Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ОБ ЭНЗИМАХ КАРБОКСИЛИРУЮЩЕЙ ФАЗЫ ФОТОСИНТЕЗА И ИХ СВЯЗИ С ИНТЕНСИВНОСТЬЮ ПРОЦЕССА

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "ОБ ЭНЗИМАХ КАРБОКСИЛИРУЮЩЕЙ ФАЗЫ ФОТОСИНТЕЗА И ИХ СВЯЗИ С ИНТЕНСИВНОСТЬЮ ПРОЦЕССА"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А. Н. БАХА

Об энзимах карбоксилирующей фазы фотосинтеза и их связи с интенсивностью процесса

-\ •

(спецнальвость 03. 00. 04 - биологическая химия) Диссертация написана на русском языке

/

На правах рукописи

аббат Абдурахмановна Бабаджаяова

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на сонскайме учено* степени кандидата бимюгнчссих наук

Москка 1973

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А. Н. БАХА

11а иравйх [) у кончен •

Мухаббат А бдурахманонна Бабаджанава

Об энзимах карбоксилярующеи фазы фотосинтеза я ях связя с интенсивностью процесса

(специальность 03.00-04~биологическал химия) Диссертация написана на русском языке

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1972

Работа выполяена в Лаборатории автотрофнои ассимиляции углерода Ордева Лепина Института биохимии ни. А. И. Баха АН СССР и в Лаборатории биохимии фотосинтеза Института физиологии л биофизики растении АН Таджикской ССР.

Научный руководитель—кандидат химических наук Н. Г. Доман

Офицнальг оппоненты:

Доктор биологических наук II. П. Воскресенская

Доктор биологических наук П. А.< Колесников

На официальной отзыв работа направлена о ботанический Институт АН СССР (Ленинград).

Автореферат разослав

Защита диссертации состоится «_» г.

на заседании Ученого совета Ордена Ленина Института био-хнмпн ни. А, Н. Саха АН СССР (Москва, В-Т1, Ленинский проспект, 33).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.

Ученый секретарь кандидат биологических наук Н, Н. Дьячков

Подписано к печати 13/ХЫЙ72 г. КЛ 05399. Заказ 300.

Тираж 200 экэ Печ. листов 1,85__

Отпечатано в Таджикском госуниверснтете ям. В. И. Ленива

I. ВВЕДЕНИЕ

Фотосинтез, являясь одним из ватных биологических процессов, происходящих в природе, играет исключительную роль в жизни нашей планеты. Используя солнечную энергию, растительные организмы в процессе фотосинтеза образуют органическое вещество из углекислоты и води. Этот процеоо также является единственным источником свободного кислорода в земной атмосфере. Подсчитано, что весь атмосферный кислород обновляется растениями каждые 2000 лет. По A.A. Ничдаоровичу (1961) в настоящее время в процессе фотосанте-г за ежегодно создается около 380 шрд т органических веществ. Че- -ловечество же использует в шщу лишь 6% всей годовой продукции фотосинтеза. Увеличение использования в пишу фотосинтетической продукция растительности земного тара должно, по-видимому, идти разными путями. Одним из таких путей является увеличение урожайности сельскохозяйственных растений. Умение же получать высокие урожая по существу представляет собой умение обеспечить наивысшую продуктивность фотосинтеза. Другой возможный путь увеличения продуктов питания и сырья для промышленности - искусственный фотосинтез. Таким образом, очевидна крайняя актуальность изучения проблемы фотосинтеза.

Большой рклчд в области исследования путей фотосинтетической ассимиляции углекислоты был внесен Кальвином и его сотрудниками, которые на основании опытов о высшими растениями и зелеными водорослями предложили общепринятую в настоящее время схему автотроф-ИОЙ асснмиляпиж углекислоты (Baeeham, Ввивon, Kay, Hai-rlв, Uilecra and Calvin, 1954). Согласно этой схеме реакция первичного карбо-ксияированжя при фотосинтезе, в которой акцептором углекислоты яв~ ляется о-рибулозо-1,5-дафосфат, катализируется ферментом рибулозо-дифосфаткарбоксилазой (З-фосфо-ь-глицерат-карбокси-^лиаза днмерязу-идая, 4.1.1.39). Реакция, катализируемая рибулозодифосфаткарбокси-лазой, является "главными входными воротами" для ассимилируемой углекислоты и, возможно, одной из определяющих интенсивность фотосинтеза у растений. Она поставляет материал для всех остальных синтетических процессов растительной клетки. Выяснение особенностей

этой ферментативной реакции имеет важное значение для понимания, механизма фотосинтеза и возможного управления этим пропеосом.По-этому рибулоэодифосфаткарбоксжлаза послужила объектом разнообразных исследований, направленных, главным образок» на изучение звко-химячески свойств энзима и его активности. Однако, до сих пор остается неясным ряд вопросов, в частности, низкая удельная активность рибулозодифосфаткарбоксилаэы в полученных препаратах, не обеспечивалцая скорости фиксации углекислот in víto (losada, Trebet f А пит, i9601 Peterkofeky end Backer, 1961; Heber, pon, Heber, 1963)*

Низкую удельную активность рибулозодафосфаткарбоксилазы, не соответствующую ее ключевой роли при фиксации углекислоты в процессе фотосинтеза объясняют возможным повреждением энзима при его виделекии а очистке. Кроме того, можно было предположить отсутствие агентов или условий, регулирующих активность энзима in vivo.

На основании вышеизложенного задачами данной работы являлись;

I. Выявление причин шзкой удельной активности рибулозоди-фосфаткарбоксидазы;

П. Сравнительное изучение величины потенциальной интенсивности фотосинтеза и фиксации углекислоты ферментными препаратами у различных видов растений с целью определить, в какой мере различия в ассимиляционной способности зависят от активности фотосин-тетяческюс энзимов;

Ш. Изучение регуляции активности фотосиптетических энзимов in vitro.

п. материалы >1 метода

рбъ^кгы ирслеровдний

Лдя сравнительного изучения величин потенциальной интенсивности фотосинтеза и фиксации углекислоты ферментными препаратами использовались исходные формы и глоро^ильные мутанты растений гороха (Piвша eativum) и резушки Таю (Arabldopeia tbali&naK Для

методических исследований и изучения свойств рибулозодифоефаткар-бокоилазы лспользовались листья гороха и фасоли (Fhaeeolus vulgaris).

Исследование различна* м^трдов рцд^леяия

хлоропластов. подтекая из «их ^¡фцкя и

ферментных препаратов.

Вследствие того» что при выделении хлоропластов в водных средах из них вымываете? весьма значительная часть растворимых ферментов (Smillie and Fuller, 1959) необходимо било, предо всего, найти такие условия, при которых это вшивание происходило бы в меньшей степени. Однако, выделенные s безводной среде со методу Стонияга (stocking, 1959) хлоропласта не удалось нам разрушать ни растиранием в фарфоровой ступке, ни в гомогенизаторе,, на с помощью ультразвука. Поэтому нами были испробованы два метода выделения хлоропластов в различных водных средах с целью выбора такого метода, ори использовании которого из хлоропластов не вымывались бы водорастворимые белки. Для опытов были взяты листья гороха сорта "Капитал".

