S. Uptake and esterification of exogenueus cholesterol by low-density- lipoprotein-receptor-negative human fibroblasts in culture. Biochem. J., 1984; 222: 821-824.

270. Smith L.L. In: Cholesterol Autoxidation, New York, Plenum Press, 1981.

271. Sniderman A., Matpole D., Teng B. Low density lipoprotein: a metabolic pathway for return of cholesterol to the splanchnic bed. J. Clin. Invest., 1978; 61: 867-876.

272. Sniderman A., Brown B.G., Stewart B.F., and K. Cianflone. From familial combined hyperlipidemia to hyperapoB: unravelling the overproduction of hepatic apolipoprotein B. Curr. Opin.Lipidol., 1992; 3: 137-142.

273. Soma M.R., Morrisett J.D., Gotto A.M., Loose-Mitchell D.S., Poorman J.A., Smith S.A., OverturfM.L. Cholesterol metabolism in fibroblasts from rabbits resistant to diet-induced hypercholesterolemia. J. Lipid Res., 1990; 31: 985-994.

274. Sorci-Thomas, M., M. D. Wilson, F. L. Johnson, D. L. Williams, and L. L. Rudel. Studies on the expression of genes encoding apolipoproteins B100 and B48 and the low density lipoprotein receptor in nonhuman primates.J. Biol. Chem., 1989; 264: 9039-9045.

275. Sorci-Thomas M., Hadcock J.R., Rudel L.L., Williams D.L. Liver low density lipoprotein receptor mRNA levels in cholesterol-fed nonhuman primates. Arteriosclerosis, 1987; 7: 503a.

276. Spady D.K, Cuthbert J.A., Willard M., Meidell R.S. Circulation, 1994; 90: 1-90.

277. Spady D.K., Bilheimer D.W., Dietchy J.M. Rates of receptor-dependent and -independent low density lipoprotein uptake in the hamster.-Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1983; 80: 3499-3503.

278. Sparks J.D., Sparks C.E. J.Biol.Chem., 1990; 265: 8854-8862.

279. St.Clair R.W., Wood L.L., Clarkson T.B. Effect of sucrose polyester on plasma lipids and cholesterol absorption in African green monkeys with variable hypercholesterolemic response to dietary cholesterol. Metabolism, 1981; 30: 176-183.

280. Staels B. And J. Auwerx. Role of PPAR in the pharacological regulation of lipoprotein metabolism by fibrates and thiazolidinedines. Curr. Pharmaceutic. Design, 1997; 5:1-14.

281. Staels B., N. Vu-Dac, V. Kosykh, R. Saladin, J-C. Fruchart, J. Dallongeville, and J. Auwerx. Fibrates downregulate apolipoprotein C-lll expression indedendent of induction of peroxisomal acyl coenzyme A oxidase. J.CIin.lnvest., 1995; 95: 705-712.

282. Staels B., Schoonjans K., Fruchart J.-C., Auwerx J.: The effects of fibrates and thiazolidinediones on plasma triglyceride metabolism are mediated by distinct PPARs. Biochimie 1997;79:95-99

283. Staels B., Van Tol A., Audren T. and J. Auwerx. Fibrates influence the expression of genes involved in lipoprotein metabolism in a tissue-selective manner in the rat. Arterioscler. Thromb., 1992; 12:286-294.

284. Staels, B., and J. Auwerx. Perturbation of developmental gene expression in rat liver by fibric acid derivatives: lipoprotein lipase and alpha-fetoprotein as models. Development, 1992; 115: 1035-1043.

285. Staels, B., J. Auwerx, L. Chan, A. van Tol, M. Rosseneu and G. Verhoeven. Influence of development, oestrogens and food intake on apolipoprotein A-l, A-ll and E mRNA in the rat liver and intestine. J. Lipid Res., 1989; 30: 1137-1145.

286. Stahlberg D., Angelin B., Einarsson K. J.Lipid Res., 1989, v.30, p.953-959.

287. Stahlberg D., Reihner E., Rudling M., Berglund L., Einarsson K., Angelin B. Influence of bezabibrate on hepatic cholesterol metabolism in gallstone patients: reduced activity of cholesterol 7 alpha-hydroxylase. Hepatology. 1995; 21: 1025-1030.

288. Staprans I., Pan X-M., Rapp J.H., K.R. Feingold. Oxidized cholesterol in diet accelerates the development of aortic atherosclerosisin cholesterol-fed rabbits. Arterioscler. Thromb. Vasc.Biol., 1998; 18: 977-983.

