Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Нуклеотидная последовательность и экспрессия гена, кодирующего токсин типа К2 и иммуноность к нему у дрожжей SACCHAROMYCES CEREVISIAE

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Нуклеотидная последовательность и экспрессия гена, кодирующего токсин типа К2 и иммуноность к нему у дрожжей SACCHAROMYCES CEREVISIAE"

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ ЛИТОВСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

МЕШКАУСКАС АРТУРАС

НУКЛЕОТИДНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО ТОКСИН ТИПА К2 И ИММУННОСТЬ К НЕМУ У ДРОЖЖЕЙ 8ассЬагошусе5 сегеу181*ае

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соиснание ученой степени нандидата биологических наук

ВИЛЬНЮС - 1991

Работа .выполнена в Лаборатории генетики Института ботаники Литовской Акадеши наук.

Научный руководитель - кандидат биологических наук

Д. ЧИТАЗИЧЮС

Официальные оппоненты - доктор биологических, наук

Ы. Д. ТЕР-АВАНЕСЯН

- кандидат биологических наук К. САСНАУСКАС

Ведущая • организация. - Кафедра биохимии Естественного

факультета Вильнвского Университета.

Защита диссертации состоится /?. декабря 1991 г. в /.'. часов на заседании спешализировайного совэтб К ОН.05.01 в Институте биохимии Литовской Академии наук (232021, г. Вильнюс, ул. Мокслининку, 12),

С диссертацией мояно ознакомится в библиотеке' Института биохимии Литовской Академии наук.

Автореферат разослан .Л ноября 1991 г.

Ученый секретарь специадазированного совета, кандидат биологических наук

. Ф. ЗОВИТЁ-ЕРАЖЕНЕНЕ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность тепы. Кшшернно штаммы S. cerevlsiae сокрэтируют токсины, по своей специфичности составляющие два основные группы: KI и КЗ. Токсины кодируются разными молекулами двунитевой РНК (днРНК), Ml и.М2, входящими в состав нвинфзктиЕШх вирусных частиц. Исследование первичной структуры и организации генов, кодирующих токсин и устойчивость у III К2 типов вирусов необходимо по следующим положениям. Первое, процессянг п секреция токсина могут изучатся как общая модель процвссипга к секреции белков в аукариогах. Второэ, изучение механизма действия токсина моеэт послужить моделью в понимании действия гормонов и нежклеточных коммуникаций. Однако, изучение генома вирусов, входящих в кшшрную систему S, cerevlsiae, в основном было сконцентрировано на системе 'EI типа. Ген, кодирующий токсин и иммунность IC2 'типа до настоящего времени не был секвенирован в связи с трудностями при син-.тезэ да, кошлегаентарноа к вирусной днРНК (кДНК). Поэтому установление первичной структуры гена, кодирующего токсин и иммунность КЗ тша' является необходимым этапом в исследовании органи зации киллерных токсинов. Кроме того, прямое сравнение геномов двух типов вирусов обеспечивает более полное представление о структурно-фушошональной организации киллерной системы Sacctero-шусеа cerevlsiae. Таиш образом, актуальность данной теш обусловлена необходимость® получения информация о структуре генов на М2 днРНК сегменте генома вируса К2 типа для выяснения организации и проявления киллерной системы БассМаготусез cerevlsiae..

Работа выполнена по теме Института ботаники Литовской АН "Создание и анализ модальных генетических систем на клеточном уровне для селективного изучения изменчивости и биологической продуктивности генома с целью создания высокопродуктивных корме-вше культур" (й Госрепистрации 022814) и является составной частью Всесоюзной научно-технической программы "Новейшие метода биоинжвнвряи". ч .

Полу исследования: изучение структуры генов в участке вирусной М2 днРНК, определяющем продукцию токсина и иммунность.' Задачи исследования':

1) провести синтез и клонирование ДНК, комплементарной к М>;~1

сегменту вирусного генома;

2) определить нуклэотидную последовательность клонированного участка вирусного генома, выявить первичную структуру гена токсина-иммунности. - . ■

3) провести экспрессию кДНК в дрокжах.

Научная новизна работы. Впервые проведен сштез и клонирование кДНК, величиной в 1144 п.н., почти полностью перекрывавдей M2-I даРЖ фрагмент и включающей ген токгаша-иммувности К2 типа. Определена нуклеотидная последовательность гена • токсина-ишунности К2 тша, 'состоящего из 362 кодонов, включающая ранее устаковлещую (Harnlg and Lelbowitz, 1985) 210 п.н. 5'-концвврз последовательность. Впервые проведена экспрессия клонированного гена К2 токсина-иммунности In vivo и показано, что токсин и иммунность кодируются одной открытой рамкой считывания., расположенной на M2-I днРНК фрагменте. На аминокислотной последовательности предшественника токсина 1(2 тша выявлены потенциальные =-сайты гликозилирования и процессинга, осуществляемого KEXI -и КЕХ2 кодируемыми протеазаш. ,

Практическое значение работы. Селективные прзимугэства клеток дроетгай, обладающих клониро'ванным геном токсина-иммунности, используются в.Лаборатории гене шеи Института ботаники Литовской АН для стабильной поддержки шазвдц. Нуклеотидная последовательность кДНК, представленная в работе, зарегистрирована в банке данных Европейской Лаборатории Молекулярной Биологии (EMBL, Гей-дельберг, ФРГ) под номером X54I54 и- может быть использована в научных лабораториях, ведущих работы- по генной инженерии и молекулярной биологии. На базе гена токсина-иммунности могут быть сконструированш дрожжевые векторы для секреции белков.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на отчетной конференции по Всесоюзной программе "Новейшие метода био-инкенерии" (Пущино, 1990), на научных, конференциях Общества генетиков и селекционеров Литвы (Вильнюс, 1988, 1991), и мзадународном симпозиуме по вирусам грибов и низших эукарйотов (Мальерка, 19Э1). ■ '

Публикации. По теме диссертации опубликованы 4 статьи и тезисы 5 докладов. - ' •

Структура и объем работы. Диссертация состоит. из введения,

обзора литературы, материалов и методов исследован.,.а, экспериментальной части и обсуждения результатов, обобщения, выводов, списка литература тиз(9$ наименований. Диссертация изложена на/2*3страницах машинописного текста, содержит/■? рисунк^и^ таблицы.

МАТЕРИМЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.-

Объект исследования: M2-I сегмент днРНК вирусоподобных частиц типа К2 дроккей Saccharomyses cerevlslae. Штамм S. cerevlslae Po-манешти KIOO (гомоталичный прототроф, [KI1-K23) (Jokantalte et al., 1982) служил в качестве донора М2 днРНК для синтеза кДИК. Штаммы S. cerevlslae:'КТа (a, arg9, [KIL-ld ]), получен от Е. А. , Бивана, М437 (гомоталичный прототроф, [KIL-K2I), получен от Г. И. Наумова, использовании в качестве тестеров киллерной специфичности. Штемм а'1 (а, 1еи2), суперчувствитэльшй к токсинам типов KI и К2 .(Читавичюс и Инге-Вечтоыов, 1972), был использован для экс-" . прессии. гена' препротокскна К2 тала и а качестве чувствительного тестера для определения киллерной активности. В работе использованы штаммы Е. coll: SCSI (F~, ehdA1, hsdR17(r£, m£), supE44, thl-1, recA1, gyrA96, ге1А1), в качестве реципиента при конструировании рекомбинантных ялазмид,. штамм ХЫ (endA1, hscffi17(r^, m£), supE44, thl-1, AT, recA1, gyrA96, relA1, A(lac), IF', proAB, lacl^, ZAM15, Tn10(tet)r, для клонирования в плазмиде plIC18. Оба шташа получены из фирмы Stratagene Cloning Systems.

Плазмнда pUC18, (Vlelra and Мезз1щ^ 1982) использована для клонирования и секвенсирования кДНК. Плазмида pAD4, величиной в 8,2кб, получена от М. Виглера, содержит оридкшщ репликации colli и 2ц плазмида дрожкей, ген устойчивости к акшицилину, ADH1 промотор, LEU2 геи .и полилинкер от pU018. Плазмида была-использована для экспрессии кДНН в дрожках.

Для выделения днРНК применяли методику, описанную в (Skipper et al., 1984). Синтез первой цепи кДНК проводили в основном по методике (Skipper, 1983) с небольшими модификациями, включающими более жесткие условия денатурации днРИК, присутствие в реакционной смеси актиноницина Д й более высокую концентрацию обратной транскриптазы. Синтез второй цепи проводили по (Gubler and Hoffman, 1983). Нуклеотидную последовательность определяли методом

Сэнгера (Sanger et al., 1977)., Киллерную активность и чувстви-тельвость клеток определяли со методике (Woods and Bevan, 1968).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССВД0ВА1Ш И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

I. Синтез и клонирование «ДНК.

Ко времени начала данной работы уке имелись сведения о том, что ген(н) токсина и устойчивости К2 типа может, быть расположен на M2-I сегменте вирусного генома . (Hannlg and leibowltz, 1985; Boatian et al., 1980). Исходя из этого, задачей данного раздела работы являлось синтез кДНК к по возможности протяженному участку M2-I фрагмента. Обычная стратегия синтеза кДНК с вирусных днРНК (Dyall-Smith et al., 1983; Nemeroff et al., 1988) оказалась мало пригодной для копирования М даРНК сегментов вирусов S. cerevisi-ае. Наибольший фрагмент кДНК, полученный тагам путем с.Ml днРНК, составлял 450 нуклеотндов. Однако, праймироваше обратной транс-криптазы с внутреннего нолкА участка позволило получить более протяженные копии Ml дйРНК (Skipper et al., 1984).

Структурно Ш днРНК может бнть разделена на два двунитевые фрагмента, M2-I (1050 п. н.) и М2-2 (370 п.н.), разделяемых на гшос цепи расположенным внутренним полиА (Hamig and. Leibowltz, 1985). Обработка частично денатурированных днРНК нуклеазой• S1, специфичной к одаонитевым ДНК и РНК, показало наличие полиА/У участка на 'Ш даРНК из штамма Романешти KI00. Впоследствии гидролиза М2 образуются два фрагмента, идентичные по подвижности с М2-I и М2-2 фагменташ контрольного штамма М437 (Рис.1,А). Таким образом, Ы2 днРНК штата Романешти KI00 имеет величину и структуру, характерные для К2 типа киллеров (Hannig and Leibowltz, 1985). Наличие поли А/и участка' на М2 днРНК из штамма Романешти KI00 позволило использовать для праймирования обратной транскрип-тазы олиго <(ЗТ) 12_1 в» комплементарный к внутреннему полиА. Синтезированную кДНК фракционировали на агарозном геле и анализировал!-: радиоавтографиой (Рис.1,Б). Данная стратегия позволила получит! кДНК величиной от 500 до 1144 п.н.

Чтобы удостоверится в том, что синтезированная кДНК представляет последовательность нуклеотидов, комплементарную к М2 днРНК,

Б Б

ЗООгийт-

- мн

Рисунок I. А) Электрофореграмма днРНК. 1-штамм К7а; 2-штамм М437; 3-гатамм Романешти HIOO; 4, Б, 6-днРНК соответствующих штаммов после гидролиза S1- нуклеазой. Б) Типичные продукты синтеза кДНК.

В) Авторадиограша гибридизации кДНК с тотальными нуклеиновыми кислотами штамма Романешти KIOO. • 1

100 п.н.

|——| Bst EII

Pyu II Sma Hind III Взр-МИ

Pst I Hind III Mlu I

Stu I

Рисунок 2. Стратегия и протяженность секвенирования кДНК.

произвели гибридизацию кДНК с нуклеиновыми кислота!,® дрожжей. Нуклеиновые кислоты фракционировали на агарозном геле, денатурировали и переносили на' иигроцеллулозиый фильтр (Southern, 1975). Для oifpeделения локализации кДНН на М2 диРНК часть препарата перед электрофорезом обрабатывали нуклеазой S1 в условиях частичной денатурации. Гибридизацию проводили с меченной кДНК и анализировали радаоавтографиэй. Как и окидалось, кДНК гибридязируатся с M2-I фрагментом (Рис.1, В). Копированная область не имеет Гомологичных участков на' дрозшзвой ДНК, однонитевой РНК, а так же на L днРНК.

Для клонирования фрагментов кДНК нами была шбранна система отбора плазмлд со вставкой по цветовой окраске колоний трансфор-мантов-векторы серии pUG (Vieira anl Messing, 1982; Yanisch-Perron et al., 1985). кДЯК лигировалй с синтеи-хческши линкерами, содержащими сайты узнавания рэстриктазы Baa Н1,;нэ имеющей сайтов узнавания на дДНК. <£рап,'.эпти дЩ£ лигировали с рОЦ18, обработанной рзстриктазой Ван 111. Было отобрано 5 клонов, содержащих плаз-миды со вставкой наибольшей длины.

2. Определение и анализ нуклеотидной последовательности кДНН.

* I

I

Для последующего определения нуклеотидной последовательности кДНК было необходимо получить набор рекомбшантных плазшд, содержащих различные взаимоперекрывающиеся фрагменты кДНК. Пдазмкды с клонированной кДНК обрабатывали доступными рестриктазами и анализировали ве^шчину образовавшихся фрагментов глектрофорезом в агарозном геле. На основании полученных данных была построение рестрикциошая карта клонированной кДНК (Рис. 2), служившая основой при конструировании рекомбинантшх плазмид .для секвенирова-ния. Стратегия и протяженность секвенированля показаны на Рис. 2. Таким образом были секвенированны. обе цепи пяти независимых клонов кДНК* величиной 1144, 1137, 1129 и III5 п.н.

Нуклеотидная последовательность M2-I фрагмента, представленная на Рис. 3, получена в последствии комбинации ранее известной 5'-концевой последовательности М2 днРНК (Hannlg and Lelbowltz, 1985, нуклеотиды I-I9) с последовательностью кДНК. Все пять клонов кДНК имели общие перекрывающиеся последовательности. Наиболь-

OPC I

gaaaaaaugaaagagactaCCACCAGCCTGGTGCAAGACGAGCrGACACTAGGTGAGCCG 60 •Me t LysGluTlirThrThrS erLeuYal G InAspG luLeuItirLeuG 1 yG luPro 18

GCCACCCGAGCAAGGA'PGTGCG,IACGTGTATTAGGTTTm'GATA<3GTC'DGAGTAiIAAGG 120 AlaThrArgAlaArgMetGysValArgLeubeuArgPhePhelleGlyLeuTIirlleThr 38

GCATMATTATAGCAGCCTGTATTATTAAAAGTGCGACAGGCGGTTGGGGAiEATTCTAAT 180 AlaPhellelleAlaAlaCysIlelleLyBSerAlaTlTrGlyGlySerGlyTyrSerAsn 58

GOAGFTGCTGTTCGGGGAGMGCGG/GACCCCTrCCACAATTGTGGGCCAGCTCGTCGAG 240 AlaValAlaYalArgGlyGluAlaA.spThrProSeiihrlleVa.lGlyGlnLeuValGlu 78

CGTGGCGGOrTGCAAGCTTGGGCAGTGGGGGGTGGTATGTATTrGOTGCCAAGATAGCA 300 ArgGlyGlyPlieGlnAlaTrpAlaValGlyAlaGlyIleTyi-beuPheAlaI,ysIleAla 98

TATGATACATCTAAGGmCCGCAGCTCTATGTAATCGGGAGGOGGTGATTGCTATGAGA 360 TyrAspTta-SerlysValTfirAlaAlaValCyaAsnProGluAlalfiuIleAlalleThr 118

TCGTATGTGGOATATGCGCCTAGACTGTGTGGTGG'iGCATAGGrrATrGGTGCGATGAGT 420 SeiTyrYalAlaTyrAlaProTlirLeuCyaAlaGlyAlaTyrVallleGlyAJalietSer 138

GGGGCAATGrOGGCGGGCCTTGCTCTGTATGGGGGTTACAAAGGATGGCAGTGGAGCGGO 480 GlyAlaHetSerAlaGlyLeuAlaLstffyrAlaGlyTyrbysGlyirpGlnTrpSerGly 158

CCCGGGGGCATGGGAGAGAGAGAGGACGTGGCCTCTTTTTATTCACCACTCCTGAACAAC 540 ProGlyGlyiretAlaGluArgGluAspValAlaSerPheTyrSerProLeuLeuAsnAsn' 178

ACTCTGTAGGTGGGTGGGGACCACACTGGAGACrACGACAGTGAAOTGGCTAGTATATTA 6G0 TlrrLeuTyi'ValGlyGlyAspHIsTlirAlaAspTyrAspSerGliileuAlaTrirlleLeu 198

GGTAGCGTATATAATGATGIGGTCGACCTGGGGGTGTATTAGGATAACAGCACTGGAATT 660 GlySerValTyrA siiAspVal ValHi sLeuGlyValTy rTyrAspAsnSerTiirGlyll e 218

GTCAAGAGGGATTGGAGACCTAGCATGACCTCATGGACGGTGTTGCATGACAACATGATG 720 ValLysArgAepSerArgProSer'ietTta*SerTrpTiirYalLeyHl3AspAsffletfiet 238

ATMCATCATACCATAPGGCAGAGGAGCTGGGCGCAGGCGCGAGAGCGTACAAAGCTTAT 780 IleThrSeiiyrHisArgProAspGlnLeuGlyAlaAlaAlalihrAlaTyrLyaAlaTyr 258

GCCACAAAOACAAGACGGGTCGGTAAGAGGCAGGAGGGTGAGTGGGTGTCATAGTCGGTC 340 AlarhrAsnThrTbrArgYalGlyLysArgGlnAspGlyGlurrpValSerTyrSerYal 278

TACGGTGAGAATGTTGACrATGAAAGATACCCTGTAGCACATCTGCAAGAGGAGGCCGAC 900 Tyi^lyGluAsnValAspTyrGluArglyrProYalAlalliQLeuGlnGluGluAlaAsp 298

GCGTGTTACGAGAGTTTAGGTMFATGATTACGAGCCAGGTACAGGCGTGTAGTCAGAGA 960 AlaGysTyTGlviSerLeuGlyAsMetIleTltrSei<31nValGlnProGy3TUrGlnArg 318

GAATGTTATGCTATGGATCAGAAAGTATGCGGAGCTGTCGGCraCTCATCAGA'EGCGGGT 1020 GluCysTyrAlaMstAspGlnXysValCysAlaAlaValGlyPiieSerSerAMpAlaGly 338

GTTAACTCCGCAATGGTCGGTGAGGCGTACTTCTATGCCTATGGTGGGGTTGATGGTGAA 1080 . ValAsnSerAlaMetValGlyGluAlaT/rPiieTyrAlaTyrGlyGlyValAspGlyGlu 358

TGTGACAGGGGCTAGGATAGGATATAAATAATATATTAATAAHCAAAATAATAAAAATA I140 CysAspSerGlyEnd. 362

TAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

Рисунок 3. А) Поолэдовательность нуклеотидов кдНК и последовательность аминокислот, кодируемух ОРС I. 5'-концевые 19 нуклеотл-дов (отмечены малыш буквами) определены прямым сэквенировашгем РНК (Hannig and Lelbowitz, 1985).

пшй секвенированный клон кДНК в рзкомбинантной плазмиде рК1-1 составлял последовательность 20-1163 нуклеотидов на M2-I сегменте. Кошьштерный анализ нуклеотидаой последовательности, проведенный с целью поиска открытых рамок считывания (ОРС) длиной не менее F0 кодонов, выявил наличие одной продолжительной ОРС I (Рис. 3). Наш идентифицированная ОРС I продолжает ранее предположенную ОРС (68 5'-концевых кодонов, Hannlg ani leibowltz, 1985) и составляет 362 кодона. ОРС I кодирует белок величиной-в 38,7 кД, коррелирующей с величиной продукта трансляции М2 днРНК In vitro (Hannlg and Leibowltz, 1985). Других существенных ОРС не найдено на нуклеотидаой последовательности обеих цепей. QPC I фланкирована короткой 5'-концевой последовательностью и значительно более продолжительной 3'-концевой некодирушдей последовательностью, заканчиваю-, щейся поли А. Эта последовательность 21 остатка аденина, по вида-'мому, проставляет начало внутреннего шли А участка. Все нуклео-тида совпадают в ранее установленной 210 п.н. перекрывающейся области М2 днРНК (Hannlg and. Leibowltz, 1985) за исключением позиции 31, 68,, и 289. Эту часть последовательности мы определяли несколько рай .на независимых- клонах кДНК. Следовательно, мы можем быть уверенными, что она соответствует последовательности , ,М2 днРНК, выделенной из штамма Романешти KI0Q. Несовпадающие нуклео-тиды в двух случаях приводят к разным аминокислотам и, возможно,..• представляют собой полиморфизмы мевду М2 днРНК из разных штаммов. В ОРС I можно обнаружить еще несколько фазовых ATG, но по принятым критериям (Hltzeman et al., 1981;- Hannlg et al, 1984; Tlilele et al., 1982; Hannlg and Leibowltz, 1985; Tlilele and Leibowltz, 1982; Kozak, 1984) первый фазовый ATG, по видимому, является инициирующим. Косвенным свидетельством этого является тот факт, что при попытке экспрессировагь кДНК, включаш,лй последовательности 20-1163 М2-1 (т.е. несодержащей ATG 7-9, но включавшей ATG 76-78) не наблюдалось проявления киллерной активности и устойчивости к токсину (см. гл. 3). ' ■

Сканирование банка генов с использованием программы PASTA не выявило значительных гомология с последовательностью кДНК. Не было обнаружено значительных гомология и с геном KI препротоксина. Однако, сравнение встречаемости кодонов в ОРС I и в- гене препротоксина КГ типа (Boatlan et al., 1984) выявило, что по встречав-

мости синонимических кодонов гены КГ и К2 токсинов близ1си мекду собой. Вакно'отметитьчто в генах KI. и К2 токсинов встречаются редкие кодоны, не используемые даже в очень слабо экспрессируемом гене изо-2-цитохрома С. Встречаемость синонимических кодонов в OPG I, следовательно, соответствует низкому уровню мРНК киллерных токсинов (0,003% тотальной РНК; Bostlan et al., 1983;Bennetzen and Hall, 1982). '

3. Экспрессия кДНК в дрожжах.

Сравнение нуклеотидной ' последовательности наибольшего нами клонированного фрагмента кДНК с известной 5*-концевой последовательностью М2 даРНК (Hannig and Lelbowitz, 1985) выявило, что клон кДНК не содержит 19 5'-концевых нуклеотидов М2. днРНК, включающих и предпологаемый старт кодон. Мы попытались произвести экспрессию этого фрагмента кДНК в дрокжах используя вектор экспрессии pAD4. Полученными гибридными плазмидами, содеркащими кДНК в разных ориентациях по отношению к ADH1 промотору, трансформировали штамм "дрожжей а* 1. Трансформанты, тестировали на проявление киллерного'фенотипа. Тест кшшерности' показал, что клон кДНК с отсутствующими 19 5*-концевыми нуклэотидами Ы2 днРНК, включающими первый ATG, не способен обеспечить экспрессию токсина и устойчивости независимо от ориентации по отношению к АШ1 промотору.

Далее для экспрессии кДНК' в дронс&х 'мы модифицировали полилинкер плазмиды pAD4. Для этого использовали синтетические олиго-нуклеотиды, "с учетом восстановления старт-кодона, расположенного в трех фазах по отношению к ОРС I с наиболее приближенным к М2 днРНК инициирущим контекстом. Фрагмент кДНК из плазмиды рК1-1 переклонировали в Bam Н1 сайт модифицированных полилинкеров плазмиды pAD4. Таким образом.было отобрано шесть рекомбинантных плаз-мид, различающихся по фазз трансляции кДНК и ориентацией вставки КДНК по отношению к ADH1 промотору. Рекомбинантными плазмидами трансформировали чувствительный штамм S. cerevlsiae а'1 и проверяли киллерную активность трансформантов. Для проверки специфичности токсина, выделяемого трансформантами, использовали газоны штаммов К7а и М437. В контрольных экспериментах использовали штамм а'1, трансформированный векторными плазмидами. Шшзмидэ

pH2-II, содеря;ащая ATG в одной фазе с ОРС I и кДНК, ориентированную к АБК1 промотору как показано на Рис. 4, обеспечивала трансформантам килдериую активность и иммунность, идентичные штамму Романеити KI00, Остальные плазмиды, .содержащие предполагаемый шициирующзй ATG в других фазах или кДНК в противоположной ориентации, на обеспечивала продукцию токсина и устойчивости. Способность трансформантов'плазмидой рК2-11 проявлять киллерный фенотип и иммунность, а также отсутсвие этих фенотипов при сдвиге фазы, подтверждает корректность оцределенной секвенированием открытой рамки считывания. Так как клон кДНК содержит лишь одну существенную ОРС, то токсин и иммунность наверняка кодируются ОРС I. Эксперименты по экспрессии кДНК также выявили, что произведенные в последствии кодификации pAD4 вектора изменения чётырех Н-концевых аминокислот (Рис. 4) транслируемого белка не приводят к существенным изменениям в киллерной активности и в проявлении иммунности.

ADH1 промотор-> • ' .

Sal 1 Вт Н1 ' •

TCGACGGAGGÁAAAMTGAGGATCCGGGCC ...

MetGlylleArgála ...

Рисунок 4. 5*-кондовая последовательность кДЖ в плазмиде рК2-11. Показаны изменившиеся впоследствии модификаций полклинкера И-концевые аминокислоты.

4. Анализ последовательности аминокислот, кодируемых 0PCI.

Последовательность аминокислот, кодируемая 0PCI, не имеет значительных гомологий с препротоксином KI типа. Также не найдено значительных гомологий сканированием банка бвжов NBRP с использованием программы FASTP. Однако, по аминокислотному составу и суше конформаций бежа токсины KI и К2 типа являются похожими (таблица I). В а гаю отметить, что у, токсина К2 типа кислотные аминокислоты преобладает в С-концевой части,. что характерно и для токсина KI типа (Bostian et al., 1984). Вычисленные pl обеих токсинов близкие к рН их максимальной стабильности. Как и KI препро-токсин, предпологаемый Л2 цредшественник содержит потенциальные

-Ii-

Таблица I. Сравнение предшественников К2 и KI токсинов по амино-. кислотному составу и*процентносга конформациопных состяний бежа*

К2 К1 К2 К1 K2 K1 K2 Kl

Неполярнне Число Процент Полярные Число Процент

Alff А 47 26 12,9 8,2 ■ Gly G 37 23 10,2 7,3

Val V 30 25 8,2 7,9 ,_Ser S 27 25 7,5 7,9

Xeu Ь 22 25 6,1 7,9 ' Thr T 27 24 7,5 7,6

Не I 16 19 4,4 6,0 Суз 0 9 6 2,3 1,9

Pro Р ' 10 tz 2,8 3,8 "Туг Y 26 11 7,2 3,5

Met М 11 6 3,0 1 ,9 Asn N. 11 19 3,0 6,0

Phe -1 8 11 2,2 3,5 Gin Q 11 7 3,0 2,2

Trp W 5 . . 9 1 ,4 2,8

Кислотные Asp D Glu Е

Число 19 21 • 18 14

Процент 5.3 б,б 4.9 4,4

Основные Число • Процент

Lya К .9 13 2,5 4,1

Arg R 14 9 3,9 2,9

His ' H 5 11 1,4 3,5

Предсказание общей проценгности конформаций бежа

KI

а спираль

ß слой ß поворот случайная

<Н) [DG (Е) [ВО (!')■ [ВО ЛС) [DC

а-спираль Р-слой ß-поворот случайная

(Н) [DC

(Е) [ВС

(Т) [DC

(С) [D0

-75 ]

-88 ]

О 1

а ]

К2

-75 1 -88 1 О ] .0 ']

98. АК =>, 31.0% 138 АК => 43.6% 53 АК => 16.7% 27 АК => 08.5%

112 АК => 30.9% 188 АК => 51.9% 29 АК => 08.0% 33 АК => 09.1%

*Вторичнш структуры вычислялись по методу (Garnier et al., 1978) с указанными коэфициентами. АН-число аминокислот.

сайты гликозилирования Asp-X-Thr/Ser на остатках аспарагинч в позициях 177, 214, и 261. Предполагается, что для. доступности сайтов гликозилирования in vivo остатки аспарагкна должны находится в изгибе или в р слое (Aubert et al., 1976; Beeley et al., 1977). Так как предполагаемые сайты гликозилирования в позициях 177 и 214 находятся'в изгибе, a Asn^ в р слое, то, по крайней мере по этим критериям, они мргут быть доступны для гликозилирования.

Как и в случае KI киллеров для продукции.активного К2 токсина требуется'процессию? КЕХ2 и KEXI кодируемыми протеазамн (Wickner, 1986). Поэтому неудивительно, что мы' обнаружили. сайты узнавания этих протеаз на аминокислотной последовательности предшественника К2 токсина, включающие lys22oár^21 и ^¿вТ^ВгбВ' в настоящее время неизвестно, действительно ли происходит расщепление по обеим сайтам при процессинге предшественника. Однако, при изучении специфичности КЕХ2 протеазы установлена' определенная закономерность контекста. Как правило, расщепление происходит за двумя основными аминокислотами если в -2 позиции находится алифатический радикал содержащая аминокислота (Тао et ai., 1990). Исходя из этого требования, оба сайта на К2 предшественнике могут быть доступны для расщепления КЕХ2 протеазой. После публикаций наших исследований была опубликована работа по определению нуклеотидаой последовательности, и экспрессии гена препротоксша К2 типа (Dignará et al., 1991), подтверждающая нами полученные соответствующие данные. Однако, в этой работе представленные данные позволяют предполагать, что процессинг по сайту LySgg^Argg^g может быть менее существенным для проявления киллерной активности.

Важное различие между прецротоксинами KI и К2 типов представляет отсутствие Pro-Arg последовательности на предпологаемом предшественнике К2 токсина. В препротоксине KI типа эта последовательность является еще одним .сайтом процессинга, осуществляемого еще неидентифицированной протеазой (Bostlan et al., 1984). Возможнёя независимость.проявления киллерного фенотипа К2 типа от процессинга этой протеазой представляется важной, ранее.не отмеченной, особенностью. ■".,.' , . •

Анализ гидропатического профиля по методу (Kyte and Doolit-tle, 1982) выявил сильно гидрофобный участок, расположенный между амщюкислотнымИ'-остатками 27 и 45 (Рис. 5). Согласно пршйтым ха-

рактеристикам (Von Heine, 1986) можно .предполагать, что эта последовательность представляет собой сигнальный пептид, с наиболее предпочтительным сайтом расцепления сигнальной пептвдазой мезду аланинами 43-44.■ Предполагаемый сигнальный пептид рйсполояен и на N-концввой части KI препротоксшш (Boatlan et al., 1984). Оба сигнальные пептида щяош по величине, превышающей величины сигнальных "йослэдовательностей большинства секретируемых белков и своей вторичной структурой (Hannig and Leibowits, 1985). Однако, существенное различие мекДу этими последовательностями заключает-ея в растоянии от N-конца. Перед возможным сигнальным пептидом К2 токсина расположена Ií-концввая гидрофильная последовательность из 26 аминокислот, о функциях которой трудно судить.

Опираясь на анализ гидропатичности, на данные о идентифзциро-ванных потенциальных сайтах процессшга и глккозилировашя мы предлагаем гипотетическую схему структурной организации препро-токсина К2 типа (Рис. 5). На Н-концевгй части расположена.предполагаемая сигнальная последовательность <3, за ней следует сравнительно гидрофобный-гликозилированный а домен, дальше гидрофильные 7 оубъединица и р домен. Как и КГпрепротоксьн, предполагаемый К2 предшественник содержит насколько остатков цистейна. В KI токсине они образуют «.дасульфвдные мостики мевду аир еубъедишщвми токсина (Lolls et al., 1984). Вполне вероятно, что похожие гетерода-мэры'шжет образовать и токсин К2 типа. Известно, что токеин К2 типа секретируется в виде гликозилированного белка 21,5 кД, состоящего по крайней.каре из двух субъедшшц-'(В. Y.'Thomas, личное сообщение). Эти датшв подгвервдаот'яамн предполагаемую структурную организацию препротоксина типа К2. '

Привлекают внимание общие черта структурной организации пре-протоксинов KI и К2 типов: в обеих случаях токсин и-иммунность кодируются одной рамкой считывания; оба препротоксина содержат сравнительно большие предположительные сигнальные последовательности с почти идентичными вторичным! структурами белка; обе молекулы содержат потенциальные сайты гликозилирования и КЕХ2 протеа-зой осуществляемого процессинга. Гидрофобные области а субъединицы KI токсина определяют киллерную активность и устойчивость (Sturley et al., 1986; Boone et al., 1984), а гидрофильная p субъединица предположительно участвует в связывании с рвцептора?*и

Рисунок 5. Сравнение структуры KI (Boone et al., 1986) и.К?; пре протоксинов. Профили гидропатичности определены по (Kyte аг Doollttle,' 1982). Показаны сайты процвссинга на предаестданниш К2 (предпологаемые) и KI токсинов. Отмечены гипотетический а, р 7 домены препротоксина К2 типа. Потенциальные сайты гликозилирс ваши отмечены черными кружочками.