I. Метод Иона и др. (Роа et al., 196З). Для выделения хлоропластов использовался 0,1 К калий фосфатный буфер, рВ 7.4 с 0.5 К содержанием сахарозы. Осмотический "шок" хлоропластов юроводижоя в этом же буфере.

П. Метод Сисакяиа и др. (Siaaakian et al.( 1965). Для выделения хлоропластов использовался 0.1 M калий-фосфатный буфер» рН 7.4, содержащий 0.5 M сахарозы, 0.005 M UgCl2 и 0,004 К СаС1?. Осмотический "шок" хлоропластов проводился в 0.1 II трис- нс1 буфере рН 7.4.

Для получения ферментных препаратов использовалось фракционирование белков вытяжки из хлоропластов и супернатаята, оставшегося после выделения хлоропластов, различными насыщениями сульфата ашоння. В даажзоваяиыг ферментных препаратах определялась Фиксация нанс1403 в присутствии Р-5-Ф и АТФ в качестве субстратов реакции (табл.1).

Табл. I.

Относительная фиксация НаНС14о3 ферментными препаратами в зависимости от метода выделения хлороплаотов из гомогеката листьев гороха сорта "Капитал".

| 1-ый метод П-ой метод

Фракция (Т насыщения (НН4)2Б0+ 'Фиксация Я«НСи03 в импДшн на г сырого веса лноть-'ев Распределение белков по фракциям в 2 Фиксация НаНС140э в шип/мяв на г онрого веоа листьев Распределение белков Вйг*"

Внтяжиа кэ хлоропласт сев о-з.бГ Контроль 3.5-7.456 Контроль^ 7.4-4274;* Контроль _ 42.4-81.4% Контроль 2170 30 310 1685 90 1045 ' 26* 490 260 , 50 1280 620 30 15!!

Супернатант,оставшийся после выделения хлоропластоэ 0-3.52 Контроль 3.5-7.В Контроль , 7.4-42.42 Контроль 42.4^1.4 Контроль 5450 1950 40 4360 210 3460 > 742 5230 60 7660 1740 780 335 > . 852

Представленные в табл. I результаты показывает» что при выделении хлоропластев как первый, так и вторым методом большая часть (от 74*2 до 855?) водорастворимых белков вымывается из хлоро-пластов. Эти результаты подтверждают данные, полученные ранее Смайлн и Фуллероы (Smlllie and Fuller, 1959)• Поэтому ДО отказались от выделения хлоропластов и получения вытяжки из них и разработали метод получения ферментных препаратов без предварительного выделения хлоропластов.

Метод получения фешекткы^ препаратов фе^

предварительного выделения хлоропластом.

Подобрав состав буфера на основании литературных данных и ваших многочисленных опытов с ферментными препаратами и используя для разрушения хлоропластов замораживание и оттаивание гомо-гената, нами был разработан следующий метод получения ферментных препаратов без предварительного выделения хлоропластов.

500 г листьев гороха сорта "Победитель" растирали в фарфоровой ступке о 300 мл 0.02 U трио- so^ буфером, рН 8.0, содержащим 0.005 Ы MgClg а 0.01 М восстеновленкого глютатиова. Гомогеаат (фильтровали через полотно, затем замораживали при температуре -24°С к размораживали под током холодной водопроводной воды. Оттаявший гомогенаг центрифугировали на холоду в течение одного часа при 100000 xg ка вакуумной центрифуге парки MSB. Прозрачный светлохедтый судернатант использовался для получения ферментных препаратов с помощью фракционирования сульфатом ашояия. Результаты определения фиксации Ланс^о^ в присутствии Р-5-Ф о АТФ а. РиДФ показывают (табл. 2), что в обоих вариантах наибольшая фиксация наблюдается во фракции 25-303! насыщения сульфатом аммония. Эти данные свидетельствуют о том, что фракционированием белков с помощью сульфата аммония различной степени насыщения не удается отделить ржбулозодяфосфаткарбоксалазу от сопутствуяцях ей в ходе выделения рибо эофосфатизомеразы (D-рибозо-5-фосфат-кетоиэомераза, 5.3.1.6) и фосфорибулокияазы САИ: рибулозо-5-фосфат-1-фосфотрая-сфераэа, 2.4.1.19). Из табл. 2 видно, что удельная активность ри-

булозодафосфаткарбоксилазы возросла в 6 раз - от 0.04 мкМ СГ402 на мг белка в №«717 в исходном суперяатанте до 0.24 мкЫ во фракции 25-3056 насыщения сульфатом аммония. Тровцу (Тго*п, 1965), разработавшему улучшенный метод получения препаратов ри-булозодифосфаткарбоксилазы из листьев шпината, удалось достичь увеличения удельной активности энзима в 1.6 раз - с 0.074 мкЫ С14С>2 на мг белка в минуту в исходной вытяжке из хлоропластов до 0.120 мкМ в самой активной фракции 40-4552 насыщения суль-

фатом аммонии.

Табл. 2.

Фиксация ЯаНС1403 ферменткьми препаратами, выделенными из листьев гороха сорта "Победитель" при фракционировании белков сульфатом адооквя.

Фиксация {% насыщения сульфатом аммония) Фиксация Кавс1^ в ивд/иин/мг белка в присутствии в качестве субстратов реакции Удельная активность РиДФК в мкМ С1402/мг белка/мин

Р-5-4 + А» Рида

Исходный оу- 9160

пернатант 17000 0.043

0-2555 10120 12000 0.030

25-30$ 84700 97000 0.240

30-355Е 35800 65080 0.160

35-405? 9320 22000 0.055

40-45% 2000 3100 0.008

Таким образом, разработанный метод получения ферментных препаратов из листьев гороха без предварительного выделения хлоро -пластов является эффективным и имеет ряд преимуществ: значительно сокращается вреда получения препаратов, более паяно извлекается растворимые фермента и достигается существенно большее, чем у Тоопйа, увеличение удельной активности рибулозохифосфаткарбокси-. лазы. Подученные нами результаты указывают также на то, что иамо-

раживание не влияет на активность рибулозодифосфаткарбоксилазн. Позднее, специальными опытами (Веденина, 1968) было показано,что активаооть рибулозодифосфаткарбоксидазы сохраняется и после многократны! замораживаний бесклеточного экстракта из водородных бактерий»

Кожичеотввяяое определение

Количественное содержание белка определили по методу Доури и др. ÍLowry et si., 1951) о небольшой модификацией: для освобождения от Лоури-положительных веществ небелковой природы попользовали диализ и осаждение белка 3% ТХУ. Калибровочная кри -вая построена по бычьему сывороточному альбумину.

