Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

О ПАТОГЕНЕЗЕ И ДИАГНОСТИКЕ МИКОПЛАЗМОЗОВ РАСТЕНИЙ

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "О ПАТОГЕНЕЗЕ И ДИАГНОСТИКЕ МИКОПЛАЗМОЗОВ РАСТЕНИЙ"

ей-

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА СССР

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

. На правах рукописи ЭЛЬ-ФАХААМ ЯХИЯ МУХАМЕД

О ПАТОГЕНЕЗЕ И ДИАГНОСТИКЕ МИКОПЛАЗМОЗОВ РАСТЕНИЙ

. 06.01.11 — фитопатология и защита растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА —1976

Работа выполнена в 1971—1975 гг. на кафедре фитопатологии и станции защиты растений Московской ордена 'Ленина н ордена Трудового Красного Знамени сельскохозяйственной академии имени К. Л. Тимирязева.

Научный руководитель— академик ВАСХНИЛ доктор биологических наук профессор М. С. Дунин.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук Е. А. Проценко н доцент( кандидат сельскохозяйственных наук И. С. Узунов.

Ведущее учреждение — Московское отделение Всесоюзного института растениеводства им. Н. И. Вавилова (п. Михнево, Московской обл.).

Автореферат разослан « .1976 г.

Защита диссертации состоится «Й?» ¿^С/С^Л^^ _ . . 1976 г. в /В. час. на заседании Ученого совета агрономического факультета ТСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке ТСХА (корп. 10). . .. ■'.

Просим Вас принять личное участие в работе указанного Совета или прислать письменный отзыв (в двух экземплярах, заверенных печатью) по адресу: 125008, Москва А-8. Тимирязевская ул., 48, корп. 8, Ученый совет ТСХА. :

Ученый се]

Ф. А. ДЕВОЧКИН

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Исследованиями, опубликованными за последние годы, установлено, что ряд инфекционных болезней, возбудителями которых считались вирусы (группа желтух), имеют принципиально иную этиологию и представляют собой особую группу заболеваний. Эти заболевания возникают в результате заражения растений микроорганизмами ультрамикроскопических размеров — микоплазмамк. Желтушные заболевания ра-CTettiift отличаются широким географическим распространением, сочетаются с обширным кругом поражаемых растений (представители семейств пасленовых и сложноцветных, цитрусовые, шелковица, яблоня, персик, некоторые виды пальм и др.). Установлено, например, что возбудитель столбура томатов поражает около 70 видов растений, а возбудитель желтухи астр — около 300 видов из 48 семейств (Kunkel, 1955). Поражая широкий круг растений, желтушные заболевания наносят огромный вред экономике, снижают урожай и резко ухудшают его качество у ряда важных сельскохозяйственных культур. Особой вредоносностью отличается столбур томатов, который снижает урожай на 50—70% (Цыпленков, 1971).

Диагностика микоплазм и микоплазмозов имеет первостепенное значение и является одной из наиболее актуальных задач в этой новой области фитопатологии.

Для решения этой задачи необходимо подробно изучить морфологические особенности, многообразие форм, размеры и строение частиц, антигенные свойства микоплазм, их развитие в зараженном растении и патологические признаки. Именно эти вопросы и определяют цели и содержание нашего исследования.

Цель и задачи исследования:

а) изучить патологические изменения у различных растений при заражении их микоплазмоподобными микроорганизмами и выявить влияние различных факторов на длительность инкубационного периода болезнщ.

-> II-. : ....... \ I^ |

4t3ipas'-uia >;.-.у.....1 C.-äs;awsa|

Иосиогекй cj-д.

йназк

LXQ3.I

ЧЙШЕЯЙ

-

б) провести эдектронномнкроскопнческое исследование возбудителей заболеваний растеннй типа же.^ух и пораженной ткани растения-хозяина с целью выявления локализации возбудителя;

в) изучить антигенные свойства фнтопатогенных мико-плазм в сопоставлении с сапрофитной мнкоилазмой с целью разработки методов ранней диагностики заболеваний группы желтух. ~

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые нами были найдены МПТ в проводящих тканях прорастающих семян внутри столбурных плодов томата. При элект-ронномнкроскоиическом исследовании ультратонкйх срезов подтверждено также и наличие МПТ в столбурных плодах томата, впервые обнаруженных В. Л. Федотнной (СССР). ;

Это явление представляет большой интерес. Его|дальней-шее изучение необходимо и важно как с точки зрения патологической физиологии растений, так н для выяснения* особенностей взаимосвязей МПО с метаболизмом растения^хозяина.