клеточной стенки (Sturley et al., 1986). Несмотря на то, что гидропатические профили KI и К2 предшественников неидентичны, можно отметить похожую общею гидропатично с т ь соответствующих доменов, а сходность их общей организации наводит на определенные аналогии.

Перекрывание последовательностей М2 днРНК и кДНК, величина предсказанного продукта трансляции, анализ последовательности ну-клеотидов "кДНН и кодируемых аминокислот, а также экспрессия кДНК ln vivo позволяют считать, что наш идентифицирована ОРС I кодирует препротоксин К2 типа; По видимому, токсин и иммунность кодируются одним геном, расположенным на M2-I сегменте вирусного генома. 'Полученные н&ми результаты позволили прямое сравнение генов, кодирующих токсины и иммунность разных типов. Наиболее интригующим вопросом этих исследований нам представляется тот факт, что при отсутствии гомологии на аминокислотном уровне, общая организация препротоксшов KI и К2 типов очень похожая по многим характеристикам." Наличие легко манипулируемой и экспрессируемой копии - кДНК гена К2 препротоксина открывает широкие перспективы дальнейших исследований секреции К2 токсина, структурно-функциональной организации и механизмов проявления'киллерности и иммунности.

вывода

1. Примененные метода синтеза кДНН позволили получить почти . полноразмерные (1144 п.н.) копии M2-I фрагмента днРНК киллерного вируса дрожжей Saccharomyces cerevlslae.

2. Впоследствии определения нуклеотидаой последовательности клонированного участка вирусного генома выявлена открытая рамка считывания протяженностью в 362 кодона.

3. При экспрессии клонированной кДНК, оснащенной синтетическим старт-кодоном, в дрожжах "оказано, что токсин и иммунность К2 типа кодируются одной открытой рамкой считывания, расположенной на M2-I фрагменте вирусной- днРКК.

■ 4. На основе анализа последовательности аминокислот, кодируемых геном токсина-иммунности, предложена гипотетическая схема структурной организации К2 типа препротоксина.

■ 'СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕИАЦКИ:

1. Ыеикаусвас А. Дополнительные характеристики первичных множественных мутантов // Тез. респ. конф.'"Генетика и селекция народному хозяйству".-Ввдьнюс, I98I.-C. 15.

2. Метсаускас А., Читавичюя Д. Синтез кДНК от двухцопочэчшй Ы2 РНК киллеровнх дрожжей S. cerevlsiaa // Tes. рзсп. кохтф: "Проблемы экологического мониторинга к генетические аспекты орнитофауна и других организмов.",-Вильнюс, 1988.-С. 173.

3. A. ЫевКаивКвз, Т. Jokantaite. The expression of сВНА clones of yeaat .M2 dDUble-stratided RNA // SBstr. 14th. International conference on yeast genetics and - molecular biology,'^Amsterdam, 1989.-P. 78.

v * V

4. A. Meskauskas, D. Cltaviclu3. Study on killer system of K2 type // Abstr. IMBQ International Workshop on viruses of fungi' and simple eucaryotes,-Mallorca, 1991.-P. 27.

V v V f

5. A. Heskauskas, D. Citavicius. Synthesis and cloning of a сША transcript of the killer toxin-coding»region of the yeaat Ы2 double-strands! B1IA // Experimental Biology (Vilnius).-1991 .-Mr.

3. P. 3. • '

; v ' v

6. A. Keskauskas, D. Citavicius. Sequencing of the toxin and

immunity coding region of the yaast UZ double-stranded RNA // Experimental Biology (Vilnius).-199-1 .-Mr. 3. P. 7. ,

7. A. Meskauskas, D. Citavicius.' The expression of cDNA clone of yeast M2 double-stranded FtNA to yeast confers -both killer and immunity phenotypes // Experimental Biology (Vilnius).-1991.-Nr.

.3. P. 18.

V

8. A. Meskauskas K2 type killer system .in Sacharornyces cerevisiae: structure and expression of cDNA clones of yeast M2 double- stranded ША // Proceedings of the 6th congress of Lithuanian geneticists and breeders. Experimental Biology (Vilnius).-1991.-Nr. 1. P.32..

. 9. A. Meskauakas. The nucleotide sequence of cDNA to M2-1 dsRHA segment. Nucleic Acid Research.-1990.-Vol.' 18.-P. 6720,