Определение активности рибулоэодифдоФаткзрбокфилазы и суммарной актавнодт^ рибозоФосфатизомеоазн. ФосФорибудокиназн и рд-^у^о^ош^6ооааткарбок9дд^?ы_проводиля радиометрическим методом при 25°С в обычных пробирках на воздухе или в специальных сосудиках в атмосфере инертного газа. Останавливали реакцию добавлени- -ем равного объема 6Л hci или 122 ТХУ. Поаве удаления белка центрифугированием радиоактивность растворов определяли с помощью га-» эолроточного гелиевого иди торцового счетчика. Активность ферментов обычно выражали в ныл или расп на мг бедка в минуту или ккМ превращенного за I минуту субстрата на мг белка препарата.

Состав реакционной смеси в мкМ/мл при определении:

1. Активности pffiyjfo?одаФосфаткарбоксялазы - KgCl2 - 10j восстановленный глютагжоя - 10;

НаН014.03 в 0.5 U трис- нсг буфере, рН 7.5-50; РИД« - I

; раствор фермента, содержащей 0.4 мг белка,

2. суммарной активности рибозоФооФатазомераэы. ДооФорнбудо-рднаод и рибудозодифроФаткарбокдилазн - HgCl2 - lOj восстановленная глкатион - 10; НаНС14о? в 0.5 M трис-SC1 буфере, рН 7.5-50Í Р-5-Ф - 10; ATO - 10; раствор фермента, содержащий 0.4 мг белка.

Очцстка тдаепапатов рибудо?ориФосФаткарбоксилазы.

Для очистка препаратов рибулозодифосфаткарбоксилаэы использовались последовательно два метода: I - фракционированное осаждение белков с помощью сульфата аммония путем увеличения степени насыщения, 2 - двухкратное фильтрование через колонки о сефадекс в-гоо ■ размером 4.7 х 42 см, предварительно уравновешенные 0.1 М трис-НС03 буфером, рН 8.0, содержащим 0.005 М %С12 н 0.005 М меркаптоэтанола. Для фильтрования был использован препарат рибу-лозодифосфаткарбоксияазы (300 мт в 15 мл), выделенный при 25-355? насыщении (Шд)г50+ в атмосфере аргона из листьев гороха сорта "Победитель".

Определение рп-удрдрталъной интенсивности

Фотосинтеза.

Потенциальная интенсивность синтеза определялась о по-

несенским, О.В.Заленским, О.А.Семихатовой (1965). В газгольдере создавалась 1% концентрация углекислоты с активностью 5 микрокюри на I л смеси. Листья экспонировались в камере в течение 5 минут. Освещенность 20-26 тысяч лике. Температура 25-28°С.

Ш. ПОЛУЧЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ РИБУЛОЗОДИФООФАТКАРБОКОШЗЫ И ЮС АКТИВНОСТЬ.

Выделение и ^чистка препаратов рибудоэодиФооФат-карбоксилаэы из листьев гороха на вузз^е я ? атмосфере инертного газа.

До настоящего времени не удалось получить препараты РиДОК в высокоочищенном кристаллическом виде, активность которых существенно приближалась бы к активности фермента, осуществляющего процесс фотосинтетической «фиксации углекислоты in vivo. Одной из причин недостаточно высокой активности выделявшихся препаратов фер-

мощью радиоактивной углекислоты

методом, описанным В.А.Воз-

мента могут быть его изменения ори выделении, происходящие в го-могеяате листьев под действием некоторых активных веществ клетки, а также различных окислительных процессов под действием кислорода воздуха.

Чтобы проверить предположение о возможной инактивации фермента под действием кислорода воздуха выделение и очистка препаратов РиДФК производились на воздухе я в атмосфере аргона. Для опытов были использованы листья двухнедельных проростков гороха сорта "Победитель*.

При выделении препаратов РиДФК в атмосфере аргона наблюдается более четкое фракционирование с помощью сульфата аммония, чем при выделении этих препаратов на воздухе (рис.1). Удельная активность РиДФК, выделенной в атмосфере аргона, в ходе фракционирования сульфатом аммония возросла от 0.03 мкМ с^О^/мг белка/ минуту в исходном супернатанте до 0.3 мкН во фракции 30-35$ насыщения <hh4)2so4, т.е. достигнута 10-кратная степень очистки фермента. На воздухе удельная активность РиДФК возрастает от 0.04 икМ С1402/мг белка/мин в исходном супернатанте до 0.24 мшМ во фракции 25-30Í насыщения сульфатом аммония, т,е. достигается только 6-кратная степень очистки фермента. Таким образом, удельная активность РиДФК в препаратах, выделенных в атмосфере аргона, выше, чем в препаратах, выделенных на воздухе.

Как нами было показано в главе "Материалы и методы", фракционированным осаждением белков о помощью сульфата аммония различной степени насыщения не удается очистить препараты рябулоэо-дифосфаткарбоксялазы от рибозофосфатизомераэы и фосфорибулокияа-эы. Поэтому следупфш этапом очистки препаратов РиДФК от сопутствующих ей энзимов явилось фильтрование через колонки о сефадеко g-200* При первом фильтровании РиДФК выходит некомпактно, размываясь по многим фракциям; существенною возрастания удельной активности фермента не наблпдаетая. При вторичном фильтровании (рис.2) РиДФК выходит компактно, в основном, в двух фракциях I и 2, удельная активность энзима достигает 0.8 мхХ С402/мг бедка/-мин. В табл.3 приведены данные об удельной активности РиДФК, по-лучамне разными авторами.

Приведенные в табл.3 данные показывают:

I. Величина удельной активности РйДФК, выделенной различны-ю авторава из одних и тег же объектов, сильно варьирует в зависимости от способа выделения и очистти фермента.

I

6? -

£

¡§ 0,1

А

1

УЪгъ

!

1

на 0-25 25-30 ЛН53М0 4045

ФРАКЦИИ ПРОЩЕНИЯ {т„)г$Оч 8%

Рис.1. Удельная активность рибулозоди-фоофаткарбоксилазн в препаратах, выделенных при различных насыщу яиях <кНд)Е атмосфере аргона и на воздухе из листьев гороха сорта "Победитель".

□ - воздух

щ - аргон.

Рис.2. Удельная активность рийулозодифосфаткарбо-ксхлаэн, выделенной в атмосфере аргона при 25-35^ насвденжм (нн^)250+ жз листьев гороха сорта "Победитель", после второго Зяльтррванхя через колонет сефадеко е-200 (4.7 х 42 см).

2. Величина удельной активное яг РжДФК, вшдааеяной вам из лиотьев гороха в атмосфер« аргона, превышает в 4-40 рав величины, подученные для «того фермента друпши авторами. Удельная активность РиДФК в исходном суперяатанте до фракционирования о помощь» сульфата амаония составляла 0.025 мкМ С1^ на иг белка в минуту. Следовательно, вам удалось в атмоофере аргона из лиотьев гороха подучить препарат Ридак о 32-кратной степени» чиототы.Как видно из рнс.З, фиксация Яанс140? этими препаратами в присутот-вхи Р-5-Ф к АТО почти не происходит, что свидетельствует об отсутствии в препарате язоыеразо-кинаэяой адтявност*.

Табл.3.

