Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
О-гликозилгидролазы морских беспозвоночных. Свойства и специфичность фукоиданаз, сульфатаз и 1→3- β-D-глюканаз
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "О-гликозилгидролазы морских беспозвоночных. Свойства и специфичность фукоиданаз, сульфатаз и 1→3- β-D-глюканаз"
На правах рукописи
Кусайкин Михаил Игоревич
О-гликозилгидролазы морских беспозвоночных. Свойства и специфичность фукоиданаз, сульфатаз и 1—»З-р-В-глюканаз.
03.00.04 - биохимия
Автореферат диссер1ации на соискание ученой стенени кандидата биологических наук
ВЛАДИВОСТОК 2003
Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного отделения Российской академии наук
Научный руководитель' доктор химических наук
Т Н. Звягинцева
Официальные оппоненты. доктор химических наук
А И. Усов
кандидат биоло! ических наук Н А. Тереньтьева
Ведущая организация. Петербургский институт ядерной фишки РАН,
Санкт-Петербург
Защита диссертации состоится «24» сентября 2003 i.bIO часов на заседании диссертационного совета Д 005 005 01 в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН но адресу: 690022, и Владивосток, проспект 100-лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН Факс. (4232) 314-050, электронная почта: piboc@stl ru
С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100-лет Владивостоку. 159, ТИБОХ ДВО РАН) Автореферат разослан «22» августа 2003 г
Ученый секретарь
диссертационного совета, к х н Г И Прокопенко
РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ! БИБЛИОТЕКА 1
С.Петербург prS
03 300g
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы. Полисахариды бурых водорослей (фукоиданы, ал ьги новые кислоты, ламинараны) разнообразны но своей структуре и биологической активности. Фукоиданы -сульфатированные тсрополиеахариды - проявляют а1тгнкоагуляптное, иммуномодулирующее, противоопухолевое и антивирусное действие и в настоящее время уже прсдлашются как лекарственные средства. Альгинаты широко используются в пищевой промышленности и медицине Они способны связывать и выводить из организма ионы тяжелых металлов. Интерес к I—»3;1-*6-Р-[)-глюканам. к которым относится и ламинаран, связан с их влиянием на системы иммунитета растений и животных. Несмотря на широкую известность ттих полисахаридов, структуры их нолкостыо не установлены Трудности связаны с тем, что содержание и структурные характеристики полисахаридов зависят не только от вида водоросли, но и от сезона сбора, возраста и т.л
Важными инструменгами в структурных исследованиях полисахаридов служат фермойы (О-гликозилгидролазы, сульфатазы) с установленной специфичное!ыо и механизмом действия Большой интерес предсзаиляст ферментативная фансформация полисахаридов, позволяющая иолучль новые прспараш с более высокой биологической активностью
Морские беспозвоночные, представленные большим количеством таксонов. Находящихся на различных ступенях эволюции и отличающихся друг от друга способом питания и обраюм жизни, являются богатыми й сравнительно доступными источниками различных Очликшилгидролаз Некоторые виды морских беспозвоночных служат объектами марикультуры О-Гликошлгидролазы чаще всего содержатся в пищеварительных трактах морских живожых. которые попадают в отходы при их' промышленной переработке
Исходя из вышесказанное. преде! авляютея актуальными систематические исследования распространения в морских беспозвоночных ферментов, принимающих участие в деградации полисахаридов, разработка методов выделения индивидуальных ферментов; изучение их свойств, специфичности, механи зма действия и возможности их применения в структурных исследованиях углеводов и для получения новых биологически активных веществ
Цель и задачи исследования. Целью работы является получение высокоочнщепных ферментов, катализирующих фансформацию полисахаридов бурых водорослей (фукоидана и ламинараиа).' установление их специфичное!и и механизма действия
Для достижения згой цели были поставлены следующие задач и-
1. Изучение распространения фукоиданаз, а-Ь-фукозида.1 и других гликозидаз в морских беспозвоночных Японского моря.
2. Выбор объекта для выделения индивидуальных ферментов.
3. Разработка методов выделения фукоиданазы, а-Ь-фукозидазы. сульфатазы, I—»3-Р-П-»люканазы из тыюпанкрсаса I. кнп!а
4 Исследование топав, специфичное! и, мша действия и возможности применения выделенных ферменюв.
5. Сравнение свойств и типа действия 1—»З-р-О-пноканаз из яйцеклеток морского ежа Strongyhcentrotus intermedins с 1 —O-fï-D-глкжаназамн морского и наземного моллюсков
Положения, выносимые на защиту.
1. Фукоиданаза широко распространена в морских беспозвоночных. Уровень се активности значительно ниже других 0-гликозилгидролаз. ,
2. Фукоиданаза из гслатопанкреаса L kurila катализирует расщепление I—»3 - 0-гликозидных связей в молекуле фукоидана с образованием Ьульфатированных олигосахйрндов и фукозы.
3 Сульфатаза из L. kuriia не действует на природный фукоидан, сульфата рованные полиоксистеронды и фукозу, но катализирует десульфатирование ксилозы, входящей в состав гликозидов голостанового ряда.
4 Это- \ —»З-^-О-глюканаза из неоплодсггворсниых яйцеклеток морского ежа S intermedius имеет необычные для экзо-фермента свойства осуществляет гидролиз ламинарана с сохранением конфигурации расщепляемой связи, действует на модифицированные субстраты и обладает трансгликозилирующеи активностью
Научная новизна и практическая значимость работы. Изучено распространение фукоиданаз среди морских беспозвоночных Японского моря Впервые из гепатопанкреаса морского брюхоногого моллюска L kurila выделены фукоиданаза. a-L-фукозидаза, сульфатаза, 1—>3-р-0-глкжаназа Определены физико-химические свойства ферментов. Установлена структура продуктов ферментативной трансформации фукоидана из Fucus evanescens, что позволило сделать вывод о специфичности фукоиданазы Впервые показано, что сульфагаза катализирует специфичное десульфатирование гликозидов голостанового ряда, что дает возможность применять се для получения новых веществ
Апробация работы. Результаты работы были доложены на'
« Дальневосточной региональной конференции молодых ученых «Проблемы экологии и
природолользовния Дальнего востока», г. Владивосток, 1998.
• 2-м Международном симпозиуме «Химия и химическое образование», г. Владивосток, 2000
• 10-th International Symposium on Marine Natural Products, Nago. Okinawa. 200!.
С XVI International symposium on glucoconjugates, The Hague, The Netherlands, 2001.
Публикации. По материалам исследования опубликовано 7 научных работ.
Структура н объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов н списка цитируемой литературы. Список литературы включает 138 публикаций Диссертация итожена на сгр машинописного текста, содержит 24 таблицы и 27 рисунков
Работа выполнена в лаборатории химии ферментов ТИЬОХ ДВО РАН
Содержание работы 1. Рас1ф0с1рансннс некоторых 0-1 ликолин идрола} в морских беспозвоночных
В лаборагории химии ферментов ТИБОХ в учение ряда лот проводя гея сиаемашческне исследования но распроефапсишо ферментв уиюводною обмена в морских орган и шах, обииющнх как в есвеоиых, гак и в фонических водах Мировою Оксана Мокаыпо, <по в ннщеварщельных органах морских бостивоночных, различающихся способом мигания и иинмающих рлные жолошчсскис ниши, со юржаия активные Оч никоими идролаш I—>3-Р-П-|люкана ил. алы нна »ы, целлюлаиа. хнппшы В жстракчо тшгошшкреаса брюхоноюю моллюска Ъшоипа . паря чу с друшми карбо! «драмами ранее было отмочено ирисугсгвнс фукоидан Iидрола(фуконданаш) В настоящее время вофое интерес к ним ферментам, которые являются важными ииструмешами для изучения сфуктурных особенностей и биологической активности фукоидана
С целью поиска источников активных фукоидана! и иткождл (олиюсахаридч идрола0 было исследовано расирооранение пих фермой ган в 61 виде морских бестнвоиочиых. шносящихся к 6 итам
Для поиска фукоидана^ были иснолыованы еубегра« ы, сфуюурные характеристики. коюрых приведены в 1абд. I. При поиске Iл и ко гида* иснодиювали еитчмичеокие субсчрагы - «-нкфофеннлшые производные еооIвечечвующих Сахаров.
Таблица I
Структурные характеристики фукоиданов
Источник Содержание у1 леводов. % 01 (.ухой М.1ССЫ Молекулярная масса. кДа Моиосаха- ридш.ш состав. % РисБС^ . моль/моль 11К(Я04 ) Ушах.
1лтптн ш с /с Иогюик'Ч 30 20-4« Рис-90,С.а|-1,2. Ху1-2,Х, (¡1с-6 1:1.7 842 Х20
Гш и\ с'уат'и епк 2Н 60-65 Рис-81.С1а1-4. Ху1-2 И1с-3, Мап - 2, Мл-Х 1 0.8 820
Речулылы женеримста показали (габл 2), что фукоидана«ы ммеююя практически у всех живошыч Однако большинство ш них обладало слабой акшвиосшо, и юлько моллюски, а 1аюке пскогорыс нредс1ави1сли шлокожнх {Ьс1ишнаи/шт сочками. Л^Ыи/юрт нцюпинь) и ракообратич (Ва1апи\ ю\(1а1ит) обладали юмспгои акчивиоешо (100 сч/мг белка и более) сопоставимой с акт вносило фукоидана» и < дру| их практически важных источников X а раю ер распределения фу коп чана I и I лнко шча \ и пищеварительных орииих морских бссношоночных был анало! ичен полученному нами ранее для дру> их О-I лико1ил1 идрола<а исключением одной особенности Гели для дру| их 0-1 лнко лип идрола5(ламннарина I, иеллюла к хигина» и др.) уровень амивности их в кристаллических сюбсльках моллюсков был в 10-1000 ра; выше, чем в юплоианкреаее. ю для фукондана) и гликоникм такой ыинсимосш не наблю юл ось
Таблица 2
Активность фуконданаз н гликозидаз в экстрактах морских беспозвоночных
ТИП, Класс, Вид*. Фуконданазная активность * Гликозидазная активность"
s, S, p-Np-GIc p-Np-Gal /J-N'p-Мап ¿^Np-lñic
COELENTERATA Anlhozoa Metridium sp. Все II о 10 180 240 610 +
Actinia sp. П.т. 43 и о. 162 278 290 II 0
Cmdopuluí japomcus Вес 19 н о 141 516 557 н о
AnlhopJeura orientalis Все 27 II о 103 239 116 11 о.
Ttalui felhna Все 38 и.о 122 313 1450 II О
ANNELIDA Sipunculidea Phvscosoma japónica Все 0 60 0 0 0 +
Pol ¡chacta Pafynoidae Все 0 II о 71 91 135 II О
Sabeltdae* Все 80 н о 46 290 321 II о
Tubulamus punc talus Все 28 II о. 71 159 106 II (1
Chaetoplerus cautus Все 235 II О 2044 3268 647 II О
Eudistvhai polymorpha (Btspira) Все 117 н о 690 495 204 II о
Sipuncuhda phascoiosoma* Все 80 Н О 316 888 395 II О.
NEMERTINI Nemerlmi Collarenemertes htmatulaia Хобот 105 но 0 524 0 II1)
ARTHROPODA Crustacea Baionm rostratas Все м.о 190 760 760 520 +
Pugurus ьр Все 10 0 4050 770 190 -
Panda!ич hvpsiuotus г.п 0 II 0 278 1564 222 II 0.
Pagurus bermganus Все 32 II О 0 0 428 II о.
Chtohoet etes opiho-ebngatus г.п 0 II о 690 1525 313 II О
Cancer amphioetus г п 10 50 3170 1290 580 +++
Hemigrapsus sanguineus Г II . 10 70 2180 570 230 +
MOLLUSCA Lo rica ta Lepulozona abberatm I.II. 0 0 2680 2060 210 +
Monoplacophora Onchuhopsis sp I II 86 II о 296 919 140 н о.
