Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Влияние β-D-глюканов на развитие инфекционных заболеваний растений
ВАК РФ 06.01.11, Защита растений
Автореферат диссертации по теме "Влияние β-D-глюканов на развитие инфекционных заболеваний растений"
На правах рукописи
ФЕДОРОВА Вера Яковлевна
ВЛИЯНИЕ Р-Б-ГЛЮКАНОВ НА РАЗВИТИЕ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ РАСТЕНИЙ
06.01.11 - защита растений
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Владивосток-2004
Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного Отделения РАН
Научные руководители:
доктор биологических наук, профессор А. В. Реунов доктор химических наук Т. Н. Звягинцева
Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук, академик РАСХН, профессор Е. П. Киселев
кандидат биологических наук Л. А. Лапшина
Ведущая организация: Приморский научно-исследовательский
институт сельскою хозяйства ДВО РАСХН
Защита состоится « 24 » декабря 2004 г. в 10 час. на заседании диссертационного совета Д 005.005.03 при Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, пр. 100 лет Владивостоку, 159
С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной библиотеке ДВОРАН
Автореферат разослан « 24 » ноября 2004 г.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук
О.И. Недашковская
I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Культивируемые растения подвергаются заболеваниям, вызываемым различными патогенами (грибами, бактериями, вирусами, вироидами и др.), что приводит к значительным потерям урожая. Поэтому снижение ущерба от заболеваний растений - одна из важнейших народно-хозяйственных задач.
При разработке стратегии защиты растений исследователи пытаются объединить все доступные методы борьбы с патогенами. Такой подход получил название интегрированной системы защиты растений. Наибольшее место в этой системе отводится использованию пестицидов и селекции устойчивых сортов. Однако применение пестицидов представляет серьезную угрозу для биосферы. Выведенные же высокоустойчивые сорта с.-х. культур, препятствуя развитию патогенов, в то же время оказывают на них мощное селекционное давление, что приводит к появлению новых более агрессивных форм возбудителей; таким образом, достигнутая устойчивость сортов является недолговечной (Рассел, 1982). Кроме того, устойчивые сорта часто оказываются малопродуктивными и сравнительно невысокого качества.
Все большее внимание исследователей привлекает возможность защиты растений, основанная на стимуляции их естественной устойчивости с помощью экологически безопасных биологически активных соединений (Метлицкий, Озерецковская, 1984; Елякова, 1995; Lyon et al., 1995). К таким соединениям относятся различные олиго- и полисахариды. Наибольшее внимание уделяется иммуномодулирующей способности глюканов, имеющих ß-конфигурацию глюкозидных связей. Подобные P-D-глюканы могут действовать как элиситоры, способные инициировать образование фитоалексинов и другие защитные механизмы (Дьяков и др., 2001). Наряду с индукторным глюканы могут обладать и супрессорным действием на иммунитет растений (Doke et al., 1980).
Необходимо подчеркнуть, что продолжительное время исследования по изучению иммуномодулирующей способности олиго- и полисахаридов проводились только на препаратах микробиального происхождения. В лаборатории химии ферментов ТИБОХ ДВО РАН путем ферментативного преобразования природных ß-D-глкжанов (из водорослей и других объектов) получены продукты, среди которых обнаружены вещества, обладающие иммуномодулирующими свойствами. Исследование влияния подобных веществ на иммунный статус растений представляется весьма перспективным, так как запасы морских водорослей в дальневосточных морях имеют промышленное значение.
Основная цель работы состояла в изучении влияния p-D-глюканов (пахимана из Ропа cocos, пустулана из Umbelhcaria russica, ламинаранов из Laminaria cichorioides, L. gurjanova, Fucus evanescens, а также глюканов I, II, III, IV и пустуланов I, II, III, IV, полученных в результате ферментативной трансформации ламинарана из L cichorioides и пустулана, соответственно) и преобразующих их у растений
I БИБЛИОТЕКА |
инфекционных заболеваний, вызываемых грибным патогеном РкуЩЫкога infestans, Х-вирусом картофеля (ХВК) и вироидом веретеновидности клубней картофеля (ВВКК).
Ставились следующие задачи:
1.Изучить иммуномодулирующие (элиситорные и супрессорные) свойства р-Б-глюканов на инфицированном фитофторой картофеле.
2.Исследовать действие р-Б-глюканов, а также эндоглюканаз на прорастание и жизнеспособность зооспор фитофторы.
3.Изучить влияние р-Б-глюканов на развитие инфекции, вызываемой в растениях-хозяевах ХВК.
4.Изучить влияние р-Б-глюканов на развитие инфекции, вызываемой в картофеле ВВКК.
5.Изучить корреляцию между устойчивостью растений к патогенам и активностью в них 1,3-р-О-глюканаз и хитиназ.
Научная новизна. Обнаружено, что препараты линейных р-Б-глюканов (пахимана и пустулана), а также глюкан II наиболее интенсивно стимулируют защитные реакции растений. р-Б-Глюканы с относительно невысокой степенью полимеризации и достаточным количеством разветвлений от основной цепи (ламинараны из Ь. cicкorioides и Л вуапеясвт; глюкан III; р-Б-глюкан из расы Р. infestans (совместимой с хозяином) обладают супрессорной активностью. Показано, что влияние исследуемых р-Б-глюканов на поражаемость вегетирующего картофеля зависит от их концентрации: обработка клубней либо опрыскивание клонов препаратами в низких концентрациях способствует поражаемости растений, а в более высоких - стимулирует защитные реакции растений. Впервые установлено, что ламинаран из Ь cicкorioides, а также глюканы I, III и пустулан III способствуют умеренной активации 1,3-р-Б-глюканазы в листьях всех ярусов табака и системному распространению ХВК. Ламинараны из Л. evanescens и Ь. ^г/атуа, глюканы II, IV и пустулан II значительно повышают активность фермента и число вирусных поражений в инокулированном вирусом листе, но слабо влияют на активность фермента в листьях верхних ярусов и замедляют распространение вирусной инфекции по растению. Получены данные, что активация 1,3-р-Б-глюканазы в листьях, расположенных выше инокулируемого ХВК, стимулирует транспорт вируса по растению. Впервые показано, что в процессе развития вироидного заболевания в листьях растений картофеля усиливается активность 1,3-р-Б-глюканазы и хитиназы и что существует корреляция между активностью 1,3-р-Б-глюканазы и степенью выраженности симптомов ВВКК. Впервые установлена возможность раннего выявления вироидной инфекции в картофеле с помощью P-D-глюканов. Впервые показано, что р-Б-глюканазы эндотипа действия (Ло, Ро) из морских моллюсков и экзо 1,3-р-Б-глюканаза (Ли) из наземного моллюска ингибируют прорастание зооспор и уменьшают длину гиф P. infestans. Установлена корреляция между устойчивостью растений к патогенам и активностью в них 1,3-р-Б-глюканаз >„> ■■ •. . , ; ; мио-',,,.;, :
' •** С О !
и хитиназ. Показано, что действие р-Б-глюканов на развитие фитофтороза и ВВКК в клубнях картофеля определяется структурой препаратов.
Практическая значимость. Выполненная работа расширила арсенал р-Б-глюканов, обладающих иммуномодулирующими (элиситорными и супрессорными) свойствами за счёт полисахаридов бурых водорослей. Исследования, проведенные нами в условиях природного резервуара инфекции Р. infestans, показали, что с помощью р-Б-глюканов И и IV, а также пустуланов I и II можно сдерживать быстрое развитие патогена на картофеле и, таким образом, получить более здоровый клубневой материал в полевых условиях. Показана возможность с помощью р-Б-глюканов выявлять вирусную и вироидную инфекцию в сравнительно ранние сроки, когда симптомы инфекции в полевых условиях еще не проявляются. Это позволило использовать исследуемые препараты для оздоровления инфицированного посадочного материала. Вся представленная в работе коллекция р-Б-глюканов может применяться в научных исследованиях различных учреждений. Несомненное практическое значение могут иметь ламинараны из бурых водорослей Ь. cichorioides и evanescens, широко распространённых на Дальнем Востоке.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на выездных сессиях РАСХН (Болыной-Камень, 1994; Хабаровск, 1995; Уссурийск, 1999); региональной конференции по защите растений (Владивосток, 1990), международной конференции, проведённой в Ботаническом саде-институте ДВО РАН (Владивосток, 1998); конференциях ТИБОХ ДВО РАН (Владивосток, 1993; 1998; 2001).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, экспериментальной части, заключения и выводов. Работа изложена на 135 страницах текста, включает 29 таблиц и 16 рисунков. Список литературы состоит из 172 наименований, из них 52 - на русском языке.
Автор выражает глубокую признательность научным руководителям д.х.н. Т.Н. Звягинцевой и д.б.н., профессору А.В. Реунову. Особую благодарность автор выражает д.х.н., профессору Л.А. Еляковой, своим коллегам В.В. Сова, Н.М. Шевченко и всей лаборатории химии ферментов ТИБОХ. Искреннюю признательность автор выражает коллегам из других научных учреждений: С А. Романовой, В.А. Ледневой (БПИ); В.И. Пищековой (ОП ВНИИФ); А.В. Уманец, Б.И. Уманец, Л.А. Новосёловой, А.К. Новосёлову, Т.В. Ильяшек (ПримНИИСХ); Б.Г. Анненкову, И.А. Толмачёвой (ДальНИИСХ).
Основные положения, выносимые на защиту:
1. р-Б-Глюканы из бурых водорослей и препараты, полученные из них ферментативной трансформацией, обладают иммуномодулирующей активностью.
2. р-Б-Глюканы могут использоваться для раннего выявления вирусной и вироидной инфекций.
3. Существует корреляция между устойчивостью растений к патогенам и активностью в них 1,3-р-Б-глюканаз и хитиназ.
П. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Ламинараны из L. cichorioides, L. gurjanova, F. evanescens; пустулан из лишайника U. russica, а также продукты их ферментативной трансформации были получены в лабораюрии химии ферментов ТИБОХ по методам Звягинцевой (Звягинцева и др., 1986, 1991, 1994, 1999). Депротеинизированный, деминерализованный хитин со степенью дезацетилирования 70% любезно предоставлен сотрудником ТИБОХ А.А. Артюковым. Карбоксиметилпахиман (КМП) приготовлен
карбоксилированием пахимана из P. cocos по методу (Clarke, Stone, 1962). Характеристики исследованных в работе p-D-глюканов представлены в табл. 1.
p-D-Глюканазы получены в лаборатории химии ферментов ТИБОХ. Ламинариназа Ло (эндо-1,3-р^-глюканаза, ЕС 3.2.1.39) и пустуланаза Ро (эндо-1,6-р^-глюканаза, ЕС 3.2.1.75) получены из кристаллического стебелька морского моллюска Chlamys albidus (Privalova et al., 1978; Rudakova et al., 1985). Эндо-1,3-р^-глюканаза Л„ выделена из морского моллюска Spisula sachalinemis по методу (Sova et al,. 1970), а ламинариназа Лп (экзо-1,3-р^-глюканаза, ЕС 3.2.1.58) - из пищеварительного тракта наземного моллюска Eulota maakii по методу Широковой (Широкова, 1985).
Определение активности 1,3-р^-глюканаз и хитиназ в тканях растений проводили в трех видах экстрактов (А, В и С), содержащих, соответственно, весь комплекс ферментов листа, вне- и внутриклеточные ферменты, по методам (Kombrink et al., 1988; Mauch, Staehclin, 1989).
В работе использовали следующие растения:
- районированные селекционные и коллекционные сорта картофеля (Solarium tuberosum L), выращенные в теплице, на опытных делянках Дальневосточной опытной станции ВИР (Владивосток); на опорном пункте ДВОС ВИР при ПримНИИСХ (с. Пуциловка); опорном пункте института фитопатологии ВНИИФ (п. Анива Сахалинской обл.); селекционных семенных участках ПримНИИСХ (с. Пуциловка Приморского края) и ДальНИИСХ (п. Восточный Хабаровского края);
- растения табака (Nicotiana tabacum L.) сортов Ксанти, Ксанти-нк, а также индикаторные растения гомфрены (Gomphrena globosa L.), скополии (Scopolia sinensis Hemsl.) и томатов сорта Rutgers, выращенные в теплице БПИ ДВО РАН.
Объектами исследований служили:
-истинные семена картофеля сортов Ора, Сантэ, Дальвас и семена гибридных линий, любезно предоставленные сотрудниками БПИ ДВО РАН и ПримНИИСХ;
- клубни картофеля с генами устойчивости Rl, R3, R 1,3, любезно предоставленные сотрудниками лаборатории фитоиммунитета Института биохимии РАН им. А.Н. Баха;
- семенные клубни селекционных районированных и коллекционных сортов, возделываемых в ПримНИИСХ, ДальНИИСХ и ВНИИФ;
Таблица 1.
Некоторые структурные характеристики р-Б-глюканов
Р-Б-глюканы Соотношение 1,3:1,6* Средняя степень полимеризации (СП)**
Пустулан (1,6-р-Э-глюкан) из и. твв^а 0:100 120
Пустулан 1 0:100 50-54
Пустулан II 0:100 37-42
Пустулан III 0:100 23-25
Пустулан IV 0:100 14-17
Ламинаран (1,3;1,6-р-Б-глюкан) из Ь cichorhides 90:10 25-30
Глюкан I 85:15 5-6
Глюкан II 80:20 10-14
Глюкан III 80:20 20-25
Глюкан IV 80:20 35-40
Ламинаран из Ь. gurjanova 97:3 20-25
Ламинаран из ¥. evanescens 60:40 20-25
Пахиман из Р. соо "МЬИ 98:2 250
Аубазидан из А ureoЪasidium ри11и1ат 55:35 5000
1,3;1,6-р-Э-глюкан из Р. infestans расы 1,4 88:12 18
1,3;1,6-р-Э-глюкан из Р. infestans расы 3,4 90:10 12
Примечание
Получен по методу (Звягинцева и др., 1986)
Получены действием на пустулан 1,6-р-Б-глюканазы Ро из С. albidus
Получен по методу (Zvyagintseva е1 а1., 1999)
Получены ферментативной трансформацией ламинарана Ло С. сМЫт (Звягинцева и др., 1995)
Получены по методу (Звягинцева и др., 1994)
Получены по методу (Звягинцева и др., 2002)
Получены по методу (Васюкова и др., 1987)
* Соотношение (3-1,3- и 1,6-глюкозидных связей определяли из 13С-ЯМР-спектров или метилированием (Звягинцева и др., 1995);
** СП - степень полимеризации фракций определяли концевым анализом (из соотношения количеств общих и восстанавливающих Сахаров, полученных методами фенол-сернокислотным и Нельсона, соответственно) или гель-проникающей хроматографией.
- ростки, снятые с проросших клубней сортов При-12 и Приекульский ранний;
- сеянцы и вегетирующие клоны различных сортов картофеля (выращенные в теплице БПИ и на опытных делянках ВИР).
Используемые патогены:
- фитопатогенный гриб Phytophthora infestans (Mont.) de Bary. Использовали расы патогена различных генотипов: 1,3; 3,4 и Белорусскую расу с большим набором генов вирулентности (l,2,3,4,5,6,(6:0),7,8,9,XYZ).
- сильнопатогенный штамм Х-вируса картофеля (Рейфман, Колесникова, 1973).
- вироид веретеновидности клубней картофеля. Источником ВВКК служили истинные семена, ростки и клубни картофеля с характерными симптомами вироида (Романова, 1996).
Действие p-D-глюканов и p-D-глюканаз на зооспоры P. infestans исследовали по методикам (Озерецковская и др. 1986; Бёттхер и др. 1987).