Удельная активность рибуло зоддфосфаткарбоксилазы выделенной из различных объектов.

Объект - источник фермента Удельная активность в нхЦ С1402 ва UP белка в минуту Литературный источник

Chrometium okenli 0.02 Trtlper, 1964

Chromatium strain D 0.05 Kieraa and Haaelkorn, 1968

Hydrogeпотопаa H-16 0.047 Gottsehalk, 1964

Hydrogenomonae 2-1 0.04-0.16 Веденина, 1968

TMbaccilue thioparue 0.041 Johnacm, Peek, 1965

Листья шпината 0.085 Feterkofekу and RacKer, 1961

0.215 TTOTO, 1965

Листья гороха 0.800 Еабадханова и др., 1971.

Таким образом, двухкратным Зяльтрованием раствора фермента через колонки с сефедеко е-200 вам удалось практически освобо -литься от сопутствуй*« рибудозодифосфаткарбокежжазе в ходе выделения и очистки о помощью сульфата ашония ферментов - ржбоэо-фосфатизомеразн и фосфорибулоккяаэы.

Фракций

Ржс.3. ФХКСЛЦЖН Я»НС1^03 в прлсутотвхж 1>-Р*буЛ030-I,5-джфосфата к 1>-рабозо-5-фосфата с AW фермент шля препаратам*, выделенными s атмосфере apposa оря 25-35% насыщения (nh^)2so+ из листьев гороха сорта "Победитель", после двухкратного {шоьтроваяхи через колонки сефадеко g-гоо (4.7 г 42 см).

-о-с--факсадкя в присутствжж D-ри-

оулозо-1, 5-дкфосфага

----а.-д--фиксашя в присутствии о-ри-

боав-5-фюфйТа + AT®.

Тровяг (Тгеято, 1965)» Паульсену Я Лейя (Раи1яеп &п1 Ьап«, 1966) из листьев шпината фракционированным осаждением белков сульфата аммония с последующим фильтрованием через колонки с с»? фадево г-200 и гадроясилапатитом удалось получить препараты ри-булозодифосфаткарбоксилазы только с 20-кратной степенью чистоты, свободные от примесей ферментов - рнбозофосфаткзомеразы и фосфо-рибулокиназы.

Активность тябУлоэодифо9Фаткарбококлазы. выделенной иэ листьев Фасоли на воздухе Ч В ЗТ*19<гФ9Ю

Чтобы выяснить, сказывается ли отрицательное действие кислорода на энзим в процессе реакции карбоксилирования Б-рибуло-зо-1,5-дафосфата» нами были проведены специальные опыты по изучению влияния атмосферы различных газов на активность рибулоэо-дифосфаткарбоксилазы, выделенной на воздухе из листьев фасоли сорта "Сакса" прч 0-25% насыщении сульфатом аммония.

Табл.4.

Влияние атмосферы различных газов на активность ржбулозодифоофагкарбокожлазы,выделенной па воздухе из листьев фасоли сорта "Сакса".

Газ Фиксация нанс1403 в расп/мнн/мг

белка

воздух 11110

гелий 20500

водород 16750

Из данных, приведенных в табл.4 видно, что РиДФК из листьев фасоли в атмосфере гелия вдвое интенсивнее фиксирует Иалс1*о3 чем на воздухе; в атмосфере водорода РиДФК также активнее, чем яа воздухе, но эффект не так значателея, как в атмосфере гелия.По-

видимому, водород, подученный наш в лаборатории о помощи» адпара -та Киша при вэаимодействии свободного от примесей мышьяка цинка я серной кислоты, бых недостаточно .чист. Полученные наш результаты были подтверждены Еер>рк (Ввггу, 1971). Им было показано, что кислород окисляет 1>-рибулоэо-1,5-дафосфат до гликолевой кислоты.

1У. ВЛИЯНИЕ РЯДА ФАКТОРОВ НА ФИКСАЦИЮ НаЕСиО. В ПРИСУТСТВИИ Р-5-Ф И АТО ФЕРМЕНТНЫМИ ПРЕПАРАТАМИ, ВЫДЕЛЕННЫМИ ИЗ ЛИСТЫВ АНАВИЮРЗК ТНА1ЛАЛА (Ь) нвтнж.

Дня понимания механизма генетической регуляции фотосинтеза большое значение имеет выяснение особенностей реакции фиксации. углекислоты. При изучении этой проблемы особенно удобны биохимические мутации, выражащнеоя в различных нарушениях обмена веществ. Начатые в Австралии Лэндгряджем (1оп£г1ев,195б) опыты по выделении биохимических мутантов у лгаМ<1орв1е №а11ап& открыл! путь для широкого использования этого растения при изучении действия гена на молекулярном уровне. Но прежде чем прово -дить исследования на биоххмпческих мутантах АгаЪ1<1орв1е гьаИааа необходимо было изучить влияние ряда факторов на фиксацию углекислоты ферментными препаратами из листьев растений исходной расы, так как до наших исследований это растение не использовалось для энзнмологпческсх опытов. Поскольку исследования проводились на частично очищеншх ферментных препаратах, то необходимо было установить, присутствуют лж в подученных препаратах сопутствующие рибулозодифосфаткарбоксихаэе энзимы - рнбозофоофатиэомераза л фоофорибулокиназа. О наличии к степени согласованности работы этих ферментов в препаратах можно судить по фиксации углекислоты в присутствии иди отсутствии какого-либо субстрата энзимов.Представленные в табл.5 данные о фиксации НаВс1+о3 в зависимости от состава ферментной смесж, свидетельствуют о том, что в подученных препаратах присутствуют.все три вышеназванные энзима, обуславливаете превращение Р-5-Ф в РиДФ к фиксацию НаНС1+о3.

......

' Табл.5.

Фюсошщя *шнс1*03 в завкотоехж о* составе ферментной смесж препарата«, декелтошж мэ

ЛИСТЬвВ АгаЬЫор«!« «Ьв11шни

Состав ферментной смеси в нйЛи И«в0и03 в расп/ мин/мг белка х * 1СГ4

нвсОг .бну) Вооотавовлея-ввк гжютатаон Р-6-» А»

10 10 10 10 3.2

10 10 10 а» 0.6

10 10 — 10 1.4

Представляло жнтерес сравнить скорость фпссацих ОДО14^ фермеит-шши препаратами в прясутствлж к Р-5-Ф о АТ® в качестве субстратов реакцп. Оказалось (табл. 6), что ферментные препараты интенсивнее <}жксжруют н«вс1*о3 в присутствен Р-5-Ф, чем в присутствии Рида. Этот удивительный факт трудно интерпретировать. Можно полагать, что одной хз возможных причин этого факта является наличие большого количества неорганического фосфора в препаратах РиДФ, так как их чистота колебалась (по нами определениям) от 12% до 37*. Кая известно, неорганический фосфор в больших концентрациях оказывает на рнбулоэодафосфаткарбоксжлаэу ингабирупцее действие. В связи о этим дальнейшее изучение фгасацни углекислоты ферментными препаратами из листьев Агама орв1е гЬаНапа проводилось в присутствии Р-5-Ф в качестве субстрата реакции. Следующим этапом вапжх исследований был подбор наиболее благоприятны условий для этой реакции. Изучено влияние концентраций белка, Р-5-Ф.КаНСО^ и иона фосфата на фиксацию НаНС14о3 ферментными препаратами. Исследована кинетика реакции фиксации НаНС14о5 в присутствии Р-5-Ф и ¿ТФ в качестве субстратов реакции. *

Прямая пропорциональная зависимость фиксации Майс14о^ наблюдается в пределах следующих концентраций на мл ферментной смеси: белка - от 0.1 до 1.0 мг, Р-5-Ф - от I до 15 мкМ,и»нсио3 - от 10 до 40 мкМ.