289. Stone B.G., Erickson S.K., Craig W.J., Cooper A.D. Regulation of rat biliary cholesterol secretion by agents that alter intrahepatic cholesterol metabolism. J.Clin.Invest., 1987; 76: 1773-1781.

290. Straka M.S., Junker L.H., Zacarro L., Dueland S., Everson G., Davis R.A. Substrate stimulation of 7a-hydroxylase, an enzyme located in cholesterol poor endoplasmic reticulum. J. Biol. Chem., 1990; 265: 7145-7149.

291. Stravitz R.T., Hylemon P.В., Heuman D.M. Transcriptional regulation of cholesterol 7a-hydroxylase mRNA by conjugated bile acids in primary cultures or rat hepatocytes. J. Biol. Chem., 1993;268:13987-13993.

292. Suckling K.E., and E.F. Stange. Role of acyl-CoA: cholesterol acyltransferase in cellular cholesterol metabolism. J.Lipid Res., 1985; 26: 647-671.

293. Suzuki, H., Y. Kawarabayasi, J. Kondo, T. Abe, k. Nishikawa, S. Kimura, T. Hashimoto, and T. Yamamoto. Structure and regulation of rat long-chain acyl- CoA synthetase. J. Biol. Chem., 1990; 265: 8681-8685.

294. Tardif J.-C., Cote G.T., Lesperance J. Et al. Probucol and multivitamins in the prevention of restenosis after coronary angioplasty. New Engl. J. Med., 19777; 337: 365-372.

295. Tall A.R., Small D.M. Body cholesterol removal: role of plasma high density lipoproteins. Adv. Lipid Res., 1980; 17: 1-11.

296. Tavella M., Alaupovic P., Blankenhorn D.H., Chin H.P. Specific effect of combined cholestipol and niacin terapy on apolipoprotein В containing particles. Arteriosclerosis, 1987; 7: 494a.

297. Taylor W., Ellis W.R., Bell G.D. The effect of cholesterol feeding on gallbladder bile acids of the rabbit. Biochem.J., 1981; 198: 639-643.

298. Theriault A., Ogbonna G., Adeli K. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1992; 186: 617-623.3

299. Thomas M.S., Rudel L.L. ( H) cholesteryl ester labeling and transfer among human and nonhuman primate plasma lipoproteins. Anal.Biochem., 1983; 130: 215-222.

300. Tikkanen M.J. Fibric acid derivatives. Curr.Opin.Lipidol., 1992; 3, 29-33.

301. Tokunaga, K., Y. Nakaruma, K. Sakata, K. Fujimoro, M. Ohkubo, K. Sawada and S. Sakiyama. Enhanced expression of a glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene in human lung cancers. Cancer Research, 1987; 47: 5616-5619.

302. Tolleshaug, H., J.L. Goldstein, W.J. Schneider, and M.S. Brown. Posttranslational processing of the LDL receptor and its genetic disruption in familial hypercholesterolemia. Cell, 1982; 30: 715-724.

303. Tsai Y., Yuan J., Hunninghake D.B. Effect of gemfibrozil on composition of lipoproteins and distribution of LDL subspecies. Atherosclerosis, 1992; 95: 35-42.

304. Tsai, M-J and B. O'Malley. Molecular mechanisms of action of steroid/thydroid receptor superfamily members. Annu. Reu. Biochem., 1994; 63: 451-486.

305. Ueno K., Hayashi H., Moriuchi A., Okuyama H. Effect of a high cholesterol diet on lipid metabolizing enzymes in rabbits. Biochem. Biophys. Acta, 1985; 837: 173-180.

306. Van Zutphen L.F.M., Den Bieman M.G.C.W. Genetic control of plasma cholesterol response in the rat. J. Heredit., 1983; 74: 211-212.

307. Van Zutphen L.F.M., Fox R.R. Strain differences in response to dietary cholesterol by JAX rabbits: correlations with esterase patterns. Atherosclerosis, 1977; 28: 435-446.

308. Vanloo, B., J. Taveirne, I. Baert, G. Lorent, L. Lins, J. M. Ruyschaert, and M. Rosseneu. LCAT activation properties of apo A-l CNBr fragments and conversion of discoidal complexes into spherical particles. Biochim. Biophys. Acta, 1992; 1128:258 -266.