Tntia tratercula I л 0 II о. 982 lili 1174 II 0
Piici/испч plica tus г п. 7 н о. 766 201 126 II о
Neptúnea hulbacca 1 If 2 м о 0 1292 0 II о
Neptúnea /\rafa 1 II 0 но 0 0 0 II о
A\tarie harealis ( к 33 II о 402 39(1 139 II о
Lusswvolutopbws sp 1 II. 18 н о 383 623 322 II о
Gastropoda l.ottia sop Все 10 2(1 1160 1160 820 ++
f.iiioi ma brevu ula (.и II о II о 2410 2260 800 +++
Littorma squah da i п 30 40 42(H) 2290 670 -Ы-+
l.iflonmi hitrtla г 11 и о 10 16X0 1160 1160 +
Ai »uu'd pallida Все 0 30 520 916 520
Nuс ella < hevseana i н II) 50 170 17(1 70 +
tilvalvia Cru\sowea gigas i п 40 1 240 1060 1060 220 +
тип. Класс. Фуконланазная активность Гликшида-шая активность
Вид" S, S, />-Np-Glc /J-Np-Ual /j-Np-Man />-N р-1 (к:
Crcmtmyliliis Xravamr, I 11. 240 200 240 350 470 +
Gh'tvmens vewaens/s Г II II 60 13X0 2530 470 +
Cvctoc ai dta i /ahwinac [ II. и 0 41 10« 2X5 26 II о
Modiolus tlti'fii iht\ Kp L. и 0 14 67 7Х 14 II о
Sfmula \iiilwlitit'ti\i\ 1 .11. 20 100 1430 1440 650 +-Н-
кр С 3(1 5(1 3(1 10 30 _
Mac tra chniLusi\ i.ll. II 5(1 960 1 160 340 +4
кр С II 0 10 20 21) 20 II О
Merttliarta Altntpwni I.ll. 20 по 350 208(1 1040 ++
кр с н о 10 70 40 40 II О
Paonidia wnulma 1 II кр с. 260 н о 240 1(1 62(1 2140 46(1 ++ 11 о
Pammpci len wt.MieiTiis I II 1(1 5(1 660 1770 550 -н-
кр С. 10 20 30 10 10 и о
FCHINODCRMATA Ophium»dca Ofthitiia \ui ч/ Пт. II н 0 0 141S 0 II о
Hulolhuroidca Гnprnhit hl fi wutali n Всс 20 20 0 0 II ++
Apatit hnpn\ Ja/wnu u\ LU пш1и\ В(.С м о 40 Х40 310 1640
Echinoidca SfmftgyltK etitrollis muht* П г 20 30 2740 740 550
Sil ongyltK enlrotm intermedia ч 11.1. () Ы1 1710 К40 5 КО
Sil ongylot entrot m palhdtt\ П г 31 но 1X65 758 256 II о
Scaphethinm ni'nahtlr* П.т 20 20 3X20 1240 1240
SttipItethmtH gl ней1, II I 20 60 6500 3200 III«)
Eihintnaulium itiiilalinit II 1. 630 (1 114(1 340 740
Aslcmidca Ulciltn anmicim\ П г 0 70 НО 240 240 +
Lefito\tei tus autica II 1 144 н о 53Х 3X7 232 11 о
l.v\a\lio\uma (ituho\lu hi П г 0 40 710 71(1 710
Polti in />c( lim/t'i а II г 10 20 1260 360 1260 +
Di\ntlti\U'iia\ ahxim\ Пт 154 н о. * 644 3X6 27(1 II о
Dntoliistei ta\ трап II 1. II о 2(1 8X0 760 37(1 +
Нет i и ш \p П 1 17 II 0 517 444 304 II о
Crmodca П г 42 п о 36Х 261 306 и о
l IIORDATA Ascldiac ßt>inllll\ llthciUlll\ Вес 1(1 50 II 0 0 +
Примечания Iii.- uHiucujpmcjiunuH тракч. i u - ivnaioitaiiKpcjc. кре - крип аллпчес кии ci сое чек. S, -
фук'он'шн н< L iufu)iiimic\% - фукой'Uli ih h e\anc\n'n\. /»-Np-Glc - и-нигрофемнл-р-!)-! люкоииратин l.
p-Np-Gal - w-нитрофснил -{i-D-галактопнранозид, /j-Np-Мап - и-нитрофенил-а-О-маннопиранозид, /т-Np-Fuc - я-нитрофенил-а-Ь-фукопиранозид, «-» - нет активности,«+» - гидролиз субстрата менее, чем 50%, «++» - гидролиз 50-100%, «+-ь+» -100% гидролиз субстрата, «н о »- не определйп.
'Выловлен способом драгирования
''удельную активность гликаиаз выражали как количество фермента, образующего 1нмоль злюкозы за I ч на мг белка. Содержание белка определяли методом Лоури (Lowry et al. 1951)
удельную активность гликозидаз выражали как количество фермента, образующего 1 нмоль п-нитрофенола за I ч на мг белка.
Mhoihc экстракты с различной эффективностью катализировали расщсплснис фукоиданов из L achorioides и F. evanescent Экстракты большинства исследованных видов хуже гидролизовали фукоидан из L cichorioides. Исключение составляли экстракты гепатопанкреаса моллюсков Crenomvtifvs gtavanus и Peromelia vemdosa, которые обнаружили практически одинаковую способность гидролизовль фукоидаиы из L achorioides и F. evanescent, а также экстракт из пищеварительных органов морскою ежа Echtnocatdium corJatum, iидролнэующкй только фукоидан из L achorioides Различное действие экстрактов морских беспозвоночных на 2 образца фукоидана, вероятно, связано со специфичностью ферментов к некоторым элементам структуры субстратов (табл. I )* например, к 11смени сульфатирования фукоиданов и различному положению сульфажых групп Созласно резулыагам анализа (табл. I) соотношение Fuc S04* для фукоидана из L achorioides составляет 1: 1,7, а для фукоидана из F. evanescens 1:0,8. Следова гсльно, можно предположить, что фукоидана зы большинства исследованных морских беспозвоночных обладают специфичностью к низкосульфатированному фукоидану из F evanescens и только фермент из Е cordalum специфичен к высокосульфатироваиному фукоидану из L. achorioides- Фукоиданазы из С gravanus и Р vemdosa, по-видимому, не обладают чувств ительноаъю к данному структурному элсмегиу. Кроме то» о, различная активность некоторых ферментов но отношению к фукоиданам из L achorioides и F evanescens может быть обусловлена разным типом глнкозидных связей между остатками фукозы в молекулах полисахаридов
Показано, что из 4 исследованных гликозидаз (p-D-i люкозидаза. p-D-галактоэидаза, а-Р-манно^идаза, a-L-фукозидаза) наиболее распространены в морских беспо топочных глюкозидазы, наименее -маннозидазы. Высокая активность практически всех исследованных гликозидаз обнаружена в гснатопанкрсасс брюхоногих моллюсков рода Littonna. двустворчатого моллюска S. sachalmensis и краба Cancer amphioelm.
Мы провели нолуколичссгвснную оценку содержания активности a-L-фукозидазы в жстрактач Результаты исследовании показали, что экстракты 25 видов из 33 проанализированных способны катализировать расщепление л-нитрофсннл-а-Ь-фукопиранозида Экстракты четырех видов моллюсков (I. brevicula. I squall da. Acmea pallida. S sachahnensis) и краба С amphioeius обладали высокой активностью Однако, присутствие в экстрактах активной a-L-фукозидазы не увеличивало и\ способность тдролиюнагь фукоиданы Интересно отмстить, что в экстрактах ииюкожич (ГсЬнюк1еа) при практическом отсутешии активности a-L фукозидаш отмечен высокий уровень дру( их i лико гида з (f3-D-i л ¡око зида зы, P-D-галакто зида зы и a-D-маинозндазы)
Не исключено, что значения ферментативной акт и внос) и, полученные для морских звезд. Moiyr fiuib несколько занижены, гак как в жчпрактах их пищеварительной системы paiiee обнаружены активные проIсазы Несмотря на это. высокая фукоиданазная активность была обнаружена у звезды DisolasWrias ahgaivi.
Таким образом, результаты проведем пот поиска показали, что фукоидапазы и гликозидазы различной специфичности широко представлены в морских беспозвоночных Необходимо отметить, что активность фукоиданаз в этих же источниках в 100-1000 раз меньше активности ламинариназ - фермапов. трансформирующих другой полисахарид бурых водорослей - ламинараи. 1 1редстави гели Mollusca. Echtnoidca и Arthropoda Японскою моря, у коюрых аю нвиоеп» фукондаиаз наиболее высокая среди исследованных видов, мосут являться обьекчами для выделения и доилыют и {учения <|)ермси10в. расщепляющих фу кон даны.
2. Выделение и характеристика О-глнкозилгидролаз морского брюхоиогого моллюска
Littorina kurila
В качество объект >я выделения фукондан-дефадирующнх фермешов был выбран брюхоношн моллюск L kurila. iycio населяющий прибрежную зону, выдерживающий длительную фаиеноржровку в морской воде Исследование еоаава и уровня активности различных О-ишконшидролаз генатонлнкрсаса L. kimla показало (ыбл. 3), чю в жаракче присутствуют высокоактивные ижкозидазы {(^-Очинактошдаза, u-D-манно зила w. ß-D-i люко зида w, u-L-фуко зила за), сульфа i a ja и i лкжана$ы (I —O-ß-D-i люка na за, амилаза, цоллюлаза) Однако, активность фукоидаиазы была более чем на порядок ниже активности друшх ферментов, гндролизующих полисахариды
Таблица 3
О-Гликозтиидролал»! lenaroiiaiiKpeaca L kurila
Фермент Субсфа г Удельная акшвиосчь. нмоль/м! белка
Фукой 'цша за фу кои да и из Г сгапсчст 71
1 —»З-ß-D-i люкана за л а м и 1 зари н из Л с к Inn н>и ics 3571
Амилаза амилоиектин 1130
1 (еллзола ia КМ-целлюлоза 1555
Агараза агар (галакто! ликан) 123
Пустуланаза 1—*6-0-О-гл»окан 152
ß-D-Галактозида (а п-пигрофенил-Р-П-галактониранозид 1113
ß-D-Глюкозида за я-ии фофеннл-Э-О-глюкоинраио зид 1140
a-D-Маннозида за и-нитрофсиил-а-О-маннопир^зюзид 344
a-L-Фуко зида за «-ни 1ро<|>еннл-а-Ь-фукониранозид 437
Сульфа та за /7-нн 1тнк|>сиил-суль<|»а i 1200
2.1. Фукоиданаза 2.1.1. Выделение и физико-химические свойства
Для иочбора условий очистки ферментов, способных участвовать в дофачацнн фукондана (фуконч<1нла. (x-L-<|>yKOHUUit) и сульфатаи), нами был нсиольюван большой набор кагионо- и апнонообмениых носи гелей (SP-сефачеке. ПГАП-сефадскс, СМ-иеллюло»а. ПГАГ-пеллюло их. ОГДГ-Toyopearl, DFAr.-еефароза. феннл-сефаро ш) Следует отмстить, чю фукондана и не зачеркивалась ни на одном m них сорбепюв На рис. I приведена разработанная нами посчочоваюльткль процедур ра полепи я и очна ни фукоидаиазы. a-L-фукозичазы и сульфа (азы
Днапп
Хроматография >« ДЭЛО-иеллютоэс
Рсхромаго» рафия »в Л МЗ-оеллникче
УчМр.»[»И 1ьтр<ни>я Н-1 мембргик. РМ-10
Хроч<погри|»я ш лфакрнлс V
Экстракт
С^Л1»фатиос гсажлсги*..
I цпрчфобмл хромлщрафи* па фепил-(.сфарою
Хроматография П11
Хроматография на SP сефадсм-е
Рсхромагогряфия ш ЧР и фомке
Утьтрафи.илрапия »и мембране РМ-10 _
Хрйчэтография на и:факр»1ЛеЬ-3<Х)
Фук>идвшаи
Сум*Фа|а
Рис.1 Схема разделения некоторых ферментов гепатопанкреаса £ кип1а
Такая схема позволила отделить фукоиданазу от других ферментов, которые могут принимать участие в трансформации фукоидана В большинстве других исследований, посвященных ферментам, деградирующим фукондан, использовались частично очищенные ферменты. Разделить фукоиданазу, а-Ь-фукозидазу и сульфатазу из генатопанкреаса РаНпорес/еп удалось японским исследователям
18
Рис. 2. рН-оптимум фукоиданазы.
При определении оптимума рН для действия фукоиданазы были получены 2 ярко выраженных пика с максимумами в области 5,4 и 8,5 (рис. 2), что позволяет предполагать присутствие двух форм 'ггот фермента Следует отметить, что ошимальные значения рН для большинства исследованных ранее ферментов, гидролнзукнцих фукоидан, лежат в кислой, слабо кислой или нейтральной областях Фукоиданазы со значениями рН-онтимума 9-10 были обнаружены только в бактерии ЫатЬтН'пшч.
Зависимость активности двух форм фукондана! ог концетрацин №С1 представлена на рис. 3. Показано, что кислая фукоидл1аза имеет солевой онгнмум (около 0.2 М №С1), в то время как щелочная форма фукоиданазы с повышением концентрации №С1 теряет активность.
" „'„ ' „', ' ^' ^ ' 20 30 40 50 80 70
Рис. 4 Темпера гурная стабильность Рис 3 Влияние №С1 на активное! ь двух форм фу ко и дама* I. кии1а 1 - при рИ 5,4 (0.05 М
фукоиданаз из Д кш,к, сукцинлиыи буфер с 0.2 М ЫаС!), 2 - при
рН 8.5 ((»,05 М боратиый буфер) Выделенная нами фукоиданаза нолноезью геряс! свою акпншоезь в рааворс 0.05 М сукцинашено буфера рН 5,4 при +4°С в течение недели Выло замечено, что стабильность ферменга повыпыется при добавлении ЫаС1' при оптимальной концентрации N¿0 0.2 М потерн активности ие наблюдаюсь н |сченнс месяца
На рис. 4 показано влияние температуры на активности ферментов Обе формы фукоидан» зм устойчивы до 50°С.