; Весьма существенное значение для ранней диагностики мн-коилазмозов растений имеют антигенные свойства ф'итопато-генных и сапрофитных микоплазм. На основе этих данных показано наличие родоспецнфическнх антигенов, общих для обеих групп микроорганизмов.

. Объем работы — 150 машинописных страниц, включающих 18 таблиц н 48 оригинальных рисунков.

Диссертационная работа содержит 5 глав, выводы; список использованной литературы (380 наименований) к прнложе-. ння.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

• В главе I приводится обзор литературы по изучаемой теме.

Обзор состоит из трех разделов: 1. История вопроса об этиологии желтушных заболеваний (микоплазмозов)|расте-ний. 2. Биологическая характеристика микрооргаппзмов, сходных с возбудителями желтушных заболеваний растеннй: L—; форм бактерий, Chlamydia и Mycoplasma. 3. Мнкоплазмозы растеннй — новая отрасль фитопатологии.

Глава И. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Экспериментальная работа выполнена лабораторными и вегетационными методами. Вегетационные методы выполнены в теплице и на участке Опытной станции защиты растеннй ТСХА, лабораторные — в лаборатории Опытной станции защиты растений и на кафедре с.-х. фитопатологии ТСХЛ в 1971 — 1975 гг. V ~

Источником инокулюма была чистая культура возбудителя стол бура томатов на растении томата, любезно предоставленная нам профессором А. Е. Проценко (Институт микробиологии АН СССР). .

Почва для вегетационных опытов готовилась смешиванием дерновой земли, песка и торфа в соотношении 1:1:1, затем стерилизовалась дважды с интервалом 1—2 дня в автоклаве при 105—108° под давлением 1,2—1,3 атм. в течение двух часов каждый раз.

Керамические сосуды н рассадные ящики дезннфецнрова-. лись погружением в 2%-нын раствор KMnOí в течение 20— 30 мин. с последующей промывкой водой.

Растения томатов разных сортов выращивались из семян, полученных с Овощной опытной станции , ТСХА им. В. И. Эдельштейна. Для исключения возможной семенной инфекции за 40—45 дней до начала опыта семена обрабатывали одним из способов, описанных М. И. Дементьевой (1970). Сеянцы выращивали под блоками люминесцентных ламп ЛБ-80 при освещенности/—7>5тыс. люкс и 12—14-часовом дне. С образованием первого или второго настоящего листа сеянцы помидоров пикировали по одному в вазоны.

Инокуляция подопытных растений производилась путем прививки «в расщеп»- в пазуху листа или на верхушечную часть стебля.

Чистота коллекций экспериментальных растений и отсутствие вирусов в них контролировались визуально, серологическим капельным методом Дуннна—Поповой (Дуннн и Попова, 1937), а также с помощью растении-индикаторов,

В осенне-зимний период температура в теплице поддерживалась на уровне 13—25°, освещенность, создаваемая блоками люминесцентных ламп ЛБ-80, — на уровне 3—4 тыс. люкс. В весенне-летний период температура колебалась в пределах 15—35°С, освещенность (естественная) — от 6 до 30 тыс. люкс.

Методом электронной микроскопии нами были исследованы растения томата, обладающие четкими типичными симптомами столбура, растения клевера с признаками нзрастания и черной смородины с признаками махровости. Контролем служили здоровые растения. Анализировались разные ткани различных органов больных и здоровых растений.

Фиксацию блоков тканей проводили по методу Люфта (Luit, 1956) и Паладе (Palade, 1952).

, Заливка подготовленных образцов проводилась двумя заливочными средами: смесью метакрнлатов (Newman, et al., 1950) и смесью эионов (Kushida, 1959; Finch, I960).

Ультратонкне срезы толщиной не более 50—60 нм нами, были получены на шведском ультра микротоме LKB со стек-

лянным ножом. Контрастирование ультратонких срезов производилось последовательным окрашиванием ураннлацетатом натрия и цитратом синица по Рейнольдсу (Reynolds, 1963). Полученные срезы просматривались в советском электронном микроскопе УЭМВ 100Б. • |

Для получения антисывороток был использован^ штамм В сапрофитной мнкоплазмы Mycoplasma laidlawii; который был нам любезно предоставлен профессором Г. Я. Каган (Институт эпидемиологии и микробиологии им. Гамалеи АМН СССР). Полученный штамм культивировался на специальной питательной среде и сохранялся в чистой культу ре ¡(с огласи о методике лаборатории по изучению микоилазм и L-форм бактерий вышеназванного института. Культура штамма мнкоплазмы в возрасте 5—6 дней осаждалась при 10000'об/мнн в течение -15 мин., троекратно отмывалась физиологическим раствором, осадок ресуснеизировался в физиологическом растворе в соотношении 1/100 объема от исходной среды. ~5

Сравнивались две схемы иммунизации: HayflicM Steinb-ritlge (I960) в модификации Чумаченко и Смирновой (1974) с некоторыми нашими изменениями (длительность иммунизации 90 дней) и предложенная нами схема продолжительностью 28—30 дней, i

При обеих схемах иммунизации кроликов одним и.$тем же способом вводилось одинаковое количество антнгена и адью-ванта. |

Все подопытные кролики относились к одной породе- (шиншилла), имели вес 3—3,5 кг, были одинаковы но лолу и возрасту, содержались при одинаковом режиме питания. I -Сравнительное изучение антисывороток проводилось с помощью реакции нейтрализации или ингибиции роста и реак-' пин аглютннацнн. 1

Для доказательства принадлежности обнаруженных нами' в тканях больных растений микоплазмоподобных телец'к ми-коплазме изучалось их антигенное родство. С этой целью были поставлены серологические реакции кольцепреципйтацни и реакции Дунина—Поповой. ^

Параллельно с опытом ставились 2 контрольные реакции: частично очищенного сока здорового растения, обработанного по методу Габорьяни и Бенчич (1968) с антисывороткой к М. laidlawii и антнгена, полученного из сока больного растения, с нормальной кроличьей сывороткой.

Для получения антисывороток к возбудителю стол бура использовался сырой сок без обработки, выделенный из больных растений томатов с четкими симптомами заболевания, и сок, очищенный по методу Габорьянн и Бенчич (Gaborjanyi, Вепс-sics, 1968). - . I

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава III. СИМПТОМАТИКА СТОЛБУРА НА РАСТЕНИЯ^ ИЗ СЕМЕЙСТВА ПАСЛЕНОВЫХ

Ш. 1. Реакция различных пасленовых растений на заражение их дву1ля формами фитопатогеиной микоплазмы

(возбудителя столбура)

Реакция различных пасленовых растений на заражение нХ дбумя формами фитопатогеиной микоплазмы отличалась в зависимости от вида растения-хозяина и формы возбудителя;

а) на растениях томатов хорошо проявляются симптомы двух форм столбура. При I форме наблюдается сильное гипертрофирование чашелистиков, пзрастание завязи в вегетативный побег и прорастание семян внутри плода. При II форме Пзрастание завязи не наблюдается, увеличивается число долей в одном листе, наступает быстрая гибель растения. Следовательно, воздействий II формы на растение томата сильнее;

б) на растениях перца внешнне симптомы обеих форм не различаются, но I форма сильнее угнетает образование и развитие плода в сравнении со II формой, и в целом симптомы обеих форм ограничиваются редуцированием листовых пластинок, хлорозом верхушек, наблюдается стерильность цветков;

в) на растениях табака возбудитель II формы вызывает сильную деформацию цветков, тогда как I форма не влияет на нх внешний вид;

г) инкубационный период не зависит от форм возбудителей столбура, но зависит от вида растения-хозяина;

д) наблюдалось различие в реакции видов одного и того же рода пасленовых растений: Lycopersicum (Solanum) escu-lentum, Datura stramonium и Nicotiana tabacum заражаются I и И формами столбура. Однако Solanum lacinatum и Datura arbórea не заражаются ни I, ни II формой столбура, a Nicotiana glauca является бессимптомным хозяином.

III. 2. Влияние различных факторов иа длительность инкубационного периода и иа развитие столбура на томатах

III. 2, 1. Способы передачи

Нами были испытаны следующие способы передачи возбудителей столбура томатов:

I способ — механическое натирание соком; использовали экстракт из листьев и стеблей пораженного растения.

II способ — прививка верхушечных черенков столбурных томатов в расщеп на срез верхушки стебля здорового растения.

III способ — передача инфекции от больЦогО растения ЗД0-1 ровому с помощью повилики (Cuscuta campestris). Семена повилики были посеяны вокруг здоровых и больных столбуром растений. После того, как повилика укрепилась на -растенин-хозяине и имела стебель длиной не менее 15 см, стебли паразита были направлены на новые здоровые растения томатов, выращенные по одному в вазонйх. Таким образом, стебли повилики явились мостиками между стол бурными и здоровыми растениями. |

Т а б л и к а 1

з

Влияние способа передачи на заражение томатов столбуром

Способ передачи Инкубация в днях при температуре воздуха: 1 % заражения i

24—27° С J5-20T

Механический—натирание соком , Прививка.......... Повилика......... 0 28 38 0 32 40 0 100 I 90

Как видно нз таблицы, возбудитель столбура не передается механическим заражением, а передается прививкой^и с помощью повилики. Передача инфекционного начала прививкой является самым наделен им методом, поскольку все подопытные растения заражались таким способом и на них появились симптомы болезни через довольно короткий инкубационный период.

III. 2. 2. Время года (даты прививки)

Длительность инкубационного периода столбура {I форма) и развитие заболевания варьирует в зависимости OTi условий температуры и освещенности. |

У томатов, привитых 27$~72 г., симптомы стали заметными только в последнюю декаду мая—через 118 дней. Значительное удлинение инкубационного периода можно объяснить влиянием невысокой температуры воздуха (16—24°С) и] недостаточной освещенностью. :'■>■■:

На растениях томата, привитых 20/IV—72 г., долго не;про~. являлось никаких симптомов. Это, видимо, было связано^ тем, что температура для развития симптомов столбура была неблагоприятной, так как в жаркое лето 1972 года среднесуточная температура в боксе теплицы в мае в отдельные дни достигала 37—42аС. Возможно, это вызвало частичное подавле-

III. 2.6. Источник инфекции

В качестве источников инфекции для заражения томатов использовали растения многолетнего табака, дурмана и томата. Результаты опыта показывают влияние источника инфекции на развитие болезни, в частности, на длительность инкубационного периода (таблица 3).

Таблица 3

Влияние источника инфекции на инкубационный период стол бур а на томатах

ПрнвоП Подвой Длительность инкубационного периода в днях Температура

Томат Lycopersícum escu-lentum....... Растения томата 28—31

Дурман Datura stramonium Табак многолетний Nicotian а glauca Белuii налив в фазе 3—4 настоящих листьев 35—10 24—28 28 ±2° С

Подобные результаты были получены другими авторамп при изучении переноса возбудителя ведьмнной .метлы картофеля (Ulrychora, Limberk, 1972).

В случае использования привоев от стол бурных томатов для заражения табака и дурмана была получена иная картина. Заражение табака происходит значительно медленнее (в течение 96 дней), чем заражение дурмана, которое наблюдалось через 50 дней.

III. 2. 7. Длительность биологического контакта между микоплазмозной и здоровой тканями, необходимая для заражения

Растения томатов (сорт Белый налив) в фазе 3—4 настоящих листьев инокулировали прививкой столбуром I формы, затем по истечении определенного срока столбурный привой удаляли от подвоя через 12, 24 часа, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12 су-' ток после прививки (таблица 4),

Из таблицы 4 видно, что минимальный срок контакта, необходимый для заражения подвоя, составляет 5 суток, хотя при . этой длительности контакта инфекционного привоя с подвоем инкубационный период длился до 54 дней и процент зараженных растений не превышал двадцати. При длительности био-

Таблица 4

Зависимость величины инкубационного периода | и процента заражения от длительности биологического контакта между микоплазменкои и здоровой тканями томата |

Длительность контакта микоплазменной ткани со здоровым л о двоел (в сутках)

Длительность инкубационного периода в дня х

Число зараженных растений

i % : заражения

Ч

0.5 I

3

5

6

7

8 9

10 I1»

Без удаления привоя

54

54 46 46 42

35 33 32

О О О 4 4 6 10 15

19

20 1 20

логического контакта до 12 дней все подвои заражались стол-буром, 1

Наши данные совпадают с данными Лимберка и Ульрнхо-войв их исследовании передачи возбудителя ведьминых метел картофеля томатам путем прививки (Limberk, Ulrychova, 1973, а). \

Глава IV. ЭЛЕКТРОННОМИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ МИКОПЛАЗМОЗОВ И ПОРАЖЕННОЙ ТКАНИ РАСТЕНИЯ-ХОЗЯИНА

IV. 1, Сравнительное изучение двух методов | фиксации растительных объектов и двух методов заливки

4

Нами были испытаны два метода фиксации: фиксация мар-ганцевокислым калием по методу Люфта {Luft, 1956)?и фиксация по'методу Паладе (Palade, 1950). |

Объектом для фиксации служили центральная жилка н черешок здорового и столбурного растения томата, J

Исследование срезов на электронном микроскопе показало, что срезы материала, фиксированного по методу Люфта, слабоконтрастны. В срезах плохо различимы клеточная оболочка, хлоропласты, митохондрии. При фиксации объекта по методу Паладе подобных недостатков не было. Все наши дальнейшие фиксации растительных объектов проводились} в основном по методу Паладе с некоторыми модификациями.