309. Vega G.L., and S.M.Grundy. Hypoalphalipoproteinemia (low high density lipoprotein ) as a risk factor for coronary heart disease. Curr. Opin. Lipidol., 1996; 7: 209-216.

310. Vlahcevic Z.R., Hyleman P.B., Chiang J.Y., Hepatic cholesterol metabolism. In: The Liver: Biology and Payhobiology, third edition, edited by I.M.Arias, J.L. Boyer, N.Fausto, Raven Press, Ltd., New York, 1994, pp. 379-389.

311. Voller A., D.E.Bidwell and A. Bartlett. Enzyme immunoassays in diagnostic medicine. Theory and practice. Bull.W.H.O., 1976; 53: 55-65.

312. Von Bergmann K., Mok H.J.I., Hardison W.G.M., Grundy S.M. Cholesterol and bile acid metabolism in moderately advanced stable cirrhosis of the liver.- Gastroenterology, 1979; 77: 1183-1192.

313. Vu-Dac N., Schoonjans K., Kosykh V., Dallongeville J., Fruchart J.-C., Staels B., Auwerx J.: Fibrates increase human apolipoprotein A-11 expression through activation of the peroxisome proliferator-activated receptor. J. Clin.Invest., 1995;96:741-750

314. Vu-Dac N., Schoonjans K, Kosykh V., Dallongeville J., Staels B., Auwerx J.: Retinoids increase human apolipoprotein A-11 expression through activation of the Retinoid X Receptor but not the Retinoic Acid Receptor. Mol. Cell.Biol. 1996;16:3350-3360

315. Wagner W.B., Clarkson T.B. Mechanisms of the genetic control of plasma cholesterol in selected lines of Show Racer pigeons. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1974; 145: 10501057.

316. Wang H„ Chen C., Fisher E.A. J. Clin. Invest., 1993; 91: 1380 -1389.

317. Wang, C.-S., W. J. McConathy, H. U. Kloer, and P. Alaupovic. Modulation of lipoprotein lipase activity by apolipoproteins. Effect of apolipoprotein C-lll. J. Clin. Invest., 1985; 75: 384-390.

318. Warden, C. H., C. C. Hedrick, J. H. Qiao, L. W. Castellani, and A. J. Lusis. Atherosclerosis in transgenic mice overexpressing apolipoprotein A-ll. Science (Wash. DC), 1993; 261: 469-472.

319. Whiting M.J., Wishart R.A., Gowing M.R., McManus M.E., Mackinnon A.M. Bile acid synthesis and secretion by rabbit hepatocytes in primary monolayer culture: comparison with rat hepatocytes. Biochim.Biophys.Acta, 1989;1001:176-184.222

320. Whiting M.J., Wishart R.A., Lewis G., Mackinnon A.M. Bile acid synthesis by cultured rabbit hepatocytes: stimulation by three lipoprotein fractions. Biochim.Biophys, 1989; 1005: 137-142.

321. Williams D.L., Dawson P.S., Newman T.C., Rudel L.L. Synthesis of apolipoprotein E By peripheral tissues. Ann. NY Acad. Sci., 1985; 454: 222-229.

322. Yamamoto A.Y., Matsuzawa B., Kishino R., Hayashi R., Hirobe K., Kikkawa T. Effects of probucol on homozygous cases of familial hypercholesterolemia. Atherosclerosis, 1983;48:157-163.

323. Yao Z., Tran K., R.S.McLeod. Intracellular degradation of newly synthesized apolipoprotein B. J.Lipid Res., 1997; 38: 1937-1953.

324. Yokoi Y., Daida Y., Ruwabara Y. et al. Effectiveness of an antioxidant in prevention restenosis after percutaneous transluminal coronary angioplasty; the probucol angioplasty restenosis trial. J. Am. Coll. Cardiol. 1997; 30: 855-862.

325. Zanis, V. I., D. Kardassis, P. Cardot, M. Hadzopoulou-Cladaras, E. E. Zanni, and C. Cladaras. 1992. Molecular biology of the human apolipoprotein genes: gene regulation and structure/function relationship. Curr. Opin. Lipidol. 3:96-113.

Информация о работе

Косых, Владимир Алексеевич
доктора биологических наук
Москва, 2000
ВАК 03.00.04

Диссертация

Обмен холестерина в гепатоцитах при развитии алиментарной гиперхолестеринемии и механизмы действия пробукола и фибратов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Обмен холестерина в гепатоцитах при развитии алиментарной гиперхолестеринемии и механизмы действия пробукола и фибратов - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы