Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Нуклеотидный полиморфизм генов, определяющих солеустойчивость многолетних видов люцерны

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Нуклеотидный полиморфизм генов, определяющих солеустойчивость многолетних видов люцерны"

На правах рукописи

гг?

Вишневская Мария Сергеевна

НУКЛЕОТИДНЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИХ СОЛЕУСТОЙЧИВОСТЬ МНОГОЛЕТНИХ ВИДОВ ЛЮЦЕРНЫ

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 МАР 2015

Санкт-Петербург 2015

005559657

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Всероссийский научно-исследовательский институт растениеводства имени Н. И. Вавилова» в 2010-2014 гг.

Научный руководитель доктор биологических наук

Потокина Елена Кирилловна, заведующая лабораторией мониторинга генетической эрозии растительных ресурсов Всероссийского научно-исследовательского института растениеводства имени Н. И. Вавилова Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Карлов Геннадий Ильич, профессор руководитель Центра молекулярной биотехнологии Российского государственного аграрного университета -МСХА имени К.А.Тимирязева

кандидат биологических наук Андронов Евгений Евгеньевич, заведующий лабораторией микробиологического мошггоринга и биоремедиации почв Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт цитологии и генетики

Защита диссертации состоится «15» апреля 2015 г. в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д 006.041.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте растениеводства им. Н. И. Вавилова по адресу: 190000, Санкт-Петербург, ул. Большая Морская, д. 44, тел. 314-78-36, 312-2593; факс (812) 571-87-28; e-mail: v.gavrilova@vir.nw.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института растениеводства имени Н. И. Вавилова и на сайте http://www.vir.nw.ru.

Автореферат размещен на сайтах ВАК и ВИР « 13 » февраля 2015 г. и разослан «25» февраля 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Вера Алексеевна Гаврилова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Засоление возделываемых почв является одним из наиболее распространенных деградационных процессов, понижающих плодородие сельскохозяйственных земель, приводящих к их опустыниванию и исключению из использования. По данным Международного института окружающей среды и развития около 10% поверхности континентов страдает от засоления. В России засоленные почвы занимают 5% площади равнин (Казакова, 2007).

Для эффективного восстановления деградированных земель перспективным является использование растений-биомелиорантов, среди которых представители семейства бобовых имеют приоритетное значение, так как обладают уникальной способностью повышать почвенное плодородие за счет накопления атмосферного азота вследствие симбиоза с клубеньковыми бактериями. Люцерна (Medicago L.) является важной сидератной культурой, выращиваемой на обширных территориях многих стран (Голобородько, 2009). Помимо симбнотических отношений с азотфиксирующими бактериями, культура люцерны способствует снижению уровня грунтовых вод и рассолению почв.

Анализ естественного аллельного разнообразия генов, контролирующих устойчивость к засолению, сохраняемого в коллекции образцов люцерны генбанка ВИР им. Н. И. Вавилова, представляет первостепенный интерес для селекции солеустойчивых сортов.

Генетический контроль ответной реакции растений на солевой стресс детально изучался на модельном объекте Medicago trwicatula Gaertn. (Merchan et al., 2003; 2007; Lorenzo et al., 2009). По результатам транскрнптомного анализа были идентифицированы гены-кандидаты, участвующие в формировании адаптивной реакции растения на засоление. В частности, у М. truncatula был идентифицирован ген, кодирующий транскрипционный фактор Zpt2-1 (TFIIIA-like), регулирующий способность корней восстанавливать ростовые процессы после воздействия солевого стресса (Frugier et al., 2000, Merchan et al., 2003). Позже было установлено, что экспрессия Zpt2-1, в свою очередь, контролируется геном рецепторной протеинкиназы Srlk (Salt-Induced Receptor-like Kinase) (Lorenzo et al., 2009). Сигнальный белок Srlk встроен в клеточную мембрану, имеет три домена: экстрацеллюлярный, трансмембранный и интрацеллюлярный. Его функция заключается в передаче сигнала об изменении концентрации ионов натрия в околоклеточном пространстве и активации экспрессии генов, обеспечивающих защитную реакцию на засоление. Ген Srlk экспрессируется преимущественно в корнях, уровень его экспрессии в эпидермисе корневых волосков и в апексе корня увеличивается в несколько раз в условиях солевого стресса (Lorenzo, 2009). Установлено, что мутации в структурной части гена, изменяющие аминокислотную последовательность Srlk, или приводящие к стон-кодонам

3

(TILLING .SrMr-mutants), в условиях солевого стресса достоверно и существенно сказываются на длине и массе корней, массе наземной части растения, способности растения к образованию клубеньков (Lorenzo et al., 2009).

Сходная организация (синтения) геномов бобовых позволяет использовать знания, полученные для модельного вида М. truncatula, для идентификации генов солеустойчивости у экономически значимых многолетних видов Medicago.

Цель исследования заключалась в выявлении аллельного разнообразия генов, определяющих устойчивость многолетних видов люцерны к хлоридному засолению, для последующего использования в маркер-вспомогательной селекции.

Задачи исследования. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. На материале мировой коллекции ВИР сформировать выборку образцов Medicago sp. из разных эколого-географических зон произрастания, потенциально отражающих внутри и межвидовое генетическое разнообразие.

2. Провести фенотипическую оценку образцов по признаку солеустойчивости в вегетационных экспериментах: определить содержание поглощенных ионов Na+/K+, определить степень угнетения растений.

3. Идентифицировать в геноме видов Medicago гены-ортологи, формирующие защитную реакцию на засоление, клонированные для модельного вида М. truncatula.

4. Оценить уровень экспрессии генов-кандидатов в корнях и листьях у солечувствительных и солеустойчивых образцов многолетних видов Medicago в условиях засоления субстрата и контрольных условиях.

5. Секвенировать последовательности генов-кандидатов в изучаемой выборке растений, выявить их нуклеотидный полиморфизм.

6. Сопоставить выявленные аллельные варианты генов-кандидатов с показателями солеустойчивости и идентифицировать аллели, связанные с устойчивостью к хлоридному засолению.

7. Разработать на потенциально перспективные аллели молекулярные маркеры для последующего их использования в целях маркер-вспомогательного отбора.

Научная новизна и практическая значимость работы.