2.1.2. Специфичность действия фукоидан аз
Для исследования специфичности фукой taxai в качестве субстрлов были использованы фукондапы. выделенные нами из бурых водорослей F е\апе\сеп\ и L си(юиоикs. имеющие различную cipyiaypy. Фракция фукондана из F. счancsccns состояла нз Кис (95%), Ху1 (2,8%), Мап (0.2%), («1с (2%). молярное соопшшснис fue S()4: соответствовало 1 0,8. В результате мезнлировиния десульфагнровашюн фракции тюго фукондана были получены ацетаты 2.3.4-грн-0-ме1ил- : 2J-'Ui-C)-wcnui-. 2.4-дн-О-метил : 2-О-ме)нл : 3 и 4-О-метнлфу китов в сооmontant и 23 IL"W1)-.IK. Таким «(»разом, в фукой чане из Г. ftatn'\<. ci¡\, ник>льзусмом в качестве суборла, количество I—>3-связлнюн фукозы было и 3.5 рай больше, чем 1 —>4 СлсЧуст отметить наличие в обрате фукондана большого количества монометнлнрованнмх и сполна метилированных остатков Сахаров* что ми жег быть сяя uno с частичным десульфа троками ем и метилированием. Похожие данные были получены лрушми а шорами для фуконцаиов. выделенных нз различных образнов водорослей
Но структурным характеристикам исследуемая нами фракция фукондана заменю оинпалась oí шибанной ранее, выделенной из бурой вочороелн Г емтенст и представляла собой лпнснным полимер, сос-гоящин из чередующихся I—и I —»4-.связанных осыжов фукозы. сульфа тированных в основном но
С2 и частично ацетил ирояанных по оставшимся свободными гидроксильным группам. Фукоидан из I,. асИопоикз значительно отличался от фукоидана из Р еуапезсею и по данным исследования дссульфатированного и метилированного образца представлял собой почти полностью сульфатнрованный 1-*3-а-Ь-фукан.
Нами были исследованы продукты исчерпывающих» гидролиза фукоиданов из Г еуапе\сеп\ и I, с1сИогю'н1еч двумя формами фукоиданаз - кислой (рН 5,4) и щелочной (рН 8.5) Максимальная степень зидролиза фукоидана из V егапечсет была достигнута щелочной фукоиданазой (но выходу восстанавливающих Сахаров) и составляла 45% Пример полной схемы разделения продуктов ферментативного гидролиза фукоидана приведен на рис 5
Рис. 5. Схема разделения продуктов трансформации фукоидана и? F evanescens фукоиданазой, pH 8.5. Выход продуктов определялся фспол-сернокисЛотным метолом. ВМФ - 'высокомолекулярная фракция (л>12). НМФ - низкомолекулярная фракция (олигосахариды 12>м>2. фукоза) Р-1 - высокомолекулярная фракция «>12. Р-2 - оли! осахариды 12>/?>2, Р-3 -три-. дисахариды, фу коза
С помощью автоматического ЖНДКОСПЮ1 о анализатора проведен анализ низкомолекулярной фракции (НМФ) продуктов
исчерпывающе! о гидролиза фукоиданазой на фукоидана из /\ ех'апемепч при рН 5,4 НМФ получена после осаждения высоко-
молекулярных фра! мен юв (ВМФ) фукоидана 80%-ным водным спиртом. Рсзулы-агы хроматографии показали (рис 6а), что в качестве продуктов образуется смесь олиюсахаридов и мономера Моносахарид идет ифицирован как
фукоза методом ВЭЖХ
Хроматографи чески й анализ показал, чю при рН 8.5 меняется состав продую о в действия фукоиданаш на фукоидан из ^ етпеъсепя но сравнению с полученными при рН 5.4 (рис 6а. б) Увеличивается доля моносахарида в инкубационной смеси, доля ли сахарила значительно уменьшается, а продукты со степенью полимеризации в интервале 5-10 отсутствуют. Распределение продуктов, полученных после действия фукоиданазы в аналошчных условиях на фукоидан из I с/с/к«юп/е\, имеет другон харамер (рис. 6в) Анализ продуктов, полученных иод действием кислой формы фукоиданазы. показал, чю при расщеплении фукоидана из £ си Иогюн1е\ образуется в три раза меньше НМФ, чем при мшролнзе фукоидана из /•* е\'апе\сем (табл 4) Этот факт указывает на то. что в ни зкосульфа тированном фу кон чане из Г. е\'(шечеп\ для фукоиданазы с рН-оптимумом 5.4 иместся большее количество доступных лля I идролнза связей При расщеплении фукоидана из Р. е\апе\сепч щелочной формой фукоичаназы выход НМФ оказался ь три раза выше, чем при действии кислой формы фукоиданазы (табл. 4)
О 0 0
Рис. 6. Гель-фильтрация на биогсле Р-2 (автоматический жидкостной аналньпор Jeol-JLC-6ДН) низкомолскулярной фракции продуктов «идролим фукоидаиа Ht F cw/wsî (а) н /. athonouiet (в) фукоидаиа н>й при рН 5.4, продуктов пиролиза фукоидаиа мi F evanestens фукоиданазой при pli 8,4 (6) M - мономер, О - олнюсахариды со степенью полимеризации п > 2
Таблица 4
Характеристика продуктов фермеи га i hbhoi о i ил релиза фу кон да пав
Фермент, рН-онтимум Субегра г Выход продукте реакции, %
ВМФ" НМФ"
Фукоидаиа w, рН 5,4 фукоидан из F суапе\сепч 85 15
фукоидан из L cichoriouies 95 5
Фукоидаиа за. рН 8,4 фукоидан hi F evtHwuem 55 45
ВМФ • высокомолекулярная фракция (п > (2)
"НМФ -низкомолекулярная фракция (олш осахариды 12>я>2. фу ко ia)
Дня детальною и лучения структуры продуктов ферментативной трансформации фукоидаиа Нами была выбрана НМФ, полученная под действием щелочном фукоидаиа «ы Такой выбор был обусловлен высоким выходом НМФ, который составлял 45% or количества фукоидаиа. введенною в реакцию Была разработана схема разделения продуктов ферментативного расщепления фукоидаиа (рис. 5) Установлены характерhciнки фракции продуктов Р-1.1, образу ющейся под дейспшем щелочной фукоидаиа)ы из L kurihi (рис. 5) В обрашс после полною кислотою ¡идролим меюдом ВЭЖХ идешифицированы hue (92%). Xyl (1.8%). Man (3,7%) Glc (2.5%) Молярное соотношение Fuc • S04: составило I 0.59. Сольволитичеекое десульфатироваиие с последующим метилированием, I идролиюм и ацетил и рованисм оюй фракции дало соотношение ацегакш 2.3,4-грн-О-метнл-. 2,3-ди-О-мстнл- : 2.4-ди-О-метил 2-О-метил : 3 и 4-0-мегилфуцнтов == 10 41.31:11.7. Из пих данных следует, что в Р-1 I количество образующегося 2.3-ди-О-метилфуцнта на 27% больше по сравнению с исходным фуконданоч. ')ю п>ворпг об увеличении в продуктах доли 1-»4- свя миной фукозы Верояшо, деист вшо (|>ермен ia подвергшиеся 1-*3-О-ишкоиздные связи Результаты метилирования согласуются с данными ПС-ЯМР спектроскопии В ПС-ЯМР - cncKipe десульфашровантм о Р-1.1 наблюдались более ннгснснвнис с»н налы при 97.3 мл (CI). 67.S мл (С2). 76.6 м ч (СЗ), 69.Х мл (С*4), 67.7 мд (С5), инивстетвующие фрлмешу ->3)-a-L-Fuc/J-(l^. но сравнению с сш налами в облает 96.5 м д (СП, 69,1 м д (С2). 70.2 м д (СЗ). 81.1 мл К'4), 6Х,8 м д (( 5). характерными для фра« мета -*4)-a-L-Kue/>-(l--» Кроме тт. в спектре имелись сш иалы, икпвсгсшунпинс фрагменгу-+3)-a-L-huc/M4~> • 101.5 м ч (С1). 6Ммл (С2>. 77.2 мд (СЗ). 70.2 мл (С4). 67,7 м д (С5).
Следовательно, в Р-1Л присутствуют фрагменты с разветвлениями по С4, которые не были обнаружены при исследовании фукоидана из Р. еуапезсеги химическими методами.
По всей видимости, щелочная фукоиданаза из морского моллюска Ь. кип!а катализирует расщепление преимущественно а-1->3-связи между остатками фукозы в молекуле полисахарида. Таким образом, нами впервые сделана попытка определить тип расщепляемой фукоиданазой О-гликоэидной связи
2.1Л. Функциональные группы фукоиданаз, участвующие в трансформации субстрата
С целью идентификации функциональных п>упп, ответственных за активность фукоиданаз, исследовалось действие групп-специфических реагентов, модифицирующих определенные аминокислоты в молекулах белков. Результаты представлены в табл 5 Известно, что Н-бромсукцинимид специфично окисляет остатки триптофана в кислой среде Другие реагенты также взаимодействуют с функциональными группами аминокислот в слабо кислой или нейтральной области рН. Поэтому достаточно достоверные результаты могут быть получены только по отношению к кислой форме фукоиданазы Ы-Бромеукцинимид понижал активность фермента па 63%, что позволяет предположить важную роль остатков триптофана для каталитической активности фукоиданазы. Возможно участие в катализе карбоксильных 1рупп, так как растворимый карбодиимид (даже в отсутствие нуклеофильного компонента) снижал активность ферменга на 16%.
Таблица 5
Влияние групн-специфических реагентов на астивноегь кислой фукоиданазы
Реагент Концентрация реагента, М Модифицируемый остаток Оруппа) Активность, %
М-Бромсукцинимид 102 Тгр 37
Л-Г>тилмалеимнд 10! SH 120
л-Хлормеркурибензоат Ю-3 SH 97
1-Этил-3-(3- диметиламннопропил- карбодиимид) 10° -СООН • 84
Ацетил имкдаэдл I0J Туг, His 9Х
Диэтшширокарбонат 10- His 9Х
3.2.2. а-Ь-Фукошдаэа
При изучении энзиматической деградации фукоидана японскими исследователями были обнаружены два типа а-1~-фукозидаз В гепато панкреасе морского моллюска Р. уемоепз >з содержалось два фермента с различной специфичностью I - а-Ь-фукоэндаза. которая гидролизует только л-ии грофснил-а-Ь-фукозид, но не фукоидан, 2- фермент, который кроме синтетического субстрата медленно гидролизует фукоидан с образованием фукозы, подобно а-Ь-фукозидазе из Г охузратт
В экстракте гспатопанкрсаса Ь кш ¡1а нами была обнаружена а-Ь-фукозндаза, г идролизующая п-нитрофсннл-а-Ь-фукониранозид Фермент имел рН-оптимум 6,4, Кт = 16 ± 0,1 мкмоль Он не действовал на природный фукоидан, следовательно, являлся ферментом I типа а-1_-Фукозидаза не обладала трансгликозилнрующей способностью* методом ВЭЖХ в продуктах реакции не были обнаружены п-лнтрофеннл-фукоолш ознды как при действии фермента на н-нитрофснил-а-Ь-фукипиранопи, гак н на п-шпрофенил-а-Ь-фукопиранозид в присутствии фукоидана
Для выяснения роли функциональных групп молекулы a-L-фукозидазы в процессе катализа был использован метод иигибиториого анализа. Полная потеря активности наблюдалась при действии N-бромсукциннмида - реагента на триптофан. Можно сделать предположение, что в молекуле a-L-фукозидазы имеется остаток триптофана, принимающий участие в связывании субстрата. Изменения активности в присутствии других реагентов были менее значительным« Всроязио, п молекуле фермеша отсутствует свободная S И- зрунна. существенная для каталитической активное! и. Хозтз активность фермойга понижалась на 30% при действии N-этил мало нмнда, в нрнсузствии л-хлормеркурибеп зоа та, также взаимодействующего с SH-груннами, активность даже возрастала. Coi ласпо полученным данным, нельзя исключи*] ь также участие в катализе гаких остатков как з hci идин и дикарбоновыс аминокислосы.