"I Заливка растительных объектов в метакрилат имеет следующие недостатки: блоки при полимеризации уменьшаются в^объеме на 20%, затвердевание происходит неравномерно, а срезы, полученные с блока, нестабильны под пучком электронов, кроме того, метакрплаты нуждаются в очистке от стабилизатора.

В отличие от метакрнлатов эпоксидные смолы твердеют равномерно н с небольшой усадкой (до 2% объема жидкой ф'азы). Они не требуют дополнительной очистки и ле5Гв^ика их применения проста. Наилучшей средой для заливки препаратов тканей оказалась смесь эпопов, которую мы и использовали в дальнейшей работе.

IV. 2. Локализация микоилазмоподобных телец (МПТ) в различных органах растения-хозянна

^ В подавляющем большинстве случаев ЛАПТ встречались но всех исследованных органах растення, МПТ намн были найде* ■'.. ны в стебле, листе, чашелистике, пролнферирукицей завязи, вТплоде с ребристостью, ненормальной окраской и в прорастающих семенах внутри столбурных плодов томата.

JjB наших исследованиях МПТ обнаруживались во флоэм-

jt тканях, и, в частности, они сосредотачивались в ситовидных элементах. Чаще всего МПТ встречались во флоэмных клетках, лишенных цитоплазматического содержимого. Реже мьГ наблюдали пх во флоэмных клетках, содержащих остатки цитоплазмы с митохондриями, мембраной тонопласта, аппаратом Гольджн и другими клеточными органелламн. В парен-хнмных клетках тканей флоэмы МПТ встречались редко.

|МПТ часто неравномерно распределены по клеткам растения-хозяина н необязательно присутствуют в каждой клетке флоэмы.

|Они не были выявлены п точках роста растений, но обнаруживались в дифференцированных сосудах ниже точки роста. Наши результаты подтверждают данные Коузэн и др., полученные ими нрп изучении точки роста табака, пораженного столбуром (Cousin et al, 1972).

:Нам удалось наблюдать скопление МПТ в области ситовидной пластинки около пор. Очевидно, таким путем возбудитель столбура мигрирует из клеткп в клетку.

;Во флоэмиой ткани завязи и плода томата, зараженного столбуром, мы обнаружили большие скопления микоплазмо-подобных организмов (морфологически они не отличались от тел&найденных в других изученных намн органах растення). Наши наблюдения подтверждают впервые обнаруженное В; А. .Федотлной (1973) наличие МПТ в плодах столбурного томата. МПТ были нами впервые найдены в проводящей ткани прорастающих внутри столбурного плода семян.

Итогом наших исследований явилось изучение ультратон-кпх срезов с разных тканей различных органов растений через неделю после заражения и затем с интервалами 5—8 дней до проявления типичных симптомов столбура.

Мы установили, что наиболее ранний срок обнаружения МПТ в клетках хозяина был равен 5—7 дням до проявления первых признаков заболевания на томатах. Через 15 дней после проявления симптомов в проводящих тканях всех органов столбурного томата можно было обнаружить МПТ.

В таблице 5 обобщены данные о локализации МПТ в органах пораженного столбуром томата, полученные при элек-тронномнкроскопическом исследовании.

Т а б л и ц а 5

Локализация МПТ в тканях различных органов растения томата, пораженного столбуром

Наличие МПТ в различных органах растения:

Ткал» развившихся до заражения развившихся после заражения

8 листовой пластинке в стебле в листовой пластинке в стебле в цветках в плодах

Паренхима — — ■ — — + + ■

Флоэма + ++ ++ +++ -М-+

Ксилема _ — — — — —

МПТ — не обнаружены; 4- — обнаружены редко; -[—|--встречались -

часто; ++Ч--наблюдались в больших количествах,

IV. 3. Морфология и ультраструктура МПТ, обнаруженных в микоплазмозных растениях

Мнкоплазмоподобные тельца, наблюдаемые нами при изучении ультратонких срезов с различных тканей органов микоплазмозных томатов, Табаков, дурмана, клевера, черной смородины, были полиморфны по величине, форме и внутренней структуре. Размер их колебался от 25 до 1000 им в диаметре. На с()езах наблюдались сферические, овальные и округло-продолговатые тельца (табл.6).