На основе синтении геномов бобовых растений у люцерны посевной идентифицирована последовательность гена рецепторной протеинкиназы Srlk и активируемого им гена транскрипционного фактора Zpt2-1, чья ключевая роль в реакции на солевой стресс доказана для модельного вида M.truncatula.

Для 18 образцов многолетней люцерны из мировой коллекции ВИР, имеющих различное географическое происхождение и тестированных на выживаемость в условиях засоления, проанализирован нуклеотидный полиморфизм генов Srlk и Zpt2-1.

Экспериментально установлено, что в условях солевого стресса уровень экспрессии гена Srlk в корнях солеустойчивого сорта люцерны изменчивой

4

достоверно выше, чем в контроле. У солечувствительного образца многолетней люцерны уровень экспрессии гена Srlk в корнях ниже, по сравнению с контролем.

В последовательностях генов Srlk и Zpt2-1, выявлены несинонимичные нуклеотидные замены (SNP), достоверно ассоциированные со способностью растений восстанавливать ростовые процессы в условиях засоления.

На потенциально значимые несинонимичные SNP впервые разработаны молекулярные маркеры, которые могут быть использованы при массовом скрининге селекционного материала для выявления генотипов люцерны с повышенной устойчивостью к засолению.

По результатам фенотипической оценки на солеустойчивость образцы М. varia к-25782 сорт Тибетская и М. caerulea к-12821 определены как наиболее солеустойчивые и рекомендованы в качестве источников ценных аллелей для селекции сортов с повышенным адаптивным потенциалом.

Положения, выносимые на защиту.

1. В геноме многолетних видов люцерны идентифицированы ортологи генов Srlk и Zpt2-1, клонированных для модельного вида M.truncatula.

2. Уровень экспрессии гена Srlk в корнях солеустойчивого сорта люцерны изменчивой достоверно повышается в ответ на солевой стресс.

3. В последовательности генов Srlk и Zpt2-1 выявлены несинонимичные SNP, достоверно ассоциированные со способностью растений люцерны выживать и восстанавливать ростовые процессы в условиях засоления.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на II Всероссийской молодежной научно-практической конференции «Перспективы развития и проблемы современной ботаники» ЦСБС СО РАН, Новосибирск (58 октября 2010); Всероссийском симпозиуме «РАСТЕНИЕ PI СТРЕСС (Plants under Environmental Stress)» ИФР им. К.А. Тимирязева РАН, Москва (9-12 ноября 2010); Международной школе молодых ученых «Bioinformatics methods and next generation sequencing technologies» ИЦиГ CO РАН, Новосибирск (26 -30 августа 2011); Международной конференции 19й EUCARPIA General Congress, Будапешт (21-24 мая 2012); Конференции молодых ученых и аспирантов «Актуальность наследия Н. И. Вавилова для развития биологических и сельскохозяйственных наук», Санкт-Петербург (20-21 марта 2012); Международной научной конференции «Генетические ресурсы растений - основа продовольственной безопасности и повышения качества жизни» Санкт-Петербург (6 — 8 октября 2014).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, из них 4 статьи в журналах из списка ВАК, 6 статей и тезисов в сборниках трудов конференций, 1 учебное пособие.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 97 страницах компьютерного текста, состоит из введения, 6 глав, выводов, списка литературы (71 наименования, в том числе 50 зарубежных авторов), двух приложений, содержит 16 таблиц и 26 рисунков.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Для фенотипической оценки по признаку солеустойчивости из мировой коллекции ВИР были отобраны 18 образцов многолетних видов люцерны. Среди них пять сортов M. varia Mart., два сорта M. sativa L., три дикорастущих местных образца М. sativa различного происхождения — из Казахстана, Туркмении и Китая, и восемь дикорастущих образцов разных видов: М. coerulea Less, ex Ledeb., M.falcata L., M. trautvetteri Shumn. (табл.1).

Оценку солеустойчивости производили экспериментально на разных стадиях развития растений. Всего проанализировано 2322 растения. Для оценки проростков люцерны на солеустойчивость использовали опубликованный ранее протокол (Rumbaugh, 1991). Эксперимент проводили в трех повторностях. Оценивали достоверность отличий по всхожести по критерию хи-квадрат с гипотетической «средней» кривой, полученной при усреднении значений гибели всех образцов при каждой концентрации. Образцы, которые значимо (р<0.05) отличались от «средней» кривой в сторону большей смертности семян (меньшей всхожести), были определены как неустойчивые, в сторону меньшей

— как устойчивые.

Методика микровегетационного эксперимента по выращиванию растений in vitro была первоначально отработана нами на люпине (Дроздов и др., 2007). В экспериментах с люцерной семена скарифицировали концентрированной соляной кислотой в течение 40 с и помещали в чашки Петри на агаризованную питательную среду Гамборга В5. Проростки рассаживали по одному в пробирки 160 мм в диаметре и 200 мм высотой и культивировали в течение 28 сут. Стресс создавали содержанием в среде 0,17 M NaCl по Мезенцеву (1980). Объем выборки составил 1023 растения, из них 682 выращены в условиях засоления и 341 — в условиях контроля. Для всех образцов эксперимент проводился в трех повторностях. Оценку угнетения проводили по трем показателям: длине корня, сухой массе корня и сухой массе растения. Влияние соли на указанные параметры оценивали с помощью дисперсионного анализа; для выравнивания дисперсий из всех измеренных величин был извлечен квадратный корень.

Выращивание люцерны в вегетационных сосудах проводили по методике, разработанной Смитом (Smith, 2011). По истечении срока выращивания были измерены длины побегов и корней. Дополнительно, визуально оценивали в баллах состояние растений по степени пожелтения (усыхания) листьев разных ярусов и точки роста по следующей шкале: 0 - отсутствие видимого стресса, 1

- небольшое пожелтение нижних листьев, 2 — слабое пожелтение всего растения, 3 — пожелтение всего растения, гибель листьев нижнего яруса, 4 -пожелтение всего растения, листья нижнего и среднего ярусов погибают, 5 -гибель всего растения.

Для определения содержания натрия и калия использовали метод, описанный Шавруковым (2009). Для каждого сорта составляли 3 выборки: а) контрольные растения, б) погибшие в опытном варианте растения, в) выжившие

6

в опытном варианте растения. Определения содержания натрия и калия проводили на пламенном фотометре (Flame photometer Jenway PFP 7, England).