3.2 J. Сульфа>аза
Из гс1(атонанкреаса L kunki нами была выделена сульфата и, эффективно катализирую и уя расщепление п-нигрофсззззл-сульфага, но не дейсгвуюнщя на природный фукоидан Профили злюцнп фукоидаиа из F е\хмеьсеп\ и сю обращд, обработанного сульфагаюн, при хроматозрафии на колонке с DEAE-Toyopearl были идепзичными. Данные пС-ЯМР-енек"1роскомии и злекзрофореза подзвердилн imi результат. Ьыло показано, чю сульфатаза из L kurilu не действовала па сульфазированные по разным положениям производные фукозы Изи ибируюзцей снособностъю л и вещее] ва не обладали
В литературе имеются данные о подобных ферментах. Японскими исследователями было показано, что в гепатонанкрсасс морскою моллюска Haholus sp присутствовала сульфатаза, iид рол изующая п-питрофенил-сульфат. но не фукоидан. Получонззыс нами данные показывают, что комплексы фермешок, до радирую тих фукоидан, у морских моллюсков L kiirila и Hahotut sp. близки по составу (фукоиданаза. фукозидаза. сульфатаза) и свойствам, pli-От им ум сульфатазы из raïaionaiikpcaea L knnla имел 2 максимума при рН 4,4 и 5,4 (рис. 7) Фермент полностью терял активность при темнерагурс 70°С через 20 мин (рис. 8) Couiacno данным гсльфилырации молекулярная масса сульфаты была равна 158 кДа. К„, дли я-нитрофенил-сульфата составляла 8,7±1 мкмоль.
0.7 -
0,6 - (
0,5 - \
1
0123456789 10 рН
Рис 7. pll-Оизимум сульфазазы из L кип ¡о
Действие |руин-снсцз|фичсскнх pcaicinoB на азезззвноезь сульфазазы ззз L. kunh (табл 6) показало, что та юле как и для большинства зичролаз. в молекуле фермезла нмеезея oeiaioK зрззззюфана, разрушение когорозо приводзгг к ночпон позере активностзз сульфазазы Друз не реазезггы sic действовали на активность фермой ta. И случае ацешшзмидашла - реагекга на Sll-зруииы. наблзодалась замешан акзшзазшн суиьфазггзи (на 50%)
100
температура. С Рис. X Термостабззльноезъ сулы||азазы из L kiinh
Таблица 6
Влияние гру пи-специфических реагентов на активность сульфатазы из L kuriia
Реагент Концентрация реагента, М Модифицируемая rpynrta (остаток) Активность, %
N - Бромсукцинимид 10" ТФ 0
N-Этилыалеимид 10" SH 121
и-Хлорчеркурибензоат 10 J SH 108
1-Эгил-ЗЧЗ- диметиламинопропил* карбоднимнд) 10": соон 104
Ацетилимидачол 10- Туг, Пю -и 151
Диэтилпирокарбонат I0J His 110
С целью исследо&шия специфичности сульфатазы из L кип 1а было проверено сё действие на сульфатированные полиоксисгероиды различной структуры (табл. 7) После инкубирования с ферментом хроматографнческая подвижность сульфатированных полиоксистсроидов не изменялась, чю указывало на то, что количество сульфатных групп у исследуемых веществ осталось прежним. Нами было сделано предположение, что сульфа i ированные нолиоксистероиды в использусмои концентрации могут ингибнровать активность сульфатазы.
Действие сульфатированных полиоксистсроидов на активность сульфатазы из L kuula было испытано в присутствии субстрата - w-нитрофен ил-сульфата. Использованные нами нолиоксистероиды условно можно разделить на три структурные группы, сульфатированные полиоксистероиды офиур (А), сульфатированные агликоны астсросанонннов (Б) и сульфатированные, гликозиды морских звезд (соединение 4В не гликоздлировано) (В) (табл. 7)
Наиболее сильным ингибирующим действием (1« ~10-5М) на сульфатазу обладали вещества 1-5 группы А (рис. 9) В группу Б входят вещества (4, 5). обладающие наименьшей иш нбирующей активностью (Ito -10"J М). Для веществ группы В получены средние значения Г5() (ЧО^М) Интересен тот факт, чю введение ОН-группы в гидрофобную боковую цепь соединения 5А вызывало значительное увеличение ингибирующей активности, по сравнению с соединением 7А. Изменение положения заместителей и введение двойной связи в стероидное ядро не оказывало влияния на ижибирукчцую способность веществ (6А и 7А). Анализ данных по ингибированию, полученных для соединений IB и ЗВ, позволяет предположить, что сульфатаза имеет сродство к ксилозе, имеющей сульфат при С4, поскольку ингнбирующая активность вещества IB в 2 раза выше, чем у соединения ЗВ. которое вместо остатка ксилозы содержит остаюк глюкозы, сульфа i ированной но С4 (забл 7) Зависимое! ь ингибирующей способности нолиоксистероидов от структуры веществ нашядно демонстрирует рис 9.
Рис 9 Ишибирующая способность полиокеисгероидов и их ишкошдов по отношению к с ульфа кие воцсс! в и названия i руин com веч ci вуют ыбл 7.
Таблица 7
И hi ибируницее деистиие молиокенстероидов на активность сульфшазы
№ BciH-Bj, i-pyiiiu Вещее*! во 1ч,. M № вещ-вл, l"PyilMd Вещее i во U,. M
1, А ..... 2x10 ^ 1. Ь i 6x1 (Г
2. А ЗхИ)' 2. В К)-1
З.Л 3x10' 3. Г, Их КГ4
4. Л •Ulli' 4.Г> ..... III'
5. А Jr-r- 4х II)s 5. Ь ......xtf6 ПН txll) '
№ вещ-ва, группа Вещество 1«.М № вещ-ва, группа Вещество 1**М
СИО,М»
6, А .ГХ^Х 4x10"* 1.В ___ (ч\ 6х105
7, А 4x10^ 2, В д. 10-
ОМ1,Ы> -
8, А 5Х10"1 З.В 10^
4. В он1 ПН Ю-4
Рсгиоселективное сульфатирование углеводных молекул может осуществляться следующими способами химическим, с использованием специфически защищенных Сахаров, и зшимагическим В энзиматическом способе применяются два типа ферментов сульфотрапсферазы. для которых акцепторами служат несульфатированные сахара, и гликозилтрансфсразы, использующие в качестве акцепторов сульфатированные производные Сахаров. Недавно был предложен оригинальный подход в получении сульфатированных производных Сахаров, сочетающий химический и энзиматический методы Сульфатирование осуществляется химическим способом, а избирательное десульфатирование - с помощью сульфатаз.
Проведенные нами исследования показали, что сульфатаза из £ кип!а не катали зировала десульфатирование полиоксистероидов, имеющих сульфатную группу в стероидном ядре и тли коз ид ов полкоксистероидов, содержащих сульфатириванныи миносаларидный остаток (табл. 7)
Методом ТСХ было обнаружено, что сульфатаза из ¿- кип/а может направлено катализировать десульфатирование гликозидов Iолостанового ряда. Углеводная часть них веществ представлена тора- нли пентасахариднымн остатками, включающими остатки ксилозы, сульфатированные но С4 Они также обладали способностью ннгибировагь сульфата »у со значениями -10"4 М (табл. 8) Иомому в эксперименте но десульфатированию учитывалась ингибирукнцая активность субстрата Реакция проводилась в разбавленных растворах, >де концентрация субстрата была ниже значения и»(<Х0 мм/мл)
Таблица 8
Ингибирующии эффект гликозидов голостанового ряда на сульфатазу
В с щеп во и м
'Ч Фрондозид А 4Х1«"1
он он чн Кукумариозид 0-1 |х|о'
Псевдостихопочид А 1x1«'
Выделенная нами сульфата за обладала дссульфа тирующей акзивносгмо но отношению к сульфа тированным но С4 остаткам ксило»ы В качестве продуктов реакции (с выходом около 50%) были получены десульфатированные ирои »водные фронцознда Л, пееидоетихопо зида А и кукумариозида Сц Продукты были выделены с помощью хромаюфафин на полихроме и еилика!еле, структура соединении под твержена данными "С-ЯМР-снсктроскоиии
Известно, что сульфа1ировапие сдвигает сишал С5 оста1ка ксилозы в слабое ноле на 4-6 мл. при зтом еж налы соседних атомов у« леродов сдвигаются в сильное ноле па 2-3 мл
Сравнение 13С-ЯМР-спектров нативных тршериеновых зликозидов и обрабо1анных сульфат зон показало, что произошло дссульфатированис ксилозы по С4 (табл 9)
ТаблицаЧ
Химические сдвиги (м.д.) пС-атомов в ЯМР-спектрах гликозидов голостанового рада, соответствующие СЗ, С4 и С5 атомам остатка сульфатированнои ксилозы исследуемых гликозидов и их лесульфя1ировапных производных
Атом Фрондо 1нд Л Фропдочид А-ОЯ" Кукумлриошд о, Кук> мариопг! «,-оя Псевдостихшкннд А, Пссв Ц)СТИ\ОПОШД
СЗ 75.8 77.7 75.Х 7Х.1 76.2 7Х.0
С4 76.1 70.3 75.3 70.7 75.3 70.7
С5 64.4 66,9 64.0 66.7 64,0 66.5
дссульфа тированное прои зводное
Таким образом, сульфатазу из Ь. киг\1а можно считать гликозилсульфатазой, которая не действует на фукондан, сульфатирсванные производные фу козы, но десул ьфати рует имеющие сульфат при С4 остатки ксилозы, входящие в состав сул ьфати ро ванных гликозидов гол оста нового ряда.
3.2.4. Изучение свойств и специфичности 1-»3-р-0-глк>каназ 3,2.4.1.1—>3-{М)-Глюканаза из гепатопанкреаса Цштпа кигНа 3.2.4.1.1 Физико-химические свойства
1->3-Р-Г)-Глкжзиаза была выделена из гепатопанкреаса морского моллюска I* киЫа согласно схеме, представленной на рис. I. Препарат не содержал сопутствующих О-зликозилгидролаз, обнаруженных в экстракте гепатопанкреаса (табл 3) Получены характеристики выделенного фермента. 1-»3-Э-0-Глюканаза из I.. кип!а имела значение оптимума рН, характерное для 1-*3-р-0-глюканаз морских беспозвоночных: рН 5.8 в 0.05 М сукцинатмом буфере (рис. 10) Константа Михаълиса (К,„) при использовании ламинарана из Д. асИопонкч (М, - 5 кДа) в качестве субстрата также была сопоставима со значениями Кт для известных 1->3-р-0-глюканаз и составляла 0,13 ± 0,01 мг/мл Молекулярная масса согласно данным гель-фильтрации составляла 40 кДа, что соответствовало молекулярным массам большинства ")нло-1 люкаиаз При исследовании тсрмостабнльности было установлено, что 1-»3-р-1)-глюканаза за 20 мин полностью теряла свою активность при температуре 45°С (рис. 11).
100
^ 80
ё 60
0
1 40 < 20
0
100 г 80
5 60 о
40
20 0
3 4 5 6 7 8 9 РН
Рис 10.pH-Оптимум 1-+3-Р-0-1Люкана»ы из£ kurita
20
30
40
50
60
Рис П. Термостабильность 1-*3-р-1)-1ЛЮкаиазы из L кип/а
Результаты ингчбиторного анализа (табл 10) позволили сделать некоторые 'заключения о роли отдельных функциональных групп для кагалитическои активности 1—>3-ß-D-unoKana3U Как и для большинства l-H-ß-P-i люканаз различ1к>ю тина действия окисление остатков триптофан л N-бромсукнинимидом приводило к полной Нигере активности I->3-ß-D-iлюклиаш из L kunlu Вероятнее всего, остатки TpHiuty^ana участвуют в связывании cyfteipaга и расположены в молекулах 1лнжаназ вблизи каталитического участка. Ацетилимидазол. взаимодействующий с остатками тирозина и гистидина, вызывал 30% нигибирование фермента. Вероятно, модификация затрагивает важный остаток тирозина, так как реагент на гистидин дитгилпирокарбонат - почти не влиял на активность фермента Pcareirr на SH-грунпу • Гч-эгнлмаиснмнд не понижал активность 1 —>3-ß-D-iлкжаиа«ы из L kunlu. иш ибирующее действ»1с вropoiо реагента (л-хлормеркурибензоата). вероятно, связано с влиянием ртути, входящей в состав реагента Ип|-и5|1рование активности I —»З-ß-D-iлюкаиазы растворимым карбодиимидом почти на 60% позволяет предполагать, что в кз>алитическом процессе важную роль И1рают СООН-групны
Таблица 10
Влияние (руин-сиецифических реатпоя на шивнооь I-»J-ß-D-i люканазы из L kurífa
Pcami i Концентрация poai-eiira, M Модифицирусмая Фунна (остаток) Ак"1ИШ10С1Ь.%
N-lïfK'MLV кципимид 10- Tm (1
N-">rHJiMdjicHMHfi 10- SH «S
л-Хлормсркурибеи-юат 10 1 SH (1
1-'>гил-3-(3- димстмламинопропил- карбодинмид) №: ("ООН 41
Атггилнмндашл 1 €Г- Туг, Iiis 67
Днтпншрокарбона! 10- Iiis m
Снсцифиннос1Ь l->3~ß-D-i люказзазы была установлена при использовании в качестве субстраюв иноканов с различным i ином связен {забл II)
Таблица 11
Дсиствис 1—»3-р-1Э-глн1каназы hi L kurUa на различные субстраты
Субстрат Тип спя (И. сошошСнис M„ кДа Оиюимсльпая скорой"! ь 1 ндролнта, %
Ламнпарап ß-1.3.ß-l.6 40 10 5-6 КМ)
Транслам ß-1.3,ß-l.6 75-25 S-10 43
Дрожжевой i люкан 13-1.3. (И .6 90-10 >200 12
Пахнман ß-1,3.ß-l.6 ЧК 2 50-120 0
КМ-|ихимап ß-u.p-l.6 MS 2 >200 0
Знмоим ß-l.3,ß-l.6 >200 0
Дуба ждан ß-l.3.ß-l.6 50 50 500-550 0
Лихснан ß-1.3,ß-1,4 70 30 10-74 0
Ксилан ß-1,4 10-20 0
Фермой был специфичен к ß-l—>3-еиязям в иноканах. Он с высокой скоростью i идролнзовал ламнпарап и со значительно меньшей ~ гранслам и дрожжевой инокан Различия в скоростзз зндролнза ламннарана и 1раислама связаны с особенностями их ефукчурз.з г>зи I—>3.1-»б ß D-злюканы разлпчаюзея но молекулярным массам, колззчеезву и расположению ß-l—>6-связс>з ( факелам)
»идролиз- 13%
i идролиз - 26%
i идроли i - 68°/i
время, ч
Рис 12 Гель-фильтрация на биогеле Р-2 (автоматический жидкостной анализатор Jeol-JLC-бЛН) продуктов i идролиза ламинарана из L i ichoriouiei l—уЗ-^-D-i люканазой. Л — ламниаран, Г - i люкоза. О -олигосахарнды со степенью полимери зации 2>п> 12.