Полиморфные тела возбудителен названных микоплазмо-зов растений имеют трехслойную цитоплазм атнческую мембрану, между двумя электронноплотнымн слоями мембраны (толщиной 70—90 Л) располагается более прозрачный слой. Все тельца содержат рибосомоподобные гранулы.

Элементарные тельца имеют более правильную сферическую форму, густо и равномерно заполнены рибосомоподоб-нымп гранулами. Крупные тельца отличались меньшей электронной платностью, а также обладали более днфференциро-

-.меняли реакцию нейтрализации, предложенную Edward и Fitzgerald в 1954 году, а также реакцию агглютинации, Результаты реакций показаны в таблице 7.

.Таблица, 7 Титры антител к M. laidlawii в сыворотках в зависимости от схемы иммунизации

jt Длительность 3 цикла иммунизации 1 Л(без реиммуннэашш) i (в днях) .Vi Реакция нейтрали эацнн Реакции агглютинации

кролика без ре-иммунизации после реимму- ннзашга без ре- нммунн- зашш после ренмму- низашш

5 : so (первая схема) I0S 110 Ш 1 : 32 1:8 1 : 32. 1 : 236 1 : 64 1 : 256 I : 800 1 : 400 1 : 800 I : 1600 1 : 800 1 : 1600

28—30 (вторая схема) 106 106 109 1 : 8 1 : 16 1 : 16 t : 32 1 : 128 1 : 128 1 : 320 1 :320 1 :640 1 ; -100 1 : 1600 1 : 800

3И3 таблицы 7 видно, что при использовании первой схемы иммунизации получены антисыворогкн с несколько более высоким тигром (в среднем на одно разбавление), чем при второй" схеме, но для их получения необходим срок 90 дней, и то время как использование второй схемы дает возможность получить активные антисыворогкн через 28—30 дней, т. е. длительность тммунизацнн сокращается в 3 раза.

.Реим>мунизация через 1 месяц после п оспе дней нммуииза-ции^по первой схеме, как и через 2 недели после последней иммунизации по второй схеме, вызвала повышение титров антител М. laidlawii. Наши даиные подтверждают и результаты. Чумаченко н Смирновой {1974) при изучении ими антисывороток к М. laidlawii н L-форм бактерии.

f

^у. 2. Антигенное родство фитолатогенных мнкоплазм

Ц с сапрофитной мнкоплазмон Mycoplasma laidlawii

Нами было изучено наличие общих антигенных групп у возбудителей ряда желтушных заболеваний растений н сапрофитной мнкоплазмы.

. При изучении антигенного родства были исследованы возбудители следующих заболеваний: стол бур а (I форма) на томате, табаке и дурмане, израстания цветков клевера и махровости черной смородины. Антигены готовились из сока зараженных растений с типичными симптомами заболеваний.

'В опЫте использовалась антйсыворогка; полученная при -первой -схеме иммунизации с реиммуннзацией. Серологические анализы-проводились при ;помощи -метода.кольцепреципита- -цнн, их результаты представлены в таблице 8.

., . Таблица в "

Реакция кольцепреципиташш между антигенами из сока мнкоплазмозных растенкП н антнсыворотной к М. 1аШа\у11

Микоплазмоз " "" и растение-хозяин Тнтр реакции

по антигену по аитнеиворогке

Столбур на томате ■ 1 ; 32 f ■ 1 : 32

Столбур на дурмане . , ' . ; 1 : 1С 1 : 32

Столбур на многолетнем табаке , 1 : 64 1 : 61

Израстание цветков клевера . , , 1 ; 32 1 ; 32

Махровость черной смородины . , t : 16 1 : 32

Из представленных в таблице 8, данных видно, что во всех случаях реакции были положительными. Однако они различались по интенсивности. Наиболее интенсивными были реакции антигена столбурных растений табака Nicotiana glauca (1:64).

Невысокие титры реакций объясняются, вероятно, малой концентрацией возбудителя в соке растений. Наши результаты согласуются с литературными данными (Pozdena, 1954; Gaborjanyi, Bencsics, 1968; Marchoux, et al, 1969; Проценко и др., 1972).