Таблица 1. Образцы люцерны из мировой коллекции ВИР, проанализированные по

устойчивости к засолению

№ Вид, № по каталогу BIIP, сорт Пловд-носп. Происхождение Характеристика образца

1 M. coenilea к-12821 2n Дагестан, Кавказ Образец дикорастущей люцерны. Предположительно солеустойчив.

2 M. coerulea к-36116 2n Казахстан, Уральская обл. Образец дикорастущей люцерны

3 M falcata subsp. borealis Grossh. K-1467 2n Россия, Ленинградская обл. Образец дикорастущей люцерны. Собран на северной границе ареала. Предположительно зимостоек.

4 M.falcata K-36748 2n Казахстан, Актюбинская обл. Образец дикорастущей люцерны.

5 M. falcata K-44033 2n Россия, Якушя Образец создан на основе дикорастущего экошпа, распространенного в Якутии. Зимостоек. Выращивается на сено и под выпас скота.

6 M. falcata к^4050 2n Россия, Краснодар-скнйкрай Образец дикорастущей люцерны. Собран в степи, подверженной вторичному засолению.

7 M. sativa K-33743 4n Китай Староместный образец Предположительно солеустойчив.

8 M. sativa K-38539 4n Казахстан, Семиреченск Образец дикорастущей люцерны, собранный в Семиреченской область

9 M. sathu, K-40812, сорт Надежда 4n Укранна Создан в Херсонском НИИ орошаемого земледелия. Высокоурожайный.

10 M satrm к-42760, coprDeseret 4n США Создан на базе турецкого генотипа люцерны посевной. Выращивается на сено в условиях орошения.

11 M sativa к-8958 4n Туркмения Предположительно солеустойчив.

12 M. trautvetteri к-35023 2n Казахстан, Акпобинская обл. Образец дикорастущей люцерны габрццного происхождения. Засухоустойчив и зимосго®.

13 M. trautvetteri к-38553 2n Казахстан, Джезказганская обл. Образец дикорастущей люцерны пгорцдного происхождения. Засухоустойчив и зимостоек.

14 M. vatia к-25782, сорт Тибетская 4n Казахстан, Актюбинская обл. Соддан на Аральской опышой станции ВИР на материале геиотипа М. sativa из Непала. Выращивается на засаленных территориях.

15 M liana к-27062 сорт Северная гибридная 4n Росам, Ленинградская обл Создан в НИИ кормов, г. Москва, на материале М. falcata subsp. borealis Grossh.H М. sativa Rambler type. Выращивается под выпас.

16 M дипа к-33299, сорт Rambler 4n Канада Создан на материалеМ falcata для возделывашга на территории засушливых прерий Канады. Зимостоек.

17 M 1нпа к-38382, сорт Dryiandcr 4n Канада Создан на материале разновидности Rambler для возделывания на твдяпории засушливых прерий Канады

18 M. varia к-8469, сорт Vernal 4n США Сорт для орошаемых угодий США, выращивается на сено. Высокопродуктивен, зимостоек.

Геномную ДНК выделяли из лиофилизированных растений СТАВ-методом по Saghai-Maroof et al. (1990) с модификациями, использованными нами ранее для выделения ДНК из растений люпина (Erra и др., 2012). Для амплификации последовательностей генов Srlk и Zpt2-1 были использованы геноспецифичные праймеры, разработанные в ходе исследования с использованием программного обеспечения Vector NTI 10.0 (Life Technologies). Секвенирование ампликонов проводили в прямом и обратном направлении (Евроген, Москва; Пекин, Китайская академия с.-х. наук, www.genomics.cn). Выравнивание последовательностей ДНК производили с использованием программы ClustalW. Анализ нуклеотидных последовательностей и выявление SNP осуществляли с помощью пакета Seqman программного обеспечения DNASTAR и BioEdit.

Для проведения экспрессионного анализа, тотальная РНК выделялась с использованием Trizol по протоколу производителя (Invitrogen, USA). Реакция обратной транскрипции проводилась с использованием TaqMan Reverse Transcription Reagents (Life Technologies, www.lifetechnologies.com) no протоколу производителя. Количественная ОТ-ПЦР проводилась с праймерами, специфичными для гена Srlk. В качестве гена внутреннего контроля использовали ген 18S рРНК с прямым праймером: 5-CTCAACACGGGGAAACTTAC-3' и обратным праймером: 5-AGACAAATCGCTCCACCAAC-3'. Для оценки уровня экспрессии гена Srlk был использован метод относительной количественной оценки (ACt). Уровень экспрессии гена интереса определялся как 2ЛС(,) = 2c(t)(reH сра"'"с,шя| - C(t)(rcH гатереса) (Ermilova et aL, 2010). Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Statistica 7.0 (StatSoft, Inc., USA).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Оценка образцов люцерны па солеустойчивость производилась тремя разными способами: 1) методом проростков; 2) в стерильном эксперименте на агаризованной среде (микровегетационный эксперимент, 1023 растения); 3) при выращивании растений в вегетационных сосудах на субстрате (вегетационный эксперимент, 1299 растений). В каждом эксперименте каждый образец был определен как устойчивый или чувствительный к хлоридному засолен то (табл. 4).

На стадии прорастания семян гибель растений достоверно зависела от концентрации соли (Kruskal-Wallis ANOVA, H2>54=38, р<0.001), в среднем возрастая от 44% в контроле (0% соли) до 100% при максимальной концентрации (2% соли). С увеличением концентрации хлорида натрия, снижение количества проростков наблюдалось у всех образцов, при этом различия между образцами незначимы (Н)7^0=15, р=0.60). Диплоидные образцы люцерны оказались более чувствительными к засолению, чем тетраплоидные (табл.4).

В микровегетационном эксперименте в качестве показателей солеустойчивости для опытных и контрольных растений сравнивались три параметра: 1) длина корня, 2) вес лиофилизированной корневой системы растения, 3) вес всего лиофилизированного растения. По результатам

двухфакторного дисперсионного анализа засоление среды значимо влияло на все показатели у всех образцов (табл. 2).

Таблица 2. Влияние засоления и принадлежности к образцу на морфометрические параметры люцерны_

Параметры Факторы

Засоление Образец Засолениехобразец

Ювенильные растения (микровегетационный эксперимент):

Длина корня F, .9„=308, р<0.001 F„ 999=6, pO.OOl FII,999=1,P=0.26

Сухая масса корня F1 999=185,p<0.001 F,, 999=17, pCO.OOl F„,99=5, pO.OOl

Сухая масса побега F, .999=258, pO.OOl F,, 999=25, pO.OOl F,, 999=4, pO.OOl

Вирпшильные растения (вегетационный эксперимент):

Длина побега FU265=1310,p<0.001 Fl6.U65=14,pO.OOl F,6Л265=12, pO.OOl

Длина корня FUM5=629, pcO.OOl F,6.12M=23, pO.OOl Fl6,1165=7, pO.OOl

Коэффициент угнетения FU082=1565,p<0.001 F,5,1082=13, pO.OOl Fi5.,082=21,p<O.OOl

В вегетационном эксперименте по результатам дисперсионного анализа длина побега, длина корня и коэффициент угнетения значимо реагировали на повышенное содержание соли в субстрате (табл.2). Попарные сравнения всех образцов по тесту Тьюки выявили образцы, с минимальным сокращением длины корня или стебля в ответ на солевой стресс, а также образцы с минимальным коэффициентом угнетения (табл.4).

Содержание Ыа+ и К+ в тканях испытуемых растений значимо зависело от засоления, генотипа образца, и от взаимодействия обоих факторов (табл. 3). При этом концентрация натрия для всех образцов была выше у погибших растений, чему у контрольных, для калия - наблюдалась обратная картина. Двухфакторный дисперсионный анализ не обнаружил значимых различий между образцами по содержанию натрия в условиях стресса (табл.3).

Таблица 3. Влияние засолеиия и принадлежности к образцу на содержание натрия и калия у люцерны___

Параметры Факторы

Засоление* | Образец | Засолениехобразец

Образцы 2, 8 и 17 (нет выживших в эксперименте)

Содержание Na FU4=367, pO.OOl F2,14=5, p=0.03 F214=6, p=0.02

Содержание К FU4=98, pO.OOl F2,i4=8, p=0.004 F2,4=6, p-0.01

Отношение Na/K F,.14=144, pO.OOl Fi ,4=3, p=0.08 F2,4=2, p=0.15

Образцы 1,3-5, 7, 9-16 и18

Содержание Na F2,i62=365, pO.OOl F13.I62=1,P=0.20 F26.i62=l,P=0.30

Содержание К F2,,62=24, pO.OOl Fi3,162=3, p=0.002 F26,162=2, pO.OOl

Отношение Na/K F2,162=195,pO.OOl Fi3.i62=4, pO.OOl F26.162=3, pO.OOl

Из 18 тестируемых образцов к-25782 (M varia, сорт Тибетская) оказался самым солеустойчивым. Этот сорт отличался устойчивостью к засолению на стадии прорастания и имел минимальный коэффициент угнетения в вегетационном эксперименте. Интерес для селекции может представлять образец M.coerulea из горных районов Дагестана (к-12821). Несмотря на

низкую всхожесть семян в условиях засоления, молодые растения этого образца успешно вегетировали при повышенных концентрациях соли в почве.

Таблица 4. Солеустойчивость образцов люцерны, выявленная на разных стадиях развили растений.____

я Я" СО Л а ю о g Вид, плоидность Стадия проростков Микровегетационный эксперимент Вегетационный эксперимент

Длина корня Масса корня ^íacca расте1шя Длина корня Длина побега Коэф. угнетения

1 М. coenilea (2п)

2 М. coerulea (2п) > 11 уст

3 М. falcata (2п) ver.

4 М. falcata (2п)

5 М. falcata (2n)

6 М. falcata (2n) уст. ■

7 M. sativa (4n)

8 M. sativa (4n) VíM.

9 M. sativa Надежда (4n) VCT>

10 M. sativa Deseret (4n)

11 M. sativa (4n) \.i.

12 M. traatvetteri (2n)

13 M. trautvettcri (2n) уст. \í-| ■.,4

14 M. varia Тибетская (4n) \l¡. уст i

15 M. varia Сев.гибридная (4n уст.

16 M. varia Rambler (4n) усг.

17 M. varia Drylander (4n)

18 M. varia Vernal (4n)

уст. - устойчивые образцы, выделены серым цветом.

Выявление в геноме M.sativa последовательностей ДНК, ортологичных генам Srlk и Zpt2-1. клонированных для M.truncatula. На основашш синтении геномов бобовых растений, в базе данных DFCI (littp://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/) для многолетних видов Medicago sp. были идентифицированы ортологичные последовательности для генов рецепторной киназы Srlk и транскрипционного фактора MtZpt2-l, опубликованые для M.truncatula под индексами ТС115753 и ТС77176 соответственно (Lorenzo et al., 2009). Процент сходства последовательности С0515446 у M.sativa с геном Srlk для M.truncatula составил 97%, последовательности Y18788 у M.sativa с геном MtZpt2-l для M.truncatula составил 94%. Для амплификации ортологичных последовательностей генов-кандидатов были сконструированы геноспецифичные пары праймеров: SrlMor-GCTITCTGGGTCACITTATCrTCATCTCAAG и Sr/Ar-rev-GCCGCTCCCAACCCAATCCTAA; Zpt2-l-for-CGGCACGAGAAATAACCACTTCrCTC и Zpt2-lrev-AGTCCGGAAAAGCCGGGAGGT. Полученные ампликоны длиной 1184 и 1006 п.н. были секвенированы и выравнены с референсными последовательностями.

Оценка уровня экспрессии гена рецепторной киназы Srlk у солсчувствительного и солсустойчивого образцов многолетней люцерны в условиях засоления. Согласно экспериментам Lorenzo et al. (2009), в условиях засоления уровень экспрессии гена Srlk в корнях солеустойчивых генотипов M. truncatula был всегда выше, чем в условиях контроля и в листьях. У чувствительных к засолению генотипов уровень экспрессии Srlk в корнях изменялся незначительно, тогда как в листьях разница в экспрессии была достоверной. Для подтверждения роли гена Srlk в индуцировании ответной реакции растений многолетних видов люцерны на солевой стресс, был проведен анализ экспрессии гена Srlk с использованием разработанных ираймеров: RT-Srft-far-GAGG'l'I'AGCiTGGGGAQAGGAG, RT-Sí'ft-rev-CGCAGCCATCAAATCACCAAG. Тотальная РНК была выделена из 12 растений, принадлежащих «солеустойчивому» образцу M. varia (к-25782 сорт Тибетская) (6 проб - растения в условиях засоления, 6 -контроль), аналогично для 12 растений <<cone4yBCTBHTenbHoro>>Myâfci7to (к-44050).

В условиях засоления наблюдалось достоверное увеличение уровня экспрессии гена Srlk в корнях солеустойчивого образца сорта Тибетская по сравнению с контролем и уровнем его экспрессии в листьях. Для солечувст-вительного образца M.falcata (к-44050) наблюдалась обратная картина (рис. 1 ).

Рисунок 1. Уровень экспрессии гена Srlk в корнях (А) и листьях (Б) листьях двух генотипов люцерны: M. varia к-25782 с.Тибетская (Varia) , M. falcata к-44050 (Falc.). 1 -условия засоления (1% NaCl). 2 - условия контроля (0% NaCl).

Выявление нуклеотидного полиморфизма последовательностей генов Srlk и Zpt2-1. Для выявления нуклеотидного полиморфизма последовательности гена Srlk в изучаемой выборке первоначально был получен ПЦР-фрагмент ожидаемой длины с праймерами Srlk-for и Srlk-rev для 215 генотипов, относящихся к 18 образцам люцерны. Продукты ПЦР были подвергнуты рестрикционному анализу с использованием мелкощепящей эндонуклеазы Tsp509I, имеющей в исследуемой последовательности 9 сайтов рестрикции. Затем у 215 генотипов была проанализирована картина рестрикции с Tsp509I. В результате у 12 генотипов многолетних видов Medicago, показавших различающуюся картину рестрикции, фрагмент последовательности Srlk был секвенирован в прямом и обратном направлении. При сравнении этих 12

последовательностей Srlk с последовательностью ТС115753, опубликованной для M.truncatula, было выявлено 30 SNP. Число нуклеотидных замен, выявленных при сравнении 12 последовательностей Srlk между собой, было значительно ниже (19 SNP, из них 7 несинонимичных).

Таким образом, было установлено, что анализируемый ген в имеющейся выборке образцов является полиморфным, и дальнейшее ре-секвенирование последовательности гена Srlk в феношпированной выборке образцов с целью выявления ассоциации нуклеотидного полиморфизма и реакции растения на солевой стресс имеет очевидный смысл.

Структура аллельного разнообразия генов Srlk и Zpt2-1 в анализируемой выборке растеннй люцерны и ее ассоциация с выживаемостью в условиях засоления. Ранее, в вегетационном эксперименте было протестировано 1299 растений, для которых были измерены длина корня, длина побегов и коэффициент угнетения в контроле и при засолении. Для 132 растений, выращенных при засолении, были получены данные секвенирования последовательности Srlk. Фрагмент последовательности гена Zpt2-1 был секвенирован для 70 растений. Располагая фенотипической оценкой и данными секвенирования, мы провели статистический анализ с целью выявления ассоциации между отдельными SNP или их комбинациями и 1) выживаемостью в условиях стресса (1 - растение выжило; 0 — растение погибло), 2) длиной корня и длиной побега (Merchan et al., 2007; Lorenzo et al., 2009).

Для гена Srlk в анализируемой выборке из 132 растений было выявлено 13 полиморфных сайтов (SNP). Каждый SNP в анализе был представлен двумя (например, АА и СС, или АА и АС) или тремя (АА, АС, СС) выявленными гомо- или гетерозиготными состояниями. Из 13 SNP 11 уже были обнаружены в предыдущем эксперименте с использованием рестрикционного анализа.

Для выявления каких-либо закономерностей в распределении аллелей SNP среди изучаемых растений, был проведен факторный (компонентный) анализ. На первом этапе мы использовали факторный анализ для выявления характера и силы связей между аллелями, без учета параметров выживаемости растений в условиях солевого стресса. Было выявлено четыре фактора (F^ Fj, F3 F4), отражающих структуру и уровень взаимосвязей между аллелями, их факториальная дисперсия равнялась 10%, 9%, 8% и 8%.

Для того, чтобы установить существует ли связь между каким-либо из этих факторов, характеризующих аллельное разнообразие изучаемой выборки генотипов, и степенью выживаемости растений в условиях засоления был проведен однофакторный дисперсионный анализ, где в качестве фактора использовали показатель выживаемости (1/0), а в качестве изменчивого ряда - значения факторных нагрузок, рассчитанные для каждого растения. Из четырех факторов выживаемость растений была достоверно ассоциирована только с F3 Достоверность влияния F3 на выживаемость растений представлена в табл. 5.

Таблица 5. Результаты однофакторного дисперсионного анализа по выявлению ассоциации главных компонент аллельного разнообразия гена Бг1к и степенью выживаемости растений люцерны в условиях засоления

Виды изменчивости | Df | SS | MS | F ¡ р

Фактор 1

Жизнеспособность 1 0,60 0,61 0,61 0,44

Остаточная изменчивость 130 130,39 1,00

Общая изменчивость 131 131,00

Фактор 2

Жизнеспособность 1 2,33 2,33 2,36 0,13

Остаточная изменчивость 130 128,66 0,99

Общая изменчивость 131 131,00

Фактор 3

Жизнеспособ ность 1 14,98 14,98 16,79 0,0001

Остаточная изменчивость Í30 116,02 0,89

Общая изменчивость 131 131,00

Фактор 4

Жизнеспособность 1 0,40 0,40 0,40 0,53

Остаточная изменчивость 130 130,60 1,01

Общая изменчивость 131 131,00

ЗЭ - сумма квадратов, МБ - средне-квадратичное отклонение, Б - значение критерия Фишера, р - уровень значимости, Фактор 1-4 - факторы, описывающие аллельное разнообразие 8г1к в изученной выборке растений, с^- числа степеней свободы

Выделенный фактор F3 объясняется, в основном, аллелями четырех SNP, имеющих максимальные нагрузки для F3: SNP 480, 544, 726 и 245. Детальный анализ аллелей этих SNP показал, что SNP_245 приводит к замене аминокислоты Ser/Asn и встречается только у одного растения из 132 проанализированных, это растение не выжило в условиях засоления. Несинонимичный SNP_544 (Glu/Gin), был также обнаружен только у 4 растений М. sativa к-38539 (Казахстан, Семиреченск), все растения этого образца погибли. Наиболее вероятно, что эти редкие «образец-специфичные» аллели скорее отражают генетическую особенность образцов, чем ассоциированы с солеустойчивостью. Несинонимичный SNP480 (Thr/Ser) является возможным кандидатом на рассмотрение ассоциации с солеустойчивостью, его альтернативные аллели не являются специфичными для какого-либо образца. SNP_726 является синонимичным.