В высокомолекулярных и слабо растворимых 1люканах р-1—>3-связи являются недоступными дня i -+3-Р* Рчлкжаназы из L kurda Фермент также не гидролизовал ксилан и сметанный l-»3;l-+4-p-D-i люкан -лихенан.
Проведен аналн з продукт ов iидролиза ламинарана l->3-P-D-глюканазой из L kunla. Результаты жидкостной хроматозрафии показали (рис. 12). что конечными продуктами фермен гативного гидроли за
ламинарана I —>3-J3-D-i люканазои являются олигомеры со степенью полимеризации 10>/i>2 *и глюкоза. При этом, уже на начальных стадиях i идролиза наблюдалось обраювание значн гслызо! о количества глюкозы (рис. I2A). Аналозичный состав продуктов характерен для эпдоламинариназ JI0 из Ch и/Ьи/ич и ЛIV из S sacha Imensis, изученных ранее в лаборатории химии фермен тов ТИБОХ.
'>ги результаты позволяют предположи ib, ч го 1 —»З-^-О-иноканаза расщепляет ламинаран также но энда • iniiy. Бумажной
хроматоз рафией было показано присутствие в продуктах реакции ламннарнПиозы - образование которой характерно для эндо-. но не экзо-ферментов Особенность дейсзвня экзо-1-»3-Р-0-1люкапаз такова, чга они, «зачиная зидролиз р-1-*3-связей с исвоестанавливающезо конца молекулы ламииаразза. «обчоднз» несвязанные остатки глюкозы, образуя в качестве продуктов реакции I люксзу, и из разве тлений -днеахарил гентиобиозу При дейпвин эн до-ферментов образуется ламинарнбноза, а I —>6-свяж обнаруживают в дру|их олн1 осахарндах. Так например, в продуктах I идролиза ламинарана эидо-1-»3-р-0-пиоианазами из морских моллюсков р-1—»б-связанная злижоза присутствовала а три* и течраеахарндах
Выделенная нами I~>3-Р*0-1 люканаза обладала способное!ыо перепоешь I лнконовую часть субеграIа не только на воду, но н на л-нитрофснил-Р-О-ипокопиранозид (рис. 13), тс проявляла трансгликознлирующую активность Принято считать, что транемикозилирую активность имеют >нчо-(лкжаназы. экзо-фермепты не казшшзируют реакцию транстликози шрования Хо1я обнаружены и исключения и з нош правила экзо-1 -+3-Р-0-глкжаназа н з СшиЫо а1Ии от проявляла
трансгликозилирующую способность. Было замечено, чго способность к трансгликозилированню у D-глюканазы из L. kuri/a выражена слабее, чем у I -»З-Р-О-глюкипаш и* кристаллического стебелька S sachalmetisis (J1IV). При внесении в реакционную смесь одинаковых по гидролитическому действию количеств этих ферментов (~10"2 ед.), продукты трансгликозилирования появлялись: при действии ЛIV через 20 мин, а при действии 1-»3-Р-Очлюка1Шы и*/ inula лишь через 50 мин реакции.
1
о о
20 мин
Е
Ж
50 мин
в
75 мин
3
Г
и
120 мин
д
24 ч
К
время, мин
Таким обраюм, полученные данные шнволякц ечншь. чю в i снагопанкреасе морского моллюска L kioila содержится I ->3-Р-П)-1Л1окапа»а. специфичная к 0-1 ->3-свя»ям в i люканах. облагающая граноликошлнрующим деновнем и пиролтумщая cyoeipal но wuMiniy.
3.2.4.2.1—►З-р-О-Глюканаад из неоплодотворенных яйцеклеток морского ежа StrongylocentTotus ¡ntermedius
Ранее было показано, что I —►З-р-й-глнжаназы широко распространены в морских беспозвоночных. Детальное исследование свойств, специфичности и механизма действия !—*3-{5-D-i люканаз из кристаллических стсбсльков морских моллюсков позволило отнести их к зндо-ферментам Обнаружена особенность действия эндо-1 —»З-р-О-глкжаназ морских моллюсков они гидролнзуют ламипаран со значительно более высоким выходом моносахарида Олюкозы), чем эндо ферменты из растений, фибов и друз их источников К эндо-ферментам отнесены и другие 1->3-Р-0-глюканазы из морских беспозвоночных.
I -»З-Р-О-Глюкамазы присутствукгг в неоплодотворенных яйцеклетках морских ежей Предполагается их участие в процессе оплодотворения, но субстрат для них не найден 1->3-р-0-Глюканазы из неоплодотворенных яйцеклеток морского ежа Strongy!ocentrotu\ purpuratus и эмбрионов на стадии бластулы S intermedins исследователи отнесли к экзо-1—»l-p-D-глюканазам основываясь, главным образом, на резульга(ах анализа продуктов ферментативной реакции, содержащих большие количества i люкозы.
В ной части нашей работы мы провели сравнение пскоюрых свойств 1-*3-р-0-ипоканазы из пеонлодозворенных яйцеклеток морского ежа S intermedins (Jle) с ранее изученными в пашей лаборатории пищеварительными ферментами двух типов действия* >ндо-1-»3-р-0-глюканазой из кристаллическою стебелька морского моллюска S wthahnenm (Л IV) и зкзо-1 —>3-P-D-i л юканазой из на земною моллюска Е. танки (Л II )
Схема очистки 1-»3-р-0-глюканазы из неоплодотворенных яйцеклеток морскою ежа S nutiniedins несколько отличалась oí опубликованных для подобных объектов и включала ионообменную хроматографию на DEAE-Toyopearl, гель-фильтрацию на сефадексе G-200, хроматографию на мопо-Q.
Для установления типа действия 1-*3-|5-0-глкжаиазы из неоплодотворенных яйцеклеток морского ежа S intermedins использовали несколько подходов Выл проведен анализ продуктов реакции двумя
методами: все восстанавливающие сахара были определены методом Нельсона (Nelson, 1944). содержание i люкозы устанавливали i люкозо-оксидазным методом (tluggcM. Nixon, 1957) Как показано ранее, для зкзо-1->3-р-[>глюканазы из Е пшики на начальных стадиях i идролиза содержание восстанавливающих
Сахаров полностью совпадало с количеством i люкозы. а для знчо-1-»3-P-D-i люкана зы из S uu ha/menu* содержание восстанавливающих
Сахаров превышало уровень i люкозы, что ювориго присутствии в продуктах реакции ламинариолиюсахаридов Изданных, полученных для I-И-Р-0-1ЛЮканазы 5 intermedins (рис. 14), можно с дела i ь вывод, чго на начальных i танах тдролнза ламинарана в составе продуктов преобладает 1Люкоза, на более поздних стадиях гидролиза накапливаются олшосахарнды
30
25
Ss s 20
m п о 15
i
£ 10
5
о !--о
10 20 30 40 50 60 70 80 9С
Время, мин
Pul. 14. Действие (i-1 —»3-1 лкжана (ы Лс на ламннаран, I -накопление восстанавливающих Сахаров. 2 - увеличение содержания 1лкжо1ы
Продукты, образовавшиеся при действии ферментов на ламинараи. анализировались также с помощью автоматического жидкостного анализатора. На рис. 15 приведены результаты жидкостной хроматографии продуктов гидролиза ламинарана тремя исследуемыми ферментами при одинаковой степени I идроли за субстрага (около 14%) Содержание инокозы в продуктах исчерпывающего гидролиза ламинарана тгими ферментами приведено в табл 12. _ - '1 .
л I) 1\
А .ж •
/ ^ л/ \ДА
МлХ ■
-- - Г --------г- ' *
2 3 4 5 6 Время, ч
Рис 15. Гсль-фильграция продуктов гидролиза ламинарана I -+3-0-13-1 люкапазами Ле, Л1У и ЛИ (степень гидролиза - 14%) на биореле Р-2 (автоматический жидкостнои анализатор ^1-ЛХ-6АН, колонка с биогелсм Р-2, IхГ00 см. ) Л -ламинаран, Г-
глюкоза.
Таблица 12
Характеристика продуктов исчерпывающего гидролиза ламинврана на Ь. сккопоШез под действием 1-*Э-р-1)-гдюканаз.
1 -*3-(МЭ-глюканаза <102ед.) Степень гидролиза, % Количество глюкозы в продуктах, %
ЛИ 95 90
Ле 63 33
Л1У 60 40
Одним из критериев при определении типа действия гликаназ является стереохимия продуктов ферментативного гидролиза. Экзогликаназы гидролизуют субстрат с обращением, а эндо с сохранением конфигурации расщепляемой связи. Конфигурация продуктов гидролиза ламииарана I—►З-р-О-глюканазами была определена по изменению величины оптического вращения инкубационной смеси. Данные измерений приведены в табл. 13.
Таблица 13
Изменение величины оптического вращения инкубационной смеси в процессе I идролиза ламииарана
1 -»Э-Р-О-гл юканазам и
Время, с ГаЬлшл
ЛИ Лс ЛIV
5 -19 -23 -18
10 -13 -22 -II
15 -8 -20 -5
20 +2 -18 -3
30 +11 -16 +3
добавлено 100 мкл ЫН4ОН +1 -15 +3
[а]ц ламииарана из асИопои^ез (10 мг/мл) - -23° [а]0 а- глюкозы =+105° [а]0 р- глюкозы =+20°
[а][> равновесной смеси аир аномеров глюкозы =+55°
В процессе гидролиза ламииарана ЛИ наблюдалось равномерное увеличение величины оптического вращения раствора до положительного значения, которое резко уменьшалось до равновесною при добавлении капли аммиака - катализатора реакции аномеризации. Аналогичная картина, полученная для экзо-1-»3-р-1>глюканазы из Не!я ротапа, позволила заключить, что (идролиз ламииарана под действием этого фермента приводит к образованию а- глюкозы
Ранее методом ЯМР-спектроскопии было показано, что Л1У гидролизуст ламинаран с сохранением конфигурации расщепляемой связи. Созласно полученным данным (табл. 13) при гидролизе ламииарана ЛIV оптическое вращение раствора не только не достигает высокого положигельного значения, но и не изменяется при добавлении аммиака. Еще медленнее происходит увеличение оптическою вращения в случае действия на ламинаран 1-*3-р-0-глюкапазы Ле из яйцеклеток морскою ежа и практически не меняется с добавлением капли аммиака. Вероятнее всего, что также, как и в случае Л1У, здесь образуются продукты, имеющие Р-конфигурацию при СI.
Известно, что субстраты с измененным нсвосстанавливакмцим концом молекулы не подвергнутся действию экзофермезп ов. тогда как такая модификация практически не сказывается на скорости I идролиза тгих субстратов зндоферментами. Среди исследуемых глюка на з только ЛИ не катализировала расщепление модифицированного ламииарана. Л1У и Лс гидролизовалн сю с высокой скоростью (табл 14) Близкими
оказались скорости гидролиза глюкаиазами Л1У и Ле высокомолекулярного I—>3-Р-[)-глкжана - нахимана и смешанного 1-»3,1—^р-О-глюкана - лихенана
Таблица 14.