Табл.б.

Сравнение скорости фиксации Н*НС1*С>2 фериентямя препаратами, выделенными аз листьев Ar*bidopeiei thailana в пржсутстваи РиДФ и Р-5-Ф о ATS в качестве субстратов реакции.

Ферментный препарат Субстрат Относительная фиксация НаИСиО, в нмп/мин/г сырого веса листьев

Неходкая раса Enkhelm

Вытяжка из хлоропластов и их промывные

воды

32-465? насыщения {hh4)2so+ Р-5-® 185

Рида 120

Контроль Р-5-Ф 15

Супернатант, оставшийся после выделения

хлоропластов

0-32? насыщения <hb4)2so4 Р-5-Ф 5170

РиЛФ 1630

Контроль Р-5-Ф 20

Контроль - раствор фермента кипятили в течение 3-х минут.

Иои фосфата в пределах концентраций от 1.0 х IO-6!! до 5.0 х х ICT^M слегка стимулирует фиксацию навс£4о3 ферментными препаратами, но ухе при концентрации 10 х ЮГ^М эффект исчезает. Эти результаты согласуются с данными,подученными другими авторами. Так, например, Гиббо и Кало (cibbs and c&io, 1959) набдвдали увеличение фиксации CI40g изолированными хлоропластами шшшата при концентрации фосфата I х ICT^M, более высокие концентрации являдиоь иютбирущими. Романовой А.К., Ведениной И.Я., Ломаном Н.Г. ÍI968) было показано, что ион фосфата до концентрации 2.0 х 10тС слегка активирует действие рибулозодифосфаткарбо-

ксилазы из водородных бактерий, so уте при кондентращн 5.0с1СГ3Ы подавляет действие фермента на 20i.

Влияние FTf ШТАШВ T,°"",4ft3 *вР*ентнмм

TrPa4"rffTffTg S шдутргстяиг У-'Ц* *

Участие кннеэтша в регуляции развития ■ поддержания внутренней структуры хяоропяастов является хорошо установленным фактом, подтверждении« па многих объектах. Такое дейстме кинетжва ва структуру хлоропластов не могло не сказаться ва их функциональном состоянии. Прямое доказательство усиления фотосинтетичаакой активности хлоропластов в результате обработки листьев кжнетжном было получено в лаборатории А.А.Ынчипоровяча в опытах, проведенных Романко Е.Г., Хейном Х.Н. и Кунаевой О.Н. (1968). ФаЙерабеа-дом(ierabend, 1969, 19ТО) на этиолированных проростках ржи было показано, что под влияние» кинетика возрастает активность двух хдоропжаотных энзимов - ркбулозодифосфаткарбоксилазы и НАДО - зависимой фосфоглицерадьдегид дегидрогеназы. Существенно, что кинетин стимулировал прирост активности этих энзимов не только в расчете на проросток, но и на мг белка, что указывает ва относительную избирательность его действия. После анализа литературных, данных становится очевидной необходимость изучения действия кинетика на активность ферментов непосредственно in vitro, т.е* при добавлении в реакционную смесь. Объектами исследований были выбраны растения исходной расы Enihei» Arabldopele thaliana и ^ его выцветающего мутанта v-155/2. Этот хлорофисьяый мутант получен от профессора Г. Реббеяена (Геттингёнгский университет, ФРГ) и интересен тем, что в условяях короткого двя я высоких температур его листья выцветают и ва них появляются белесые пятна,* а в условиях длинного дня и низких температур листья зеленеют и его фенотип приближается к исходной расе Enttheim. Для опытов растения выращивались в оранжерее в зимне-весенний период. Для получения фер~ ментных препаратов брались листья у растений в стадии бутонжза * цпи. Из представленных в табл.7 данных по влиянию различных концентраций кинетина на фиксацию н&вс^о^ ферментными препаратами видно, что во всех вариантах опытов под действием кинетина наблюдается значительное возрастание фиксации Яанс^о^* Степень воз-

растания фиксации Ханс140? зависит от концентратам кинетина в реакционной смеси и от исходного состояния самого ферментного препарата, обусловленного физиологическим состоянием растений в. зависимости от сроков посева. В зависимости от исходного состояния ферментного препарата, воздействие кинетика в концентрации 2.0 г КГ6« вызывает возрастание Таксации НаНс14о3 от 1,5 до 3 раз,

ТЬбл.7.

Влияние иинетона на Зюссаш» Иансио3 фермеятщын препаратами в присутствии Р-5-Ф и АТФ

Объект исследования Концентрация кинетика в I мл ферментной смеси Фиксация ВаВс1*о, в раса/ мин/ыг белка х

март апрель май

Исходная раса ЕакЬв1ж1 АгаЬ±с1орв1в -ЬЬаНваа 0.5 х 1.0 х 1.5 х 10~6М 10^ ИГ6!! 4.8 4.2 4.8 5.2 2.9 3.5 3.3 3.8 1.5 2.1 1.9 2.4

2.0 х 1СГ®М 5.7 5.7 4.3

Контроль I - без Р-5-Ф в ферм.смес* 1.0 1.0 0.8

Контроль П - без Р-5-Ф в ферм.смеси 2,0 х кг^м 1.1 1.0 0.9

Контроль Ш - белок кипятили в течение 3-х минут 2.0 х 10"®М 1.0 0.9 0.8

Мутант т-155/2 юг6« 3.0 2.3 1.2

0.5 х 3.8 з.е 2.5

1.0 х ЮПИ 1.5 х 10Г% 4.0 4.2 4.0 4.2 2.9 3.0

2.0 х ЮПИ 4.8 4.7 З.В

Контроль - без Р-5-Ф в ферм.смеси X . 1.1 1.1 0.8

Одинаковый характер зависимости степени возрастания ИаНС14о. от исходного состояния ферментных препаратов к от различных концентраций яанетина как у исходной расы Энкхайм, так и у его выцветающего мутанта т-1?5/г позволяет предполагать, что кинеткн может играть роль регулятора активности ферментов, ответственных за фиксацию углекислоты и регенерацию акцептора. Полученные нами данные могут служить также косвенным подтверждением предположе -нин Кенде и Тавариса (Кгвйе аюй Татагва, 1Э68) о том, что кине-тин оказывает влияние на активность фотооинтетических энзимов в качестве аляостерического эффектора.

