Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Нуклеиновые кислоты человеческого молока. Структура и возможные функции
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Нуклеиновые кислоты человеческого молока. Структура и возможные функции"
На правах рукописи
Кулигина Елена Владимировна
Нуклеиновые кислоты человеческого молока. Структура и возможные функции.
03.00.04 - биохимия
Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук
Новосибирск - 2005
Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН
Научный руководитель: к.б.н. Владимир Александрович Рихтер
Официальные оппоненты: д.х.н., профессор Галина Георгиевна Карпова
д.б.н. Николай Борисович Рубцов Ведущая организация: Институт физико-химической биологии
им. А.Н. Белозерского (МГУ)
Защита состоится « ¿^ » 2005 г. в часов
на заседании диссертационного совета Д 003.045.01
при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, г. Новосибирск 90, пр. Лаврентьева, 8
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке
Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН
Автореферат разослан « » в^С^О/ 2005 г.
Учёный секретарь диссертационного совета д.х.н.
Фёдорова О. С.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В настоящее время нуклеиновые кислоты (НК) и их синтетические аналоги получают все большее распространение в научной и медицинской практике не только как инструменты исследования, но и как потенциальные лекарственные средства. Именно поэтому усилия многих научных лабораторий сегодня сосредоточены на изучении способов проникновения нуклеиновых кислот и их производных внутрь клетки, их взаимодействия с биологическими макромолекулами и влияния на физиологические процессы.
В то же время, в последние годы во внеклеточных жидкостях организма млекопитающих были обнаружены собственные соединения нуклеотидной природы, в том числе высокополимерные фрагменты нуклеиновых кислот. Было показано, что некоторые из них играют важную роль в регуляции механизмов функционирования клеток и организма в целом. Эти соединения являются не только необходимыми метаболитами, но выступают как биоактивные вещества!, участвующие в регуляции многих процессов. Известно, например, что нуклеотиды и нуклеозиды молока обладают иммуномодулирующим действием, стимулируя выработку артител, способствуют адсорбции металлов в кишечнике и влияют на синтез полиненасыщенных жирных кислот на ранних стадиях развития новорожденных.
Кроме того, к настоящему моменту накоплены многочисленные данные о повышении концентрации внеклеточных нуклеиновых кислот в организме при онкологических заболеваниях и при аутоиммунных и пульмонологических расстройствах.
Тем не менее, вопросы о механизмах появления, составе и возможных функциях собственных внеклеточных нуклеиновых кислот здорового организма во многом остаются открытыми.
Цель и задачи работы. Целью настоящей работы являлось выделение и характеризация внеклеточных нуклеиновых кислот молока человека, а также исследование их возможных биологических функций.
В ходе исследования решались следующие задачи: - выделение внеклеточных нуклеиновых кислот плазмы молока человека и сравнение их с наборами внеклеточных нуклеиновых кислот других жидкостей организма;
определение концентрации нуклеиновых кисдот р препаратах плази
РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ
плазмы молока
человека;
БИБЛИОТЕКА С Петеру 09
II т Ф
- определение нуклеотидной последовательности внеклеточных нуклеиновых кислот плазмы человеческого молока;
- анализ влияния внеклеточных РНК молока человека на физиологические процессы, происходящие в молоке и культуре клеток молочной железы.
Научная новизна и практическая ценность работы. Работ? представляет собой первое систематическое исследование внеклеточных нуклеиновых кислот молока человека. Впервые проведено выделение набора нуклеиновых кислот молока и их сравнение с наборами внеклеточных нуклеиновых кислот спинномозговой жидкости и плазмы крови. Установлено, что основной формой нуклеиновых кислот плазмы человеческого молока являются фрагменты РНК длиной до 100 нуклеотидных звеньев, обладающие развитой вторичной структурой. Показано, что концентрация нуклеиновых кислот в плазме молока варьирует в интервале от 16 до 58 мкг/мл и является индивидуальной характеристикой донора. Впервые определены нуклеотидные последовательности ряда олигорибонуклеотидов плазмы человеческого молока и показано, что эти олигорибонуклеотиды являются фрагментами рибосомных и транспортных РНК. Установлено, что олигорибонуклеотиды человеческого молока участвуют в процессах фосфорилирования/дефосфорилирования белков молока. Показано, что препараты суммарной РНК человеческого молока оказывают цитопротективное действие на клетки MCF-7 в условиях холодового шока, которое проявляется при низкой плотности клеток. Цитопротективными свойствами обладают фрагменты РНК длиной не менее 30 нуклеотидов.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ. Результаты работы были представлены на международных конференциях "RNA as therapeutic and genomic target" (Новосибирск, 2001), "Chemical and Biological Problems of Proteomics" (Новосибирск, 2004), "Chemical Biology" (Новосибирск, 2005) и 5-ой международной конференции им. Я. Парнаса "Molecular Mechanisms of Cellular Signaling" (Киев, Украина, 2005).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 128 страницах, содержит 23 рисунка Библиография включает 237 литературных источников.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Нуклеиновые кислоты плазмы молока человека
Для выделения нуклеиновых кислот (НК) использовали молоко, предоставленное донорами в различные периоды лактации. Для выявления свободных (не связанных с белками молока) олигонуклеотидов (ОЫ) проводили прямое фосфорилирование нуклеиновых кислот в препаратах молочной плазмы (клетки молока удаляли центрифугированием) в присутствии полинуклеотидкиназы
Рис. 1. Электрофоретический анализ [32Р]-меченых нуклеиновых кислот (НК) плазмы молока человека, а. 1 - плазма молока + [у32Р]-АТР; 2 - плазма молока + [у32Р]АТР + ПНК Т4; 3 - [у32Р]АТР + ПНК Т4. Слева от панели указаны положения в геле олигодезоксирибонуклеотидов длиной 4, 8, 12, 16 нт. б. 1 - [у32Р] АТР + ПНК Т4; 2 - НК плазмы молока + РНКаза А; 3 - НК плазмы молока + ДНКаза I, 4 - НК плазмы молока (контроль). М - набор [32Р]-меченых олигодезоксирибонуклеотидов известной длины. Радиоавтографы 20%-ных ПААГ.
фага Т4 (ПНК Т4) и [у,2Р]-АТР. В результате проведенных экспериментов в молоке человека обнаружили набор коротких олигонуклеотидов, которые, вероятно, находятся в свободном состоянии, так как доступны для прямого кинирования ПНК Т4. (рис. 1, а).
Для выявления полного набора нуклеиновых кислот плазмы молока использовали два подхода.
Первый подход включал протеолиз белков молока протеиназой К и отделение нуклеиновых кислот от продуктов протеолиза ионообменной хроматографией на ДЕАЕ-сорбенте. Данный метод позволил выделить из молока человека олигонуклеотиды длиной до 60 нуклеотидов (нт) (рис. 1, б, дорожка 4).
Второй подход включал экстракцию и осаждение белков молока с помощью системы органических растворителей (хлороформ : изоамиловый спирт). Экстракцию проводили в присутствии детергентов и высокой концентрации соли. С помощью
этого подхода из плазмы молока были выделены как короткие олигонуклеотиды (менее 15 нт) (рис. 2, а), так и набор полимерных (более 100 нт) нуклеиновых кислот (рис.2, б).
Рис. 2. Электрофоретический анализ нуклеиновых кислот (НК) плазмы молока человека в денатурирующем ПААГ. а. 1, 2 - препараты [12Р]-меченых НК из образцов плазмы молока двух различных доноров. Радиоавтограф 12%-ного ПААГ. б. 1, 2 - НК, выделенные из плазмы молока двух доноров 7%-ный ПААГ. Окрашивание бромистым этидием Слева от панелей указаны положения в геле ДНК-олигомеров известной длины.
Необходимо отметить, что молоко - это внеклеточная жидкость организма млекопитающих, которая образуется лишь в периоды лактации. В связи с этим представлялось интересным сравнить наборы нуклеиновых кислот различных внеклеточных жидкостей млекопитающих - спинномозговой жидкости, сыворотки и плазмы крови.
2. Олигонуклеотиды сыворотки крови
Методом фенол-хлороформной экстракции мы выделили из сыворотки
крови олигонуклеотиды длиной до 20-ти нуклеотидов (рис. 3, дорожка 1).
Оказалось, что олигонуклеотиды присутствуют как в альбуминовой, так и в
глобулиновой фракциях сыворотки (рис. 3, дорожки 2, 5). При этом нуклеиновые
кислоты альбуминовой фракции (рис. 3, дорожка 2) представлены более
протяженными олигонуклеотидами, чем нуклеиновые кислоты, ассоциированные с
белками глобулиновой фракции (рис. 3, дорожка 3).
При выделении олигонуклеотидов из сыворотки крови мы использовали
стадию диализа, при которой происходит существенное обеднение диализуемого
препарата по низкомолекулярным соединениям, в том числе по коротким
олигонуклеотидам, не связанным с белками. При этом концентрация 1 2 3 М
Рис. 3. Электрофоретический анализ [12Р]-меченых олигонуклеотидов сыворотки крови человека. / - олигонуклеотиды сыворотки крови; 2 - олигонуклеотиды альбуминовой фракции сыворотки; 3 - олигонуклеотиды глобулиновой фракции сыворотки. М - набор [32Р]-меченых олигодезоксирибонуклеотидов известной длины (длины указаны справа от панели). Радиоавтограф 20%-ного ПААГ.
олигонуклеотидов, прочно связанных с белками, изменяется несущественно.
Полученные данные позволяют предположить, что с белками сыворотки крови человека достаточно прочные комплексы образуют короткие олигонуклеотиды сыворотки (рис. 3, дорожки 2, 3). Эти данные дополнительно подтверждаются тем, что коммерческий препарат человеческого сывороточного альбумина содержит набор олигонуклеотидов близких по длине олигонуклеотидам альбуминовой фракции сыворотки крови (данные не представлены).
Сравнение наборов нуклеиновых кислот плазмы крови и плазмы молока человека, выделенных с помощью системы органических растворителей (хлороформ :
1 2
28
Рис. 4. Электрофоретическое разделение [32Р]-меченых
нуклеиновых кислот (НК) плазмы крови и плазмы молока человека. / -НК плазмы крови; 2 - НК плазмы молока. Радиоавтограф 20%-ного ПААГ. Справа от панели указаны положения в геле
олигодезоксирибонуклеотидов длиной 8 и 28 нт.
изоамиловый спирт), показало, что в молоке относительное содержание фрагментов НК, протяженность которых превышает 28 нт, выше чем в крови (рис. 4).
3. Олигонуклеотиды спинномозговой жидкости
Спинномозговую жидкость (СМЖ) брали путем поясничной пункции у людей, перенесших спинномозговые и черепномозговые травмы (Окружной военный госпиталь №333, г. Новосибирск). Клетки СМЖ удаляли центрифугированием. Образцы СМЖ обрабатывали протеиназой К, и нуклеиновые кислоты отделяли от продуктов протеолиза ионообменной хроматографией на ДЕАЕ-сорбенте. Полученный из СМЖ нуклеотидный материал метили 32Р с помощью ПНК Т4 и [у32Р]-АТР и разделяли электрофорезом в ПААГ. В результате нам удалось выделить из СМЖ фрагменты нуклеиновых кислот длиной до 45 нт (рис. 5) При этом оказалось, что спектры олигонуклеотидов, выделенных из СМЖ людей, перенесших спинномозговые и черепномозговые травмы, сходны между собой (рис. 5, дорожки 2, 3) и в то же время отличаются от набора олигонуклеотидов, вьухеленных из плазмы молока человека (рис. 5, дорожка 4).
Рис. 5. Электрофоретическое разделение [32Р]-меченых олигонуклеотидов из СМЖ людей, перенесших черепномозговые и
спинномозговые травмы. / - набор [32Р]-меченых олигодезоксирибонуклеотидов
известной длины (длины указаны слева от панели); 2 - олигонуклеотиды, выделенные из СМЖ людей, перенесших черепномозговые травмы; 3 - олигонуклеотиды, выделенные из СМЖ людей, перенесших спинномозговые травмы; 4 - олигонуклеотиды плазмы молока человека. Радиоавтограф 20%-ного ПААГ.
Таким образом, нам удалось показать, что все исследованные внеклеточные жидкости (молоко, СМЖ, плазма крови) содержат нуклеиновые кислоты. Наборы нуклеиновых кислот разных внеклеточных жидкостей значительно отличаются. Это свидетельствует о разных механизмах попадания фрагментов НК во внеклеточные
жидкости или о существенных различиях в глубине и специфичности постсекреторной деградации этих нуклеиновых кислот.
Дальнейшие исследования структуры и функций внеклеточных нуклеиновых кислот проводили на примере нуклеиновых кислот плазмы молока. Молоко является гораздо более доступным биологическим материалом, чем СМЖ, и менее изученным, чем сыворотка и плазма крови.
4. Определение состава нуклеиновых кислот человеческого молока
Для определения природы углеводных остатков нуклеиновых кислот человеческого молока мы использовали несколько различных подходов:
а) Разделение нуклеиновых кислот молока хроматографией на гидроксиапатите (ГАП1. Известно, что различные формы нуклеиновых кислот удается эффективно разделить сорбционной хроматографией на ГАПе. Как видно из данных рис. 6, времена элюции основного пула нуклеиновых кислот молочной плазмы с сорбента соответствуют временам выхода коротких фрагментов РНК. Оценка оптической плотности элюента при временах элюции ДНК позволяет говорить о том, что содержание ДНК в препаратах нуклеиновых кислот молока не превышает 0.5%. Эти данные указывают на то, что основной пул нуклеотидного материала молода представлен олигорибонуклеотидами.
Д [КНРО,],М
Рис. 6. Разделение нуклеиновых кислот плазмы молока человека сорбционной хроматографией на ГАПе. Стрелками указаны времена выхода контрольных препаратов ДНК спермы лосося (ДНК), высокополимерных РНК дрожжей (РНК) и полимерных продуктов гидролиза РНК дрожжей РНКазой А (олиго РНЮ.
б) Гидролиз фосфодиэфирных связей олигонуклеотидов молока ферментами и основаниями. Для установления структуры сахарофосфатного остова (О-рибоза/2-дезокси-О-рибоза) препараты нуклеиновых кислот плазмы молока человека подвергали обработке гидролизующими ферментами (ДНКазой I, РНКазой А) и щелочному гидролизу. Результаты представлены на рис. 7. Видно, что суммарный
набор олнгонуклеотндов молока практически не меняется под действием ДНКазы I (рис. 7, дорожка 2). В присутствии РНКазы А происходит частичный гидролиз олигонуклеотидов (рис. 7, дорожка _?), а под действием щелочи - деградация НК до нуклеозидмонофосфатов и коротких олигонуклеотидов (рис. 7, дорожка 4). Таким образом, анализ устойчивости фосфодиэфирных связей нуклеиновых кислот человеческого молока к действию гидролитических ферментов и оснований также
Рис. 7. Электрофоретическое разделение продуктов гидролиза фосфодиэфирных связей [52Р]-меченых нуклеиновых кислот (НК) плазмы молока человека ДНКазой I (2), РНКазой А (5) и 60 мМ КОН при 90°С (4). 1 - набор [Э2Р]-меченых НК плазмы молока (контроль). Радиоавтограф 20%-ного денатурирующего ПААГ. Справа от панели указаны положения в геле ДНК-олнгомеров известной длины.
показал, что суммарный пул олигонуклеотидов молока представлен в основном рибонуклеиновыми кислотами.
5. Количественная оценка содержания РНК в плазме человеческого молока
Концентрация суммарных РНК в использованных в данном исследовании препаратах плазмы молока человека изменялась от 16 до 58 мкг/мл. Концентрация РНК варьировала от донора к донору и у индивидуального донора в течение периода лактации.
На примере набора препаратов молока донора, период лактации которого нам удалось проследить, начиная со 2-ой недели, видно, что кривая зависимости концентрации РНК от времени лактации имеют куполообразный вид с максимумом на 5-ой неделе (приблизительно в середине лактации) (рис. 8). С увеличением времени лактации концентрация РНК в молоке снижается. Сравнение полученных результатов с данными литературы позволяет утверждать, что концентрация РНК в молоке человека значительно выше, чем в плазме крови.
[РНК], мкгУмл
30
40
SO
о
4
8
12
Время, недели
Рис. 8. Изменение концентрации РНК в препаратах плазмы молока одного донора с течением лактации.
Сравнительный анализ РНК из различных препаратов плазмы человеческого молока показал, что в молоке разных доноров присутствуют сходные наборы олигорибонуклеотидов (рис. 9, дорожки D3, D4, D5). С другой стороны, можно наблюдать изменение содержания разных форм РНК в молоке одного донора в течение лактации (рис. 9, дорожки Dl/15, Dl/24, Dl/28). Эти данные позволяют предположить, что в молоко секретируется консервативный набор форм РНК, который в дальнейшем подвергается деградации нуклеазами на различную глубину.
1 донор D1 02 о; Dl Об Об
! недепя лактации ?5| 24]28 4 10 17 43 31 81 101 15
Вместе с тем необходимо отметить сохранность протяженных олигорибонуклеотидов в плазме молока в окружении внеклеточных нуклеаз. Повышенная устойчивость РНК во внеклеточном пространстве может быть объяснена образованием комплексов с белками, защищающими РНК от гидролиза
*-100 разделение [5'-32Р]-
Рнс. 9.
Электрофоретическое
меченых нуклеиновых кислот из препаратов плазмы молока шести доноров (О!-Об). Радиоавтограф 20%-ного денатурирующего ПААГ. Справа от панели указаны положения в геле ДНК-
олигомеров известной
длины (10, 30, 50 и 100 нт).
секреторными РНКазами, а также наличием у олигорибонуклеотидов молока развитой вторичной структуры ,
6. Анализ РНК человеческого молока двумерным электрофорезом в ПААГ
Использование двумерного электрофореза (ЭФ) для анализа
олигорибонуклеотидов из набора нуклеиновых кислот молока позволяет не только выявить наличие вторичной структуры в этих олигонуклеотидах, но и разделить протяженные олигомеры, обладающие близкой подвижностью при одномерном электрофорезе.
Разделение РНК молока двумерным электрофорезом (в нативиых условиях в одном направлении, и, затем, в денатурирующих условиях - в другом) показало, что электрофоретическая подвижность -меченых олигорибонуклеотидов молока
существенно меняется после их обработки 7 М мочевиной.
Из рис. 10 видно, что при ЭФ в денатурирующих условиях часть олигонуклеотидов (например ОЫ7) мигрирует с большей подвижностью, чем в нативных условиях. Это указывает на наличие в олигорибонуклеотидах молока двуцепочечных структур, которые разрушаются в присутствии 7 М мочевины. Подвижность других олигонуклеотидов (например ОЫ6, рис. 10) практически не изменяется при денатурации. В совокупности эти данные указывают на то, что протяженные олигорибонуклеотиды молока обладают развитой вторичной структурой.
I - нативные условия ■
Рис. 10. Разделение [5'-32Р]-меченых нуклеиновых кислот плазмы человеческого молока двумерным электрофорезом. I - ЭФ в
^ 10%-ном нативном ПААГ
а- в первом направлении,
II - ЭФ в 25%-ном денатурирующем ПААГ во втором направлении Радиоавтограф геля. Цифрами 6, 7 обозначены дискретные области, соответствующие олш орибонуклеотидам
ОИ6 и ОЫ7.
7. Выделение индивидуальных олигорибонуклеотидов плазмы человеческого молока и установление их первичной структуры
При определении нуклеотидной последовательности некоторых 5'-меченых олигорибонуклеотидов молока человека с помощью ограниченного гидролиза РНКазами Tl, U2, PhyM, B.c. и А мы установили, что олигонуклеотиды молока представлены гетероолигорибонуклеотидами. Последовательность олигонуклеотида ON6 (см. рис. 10) 5 ' - AGAGGUGAAAUUUC - 3 ' (рис. 11) соответствует фрагменту 955 -968 18S рибосомной РНК человека. Что касается олигонуклеотида ON7 (см. рис. 10), то, учитывая высокую степень гомологии его нуклеотидной последовательности 5 ' -ACUCYCGACYCNN-3 ' (где N - неустановленные нуклеотидные остатки и Y -неустановленные остшки пиримидинового типа) (данные не представлены) с
Рис. 11. Электрофоретическое разделение продуктов гидролиза [5'-32Р]-меченого олигорибонуклеотида ON6 (рис. 10) набором РНКаз: Т1 (дорожка 77), U2 (U2), Phy M (РА), В с (B.c.) и А (А). ОН - статистический гидролиз ON6 60 мМ КОН К - исходный ON6. Радиоавтограф 25%-ного денатурирующего ПААГ.
последовательностью фрагмента 492 - 505 18S рибосомной РНК человека, можно предположить, что предшественником ON7 также являлась 18S рРНК.
Поскольку в пуле РНК молока фосфорилированию ПНК подвергался достаточно обширный набор олигонуклеотидов, выделение индивидуальных 5'-меченых форм РНК с чистотой, необходимой для определения их первичной структуры, являлось трудной задачей.
Полагая, что РНК молока подвергались постсекреторному процессингу РНКазой А, можно заключить, что большая часть набора олигорибонуклеотидов представлена З'-фосфорилированными фрагментами, которые не являются субстратами РНК-лигазы фага Т4. Поэтому для получения ограниченного набора
К ОН Т1 U2 Ph В с А
меченых РНК из общего пула РНК молока (т.е. для выявления олигорибонуклеотидов со свободной З'-ОН группой ) мы использовали метод З'-концевого мечения РНК с помощью РНК лигазы Т4.
РНК молока содержит более узкий набор субстратов РНК-лигазы, чем полинуклеотидкиназы, и продукты З'-концевого мечения РНК эффективно разделяются двумерным электрофорезом в ПААГ и образуют дискретные области, соответствующие индивидуальным олигорибонуклеотидам (рис. 12).
Последовательности индивидуальных форм РНК - олигорибонуклеотидов ONI - ON5 (рис. 12) также определяли с помощью ограниченного гидролиза набором РНКаз.
Рис. 12. Разделение [3'-52Р]-меченых нуклеиновых кислот плазмы человеческого молока двумерным электрофорезом. I - ЭФ в 10%-ном нативном ПААГ в первом направлении, И - ЭФ в 25%-ном денатурирующем ПААГ во втором направлении. Цифрами 1 - 5 обозначены дискретные области, соответствующие олигорибонуклеотидам ON1 -ON5.
7.1. Первичная структура олигорибонуклеотидов ONI - ON3
На рис. 13 представлены результаты ограниченного гидролиза олигорибонуклеотида ON1 (рис. 12) набором специфических РНКаз. Аналогичные результаты для олигорибонуклеотидов ON2 и ON3 (рис. 12) не приведены. Нуклеотидные последовательности ONI - ON3 где N - неидентифицированные нуклеозидные остатки, представлены ниже: ON1 - 5'-NNUCCCGGGGCUACGCCUGUCUGAGCGUCGCUU-3', ON2- 5'-MNGGGGCUACGCCUGUCUGAGCGUCGCUU-31 ON3- 5'-NGGGGCUACGCCUGUCUGAGCGUCGCUU-3■.
Рис. 13. Электрофоретическое разделение продуктов гидролиза [3'-32Р]-меченого олигорибонуклеотида ON1 (рис.12) набором РНКаз: Т1 (дорожка 77), V2 (U2), Phy М (Ph), В с (В.с.) и А (А). ОН - статистический гидролиз ON1 60 мМ КОН. К - исходный олигорибонуклеотид ON1. Радиоавтограф 25%-ного денатурирующего ПААГ.
Видно, что эти олигонуклеотиды могут являться продуктами гидролиза одного РНК-предшественника. Последовательность ON1 соответствует последовательности фрагмента 129 - 159 З'-концевой области 5.8S рибосомной РНК человека. Эта область 5.8S рРНК не содержит модифицированных оснований, которые могли бы затруднить сопоставление определенной нами нуклеотидной последовательности ON1 с последовательностью рРНК. Поэтому можно утверждать, что олигорибонуклеотиды ONI - ON3 (рис. 12) являются продуктами расщепления 5.8S рибосомной РНК человека.
Известно, что 5.8S рРНК животных образует прочную двуцепочечную
структуру с 5'-концевым доменом 28S рРНК (остатки 2 - 20). Нуклеотидные остатки фрагмента 126 - 129 5.8S рРНК представлены олигопиримидиновой последовательностью, не участвующей в образовании комплементарных пар. Именно в этой области произошло расщепление 5.8S рРНК с образованием наблюдаемых в молоке олигорибонуклеотидов ONI - ON3. Определенная стабильность этих олигонуклеотидов в окружении нуклеаз молока указывает на возможное наличие в человеческом молоке протяженных продуктов деградации 28S рРНК, по крайней мере, фрагмента 2 - 20, комплементарного ONI - ON3.
7.2. Первичная структура олигорибонуклеотида ON4
Установленная нами нуклеотидная последовательность З'-концевой части олигорибонуклеотида ON4 5 ' -CGGUUCGAAACCGGGCGGAAACA-3 ' совпадает с 3'-
К ОН Tl U2 Ph Б с А ОН
концевой областью валиновых тРНК человека, а именно, областью акцепторного стебля и псевдоуридиновой петли (рис. 14).
Известно, что зрелая форма тРНКВал содержит остаток псевдоуридина в положении, соответствующем 114 в ОЖ и остаток 1-метиладенина в положении,
Рис. 14. а. Электрофоретическое разделение продуктов гидролиза [3'-,2Р]-меченого олигорибонуклеотида ON4 (рис.12) набором РНКаз: Т1 (дорожка 77), U2 (Ш), Phy M (Ph), B.c. (B.c.) и A (A) OH - статистический гидролиз ON4 60 мМ КОН. К - исходный ON4. Радиоавтограф 25%-HOt о денатурирующего ПААГ. б. Вторичная структура валиновой тРНК человека. Выделенная область соответствует олигорибонуклеотиду ON4 человеческого молока.
идентифицированном нами как А8 в ON4. Картины расщепления фосфодиэфирных связей, образованных З'-гидрооксильными группами нуклеотидов U4 и А8 (рис. 14, а) не позволяют однозначно сделать вывод о присутствии в этих положениях канонических А и U, либо модифицированных ,тА и цг. Вместе с тем известно, что |тА и V|i, так же как и другие минорные компоненты РНК, присутствуют в гидролизатах суммарных нуклеиновых кислот молока, поэтому оправданным является предположение о том, что олигонуклеотид ON4 является продуктом гидролиза полностью процессированной тРНКВал .
Известно также, что полностью процессированные тРНК имеют ССА-акцепторную последовательность на З'-конце. В З'-концевой части олигонуклеотида ON4 эта последовательность отсутствует.
Так как ON4 является субстратом РНК-лигазы фага Т4, то, соответственно, этот олигонуклеотид имеет свободную З'-ОН группу. Наличие свободного 3'-гидрооксила у этого олигорибонуклеотида исключает возможность его образования из тРНК8^ благодаря действию одной только РНКазы А. Такой олигонуклеотид мог образоваться в результате секреции в молоко не полностью процессированной
к он пшиь.дш
t^lîllî
$
»mit
* i
валиновой тРНК, либо при деградации зрелой тРНКВал во внеклеточном пространстве З'-экзонуклеазой.
Как и в случае олигонуклеотидов ONI - ON3, стабильность ON4 в окружении нуклеаз молока может быть обусловлена образованием дуплекса с другим олигонуклеотидом молока. Наиболее вероятным партнером ON4 является 5'-концевая часть акцепторного стебля тРНКВал, либо более протяженный фрагмент этой тРНК (рис. 14).
7.3. Первичная структура олигорибонуклеотида (Ж5
5'-концевая область 5'-ииССДииСССССиСБАШСАСС-З' в составе олигонуклеотида ОК 5 совпадает с З'-концевой последовательностью тирозиновой тРНК человека (псевдоуридиновая петля, акцепторный стебель, включая СС-фрагмент ССА-акцептора) (рис. 15). Последовательность 5 ' -сиидс-З ' отсутствует в составе зрелой тРНК и не встречается в про-тРНКТир.
Рис. 15. а. Электрофоретическое разделение продуктов гидролиза [3'-32Р]-меченого олигорибонуклеотида ОЫ5 (рис.12) набором РНКаз: Т1 (дорожка 77), Ш (Ш), РЬу М (РН), В с (В.с.) и А (А) ОН - статистический гидролиз ОЫ5 60 мМ КОН. К - исходный (Ж5 Радиоавтофаф 25%-ного денатурирующего ПААГ.
6. Вторичная структура тирозиновой тРНК человека. Выделенная область
сооТве] ствует олигону клеотиду (Ж5 человеческого молока.
Образование олигорибонуклеотида ОЮ, возможно, является результатом использования исчерпывающих условий З'-концевого мечения РНК Можно предположить, что О^ является продуктом лигирования З'-концевой части тРНКТир (без (СС)А-акцепторной последовательности) с другим олигонуклеотидом 5' -(СС)СииАС-З' из суммарного пула РНК человеческого молока При этом остатки
С21 и С22 могли быть как З'-концевыми в составе РНК-акцептора, так и 5'-концевыми в составе донора фосфата в реакции лигирования.
Последовательность З'-концевой части ON5 5 ' - (С) CCUUAG-3 ' достаточно коротка, для того чтобы можно было достоверно установить природу ее РНК-предшественника. Среди основных клеточных РНК такая последовательность встречается в составе 18S рРНК (5 ' -CCCUUAG-3 ' 1501 - 1507), и, кроме того, в составе самой тРНКТир (40 - 45).
Таким образом, мы установили, что последовательности олигорибонуклеотидов плазмы молока человека соответствуют последовательностям основных РНК эукариотических клеток - 5.8S и 18S рРНК, тРНКВал и тРНКТир. При этом повышенная устойчивость РНК к действию РНКазы A in vitro и в молоке, по-видимому, детерминирована вторичной структурой РНК - формированием шпилек и дуплексов с другими олигонуклеотидами молока. Так, для З'-концевых фрагментов 5.8S рРНК наиболее вероятным партнером в образовании двуцепочечной структуры является 5'-концевая часть 28S рРНК, а для З'-фрагментов тРНК - 5'-концевые области тех же тРНК (рис. 14, рис. 15).
Отсутствие ССА-акцепторных последовательностей и наличие свободного З'-гидрооксила у фрагментов тРНК свидетелыртвуют об участии в постсекреторном процессинге клеточных РНК-предшественников не только РНКазы А, но и фермента с З'-экзонуклеазной/фосфодиэстеразной активностью. Ферменты с такой активностью присутствуют в плазме крови и на внешней мембране форменных элементов крови, на мембранах клеток эндотелия сосудов, а также на мембране эпителиоцитов.
8. Функции внеклеточных нуклеиновых кислот
Какова функция коротких фрагментов цитоплазматических РНК во внеклеточном пространстве?
К настоящему моменту РНК, рибонуклеозиды и рибонуклеотиды молока рассматриваются, в основном, как источники "частично незаменимых" метаболитов, необходимых для постнатального развития млекопитающих.
В настоящей работе мы попытались проанализировать влияние внеклеточных РНК молока человека на некоторые физиологические процессы, происходящие в молоке и в культуре клеток молочной железы.
8.1. Влияние внеклеточных нуклеиновых кислот человеческого молока на фосфорилирование белков молока
Мы обнаружили, что в присутствии [у-эзР]АТР в плазме человеческого молока происходит фосфорилирование белков с молекулярными массами 76, 38, 30 и 18 кДа (рис. 16, дорожка 1). Белок с молекулярной массой 30 кДа соответствует р-казеину. При исследовании влияния выделенных из молока человека олигонуклеотидов на фосфорилирование белков молока оказалось, что добавление к молоку олигонуклеотидов (рис. 16, дорожка 2) или гепарина (рис. 16, дорожка 3) приводило к ингибированию фосфорилирования белка р38 и существенному уменьшению включения 32Р в р18. Присутствие олигонуклеотидов и гепарина не влияло на фосфорилирование белка р76, хотя при этом наблюдалось некоторое снижение фосфорилирования Р-казеина (рис. 16, дорожки 2, 3).
12 3 Рис. 16. Электрофоретическое разделение
[32Р]-меченых белков плазмы молока человека. / - белки плазмы молока; 2 - белки плазмы молока в присутствии олигонуклеотидов; 3 - белки плазмы молока в присутствии гепарина. Радиоавтограф 10%-ного ПААГ Слева от панели указаны положения в геле белков с известными молекулярными массами. Справа от панели указаны положения в геле меченых белков.
Таким образом, полученные данные указывают на то, что внеклеточные олигорибонуклеотиды молока могут влиять на физиологические процессы в молочной железе, участвуя в фосфорилировании/дефосфорилировании биологически активных белков и пептидов.
8.2. Влияние внеклеточных РНК молока на жизнеспособность клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7
При изучении влияния РНК на клетки аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 в условиях оптимальных для культивирования этих клеток мы установили, что как РНК человеческого молока, так и используемая в качестве контроля суммарная РНК пекарских дрожжей, не оказывают существенного влияния на пролиферацию и жизнеспособность клеток.
Вместе с тем оказалось, что РНК обладает цитопротективным действием на \lCF-7 в условиях холодового шока (инкубации 12 ч при 5°С). Из данных рис. 17 видно, что график зависимости МТТ индекса клеток \fCF-7, подвергнутых холодовому шоку в присутствии экзогенной РНК, от концентрации РНК в среде
Аб»(%) 300
200
100
0.0001 0.001 0.01 0.1 1
[РНК], иг/мл
Рис. 17. График зависимости жизнеспособности клеток \fCF-7 (МТТ -индекс) после холодового шока от концентрации в культурапьной среде: □ - суммарной РНК дрожжей; я - продуктов гидролиза суммарной РНК дрожжей РНКазой А; • - суммарной РНК плазмы молока человека.
имеет куполообразный вид с максимумом в диапазоне 25- 100 мкг/мл. При этом РНК человеческого молока увеличивает жизнеспособность клеток в 2 раза, а суммарный пул РНК пекарских дрожжей - в 3 раза.
Протективные свойства РНК проявляются при низкой плотности клеток, в
А,70, (%)
10* 10* Квицттршум клеток, (мл'')
Рис. 18. График зависимости жизнеспособности клеток МСР-7 (МТТ -индекс) от начальной концентрации клеток в условиях холодового шока. Клетки предынкубированы в присутствии 100 мкг/мл (12 ч, 37°С): ♦ - суммарной РНК дрожжей; □ - суммарной РНК плазмы молока человека; я - без добавления РНК. (За 100 % принята оптическая плотность (А370) МТТ-формазана, образовавшегося при инкубяпии г 106 кпеток!
отсутствие контактного торможения. В то время как при высокой плотности МСР-7 (80% монослоя) РНК не обладает цитопротективным эффектом, а напротив подавляет жизнеспособность МСР-7 (рис. 18).
При разделении препаратов РНК молока и дрожжей на ГАПе и дальнейшем исследовании цитопротективных свойств различных хроматографических фракций в условиях холодового шока, оказалось, что только фракции с высоким содержанием фрагментов РНК длиной не менее 30 нуклеотидов обладали цитопротективными свойствами при холодовом шоке.
Таким образом, полученные результаты указывают на то, что присутствие экстраклеточных нуклеиновых кислот во внеклеточных жидкостях организма человека не является случайным. Обнаруженные нами физиологические эффекты внеклеточных РНК, конечно же, не исчерпывают всего многообразия их функций, но, тем не менее, эти эффекты достаточно четко указывают на возможную регуляторную роль протяженных фрагментов основных клеточных РНК на уровне клетки и организма.
4. Выводы
1. Выделен набор нуклеиновых кислот из плазмы молока человека. Сравнение наборов нуклеиновых кислот плазмы молока, плазмы крови и спинномозговой жидкости показало, что размеры внеклеточных нуклеиновых кислот для разных физиологических жидкостей значительно различаются.
2. Установлено, что внеклеточные нуклеиновые кислоты плазмы человеческою молока представлены в основном фрагментами РНК и некоторые из этих фрагментов имеют развитую вторичную структуру. Концентрация РНК в препаратах молочной плазмы варьирует в интервале от 16 до 58 мкг/мл и является индивидуальной характеристикой донора.
3. Определены нуклеотидные последовательности ряда олигорибонуклеотидов плазмы человеческого молока, и показано, что эти олигорибонуклеотиды являются фрагментами 5.88 и 188 рибосомных РНК, тРНКВал и тРНКТир.
4. Установлено, что олигорибонуклеотиды человеческого молока участвуют в процессах фосфорилирования/дефосфорилирования белков молока.
5. Показано, что препараты суммарной РНК человеческого молока оказывают цитопротективное действие на клетки МСР-7 в условиях холодового шока, которое
19
проявляется при низкой плотности клеток в отсутствие контактного торможения. Цитопротективными свойствами обладают фрагменты РНК длиной не менее 30 нуклеотидов.
Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:
1. Кит Ю.Я., Кулигина Е.В., Романникова И.В., Семенов Д.В., Рихтер В.А., Власов В.В В препаратах человеческого а-лактальбумина, индуцирующих апоптоз трансформированных клеток, присутствуют рибоолигонуклеотиды // Доклады Академии Наук. 1998. Т. 360. № 3. С. 406-408.
2. Кулигина Е.В., Андреева А.Ю., Могельницкий А.С., Кит Ю.Я., Якубов JI.A., Рихтер В.А., Власов В.В. Олигонуклеотиды и олигонуклеотидсвязывающие белки спинномозговой жидкости человека // Доклады Академии Наук. 1999. Т. 364. № 6. С. 832-834.
3. Кит Ю.Я., Кулигина Е.В., Онищенко A.M., Юрченко JI.B., Романникова И.В., Рихтер В.А., Власов В.В. Эндогенные олигонуклеотиды молока человека и их возможная биологическая активность // Биохимия. 1999. Т. 64. вып. 8. С. 59-64.
4 Kuligina Е , Semenov D., Shevyrina О., Richter V. Ribonucleic acids of human milk // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2004. V.23. P. 837-842.
5. Semenov D.V., Kuligina E.V., Shevyrina O.N., Richter V.A., Vlassov V.V Extracellular ribonucleic acids of human milk // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2004. V. 1022. P. 190-194.
? í
л
I
i
»18202
РНБ Русский фонд
2006-4 14831
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кулигина, Елена Владимировна
i СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ 5 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Внеклеточные нуклеиновые кислоты: функции в биологических системах и применение в исследовательской и медицинской практике
1.1. Введение
1.2. Экзогенные нуклеиновые кислоты и их судьба в клетках млекопитающих
1.3. Нуклеиновые кислоты внеклеточных жидкостей 12 1.3.1. Нуклеиновые кислоты сред культур клеток 1.3.2. Нуклеиновые кислоты плазмы крови j 1.3.3. Нуклеиновые кислоты других физиологических жидкостей
1.4. Биологические эффекты и функции внеклеточных нуклеиновых кислот
1.4.1. Внеклеточные нуклеиновые кислоты как возможные переносчики информации между клетками и органами иммунной системы.
1.4.2. "Неспецифические" эффекты нуклеиновых кислот
1.4.3. Горизонтальный перенос генов
1.4.4. Биологические эффекты, детерминированные структурой и последовательностью внеклеточных нуклеиновых кислот
1.5. Нуклеиновые кислоты как противоопухолевые вакцины 32 1.5.1. Дендритные клетки, заполненные РНК
1.5.2. РНК-вакцины, основанные на заключении РНК в липосомы (липосомные РЖ-вакцины)
1.5.3. «Голые» РНК-вакцины
1.5.4. Самореплицирующиеся вакцины
1.5.5. Иммунология РНК вакцин: механизмы и иммуномодуляторы
1.6. Генная терапия
1.6.1. Основные средства доставки генов в организм
1.6.2. Направленная доставка генов
1.6.3. Экспрессия трансфицированных генов
1.6.4.0 типах клеток - мишеней. Стволовые клетки 44 \
1.6.5. Генная терапия рака
J 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Нуклеиновые кислоты плазмы молока человека
I 3.2. Олигонуклеотиды сыворотки крови
3.3. Олигонуклеотиды спинномозговой жидкости
3.4. Определение состава нуклеиновых кислот человеческого молока
3.5. Количественная оценка содержания РНК в человеческом молоке
3.6. Анализ РНК человеческого молока двумерным электрофорезом в ПААГ
3.7. Выделение индивидуальных олигорибонуклеотидов человеческого молока и установление их первичной структуры
3.7.1. Первичная структура олигорибонуклеотидов 1
3.7.2. Первичная структура олигорибонуклеотида
3.7.3. Первичная структура олигорибонукпеотида
3.8. Механизмы происхождения внеклеточных нуклеиновых кислот в молоке человека
3.9. Биологические эффекты внеклеточных нуклеиновых кислот
3.9.1. Влияние внеклеточных РНК человеческого молока на фосфорилирование молочных белков
3.9.2.Влияние внеклеточных РНК молока на жизнеспособность клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF
4. ВЫВОДЫ
Введение Диссертация по биологии, на тему "Нуклеиновые кислоты человеческого молока. Структура и возможные функции"
В настоящее время фрагменты нуклеиновых кислот (НК) и их синтетические аналоги получают все большее распространение в научной и медицинской практике не только как инструменты исследования, но и как лекарственные препараты. Олигонуклеотиды используются в генной терапии для коррекции генетических дефектов [1,2] и при генной иммунизации, основанной на введении в организм нуклеиновых кислот, кодирующих необходимые для иммунизации белки [1]. Фрагменты НК и их производные, комплементарные определенным последовательностям нуклеиновых кислот клетки (так называемые антисмысловые олигонуклеотиды), рассматриваются как потенциальные терапевтические препараты при лечении инфекционных, онкологических и наследственных заболеваний [3-6]. Показано иммуномодулирующее действие нуклеиновых кислот и олигонуклеотидов [7, 8].
Перспектива использования природных и синтетических фрагментов нуклеиновых кислот в качестве высокоэффективных терапевтических средств стимулировала развитие работ по изучению транспорта и метаболизма синтетических олигонуклеотидов в организме человека. В результате таких исследований на поверхности ряда клеток были обнаружены специфические олигонуклеотид-связывающие белки, и показана их функциональная активность [9-13]. Кроме того, белки, обладающие сродством к олигонуклеотидам, были обнаружены в плазме крови человека и млекопитающих, а также в секреторных выделениях человека [14]. Обнаруженное разнообразие олигонуклеотид-связывающих белков дало основания предполагать, что нуклеиновые кислоты и/или их фрагменты могут являться постоянной составляющей внеклеточных жидкостей живого организма и участвовать в выполнении определенных биологических функций.
К настоящему моменту накоплены многочисленные данные о повышении концентрации внеклеточных нуклеиновых кислот в организме при аутоиммунных г растройствах и онкологических заболеваниях. Тем не менее, вопрос о механизмах появления, составе и возможных функциях собственных внеклеточных нуклеиновых кислот здорового организма во многом остается открытым.
Целью настоящей работы являлось выделение и характеризация внеклеточных нуклеиновых кислот молока человека, а также исследование их возможных биологических функций.
Основными задачами исследования являлись:
- выделение внеклеточных нуклеиновых кислот плазмы молока и их сравнение с наборами внеклеточных нуклеиновых кислот других жидкостей организма;
- определение концентрации нуклеиновых кислот в препаратах плазмы молока;
- нуклеотидной последовательности внеклеточных нуклеиновых кислот плазмы молока;
- анализ влияния внеклеточных РНК молока на физиологические процессы, происходящие в молоке и культуре клеток молочной железы.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Внеклеточные нуклеиновые кислоты: функции в биологических системах и применение в исследовательской и медицинской практике 1.1. Введение
Известно, что основными функциями нуклеиновых кислот в клетке являются хранение, передача и реализация наследственной информации. Выполнение этих функций обеспечивается процессами репликации, транскрипции и трансляции [15,16].
Однако функции нуклеиновых кислот не ограничиваются вышеупомянутыми. В последние годы были обнаружены различные соединения нуклеотидной природы, играющие важную роль в регуляторных механизмах функционирования клеток и организмов. Одними из таких соединений являются внеклеточные нуклеиновые кислоты и олигонуклеотиды. Кроме того, фрагменты нуклеиновых кислот и их синтетические аналоги получают все большее применение в клинической практике как иммуномодулирующие и терапевтические препараты.
Рассмотрению свойств и функций внеклеточных нуклеиновых кислот, а также некоторым аспектам использования этих соединений в исследовательской и медицинской практике посвящен настоящий обзор.
Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Кулигина, Елена Владимировна
4. ВЫВОДЫ
1. Выделен набор нуклеиновых кислот из плазмы молока человека. Сравнение наборов нуклеиновых кислот плазмы молока, плазмы крови и спинномозговой жидкости показало, что размеры внеклеточных нуклеиновых кислот для разных физиологических жидкостей значительно различаются.
2. Установлено, что внеклеточные нуклеиновые кислоты плазмы человеческого молока представлены, в основном, фрагментами РНК, и некоторые из этих фрагментов имеют развитую вторичную структуру. Концентрация РНК в препаратах молочной плазмы варьирует в интервале от 16 до 58 мкг/мл и является индивидуальной характеристикой донора.
3. Определены нуклеотидные последовательности ряда олигорибонуклеотидов плазмы человеческого молока, и показано, что эти олигорибонуклеотиды являются фрагментами 5.8S и 18S рибосомных РНК, тРНКВал и тРНКТир.
4. Установлено, что олигорибонуклеотиды человеческого молока участвуют в процессах фосфорилирования/дефосфорилирования белков молока.
5. Показано, что препараты суммарной РНК человеческого молока оказывают цитопротективное действие на клетки MCF-7 в условиях холодового шока, которое проявляется при низкой плотности клеток в отсутствие контактного торможения. Цитопротективными свойствами обладают фрагменты РНК длиной не менее 30 нуклеотидов.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кулигина, Елена Владимировна, Новосибирск
1. Nabel G.J., Feigner P.L. Direct gene transfer for immunotherapy and immunization I I Trends Biotechnol. 1993. V. 11. P. 211-215.
2. Knorre D.G., Vlassov V.V., Zarytova V.F. Oligonucleotides: Antisence inhibitors of gene expression // (Cohen, J. S., ed.) CRC Press. 1989. P. 173-196.
3. Zamecnik P.C., Stephenson M.L. Inhibition of Rous sarcoma virus replication and cell transformation by a specific oligodeoxynucleotide // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. V. 75. P. 280-284.
4. Wickstrom E. Strategies for administering targeted therapeutic oligodeoxynucleotides // Trends Biotechnol. 1992. V. 10. P. 281-287.
5. Klinman D.M., Yi A.K., Beaucage S.L., Conover J., Krieg A.M. CpG motifs present in bacteria DNA rapidly induce lymphocytes to secrete interleukin 6, interleukin 12, and interferon gamma//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 2879-2883.
6. Yakubov L.A., Deeva E.A., Zarytova V.F., Ivanova E.M., Ryte A.S., Yurchenko L.V., Vlassov V.V. Mechanism of oligonucleotide uptake by cells: involvement of specific receptors? // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 6454-6458.
7. Yao G.Q., Corrias S., Cheng Y.C. Identification of two oligodeoxyribonucleotide binding proteins on plasma membranes of human cell lines // Biochem. Pharmacol. 1996. V.51. P. 431436.
8. Balakireva L.A., Levashova Z.B., Chroboczek J., Vlassov V.V. Rapid sequence-independent cellular response to oligodeoxynucleotides // FEBS Lett. 1997. V. 400. P. 267-270.
9. Laktionov P.P., Dazard J.E., Vives E., Rykova E.Y., Piette J., Vlassov V.V., Lebleu B. Characterisation of membrane oligonucleotide-binding proteins and oligonucleotide uptake in keratinocytes // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. 2315-2324.
10. Chelobanov B.P., Laktionov P.P., Kharkova M.V., Rykova E.Y., Vlassov V.V. Isolation of nucleic acid binding proteins: an approach for isolation of cell surface, nucleic acid binding proteins // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2004. V. 1022. P. 239-243.
11. Лактионов П.П., Рыкова Е.Ю., Крепкий Д.В., Брыксин А.В., Власов В.В. Взаимодействие олигонуклеотидов с белками барьерных жидкостей // Биохимия. 1997. Т. 62. С. 613-618.
12. Ленинджер А. Биохимия. М. Мир. 1974.
13. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия. М. Высшая школа. 1998.
14. Bhargava P. М., Shanmugam G. Uptake of nonviral nucleic acids by mammalian cells // Progress in Nucl. Acids Res. and Molecular Biology. 1971. V.l 1. P. 103-193.
15. Hill M., Huppert J. Fate of exogenous mouse DNA in chicken fibroblasts in vitro. Non-conservative preservation // Biochim. Biophys. Acta. 1970. V. 213. P. 26-35.
16. Hohlweg U., Doerfler W. On the fate of plant or other foreign genes upon the uptake in food or after intramuscular injection in mice // Mol. Genet. Genomics. 2001. V. 265. P. 225233.
17. Chin D.J., Green G.A., Zon G., Szoka F.C. Jr., Straubinger R.M. Rapid nuclear accumulation of injected oligodeoxyribonucleotides // New Biol. 1990. V. 2. P. 1091-1100.
18. Zamecnik P., Aghajanian J., Zamecnik M., Goodchild J., Witman G. Electron micrographic studies of transport of oligodeoxynucleotides across eukaryotic cell membranes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 3156-3160.
19. Ledoux L., Charles P. Fate of exogenous DNAin mammals. Uptake of informative molecules by living cells (Ed. Ledoux L., Amsterdam London) 1972. P. 397-413.
20. Карамышев B.H., Власов B.B., Зон Д., Иванова Е.М., Якубов JI.A. Распределение производным олигонуклеотидов и их стабильность в тканях мышей // Биохимия. 1993. Т. 58. С. 590-598.
21. Vlassov V.V., Karamyshev V.N., Yakubov L.A. Penetration of oligonucleotides into mouse organism through mucosa and skin // FEBS Lett. 1993. V. 327. P. 271-274.
22. Vlassov V.V., Nechaeva M.V., Karamyshev V.N., Yakubov L.A. Iontophoretic delivery of oligonucleotide derivatives into mouse tumor // Antisense Res. Dev. 1994. V. 4. P. 291-293.
23. Stroun M., Anker P., Maurice P.A. Circulating nucleic acids in higher organisms // International review of cytology. 1977. V. 51. P. 1-48.
24. Якубов Л.А., Андреева А.Ю., Карамышев B.H., Власов В.В. Выделение и свойства почечного белка-рецептора, связывающего нуклеиновые кислоты//ДАН. 1996. Т. 350. С. 414-417.
25. Loke S.L., Stein С.А., Zhang Х.Н., Mori К., Nakanishi M., Subasinghe С., Cohen J.S., Neckers L.M. Characterization of oligonucleotide transport into living cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 3474-3478.
26. Hefeneider S.H., Cornell K.A., Brown L.E., Bakke A.C., McCoy S.L., Bennett R.M. Nucleosomes and DNA bind to specific cell-surface molecules on murine cells and induce cytokine production // Clin. Immunol. Immunopathol. 1992. V. 63. P. 245-251.
27. Якубов Л.А., Шестова О. Е., Андреева А.Ю., Власов В.В. Участие специфических белков клеточной поверхности в транспорте нуклеиновых кислот в клетки // ДАН. 1998. Т. 361. С. 550-553.
28. Шестова О. Е., Андреева А.Ю., Власов В.В., Якубов Л.А. Транспорт комплексов олигонуклеотидов с белками клеточной поверхности в клеточное ядро // ДАН. 1999. Т. 368. С. 264-267.
29. Herrera F., Adamson R.H., and Gallo R.C. Uptake of transfer ribonucleic acid by normal and leukemic cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1970. V. 67. P. 1943-1950.
30. Sirdeshmukh R.B., Bhargava P.M. Uptake of exogenous RNA by rat-liver parenchymal cells in suspension prepared by the collagenase method // Indian J. Biochem. Biophys. 1983. V. 20. P. 121-126.
31. Juliano R., Mayhew E. Interaction of polynucleotides with cultured mammalian cells. 1. Uptake of RNA by Ehrlich ascites carcinoma cells // Exp. Cell Res. 1972. V. 73. P. 3-12.
32. Mclntoch A.A.G., Adams D.H. Further studies of the extrusion of cytosol macromolecules by cultured chick embryo fibroblast cells // Int. J. Biochem. 1985. V. 17. P. 143-153.
33. Adams D.H., Mclntoch A.A.G. Studies of the cytosolic DNA of chick embryo fibroblasts and its uptake by recipient cultured cells //.Int. J. Biochem. 1985. V. 17. P. 1041-1051.
34. Adams D.H., Challen C. The chick embryo fibroblast cytosolic DNA complex a possible cell - cell messenger// Int. J. Biochem. 1988. V. 20. P. 921-928.
35. Stroun M., Anker P. In vitro synthesis of DNA spontaneously released by bacteria and frog auricles // Biochimie. 1972. V. 54. P. 1443-1452.
36. Stroun M., Anker P. Nucleic acids spontaneously released by living frog auricles // Biochem. J. 1972. V. 128. P. 100P-101P.
37. Anker P., Stroun M., Maurice P.A. Spontaneous extracellular synthesis of DNA released by human blood lymphocytes 11 Cancer Res. 1976. V. 36. P. 2832-2839.
38. Anker P., Stroun M., Maurice P.A. Spontaneous release of DNA by human blood lymphoctyes as shown in an in vitro system // Cancer Res. 1975. V. 35. P. 2375-2382.
39. Stroun M., Anker P., Beljanski M., Henri J., Lederrey C., Ojha M., Maurice P.A. Presence of RNA in the nucleoprotein complex spontaneously released by human lymphocytes and frog auricles in culture // Cancer Res. 1978. V. 38. P. 3546-3554.
40. Mellgren J. Effects of the number of cell divisions and of added isologous nucleic acids on ageing of normal human fibroblasts in vitro // Pathol. Eur. 1975. V. 10. P. 215-219.
41. Kolodny G.M. Evidence for transfer of macromolecular RNA between mammalian cells in culture // Exp. Cell Res. 1971. V. 65. P. 313-324.
42. Kolodny G.M., Culp L.A., Rosenthal L.J. Secretion of RNA by normal and transformed cells //Exp. Cell Res. 1972. V. 73. P. 65-72.
43. Ситиков A.C., Мунишкин A.B. Специфические супрессорные Т-клетки секретируют РНК//ДАН. 1991. Т. 318. С. 1486-1488.
44. Morozkin E.S., Laktionov P.P., Rykova E.Y., Vlassov V.V. Extracellular nucleic acids in cultures of long-term cultivated eukaryotic cells // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2004. V. 1022. P. 244249.
45. Sisco K. L. Is RNA in serum bound to nucleoprotein complexes? // Clin. Chem. 2001. V. 47. P. 1744-1745.
46. Kamm R.C., Smith A.G. Nucleic acid concentrations in normal human plasma // Clin. Chem. 1972. V. 18. P. 519-522.
47. Anker P., Mulcahy H., Chen X.Q., Stroun M. Detection of circulating tumour DNA in the blood (plasma/serum) of cancer patients // Cancer Metastasis Rev. 1999. V. 18. P. 65-73.
48. Stroun M., Maurice P., Vasioukhin V., Lyautey J., Lederrey C., Lefort F., Rossier A., Chen X.Q., Anker P. The origin and mechanism of circulating DNA // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2000. V. 906. P.l 61-168.
49. Giacona M.B., Ruben G.C., Iczkowski K.A., Roos T.B., Porter D.M., Sorenson G.D. Cell-free DNA in human blood plasma: length measurements in patients with pancreatic cancer and healthy controls // Pancreas. 1998. V. 17. P. 89-97.
50. Shapiro В., Chakrabarty M., Cohn E.M., Leon S.A. Determination of circulating DNA levels in patients with benign or malignant gastrointestinal disease // Cancer. 1983. V. 51. P. 21162120.
51. Maebo A. Plasma DNA level as tumor marker in primary lung cancer // Japan J. Thor. Dis. 1990. V. 28. P. 1085-1091.
52. Stroun M., Anker P., Lyatey J., Lederrey C., Maurice P.A. Isolation and characterization of DNA from the plasma of cancer patients // Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 1987. V. 23. P. 707-712.
53. Lo Y.M.D. et.al. Quantitave analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis // Am. J. Hum. Genet. 1998. V. 62. P. 768-775.
54. Bianchi D.W. Fetal DNA in maternal plasma: the plot thickens and the placental barrier thins // Am. J. Hum. Genet. 1998. V. 62. P. 763-764.
55. Bianchi D. W. and Lo Y.M. D. Fetomaternal cellular and plasma DNA trafficking // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2001. V. 945. P. 119-131.
56. Rumore P. Hemodialysis as a model for studying endogenous plasma DNA: oligonucleosomelike structure and clearance // Exp. Immunol. 1992. V. 90. P. 56-62.
57. Kraitov P. M. Dinucleotides and immunological disorders // Immunologia. 1996. V. 3. P. 7-10.
58. Vasilyeva I. N. Low-molecular-weight DNA in blood plasma as an index of the influence of ionizing radiation // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2001. V. 945. P. 221-228.
59. Coritsidis G.N., Beers P.C., Rumore P.M. Glomerular uptake of nucleosomes: evidence for receptor-mediated mesangial cell binding // Kidney Int. 1995. V. 47. P. 1258-1265.
60. O'Donnell J. Ribonucleic acid levels in blood of cancer patients // Ir. J. Med. Sci. 1963. V. 450. P. 251-255.
61. Guin L.W., Griswold K.E., Patton S., Kamm R.C., Smith A.G. Electrophoretic characterization of plasma RNA // Biochem. Med. 1975. V. 13. P. 224-230.
62. Hamilton T.C., Smith A.G., Griffin C.A., Henderson R.J. Jr. Ribonucleic acid in plasma from normal adults and multiple myeloma patients // Clin. Chem. 1979. V. 10. P. 1774-1779.
63. Блинов M.H., Луганова И.С., Владимирова А.Д. О факторах нуклеиновой природы в плазме крови человека//Вопросы медицинской химии. 1981. N. 5 С. 600-603.
64. Кулигина Е.В., Андреева А.Ю., Могельницкий А.С., Кит Я.Ю., Якубов Л.А., Рихтер
65. B.А., Власов В.В. Олигонуклеотиды и олигонуклеотидсвязывающие белки спиномозговой жидкости человека//ДАН. 1999. Т. 364. С. 832-834.
66. Schlom J., Spiegelman S., Moore D. Detection of high-molecular-weight RNA in particles from human milk// Science. 1972. V. 175. P. 542-544.
67. Кит Ю.Я., Семенов Д.В., Канышкова Т.Г., Кулигина Е.В., Романникова И.В., Морозова О.В., Рихтер В.А. Секреторные иммуноглобулины А молока человека обладают сродством к олигонуклеотидам и нуклеиновым кислотам // Биохимия. 1999. Т. 64. С. 52-59.
68. Кит Ю.Я., Кулигина Е.В., Романникова И.В., Семенов Д.В., Рихтер В.А., Власов В.В. В препаратах человеческого а-лактальбумина, индуцирующих апоптоз трансформированных клеток, присутствуют рибоолигонуклеотиды // ДАН. 1998. Т. 360.1. C. 406-408.
69. Кит Ю.Я., Кулигина Е.В., Онищенко A.M., Юрченко Л.В., Романникова И.В., Семенов Д.В., Рихтер В.А., Власов В.В. Эндогенные олигонуклеотиды молока человека и их возможная биологическая активность // Биохимия. 1999. Т. 64. С. 1067-1072.
70. Leach J.L., Baxter J.H., Molitor B.E., Ramstack M.B., Masor M.L. Total potentially available nucleosides of human milk by stage of lactation // Am. J. Clin. Nutr. 1995(6). V. 61. P. 1224-1230.
71. Schlimme E. and Schneehagen K. Ribonucleosides in human milk. Concentration profiles of these minor constituents as a function of the nursing time // Z. Naturforsch. 1995. V. 50. P. 105— 113.
72. Larson B.L., Heary H.L. Jr., Devery J.E. Immunoglobulin production and transport by the mammary gland // J. Daiiy Sci. 1980. V. 63. P. 665-671.
73. Schlimme E., Martin D. and Meisel H. Nucleosides and nucleotides: natural bioactive substances in milk and colostrums // British Journal of Nutrition. 2000. V. 84. P. 59-68.
74. Gyorgy P. The uniqueness of human milk. Biochemical aspects // Am. J. Clin. Nutr. 1971. V. 24. P. 970-975.
75. McMillan J.A., Oski F.A., Lourie G., Tomarelli R.M., Landaw S.A. Iron absorption from human milk, simulated human milk, and proprietary formulas // Pediatrics. 1977. V. 60. P. 896900.
76. Plagemann P.G., Wohlhueter R.M. Hypoxanthine transport in mammalian cells: cell type-specific differences in sensitivity to inhibition by dipyridamole and uridine // J. Membr. Biol. 1984. V. 81. P. 255-262.
77. Aronow В., Toll D., Patrick J., Hollingsworth P., McCartan K., Ullman B. Expression of a novel high-affinity purine nucleobase transport function in mutant mammalian T lymphoblasts // Mol. Cell Biol. 1986. V. 6. P. 2957-2962.
78. Williams T.C., Jarvis S.M. Multiple sodium-dependent nucleoside transport systems in bovine renal brush-border membrane vesicles // Biochem. J. 1991. V. 274. P. 27-33.
79. Gutierrez M.M., Brett C.M., Ott R.J., Hui A.C., Giacomini K.M. Nucleoside transport in brush border membrane vesicles from human kidney // Biochim. Biophys. Acta. 1992. V. 1105. P. 1-9.
80. Martin S.J., Green D.R., Cotter T.G. Dicing with death: dissecting the components of the apoptosis machinery // Trends Biochem. Sci. 1994. V. 19. P. 26-30.
81. Meisel H., Hartmann R., Martin D., Schlimme E. Modulating effects of adenosine and modified adenine ribonucleosides on human cells (HL-60) //Nahrung. 1999. V. 43. P. 213-215.
82. Biggiogera M, Bottone M.G, and Pellicciari C. Nuclear RNA is extruded from apoptotic cells 11 The Journal of Gistochemistry and Cytochemistry. 1998. V. 46. P. 999-1005.
83. Biggiogera M., Bottone M.G., Martin Т.Е., Uchiumi Т., Pellicciari. Still immunodetectable nuclear RNPs are extruded from the cytoplasm of spontaneously apoptotic thymocytes // Exp. Cell Res. 1997. V. 234. P. 512-520.
84. Casciola-Rosen L.A., Anhalt G., Rosen A. Autoantigens targeted in systemic lupus erythematosus are clustered in two populations of surface structures on apoptotic keratinocytes // J. Exp. Med. 1994. V. 179. P. 1317-1330.
85. Biggiogera M. and Pellicciari C. Heterogeneous ectopic RNP-derived structures (HERDS) are markers of transcriptional arrest // The FASEB Journal. 2000. V. 14. P. 828-834.
86. Delic J., Coppey-Moisan M., Magdelenat H. Gamma-ray-induced transcription and apoptosis-associated loss of 28S rRNA in interphase human lymphocytes // Int. J. Radiat. Biol. 1993. V. 64. P. 39-46.
87. Grishok A. Extracellular nucleic acids as possible messengers in regulatory information . transfer from immune system to non-lymphoid tissues // Medical Hypotheses. 1995. V. 44. P. 435-438.
88. Anker P., Jachertz D., Stroun M. The role of extracellular DNA in the transfer of information from T to В human lymphocytes in a course of an immune response // J. Immunogenet. 1984. V. 7. P. 33-37.
89. Fadeel В., Orrenius S., Zhivotovsky B. Apoptosis in Human Disease: A New Skin for the Old Ceremony? // Biochemical and Biophysical Research Communications. 1999. V. 266. P. 699-717.
90. Holan V., Lipoldova M., Zadrazil S., Hasek M. Induction of specific cell-mediated cytotoxicity in vitro by means of RNA isolated from allografted mice // Folia Biol. 1981. V. 27. P. 422-426.
91. Archer S. Induction of T-cell specific antigen on bone marrow lymphocytes with thymus RNA // Immunology. 1978. V. 34. P. 123-129.
92. Bazanova N.V., Seitz I.F. May the presence RNA-lipoprotein complex in the human sera be the tumor marker? // Eksp. Onkol. 1989. V . 11. P. 37-39.
93. Wieczoker A.J., Rhyner C., Block L.H. Isolation and characterization of an RNA-proteolipid complex associated with the malignant state in humans // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. V. 82. P. 3455-3459.
94. Wieczoker A.J., Sitaramam V., Machleidt W. Diagnostic and prognostic value of RNA-proteolipid in sera of patients with malignant disorders following therapy: first clinical evaluation of a novel tumor marker // Cancer Res. 1987. V. 47. P. 6407-6412.
95. Halpern B.C., Halpern R.M., Chaney S.Q., Smith R.A. Reversal of malignant transformation by tumor DNA// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1970. V. 67. P. 1827-1833.
96. Bresler V.M., Broun R.G., Podgaetskaia D.Ia., Shvemberger I.N. On the leukogenic effect of nucleic acids isolated from tumors // Tsitologiia. 1962. V. 4. P. 318-322.
97. Katsman Y., Giacomoni D., Yakulis V., Heller P. Characterization of two plasmocytoma fractions and their RNA capable of changing lymphocytes surface immunoglobulines (cell conversion) // Cell Immunol. 1975. V. 18. P. 98-109.
98. Chen Y., Bhoopalam N., Yakulis V., Heller P. Changes in lymphocyte surface immunoglobulines in myeloma and effect of an RNA-containing plasma factor // Ann. Internal. Med. 1975. V. 83. P. 625-631.
99. Hess M., Corrigan J.J., Hodak J.A. The effects of nucleic acids on pituitary ACTH content // Endocrinology. 1961. V. 68. P. 548-552.
100. Amos H., Moore M.O. Influence of bacterial ribonucleic acid on animal cells in culture. Stimulation of protein synthesis // Exp. Cell Res. 1963. V. 32. P. 1-13.
101. Rollins E., Miyagi M., Moser C.R., Flickinger R.A. Stimulation of protein synthesis of frog embryo cells by larval and adult frog liver ribonucleic acid preparations // Nature. 1966. V. 209. P. 5095-5510.
102. Weisberger A.S. Induction of alered globin synthesis in human immature erythrocytes incubated with ribonucleoprotein // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1962. V. 48. P. 68-80.
103. Смирнов A.B. Механизмы воспроизведения экзогенными РНК специфических эффектов биологически активных веществ // Фармакология и токсикология. 1989. Т. 52. С. 111-119.
104. Klinman D.M. Use of CpG oligodeoxynucleotides as immunoprotective agents // Expert. Opin. Biol. 2004. V. 4. P. 937-946.
105. Ishii K.J., Gursel I., Gursel M., Klinman D.M. Immunotherapeutic utility of stimulatory and suppressive oligodeoxynucleotides // Curr. Opin. Mol. 2004. V. 6. P. 166-174.
106. Carpentier A.F. Cancer immunotherapy with CpG-ODN // Med. Sci. 2005. V. 21. P. 7377.
107. Klinman D.M., Currie D., Gursel I., Verthelyi D. Use of CpG oligodeoxynucleotides as immune adjuvants 11 Immunol. Rev. 2004. V. 199. P. 201-216.