Действие 1—^З-р-Очлюканги на различные субстраты
Субстрат Ошоси гсльная екорость ■ идроли и.%
ЛИ Ле Л1У
Ламмпараи ич 1 снЬпппнкч КЮ 100 100
1(сриодатио-окисленнын иамниараи 0,5 Н5 90
Махиман 0 13 10
КМ-пахимаи 7 24 14
Лих снам 16 22 20
л-Нитрофснил-^-Г^люкомирано-гид 0 7 2.1
Известно, что эндогликаназы катализируют как реакцию I идролиза. гак и реакцию трани ликошлироваиия. а экзоферменты, за редким исключением, осуществляют только шдролиз гликозндных свя«си субстраи Сведения о транстликозилирующих свойствах I—»З-р-П-1 люканаз крайне о1раничсны В большинстве публикаций лишь отмечается присутствие или отсутствие трансглнкозилирующнх свойств у этой группы ферментов. Ранее нами было показано, что для эндо-1 —»З-Р-О-глюкаиаз из морских моллюсков характерна повышенная способность но сравнению с дружми карбо! идразами к реакциям трансгликозилирования Сравнительная оценка величины трапа ликозилирующеи активности 1->3-Р-[)члюканаз из различных источников приведена нами в работе. Трансижкозилирующую способность оценивали но скорости образования меченных /7-ннгрофснолом продуктов, образующихся при использовании ламнпарана в качестве донора, а л-ншрофснил-Р-Р-инокопирапозида - в качестве акцешора реакции. Выло показано, чю I —люкаиаза ЛИ не катали зируст реакцию трапа ликозилирования При равной Iидролишческои активности за I час в одинаковых условиях Л1У катализировала включение 11,5% акцептора в продукты реакции, а Ле - 0,4% Траисишкозилируюшая активность Лс значительно меньше Л1У, но сопоставима с активностью эндо-1 —»З-Р-О-1 люканаз растений
Таким образом, 1-»3-Р-0-1люкапаза из яйцеклеток морскою ежа 5 ткгтеЖт осуществляет гидролиз ламинарапа с сохранением конфжурации расщепляемой связи и с образованием большою количесгва ипокозы в продуктах реакции, действует на модифицированные еубстраш Фермой обладаст фансгликозилнрующеи активностью Все »ж свойства делают ого более похожим на зндо-1 -»З-р-О-1лнжаиазу ЛIV из морскою моллюска, чем на >км>-1 ->3-^-0-1 лкжлшу ЛИ из наемной улшки
Некоторые отличия в составе продую ов !идролиза ламипараиа 1-»3-р-0-иноканазами Л1У н Ле. пх I райи ликозилирующеи способности, веройIно,связаны с различным строением их акцизных* цен (ров
ВЫВОДЫ
I. Впервые проведен анализ содержания фукоиданаз и некоторых Iлнкознчаз в 61 виде морских беспозвоночных Японскою моря Показано, что 1ликозидазы и фуноиданазы различной специфичности достаточно широко распространены в морских беспозвоночных Моллюски, некоторые нредегавшели шлокожнх и ракообразных, показавшие наиболее высокий уровень ферментативном активности. мо(у! служить хорошими источниками для выделения этих ферментов
2. Из морского моллюска L kunla выделены высокоочищенные препараты фукоиданазы, a-L-фукозидазы, сульфатазы и 1 ~*3-Р-С>-глюканазы. Установлены молекулярные массы, К™ термостабнльность и рН-огттимумы выделенных ферментов.
3. Установлено, что a-L-фукозидаза гидролизует синтетический субстрат (я-нитрофенил-a-L-фукопиранозид) и не действуют на природный фукоидан.
4. Сульфатаза из L kurtta не действует на сульфатированные полиоксистероиды, ингибирующие ферментативную активность. Фермент не действует на природный фукоидан, сульфатированные производные фукозы. но десульфатирует остатки ксилозы, входящие в состав гликозидов голостанового ряда.
5. Впервые показано, что фукоиданаза из L. kuriia расщепляет доступные a-l—>3-связи между остатками фукозы в молекуле фукоидана с образованием сульфатированных олигосахаридов и фукозы.
6 1—►З-р-О-Глюканаза из гспатопанкреаса морского моллюска L кип la отнесена к ферментам эндо-типа действия. Она катализирует гидролиз ß-1—»3 связей в ß-1—»3,1 —»6 - глюканах (ламинаране и трансламе) с образованием олигосахаридов (п - 2-10) и глюкозы и обладает трапегликозилирующеи активностью
7 Из неонлодотворенных яйцеклеток морского ежа S intermedins выделена I —»3-р-Е)-глюканаза. Показано, что эта I—»З-Р-О-глюканаза осуществляет гидролиз ламинарана с сохранением конфигурации расщепляемой связи и с высоким выходом глюкозы в продуктах реакции, действует на модифицированные субстраты. Она обладает трансгликозилирующей активностью и является, по-видимому, ферментом эндо-типа действия.
Список основных публикаций по теме диссертации
I. Ю В Бурцева, M И Кусайкин, CA. Алексеева, В.В. Сова Распространение фукоидан-гидрол аз и некоторых гликозидаз среди морских беспозвоночных// Тезисы Дальневосточной региональной конференции молодых ученых "Проблемы экологии и нриродопользовния Дальнего востока", г. Владивосток, 1998 г ,с.2!3.
1. Бакунина И. Ю, Бурцева Ю В., Сова В.В, Шевченко Н.М , Нсдашковская О И , Алексеева С А., Кусайкин МИ., Урванцева A.M., Михайлов ВВ., Звягинцева ТН. Распределение фукоидан гидрол аз в морских беспозвоночных и микроорганизмах// Тезисы 2-го Международного симпозиума «Химия и химическое образование». Владивосток 2000, С. 206.
3. Talyana N. Zvyagintseva, Michael I. Kusaykin, Irina U. Bac un ma, Andrey S Scobun, Nataliya. M. Shevchenko. Water soluble polysaccharides of some Far-Eastern seaweeds Structure and enzymatic transformation. Abstracts of [0-th International Symposium on Marine Natural Products. Nago, Okinawa. 2001. P. 106
4. M.l. Kusaykin, Vu. V Burtseva, V.V. Sova and T.N. Zvyagintseva. The tucoidanases in manne invertebrates. Abstracts XVI International symposium on glucoconjugatcs The Hague. The Netherlands. 200). P. 81.
5 Бурцева Ю В., Кусайкин M, Сова В В., Шевченко H M, Скобу» А С., Звягинцева Т H Распространение фукоидан гидролат и некоторых гликозидаз среди морских беспозвоночных// Биолошя моря. 2000. Т. 26, № 6 С. 429-432.
6 Кусайкин M И.. Бурцева Ю В , Сова В В., Светашева Т Г., Звя|инцсва Т Н., Ферменты морского моллюска Littoriha кип la ш катализирующие трансформацию фукоиданов // Биохимия. 2003. Т. 68 № 3 С. 384-395
7. В В Сова, НИ Широкова. М.И Кусайкин, АС. Скобун. Л А. Елякова. Т.Н. Звянпщсва [Ы.З-Глюканаза из неонлодотворенных яйцеклеток морскою ежа Strong) tocentrotm mteimedius. Сравнение с ß-1 Л-i люканазами морского и наземного моллюсков // Биохимия 2003 Т. 68. №5
£оо?-Д »13^1
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кусайкин, Михаил Игоревич
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Структурная организация ферментов. Классификация о-гликозилгидролаз, основанная на сходстве первичной последовательности
1.1.1. Каталитические домены различных семейств и особенности их укладки
1.1.2. Молекулярный механизм действия О-гликозилгидролаз
1.1.3. Эволюционные аспекты
1.1.4. Углевод-связывающие модули и их классификация.
1.1.5. Линкеры
1.2. ФУКОИДАНЫ
1.3. ФУКОИДАНАЗЫ (ФУКОИДАН ГИДРОЛАЗЫ)
1.3.1. Распространение фукоиданаз
1.3.2. Выделение и очистка фукоиданаз
1.3.3. Сведения о свойствах фукоиданаз
1.4. СУЛЬФАТАЗЫ
1.5. 1->3-Р-0-ГЛЮКАНАЗЫ (ЛАМИНАРИНАЗЫ) ИЗ МОРСКИХ ИСТОЧНИКОВ.
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Распространение некоторых О-гликозилгидролаз в морских беспозвоночных
3.2. Выделение и характеристика О-гликозилгидролаз морского брюхоногого моллюска ЬШоппа кигИа
3.2.1. Фукоиданаза
3.2.1.1. Выделение и физико-химические свойства
3.2.1.2. Специфичность действия фукоиданаз
3.2.1.3. Функциональные группы фукоиданаз, участвующие в трансформации субстрата
3.2.2. а-Ь-Фукозидаза
3.2.3. Сульфатаза
3.2.4. Изучение свойств и специфичности 1—>3-(3-0-глюканаз
3.2.4.1. 1—>3-Р-0-Глюканаза из гепатопанкреаса ЬШогта кигИа
3.2.4.1.1. Физико-химические свойства
3.2.4.2. 1—>3-(3-ОТлюканаза из неоплодотворенных яйцеклеток морского ежа
§1гопру1осеп1гоШ$ ¡п(егтесИш'
ВЫВОДЫ
Введение Диссертация по биологии, на тему "О-гликозилгидролазы морских беспозвоночных. Свойства и специфичность фукоиданаз, сульфатаз и 1→3- β-D-глюканаз"
Полисахариды бурых водорослей (фукоиданы, ламинараны, альгиновые кислоты) разнообразны по своей структуре и биологической активности. Альгинаты широко используются в пищевой промышленности и медицине. Они способны связывать и выводить из организма ионы тяжелых металлов. Фукоиданы проявляют антикоагулянтное, иммуномодулирующее, противоопухолевое и антивирусное действие и в настоящее время предлагаются как лекарственные средства. Интерес к 1—>3;1—>6-|3-0-глюканам, к которым относится и ламинаран, связан с их влиянием на системы иммунитета растений и животных. Несмотря на широкую известность всех этих полисахаридов, имеются трудности с установлением их структуры. Трудности связаны с тем, что содержание и структурные характеристики полисахаридов зависят не только от вида водоросли, но и от сезона сбора, возраста и т.д. Кроме того, структуры этих полисахаридов, особенно фукоиданов, отличаются отсутствием регулярности и большим разнообразием.
Важными инструментами в структурных исследованиях полисахаридов служат ферменты (О-гликозилгидролазы, сульфатазы) с установленной специфичностью и механизмом действия. Большой интерес представляет ферментативная трансформация полисахаридов, позволяющая получать новые препараты с более высокой биологической активностью.
Морские беспозвоночные, представленные большим количеством таксонов, находящиеся на различных ступенях эволюции и отличающиеся друг от друга способом питания и образом жизни, являются богатыми и сравнительно доступными источниками различных О-гликозилгидролаз. Некоторые виды морских беспозвоночных служат объектами марикультуры. О-Гликозилгидролазы чаще всего содержатся в пищеварительных трактах морских животных, которые попадают в отходы при их промышленной переработке.
Целью работы является получение высокоочищенных ферментов, катализирующих трансформацию полисахаридов бурых водорослей (фукоидана и ламинарана), установление их специфичности и механизма действия.
В диссертационной работе представлены данные о распространении в морских беспозвоночных ферментов, принимающих участие в деградации полисахаридов; разработаны методы выделения индивидуальных ферментов из гепатопанкреаса Ь. кигИа, исследованы свойства, специфичность и возможность их применения в структурных исследованиях углеводов. В обзоре литературы отражена степень изученности полисахаридов и ферментов, катализирующих расщепление полисахаридов бурых водорослей. Основное внимание уделено наиболее перспективному направлению - исследованию структурной организации О-гликозилгидролаз.
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Кусайкин, Михаил Игоревич
ВЫВОДЫ
1. Впервые проведен анализ содержания фукоиданаз и некоторых гликозидаз в 61 виде морских беспозвоночных Японского моря. Показано, что гликозидазы и фукоиданазы различной специфичности достаточно широко распространены в морских беспозвоночных. Моллюски, некоторые представители иглокожих и ракообразных, показавшие наиболее высокий уровень ферментативной активности, могут служить хорошими источниками для выделения этих •ферментов.
2. Из морского моллюска L. kurila выделены высокоочищенные препараты ферментов, которые могут принимать участие в трансформации фукоидана: фукоиданаза, a-L-фукозидаза и сульфатаза. Установлены молекулярные массы, Кт, термостабильность и рН-оптимумы выделенных ферментов. Установлено, что a-L-фукозидаза гидролизует синтетический субстрат (и-нитрофенил-a-L-фукопиранозид) и не действуют на природный фукоидан.
3. Сульфатаза из L. kurila не действует на сульфатированные полиоксистероиды, ингибирующие ферментативную активность. Фермент не действует на природный фукоидан, сульфатированные производные фукозы, но десульфатирует остатки ксилозы, входящие в состав гликозидов голостанового ряда.
4. Йпервые показано, что фукоиданаза из L. kurila расщепляет доступные а-1—>3-связи между остатками фукозы в молекуле фукоидана с образованием сульфатированных олигосахаридов и фукозы.
5. 1 —►З-З-О-Глюкапаза из гепатопанкреаса морского моллюска L. kurila отнесена к ферментам эндо-типа действия. Она катализирует гидролиз (3-1—>3 связей в р-1—>3;1—>6 - глюканах (ламинаране и трансламе) с образованием олигосахаридов (п = 2-10) и глюкозы и обладает трансгликозилирующей активностью.