Влияние p-D-глюканов на защитные реакции тканей клубней картофеля против фитофтороза изучали по методике Озерецковской и др. (1986). Фитоалексин ришитин извлекали из тканей инфицированных дисков картофеля по методу (Keen, 1979). Подсчёт числа некротизированных клеток и оценку глубины (количество слоев клеток) проникновения гиф патогена в ткани дисков проводили иод микроскопом МБП-3 (Метлицкий и др. 1985). Опыты проведены в лаборатории фитоиммунитета Института биохимии РАН им. А.Н. Баха совместно с Н.И. Васюковой и Г.И. Чаленко.
Определение действия p-D-глюканов на защитные реакции вегетирующих растений картофеля проводили на клонах в стадии бутонизации на базе 0IIX Пуциловское. Уровень устойчивости клонов и клубней к фитофторозу, а также поражаемость клубней определяли в отделе картофелеводства ПримНИИСХ совместно с А.В. Уманец и Л.А. Новосёловой по методу Федотовой и Патрикеевой (1977).
Полевые опыты по изучению действия P-D-глюканов на уровень полевой устойчивости клонов при естественном развитии фитофтороза в условиях резервуара высоко агрессивных штаммов P. infestans проводили на опорном пункте ВНИИ фитопатологии (п. Анива Сахалинской обл.) на сортах Мавка и Нестеровский совместно с В.И. Пищековой по методам Быченковой, Попковой (1968) и Федотовой, Патрикеевой (1977).
Анализ развития вирусной инфекции на растениях табака и картофеля, проводили, используя методики (Мэтьюз, 1973). Серологический анализ выполняли с помощью антисывороток, предоставленных Р.В. Гнутовой (БПИ ДВО РАН). Серологические титры оценивали по бальной системе (Гнутова, 1985). Исследования проводили совместно с С.А.Романовой и В.А.Ледневой в лаборатории иммунохимии и биологии вирусов растений БПИ ДВО РАН.
Изучение действия p-D-глюканов на развитие вироидной инфекции в картофеле выполняли совместно с С.А. Романовой в теплице БПИ ДВО РАН и на опорном пункте ВИР (Владивосток) с 1992 по 1997 гг. Полевые
испытания проводили в течение четырёх лет (1997-2000 гг.) совместно с Б.Г. Анненковым на селекционных семенных участках ДальНИИСХ. Интенсивность развития вироидной инфекции оценивали в баллах (Можаева, Мелдрайс, 1989). Наличие вироида в образцах подтверждали электрофорезом в ПААГ и индикаторным методом на растениях скополии S. sinensis Hemsl. и томатов сорта Rutgers.
Статистическую обработку результатов проводили, используя методики Плохинского (1978) и Доспехова (1987). Доверительную вероятность принимали равной 0,95. В графических построениях применяли математическую обработку данных с помощью дисперсионного анализа, используя компьютерную программу «STRAZ».
III. ДЕЙСТВИЕ p-D-ГЛЮКАНОВ НА РАЗВИТИЕ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ РАСТЕНИЙ
При изучении действия полученных нами 1,3-, 1,6- и 1,3;1,6-p-D-глюканов на развитие инфекционных заболеваний растений-хозяев нами исследовалась и роль в патогенезе О-гликозилгидролаз (1,3-р^-глюканаз и хитиназ) растений, способных катализировать гидролиз полисахаридов.
Известно, что О-гликозилгидролазы растений являются возможными участниками защиты от патогенов, поэтому в ряде экспериментов исследовали связь между активностью ферментов и устойчивостью тканей. Установлена прямая корреляция между активностью О-гликозилгидролаз коллекционных сортов картофеля и степенью их полевой устойчивости к патогенам (рис. 1).
сорта картофеля сорта картофеля
Рис. 1. Активность внеклеточных P-D-глюканаз (А) и хитиназ (Б) в коллекционных сортах картофеля (1988 г.) с различной степенью полевой устойчивости: I группа - сильно поражаемые сорта: Dr.McIntoch (1), Auriga (2), Приекульский ранний (3); II группа - сорта со средней степенью устойчивости- Amsel (4), Филатовский (5), Темп (6), III группа -сорта с высокой степенью устойчивости: Frila (7), Невский (8).
Вырождение сортов картофеля сопровождается падением активности внеклеточных О-гликозилгидролаз. Полученные нами результаты согласуются с данными других авторов (Kombrink, Schmelzer, 2001), считающих эти ферменты маркёрами устойчивости.
Действие ß-D-глюканаз и В-Р-глюканов на зооспоры возбудителя фитофтороза. Исследовали действие на прорастание зооспор P. infestans эндо-1,3- и 1,6^^-глюканаз (Ло и Ро, соответственно) из С. albidus, эндо-1,3-глюканазы (Л„) из S. sachalinensis и экзо-1,3^^-глюканазы (Лп) из Е. maaki.
Показано, что все эти ß-D-глюканазы ингибируют развитие возбудителя фитофтороза. Наиболее эффективным действием обладала ламинариназа Ло, в присутствии которой уменьшались и количество проросших спор (почти в 5 раз), и длина гиф (в два раза). Сравнительное изучение действия этого фермента и близкого ему по специфичности показало, что Ло в большей степени ингибирует прорастание зооспор и уменьшает длину гиф. При действии ламинариназы Ло наблюдалось большое количество спор с лизированными оболочками, а гифы проросших спор имели неправильную форму: часто были искривлены, концы гиф расширялись и уплотнялись. В случае действия ламинариназы лизиса оболочек не отмечали. Это
свидетельствует о том, что Ло является более специфичной к глюканам Р. infestans. Пустуланаза Ро и ламинариназа Лц почти в равной степени уменьшали количество проросших спор. Смесь ферментов (Ро+Ло) уменьшала прорастние спор в 7 раз, а длину гиф проросших спор - в 4 раза.
Пустулан III и ламинаран сопоставимы по длине углеводной цепи (СП=25), но оказывают различное действие на развитие P. infestans. Ламйнаран ингибирует прорастание спор, но способствует увеличению длины гиф, а пустулан III, слабо уменьшая количество проросших спор, значительно, в сравнении с исходным пустулаиом, уменьшает длину гиф. В отличие от ламинарана, препараты 1,3;1,6^^-глюканов, полученные ферментативной трансформацией, в большей степени ингибировали длину гиф.
Действие ß-D-глюканов на развитие фигофтороза в тканях клубней картофеля. Показано, что действие ß-D-глюканов на развитие фитофтороза в клубнях картофеля определяется структурой препаратов. Линейные препараты 1,3- и 1,6^^-глюканов (пахимана и пустулана) стимулировали защитные реакции картофеля. Наибольший эффект оказывал пустулан, который наполовину уменьшал некротизацию клеток клубня и на 20% -глубину проникновения патогена в ткани клубня. Стимулировали защитные реакции клубней картофеля также 1,3;1,6^^-глюкан из расы P. infestans (несовместимой с хозяином) и подобный ему глюкан П.
1,3;1,6^^-Глюканы с относительно невысокой степенью полимеризации и достаточным количеством разветвлений от основной цепи ß-D-глюкана (ламинараны из F. evanescens и L. cichorioides; глюкан III; 1,3;1,6^^-глюкан из расы P. infestans, совместимой с хозяином) проявляли супрессорную акивность, способствуя глубокому проникновению гиф патогена в ткани клубней и увеличивая степень их поражения. Ламинаран из F. evanescens, содержащий 35-40% Р-1,6-связанных глюкозных остатков, имея одинаковую степень полимеризиции (СП=20-25) с практически линейным ламинараном из L gurianova, отличался более высокой иммуносупрессорной активностью.
По-видимому, присутствие р-1,6-связанных остатков глюкозы является необходимым условием для проявления полисахаридами супрессорного действия.
Влияние p-D-глюканов на устойчивость вегетирующего картофеля к фитофторозу. В исследованиях, проведенных нами в опытном хозяйстве Пуциловское ПримНИИСХ, осуществляли несколько вариантов обработки растительного материала растворами p-D-глюканов однократную предпосадочную обработку клубней, двукратное (с недельным интервалом) опрыскивание вегетирующих клонов, нанесение препаратов на листья с введением растворов в скважину под корень
Показано, что действие исследуемых p-D-глюканов на поражаемость вегетирующего картофеля зависит от их концентрации. Обработка клубней либо опрыскивание клонов всеми препаратами (за исключением глюкана IV), в низких концентрациях (0,02 мг/мл) способствовали поражаемости растений При увеличении концентрации препаратов (за исключением глюкана III) наблюдалось усиление защитных реакций растений против патогена и повышение урожайности. Значительным защитным действием обладали пустулан II и глюкан II, при обработке которыми ингибировалось спорообразование мицелия фитофторы и уменьшался диаметр некротических поражений на листьях при лабораторном заражении P. infestans.
Рис 2 Влияние двойной обработки ß-D-глкжанами (введение под корень - 0,1 мг/мл и опрыскивание вегетирующих клонов - 0,15 мг/мл) на развитие фитофтороза в инфицированных листьях картофеля Приекульский ранний в течение 2-х лет А, В -пустулан (П) и пустуланы II, III, IV, Б, Г - ламинаран (Л) и глюканы II, III, IV, К -контроль (вода). А, Б - первый год. В, Г - второй год исследований
Следует отметить, что стабильное защитное действие р-Б-глюканов особенно проявилось в следующем сезоне после обработки клубней всеми р-Б-глюканами (0,5 мг/мл), при этом индекс поражаемости ботвы уменьшался на 15-30%, а урожайность увеличивалась. В первый год исследований (1987 г.) урожайность повышалась до 135% (глюкан IV) и 131% (пустулан II), на следующий год, соответственно, до 122 и 118%.
Влияние двойной обработки вегетирующих клонов картофеля 1,6- и 1,3;1,6-р-Б-глюканами (нанесение препаратов на листья и введение растворов под корень) оказалось более действенным, значительно снижая поражаемость листьев клонов, особенно под влиянием пустулана И, глюканов II и IV (рис. 2).
На полях опорного пункта ВНИИ фитопатологии на юге острова Сахалин нами испытывалось действие р-Б-глюканов на развитие фитофтороза в клонах картофеля в условиях природного резервуара высоко агрессивных штаммов патогена.
Растворами р-Б-глюканов обрабатывали клубни и вегетирующие клоны двух сортов картофеля, один из которых (Мавка) имел Я-ген и проявлял признаки полевой устойчивости, а другой (Нестеровский) - обладал средней степенью полевой устойчивости.
Предпосадочная обработка клубней растворами р-Б-глюканов замедляла развитие инфекционного процесса. На ботве клонов сорта Мавка в течение 45 недель наблюдали слабое развитие фитофтороза - количество клонов с симптомами заболевания не превышало 2-13%. В контроле было поражено около 45% клонов. Глюканы II и IV, а также пустуланы I и II оказались способными сдерживать быстрое развитие патогена на растениях картофеля, что позволило с их помощью получить более здоровый клубневой материал в условиях природного очага инфекции. Другие препараты (ламинараны из Ь. cichorioides, L.gurianova и Л evanescens, глюкан I, пустулан III) при опрыскивании клонов усиливали поражение растений.
Влияние [¡-Р-глюканов на развитие вирусной инфекции. В опытах, проводимых на растениях табака сорта Ксанти-нк, листья 1-го или 2-го яруса за 24 либо 48 ч до заражения обрабатывали р-Б-глюканами, после чего листья 3-го или 4-го яруса инокулировали ХВК. В процессе развития инфекции изучали действие р-Б-глюканов на накопление вируса и развитие симптомов в инокулированных и выше расположенных листьях, а также на активность в них 1,3-р-Б-глюканазы. Глюканы I и III, судя по инфскционности, стимулируют накопление вируса в системно инфицированных листьях среднего яруса и способствуют увеличению в них активности 1,3-р-Б-глюканазы. Следует отметить, что в большей степени ХВК накапливался в растениях при использовании р-Б-глюканов в концентрации 0,5 мг/мл. Увеличение концентрации препаратов до 1 мг/мл заметно уменьшало накопление вируса в листьях (табл. 2)..
При исследовании влияния р-Б-глюканов на активность 1,3-р-Б-глюканазы в листьях в процессе развития инфекции установлено, что они могут быть разделены на две группы:
А - р-Б-глюканы, способствующие умеренной активации 1,3-р-Б-глюканазы в листьях всех ярусов (глюканы I и II, пустулан III, ламинаран из L. cichorioides);
Б - р-Б-глюканы, значительно повышающие активность 1,3-р-Б-глюканазы в инокулированном листе и слабо влияющие на активность фермента в листьях верхних ярусов (глюканы II и IV, пустулан II).
Таблица 2
Влияние р-Б-глюканов на инфекционность системно инфицированных ХВК листьев среднего яруса растений табака Ксанти и активность в них 1,3-
р-Б-глюканазы
p-D-глюканы Концентрация p-D-глюканов, мг/мл
0,5 1,0
Инфекционность* Активность 1,3-p-D-глюканазы в листьях среднего (4-го) яруса** Инфекци-онность* Активность 1,3-p-D-глюканазы в листьях среднего (4-го) яруса
Контроль (вода) 3 87,3 ±5,8 3 87,3 ±5,8
Глюкан I 25 163,3±14,7 8 114,1±10,6
Глюкан III 21 157,5±12,3 3,5 62,3±5,8
*выражена как среднее количество (из 30 листьев) локальных некрозов на листьях G. globosa; титрование проводилось на 6-е сут после заражения растения табака; **активность 1,3-р-Э-глюканазы на 7-е сут после заражения растений, выражена в пуаз 10-3сек-1 гр. листа-1.
Обработка растений табака p-D-глюканами группы А способствовала развитию симптомов заболевания и накоплению вируса в системно инфицированных листьях. Увеличение времени между обработкой растений препаратами и заражением ХВК до двух суток ускоряло появление симптомов. На инокулированных листьях через 5 сут после заражения формировались некротические поражения, а на системно инфицированных листьях верхних ярусов через 12 сут наблюдались мозаика, морщинистость и некротизация верхушки. Особенно такие симптомы были выражены после обработки растений глюканом III.
Отмеченная способность p-D-глюканов группы А усиливать распространение вируса по растению подтверждена при бессимптомном протекании инфекции ХВК в табаке сорта Ксанти при повышенной температуре (32-34°С). Наиболее активно в этом случае вирус накапливался в листьях растений при обработке пустуланом III и глюканом III. Наблюдаемая нами при обработке p-D-глюканами группы А корреляция между активацией 1,3-р-0-глюканазы в листьях, расположенных выше инокулируемого ХВК, и накоплением вируса в листьях верхних ярусов свидетельствует о возможном участии фермента в стимуляции вирусного транспорта по флоэме. Такая возможность подтверждается исследованиями других авторов (Beffa et al., 1996; Iglesias, Meins, 2000; Bucher et al., 2001),
выполненных на мутантных растениях табака дефицитных по 1,3-р-Б-глюканазе, в которых ингибировалось распространение инфекции, вызванной вирусом табачной мозаики. По мнению авторов этих работ, которое поддерживается нами, в заражённых вирусами растениях 1,3-р-Б-глюканаза катализирует гидролиз каллозных отложений в плазмодесмах и, таким образом, способствует распространению вируса по растению. Глюканы группы Б, слабо влияющие, в отличие от р-Б-глюканов группы А, на активность 1,3-р-Б-глюканазы в листьях верхних ярусов, но значительно повышающие ее активность в инокулированном вирусом листе, замедляли транспорт инфекции по растению. Можно предположить, что каждая группа р-Б-глюканов усиливала активность различных молекулярных форм 1,3-р-Б-глюканазы, обладающих в растениях специфическими функциями.