Аналогичный факторный анализ был выполнен для гена Zpt2-1, для которого в анализируемой выборке было выявлено 15 SNP. Было выделено четыре фактора, отражающих структуру и уровень взаимосвязей между аллелями, их факториальная дисперсия равнялась 21%, 14%, 9% и 8%. По результатам однофакторного дисперсионного анализа, из четырех факторов выживаемость растений достоверно ассоциирована только с F2 (табл. 6).

Таблица 6. Результаты однофакторного дисперсионного анализа по выявлению ассоциации главных компонент аллелыюго разнообразия гена 7р12-1 и степенью выживаемости растений люцерны в условиях засоления

Виды изменчивости | Df | SS | MS | F | р

Фактор 1

Жизнеспособность 1 0.13 0.13 0.13 0.724

Остаточная дисперсия 68 68.87 1.01

Общая дисперсия 69 69.00

Фактор 2

Жизнеспособность 1 7.74 7.74 8.59 0.005

Остаточная дисперсия 68 61.26 0.90

Общая дисперсия 69 69.00

Фактор 3

Жизнеспособность 1 2.03 2.03 2.06 0.16

Остаточная дисперсия 68 66.97 0.98

Общая дисперсия 69 69.00

Фактор 4

Жизнеспособность 1 0.24 0.24 0.24 0.63

Остаточная дисперсия 68 68.76 1.01

Общая дисперсия 69 69.00

ББ - сумма квадратов, М5 - средне квадратичное отклонение, Б - значение критерия Фишера, р - уровень значимости, Фактор 1-4 - факторы, описывающих аллелыюе разнообразие 8Нк в изученной выборке растений, - число степеней свободы.

Максимальная нагрузка по фактору 2 приходится на SNP в позициях: 170 (син), 184 (Ser/Asn), 302 (син), 313(Asp/Gly), 317 (Asn/Lys), 321 (Ser/Thr), 326 (Asp/Glu), 333 (Ala/Arg), 472 (Tle/Thr).

Некоторые из перечисленных несинонимичных SNP заслуживают внимания, как потенциально ассоциированные с солеустойчнвостыо, встречаясь равномерно в исследуемой выборке в гомо- и гетерозиготном состояниях.

Ассоциация SNP, выявленных в последовательностях генов Srlk и Zpt2-h с длиной корпя, длиной побега и жпзпеспособностыо растений в условиях засоления. Способность растения восстанавливать рост корневой системы в условиях засоления - одна из ключевых характеристик адаптационного потенциала генотипов люцерны, наряду со способностью не снижать прирост надземных частей растения (Merchan, 2003, 2007; Lorenzo et al., 2009). Задача заключалась в том, чтобы выявить в структуре изучаемых генов-кандидатов нуклеотидные замены, ассоциированные с данными показателями солеустойчивости. Для выявления такой ассоциации, в первоначальную матрицу данных для факторного анализа были добавлены данные фенотипической оценки солеустойчивости 132 анализируемых растений: успешность выживания (1 - растение выжило при засолении, 0 -погибло), длина корня и длина побега в условиях засоления. Распределение нуклеотидных замен гена Srlk, выявленных у 132 растений разных образцов

14

люцерны, и параметров солеустойчивости растений в двухмерном пространстве факторов 1 и 3 показано на рис.2. На этом рисунке (справа) отмечена обособленность по фактору 1 растений сорта Тибетская (12) и образца люцерны посевной из Казахстана (10), наиболее контрастных по солеустойчивости.

Ml.

-i 0 1 Фактор 1

Рисунок 2. Слева: Распределение SNP, выявленных в последовательности гена Srlk, в пространстве факторов 1 и 3. Цифрами обозначены SNP. Параметры солеустойчивости: «vitality» - выживаемость, «root» - длина корня, «stem» - длина побега. Справа: Распределение проанализированных генотипов люцерны с учетом их принадлежности к образцу, в пространстве факторов 1 и 3. Выделены два образца: солеустойчивый (12) и солечувствительный (10). Нумерация образцов: 1 - M. coerulea, к-12821; 3 - М. sativa, к-42760, с. Deseret; 4 - Mvaria, к-38382, с. Drylander; 5 - M. falcata subsp. borealis Grossh., к-1467; 6 - M. falcata, к-36748; 7 - M. sativa, к-33743; 8 -M sativa, к-40812, с. Надежда; 9 - M. varia, к-33299, с. Rambler; 10 - M. sativa, к-38539; 11 - M. varia, к-27062, с. Северная гибридная; 12 - M. varia, к-25782, с. Тибетская; 13 -M. trautvetteri, к-38553; 14 - M. trautvetteri, к-35023; 15 - М. falcata, к-44033; 16 - М. sativa, к-8958; 17 - M. varia, к-8469, с. Vernal.

Дополнительно к факторному анализу, идентификацию SNP, коррелирующих с солеустойчивостью люцерны проводили по t-критерию Стьюдента, и его непараметрическому аналогу - критерию U Манна-Уигни (табл. 7). Помимо нуклеотидных замен, выявленных в составе «корреляционных плеяд» с использованием факторного анализа, непараметрический критерий U Манна-Уитни позволил идентифицировать для последовательности гена Srlk дополнительно три SNP, ассоциированных с показателями солеустойчивости.

Таблица 7. Нуклеотидные замены (5НР), выявленные в генах Зг/А- и 2рП-1, достоверно ассоциированные с показателями солеустойчивости у растений люцерны в условиях засоления по результатам 1>критерия Стьюдента и и-критерию Манна-Уитни.