У. ПОТЕНЦИАЛЬНАЯ ИНТЕНСИВНОСТЬ ФОТОСИНТЕЗА ЦЕЛЫХ ЛИСТЬЕВ И ФИКСАЦИЯ С1402 ФШШШШИ ПРЕПАРАТАМИ.

Сравнение йякоапяи С1402 црдым^ JffpTtJwq Д ^рм^дуннм? препрратамд т ^ryrowtr и мгуадт-«нт jfotM имений.

Низкая удельная активность рибулозодифосфаткарбоксилаэн явилась основанием для сомнений некоторых исследователей (Тго»ш,1965! Oibbe, Bamberger, Еllyaxd and Bveгaon, 1967) в КЛичевОЙ роли 9Н-эика при фикоации 00^ в процессе фотосинтеза. Наличие корреляции между величинами потенциальной иятеесжвяоста фотосинтеза целых листьев и активности рибулозодифосфагкарбоксилаэн свидетельство-, вало бы о кгтевой роли аналма при фиксации углекислоты в процессе фотосинтеза. Отчествовенке такого типа корреляции было показано исследованиями Бёрхяана (Вуйгкаап, 1966, 1969), но оставалось неясным, отражает ли эта корреляция прячакнут связь.

Для этих исследований удобна мутаятные формы растений, у торых нарушена ассимиляционная деятельность листьев. Изучение характера изменений величин потенциальной интенсивности фотосинтеза и активности энзима при реверсии мутанта в норму могло бы дать информации о наличии кяи отсутствии причинной связи между этими величинами. Изменения в ассимиляционной деятельности листьев мо? гут быть обусловлены изменениями активности не только рибулозоди-

фосфаткарбоксилазы, но я энзямов, ответственных за регенерат» акцептора углекислоты. Поэтому нами определялась фиксация С ферментными препаратами в присутствии Р-5-Ф и .АТФ, которая является, результатом последовательного действия трех ферментов: рибозофо -сфатиэомеразы, фоофорибулокиназы и рибулозодифосфаткарбоксилаэы. Из представленных в табл. 8 результатов измерения потенциальной .. интенсивности фотосинтеза целых листьев и фиксации С14^ ферментными препаратами видно, что хлорофилыше мутанты растений резунки Таля и гороха можно разделить на две группы:

I. - мутанты с высокой потенциальной интенсивностью фотосинтеза, обладающие и высокой активностью ферментов;

2 - мутанты с пониженной интенсивностью фотосинтеза,имеющие и низкую активность ферментов.

К первой груше относятся мутант 539 резушкл Таля и мутанты * 2012, Л 2013 гороха сорта "Торсдаг". Ко второй группе относятся мутанты Ä 393, А 561, "gian* и "luoo" резушки Таля и мутант Jí 2094 гороха сорта "Фаленский".

Таким образом, у исходных форм и хлорофильных мутантов ра -стений Arabldopsle tballana и Flaum sativum обнаружена прямая корреляция меадг скоростью фотосинтетического поглощения CI4Üj целыми листьями и интенсивностью фиксации ее la vitro ферментными препаратами в присутствии в-рибоэо-5-фосфата и АТФ.

Действие ле^^тт^ ид потенциальную интенсивность

Фотосинтеза целых листьев и Фиксацию С-^О^ ферментными препаратам^.

a) in vivo.

Дня наших исследований использовались растения Aiabldopeie thallana расы Enkheim и индуцированный у этой расы гамма-лучами хлорофильный мутант вирядоальбина 40/}. А.Г.Касьяненко и Н.В. Тймофеевым-Ревсовским (1967) было установлено, что мутант виридоальбина имеет резко нарушенную морфологи» пластид, пониженное содержание пишентов я низкую потенциальную интенсивность фотосинтеза. Генетический анализ показал, что мутация произошла в ядре, рецессивна и обусловлена изменением ликь одного гена(Касья-ненко, 1967). При выращивании мутанта виридоальбина 40/3 на ara-

ТабЛ.8.

Потенциальная интенсивность фотосинтеза целых листьев в фиксация С14!^ ферментшвяг препаратами.

Фиксация НаНс140з Б присутствии Р-5-Ф и ¿та в расц/мин/мг

белка х КГ4

Объект исследований

Потенциальная интенсивность фотосинтеза в кг

час/г сухого веса

Уезуика Тали лж>

(АгаЪ1<1орв1о

Исходная раса Ешй1»1в Мутанты:

Я 539

* 393

* 561

■Чиоо"

Контроль - без Р-5-Ф в ферментной смеси

77.7*0.3

62.2+0.2 42.€£0.7 47.1+0.4 45.5±0.2 40.010.8

3.1

3.0

2.2 1.9

2.3 2.2

0.1

Горох (?1ват м*1тпш)

Исходная форма сорта "Торсдаг"

Мутанты:

* 2012 * 2013

Исходная форма оорта "ФаленскжЙ"

Мутант 2094

Контроль - без Р-5-Ф в ферментной смеси

21.6+0,5

24.6^0.4 21,6+0.2

54.5+0.9 21.510.6

1.1

1.0 ХЛ

3.0 0.7

0.1

ровой питательной среде с добавкой лейцина происходит реверсия этого мутанта в норму - листья из белесьч превращаются в зеленые, усиливается синтез пигментов^ хлоропласте нормализуются, происходит ускорение развития и увеличения сухого веса растений (Абдуллаев и др., 1970).

Представленные в табл.9 результаты показывают, что добавление ¿»х-лейцина в питательную среду у растений исходной расы Энкхайм не изменяет величину потенциальной интенсивности фотосинтеза целых листьев и не влияет на фиксацию КаНС^о^ в присутствии Р-5-Ф и АТФ ферментными препаратами.

Табл.9.

Влияние <1,1-лейцина на лотенциалькув интенсивность фотосинтеза целых листьев и фиксацию С С^ ферментными преоа, ратами, выделенными из исходной и мутантной форм растений АгаМЛораЛа ШаНапа.

Объект исследований Питательная среда Интенсивность фотосинтеза мг С^Оз/час/г сухого веса Фиксация НаНС1403 в присутствии Р-5-Ф и АТФ в расп/ тн/ит белка X 1СГ4

Исходная раса Энкхайм Минеральная Минеральная + ■+ леивдн 44.4+0.6 43,4+0.8 2.8 2.7

Мутант ви^идоальбина Минеральная Минеральная + ■+ лейцин 17.0±0.7 29.0+0.5 1.0 2.6

Кроме того, электронномикроскопические исследования показали, что выращивание растений исходной расы на минеральной среде с добавкой лейцина не изменяет структур« хлоропластов (Абдуллаев и др., 1970).

У цутанта виридоальбива 40/3 реакция иная: при выращивании мутанта на минеральной среде с добавкой й,1-лейцина величина потенциальной интенсивности фотосинтеза целых листьев и фиксации С1402 ферментными препаратами возрастает в 2-2,5 раза. Электроя-номакрос копичес ки е исследования хлоропластов этих листьев (Ad -дуллаев и др., 1970) показывает восстановление до нормы их ла -меллярной структуры а, таким образом, свидетельствует о роли лейцина в ее создании.

Совокупность всех подученных нами даннкх указывает на тесную связь между структурой хлоропластов .активностью ферментов и функциональной активностью фотосинтетического аппарата. Эти результаты хорошо согласуются с результатами других авторов (Шахов, Голуб-хова, 1964; Ааур в Ооипова, 1965; Романко, Хейн, Кулаева, 1968) констатирупцих связь между структурой хлоропластов и его функциональной активностью.

б) in vitro.

Чтобы выяснить характер влияния d.l-лейцина на активность ферментов, необходимо било исследовать влияние различных концентраций d,i-лейцина на фиксацию ЯаНС14о3 ферментными препаратами и in vitro, т.е. при добавлении в реакционную смесь* На рис.4 видно, что фиксация ферментными препаратами при добав-

лении d.l-лейцкна в реакционную смесь изменяется как у исходной расы EnWieim Arabldopeis thallana, так и у его мутанта виридоальбива 40/3. У исходной расы Enkheim фиксация НаНо14а, ферментными препаратами возрастает в пределах концентраций лещина от 5.Ох х 10"% до 1.0 х КГ^М, дальнейшее увеличение концентрации ведет к спаду интенсивности фиксации н*нс1*о3, достигая при концентрации 10.0 х Ю~еМ исходного уровня. У мутанта виридоальбина 40/3 фиксация Ваьо'^о^ ферментными препаратами возрастает постепенно в пределах концентраций лейцина от 0.5 х Ю-6« до 3.0 х КГ6!!, достигая максимума при концентрации 3.0 х и затем постепен-

но снижается, достигая первоначального уровня при концентрации 10.0 х io-ём.

Разная реакция ферментных препаратов из исходной расы Bnk-heim на действие лейцина in vivo и in vitro, а также зависимость фиксации НаВС14о3 в присутствия Р-5-Ф и АТФ ферментными . препаратами как из исходной расы, так и из мутанта вяридоальби-

нН/л шерментнои снеси с!}1-Лещ*н

Влияние концентрации Л,1-\яейцина на фиксации НаВСи03 в присутствии D-$I<fo30-5-$0C$tta и АТФ ферментными препаратами, выделенным! из ЛИСТЬАВ ¿r¿Mdop»is thaJLlana.

-•-•--исходом рем tauwim

-é-а--мутаит rlrlde-ftlbln« 40/3;

на 40/3 от различных концентраций <1,1-лейшза даст основание полагать, что лейцдн может играть роль активатора ферментов, ответственных за фиксацию углекислоты и регенерацию акцептора.

Совокупность полученных результатов позволяет заключить, что одним из факторов, регулирующих интенсивность фотосинтеза является изменение активности энзимов, ответственных за фиксации углекислоты и регенерацию акцептора. Этот вывод хорошо согласуется с работой Т.Ф. Андреевой и Т.А. Авдеевой (1970), показавшими наличие корреляции между интенсивностью фотосинтеза и активностью рибуло-зодифосфаткарбоксилазы в онтогенезе растений и при воздействии на него различных факторов внешней среда.

У1. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Сравнительное изучение скорости фиксации ЛаНС1*о3 ферментными препаратами, выделенными из листьев исходной расы ЕпИгв1п Агама орв1е №&11аоа в присутствии б-рибуло зо-1,5-дафо сфата и с- рибозо-5-фосФата с АТФ в качестве субстратов реакции показало, что фиксация С 02 интенсивнее происходит в присутствии Б-рибозо-5-фосфата с АТФ, чем в присутствии с-рибулозо-1,5-дифосфата.0д-ним из возможных объяснений результатов этих опытов является наличие большого количества неорганического фосфора в препаратах Б-рибулозо-1,5-дафосфата, чистота которых колебалась от 122 до 372. Как известно, неорганический фосфор в больших концентрациях оказывает на рибулоэодифосфаткарбоксилазу ингибирущее действие. В связи с этим [фиксация НаНС14о3 в последующих экспериментах на ферментных препаратах из этого растения изучалась в присутствии и - рабозо-5-фосфета и АК в качестве, суботратов реакции.

Результаты сравнительного изучения величин потенциальной интенсивности фотосинтеза и фиксации углекислоты в присутствии х>-рибозо-5-4осфата и АТФ ферментными препаратами у исходных и му-тантных форм растений гороха (РАеиш еа«тап) и резуики Таля (АгаЫ<йоре±в 1Ьа11ашО позволяют заключить, что активность энзимов, ответственных за фиксацию углекислоты, является одним из факторов, определяющих видовую ассимиляционную способность.Этот вывод наглядно подтверждается результатами экспериментов на му-талте А1-аЫаорв1в -ншИапа виридоаяьбаиа 40/3. При фенотипичв-

ской реверсия этого мутанта на питательной среде с добавкой ад-лейцина ваблвдается корреляция между величинами возрастания потенциальной интенсивности фотосинтеза и активности энзимов, т.е. и потенциальная интенсивность фотосинтеза и активность энзимов возрастают в 2-2,5 раза.

Испытание различных методов выделения и очистки рибулозоди-фосфаткарбоксилаэы доказало, что одной из причин низкой удельной активности энзима 1п т1*го является инактивация его под дестви-ем кислорода воздуха. Отрицательное действие кислорода воздуха проявляется как в процессе выделения и очистки энзима, так и в ходе реакции карбоксилировавия в-рибулозо-1,5-дифос$вта. В процессе этих экспериментов наш был разработан метод получения ферментных препаратов из листьев высших растений без предварительного выделения хлоропластов» Этот метод гарантирует более полное извлечение водорастворимых белков из хлоропластов и лучшее сохранение активности энзимов.

На ферментных препаратах* выделенных из исходных и мутант -них Форш АгаЪ14оре1в гъ&Иапа установлено, что на фиксацию нанс 4о3 оказывают стимулирующее действие ряж агентов: ион фосфата - в пределах концентраций от 1.0х1СГ®М до 5.0ос:10-6М; й,1-лейцин - О.бхИГ6» до б.ОхЮГ6«;

киветии - - - 0.5х10~% до г.О^ЮГ6«.

Анализ литературных данных и полученных наш результатов позволяет заключить, что энзимы, ответственные за фиксацию углекислоты, требуют для своей работы тонкой настройка, что дает широкие возможности для физиологической регуляции их активности. Данный вывод полностью укладывается в рамки гипотезы о метаболическом контроле активности энзимов цикла Кальвина.

УЛ. ВЫВОДИ.

X. Разработан метод получения препаратов рабулозодифосфат-карбоксилазы из листьев высших растений без предварительного выделения хлоропластов, который имеет ряд преимуществ: значительно сокращается время получения препаратов, более полно-извлекается энзим, достигается существенно большее, чем у других авторов,увеличение удельной активности рибулозодифосфаткарбоксилазы.

2. Сравнение результатов определения активности препаратов рибулозодяфосфаткарбоксилазы из листьев гороха, выделение и очистка которых производились на воздухе и в атмосфере аргона* позволило заключить, что атмосфера инертного газа предохраняет энзим от инактивации кислородом воздуха. Результаты изучения влияния атмосферы различных газов на активность выделенного на воздухе из листьев фасоли препарата рибулозодифосфаткарбоксидазы показывает, что фиксация НаНС^о^ в атмосфере гелия я водорода происходит соответственно в 2 и в 1,5 раза интенсивнее, чем на воздухе.

Совокупность полученных результатов свидетельствует о том, что отрицательное действие кислорода на »язвы проявляется как в процессе внделения и очистки энзима, так и в процессе реакции карбоксилирования &-рибулозо-1,5-джфосфата.

3. При выделения и очистке препарата рибулозодафосфаткарбо-ксилазн в атмосфере аргона фракционированием белков путем осаждения сульфатом аммония различной степени насыщения с последующим двухкратным фильтрованием через колонки о сефадеко g-200 получен препарат 32-кратяой степени чистота с удельной активность» 0.8 мкМ C ^Og на т белка в минуту.

4* Изучено влияние ряда факторов на фиксацию НвНС1+о3 в присутствии D-рибозо-5-фосфата и АТФ ферментными препаратами, выделенными из листьев Arabldopeie thaliana. Установлена зависимость фиксации ЛаНС14о^ от концентрации белка, D-рибозо-б-фосфета и углекислоты. Исследована кинетика реакция фиксации наНС14о3 в присутствии D - рибозо-5-фосфата и АТФ. Показано стл-мулируйцее действие на фиксацию 1аНС1*03 ряда .агентов: ионов фосфата - в пределах концентраций от i.grlct"6!! до 5*0г10т1; лейиина - от 0.5х1СГ% до Б.ОкМГ6)!; кинетика - от O.SxHT6!! до г.ОгИГ6!!.

Зависимость степени возрастания фиксация (от 1,5 до 3

раз) в присутствии D- рибозо-5-фосфата и АТФ от различных концентраций кинетива и от исходной активности ферментного препарата, обусловленной физиологическим состоянием растений указывает на возможность участия кинетинав регуляции активности энзимов*

5. У ИСХОДНЫХ и мутаятяих форм Ploum eatirua и Arebldopeie tha llana обнаружена пряная корреляция между скоростью фотостате-тического поглощения C Og целыми листьями я интенсивность» фвкс»

паи Навс1403 ферментными препаратами в присутствии в-рибозо-5-фосфата и АТФ. Эти данные свидетельствуют о том, что одним нз факторов, регулирующим интенсивность фотооинтеэа, явлдотоя изменение активности энзимов, ответственных за фиксацию углекислоты и регенерацию акцептора,

6, Проведенные эксперименты по выращиванию мутанта Arabidop-. ala th&ii&na виридоальбина 40/3 на минеральное среде без а,1-лей-цкна и с добавкой его в среду свидетельствует об участии d.i-лей-цина в восстановлении функции фотосинтетического аппарата, обусловленного также возрастанием активности энзимов, ответственных за фтсоацию углекислоты к регенерацию акцептора.

Материалы настоящей работы докладывались на 1-ом Всесоюзном биохимическом съезде (Ленинград,1964), на Всесоюзной конференции "Фотосинтез и использование солнечной энергии" (Душанбе, 196?),на. Всесоюзном семинаре "Методы выделения и исследования белков - ко№* понентов фотосинтетического аппарата" (Пущино-на-Оке, 1973).

Список ра^от. опубликовании^ -dgo материалам д^йцуят^

1. Каримова (Еабадханова) H.A., Школьник Р.Я., Доман Н.Г.,1967,

"Карбоксидиомутаза и солутствухщае ей ферменты из листьев гороха, люцерны и резушки Таля (AraMdopaia thaiiana)". в сб. "Исследования по фотосинтезу"• Душанбе, 66.

2. Каримова (Бабадяанова) М.А., Романова А.К., Доман Н.Г,,1967,

"Карбоконлаэа рибулезо-1,6-дифоофата, ее свойства и роль в фотосинтезе". Тезисы докладов всесоюзной конференции "Фотосинтез и использование солнечной радиации", Душанбе, 54.

3. Школьник Р.Я., Каримова (Бабаджаяова) М.А., Доман Н,Г.,1967,

"Влияние некоторых условий на фиксацию вне

клетки в присутствии рибулезо-1,5-дифосфата и рибо-

зо-5-фосфата". ДАН Тадж. ССР, т.Х, Ä6, 60.

4. Бабаджанова М.А., Гореняова Л.Г., Халтова Л.Т., 1969,"Фикса-

ция C^^Og ферментными препаратами, выделенными ... из листьев разли чннх мутантов гороха и реэушки Тали"» П Всесоюзный-биохим. съезд, тезисы докладов. Секция 19. Ташкент, 49.

5. Бабаджанова М;А;, Хаитова Л.Т., Горенкова Л.Г., 1971, "По -

тенциальная■интенсивность фотосинтеза и-актив -" ность ферментов карбоксилированин у исходных я мутаатяых форм растений".ДАН Тадж.ССР,т,Х1У,*4,74.

6. Бабаджанова М.А., Хаитова Л.Т., Касьяненко Л.Г., X97I. "Дейст-

вие лейцина'на потенциальную интенсивность фотосинтеза и активность ферментов, ответственных за фиксацию С02 у исходной и мутантной фор* Arabi-dopsle tballana". ДАН Тадж. ОСР, т.Х1Г,№5, 50.

7. Бабаджанова U.A., Халтова Л.Т., Насыров Ю.С., 1971. "Влияние

кинетнва на фиксацию C^^Og бесклеточными препаратами Arabidopsis thaliana". ДАН Тадж. ССР, Т.£17, *8, 62.

8. Бабаджанова М.А., Доман Я.Г., Чекина Н.Г., 1971. "Выделение и

очистка препаратов карбоксилазы рибуле эодифосфата из листьев гороха и фасоли в атюсфере инертных газов". Сб. "Фотосинтез я использование солнечной энергии", Ленинград, 222.

9. Бабаджанова U.A., Хаитова Д.Т., 1971, "Активность ферментов

карбоксидирования и потенциальная интенсивность фотосинтеза у ауясотрофного мутанта Axabidopeis tballana". Сб. "Генетические аспекты фотосинтеза", Душанбе, 133.

10. Бабаджанова М.А., Халтова Л.Т., 1972, "Фиксация Сы02 в при-

сутствии D- рибозо-5-фосфата и АТФ ферментными препаратами, выделенными. из Arabidopeie tballana? ДАН Тадж. ССР, т.ХУ, Л6.

11. Бабаджанова U.A., 1Ъренков& Л.Г.,1972, "Влияние кинетика и лей-

цина на $жксацив Сл>2 ферментными препаратами, выделенными из исходных и мутантных форм aramd*pel* theiiane Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума "Генетические аспекты фотосинтеза", Душанбе, 41.