Для изучения влияния исследуемых препаратов р-Б-глюканов на развитие инфекции, вызываемой ХВК в картофеле, использовали клубни 5". demissum. Клубни (5 шт. в варианте) обрабатывали растворами р-Б-глюканов (0,5 мг/мл) и высаживали в теплице. Через две недели после появления всходов растения инфицировали ХВК, затем наблюдали симптомы заболевания и анализировали активность 1,3-р-Б-глюканазы. Во всех вариантах на молодых растениях картофеля первые признаки заболевания ХВК отмечали на 8-е сут после заражения в виде некрозов на инокулированных листьях. На контрольных растениях такие симптомы проявлялись значительно слабее. В этот период на верхних листьях развивались симптомы морщинистой мозаики, иногда с некрозами, но экспрессия симптомов в разных вариантах была различной.
Среди исследованных р-Б-глюканов пустулан II оказывал наименьшее влияние на развитие симптомов ХВК в листьях верхних ярусов. Глюкан II и ламинаран из Ь. cicкorioides активнее влияли на этот процесс. Наибольшую стимуляцию развития симптомов ХВК-индуцированной инфекции на картофеле вызывали глюканы I и III: первый способствовал образованию чётких кольцевых некрозов на верхних листьях растений, в некоторых случаях наблюдали верхушечные некрозы; под влиянием глюкана III таких некрозов было несколько меньше. Яркие симптомы морщинистой мозаики на всех опытных образцах после обработки глюканами I и III свидетельствуют об активном распространении вирусной инфекции по растению. Симптомы поражения ХВК на контрольных растениях были выражены значительно слабее.
Установлено, что выраженность симптомов, наблюдаемых на листьях верхних ярусов, коррелировала с активностью 1,3-р-Б-глюканазы в листьях средних ярусов. Таким образом, результаты, полученные на картофеле 5. demissum, соответствовали данным по влиянию р-Б-глюканов на развитие инфекции, вызываемой ХВК в растениях табака.
Способность р-Б-глюканов усиливать развитие симптомов вирусной инфекции на растениях была использована для анализа заражённого материала на наличие вирусов в картофеле, выращенном в полевых условиях. Растворами р-Б-глюканов (1 мг/мл) обрабатывали половинки
клубней картофеля сорта Невский, отобранные из клонов с симптомами смешанного вирусного поражения; контрольные половинки замачивали в воде. В результате проведенных анализов во всех исследуемых образцах выявлено три вируса: ХВК, S- и М-вирусы картофеля (SBK и МВК).
При первом серологическом анализе у двух опытных растений, клубни которых обрабатывались глюканом I, было выявлено (на неделю раньше, чем в других вариантах) наличие вирусов SBK и МВК с титром (+++); в контрольных растениях всех вариантов вирусы ещё не выявлялись. Через неделю в этом же варианте (глюкан I) выявили ХВК с титром (++); в контрольных растениях этого варианта титр ХВК был слабее (+). Во всех остальных вариантах ХВК был выявлен только через месяц после высадки клубней. В большинстве опытных клонов (9 из 10), выращенных из клубней, обработанных пустуланом III, глюканами I и III, обнаружены все три вируса (ХВК, SBK и МВК) с титрами (+++) и (++). В генетических контролях этих вариантов количество зараженных клонов не превышало 7-8. Действие ламинаранов из L. cichorioides и F. evanescens проявилось в усилении титров трёх вирусов, в сравнении с контролями, но количество инфицированных растений в контрольных и опытных вариантах было одинаковым. В образцах, обработанных глюканами I и III, проявление внешних симптомов смешанного вирусного инфицирования наблюдали одновременно с проведением третьего серологического анализа (через месяц после посадки).
Результаты серологического анализа подтвердили способность исследуемых препаратов влиять на развитие вирусной инфекции. На картофеле нами показана возможность с помощью ß-D-глюканов выявлять вирусную инфекцию в сравнительно ранние сроки, тогда как в полевых условиях внешние симптомы инфекции наблюдаются достаточно поздно. Это открывает возможность использовать ß-D-глюканы для оздоровления инфицированного посадочного материала.
Действие ß-D-глюканов на развитие вироидной инфекции и картофеле. Исследовали действие ß-D-глюканов на развитие вироидной инфекции в сеянцах картофеля, выращенных из истинных семян, ростков и клубней, снятых с клонов, инфицированных ВВКК. Изучали влияние ß-D-глюканов на активность О-гликозилгидролаз в листьях картофеля, инфицированного ВВКК. Оценивали возможность практического использования ß-D-глюканов для выявления инфицированного ВВКК материала в селекционных сортах картофеля, выращиваемого в условиях южных районов Приамурья.
Первые исследования по изучению влияния ß-D-глюканов на развитие вироидной инфекции были выполнены на сеянцах картофеля сортов Ора и Сантэ, выращенных из истинных семян, зараженных ВВКК. Получены данные, что при обработке семян препаратами на выращенных из них растениях первые симптомы ВВКК появлялись через 25 дней после появления всходов (табл. 3), когда среди контрольных образцов больных растений не наблюдалось. Следует подчеркнуть большой разрыв в сроках
появления первичных симптомов вироидной инфекции в опытных (36 сут) и контрольных (82 сут) образцах (табл. 3).
Таблица 3
Проявление симптомов ВВКК на сеянцах картофеля сорта Сантэ
Вещества Первые симптомы ВВКК, ДНИ* Соотношение больных и здоровых растений в каждом варианте
Раннее появление симптомов (3-4 нед) ** Позднее появление симптомов (10-11 нед)***
А Б(%) А Б(%)
Контроль 82 0/15 0 2/15 13
Кинетин 36 1/11 9 10/11 90
Пустулан II 36 2/11 18 2/11 18
Пустулан III 48 0/14 0 8/14 57
Глкжан1 36 3/19 16 13/19 68
Глюкан III 36 3/20 15 8/20 40
Глюкан IV 48 3/20 15 6/20 30
* Количество дней от высадки семян в грунт до появления первых симптомов заболевания вироидом; ** 3-4 нед от всходов до появления симптомов; *** 10-11 нед от всходов до появления симптомов. А - в числителе - количество растений с симптомами ВВКК, в знаменателе - общее количество выросших сеянпев; Б - количество больных растений в % от числа выросших сеянцев.
Проведённые опыты показали способность ß-D-глюканов стимулировать проявление симптомов вироидной инфекции при любых сроках и условиях выращивания сеянцев из заражённых ВВКК семян. Глюкан I способствовал появлению симптомов вироидной инфекции на очень молодых растениях чуть раньше (на 5-7 дней), чем пустулан II; под влиянием последнего наблюдали усиление признаков заболевания. Действие глюканов III и IV проявлялось в появлении на сеянцах в ранний период их развития первых признаков хлороза, некротического поражения жилок и деформации листьев. В дальнейшем эти симптомы усиливались. Необходимо было выяснить, какие структурные особенности молекул полисахаридов определяют их биологическую активность - длина углеводной цепи или тип связи в молекуле p-D-глюкана. Установлено, что максимальное количество больных растений выявляется с помощью ламинарана (СП я 23-27, ß-1,6 - 10%), глюкана III (СП « 20-25, ß-1,6 - 20%) и пустулана III (СП » 23-25, ß-1,6 -100%). Данные показывают, что для обнаружения ВВКК более существенной является длина углеводной цепи ß-D-глюкана, чем тип связи (ß-1,6 или ß-1,3) между остатками глюкозы. ß-D-Глюканы с небольшим числом глюкозных остатков - глюкан I и пустулан IV (СП « 5-6 и 14, соответственно) позволили выявить меньше больных растений, но в максимально короткие сроки - на первом месяце вегетации. ß-D-Глюканы, имеющие в цепи 20-25 глюкозных остатков, способствовали усилению транслокации вироидных частиц по
растениям и проявлению признаков заболевания ВВКК на большем количестве сеянцев, хотя и в более поздние сроки. Увеличение длины углеводной цепи глюкана (до СП=44) уменьшало появление больных растений в опыте (рис. 3).
степень полимеризации глюканов
Рис.3. Зависимость выявления симптомов ВВКК в ранние (А, Б) и поздние (В, Г) сроки развития сеянцев картофеля сорта Ора от степени полимеризации глюканов: А, В - 1,6-|3-О-глюканы из пустулана: а - пустулан ЩСП=14), о - пустулан III (СП=23), Д -пустулан II (СП=44); Б, Г - 1,3;1,6-Р-Б-глюканы из ламинарана: ■ глюкан I (СП=5), • - глюкан III (СП=25), А - глюкан IV (СП=35).
Таким образом, оптимальными для выявления наибольшего числа инфицированных растений можно считать р-Б-глюканы, имеющие степень полимеризации 20-25 глюкозных единиц. Тип связи в структуре молекулы р-О-глюкана не влиял на результаты опытов, так как изменение содержания (3-1,6-связанных глюкозных остатков от 10% в ламинаране до 100% в пустулане не увеличивало количества выявленных растений больных ВВКК. Следовательно, замена 1,6-связи на 1,3-связь не влияет на проявление симптомов ВВКК в сеянцах.
В серии экспериментов были проведены исследования по изучению влияния р-О-глюканов на развитие вироидной инфекции в растениях гибрида картофеля При-95, выращенных из истинных семян. Показано, что обработка истинных семян гибридных линий (№ 4, 13, 39, 61, 67, 73, 76, 93,113) раствором глюкана I способствовала проявлению на сеянцах симптомов ВВКК, в результате чего была выявлена высокая заражённость вироидом
исходных родительских образцов. Так, в контрольных сеянцах гибрида № 61 наблюдалось около 40% инфицированных растений, а в обработанных (р-Б-глюканами - 91%.
В дальнейшем объектами исследования служили ростки (глазки) и клубни картофеля различных сортов, взятые с клонов, инфицированных ВВКК. При выдерживании ростков сортов Приекульский ранний и При-12 в течение 48 ч в растворах р-Б-глюканов значительно увеличивалось количество выросших из них растений с симптомами (табл. 4).
Таблица 4
Влияние р-Б-глюканов на проявление симптомов ВВКК* в клонах картофеля, выращенных из ростков
р-Б-глюканы Сорта картофеля и концентрация р-Б-глюканов, мг/мл
Приекульский ранний При -12
0,2 0,2 0,4
Количество больных ВВКК растений, %
Контроль (вода) 40 12 20
Пустулан III 60 13 29
Пустулан 1У 43 14 17
Глюкан I 55 0 50
Глюкан III 67 14 43
Глюкан !У 60 10 20
* Процент больных растений из 10 клонов каждого варианта.
Повышение концентрации препаратов от 0,2 до 0,4 мг/мл в опытах, проводимых на сорте При-12, в 2-3 раза увеличивало количество растений с выраженными симптомами ВВКК.
В экспериментах, проводимых на клубневом материале, вначале использовали клубни неоздоровленного сорта Невский. После опрыскивания растворами 1,3;1,6-р-Б-глюканов (0,2 и 0,5 мг/мл), а контрольных - водой, клубни высаживали в вазоны в теплице в начале апреля. На опытных образцах симптомы ВВКК обнаруживались через 4-5 нед после появления всходов, тогда как на контрольных - на 2-3 нед позже (табл. 5). В полевых условиях стационара ВИР в пригороде г. Владивостока в течение трёх лет (1993-95 гг.) выращивали картофель этого же сорта, ранее оздоровленный от вирусов методом культуры ткани. Клубни перед высаживанием разрезали пополам, одну половинку опрыскивали растворами р-Б-глюканов в концентрации 0,1 или 0,2 мг/мл, другую - водой.
Известно, что оздоровленный от вирусов методом культуры апикальной меристемы посадочный материал не освобождается от ВВКК (Атабеков и
др., 1999). На клонах. первого года симптомов заболевания ВВКК не наблюдали: На второй год вегетации на опытных клонах отмечали характерные признаки «готики» (2-3 больных клона из 15).
Таблица 5
Влияние 1,3;1,6-р-Б-глюканов на проявление симптомов ВВКК на картофеле
сорта Невский*
р-Б-глюканы Концентрация р-Б-глюканов, мг/мл
0,2 0,5
Количество больных растений, % Интенсивность симптомов, балл Количество больных растений, % Интенсивность симптомов, балл
Контроль (вода) 7,4± 1,1 ++ 10,1±1.7 ++
Глюкан II 15,0±2,3 ++ 16,2±3,0 ++
Глюкан III 32,0±3,1 +++ 35,8+3,2 +++
Глюкан IV 26,5±2,6 +++ 33,3±2,7 +++
"Представлены результаты, полученные через 10 нед после высаживания клубней.
При этом на контрольных клонах симптомы наблюдались реже (1-2 клона) и были выражены слабее. Большее число клонов с суровыми симптомами ВВКК отмечено после обработки глюканом I в концентрации 0,2 мг/мл.
Выбраковку проводили по клубневому материалу, на следующий год высаживали только клубни без внешних признаков инфицирования ВВКК. Отмечено положительное влияние препарата пустулана IV на увеличение (на 11-20 %) урожайности во всех опытных вариантах в сравнении с контрольными образцами. Под влиянием глюкана I в концентрации 0,1 мг/мл урожайность снизилась на 5-9%. Увеличение концентрации препарата до 0,2 мг/мл повысило урожай на 25%.
Одновременно с исследованием влияния р-Б-глюканов на развитие вироидной инфекции в картофеле оценивали уровень О-гликозилгидролаз в здоровых и больных растениях. Установлено, что развитие инфекции сопровождается повышением активности 1,3-р-Б-глюканазы и хитиназы в тканях. Активность внутриклеточной 1,3-р-Б-глюканазы была в 6-8 раз выше, чем внеклеточной. В ранние сроки развития инфекции в листьях опытных клонов значительно увеличивалась активность 1,3-р-Б-глюканазы под влиянием глюкана I (рис. 5 А). В контрольном (обработанном водой) варианте к этому времени ещё не отмечали растений с признаками ВВКК. На более поздней стадии развития заболевания активность 1,3-р-Б-глюканазы в опытных образцах повышалась под действием препаратов, имеющих среднюю степень полимеризации (пустулан III и глюкан III), которые позволяли выявить максимальное количество больных ВВКК сеянцев (рис. 5, Б).
Выявлена прямая корреляция между степенью выраженности симптомов ВВКК и активностью 1,3-р-Б-глюканазы. Такая корреляция, вероятно, свидетельствует об участии фермента в транслокации вироида по растению.
р-О-глкжакы Р-1>глкжанм
Рис. 5. Активность 1,3-|3-В-глюканаз в сеянцах картофеля сорта Ора иод влиянием |3-Б-глюканов К- контроль (вода), 1- пустулан II, 2- пустулан III, 3- глюкан 1,4- глюкан III, 5- глюкан IV; А - при ранних (8 нед) и Б -поздних (14 нед) сроках появления симптомов ВВКК. 3 - здоровые растения, В - растения с признаками вироидного заболевания
На основании проведённых экспериментов нами предложен метод раннего выявления вироидной инфекции в растениях картофеля с целью выбраковки больных клонов, который был передан для внедрения в отдел биотехнологии ДальНИИСХ.
В серии полевых испытаний в 1997-1999 гг. были исследованы сорта хабаровской селекции Дальвас, Дедовик, Евгирия. Инфицированность ВВКК первых двух сортов не превышала 16-20%, тогда как сорт Евгирия был поражён вироидом на 35%. Благодаря использованию глюкана III для ранней выбраковки больных клонов на этапе сортоиспытания и размножения сортов очищенный от ВВКК посадочный материал оказался более продуктивным. В первые годы испытаний урожайность опытных образцов за исключением сорта Дедовик была ниже контроля, однако в 1999 году она увеличилась по сравнению с контролем и дала прибавку по сортам: Дальвас - 13,3 ц/га, Дедовик - 52,9 ц/га, Евгирия - 37,7 ц/га (табл. 6). Общее количество посевных площадей картофеля, обработанных препаратами 1,3;1,6-р-Б-глюканов, составляло 5,5 га (Акт внедрения прилагается).
В 1999-2001 гг. нами были проведены испытания действия р-Б-глюканов на перспективных для Приамурья сортах картофеля. В этих исследованиях подтверждена возможность различать здоровые и несущие ВВКК растения у новых сортов картофеля, посадочные клубни которых были обработаны растворами р-Б-глюканов. Показано, что в опытных вариантах всех исследованных сортов количество клонов с симптомами ВВКК и интенсивность заболевания их значительно возрастали (табл. 6).
Это позволило своевременно освободить полевые питомники от большей части инфицированных клонов и сохранить здоровые растения от перезаражения в процессе вегетации.
Таблица 6.
Влияние глюкана III на проявление симптомов ВВКК и интенсивность заболевания в клонах различных сортов картофеля
Показатели Варианты Сорта картофеля
Андроид Н-9 Сашэ Елизавета Петербуржец Романэ
Количество растений с симптомами «готики», % Контроль 2,5 13,8 12,0 20,0 15,0 16,3
Опыт 8,7 27,0 33,6 37,5 26,4 43,8
Интенсивность заболевания, балл Контроль 0,5 1,0 1,5 2,0 1,0 1,5
Опыт 15 2,5 3,0 3,0 2,0 3,0
По результатам полевых испытаний, проведённых отделом биотехнологии ДальНИИСХ, перспективы дальнейшего развития технологии оздоровления картофеля связываются нами с применением 1,3;1,6-р-Б-глюканов для обнаружения скрытой вироидной инфекции, как при отборе здоровых клонов, так и на этапе сортоиспытаний и размножения молодых сортообразцов.
ВЫВОДЫ
1. Исследовано действие р-Б-глюканов на развитие фитофтороза в клубнях и вегетирующих растениях картофеля. Препараты линейных р-Б-глюканов: пахимана, пустулана, а также 1,3;1,6-р-Б-глюкана из расы Р. infestans (несовместимой с хозяином) стимулируют защитные реакции хозяина. 1,3;1,6-р-Б-Глюканы с относительно невысокой степенью полимеризации и достаточным количеством разветвлений от основной цепи (ламинараны из L. cichorioides и F. evanescens; глюкан III, глюкан из расы Р. infestans (совместимой с хозяином) обладают супрессорной активностью. Действие исследуемых р-Б-глюканов на поражаемость вегетирующего картофеля зависит от их концентрации: низкие концентрации препаратов (кроме глюкана IV) ослабляют защитные реакции растений, увеличивая поражение; высокие концентраций препаратов (кроме глюкана III) усиливают защитные реакции растений против патогена и повышают урожайность. Наиболее выраженным защитным действием обладают пустулан II и глюкан IV.
2. В условиях природного резервуара инфекции P. infestans глюканы II и IV, а также пустуланы I и II сдерживают развитие патогена на картофеле, что позволяет с их помощью получить более здоровый клубневой материал.
Другие препараты (ламинараны из L. cichorioides, L.gurianova и F. evanescens, глюкан I, пустулан III) при опрыскивании клонов ускоряют поражение растений.
3. Развитие возбудителя фитофтороза ингибируется 1,3-р-Б-глюканазами эндо типа действия (Ло, Ли, Po) из морских моллюсков и экзо 1,3-ß-D-глюканазой Лп из наземного моллюска. Среди них фермент Ло наиболее эффективно ингибирует прорастание зооспор и уменьшает длину гиф Р. infestans. Это свидетельствует о том, что Ло является более специфичной к ß-D-глюканам P. infestans. Ламинаран и пустулан III, сопоставимые по длине углеводной цепи (СП~25), оказывают различное действие на развитие возбудителя фитофтороза. Ламинаран ингибирует прорастание спор, но способствует увеличению длины гиф, а пустулан III, слабо влияя на количество проросших спор, значительно уменьшает длину гиф. В отличие от ламинарана, 1,3;1,6^^-глюканы, полученные из него ферментативной трансформацией, ингибируют рост гиф.
4. Изучение действия ß-D-глюканов на вирусную инфекцию, вызываемую ХВК в растениях табака и картофеля, показало, что ламинаран из L. cichorioides, глюканы I, III и пустулан III способствовуют умеренной активации 1,3^^-глюканазы в листьях всех ярусов табака и системному распространению вируса. Ламинараны из F. evanescens и L gurjanova, глюканы II, IV и пустулан II значительно повышают активность фермента и число вирусных поражений в инокулированном листе, но слабо влияют на активность фермента в листьях верхних ярусов и замедляют распространение инфекции по растению. Показана возможность с помощью ß-D-глюканов выявлять вирусную инфекцию в сравнительно ранние сроки, когда внешние симптомы инфекции в полевых условиях наблюдаются достаточно поздно. Это позволяет использовать ß-D-глюканы для оздоровления инфицированного посадочного материала.
5. Выявлена корреляция между активацией 1,3^^-глюканазы в листьях табака и картофеля, расположенных выше инокулируемого ХВК, и накоплением вируса в листьях верхних ярусов, что свидетельствует о возможном участии фермента в стимуляции вирусного транспорта по флоэме.
6. Обнаружена корреляция между устойчивостью растений к патогенам и активностью в них 1,3^^-глюканаз и хитиназ, особенно локализованных в апопласте. Вырождение сортов картофеля сопровождается падением активности внеклеточных О-гликозилгидролаз.
7. Установлено, что исследованные ß-D-глюканы стимулируют проявление симптомов заболевания ВВКК в клонах картофеля и таким образом способствуют раннему выявлению вироидной инфекции. Анализ развития симптомов ВВКК при обработке 1,6- и 1,3;1,6^^-глюканами позволяет предположить, что для обнаружения данного патогена более важной является длина углеводной цепи ß-D-глюкана, чем тип связи (ß-1,6 или ß-1,3) между остатками глюкозы.
8. Развитие вироидного заболевания у растений картофеля сопровождается усилением активности 1,3-р-Б-гакжаназы и хитиназы. Выявлена корреляция между активностью 1,3-р-Б-гакжаназы и степенью выраженности симптомов ВВКК. Среди исследованных (ß-D-глюканов препараты, имеющие среднюю степень полимеризации (пустулан III и глюкан III), усиливают активность 1,3-р^-глкжаназы в опытных образцах и позволяют выявлять максимальное количество больных ВВКК растений. Использование ß-D-глюканов для ранней выбраковки больных вироидом клонов на этапе сортоиспытаний и размножения сортов картофеля позволило получить более продуктивный посадочный материал.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Rudakova (Fedorova) V.Ya., Shevchenko N.M., Elyakova L.A. Isolation and some properties ofendo-ß-D-glucanase from marine bivalve Chlamys albidus II Сотр. Biochem. Physiolog. 1985. V. 81B. N. 3. P. 677-682.
2. Елякова Л.А., Рудакова (Фёдорова) В.Я., Сундукова Е.В., Исаков В.В. Трансферазная активность эндо-1,3^^-глюканаз из кристаллических стебельков морских моллюсков // Химия природных соединений. 1986. №4. С. 469-471.
3. Звягинцева Т.Н., Елякова Л.А., Шевченко Н.М., Безукладников Н.В., Гончарова Е.В., Рудакова (Фёдорова) В.Я. Трансгликозилирование, осуществляемое эндо^-1,3- и 1,6-глюканазами, как метод энзиматического синтеза углеводов // 5-й Биохимический съезд. Киев, 1986. Вып. 1.С. 269-270.
4. Фёдорова В.Я., Звягинцева Т.Н., Волкова О.Н., Уманец А.В., Уманец Б.И. Поиск экологически безвредных веществ для защиты картофеля // Регуляторы роста и развития растений. Киев: Наукова Думка, 1988. С. 303.
5. Васюкова Н.И.,Озерецковская О.Л., Леонтьева Г.В., Чаленко Г.И., Елякова Л.А., Звягинцева Т.Н., Рудакова В.Я. Модуляция иммунного ответа к ß-глюканам в клубнях картофеля // Физиол. раст. 1989. Т. 36. С. 794-802.
6. Елякова Л.А,, Фёдорова В.Я., Сова В.В. Способ тестирования 1,3-ß-D-глюканазы в листьях картофеля // XIV Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. Ташкент, 1989. Т.1. С. 315-316.
7. Сова В.В., Фёдорова В.Я., Елякова Л.А. 1,3^^-Глюканазы картофеля. Действие ингибиторов // Селекционно-генетические, физиолого-биохимические и технологические аспекты интенсификации производства картофеля. Уфа, 1989. С. 106-108.
8. Елякова Л.А., Звягинцева Т.Н., Фёдорова В.Я., Широкова Н.И., Шевченко
H.М., Уманец А.В. Индукция ф-1,3-глюканаз картофеля под действием
I,3;1,6^^-глюкоолиго- и полисахаридов и других веществ // Селекционно-генетические, физиолого-биохимические и технологические аспекты интенсификации производства картофеля. Уфа, 1989. С. 92-94.
9. Фёдорова В.Я., Романова С.А., Елякова Л.А., Леднева В.А. Влияние полисахаридов на устойчивость сельскохозяйственных культур к вирусам
// Индуцированная устойчивость сельскохозяйственных культур к патогенам. Ростов-на-Дону, 1989. С. 23-24.
10.Фёдорова В.Я., Звягинцева Т.Н., Елякова Л.А. Уманец А.В., Уманец Б.И. Поиск в ряду 1,3;1,6^^-глюканов индукторов фитоиммунитета // Селекция, семеноводство и технология возделывания с/х культур в Приморье. Новосибирск, 1990. С. 67-69.
П.Фёдорова В.Я., Уманец А.В., Звягинцева Т.Н., Елякова Л.А. Роль биологически активных (ß-D-глюканов в иммунитете картофеля // Защита растений на Дальнем Востоке. Хабаровск, 1995. С. 138-147.
12.Фёдорова В.Я., Романова СА. Леднсва В.А.,Звягинцева Т.Н. 1,3; 1,6-ß-D-Глюканы - индикаторы скрытой вироидной инфекции // Растения в муссонном климате. Владивосток: Дальнаука, 1998. С. 139-141.
13.Фёдорова В.Я., Романова СА, Леднева ВА, Звягинцева Т.Н., Елякова Л.А. Действие ß-D-глюканов на вироидную инфекцию // Биотехнология. 1998. Т. 6. С. 62-68.
Н.Фёдорова В.Я., Романова С.А., Леднева В.А., Звягинцева Т.Н. Глюканы -активаторы вироидной инфекции // Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии. Владивосток, 1998. С. 26-27.
15.Фёдорова В.Я., Романова СА, Звягинцева Т.Н., Леднева ВА, Ильяшек Т.М., Анненков Б.Г. Практическое применение ß-D-глюканов в селекции картофеля на вироид веретеновидности клубней картофеля // Селекция и семеноводство сельскохозяйственных культур - основа подъёма сельского хозяйства Дальневосточного региона. Новосибирск, 2000. С. 43-52.
16.Анненков Б.Г., Глаз Н.В., Фёдорова В.Я. Использование трансглюканов для контрастирования инфекции вироида веретеновидности клубней на семенном картофеле // Науч. тр. ДальГАУ. «Пути воспроизводства плодородия почв и повышения урожайности сельскохозяйственных культур в Приамурье». 2000. Благовещенск. Вып. 5. С. 77 - 80.
17. Фёдорова В.Я., Романова СА, Анненков Б.Г Звягинцева Т.Н. Применение 1,3;1,6^^-глюканов в оздоровлении картофеля от вироида веретеновидности клубней // Биоактивные вещества их морских макро- и микроорганизмов и наземных растений Дальнего Востока. Владивосток, 2001.С. 202-204.
18.Анненков Б.Г, Толмачёва И.А., Фёдорова В.Я. Использование трансглюканов - супрессоров для контрастирования готики на картофеле и отбора клонов без ВВКК // Фитопатологическая обстановка, самозащита и химзащита сельскохозяйственных растений в Приамурье. Хабаровск, 2003.С.61-67.
19 Фёдорова В.Я., Романова С.А., Звягинцева Т.Н., Анненков Б.Г., Реунов А.В., Елякова Л.А. О возможности применения 1,3;1,6^^-глюканов бурых водорослей для раннего выявления вироидной инфекции в картофелебиология. 2004. № 5. С. 119-123.
Соискатель
Федорова Вера Яковлевна
ВЛИЯНИЕ в-Б-ГЛЮКАНОВ НАРАЗВИТИЕ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ РАСТЕНИЙ
АВТОРЕФЕРАТ
Подписано в печать с готовых диапозитивов 17 11 2004 Формат 60x84/16 Печать офсетная Усл печ л 0,87 Тираж 100 экз Заказ № 725
Отпечатано в типографии «Анастасия» 690041, г Владивосток, ул Бородинская, 20
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Федорова, Вера Яковлевна
ВВЕДЕНИЕ.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ (Характеристика взаимоотношений растений-хозяев с патогенами и модулирование инфекций p-D-глюканами).
2.1. Патогенные грибы и вызываемые ими заболевания.
2.2. Фитопатогенные вирусы и индуцируемые ими инфекции.
2.3. Вироидные заболевания.
2.4. Роль P-D-глюканов и преобразующих их ферментов в патогенезе растений.
2.4.1. Иммуномодулирующая активность P-D-глюканов.
2.4.2. 1,3-Р-О-Глюканазы и хитиназы растений.
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
3.1. Реагенты и субстраты.
3.2. Ферменты.
3.3. Основные аналитические методы.
3.4. Методы определение активности ферментов.
3.5. p-D-глюканы.
3.6. Растения.
3.7. Патогены.
3.8. Оценка действия P-D-глюканов на возбудителя фитофтороза и развитие вызываемой им инфекции в картофеле.
3.9. Определение действия p-D-глюканов на развитие вирусной инфекции.
3.10. Определение действия p-D-глюканов на развитие инфекции, вызываемой ВВКК.
3.11. Статистическая обработка результатов.43 '
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ (Действие P-D-глюканов на развитие инфекционных заболеваний растений).
4.1. О-гликозилгидролазы картофеля и табака.
4.1.1. Сравнительное изучение активности и специфичности действия О-гликозилгидролаз картофеля.
4.1.2. Влияние некоторых факторов на активность 1,3-Р-0-глюканаз и хитииаз в листьях табака и картофеля.
4.1.2.1. Зависимость активности О-гликозилгидролаз от возраста растительной ткани.
4.1.2.2. Полевая устойчивость сортов и активность 1,3-Р-Б-глюканаз.
4.1.2.3. Влияние условий выращивания на активность 1.З-Р-Б-глюканаз картофеля.
4.2. Влияние P-D-глюканов на активность О-гликозилгил^олаз в здоровых листьях картофеля.
4.3. Действие P-D-глюканов на возбудителя фитофтороза и вызываемую им инфекцию в картофеле.
4.3.1. Действие P-D-глюканов и P-D-глюканаз на зооспоры возбудителя фитофтороза.
4.3.2. Действие P-D-глюканов на развитие фитофтороза в тканях клубней картофеля.
4.3.3. Влияние P-D-глюканов па устойчивость вегетирующего картофеля к фитофторозу.
4.3.3.1. Выращивание картофеля в условиях опытного хозяйства.
4.3.3.2. Выращивание картофеля в условиях природного резервуара инфекции.
4.4. Влияние P-D-глюканов на развитие вирусной инфекции.
4.4.1. ХВК в растениях табака.
4.4.2. ХВК в растениях картофеля.
4.5. Действие P-D-глюканов на развитие вироидной инфекции в картофеле.
4.5.1. Влияние P-D-глюканов на развитие ВВКК в сеянцах картофеля, выращенных из истинных семян.
4.5.2. Влияние P-D-глюканов на развитие вироидной инфекции в растениях картофеля, выращенных из зараженных семян гибридов, ростков и клубней.
4.5.3. Влияние P-D-глюканов на активность О-гликозилгидролаз картофеля, инфицированного ВВКК.
4.5.4. Влияние p-D-глюкаиов на развитие вироидной инфекции в селекционных сортах картофеля.
Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Влияние β-D-глюканов на развитие инфекционных заболеваний растений"
Потребности в продуктах питания человек в основном удовлетворяет за счет растений. Однако культивируемые растения подвергаются заболеваниям, вызываемым различными вредителями и патогенами (грибами, бактериями, вирусами, вироидами и др.), что приводит к значительным потерям урожая. Поэтому снижение ущерба от заболеваний растений - одна из важнейших народно-хозяйственных задач.
При разработке стратегии защиты растений исследователи пытаются объединить все доступные методы борьбы с патогенами и вредителями. Такой подход получил название интегрированной системы защиты растений. Наибольшее место в этой системе отводится использованию пестицидов и селекции устойчивых сортов.
Однако применение пестицидов представляет серьезную угрозу для биосферы. Выведенные же высокоустойчивые сорта с-х культур, препятствуя развитию патогенов, в то же время оказывают на них мощное селекционное давление, что приводит к появлению новых более агрессивных форм возбудителей; таким образом, достигнутая устойчивость сортов является недолговечной (Рассел, 1982). Кроме того, устойчивые сорта часто оказываются малопродуктивными и сравнительно невысокого качества.
Для снижения ущерба от болезней растений некоторые исследователи предлагают использовать толерантные (выносливые) сорта (Рассел, 1982; Clarke, 1986), так как при всех их недостатках (растения могут служить резервуарами патогенов, приобретать повышенную чувствительность к другим болезням), они не оказывают, в отличие от устойчивых сортов, селекционного давления на патогены, что уменьшает вероятность появления сильнопатогенных форм (Рассел, 1982).
Все большее внимание исследователей привлекает возможность защиты растений, основанная на стимуляции их естественной устойчивости с I помощью биологически активных веществ (БАВ) (Метлицкий, Озерецковская, 1984; Елякова, 1995; Lyon et al., 1995). При этом к используемым БАВ-модуляторам устойчивости предъявляются требования экологической безопасности и способности благоприятно влиять на рост и развитие растений. Имеющиеся данные показывают, что таким требованиям, в частности, могут отвечать различные олиго- и полисахариды. Наибольшее внимание уделяется иммуномодулирующей способности глюканов, имеющих p-конфигурацию глюкозидных связей. Такие глюканы (чаще всего микробиального происхождения) могут действовать как индукторы (элиситоры), способные инициировать у растений образование фитоалексинов и другие защитные механизмы (Метлицкий, Озерецковская, 1984).
Наряду с индукторным глюканы могут обладать и супрессорным действием на иммунитет растений. Так, в мицелии и зооспорах совместимых рас возбудителя фитофтороза обнаружен супрессор (фракция низкомолекулярных 1,3-1,6-Р-О-глюканов), ингибирующий реакцию сверхчувствительности и образование фитоалексинов у,картофеля при его заражении несовместимыми расами того же гриба или при обработке индуктором (Doke et al., 1980). Вопросу о подавлении механизмов иммунитета и индуцировании восприимчивости растений посредством^ супрессорных молекул патогенов придается важное значение. Раскрытие таких механизмов создаст предпосылки для разработки перспективной стратегии защиты растений - блокированию механизмов, используемых патогеном для подавления устойчивости хозяина.
Необходимо подчеркнуть, что продолжительное время исследования-по изучению иммуномодулирующей способности олиго- и полисахаридов проводились в мире на препаратах микробиального происхождения. В лаборатории химии ферментов ТИБОХ ДВО РАН путем ферментативного преобразования природных P-D-глюканов (из водорослей и других объектов) получены продукты, среди которых обнаружены вещества, обладающие иммуномодулирующими свойствами.
Основная цель работы состояла в изучении влияния P-D-глюканов; (пахимана из Poria cocos, пустулана из Umbellicaria russica, ламинаранов из Laminaria cichorioides, L. gurjanova, Fucus evanescens, а также глюканов 1, II, III, IV и пустуланов I, II, III, IV, полученных в результате ферментативной трансформации ламинарана из L. cichorioides и пустулана, соответственно) и преобразующих их О-гликозилгидролаз на развитие у растений инфекционных заболеваний, вызываемых грибным патогеном Phytophthora infestans, Х-вирусом картофеля (ХВК) и вироидом веретеновидности клубней картофеля (ВВКК).
Ставились следующие задачи: I
1. Изучить иммуномодулирующие (элиситорные и супрессорные) свойства P-D-глюканов на инфицированном фитофторой картофеле.
2. Исследовать действие P-D-глюканов, а также эндоглюканаз на прорастание и жизнеспособность зооспор фитофторы.
3. Изучить влияние p-D-глюканов на развитие инфекции, вызываемой в растениях-хозяевах ХВК.
4. Изучить влияние p-D-глюканов на развитие инфекции, вызываемой в картофеле ВВКК.
5. Изучить корреляцию между устойчивостью растений к патогенам и активностью в них 1,3-р-О-глюканаз и хитиназ. I
Работа выполнена в лаборатории химии ферментов Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН под руководством д.х.н. Т.Н. Звягинцевой и д.б.н., профессора А.В. Реунова.
Заключение Диссертация по теме "Защита растений", Федорова, Вера Яковлевна
16. ВЫВОДЫ
• !
1. Исследовано действие p-D-глюканов на развитие фитофтороза в клубнях и вегетирующих растениях картофеля. Препараты линейных p-D-глюканов: пахимана, пустулана, а также 1,3;1,6-р-0-глюкана из расы Р. infestans 3,4 (несовместимой с хозяином) стимулируют защитные реакции хозяина. 1,3;1,6-р-0-Глюканы с относительно невысокой степенью полимеризации и достаточным количеством разветвлений от основной цепи (ламинараны из L. cichorioides к F. evanescens', глюкан III, глюкан из расы Р. infestans 1,4, совместимой с хозяином) обладают супрессорной активностью. Действие исследуемых p-D-глюканов на поражаемость вегетирующего картофеля зависит от их концентрации: низкие концентрации препаратов (кроме глюкана IV) ослабляют защитные реакции растений, увеличивая поражение; высокие концентраций препаратов (кроме глюкана III) усиливают защитные реакции растений против патогена и повышают урожайность. Наиболее выраженным защитным действием обладают пустулан II и глюкан IV.
2. В условиях природного резервуара инфекции P. infestans глюканы II и IV, а также пустуланы I и II сдерживают развитие патогена на картофеле, что позволяет с их помощью получить более здоровый клубневой материал. Другие препараты (ламинараны из L. cichorioides, L.gurianova и F. evanescen, глюкан I, пустулан III) при опрыскивании клонов ускоряют поражение I растений.
3. Развитие возбудителя фитофтороза ингибируется 1,3-Р-0-глюканазами эндо типа действия (JIo, JIIV, Ро) из морских моллюсков и экзо 1,3-p-D-глюканазой Ли из наземного моллюска. Среди них фермент До наиболее эффективно ингибирует прорастание зооспор и уменьшает длину гиф Р. infestans. Это свидетельствует о том, что Ло является более специфичным к P-D-глюканам P. infestans. Ламинаран и пустулан III, сопоставимые по длине углеводной цепи (СП~25), оказывают различное действие на развитие возбудителя фитофтороза. Ламинаран ингибирует прорастание спор, но способствует увеличению длины гиф, а пустулан III, слабо влияя на количество проросших спор, значительно уменьшает длину гиф. В отличие от ламинарана, 1,3;1,6-р-0-глюканы, полученные из него ферментативной трансформацией, ингибируют рост гиф.
4. Изучение действия P-D-глюканов на вирусную инфекцию, вызываемую ХВК в растениях табака и картофеля показало, что ламинаран из L. cichorioides, глюканы I, III и пустулан III способствовали умеренной активации 1,3-Р-0-глюканазы в листьях всех ярусов табака и системному распространению вируса. Ламинараны из F. evanescens и L. gurjanova, глюканы II, IV и пустулан II значительно повышают актйвность фермента и число вирусных поражений в инокулированном листе, но слабо влияют на активность фермента в листьях верхних ярусов и замедляют распространение инфекции по растению. Показана возможность с помощью P-D-глюканов выявлять вирусную инфекцию в сравнительно ранние сроки, когда внешние симптомы инфекции в полевых условиях наблюдаются достаточно поздно. Это позволяет использовать P-D-глюканы для оздоровления инфицированного посадочного материала.
5. Выявлена корреляция между активацией 1,3-Р-0-глюканазы в листьях табака и картофеля, расположенных выше инокулируемого ХВК, и накоплением вируса в листьях верхних ярусов, что свидетельствует о возможном участии фермента в стимуляции вирусного транспорта по флоэме.
6. Обнаружена корреляция между устойчивостью растений к патогенам и активностью в них 1,3-Р-0-глюканаз и хитиназ, особенно локализованных в апопласте. Вырождение сортов картофеля сопровождается падением активности внеклеточных О-гликозилгидролаз.
7. Установлено,, что исследованные P-D-глюканы стимулируют проявление симптомов заболевания ВВКК в клонах картофеля и таким образом способствуют раннему выявлению вироидной инфекции. Анализ развития симптомов ВВКК при обработке 1,6- и 1,3;1,6-Р-0-глюканами позволяет предположить, что для обнаружения: данного патогена более важной является длина углеводной цепи P-D-глюкана, чем тип связи (Р~ 1,6 или Р-1,3) между остатками глюкозы.
8. Развитие вироидного заболевания у растений картофеля сопровождается усилением активности 1,3-Р-0-глюканазы и хитиназы. Выявлена корреляция между активностью 1,3-Р-0-глюканазы и степенью выраженности симптомов ВВКК. Среди исследованных P-D-глюканов препараты, имеющие среднюю степень полимеризации (пустулан III и глюкан III), усиливают активность 1,3-Р-0-глюканазы в опытных образцах и позволяют выявлять максимальное количество больных ВВКК растений.
Использование P-D-глюканов для ранней выбраковки больных вироидом клонов на этапе сортоиспытаний и размножения сортов картофеля позволило получить более продуктивный посадочный материал.
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Представленная работа посвящена изучению влияния 1,6- и .1,3; 1,6-0-D-глюканов, полученных ферментативной модификацией полисахаридов из лишайника U. russica и бурой морской водоросли L cichorioides, на развитие инфекционных заболеваний растений, вызываемых возбудителем фитофтороза, Х-вирусом картофеля и вироидом веретеновидности клубней картофеля. Нами также исследованы О-гликозилгидролазы (1,3-0-D-глюканазы и хитиназы) растений - ферменты способные гидролизовать подобные полисахариды и участвующие (Leubner-Metzger & Meins, 1999, Bargabus et al., 2002) в патогенезе растений.
Проведенные исследования показали, что исследуемые нами 0-глюканы способствуют росту и развитию растений, и таким образом, удовлетворяют требованию экологической безопасности. Так, они стимулируют процесс прорастания истинных семян картофеля.
Проведен сравнительный анализ активности суммарных, вне- и внутриклеточных О-гликозилгидролаз в листьях картофеля. Выявлены две молекулярные формы 1,3-Р-О-глюканазы (I и II), проявляющие специфичность действия: одна из них более эффективно гидролизует субстрат карбоксиметилпахиман, другая - ламинаран.
Установлена корреляция между активностью О-гликозилгидролаз апопласта сортов картофеля и степенью их полевой устойчивости к Р. infestans. Вырождение сортов сопровождается падением активности внеклеточных гликаногидролаз.
Показано, что активность как вне-, так и внутриклеточных 1,3-Р-О-глюканаз, достаточно высокая в листьях среднего яруса зрелых растений, I уменьшается в выше расположенных листьях. Эти результаты согласуются с ранее полученными данными о том, что активность 1,3-P-D-глюканаз в зрелых листьях N. glutinosa L. выше, чем в молодых (Moor, Stone, 1972) и что уровни вакуолярной 1,3-Р-О-глюканазы из эпидермиса нижних листьев и корней растений табака имеют высокие значения, снижаясь по направлению к вершине растения (Keefe et. al., 1990). В связи с этим интересно отметить, что зрелые ткани растений обычно более устойчивы к грибным болезням (Рассел, 1982). I I
Нами получены данные, что в корнях 3-недельных растений табака О-гликозилгидролазы накапливаются в наибольшем количестве. Эти данные поддерживаются результатами Чеонга с соавторами (Cheong et al., 2000), которые, используя гистохимический анализ, выявили максимальную активность 1,3-Р-0-глюканазы в корнях 7-недельных растений табака. С учетом возможного участия О-гликозилгидролаз в устойчивости растений против грибных патогенов (Boiler, 1985; Дьяков и др., 2001), мы полагаем, что активность этих ферментов в корнях растений может быть критерием их устойчивости против фузариозов.
При изучении влияния P-D-глюканов на развитие фитофтороза в картофеле исследовали их действие как на зооспоры возбудителя, так и на защитные реакции растения.
Показано, что различные P-D-глюканазы эндо типа действия (Ло, Л|у, Ро) из морских моллюсков и экзо 1,3-р-О-глюканаза (Лц) из наземного моллюска в той или иной степени ингибируют развитие возбудителя фитофтороза.
Эндо пустуланаза Ро и экзо ламинариназа Лц почти в равной степени уменьшают количество проросших спор, хотя специфичность этих ферментов различна: Ро гидролизует только Р-1,6-связанные глюкозные остатки, а Лц катализирует последовательное отщег!ление остатков Р~ глюкозы только от невосстанавливающего конца молекул полисахарида. Ламинариназа Ло более значительно, чем Л|у (~ в 5 раз) уменьшает количество проросших спор и почти в два раза - длину гиф P. infestans. Это свидетельствует о том, что Ло является более специфичной к глюканам Р. infestans. Совместное действие двух ферментов (Ро+Ло) вызывало сильное ингибирование (в 7 раз) прорастания спор и уменьшение (в 4 раза) длины гиф проросших спор.
Пустулан III и ламинаран сопоставимы по длине углеводной цепи (СП~25), но оказывали различное влияние на прорастание и жизнеспособность зооспор фитофторы. Ламинаран уменьшал способность зооспор к прорастанию, но увеличивал их длину, а пустулан III, слабо снижая количество проросших спор, в большей степени уменьшал длину гиф чем, исходный пустулан. В отличие от ламинарана, 1,3;1,6-Р-0-глюканы, полученные из него методом ферментативной трансформации, значительно ингибировали рост гиф. .
Исследования, проведенные нами с использованием p-D-глюканов из двух различных источников (бурых водорослей и различных рас P. infestans), показали, что характер действия препаратов на развитие фитофтороза в клубнях картофеля определяется их структурными особенностями. Линейные препараты пахимана и пустулана, а также 1,3;1,6-р-0-глюкан из расы Р. infestans 3,4 (несовместимой с хозяином) и подобный ему по структуре глюкан II стимулировали защитные реакции хозяина. 1,3;1,6-р-0-Глюканы с относительно невысокой степенью полимеризации и достаточным количеством разветвлений от основной цепи P-D-глюкана (ламинараны из L. cichorioides и F. evanescens, глюкан III; 1,3;1,6-Р-0-глюкан из расы Р. infestans 1,4, совместимой с растением-хозяином) обладали супрессорной акивностью. Можно предположить, что супрессорная активность ламинаранов усиливается с увеличением числа р-1,6-связанных остатков глюкозы в молекуле.
В.- исследованиях, проведенных в полевых условиях (в опытном хозяйстве Пуциловское ПримНИИСХ) показано, что действие исследуемых P-D-глюканов на поражаемость вегетирующего картофеля: зависит от их концентрации. Обработка клубней либо опрыскивание клонов низкими концентрациями препаратов (кроме P-D-глюкана IV) увеличивали поражение растений. Повышение концентрации препаратов усиливало защитные реакции растений против патогена и увеличивало урожайность. Наиболее выраженным защитным действием • обладали пустулан II и P-D-глюкан IV. Максимальный защитный эффект достигался при двойной обработке вегетирующих клонов 1,6- и 1,3;1,6-Р-0-глюканами (нанесение препаратов на листья и введение растворов под корень).
Нами также проведены, исследования по испытанию действия P-D-глюканов в условиях природного очага инфекции P. infestans (на полях опорного пункта ВНИИ фитопатологии на юге острова Сахалин) на двух сортах картофеля, один из которых (Мавка) имел R-ген и проявлял признаки полевой устойчивости, а другой (Нестеровский) - обладал средней степенью полевой устойчивости. Было показано, что глюканы II и IV, а также пустуланы II и I сдерживают быстрое развитие патоген^ на картофеле. Это позволило с их помощью получать более здоровый клубневой материал в i • i полевых условиях. Другие препараты (ламинараны из L. cichorioides, L.gurianova и F. evanescen, P-D-глюкан 1, пустулан III) при опрыскивании клонов ускоряли поражение растений.
Величина полученного урожая после обработки P-D-глюканами была ниже, чем в контроле, но клубни опытных вариантов оказались более здоровыми, чем контрольные, особенно у сорта Мавка. При предпосадочной обработке клубней урожай был здоровым на 70-85%, а при опрыскивании клонов - на 60 %;. В урожае контрольных вариантов клубни были поражены фитофторозом более чем наполовину. Только после обработки ламинараном из F. evanescens сорта Нестеровский в урожае наблюдали значительное количество клубней с симптомами фитофтороза. Глюканы II и IV, а также пустуланы II и I оказались способными сдерживать быстрое развитие патогена на растениях картофеля в условиях природного очага инфекции.
Таким; образом, использование P-D-глюканов в, условиях природного резервуара инфекции P. infestans на двух сортах: картофеля, имеющих I различную степень полевой устойчивости к фитофторозу, подтвердило результаты, наших лабораторных исследований. Некоторые P-D-глюканы способны сдерживать быстрое развитие патогена, что может способствовать получению с их помощью более здорового клубневого материала.
Исследование влияния p-D-глюканов на развитие инфекции, вызываемой' Х-вирусом! картофеля, проводилось нами на системно поражаемых хозяевах - растениях табака и картофеля. По действию исследованных препаратов на развитие инфекции в растениях табака они были подразделены нами на две группы:
А - P-D-глюканы, способствующие умеренной; активации 1,3-P-D I глюканазы в листьях всех ярусов (глюканы I и III, пустулан III, ламинаран из L. cichorioides)
Б - P-D-глюканы, значительно повышающие активность 1,3-p-D-глюканазы в инокулированном вирусом листе и слабо влияющие на активность фермента в листьях верхних ярусов (ламинараны из F. evanescens и L. gurjanova, глюканы II и IV, пустулан II).
Такие характеристики P-D-глюканов коррелируют с развитием симптомов ХВК инфекции на листьях разных ярусов табака:
I I
- p-D-глюканы группы A - способствовали развитию признаков заболевания на листьях верхних ярусов, т.е. ускоряли транслокацию вируса в растении;
- P-D-глюканы группы Б - чаще индуцировали многочисленные некротические поражения на инокулированных листьях и замедляли распространение вирусной инфекции по растению.
Сочетание активации 1,3-Р-О-глюканазы под действием p-D-глюканов с проявлением ярких симптомов инфекции на листьях верхних ярусов свидетельствует о возможном участии фермента в стимуляции вирусного транспорта по растению. Такая возможность подтверждается исследованиями'других авторов (Beffa et al., 1996; Iglesias, Meins, 2000; Bucher et al., 2001), выполненных на мутантных растениях табака дефицитных; по 1,3-Р-0-глюканазе, в которых ингибировалось распространение инфекции, вызванной вирусом табачной мозаики. По мнению этих авторов, которое нами поддерживается, в зараженных зирусами растениях 1,3-р-О-глюканаза катализирует гидролиз каллозных отложений в плазмодесмах, способствуя системному распространению инфекции. Отмеченная способность p-D-глюканов усиливать распространение вируса по растению подтверждена нами в экспериментах по изучению бессимптомно протекающей ХВК-индуцированной инфекции на табаке Ксанти при повышенной температуре (32-34°С).
В серии экспериментов проводили исследования по изучению влияния исследуемых препаратов P-D-глюканов на развитие инфекции, вызываемой ХВК в картофеле S. demissum. Установлено, что на картофеле, также как и на табаке, глюканы I, III и ламинаран из L. cichorioides способствовали более активному развитию симптомов заболевания ХВК. Высокая активность 1,3-P-D-глюканазы в листьях среднего яруса коррелировала с выраженностью симптомов, наблюдаемых на листьях верхних ярусов. Показана возможность с помощью p-D-глюканов выявлять вирусную инфекцию в сравнительно ранние сроки, тогда когда внешние симптомы инфекций b полевых условиях: наблюдаются достаточно поздно. Это открывает возможность использовать P-D-глюканы для оздоровления инфицированного посадочного материала.
Ряд экспериментов был выполнен нами на картофеле с использованием серологического анализа, с помощью которого, были выявлены три вируса:
SBK, МВК и ХВК. Используя для обработки клубней пустулан III, глюканы I и III, удалось выявить среди выращенных клонов большее (чем в контроле) количество растений, зараженных этими вирусами. Действие ламинаранов из L. cichorioides wF. evanescens проявилось в усилении титров трёх вирусов, но количество инфицированных растений в контрольных и опытных вариантах было одинаковым.
Исследования по изучению влияния препаратов на развитие вироидной инфекции в картофеле были начаты в теплице БПИ ДВО РАН на сеянцах картофеля сортов Ора и Сантэ, выращенных из истинных семян, собранных с зараженных ВВКК растений. Наличие вироида в материале предварительно определяли серологическим и индикаторным методами, а также электрофорезом в ПААГ.
• ■ I
Проведённые опыты показали, что P-D-глюканы стимулируют появление симптомов вироидной инфекции при любых сроках и условиях выращивания сеянцев из заражённых ВВКК семян. Наиболее важным свойством препаратов является их способность вызывать проявление внешних симптомов заболевания ВВКК в очень ранние сроки развития растений. Глюкан I стимулировал появление симптомов инфекции на очень молодых растениях чуть раньше, чем пустулан II, действие которого больше проявлялось в усилении признаков заболевания растений. Обработка глюканами III и IV в начальный период наблюдений вызывала на сеянцах слабые признаки хлороза, некроза жилок и деформации листьев. В дальнейшем эти симптомы усиливались. Максимальное количество больных растений было выявлено с помощью ламинарана, глюкана III и пустулана III, хотя и в более поздние сроки.
Анализ проявления симптомов ВВКК при обработке 1,6- и 1,3;1,6-P~D-глюканами позволяет предположить, что для обнаружения данного патогена более существенным показателем является длина углеводной * цепи P-D-глюкана, чем тип связи (Р-1,6 или. (3-1,3). Таким образом, оптимальными для выявления наибольшего числа инфицированных растений можно считать Р-D-глюканы, имеющие степень полимеризации 20-25 глюкозных единиц. Уменьшение или увеличение длины углеводной цепи P-D-глюкана не стимулировало выявление максимального количества больных вироидом растений. Тип связи в структуре молекулы P-D-глюкана не влиял на результаты опытов, так как изменение содержания Р-1,6-связанных глюкозных остатков от 10% в ламинаране до 100% в пустулане не увеличивало количество выявляемых больных растений
Выявленная выше способность глюкана I ускорять проявление симптомов ВВКК была использована для обнаружения вироида в семенах ! гибрида картофеля При-95, полученных в ПримНИИСХе. Была проведена серия экспериментов на растениях, выращенных из истинных семян гибридных линий (№ 4, 13^ 39, 61, 67, 73, 76, 93, 113); обработанных раствором глюкана I. Отмечено усиление симптомов: ВВКК на гибридных сеянцах, проявляющихся на большей части растений. Обработка истинных семян гибридных линий картофеля растворами глюкана I обеспечила возможность быстрого освобождения посадок от больных растений и выявления относительно здорового гибридного материала, который можно затем проверить дополнительны ми методам и.
Данные эксперимента по обработке ростков растворами. P-D-глюканов соответствовали результатам, полученным на истинных семенах.
Показано, что в процессе развития вироидного заболевания на растениях картофеля усиливается активность 1,3-Р-О-глюканазы. Выявлена корреляция между активностью 1,3-Р-О-глюканазы и степенью выраженности симптомов; ВВКК. Среди исследованных P-D-глюканов выделяются препараты, имеющие среднюю степень полимеризации (пустулан III и глюкан III), усиливающие активность Г,3-р-0-глюканазы в опытных образцах и позволяющие выявлять максимальное количество больных ВВКК сеянцев.
Тот факт, что максимальное количество сеянцев с симптомами ВВКК и усиление активности 1,3-Р-О-глюканазы в них наблюдались после обработки
• ■-' I семян препаратами P-D-глюканов (пустуланом III и глюканом: III), имеющими среднюю степень полимеризации (СП=23-25), свидетельствует об участии? 1,3-Р-О-глюканазы в развитии инфекционного процесса.
Результаты проведённой работы открывают возможность использования P-D-глюканов для раннего выявления вироидной инфекции и выбраковки больных растений. Это является важным, так как своевременное удаление больных клонов с поля и тщательная выбраковка клубней перед посадкой в настоящее время являются основными профилактическими мероприятиями, препятствующими распространению патогена. Использование препаратов p-D-глюканов ускорит первичную выбраковку и будет способствовать улучшению селекции новых сортов картофеля, проведению её на качественно новом уровне.
Предложенный нами метод выбраковки инфицированных вироидом растений картофеля был внедрён в отделе биотехнологии Дальневосточного научно-исследовательского института сельского хозяйства (ДВНИИСХ).
По результатам полевых испытаний, проведённых отделом биотехнологии ДальНИИСХ, перспективы дальнейшей оптимизации технологии оздоровления картофеля связываются с применением 1,3; 1,6-p-D-глюканов для выявления скрытой вироидной инфе;кции, как при отборе исходных клонов, так и при испытании меристемных и ростковых линий.
Использование P-D-глюканов ускоряет первичную выбраковку больных растений и позволяет проводить отбор лучших здоровых образцов в группу потенциальных родителей или потенциальных клонов, которые дополнительно могут быть исследованы с помощью чувствительных молекулярно-биологических методов. Это поможет селекционерам получать освобождённый от ВВКК исходный материал, что будет способствовать улучшению селекции новых сортов.
Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Федорова, Вера Яковлевна, Владивосток
1. Е.И., Можаева К.А., Васильева Т.Я., Кастальева Т.Б. Методические указанияпо диагностике вироида веретеновидности клубней картофеля. М.: ВНИИФ. 1. МГУ. ВНИИКХ. 1999. 24 с.
2. Бёттхер И., Ветцель Т., Древе Ф.В., Кеглер X., Науманн К., Фрайер Б.,
3. Фраунштейн К., Фукс Э. Методы определения болезней и вредителейсельскохозяйственных растений. М.: Агропромиздат, 1987. 224 с.
4. Билай В.И., Гвоздяк Р.И., Скрипаль И.Г., Краев В.Г., Элланская И.А.,' ^ Зирка Т.И., Мурас В.А. Микроорганизмы - возбудители болезней растений.
5. Киев: Наукова думка, 1988. 552 с. ' ,
6. Бойко А.Л., Ильченко О.И., Рубан В.И., Дикова И.Г. Взаимодействиебелка вируса крапчатости гвоздики с некоторыми моносахаридами //
7. Микробиол. ж. 1993. Т. 55. 37-41.
8. Быченкова А.А., Попкова К.В. Ускоренный метод оценки полевойустойчивости картофеля к фитофторозу // Картофель и овощи. 1968. № 8. 40-42.
9. Васюкова Н.И,, Озерецковская О.Л., Леонтьева Г.В., Чаленко Г.И.,
10. Елякова Л.А., Звягинцева Т.Н., Широкова Н.И. Различия в структуре (3глюканов двух рас возбудителя фитофтороза // Биоорган, химия. 1987. Т. 13. 1. 825-832.
11. Васюкова Н.И., Чаленко Г.И1, Валуева Т.А., Герасимова Н.Г., Панина^^ Я.С, Озерецковская О.Л. Регуляция иммунных ответов картофеля ламинараном // Прикл. биохимия и микробиол. 2003. Т. 39. № 6. 697-702.
12. Гнутова Р.В. Иммунологические исследования в фитовирусологии. М.:1. Наука, 1985. 184
13. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта (с основами статистическойобработки исследований). М.: Агропромиздат, 1985. 351 с.
14. Дорохов Ю.Л., Карпова О.В., Калинина Н.О., Иванов К.И., Фролова
15. О.Ю., Самуилова О.В., Родионова Н.П., Атабеков И.Г. Кодируемыетобамовирусами транспортные белки подавляют трансляцию геномных вирусных РНК ш vitro //Докл. АН. 1996. Т. 349. 259-261.
16. Дьяков Ю.Т., Озерецковская О.Л., Джавахия В.Г.0б1цая и молекулярная' ^ фитопатология. М.: Общество фитопатологов, 2001. 302 с. 1. А ^
17. Елякова Л.А., Лапшина Л.А., Реунов А.В., Можаева К.А, Защитное'W действие р-1,3;1,6-глюкана "антивира", полученного ферментативной трансформацией ламинарана на растениях табака против вируса табачной мозаики//Докл. РАН. 1994. Т. 336. N 5. 710-711.
18. Елякова Л.А. Регуляция р-1,3;1,6-глюканами растительного и животногоиммунитетов. Энзиматический синтез новых иммуностимуляторов // Вестник
19. ДВО РАН. 1995. № 2. 74-85.
20. Журавлев Ю.Н. Фитовирусы в целом растении и в модельных системах.1. М.: Наука, 1979.247 с.
21. Звягинцева Т.Н., Елякова Л.А., Сундукова Е.В., Мищенко Н.П.
22. Кривощёкова О.Е. Способ получения пустулана//А.с. №1227199. Опубл. БИ№ 16. 1986.
23. Звягинцева Т.Н., Елякова Л.А., Сундукова Е.В. Способ полученияламинаринаУ/А.с. №1642725. Опубл. БИ№ 14. 1991.
24. Звягинцева Т.Н., Елякова Л.А. Специфичность и механизм действияэндо-1—*3-Р-0-глюканаз из морских моллюсков // Биоорган. химия. 1994. Т. 200.453-474. ' '
25. Звягинцева Т.Н., Широкова Н.И., Елякова Л.А. Структура ламинарановиз некоторых бурых водорослей // Биоорган, химия. 1994. Т. 20. 13491358.
26. Звягинцева Т.Н., Елякова Л. А., Исаков В.В. Ферментативноепревращение ламинаранов в 1,3;1,б-Р-0-глюканы, обладающие иммуностимулирующим действием // Биоорган, химия. 1995. Т. 21 № 3.. 218-225.
27. Звягинцева Т.Н., Беседнова Н.Н., Елякова Л.А. Структура ииммунотропное действие 1,3;1,6-р-В-глюканов. Владивосток: Дальнаука, 2002. 160 с. • ,
28. Ильинская Л.И,, Васюкова Н.И., Озерецковская О.Л. Биохимическиеаспекты индуцированной устойчивости и восприимчивости растений. М.:
29. ВИНИТИ. Итоги науки и техники, сер. Защиты растений. 1991. Т. 7. 194 с.
30. Кастальева Т.Б., Можаева К.А., Писецкая Н.Ф., Романова А.,
31. Трофимец Л.Н. Вироид веретеновидности клубней и оздоровление картофеля// Вестник РАСХН. 1992. № 3. 22-24.
32. Караваева К.А. Некротизацация тканей и локализация ришитина принесовместимом взаимодействии картофеля и возбудителя фитофтороза //
33. Биохимия хранения картофеля, овощей и плодов. М.: Наука, 1990. 50-55.»i^
34. Киселёв Е.П., Новосёлов A.K. Селекция и семеноводство картофеля на
35. Дальнем Востоке, Части I, II. 2001. Хабаровск, 326 с.
36. Леонтьева Ю.А. Веретеновидность клубней (готика) - одно из основныхвирусных заболеваний картофеля в Поволжье // Автореф. дисс.,..д-ра биол. наук. Пушкин. 1971. 43 с.
37. Максимов В.И. Роль трансгликозилирования в деградации олиго- иполисахарадов // Успехи совр. биол. 1980. Т. 89. 41-57.
38. Метлицкий Л.В., Озерецковская О. Л. Биохимия иммунитета растений кинфекционным болезням // Биохимия иммунитета, покоя^ старения растений. 1. М.: Наука. 1984. 9-40.
39. Метлицкий Л.В., Озерецковская О. Л. Как растения защищаются отболезней. М.: Наука, 1985. 192 с,
40. Можаева К,А., Мелдрайс Я.А. Сравнительное изучение различныхметодов диагностики ВВККУ/Биол. науки. 1989. В. 6. 104-105.
41. Можаева К.А., Васильева Т.Я. Вироидные болезни растений: ВНИИ1. ТЭИСХ.М.: 1985,60 с.
42. Озерецковская О.Л., Васюкова Н.И., Леонтьева Г.В., Чалова Л.И.,
43. Чаленко Г.И., Юрганова Л.А., Карапетян Т.Е., Метлицкий Л.В. Факторрасовой специфичности Phytophthora infestans (Mont.), dQ Baiy // Изв. АН
44. СССР. сер. Биол. 1982. Т. 6. 853-866. |
45. Озерецковская О.Л. Индуцирование устойчивости растений биогеннымиэлиситорами фитопатогенов // Прикл. биохимия и микробиол. 1994. Т, 30. JST». 3 325-339.
46. Озерецковская О.Л., Васюкова Н.И., Чаленко Г.И., Герасимова Н.Г,,
47. Гришанина А,Н., Хромова Л,Я., Яковлева Г.А., Варламов В.П.. Скрябин K.F.
48. Индуцирование фитофтороустойчивости у клубней трансгенного картофеля// Прикл, биохимия и микробиол. 2002. Т. 38. № 5. 552-555.
49. Плохинский Н.А. Математические методы в биологии. М.: МГУ, 1978.265 с.
50. Попкова К.В. Фитофтора картофеля. М.. Колос, 1972. 176 с.
51. Рабинович М.Л,, Клёсов А.А„ Березин И,В. 1^инетика действияцеллюлолитических ферментов из Geotrichum candidum.
52. Вискозиметрический анализ кинетики гидролиза карбоксиметилцеллюлозы //
53. Биоорганическая химия, 1977. Т. 3. № 3. С, 405-414,
54. Рассел Г,Э. Селекция растений на устойчивость к вредителям иболезням, М.: Колос, 1982, 267 с.
55. Реунов А.В; Вирусный патогенез и защитные механизмы растений.
56. Владивосток. Дальнаука, 1999. 175 с.
57. Реунов А.В., Лапшина Л.А., Нагорская В.П., Елякова Л.А. Подавление1,3;1,6-|3-0-глюканом инфекций, вызванных Х-вирусом картофеля, в листьях гомфрены и дурмана// Физиол. раст. 2000. Т. 47. 240-243.
58. Романова А., Можаева К.А., Рейфман В.Г., Леднева В.А. Вироидверетеновидности клубней картофеля на Дальнем Востоке // Проблемы фитовирусологии на Дальнем Востоке. Владивосток. 199^. 41-46.
59. Рымарева Е.В. Роль клеточных стенок растения-хозяина и:экзополисахаридов возбудителя кольцевой гнили картофеля на детерминантной стадии патогенеза // Автореф. дис... канд. биол. наук. 1. Иркутск. 2001.
60. Сибирякова И.И., Коротаева Г.. Романова А.. Гнутова Р.В.
61. Электрофоретическое выявление вироида веретеновидности клубнейкартофеля // -Х. биол. 1999. № 5. 88-90. '
62. Синицын А.П., Черноглазов В.М.. Гусаков А.В. Методы изучения исвойства целлюло-литических ферментов «Биотехнология» // Итоги науки и техники АН СССР. М.: 1990. 59-61.
63. Сова В.В., Светашева Т.Г., Елякова Л.А. Изучение р-1,3 глюканазкартофеля - возможных участников защиты растений от патогенов //
64. Биохимия. 1996. Т. 61. Вып. 3. 514-523.
65. Тарр Основы патологии растений. М.: Мир. 1975. 587 с.
66. Тарчевский И:А. Патоген-индуцируемые беки растений // Прикл.биохимия и микробиол. 2002. Т. 37. № 5. 517-532.
67. Федотова Т.И., Патрикеева М.В. Фитопатологические работы приселекции картофеля на устойчивость к фитофторе. Методические указания. 1977. Ленинград. 50 с.
68. Феофилова Е.П. Клеточная стенка грибов. М,: Наука. 1983. 248 с.
69. Чалова Л.И. Новый фитоалексин картофеля - любимин // Автореф.дис.канд. биол. наук. М.: 1971. 25с.
70. Шелудько Ю.М., Рейфман В.Г. Вироиды - новый класс патогенов. М.:1. Наука, 1978.87 с. • :- ,
71. Широкова Н.И. Полиферментная система Ь-1®3-глюканаз из моллюска
72. Eulota maakii: свойства, специфичность и механизм действия отдельныхкомпонентов //Автореф. дис... канд. хим. наук. 1985. Владивосток. 26 с.
73. Эльберсхейм П., Дарвилл A.F. Олигосахарины7/ В мире науки. 1985. №11.G. 16-23.
74. Abeles, F.B., Bosshart, R.P., Forrence, L.E., Habig, W.H, Preparation andpurification of glucanase and chitinase form bean leaves // Plant Physiol. 1971. V. 47. P. 129-134.
75. Atabekov J.G. Host specificity of plant viruses // Ann. Rev. Phytopathol.1975. V. 13. P. 127-145.
76. Atabekov J.G., Dorokhov Y.L. Plant virus-specific transport function andresistance of plants to viruses // Adv. Virus Res. 1984. V. 29. P. 313-364.
77. Atabekov J.G., Taliansky M.E. Expression of a plant virus-coded transportfunction by different viral genomes // Adv. Virus Res. 1990. V. 38. P. 201-248.
78. Batricki-Garcia S. Chemistry of hyphal wall of Phytophthorae II J. Gen.
80. Bargabus R.L. Characterisation of systemic resistance in sugar beet elicitedby a non-pathogenic, phyllosphere-colonizing Bacillus micoides, biological control agent // Physiol. Mol. Plant Pathol. 2002. V. 61. P/ 289-298..
81. Beffa R.S., Hofer R.M., Thomas M., Meins F.Jr. Decreased susceptibility toviral disease of P-l,3-glucanase-deficient plants generated by antisense transformations // Plant Cell. 1996. V. 8 N. 6. P. lOOl-lOM.' I
82. Beffa R.S., Meins F.Jr. Pathogenesis-related functions of plant p-1,3glucanase investigated by antisense transformations: A review // Gene. 1996. V. 179.N.1. P. 97-103.
83. Bohn J.A., BeMiller J.N. 1—>3-p-D-Glucans as biological response modifiers:a review of structure-functional activity relationships. // Carbohydr. Polymers. 1995. V. 28. P. 3-14.
84. Boiler T. Ethylene and the Regulation of Antifungal Hydrolases in Plants //
85. Oxford Surveys Plant Mol. Cell Biol. 1988. V. 5. P. 145-174.н 1. glucanase // Developments in Plant Pathology. 1993. P. 391-400.
86. Branch A.D., Robertson H.D. A replication cycle for viroids and other smallinfectious RNA's // Science. 1984. V. 223. P. 450-455.
87. Burton R.A., Qi Z., Roulin S., Fincher G.B. Gene stioicture and a possiblecytoplasmic location for (I—*3)-P-glucanase isoenzyme СГ from barley {Hordeum vulgare) II Plant Sci. 1998. V. 135. P. 39-47.
88. Bucher G.L., Tarina C , Heinlein M., Serio F.D., Meins: F., Iglesias v.A. Localexpression of enzymatically active class I (3-1,3-glucanase erihances symptoms of
89. TMV infection in tobacco // Plant J. 2001. V. 28.1. 3. P. 361-369.
90. Burketova L., Sindelarova M., Sindelar L. Benzothiadiazole es an inducer ofbeta-1,3-glucanase and chitinase isozymes in sugar beet // Biol. Plantarum. 1999. 1. V. 42. P. 279-287.
91. Castresana C., de Carvalho F., Gheysen G., Habert M., Inse D., Van Montagu
92. M. Tissue specific and pathogen-induced relation of a Nicotiana plumbagmifolia
93. P-l,3-glucanase gene //Plant Cell. 1990. V. 2. N. 12. P. 1131-1144.'
94. Cheong Y.H., Kim C.Y., Chun H.J., Moon B.C., Park H.C., Kim J.K., Lee S
95. H., Han C-d,, Lee S.Y., Cho M.J. Molecular cloning of a soybean class III p-1,3glucanase gene that is regulated both developmental ly and response to pathogen infection // Plant Sci. 2000. V. 154. P. 71-81. : : I
96. Churngchow N., Suntaro A., Wititsuwannnakul R. P-1,3-Glucanase isozymesfrom the latex of Яеуеа brasiliensis II Phytochemistry. 1995. V. 39. N. 3. P. 505509.
97. Citovsky v. , Knorr D., Schuster G., Zambryski P. The P30 movement proteinof tobacco mosaic virus is a single-strand nucleic acid binding protein // Cell. 1990. V. 60. P. 637-647.
98. Clark A.E.,. Stone B.A.p-l,3-Glucan hydrolase from the grape vine (Vitisv/wZ/erflf) and other plants//Phytochemistry. 1962. V. l .P . 175-188.
99. Clarke D.D. Tolerance of parasites and disease in plants and its significance inhost-parasite interactions // Adv. Plant Pathol. 1986. V. 5. P.' 161-197.
100. Culver J.N., Stubbs G., Dawson W.O. Structure-function'relationship betweentobacco mosaic virus coat protein and hypersensitivity mNicotianasylvestris II i.
101. Molec. Biol. 1994. V. 242. N. 1. P. 130-138.
102. Cuypers В., Hahlbrock К. Immunohistochemical studies of compatible and incompatible interaction of potato leaves with Phytophthora infestans and of the non w ^ 7005. \/':\
103. Davis E., MacLachlan G.A. Effect of indoleacetic acid on intracellulardistribution of P-l,3-glucanase activities in the pea epicotyl // Arch. Biochem.
105. Davies J.W., Kaesberg P., Diener Т.О. Potato spindle tuber viroid. XII. Aninvestigation of viroid RNA as a messenger for protein synthesis // Virology. 1974. 1. V. 61.N. 1. P. 281-286.
106. Diener Т.О., Raymer W.B. Potato spindle tuber virus: a plant virus withproperties of a free nucleic acid//Science. 1967. V. 158. P. 378-381.
107. Diener Т.О. Potato spindle tuber "virus". IV. A replicating low molecularweight RNA // Virology. 1971. V. 45. P. 411-428. . ,
108. Diener Т.О., Smith D.R. Potato spindle tuber viroid.'IK. Molecular-weightdetermination by gel a electrophoresis of formylated RNA // Virology. 1973. V. 53. N. 2. P. 359-365.
109. Diener Т.О. Viroids and viroid diseases. NewYork, Toronto: A Wil.
111. Diener Т.О. Viroids // Adv. Virus Res. 1983. V 28. P. 241-283.
112. Diener Т.О., Hammond R.W., Black Т., Katze M.G. Mechanism of viroidpathogenesis: Differential activation of the interferron-induced, double-stranded
113. RNA-activated, Mr 68000 protein kinase by viroid strains of varying pathogenicity// Biochem. 1993. V. 75. P. 533-538.
114. Doke N., Tomiyama K. Suppression of the hypersentivity of suppressorsreleased during the germination of Phytophthora infestans cystospores //
115. Phytopathology. 1980. V. 70. P. 35-39.
116. Domingo C , Conjero v . , Vera P. Genes encoding acidic and basic class III1,3-P-glucanase are expressed in tomato plants upon viroid infection // Plant Moh
118. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K. Colorimetric method for determinationof sugars and related substances // Anal. Chem. 1956. V. 28. P. 350-356.
119. Gross HJ., Domdey H., Lossow C , Jank P., Raba M., Alberty H., Sanger
120. H.L. Nucleotide sequence and secondary structure of potato spindle tuber viroid //
122. Gulyas A., Farkas G.L. Is cell-to-cell contact necessary for the expression ofthe N-gene in Nicotiana tabacum cv. Xanthi nc. plants! infected by TMV //
123. Phytopathol. Z. 1978. Bd. 91. H. 2. S. 182-187. ; ^ '
124. Hultin E. and \¥апп1оф I. Viscosimetric Determination of Cellulase Activityin the Intestine of the Sea Urchin: Reaction Mechanism and Equilibrium Constant for Cellulase Stabilization // Acta Chem. Scand. 1966. V. 3. P. 2667-2677.
125. Jones R.L. Gibberelic acid - enhanced release of 1,3-P-glucanase from barleyaleuroneceel/ZPlantPhysiol. 1971. V. 47. P. 412-416. • \
126. Kang Z., Buchenauer H. Immunocytochemical localisation of I,3-P-glucanaseand chitinase in Fusarium culmorum — infected wheat spikes // Physiol. Mol. Plant
128. Kauffman S., Legrand M., Geoffroy P., Fritig B, Biological function ofpathogenesis-related proteins: four PR priteins of tobacco have 1,3-P-gIucanase activity // EMBO J. 1987. V. 6. P. 3209-3212.
129. Keeffe D., Hinz U., Meins F.Jr. The effect of ethylene on the cell-typespecific and intracellular localization of 1,3-p-glucanase and chitinase in tobacco leaves // Planta. 1990. V. 182. P. 43-51.
130. Keen N.T. The molecular biology of disease resistance // Plant Mol. Biol.1992. V. 19. N. 1. P. 109-122. • ;, ,
131. Keen N.T. Evalution of the role of phytoalexins. Plant disease control.
132. Resistance and susceptibility. New York: Wil.-Interscience Publ., 1979. 155 p.
133. Keenan P., Bryan I.B., Friend J. The elicitation of the hypersensitativeresponse of potato tuber tissue by a component of the culture filtrate Phytophthora infestans II Physiol. Plant Pathol. 1985. V. 26. P. 343- 355.
134. Kiho Y., Shimomura T. Binding of tobacco mosaic virus to membranematerial isolated from tobacco leaves // Japan J. Microbiol. 1976. V. 20. P. 537541. о * seedings of pearl millet in response to infection by Sclerospora graminicola II
135. Europ. J. Plant Pathol. 2000. V. 106. P. 267-274.
136. Kitazawa K., Inagaki H., Tomiyama K., Cinephotomicrographic observationon the dynamic responses of protoplasm of a potato plant cell to infection by
137. Phytophthora infestans II Phytopathoi. Z. 1973. Bd. 26. S. 80-86.
138. Kombrink E., Schroder M., Hahlbrock M. Several "pathogenesis-related"proteins in potato are P-l,3-glucanases and chitinases // Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1988. V. 85. P. 782-786. : ^ ,
139. Kombrink E., Somssich I.E. Defense responses of plant to pathogens //
140. Advances in Plant Pathology. London: 1995. V. 21. P. 1-34.
141. Kombrink E., Somssich I.E. Pathogenesis-related proteins and plant defence //
142. Mycota. V. 5. Part A, Plant relationships. Berlin: Springer-Verlag, 1997. P. 107128.
143. Kombrink E., Schmelzer E. The hypersensitive response and its role in localand systemic disease resistance // Europ. J. Plant Pathol. 2001. V. 107. N; 1. P. 6978.
144. Alternaria solani and may function as an elicitor release mechanism // Physiol.
145. Raton, FL. 1999. P. 49-73.1.rito M., Woo S.L., D'Ambrosio M., Harman G.E., Hayes O.K., Kubicek
146. Pathol. 1995. V. 47. N. 6. P. 419-428.1.on G.D., Reglinski Т., Newton A.G. Novel disease control compounds: the potential to "immunize" plants against infection // Plant Pathol. 1995. V. 44. P. 407-427.
147. Martin W.H. "Spindle tuber", a new potato trouble.- Hints to potato growers //
148. NEW Jersey State Potato Assoc. 1922. V. 1. P. 8-17.
149. Matthews R.E.F. Plant virology. Second edition. New York, London, Toronto,
150. Sydney, San Francisco: Acad. Press. 1981. 897 p.
151. Mauch F., Hadwiger L.A., Boiler T. Antifungal hydrolases in pea tissue. I
152. Purification and characterization of two chitinases andf'tlwo P-I,3-glucanasesdifferentially regulated during development and in response to fimgal infection //
153. Plant Physiol. 1988a. V. 87. P: 325-333.
154. Mauch F., Mauch-Mani В., Boiler T. Antifungal hydrolases in pea tissue. II1.hibitor of fungal growth by combination of chitinase and p-l,3-glucanases //
155. Plant Physiol. 1988b. V. 88. P. 936-942.
156. Mauch F., Staehelin L.A. Functional Implications of the Subcellular1.calization of Ethylene-Induced Chitinase and p-l,3-Glucanase in Bean Leaves //
157. Plant Cell. 1989. V. 1. P. 447-457.
158. Meins F., Neuhaus J.M., Sperisen C , Ryals J. The primary structure of plantpathogenesis-related glucanohydrolases and their genes //Genes Involve in Plant
159. Defence. New York. Springer. 1992. P. 245-282. :^ •' |
160. Metraux J.P., Boiler T. Local and systemic induction of chitinase in cucumberplants in response to viral, bacterial and fungal infections // Physiol. Mol. Plant
162. Moor A.L. and Stone B.A. The occurrence of a P-1,3-glucan hydrolase inplant of Nicotiana glutinosa in hormonal and pathological states// Proc. Federat.
163. Eur. Biochem. Soc. 1968. P. 182-185. :. :' I
164. Moor A.L. and Stone B.A Effect of infection with TMV and other viruses onthe level of a P-1,3-glucan hydrolase in plant of Nicotiana glutinosa II Virology. 1972a. V. 50. P. 791-798.
165. Moor A.E., Stone B.A. A P-1,3-glucan hydrolase from Nicotiana glutinosa. И
166. Specificity, action pattern and inhibitor studies // Biochim. Biophys. Acta. 1972b.1. V. 258. P. 248-264.
167. Mittler R., Lam E. Identification, characterization, and purification of atobacco endonuclease activity induced upon hypersensitive response cell death //
168. Plant Cell. 1995. V. 7. N. 11. P. 1951-1962.
169. Nelson N. A photometric adaptation of the Somogyi method of determinationof glucose//J. Biol. Chem. 1944. V. 153. P. 375-381.
170. Owens R.A., Steger G., Hu Y., Pels A., Hammond R.W., Riesner D. RNAstructural features responsible for potato spindle tuber pathogenicity // Virology. 1996. V. 222. P. 144-158.
171. Ozeretskovskaya O.L., Vasyukova N.L, Pereldiod E.A., Chalencko G.I.,1.liinskayaL.L, Gerasimova N.G. Oligosaccharine Suppressors in the Interaction of Potato and Phytophthom infestans II J. Rus. Phytopathol. Soc. 2001. V. 2. P. 3744.
172. Padgett H.S., Beachy R.N. Analysis of a tobacco mosaic virus strain capable
173. Ш of overcoming N gene-mediated resistance // Plant Cell. 1993. V. 5. P. 577-586.132 : •' '
174. Privalova N.M., Elyakova L.A. Purification and some properties of endo-p1—>3-glucanase from marine bivalve Chlamys albidus II Сотр . Biochem. Physiol. 1978. Vol. 60B. P. 225-228.
175. Rahimi S., Perry R.N., Wright D.J. Identification of pathogenesis-relatedproteins induced in leaves of potato plants infected with potato cyst nematodes,
176. Globodera species // Physiol. Mol. Plant Pathol. 1996. V. 49. P. 49-59.
177. Ryan C.A. Oligosaccharides as recognition signals for the expression ofdefensive genes in plants // Biochemistry. 1988. V. 27. P. 8879-8883.
178. Reunov A.v., Lapshina L.A., Nagorskaya V.P., Elyjakova L.A. Effect ofl,3;l,6-p-glucan on infection of detached tobacco leaves with'tobacco mosaic virus / /J . Phytopatholi 1996. V. 144. P. 247-249.
179. Rezzonico E., Flury N., Meins F., Beffa R. Trasncriptional down-regulationby abscisic acid of pathogen-related beta-l,3-glucanase genes in tobacco cell cultures // Plant Physiol. 1998. V. 117. N. 2. P. 585-592.
180. Riesner D. Viroids: from thermodynamics to cellular structure and function //
181. Mol. Plant Microb. Interact. 1991. V. 4. P; 122-131.
182. Roby D., Esquerre-Tugaye M.-T. Induction of chitinase and of translatablemRNA for there enzymes in melon plants infected with Collectotrichum lagenarium II Plant Sci. 1987. V. 52. P. 175-185.
183. Ross A.F. Localized acquired resistance to plant, virus infection inhypersensitive hosts // Virology. 1961a. V. 14. N. 3. P. 329-339.
184. Ross A.F. Sistemic acquired resistance induced by localized virus infection inplant//Virology. 1961b. V. 14. N. 3. P. 340-358.
185. Rouhier P., Kopp M., Begot V., Bruneteau M., Fritig B. Structural features offungal P-D-glucans for the efficient inliibition of the initiation of virus infection on
186. Nicotiana tobacum II Phytochemistry. 1995. V. 39. P. 57-62.
187. Rudakova V.Ya., Shevchenko N.M., Elyakova L.A. Isolation and propertiesof endo-P-D-glucanase from marine bivalve Chlamys albidus II Gomp. Biochem.
189. Ruzicska P., Combos Z., Farkas C.L. Modification of the fatty acidcomposition of phospholipids during the hypersensitive rqaction in tobacco //
190. Virology. 1983. V. 128. N. 1. P. 60-64.
191. Ryan C.A. Oligosaccharides as recognition signals for the expression ofdefensive genes in plants // Biochemistry. 1988. V.27. P. 8879-8883.
192. Saito Т., Yamanaka K., Okada Y. Long-distance movement and viralassembly of tobacco mosaic virus mutants // Virology. 1990. V. 176. P. 329-336. *
193. Sanger H.L., Klotz G., Riesner D., Gross H.J., Albrecht K. Viroids are singlestranded covalently closed circular RNA molecules existing as highly base-paired rod-like structures //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1976. V. 73. P. 3852-3856.
194. Sano Т., Matsuura Y. Accumulation of short interfering RNAs characteristicof RNA silening precedes recovery of tomato plants from severe symptoms of
195. Potato spindle tuber viroid infection //J. Gen. Plant Pathol. 2004. V. 70. P. 50-53.
196. Shapiro A., Mullins J.T. Hyphal tip growth in Achlya bisexualis L.
197. Distribution of 1,3-P-glucans in elongation and non elongation regions of the wall// Mycolog. 2002. V. 94. N. 2. P. 267-272.
198. Schlumbaum A., Mauch F., Vogeli U., Boiler T. Plant chitinases are potentinhibitors of fungal growth // Nature. 1986. V. 324. P. 365-367.
199. Semancik J.S. Small pathogenic RNA in plants. The viroids // Ann. Rev.
200. Phytophatol. 1979. V. 17. P. 461-484.
201. Shalla T.A., Petersen L.J., Zaitlin M. Restricted movement of a temperaturesensitive virus in tobacco leaves is associated with a reduction in numbers of plasmodesmata//J. Gen. Virol. 1982. V. 60. P. 355-358.
202. Shaw J.G., Plaskitt K.A., Wilson T.M.A. Evidence that tobacco mosaic virusparticles disassemble cotranslationally in vivo II Virology. 1986. V. 148. P. 326336.
203. Shinshi H., Mohnen D., Meins F, Regulation of a plant 'pathogenesis- relatedenzyme: inhibitor of chitinase and chitinase mRNA accumulation in culture tobacco tissue by auxin and cytokinin // Proc. Natl. Acad, Sci. USA. 1987. V. 84. 1. P. 89-93.
204. Shumacher R., Meyer N., Riesner D. Diagnostic procedure for viroids andviruses with circular RNAs by "Return" Gel electrophoresis // Phytopathol, Z. 1986. Bd. 115. H. 4. S. 332-340.
205. Sogo J.M., Koller Т.Н., Diener Т.О. Potato spindle tuber viroid: X.
206. Visualization and size determination by electron microscopy // Virology. 1973. V.55. P. 70-80.
207. Sova V.V., Elyakova L.A., Vaskovsky V.E. Purification and some propertiesof l->3-P-glucan glucanohydrolase from the crystalline stylb of bivalve, Spisula sachalinensis II Biochim. Biophys. Acta. 1970. V. 212. P. 111-115.
208. Stollar B.D., Diener Т.О. Potato spindle tuber viroid. V. Failure ofimmunological tests to disclose double-stranded RNA or RNA-DNA hybrids //
210. Tucker M.R., Paech N.A., Willems M.T., Koltunow A.M. Dinamics of callosedeposition and beta-l,3-glucanase expression during reproductive events in sexual and apomictic Hiemtium II Planta. 2001. V. 212. N. 4. P. 487-!498.
211. Van Lent J., Wellink J., Goldbach R. Evidence for the involvement of the 58
212. К and 48 К proteins in the intercellular movement of cowpea mosaic virus // J.
213. Gen. Virol. 1990. V. 71. P. 219-223.
214. Van den Bulcke, Bauw G., Castresana G., Van Montagu M., Van der
215. Kerckhove J. Characterization of vacuolar and extracellular p-l,3-glucanases fotobacco: evidence for a strictly compartmentalized plant defence system // Proc.
216. Natl. Acad. Sci: USA. 1989. V. 86. P. 2673-2677.
217. Van Loon L.C. Pathogenesis-related proteins // Plant Mol. Biol. 1985. V. 4. P.111-116. '' Vogeli U., Meins F., Boiler T. Co-ordinated regulation;of chitinase and P-1,3glucanase in bean leaves//Planta 1988. V. 174. P. 364-37i2.' !
218. Vogeli-Lange R., Hansen-Gehri A., Boiler Т., Meins F.Jr. Induction of thedefense-related glucanohydrolases, P-l,3-glucanase and chitinase, by tobacco mosaic virus infection of tobacco leaves // Plant Sci. 1988. V. 54. P. 171-176.
219. Wang M.C., Bartnicki-Garcia S. Mycolaminarans: storage (1—*3)-P-Dglucans from the cytoplasm of the ^ngxxs Phytophthora palmivora II Carbohydr.
221. Wang J., Xu P., Fincher G.B. Purification, characterization, and gene structureof P-l,3-glucanase isoenzyme GUI from barley {Hordeum vulgare) II Eur. J.
223. Ward E., Payne G., Moyer M., Williams, Dincher S.j Sharkey K., Beck J.,
224. Nayior H., Goy P.A., Meins F., Ryals J. Differential regulatidn of P-l,3-glucanasemessenger RNAs in response to pathogen infection // Plant Physiol. 1991. V. 96. P. 390-397.
225. Whitham S., Dinesh-Kumar S.P., Choi D., Hehl R., COIT C , Baker В. Theproduct of the tobacco mosaic virus resistance gene N: similarity to Toll and the interleukin-1 receptor// Cell. 1994. V. 78. P. 1101-1115.
226. Wilson T.M.A. Cotranslational disassembly of tobacco mosaic virus in vitro
227. Virology. 1984. V. 137. P. 255-265.
228. Wu J.H., Dimitman J.E. Leaf structure and callose formation as determinantsof TMV movement in bean leaves as revealed by UV in^adiation experiments //
229. Virology. 1970. V. 40. P. 820-827. . ,
230. Wu C.-T,, Leubner-Metzger G., Meins F.Jr., Bradford K.J. Class I (beta)-1,3
231. Glucanase and Chitinase are Expressed in the Micropylar Endosperm of Tomato
232. Seeds Prior to Radicle Emergence // Plant Physiol. 2001. V. 126. N. 3. P. 12991313.
233. Yen P.H., Ballon C.E. Composition of aspecific intercellular agglutinationfactor//J. Biol. Chem. 1973. V. 248. P. 8316-8316.
234. Youg D. H., Pegg G. F. The action of tomato and Verticillium albo-atrumglycosidases on the hyphal wall of V. albo-atrum II Plant Pathology. 1982. V. 21. 1. P. 411-423.
235. Zvyagintseva T.N., Shevchenko N.M., Popivnich I.В., Isakov V.V., Scobun
236. A.S., Sundukova E.V., Elyakova L.A. A new procedure for the separation of water-soluble polysaccharides from brown seaweeds // Carbohydr. Res. 1999. V. 322. 1. P. 32-39. • •• : ' ^
-
Федорова, Вера Яковлевна
-
кандидата биологических наук
-
Владивосток, 2004
-
ВАК 06.01.11
- ИНДУКТОРЫ ОБРАЗОВАНИЯ ФИТОАЛЕКСИНОВ КАРТОФЕЛЯ, ВЫДЕЛЕННЫЕ ИЗ ВОЗБУДИТЕЛЯ ФИТОФТОРОЗА
- Глюкан со смешанным типом связей и глюкуроноарабиноксилан в ходе роста корней и колеоптилей кукурузы (Zea mays L.)
- Лектины картофеля и их участие во взаимоотношениях картофеля и возбудителя фитофтороза PHYTOPHTHORA INFESTANS
- Ультраструктура клеток клубней картофеля под влиянием биогенных индуктора и супрессора, выделенных из возбудителя фитофтороза
- Научно-методические основы создания высокого сортового потенциала картофеля в условиях Российского Приамурья