SNP (аллель) П.с.* Число растений в группе Среднее + стандартная ошибка в группе t-критерий Сгьюденга U-критерий Манна-Уитни

Сумма рангов и Z Р

0 ГТ 0 1 1 t ÍP 0 1 1

Нуклеотидные замены в последовательности гена Srlk

113(3) Vitality 123 9 0,76+0,04 0,33+0,17 2,81 0,01 8414 365 319,5 2,11 0,03

188(2) Root Stem 115 115 17 17 13,3+0,7 11,3+0,5 18,9+1,7 16,0+1,4 -2,78 -3,48 0,01 0,00 7213 7192 1566 1587 542,5 521,5 -2,96 -3,10 0,00 0,00

195(2) Stem 13 119 8,0+1,6 12,3+0,5 -2,77 0,01 540 8239 448,5 -2,48 0.01

480(2) Root Stem 106 106 26 26 13,2+0,8 11,1+0,5 17,2+1,3 15,0+1,1 -2,26 -3,38 0,03 0,00 6579 6514 2200 2264 907,5 843,0 -2,69 -3,06 0,01 0,00

544(2) Vitality Root Stem 4 4 4 128 128 128 0.00±0,00 3,5+0,2 5,4+0,1 0,75+0,04 14,3+0,7 12,1+0,5 -3,44 -2,72 -2,47 0,00 0,01 0,01 74 34 62 8704 8744 8716 64,0 24,0 52,0 -2,55 -3,08 -2,71 0,01 0,00 0,01

726(3) Vitality 25 107 0,52+0,10 0,78+0,04 -2,63 0,01 1321 7458 995,5 -1,99 0,05

Нуклеотидные замены в последовательности гена Zpt2-1

321(3) Root 60 10 16,38+0,92 11,40+1,38 2,14 0,04 2259 226 171 2,17 0,03

326(3) Vitality 65 5 0,82+0,39 0,40+0,05 2,23 0,03 0,82 0,40 2 68,00 0,03

*П.с. - показатели солеустойчивости: Vitality - выживаемость; Root - длина корня в условиях засоления; Stem - длина побега в условиях засоления.

SNP_195 (Asn/Tyr) достоверно влиял на длину побега у растений в условиях засоления и встречался у 119 растений из 132. Несинонимичный SNP_188 (Val/Ala), встречался преимущественно (94%) у образца M.varia к-25782 (сорт Тибетская) и единично у M.coerulea к-12821 и М.sativa к-8958. Поскольку, образец сорта Тибетская M.varia к-25782 по результатам наших экспериментов оказался наиболее солеустойчивым, то аллель SNP_188 (Ala) представляет интерес для дальнейшего изучения, как, возможно, повышающая адаптацию растений к засолению. SNP_113 является синонимичным.

Для последовательности гена Zpt2-1 только два SNP из обсуждавшихся ранее результатов факторного анализа, оказались достоверно взаимосвязаны с показателями солеустойчивости растений люцерны (табл. 7).

Разработка аллель-спсцифичных маркеров для SNP гена Srlk, ассоциированных с адаптивностью растений люцерны в условиях засоления. Для двух нуклеотидных замен в последовательности Srlk (SNP_188 и SNP_480), показавших достоверную ассоциацию со способностью растений выживать и восстанавливать ростовые процессы в условиях засоления, были разработаны аллель-специфичные молекулярные маркеры.

SNP_188 не образует специфической мишени для известных эндонуклеаз, поэтому для его выявления были разработаны аллель-специфичные праймеры Tib_Forl -TGGTTTCATCTGTGATTTTGC и TibRev-TTCCCATCAAAACCATCCTT. При проведении ПЦР аллельные варианты SNP_188 (Т/С) различаются за счёт того, что 3' концевой нуклеотид праймера Tib_Forl гибридизируется

непосредственно с позицией ЭЫР, и продукт длиной 438 н.п. амплифицируется только при наличии «С» (рис. 3). Предложенный доминантный маркер не позволяет с уверенностью интерпретировать отсутствие ПЦР-продукта как аллель «Т», однако успешная амплификация с аллель-специфичными праймерами может применяться для диагносшки нуклеотида «С» в позиции 8№_188. Это было подтверждено в специальном эксперименте для 16 генотипов люцерны, у которых ген Бг1к был секвенирован.

Рисунок 3. Выявление несинонимичного SNP_188 (Т/С) в последовательности гена Srlk у растений люцерны с помощью аллель-специфичных праймеров.

SNP_480 (C/G) может быть выявлен с помощью рестриктазы Bsell, которая расщепляет ПЦР-продукт, полученный с праймерами Srlk-tor и Srlk-кv, на два фрагмента (484+700=1184 н.п.) в случае «С» (рис. 4). CAPS маркер выявляет гомозиготные (С, G) и гетерозиготные (C/G) генотипы по этому локусу.

Рисунок 4. CAPS маркер, выявляющий SNP_480 (C/G) в последовательности гена Srlk с помощью рестриктазы Bsell на примере образца M.sativa (к-8958).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При выполнении диссертационной работы в вегетационных экспериментах были испытаны на солеустойчивость 2322 растения, относящихся к 18 образцам многолетних диплоидных и тетраплоидных видов люцерны коллекции ВИР из разных эколого-географических регионов. В ходе испытаний оценка включала изучение солеустойчивости на разных стадиях онтогенеза и производилась с использованием разных методов. По результатам комплексной оценки были выявлены солеустойчивые и солечувствительные образцы. Полученная фенотипированная выборка послужила базой для последующих молекулярных исследований.

На основании синтении геномов нами были выявлены ортологичные последовательности для генов Srlk и Zpt2-1, опубликованных для M.truncatula (Merchan et al., 2003, 2007, Lorenzo et al., 2009), в геноме многолетних видов люцерны, представляющих экономический интерес. Было показано, что в условиях засоления в корнях солеустойчивого многолетнего сорта люцерны

экспрессия одного из этих ключевых генов (Srlk) достоверно повышается, а в корнях солечувствителыюго образца подобной реакции не наблюдается. Это свидетельствовало о причастности гена Srlk к формированию адаптивной реакции на засоление у испытуемых образцов. Таким образом, изучение естественного аллельного разнообразия генов-кандидатов, представлялось перспективным с точки зрения выявления функциональных нуклеотидных замен.

По результатам секвенирования последовательностей двух генов-кандидатов у 144 и 70 растений был сделан вывод о высоком уровне полиморфизма изучаемых генов. Особый интерес представляли выявленные несинонимичные нуклеотидные замены. Семь из них, по результатам факторного анализа и непараметрического теста, оказались достоверно ассоциированы со способностью растений люцерны восстанавливать ростовые процессы в условиях засоления. Молекулярные маркеры, разработанные для этих SNP могут быть использованы для маркер-вспомогательной селекции солеустойчивых сортов люцерны.