6. Из неоплодотворенных яйцеклеток морского ежа S. intermedius выделена 1—>3-P-D-глюканаза. Показано, что эта 1—»З-Р-О-глюканаза осуществляет гидролиз ламинарана с сохранением конфигурации расщепляемой связи и с высоким выходом глюкозы в продуктах реакции, действует на модифицированные субстраты. Она обладает трансгликозилирующей активностью и является, по-видимому, ферментом эндо-типа действия.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кусайкин, Михаил Игоревич, Владивосток
1. Авилов С.А., Калинин В.И., Дроздова O.A., Калиновский А.И., Стоник В.А., Гудимова E.H. Тритерпеновые гликозиды голотурии Cucumaria frondosa II Химия природ, соед. 1993. № 2. С. 260-263.
2. Афиятуллов Ш.Ш., Тищенко Л.М., Стоник В.А., Калиновский А.И., Еляков Г.Б. Структура кукумариозида Gi нового тритерпенового гликозида из голотурии Cucumaria fraudatrixll Химия природ, соед. 1985. № 2. С. 244-248.
3. Бакунина И.Ю., Сова В.В., Елякова Л.А., Макарьева Т.Н., Стоник В.А., Пермяков Е.А., Емельяненко В.И. Влияние сульфатов полиоксистероидов на экзо-и эндоглюканазы // Биохимия. 1991. Т. 56. С. 1397-1405.
4. Бурцева Ю.В., Кусайкин М.И., Сова В.В., Шевченко Н.М., Скобун A.C., Звягинцева Т.Н. распространение фукоидан-гидролаз и некоторых гликозидаз у морских беспозвоночных // Биология моря. 2000. Т. 26. № 6. С. 429-432.
5. Звягинцева Т.Н., Беседнова H.H., Елякова Л.А. Структура и иммунотропное действие 1,3;1,6-Р-0-глюканов. Владивосток: Дальнаука, 2002. 159 с.
6. Звягинцева Т.Н., Елякова Л.А. Кинетические особенности действия эндо-1—»3-ß-D-глюканаз из различных источников // Биоорган. Химия. 1981. Т. 7. С. 680-685.
7. Звягинцева Т.Н., Елякова Л.А. Специфичность и механизм действия эндо-1—>3-3-0-глюканаз из морских моллюсков // Биоорган. Химия. 1994. Т. 20. С. 453474.
8. Звягинцева Т.Н., Елякова Л.А., Сундукова Е.В., Мищенко Н.П. Выделение пустулана. 1986. A.c. № 1227199. Б.И. № 16.
9. Звягинцева Т.Н., Макарьева Т.Н., Стоник В.А., Елякова Л.А. Сульфатированные стероиды губок семейства Hálichondriidae природные ингибиторы эндо-1—>3-Р-Б-глюканаз // Биоорган, химия. 1986. Т. 1. С. 71-77.
10. Калинин В.И., Стоник В.А., Калиновский А.И., Исаков В.В. Структура псевдостихопозида А основного тритерпенового гликозида из голотурии Pseudostichopus trachus И Химия природ, соед. 1989. № 5. С. 678-684.
11. Клесов A.A., Рабинович М.Л., Чурилова И.В., Мартьянов В.А., Гусаков A.B., Елякова Л.А. Ферментный гидролиз целлюлозы // Биоорган, химия. 1982. Т. 8. С. 1490-1496.
12. Рабинович М.Л., Мельник М.С. Прогресс в изучении целлюлолитических ферментов и механизм биодеградации высокоупорядоченных форм целлюлозы // Успехи биол. хим. 2000. Т. 40. С. 205-266.
13. Сова В.В., Звягинцева Т.Н., Светашева Т.Г., Бурцева Ю.В., Елякова Л.А. Сравнительное изучение особенностей реакций гидролиза и трансгликозилирования, катализируемых ß-1,3-глюканазами из различных источников // Биохимия. 1997. Т. 62. № 10. С. 1300-1306.
14. Сова В.В., Левина Э.В., Андриященко П.В., Федоров С.Н., Елякова Л.А. Действие полиокистероидов из морских звезд и офиур на активность (3-1,3-глюканаз // Химия природ, соед. 1994. № 5. С. 647-650.
15. Сова В.В., Мястовская О.М., Светашева Т.Г., Елякова Л.А. Сравнение энзиматичееких и структурных характеристик |3-1,3-глюканаз из морских моллюсков//Химия природ, соед. 1987. № 4. С. 577-581.
16. Сундукова Е.В. Выделение и характеристика Р-1,3;1,6-глюканаз из гребешка приморского и их действие на некоторые высокомолекулярные субстраты // Дисс. .канд. хим. наук, Владивосток, 1992, 134 с.
17. Усов А. И., Смирнова Г. П., Билан М.И., Шашков А.С. полисахариды водорослей. Бурая водоросль Laminaria saccharina (L.) Lam. как источник фукоидана // Биоорган, химия. 1998. Т. 24. С. 437-445.
18. Усов А.И., Кирьянов А.В. Полисахариды водорослей. Выделение фракций фукоидана из бурой водоросли Laminaria cichorioides Miyabe // Биоорган, химия. 1994. Т. 20. С. 1342-1348.
19. Хоменко В.А. Химическое исследование саргассана глюкуроногликана бурой водоросли Sargassum pallidum II Дисс. . .канд. хим. наук, Владивосток, 1972, 154 с.
20. Широкова Н.И., Елякова Л.А. Экзо-(3-1,3-глюканаза из улитки Eulota maakii II Биоорган, химия. 1977. Т. 3. С. 1656-1662.
21. Широкова Н.И., Уварова Н.И., Елякова Л.А. Карбогидразы улитки Eulota maakii // Химия природ, соед. 1974. Т. 2. С. 222-226.
22. Ahmed S., James К., Owen С., Patel С., Patel М. Hydrophobicity, а physicochemical factor in the inhibition of the enzyme esterone sulfatase (ES) // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001. V. 11. P. 2525-2528.
23. Alexander C.G., Cutler R.L., Yellowless D. Studies on the comparison and enzyme content of the crystalline style of Telescopium telescopium (L.) (Gastropoda) // Сотр. Biochem. Physiol. 1979. V. 64B. P. 83-89.
24. Anno K., Terahata H., Hayashi Y., Seno N. Isolation and purification of fucoidan from brown seaweed Pelvetia wrightii II Agric. Biol. Chem. 1966. V. 30. P. 495-499.
25. Barbeyron Т., Flament D., Michel G., Potin P., Kloareg B. The sulphated galactan hydrolases, agarases and carrageenases: strutural biology and molecular evolution // Cah. Biol. Mar. 2001. V. 42. P. 169-283.
26. Bilan M.I., Grachev A.A., Ustuzhanina N.E., Shashkov A.S., Nifantiev E.N., Usov A.I. Structure of a fucoidan from the brown seaweed Fucus evanescens II Carbohydr. Res. 2002. V. 337. P. 719-730.
27. Chevolot L., Foucault A., Chaubet F., Kervarec N., Sinquin C., Fisher A.-M., Boisson-Vidal C. Furter data on the structure of brown seaweed fucans: relationships with anticoagulant activity // Carbohydr. Res. 1999. V. 319. P. 154-165.
28. Chizhov A.O., Dell A., Morris H.R., Haslam S.M., McDowell R.A., Shashkov A.S., Nifant'ev N.E., Khatuntseva E.A., Usov A.I. A study of fucoidan from the brown seaweed Chorda filum II Carbohydr. Res. 1999. V. 320. P. 108-119.
29. Chothia C., Lesk A.M. The relation between the divergence of sequence and * structure in protein IIEMBO J. 1986. V. 5. P. 823-826.
30. Collett R.A. Arylsulphatase activity in liver and gastrointestinal tract of sheep // Biochem. Soc. Trans. 1980. V. 8. P. 343-344.
31. Conte L.L., Aliey B., Hubbard T., Brenner S.E., Murzin A.G., Chotia C. SCOP: a structural classification of proteins database II Nucl. Acid Res. 2000. V. 28. No. 1. P. 257-259.
32. Delisle G.J., Milazzo F.H. Characterization of arylsulfatase isoenzymes from Pseudomonas aeruginosa II Can. J. Microbiol. 1972. V. 18. P. 561-568.
33. Ding S.-J., Ge W., Buswell J.A. Endoglucanase I from the edible straw mushroom Vvariella volvacea. Purification, characterization, cloning and expression // Eur. J. * Biochem. 2001. V. 268. P. 5687-5695.
34. Duarte M., Cardoso M., Noseda M., Cerezo A. Structural studies on fucoidans from the brown seaweed Sargassum stenophyllum II Carbohydr. Res. 2001. V. 333. P. 281293.
35. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J., Robers P.A., Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances // Analyt. Chem. 1956. V. 28. P. 350-356
36. El-Sayed M.M. The polysaccharides of the brown seaweed Turbinaria murrayana II Carbohydr. Res. 1982. V. 110. P. 277.
37. Elyakova L.A., Shevchenko N.M., Avaeva S.M. A comparative study of carbohydrase activities in marine invertebrates // Comp. Biochem. Physiol. 1981. V. 39B. P. 905-908.
38. Elyakova L.A., Sova V.V., Vaskovsky V.E. Cellulase of marine mollusk Littorina sp.ll Biochem. Biophys. Acta. 1968. V. 167. P. 462-464.
39. Finch P., Percival E., Slaiding I. R., Weigel H. Carbohydrates of the antarctic brown seaweed Ascoseira mirabilis H Phytochemistry. 1986. V. 25. P. 443-449.
40. Fontaine T., Hartland R.P., Diaquin M., Simenel C., Latge J.P. Differential patterns of activity displayed by 2 exo-beta-l,3-glucanases associated with the Aspergillus fumigatus cell-wall //J. Bacterid. 1997. V. 179. No. 10. P.3154-3163.
41. Freeman C., Hopwood J.J. Glucuronate-2-sulfatase activity in cultured human skin fibroblast homogenates // Biochem. J. 1991. V. 279. P. 399-405.
42. Fujikawa T., Wada M., Schleim aua der Braunalge Nematocystus decipiens, Mozuku. I. Mitt. Bestandteile des Schileims und ihre Eigenschften // Agric. Biol. Chem. 1975. V. 39. P. 1109-1114.
43. Furukawa S., Fujikawa T., Koga T., Ide A. Purification and some properties of Exo-type fucoidanases from Vibrio sp. № 5 // Biosci. Biochem. Biotech. 1992. V. 56 No. 11. P. 1829-1834.
44. Gilkes N.R., Henrissat B., Kilburn D.G., Miller R.C., Warren R.A. Domains in microbial beta-1, 4-glycanases: sequence conservation, function, and enzyme families // Microbiol. Rev. 1991 V. 55. P. 303-315.
45. Gilkes N.R., Warren R.A., Miller R.C.J., Kilburn D. G. Precise excision of the cellulose binding domains from two Cellulomonas fimi cellulases by a homologous protease and the effect on catalysis // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 10401-10407.
46. Glabe C.G., Grabel B., Vacguier V.D., Rosen S.D. Carbohydrate Specificity of sea urchin sperm bindin: a cell sulface lectin mediating sperm-egg adhesion // J. Cell. Biology. 1982. V. 94. P. 123-128.
47. Green J.D., Glas P.S., Cheng S.D., Lynn J.W. Fertilization envelope assembly in sea urchin eggs insemina in chloride-deficient sea water: II. Biochemical effets // Mol. Repord. Dev. 1990. V. 25. P. 177-185.
48. Habuchi H., Tsuji M., Hakanishi Y., Suzuki S. Separation and properties of five glycosaminoglycan sulfatases from rat skin // J. Biol. Chem. 1979. V. 254. P. 7570-7578.
49. Henrissat B. A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities // Biochem. J. 1991. V. 280. P. 309-316.
50. Henrissat B., Bairoch A. New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities // Biochem. J. 1993. V. 293. P. 781-788.
51. Henrissat B., Claeyssens M., Tomme P., Lemesle L., Mornon J.-P. Cellulase families revealed by hydrophobic cluster analysis // Gene. 1989. V. 81 P. 83-92.
52. Honya M., Mori H., Anzai M. Monthly changes in the content of fucans, their constituent sugars and sulfate in cultured Laminaria japonica II Hydrobiologia. 1999. V. 399. P. 411-416.
53. Horicoshi K., Atsukawa Y. (3-1,3-Glucanase produced by alcalophylic bacteria Bacillus № K-12-5 // Agric. Biol. Chem. 1973. V. 37. P. 1449-1456.
54. Hostos E.L., Togasaki R.K., Grossman A. Purification and biosynthesis of a derepressible periplasmic arylsulfatase from Chlamydomonas reinhardtii II J. Cell. Biol. 1988. V. 106. P. 29-37.
55. Juy M., Amit A.G., Alzari P.M., Poljak R.J., Claeyssens M., Beguin P., Aubert J.-P. 3-Dimensional structure of a thermostable bacterial cellulase // Nature. 1992. V. 357. P. 89-91.