108. Klinman D.M., Yi A.K., Beaucage S.L., Conover J., Krieg A.M. Immunology CpG motifs present in bacterial DNA rapidly induce lymphocytes to secrete interleukin 6, interleukin 12, and interferon у // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 2879-2883.
109. Hartmann G., Weiner G.J., Krieg A.M. CpG DNA: A potent signal for growth, activation, and maturation of human dendritic cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 93059310.
110. Krieg A.M.,Yi A.K., Matson S., Waldschmidt T.J., Bishop G.A., Teasdale R., Koretzky G.A., Klinman D.M. CpG Motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation // Nature. 1995. V. 374. P. 546-549.
111. Sugiyama Т., Gursel M., Takeshita F., Coban C., Conover J., Kaisho Т., Akira S., Klinman D.M., Ishii K.J. CpG RNA: identification of novel single-stranded RNA that stimulates human CD14+CD1 lc+ monocytes // J. Immunol. 2005. V. 174. P. 2273-2279.
112. Tuschl Т., Zamore P.D., Lehmann R., Bartel.D.P., Sharp P.A. Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro // Genes Dev. 1999. V. 13. P. 3191-3197.
113. Caplen N.J., Fleenor J., Fire A., Morgan R.A. dsRNA-mediated gene silencing in cultured Drosophila cells: a tissue culture model for the analysis of RNA interference // Gene. 2000. V. 252. P. 95-105.
114. Oates A.C., Bruce A.E., Ho R.K. Too much interference: injection of double-stranded RNA has nonspecific effects in the zebrafish embryo // Dev. Biol. 2000. V. 224. P. 20-28.
115. Zhao Z., Cao Y., Li M., Meng A. Double-stranded RNA injection produces nonspecific defects in zebrafish // Dev. Biol. 2001. V. 229. P. 215-223.
116. Kumar A., Haque J., Lacoste J., Hiscott J., Williams B.R. Double-stranded RNA-dependent protein kinase activates transcription factor NF-kappa В by phosphorylating I kappa В // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 6288-6292.
117. Minks M.A., West D.K., Benvin S., Baglioni C. Structural requirements of double-stranded RNA for the activation of 2',5'-oligo(A) polymerase and protein kinase of interferon-treated HeLa cells //J. Biol. Chem. 1979. V. 254. P. 10180-10183.
118. Manche L., Green S.R., Schmedt C., Mathews M.B. Interactions between double-stranded RNA regulators and the protein kinase DAI // Mol. Cell. Biol. 1992. V. 12. P. 5238-5248.
119. Fujita Т., Shibuya H., Hotta H., Yamanishi K., Taniguchi T. Interferon-beta gene regulation: tandemly repeated sequences of a synthetic 6 bp oligomer function as a virus-inducible enhancer // Cell. 1987. V. 49. P. 357-367.
120. Wathelet M.G., Clauss I.M., Content J., Huez G.A. Regulation of two interferon-inducible human genes by interferon, poly(rI).poIy(rC) and viruses // Eur. J. Biochem. 1988. V. 174. P. 323-329.
121. Gilmour K.C., Reich N.C. Signal transduction and activation of gene transcription by interferons // Gene Expr. 1995. V. 5. P. 1-18.
122. Clemens M.J., Elia A. The double-stranded RNA-dependent protein kinase PKR: structure and function // J. Interferon Cytokine Res. 1997. V. 17. P. 503-524.
123. Hall D.J., Jones S.D., Kaplan D.R., Whitman M., Rollins B.J., Stiles C.D. Evidence for a novel signal transduction pathway activated by platelet-derived growth factor and by double-stranded RNA // Mol. Cell Biol. 1989. V. 9. P. 1705-1713.
124. Daly C., Reich N.C. Double-stranded RNA activates novel factors that bind to the interferon-stimulated response element // Mol. Cell Biol. 1993. V. 13. P. 3756-3764.
125. Nilsen T.W., Maroney P.A., Robertson H.D., Baglioni C. Heterogeneous nuclear RNA promotes synthesis of (2',5')oligoadenylate and is cleaved by the (2',5')oligoadenylate-activated endoribonuclease // Mol. Cell Biol. 1982. V. 2. P. 154-160.
126. Porter R.D. Transformation in cyanobacteria // Crit. Rev. Microbiol. 1986. V. 13. P. 111132.
127. Mishra N.C. Gene transfer in fungi //Adv. Genet. 1985. V. 23. P. 73-178.
128. Daiji A., Guzman C.A., Gerstel В., Wachholz P., Timmis K.N., Wehland J., Chakraborty Т., Weiss S. Oral somatic transgene vaccination using attenuated S. typhimurium // Cell. 1997. V. 91. P. 765-775.
129. Wolff J.A., Malone R.W., Williams P., Chong W., Acsadi G., Jani A. and Feigner P.L. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo // Science. 1990. V. 247. P. 1465-1468.
130. Holmgren L., Szeles A., Rajnavolgyi E., Folkman J., Klein G., Ernberg I., Falk K.I. Horizontal transfer of DNA by the uptake of apoptotic bodies // Blood. 1999. V. 93. P. 39563963.
131. Bergsmedh A., Szeles A., Henriksson M., Bratt A., Folkman M.J., Spetz A.L., Holmgren L. Horizontal transfer of oncogenes by uptake of apoptotic bodies // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. P. 6407-6411.
132. Garcia-Olmo D., Garcia-Olmo D.C., Ontanon J., Martinez E. Horizontal transfer of DNA and the "genometastasis hypothesis" // Blood. 2000. V. 95. P. 724-725.
133. Toulme J.J., Verspieren P., Boiziau C., Loreau N., Cazenave C., Thuong N.T. Antisense oligonucleotides: tools of molecular genetics and therapeutic agents // Ann. Parasitol. Hum. Сотр. 1990. V. 65. P. 11-4.
134. Erdmann V.A., Barciszewska M.Z., Hochberg A, de Groot N., Barciszewski J. Regulatory RNAs // Cell Mol. Life Sci. 2001. V. 58. P. 960-977.
135. Liu W.C., Godbout R., Jay E. Tissue and species-specific effects of small molecular weight nuclear RNA's on transcription in isolated mammalian nuclei // Can. J. Biochemistry. 1981. V. 59. N. 5. P. 343-352.
136. Valcarcel J., Green M.R. The SR protein family: pleiotropic functions in pre-mRNA splicing // Trends Biochem. Sci. 1996. V. 21. P. 296-301.
137. Huttenhofer A., Kiefmann M. RNomics is experimental approach that identifies 201 candidates for novel, small, non-messenger RNAs in mouse // EMBO. 2001. V. 20. N. 11. P. 2943-2953.
138. Lagos-Quintana M., Rauhut R., Meyer J., Tuschl T. New microRNAs from mouse and human // RNA. 2003. N. 9. P. 175-179.
139. Vionnet O., Vain P., Angell S., Baulcomb D.C. Systemic spread of sequence-specific transgene RNA degradation in plants is initiated by localized introduction of promotorless DNA // Cell. 1998. V. 95. P. 177-187.
140. Waterhouse P.M., Graham M.W., Wang M. B. Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA // Proc. Natl. Acad. Sci. 1998. V. 95. P. 13959-13964.
141. Kasschau K.D., Carrington J.C. A counterdefensive strategy of plant viruses: suppression of posttranscriptional gene silencing // Cell. 1998. V. 95. P. 461-470.
142. Lave C., Kasschau K.D., Carrington J.C. Virus-encoded suppressor of posttranscriptional gene silencing targets a maintenance step in the silencing pathway // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. P. 13401-13406.
143. Tabara H., Sarkissian M., Kelly W.G., Fleenor J., Grishok A., Timmons L., Fire A., Mello C.C. The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans // Cell. 1999. V. 99. P. 123-132.
144. Ketting R.F., Haverkamp Т.Н., van Luenen H.G., Plasterk R.H. Mut-7 of C. elegans, required for transposon silencing and RNA interference, is a homolog of Werner syndrome helicase and RNaseD//Cell. 1999. V. 99. P.l 33-141.
145. Elbashir S.M., Lendeckel W., Tuschl T. RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs // Genes Dev. 2001. V. 15. P. 188-200.
146. Wargelius A., Ellingsen S., Fjose A. Double-stranded RNA induces specific developmental defects in zebrafish embryos // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. V. 263. P. 156-161.
147. Li Y.X., Farrell M.J., Liu R., Mohanty N., Kirby M.L. Double-stranded RNA injection produces null phenotypes in zebrafish // Dev. Biol. 2000. V. 217. P. 394-405.
148. Wianny F., Zernicka-Goetz M. Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development // Nat. Cell Biol. 2000. V. 2. P. 70-75.
149. Oelgeschlager M., Larrain J., Geissert D., De Robertis E.M. The evolutionarily conserved BMP-binding protein Twisted gastrulation promotes BMP signalling // Nature. 2000. V. 405. P. 757-763.
150. Svoboda P., Stein P., Hayashi H., Schultz R.M., Selective reduction of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA interference // Development. 2000. V. 127. P. 4147-4156.
151. Billy E., Brondani V., Zhang H., Muller U., Filipowicz W. Specific interference with gene expression induced by long, double-stranded RNA in mouse embryonal teratocarcinoma cell lines // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98(25). P. 14428-14433.
152. Caplen N.J., Parrish S., Imani F., Fire A., Morgan R.A. Specific inhibition of gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. P. 9742-9747.
153. Paul C.P., Good P.D., Winer I., Engelke D.R. Effective expression of small interfering RNA in human cells //Nat. Biotechnol. 2002. V. 20(5). P.505-508.
154. Fire A. RNA-triggered gene silencing // Trends Genet. 1999. V. 15. P. 358-363.
155. Zeng Y., Yi R., Cullen B.R. MicroRNAs and small interfering RNAs can inhibit mRNA expression by similar mechanisms // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 9779-9784.
156. Olsen P.H., Ambros V. The lin-4 regulatory RNA controls developmental timing in Caenorhabditis elegans by blocking LIN-14 protein synthesis after the initiation of translation // Dev. Biol. 1999. V. 216. P. 671-680.
157. Brennecke J., Hipfner D.R., Stark A., Russell R.B., Cohen S.M. bantam encodes a developmentally regulated microRNA that controls cell proliferation and regulates the proapoptotic gene hid in Drosophila // Cell. 2003. V.l 13. P. 25-36.
158. Митрофанова Е.Э., Бахвалова B.H., Добрикова Е.Ю., Pap В.А., Морозова O.B. Генная иммунизация против вируса клещевого энцефалита// Молекуляр. биология. 1997. Т. 31. С. 403-406.
159. Tighe Н., Corr М., Roman М., Raz Е. Gene vaccination: plasmid DNA is more than just a blueprint // Immunol. Today. 1998. V. 19. P. 89-97.
160. Schirmbeck R., Reimann J. Revealing the potential of DNA-based vaccination: lessons learned from the hepatitis В virus surface antigen // Biol. Chem. 2001. V. 382. P. 543-552.
161. Condon C., Watkins S.C., Celluzzi C.M., Thompson K., Falo L.D., Jr. DNA-based immunization by in vivo transfection of dendritic cells // Nat. Med. 1996. V. 2. P. 1122-1128.
162. Tang D.C., De Vit M., Johnston S.A. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response//Nature. 1992. V. 356. P. 152-154.