ВЫВОДЫ

1. У изученной выборки образцов люцерны из коллекции ВИР выявлен высокий уровень изменчивости по характеру реакции на засоление, как среди растений одного образца, так и между образцами.

2. По результатам вегетационных экспериментов образцы M. varia к-25782 (сорт Тибетская) и M. coerulea к-12821 являются наиболее солеустойчивыми и могут рассматриваться как источники ценных аллелей для селекции сортов с повышенным адаптивным потенциалом.

3. В геноме многолетних видов Medicago идентифицированы ортологи для генов рецепторной протеинкиназы Srlk и активируемого им транскрипционного фактора Zpt2-1, формирующих защитную реакцию на засоление у модельного видаМ truncatula.

4.Установлено достоверное повышение уровня экспрессии гена Srlk в корнях солеустойчивого образца M. varia к-25782 (сорт Тибетская) в ответ на солевой стресс, что доказывает роль этого гена в инициации адаптивной реакции на засоление.

5. Последовательность гена Srlk секвенирована у 144 генотипов многолетней люцерны, выявлен 21 SNP, из которых 8 являются несинонимичными. Последовательность Zpt2-1 секвенирована для 70 генотипов, выявлено 15 SNP, из ннх 9 несинонимичных.

6. В последовательностях генов Srlk и Zpt2-1, выявлены несинонимичные нуклеотидные замены, ассоциированные со способностью растений восстанавливать рост и развитие корневой системы в условиях солевого стресса.

7. Для двух нуклеотидных замен в последовательности Srlk (SNP_188 и SNP_480), показавших достоверную ассоциацию со способностью растений выживать и восстанавливать ростовые процессы в условиях засоления, разработаны аллель-специфичные молекулярные маркеры.

18

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи по теме диссертации в рецензируемых журналах из списка ВАК

1. Вишневская М.С., Павлов A.B., Дзюбенко Е.А., Дзюбенко Н.И., Потоюша Е.К. Нуклеотидный полиморфизм гена Srlk, определяющего устойчивость к засолению люцерны посевной (Medicago sativa L.) // Генетика, 2014, том 50, № 4. С. 433-442.

Vishnevskaya M.S., Pavlov A.V., Dzyubenko E.A., Dzyubenko N.I., Potokina E.K. Nucleotide Polymorphism of the Srlk Gene That Determines SaltStress Tolerance in Alfalfa (Medicago sativa L.) // Russian Journal of Genetics, 2014, Vol. 50, No. 4. P. 378-386.

2. Вишневская M.C., Косарева И.А. Концентрация поглощенных ионов натрия и калия в тканях растений Medicago sp., различающихся по солеустойчивости // Известия Санкт-Петербургского государственного аграрного университета, 2015, № 38. С. 26-29.

3. Егги Э.Э., Вишневская М.С., Агеева П.А., Мехтиев B.C., Гаврилюк И.П., Гапонов Н.В., Красильников В.Н. Использование полиморфизма белков семян для сортовой идентификации люпина узколистного (Lupinus angustifolius L.) // Аграрная Россия, 2012, № 4. С.2-8.

4. Дроздов Е.В., Асямолов П.О, Вишневская М.С., Нам ИЛ., Заякин В.В. Влияние условий культивирования на регенерацию и каллусогенез эксплантов из зародышей люпина // Вестник БГУ, 2007, Т.4. С.31-34.

Статьи в сборниках

1. Дзюбенко Н.И., Вишневская М.С., Павлов A.B., Дзюбенко ЕЛ., Потокина Е.К. Нуклеотидный полиморфизм гена Srlk, контролирующего устойчивость к засолению у люцерны посевной {Medicago sativa L.).- В сб. Многофакторное адаптивное кормопроизводство, М., 2011. С.231-241.

Учебные пособия

1. Никитина В.В., Вишневская М.С. Селекция растений. Культивирование изолированных тканей и органов растений в условиях in vitro : практикум. — СПб.: Изд-во Политехи, ун-та, 2015. - 32 с. ISBN 978-5-7422-4712-8.

Статьи в сборниках трудов конференций

1. Dzyubenko N.I., Vishnevskaya M.S., Pavlov A.V., Dzyubenko E.A., Potokina E.K. Nucleotide polymorphism of Srlk gene revealed for alfalfa genotypes that differ in their salt stress resistance. // Proceedings of the 19th EUCARPIA General Congress 21-24 May 2012, Budapest, Hungary, pp.86-92

2. Вишневская M.C., Потокина E.K., Дзюбенко E.A., Дзюбенко Н.И. Нуклеотидный полиморфизм гена Srlk, определяющего рекацию на солевой стресс у видов Medicago L. II II Всероссийская молодежная научно-практическая конференция «Перспективы развития и проблемы современной ботаники» ЦСБС СО РАН г. Новосибирск 5-8 октября 2010 г. С. 262-264.

19

3. Vishnevskaya M.S., Pavlov A.V., Dzyubenko E.A., Dzyubenko N.I., Potokina E.K. Development of molecular markers for genes underlying salt stress resistance in Medicago L. species // Материалы международной школы молодых ученых, ИЦиГ СО РАН, 26 - 30 августа 2011, Новосибирск «Bioinformatics methods and next generation sequencing technologies», 2011, P. 20

4. Вишневская M.C., Косарева И.А., Двуреченский B.H., Дзюбенко Е.А., Дзюбенко Н.И. Определение концентрации ионов натрия в листьях видов Medicago sp., выращенных в условиях засоления // Генетические ресурсы растений - основа продовольственной безопасности и повышения качества жизни / Тезисы докладов международной научной конференции, посвященной 120-летию основания института, 6-8 октября 2014 г. - СПб.: ВИР С. 49.

5. Дзюбенко Н.И., Вишневская М.С., Дзюбенко Е.А., Косарева И.А., Потокина Е.К. Аллельное разнообразие генов, определяющих устойчивость люцерны к засолению // Генетические ресурсы растений - основа продовольственной безопасности и повышения качества жизни / Тезисы докладов международной научной конференции, посвященной 120-летию основания института, 6-8 октября 2014 г. - СПб.: ВИР. С. 56.

Формат 60x84/1 б.Бумага офсетная. Печать офсетная. Объем: 1,5 п.л. Тираж: 100 экз. Заказ №. 51-715 Отпечатано в типографии ООО «Р-Копи» 190000, Россия,Санкт-Петербург,пер. Гривцова, д. 6, лит. Б