56. Kadzioia A., Abe J., Svensson В., Haser R. Crystal and molecular structure of barley a-amylase // J. Mol. Biol. 1994. V. 239. P. 104-121.
57. Kitamura K., Matsuo M., Yasui T. Enzymic degradation and fucoidan by fucoidanase from the hepatopancreas of Patinopecten yessoensis II Biosci. Biochem. 1992. V. 56. No. 3. P. 490-494.
58. Knoess W., Glombitza K.-W. A phenylsulphatase from the marine brown alga Cystoseira tamariscifolia I I Phytochemistry. 1993. V. 32. P. 1119-1123.
59. Manners D.J., Marshall J J. Purification and properties of (3-1,3-glucanase from rye //Phytochemistry. 1973. V. 12. P. 547-553.
60. Marshall J.J., Grand R.J. Comparative studies on $-glucane hydrolases. Isolation and characterization of an exo-( 1 -3)-J3-glucanase from snail, Helix pomatia II Arch. Biochem. Biophys. 1975. V. 167. P. 165-175.
61. McClure M.O., Moore J.P., Blanc D.F. Investigations into the mechanism by which sulfated polysaccharides inhibit HIV-infection in vitro // ADS Research and Human Retroviruses. 1992. V. 8. P. 19-26.
62. Mebeau S., Kloareg В., Joseleau J.-P. Fractionation and analysis of fucans from brown algae // Phytochemistry. 1990. V. 29. P. 2444-2445.
63. Medcalf D.G., Schneider T.L., Barnett R.W. Structural features of a novel glucuronogalactofucan from Ascophyllum nodosum // Carbohydr. Res. 1978. V. 66. P. 167-171.
64. Miamoto Т., Togawa K., Higuchi R., Komori T. Constituents of Holothurioidae II. Six newly identified biologically active triterpenoid glycoside sulfates from the sea cucumber Cucumaria echinata II Liebigs Ann. Chem. 1990. P. 453-460.
65. Mian A.J., Percival E. Carbohydrates of the brown seaweeds Himanthalia lorea, Bijurcaria bijurcata and Padina pavonia. Part 1. Extraction and fractionation // Carbohydr. Res. 1973. V. 26. P. 133-146.
66. Moore A.E., Stone B.B., A p-l,3-glucan hydrolase fron Nicotiana glutinosa. II. Specificity, action pattern, and inhibitor studies // Biochim. Biophys. Acta. 1972. V. 258. P. 238-247.
67. Mori H. Nisizawa K. Sugar constituents of sulfated polysaccharides from the fronds of Sargassum riggoldianum H Bull. Jap. Soc. Sci. Fish. 1982. V. 48. P. 981-988.
68. Mori H., Kamei H., Nishide E., Nishidzawa K. Sugar constituents of some sulfated polysaccharides from the sporophyllus of wakame (Undaria pinnatifida) and their biological activities // Mar. Algae Pharm. Sci. 1982. V. 2. P. 109-115.
69. Muchmore A.V., Epel D., Weaver A.M., Schimke R.T. Purification and properties of an exo-p-(l-3)-glucanases from sea urchin eggs // Biochim. Biophys. Acta. 1969. V. 178. P. 551-560.
70. Nagumo T., Izima-Mizui N., Fujihara M. Separation of sulfated, fucose-containing polysaccharides from the brown seaweed Sargassum kjellmanianum and their heterogeneity and antitumor activity // Kitasato Arch. Exp. Med. 1988. V. 61. P. 59-65.
71. Nagumo T., Nishino T. Fucan sulfates and their anticoagulant activities // University of Sherbrooke. Quebes. Canada. 1997. P. 545-569.
72. Nelson T.E. A photometric adaptation of the Somogy method for the determination of glucose//J. Biol. Chem. 1944. V. 153. P. 375-381.
73. Nishino T., Kiyohara H., Yamada H., Nagumo T. An anticoagulant fucoidan from the brown seaweed Ecklonia kurome II Phytochemistry. 1991a. V. 30. P. 535-538.
74. Nishino T., Nagumo T., Kiyohara H., Yamada H. Structural characterization of a new anticoagulant fucan sulfate from the brown seaweed Ecklonia kurome II Carbohydr. Res. 1991b. V. 211. P. 77-90.
75. Nishino T., Takabe Y. Isolation and partial characterization a novel (3-D-galactan sulfate from brown seaweed Laminaria angustata var. longissima // Carbohydr. Polymers. 1994. V. 23 P. 165-173.
76. Okada H. Microbial utilization of renewable resources / Kinoshilia S., Bhumiranta A. Eds. Internat.center of cooperative research in biotechnology. Japan. 1991. P. 1-7.
77. Parenti G., Meroni G., Ballabio A. The sulfatase gene family If Curr. Opin. Genet. Dev. 1997. V. 7. P. 386-391.
78. Patankar M.S., Oehninger S„ Barnett T., Williams R. L„ Clark G.F. A revised structure for fucoidan may explain some of its biological activities // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 21770-21776.
79. Percival E. Algal polysaccharides // The Carbohydrates. (Chemistry and Biochemistry) / Eds. W. Pigman, D. Horton N.Y.: Acad. Press, 1970. V. IIB. P. 541-544.
80. Percival E., McDowell R.H. Chemistry and enzymology of marine algal polysaccharides. N.Y.-L.: Acad. Press. 1967. P. 53-71.
81. Percival E., Young M. Carbohydrates of the brown seaweeds. Part III. Desmarestia acttleata II Carbohydr. Res. 1974. V. 32. P. 195-197.
82. Piavaux A. Distribution and localization of the digestive laminarinases in animals // Biochem. Syst. Ecol. 1977. V. 5. P. 231-239.
83. Pitson S.M., Seviour R.J., Mcdougall B.M. Effect of carbon source on extracellular (1—>3)- and (1—>6)- beta-glucanase production by Acremonium persicinum II Can. J. Microbiol. 1977. V. 43. No. 5. P. 432-439.
84. Ponce N.M.A., Pujol C.A., Damonte E.B., Flores M.L., Stortz CA. Fucoidans from the brown seaweed Adenocystis utricularis extraction methods, antiviral activity and structural studies //Carbohydr. Res. 2003. V. 338. P. 153-165.
85. Privalova N.M., Elyakova L.A. Purification and some properties of endo-1—>3-p-D-glucanase from marine bivalve Chlamys albidus II Comp. Biochem. Physiol. 1978. V. 60B. P. 225-228.
86. Py B., Bortoli-German I., Haiech J., Chippaux M., Barras F. Cellulase egz of erwinia-chrysanthemi structural organization and importance of his98 and glu 133 residues for catalysis // Protein Eng. 1991.V. 4. P. 325-333.
87. Rao N.V., Sastry K.V., Rao E.V. Carbohydrates of Padinia tetrastomatica II Phytochemistry. 1984. V. 23. P. 2531-2534.
88. Rasburn M., Wynn C.H. Purification and properties of an isoenzyme of arylsulphatase from Aspergillus oryzae II Biochem. Biophys. Acta. 1973. V. 293. P. 191196.
89. Rouvinen J., Bergfors T., Teeri T., Knowles J.K., Jones T.A. Three-dimensional structure of cellobiohydrolase II from Trichoderma reesei // Science. 1990. V. 249. P. 380-386.
90. Roy A. B. Evaluation of sulfate esters and glucuronides by enzymatic means // Anal. Biochem. 1987. V. 165. P. 1-12
91. Sakai T., Takeshi S., Kimura A., Hitomi H., Kojima D., Kaoru S., Ikai B., Katsushige K., Akiyoshi N., Sumiko S., Nakanishi K., Kato I., Ikunoshin R. Endo-fucoidan-lyase. 2001. Patent No. 6277616. USA.
92. Sakon J., Adney W.S., Himmel M.E., Thomas S.R., Karplus P.A. Crystal structure of thermostable family 5 endocellulase El from Acidothermus cellulolyticus in complex with cellotetraose//Biochemistry. 1996. V. 35. P. 10648-10660.
93. Sakurai Y., Isobe K., Shiota H. Partial purification and some properties of an alkaline arylsulfatase produced by Aspergillus fungi //Agric. Biol. Chem. 1980. V. 44. P.1.7.
94. Schirmer A., Kolter R. Computational analysis of bacterial sulfatases and their modifying enzymes // Chem. Biol. 1998. V. 5. P.181-186.
95. Sinnott M.L. Catalytic mechanisms of enzymic glycosyl transfer // Chem. Rev. 1990. V. 90. P. 1171-1202.
96. Sova V.V., Elyakova L.A. Some aspects of the specificity and action pattern of P-1,3-glucan-glucanohydrolase from Spisula sachalinensis I I Biochem. Biophys. Acta. 1972. V. 258. P. 219-227.
97. Sova V.V., Elyakova L.A., Vaskovsky V.E. Purification and some properties of P-1,3-glucan glucanohydrolase from the crystalline style of bivalvia Spisula sachalinensis H it, Biochem. Biophys. Acta. 1970. V. 212. P. 111-115.
98. Sova V.V., Elyakova L.A., Vaskovsky V.E. The distribution of laminarinases in marine invertebrates // Comp. Biochem. Physiol. 1970. V. 32. P. 459-464.
99. Srisodsuk M., Reinikainen T., Teeri T.T. Role of the interdomain linker peptide of Trichoderma ressei cellobiohydrolase I in its interaction with crystalline cellulose // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 20756-20761.
100. Stubbs H.J., Brasch D.J., Emerson G.W., Sullivan P.A. Hydrolase and transferase activities of the p-1,3-exoglucanase of Candida albicans I I Eur. J. Biochem. 1999. V. 263. P. 889-895.
101. Suzuki M., Hori T., Kikuehi R., Ohnishi T. Purification of laminarinase from
102. Antarctic krill Euphasia superba II Nippon Suisan Gakkaihi. 1987. V. 53. No. 2. P. 311317.
103. Takahashi N., Egami F. Hydrolysis of polysaccharide sulphate esters by a sulphatase preparation from Charonia lampas II Biochem. J. 1961. V. 80. P. 384-386
104. Takeuchi K. Purification and characterization of exo-beta-l,3-glucanase from a hatching supernatant of Strongylocentrotus intermedius II Can. J. Biochem. Cell. Biol. 1983. V. 61. P. 54-62.
105. Turkiewicz M., Galas E., Zielinska M. Purification and partial characterization of an endo-(l-^3)-p-D-glucanase from Euphasia superba Dana (Antarctic krill) // Polar Biol. 1985. V. 4. P. 203-211.
106. Ueki T., Sawada Y., Fukagawa Y., Oki T. Arylsulfatase from Streptomycesgriseorubiginosus S980-14//Biosci. Biotechnol. Biochem. 1995. V. 59. P. 1062-1068.
107. Usui T., Asari K., Mizuno T. Isolation of highly purified «fucoidan» from Eisenia bicyclis and its anticoagulant and antitumor activities // Agric. Biol. Chem. 1980. V. 44. P. 1963-1966.
108. Uzawa H., Toba T., Nishida Y., Kobayashi K., Minoura N., Hiratani K. Convenient synthetic approach towards regioselectively sulfated sugars using limpet and abalone sulfatase-catalyzed desulfatation // Chem. Commun. 1998. P. 2311-2312.
109. Ward M., Wu S., Dauberman J., WessG., Larenas E., Bower B., Rey M., Oarkson K., Bott R. Trichoderma reesei cellulases and other hydrolases / Suominen P.,
110. Reinikainen T., Eds. Foundation for biotechnical and industrial fermentation research. Helsinki. 1994. P. 153-158.
111. Yamagata T., Saito H., Habuchi O., Suzuki S J. Purification and properties of bacterial chondroitinases and chondrosulfatases // Biol. Chem. 1968. V. 243. P. 15231535.
112. Yamamoto K., Tsuji Y., Kumagai H., Tochikura T. Induction and purification of a-L-fucosidase from Fusarium oxysporum H Agric. Biol Chem. 1986. V. 50. P. 1689-1695.
113. Zvelebil M.J.J., Sternberg M.J.E. Analysis and prediction of the location of catalytic residues in enzyme // Protein Eng. 1988.V. 2. P. 127-138.
114. Zvyagintseva T.N., Shevchenko N.M., Popivnich I.B., Isakov V.V., Scobun A.S., Sur^dukova E.V., Elyakova L.A. A new procedure for the separation of water soluble polysaccharides from brown seaweeds // Carbohydr. Res. 1999. V. 322. P. 32-39.
-
Кусайкин, Михаил Игоревич
-
кандидата биологических наук
-
Владивосток, 2003
-
ВАК 03.00.04
- О-гликозилгидролазы морских мицелиальных грибов
- Молекулярное клонирование и структурная характеристика эндо-1,3-β-D-глюканаз двустворчатых моллюсков
- Ферменты морских бактерий Pseudoalteromonas citrea, катализирующие деградацию полианионных полисахаридов бурых водорослей
- Влияние β-D-глюканов на развитие инфекционных заболеваний растений
- Выделение, физико-химические свойства и некоторые структурные характеристики бета-1,3-глюканазы из гриба Verticillium dahlie Kleb.