163. Hoerr I., Obst R., Rammensee H.G., Jung In vivo application of RNA leads to induction of specific cytotoxic T lymphocytes and antibodies // Eur. J. Immunol. 2000. V. 30. P. 1-7.
164. Ying H., Zaks T.Z., Wang R.F., Irvine K.R., Kammula U.S., Marincola F.M., Leitner W.W., Restifo N.P. Cancer therapy using a self-replicating RNA vaccine // Nat. Med. 1999. V. 5. P. 823-827.
165. Boczkowski D., Nair S.K., Snyder D., Gilboa E. Dendritic cells pulsed with RNA are potent antigen-presenting cells in vitro and in vivo // J. Exp. Med. 1996. V. 184. P. 465 472.
166. Steinman R.M. The dendritic cell system and its role in immunogenicity // Annu. Rev. Immunol. 1991. V. 9. P. 271 -296.
167. Koido S., Kashiwaba M., Chen D., Gendler S., Kufe D., Gong J. Induction of antitumor immunity by vaccination of dendritic cells transfected with MUC1 RNA // J. Immunol. 2000. V. 165. P. 5713-5719.
168. Zhang W., He L., Yuan Z., Xie Z., Wang J., Hamada H., Cao X. Enhanced therapeutic efficacy of tumor RNA-pulsed dendritic cells after genetic modification with lymphotactin // Hum. GeneTher. 1999. V. 10. P. 1151-1161.
169. Martinon F., Krishnan S., Lenzen G., Magne R., Gomard E., Guillet J.G., Levy J.P., Meulien P. Induction of virus-specific cytotoxic T lymphocytes in vivo by liposome-entrapped mRNA // Eur. J. Immunol. 1993. V. 23. P. 1719-1722.
170. Zhou W.Z., Hoon D.S., Huang S.K., Fujii S., Hashimoto K., Morishita R., Kaneda Y. RNA melanoma vaccine: induction of antitumor immunity by human glycoprotein 100 mRNA immunization//Hum. Gene Ther. 1999. V. 10. P. 2719-2724.
171. Filion M.C., Phillips N.C. Toxicity and immunomodulatory activity of liposomal vectors formulated with cationic lipids toward immune effector cells // Biochim. Biophys. Acta. 1997. V. 1329. P. 345-356.
172. Wolff J.A., Malone R.W., Williams P., Chong W., Acsadi G., Jani A., Feigner P.L. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo // Science. 1990. V. 247. P. 1465-1468.
173. Granstein R.D., Ding W., Ozawa H. Induction of anti-tumor immunity with epidermal cells pulsed with tumor-derived RNA or intradermal administration of RNA // J. Invest. Dermatol. 2000. V. 4. P. 632-636.
174. Mandl C.W., Aberle J.H., Aberle S.W., Holzmann H., Allison S.L., Heinz F.X. In vitro-synthesized infectious RNA as an attenuated live vaccine in a flavivirus model // Nat. Med. 1998. V. 4. P. 1438-1440.
175. Simmons S.J., Tjoa В.A., Rogers M., Elgamal A., Kenny G.M., Ragde H., Troychak M.J., Boynton A.L., Murphy G.P. GM-CSF as a systemic adjuvant in a phase П prostate cancer vaccine trial // Prostate. 1999. V. 39. P. 291-297.
176. Mellstedt H., Fagerberg J., Osterborg A. Local low-dose of soluble GM-CSF significantly augments an immune response against tumour antigens in man // Eur. J. Cancer. 1999. V. 35. P. 29-32.
177. Mackey M.F., Gunn J.R., Maliszewsky C., Kikutani H., Noelle R.J., Barth R.J. Jr. Dendritic cells require maturation via CD40 to generate protective antitumor immunity // J. Immunol. 1998. V. 161. P. 2094-2098.
178. Conry R.M., LoBuglio A.F., Wright M., Sumerel L., Pike M.J., Johanning F., Benjamin R., Lu D., Curiel D.T. Characterization of a messenger RNA polynucleotide vaccine vector // Cancer Res. 1995. V. 55. P. 1397-1400.
179. Wilson J.M., Danos O., Grossman M., Raulet D.H., Mulligan R.C. Expression of human adenosine deaminase in mice reconstituted with retrovirus-transduced hematopoietic stem cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V. 87. P. 439-443.
180. Долгих M.C. Возможности генной терапии, ее методы, объекты и перспективы // Успехи современной биологии. 2004. Т. 124. С. 123-143.
181. Amalfitano A. Next-generation adenoviral vectors: new and improved // Gene Ther. 1999. V. 6. P.1643-1645.
182. Kochanek S. High-capacity adenoviral vectors for gene transfer and somatic gene therapy // Hum. Gene Ther. 1999. V. 10. P. 2451-2459.
183. Harada-Shiba M., Yamauchi K., Harada A., Takamisawa I., Shimokado K., Kataoka K. Polyion complex micelles as vectors in gene therapy—pharmacokinetics and in vivo gene transfer // Gene Ther. 2002. V. 9. P. 407-414.
184. Kuroiwa Y., Yoshida H., Ohshima Т., Shinohara Т., Ohguma A., Kazuki Y., Oshimura M., Ishida I., Tomizuka K. The use of chromosome-based vectors for animal transgenesis // Gene Ther. 2002. V. 9. P. 708-712.
185. Scherer F., Anton M., Schillinger U., Henke J., Bergemann C., Kruger A., Gansbacher В., Plank C. Magnetofection: enhancing and targeting gene delivery by magnetic force in vitro and in vivo // Gene Ther. 2002. V. 9. P. 102-109.
186. Cartier R., Reszka R. Utilization of synthetic peptides containing nuclear localization signals for nonviral gene transfer systems // Gene Ther. 2002. V. 9. P. 157-167.
187. Dzau V.J., Mann M.J., Ehsan A., Griese D.P. Gene therapy and genomic strategies for cardiovascular surgery: The emerging field of surgiomics // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2001. V. 121. P. 206-216.
188. Walsh C.E. Fetal gene therapy // Gene Ther. 1999. V. 6. P. 1200-1201.
189. Wagers A.J., Christensen J.L., Weissman I.L. Cell fate determination from stem cells // Gene Ther. 2002. V. 9. P. 606-612.
190. Gruenert D.C., Novelli G., Dallapiccola В., Colosimo A. Genome medicine: gene therapy for the millennium // Gene Ther. 2002. V. 9. P. 653-657.
191. Gu J., Andreeff M., Roth J.A., Fang B. hTERT promoter induces tumor-specific Bax gene expression and cell killing in syngenic mouse tumor model and prevents systemic toxicity // Gene Ther. 2002. V. 9. P. 30-37.
192. Ghaneh P., Greenhalf W., Humphreys M., Wilson D., Zumstein L., Lemoine N.R., Neoptolemos J.P. Adenovirus-mediated transfer of p53 and pl6(INK4a) results in pancreatic cancer regression in vitro and in vivo // Gene Ther. 2001. V. 8. P. 199-208.
193. Savontaus M.J., Sauter B.V., Huang T.G., Woo S.L. Transcriptional targeting of conditionally replicating adenovirus to dividing endothelial cells // Gene Ther. 2002. V. 9. P. 972-979.
194. Маниатис Т., Сэмбрун Д., Фрич Э. Молекулярное клонирование. // Москва. Мир. 1984.
195. Marmur J. A procedure for the isolation of DNA from microorganisms // J. Mol. Biol. 1961. V.3.P. 208.
196. Скоупс P. Методы очистки белков. // Москва. Мир. 1985.
197. Остермаи Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. // Москва. Наука. 1981.
198. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. // Москва. Наука. 1985.
199. Digweed М., Pieler Т., Erdmann V.A. RNA Sequensing // Advanced Methods in Protein Microsequence Analysis / Springer-Verlag Berlin Heidelberg. 1986.
200. Use of tripan blue stain and the hemocytometer to determinate total cell counts and viable cell number. // Sigma. 1996. P. 1702.
201. Mosmann T.J. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxic assays // J. Immunol. Meth. 1983. N. 65. P. 55-63.
202. Щербаков Д.Ю., Кит Ю.Я., Колдашева 3.T., Сидоров В.Н. Фосфорилирование белков на поверхности клеток слюнных желез личинок Drosophila melanogaster // Биохимия. 1987. Т. 52. С. 1608-1613.
203. Эйнштейн Э. Белки мозга и спинномозговой жидкости в норме и патологии. // Москва. Мир. 1988.
204. Паутова Л.В., Лактионов П.П., Рыкова Е.Ю., Якубов Л.А., Власов В.В. Исследование участка связывания олигонуклеотидов на молекуле иммуноглобулина // Молекуляр. биология. 1994. Т. 28. С. 1106-1112.
205. Шапот А.В. Нуклеазы. // Москва. Наука. 1975.
206. Tressler R.L., Ramstack М.В., White N.R., Molitor B.E., Chen N.R., Alarcon P., and Masor M.L. Determination of total potentially available nucleosides in human milk from Asian women//Nutrition. 2003. V. 19. P. 16-20.
207. Walker T.A., Endo Y., Wheat W.H., Wool I.G., and Pace N.R. Location of 5.8 S rRNA contact sites in 28 S rRNA and the effect of alpha-sarcin on the association of 5.8 S rRNA with 28 S rRNA//J. Biol. Chem. 1983. V. 258. P. 333-338.
208. Chen E.Y., and Roe B.A. Sequence studies on human placenta tRNAVal : comparison with the mouse myeloma tRNAVal // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1977. V. 78. P. 631640.
209. Morley D.J., Hawley D.M., Ulbright T.M., Butler L.G., Culp J.S., and Hodes M.E. Distribution of phosphodiesterase I in normal human tissues // J.Histochem. Cytochem.1987. V. 35. P. 75-82.
210. Eder P.S., DeVine R.J., Dagle J.M., Walder J.A. Substrate specificity and kinetics of degradation of antisense oligonucleotides by a 3' exonuclease in plasma // Antisense Res. Dev. 1991. V. l.P. 141-151.
211. Burgoyne R.D., and Duncan J.S. Secretion of milk proteins // J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 1998. V. 3. P. 275-286.
212. Shennan D.B., and Peaker M. Transport of milk constituents by the mammary gland // Physiol. Rev. 2000. V. 80. P. 925-951.
213. Jensen R.G. Lipids in human milk // Lipids. 1999. V. 34. P. 1243-1271.
214. Kit Y.Ya., Semenov D.V., Nevinsky G.A. Phosphorylation of different human milk proteins by human catalytic secretory immunoglobulin A // Biochem. Mol. Biol. Int. 1996. V. 39. P. 521-527.
215. Шабарова 3.A., Богданов А.А. Химия нуклеиновых кислот и их компонентов. // Москва. Химия. 1978.
-
Кулигина, Елена Владимировна
-
кандидата биологических наук
-
Новосибирск, 2005
-
ВАК 03.00.04
- Исследование содержания нуклеиновых кислот и получение низкомолекулярной ДНК из гонад пресноводных рыб байкальского региона
- Нуклеазные активности антител и лактоферрина молока человека
- Нуклеотид-гидролизующая активность иммуноглобулинов и лактоферрина молока человека
- Формирование и исследование структуры мультислойных пленок, содержащих нуклеиновые кислоты
- МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ РАЗВИТИЯ ПРОИЗВОДНЫХ ЭПИДЕРМИСА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ В СВЯЗИ С ФОРМИРОВАНИЕМ МОЛОЧНЫХ И ШЕРСТНЫХ ПРИЗНАКОВ