Показанное нами антигенное родство возбудителей желтушных заболеваний растений и М. laidlawii является еще одним доказательством принадлежности нх к микоплазме.

V. 3. Испытание антисывороток, специфичных , к сапрофитной. Mycopl as ma laidlawii, для диагностики J ' микоплазмозов растений

Мы испытали полученные сыворотки в реакциях с соком различных столбурных растений с целью:Определения нх пригодности для диагностики заболеваний. При этом мы использовали капельный метод Лунина — Поповой как самый простой и широкоприменяемый. Реакция производилась между разведенной сывороткой и разведенным соком из томатов, пораженных первой и второй формами столбура. Все изучаемые нами антисыворотки к сапрофитной микоплазме дали положительные реакции с соком больных растений.

При использовании сывороток к сапрофитной микоплазме для серодиагностики стол бур а' не - отмечалось существенной.

зразНицЫ между сыворотками, полученными по первой или по ^второй схемам. В связи с этим можно рекомендовать как бо-Злее приемлемую вторую (короткую) схему иммунизации без реиммунизации.

^ Полученные нами антисьторотки по I и II схемам иммунизации (с ренммунизацпей и без нее) дали одинаковые положительные реакции с соком растений томата, табака и дурмана, пораженных столбуром, черной смородины, пораженных махровостью, клевера, пораженных нзрастацием, одуванчика с нзрастаннем цветков и желтушного подорожника. Следовательно, антисыворотка к М. 1а1(Па\уп пригодна для диагностики указанных мнкоилазмозов растений.

§ V. 4. Поярусный серологический анализ листьев $ столбурного томата на содержание мнкоплазмы 5 возбудителя столбура

Л' С помощью антисыворотки, специфичной к сапрофитной мнкоплазме М. 1а1<11а№11т нами было исследовано распределение микоплазмы в листьях различных ярусов растений томата, искусственно зараженных столбуром. Одновременно анализировались образцы из листьев, находящихся на трех разных уровнях: верхнего, среднего и нижнего ярусов. Лнали-зы|проводились методом Дуннна—Поповой между разведенными сывороткой ■!! соком пораженных растений. !

больном растении мнкоплазма — возбудитель столбура обнаруживался за 10—15 дней до момента появления снмпто-мо^ (мелколистность и хлоротичность верхушки). Распределение антигена в тканях различных ярусов столбурного томата заметно различалось: наиболее высокие титры мнкоплаз-мениого антигена характерны для листьев верхнего и сред-негй* ярусов, а наименьшие — для листьев нижнего яруса. Как|показалн опыты, стареющие, разнившиеся до заражения листЪя содержат МПТ, хотя и не показывают визуальных симптомов болезни. Данные серодиагностики подтверждают результаты электронномикроскопического изучения локализации МПТ п тканях различных органов столбурного томата.

» V. 5. Накопление МПТ-возбудителя столбура

¥ в различных частях больного томата

Нами было проведено изучение динамита накопления М П Т|_в озб у д н те л я столбура в разных частях растения томата, зараженного столбуром. Первый анализ был проделан через 20; дцей после заражения, последующие — через каждые 10 дней до начала гибели растений. Результаты этих наблюден ий| обобщены *в таблице 9.

Верхняя часть зараженного растения, как правило, содер-

: ;ЖИт наиболее в ыс ок ую.к он це нт рацию,МПТ, чем остальные;. • части одного и того же растения.. ---,. ■ ; .

Заболевание растений, столбуром можно определить с-помощью антисыворотки к сапрофитной' микоплазме почти, за -20 дней до появления первых визуальных симптомов на растении-хозяине при аналнзе образцЬв,-взятых от верхних и ■средних ярусов. С самого начала, -цикла развития .болезни верхушка содержит МПТ. в наибольшей концентрации, следовательно, рекомендуется" использование образцов из верхних частей наблюдаемых растений с целью ранней днагностн-■ ки столбура в томатах, В период, когда наступает нзрастание боковых тюбегов! в результате-заражения столбуром, титр МПТ в соке из средних и нижних ярусов резко повышается и становится в 2 раза больше. К концу цикла развития болезни - растенне-хозяин логнбает.а титры МПТ сильно снижаются в соке листьев всех ярусов;

V, 6. Изучение антигенных свойств фнтопатогенных мнкоплазмоподобных организмов -

Антисыворотка к I и II , формам возбудителя столбура томатов была получена по. методу Габорьяни и предложенному нами.

Титры антисьгвороток в реакциях с соком больных растений существенно не различались и были равны 1 : 6-1—1 : 128. Независимо от метода получения антисыооротки реагировали не только с соком столбурных растений, по и с соком здоро-. вых растений, титр этих реакций был несколько ннже (1 :'1б—*

■Мы «сделали"попытку удалить ант1гтела, специфичные к нормальным белкам, -путем осаждения их соком здоровых ра-. стеннй. После полного,удаления антител к белкам здорового растения антисьгворотки перестали реагировать и с соком ■ столбурных ра-стений. Сравнительно'невысокий титр специфн-. ческих антител и их, вероятно, прочная связь с антителами к нормальным белкам растения не позволяют отделить антитела к возбудителю столбура и получить строго специфичную' антисыворотку. "., '-'

Нами установлена принципиальная возможность получения а нти стол бурных сывороток, но способы их -получения необходимо усовершенствовать.

. . ,Выводы

,1. Диагностически ценные реакции пасленовых растений на поражение их микоплазмозом обусловлены двумя формами возбудителя и особенностями зараженных растений. -Вы-, явлены и описаны симптомы. I и II форм столбура на расте-

ниях томата, перца и, табака, позволяющие днфференцнро-звать обе формы, особенно на томатах.

Ш 2. На фоне высокой -восприимчивости к столбуру таких здидов пасленовых, как Datura stramonium и Nicotiana taba-^i cum выделяются полной невосприимчивостью вид Datura íarborea и лекарственное растение Solanum lacinatum. ,J | Для восприимчивого к столбуру вида Nicotiana glauca, .используемого в качестве источника инфекции в экспериментальной работе, характерно бессимптомное течение этого заболевания.

Í 3. Минимальный срок контакта мпкоплазмозного привоя {^зараженным подвоем, необходимый для перехода возбудителя столбура в здоровую ткань, составляет 5 суток. ^ Длительность ннкубацнонного периода примерно одинакова для обеих форм столбура, но различна у разных видов растений; у томатов — 28—32 дня, у перца и у табака (сорт Уайт Берли) —80—90 дней.

^ 4. Среди исследованных шести сортов томатов не выявлено устойчивых к столбуру. Но у американского сорта Моней-Ма-кер инкубационный период примерно на 15 дней больше, чем у^других сортоп, что свидетельствует об относительно большей устойчивости этого сорта к столбуру.

5|5. Электроиномнкроскопический анализ ультратонких срезов позволяет диагностировать мнконлазмоз томатов, черной смородины, клевера. У томатов диагностика заболевания этим методом возможна за 5—7 дней до появления первых симптомов.

6. В меристематическнх тканях стеблей больных растений мпкоплазмоподобшлс тельца (МПТ) не обнаружены. В то же время большие скопления этих телец характерны для верхней трети стебля, Поярусный серологический анализ столбурного томата подтверждает результаты электропномпкроскопиче-ского изучения.

7i МПТ столбура томатов мигрирует из клетки в клетку флоэмы через ситовидные пластинки,

8> Подтверждено впервые обнаруженное В, Л. Федотиной (СССР) наличие МПТ в плодах столбурного томата. Нами впервые найдены АШТ в проводящих тканях семян, прорастающих внутри плода столбурного томата.

МПТ во флоэме черной смородины, пораженной махровостью, отличаются от аналогичных образований в других растениях отсутствием резко выраженного полиморфизма, преобладанием почти правильной круглой формы частиц, однообразием внутренней структуры, отсутствием рибосомонодоб-ных гранул н наличием клубка ДНК-подобных нитей.

10¿ Фитопатогенным микоплазмам — возбудителям столбура пасленовых, махровости черной смородины, нзрастания

цветков клевера и одуванчика,» желтухи подорожника и сапрофитной Mycoplasma laidlawiL— свойственно наличие общих родоспецифичных антигенов. Серологическим анализом МПТ обнаруживались при столбуре томата за 10—15 дней до появления первых симптомов.

11. В результате использования специфических антигенов столбурного томата I и II формы установлена принципиальная возможность получения антистолбурных сывороток. Но ввиду их слабой активности они еще непригодны для практического применения. Поэтому необходимы дальнейшие усовершенствования методов очистки и концентрирования антигенов фитопатогенных микоплазм.

Объем 1'А п. л.

Тираж 150

Заказ 1153.