Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

НОВЫЙ МЕТОД ИММУНОДИАГНОСТИКИ ФИТОВИРУСОВ - ВИРОБАКТЕРИАЛЬНАЯ АГГЛЮТИНАЦИЯ (АБВ-ТЕСТ)

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "НОВЫЙ МЕТОД ИММУНОДИАГНОСТИКИ ФИТОВИРУСОВ - ВИРОБАКТЕРИАЛЬНАЯ АГГЛЮТИНАЦИЯ (АБВ-ТЕСТ)"

ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ и ВИРУСОЛОГИИ имени Д.К.ЗАБ0Л0ТН0Г0 АН УССР

J

• СЕРГЕЙ НИКОЛАЕВИЧ ЧИРКОВ

НОВЫЙ МЕТОД ИШУЫОДИАГНОС'ЩКИ1 ФИТОВИРУСОВ ЕИРОБАКТЕРИАЛЬНАЯ АГГЛЮТИНАЦИЯ (АЕВ-ТВСТ)

03.00»06 - вирусология

■¿ШР1

На правах рукописи УДК 632»3,36:676«в.077

АВТОРЕФЕРАТ днсоертацда яа соискание ученой стелена кандидата Оиодогачеокяг наун

Клев - 1962

(föu/('Y^f? *

4'

Работа выполнена на кафедре вирусологи« Биологического факультета Московского государственного университета имени М*В.Ломоносова в в Институте микробиологии АН СССР*

Научные руководители:

член-корреспондент ВАСХНИЛ, доктор биологических наук, профессор И.Г.Атайіхов

кандидат йиологических наук, старшой научный сотрудник А.М.Оловников

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Н.С.Дяченко

кандидат биологически: наук, доцент А.Л.Бойко

Ведущая организация:

Институт прикладной .молекулярной биологии и генетики ВАСХНИЛ

Защита состоится «Ж" зн&аря 1983 года нз заседании специализированного совета Д.0І6.06.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени .доктора наук при Листлтуте микробиологии я вирусологии имени Д.К.Заболотного АН УССР /252627, ГСП, Киев-143, ул. академика Заболотного, 26/.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии и вирусологии им. Д.К.Заболотного Ali УССР.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

А.Г.Коваленко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность дродлета, Вирусные болезнл растений наносят серьезный урон урожаи многж сельскохозяйствешнк культур. Наиболее эффективным способом предупреждения потерь является, нараду с использованием различного рода агротехнических приемов и защитных мероприятий, применение безвирусного посадочного материала, который обычно получаяг отбором безвпруспшс растений, использованием устойчивых к вирусам сортов, химао- и термотерапией зараженного материала или оздоровлением заражених растений методом культивировании апикальной меристемы. Для проверки исходного и оздоровленного материала необходимо располагать надежным методо« вирусологического контроля. Наиболее перспективны юлмуноло-гнтеокде методы анализа, основным достоинством которых является высокая чувствительность а специфичность выявления и идентификации вирусов растений. Несмотря на то, что предложено к используется немало способов иммуноанализа, разработка нових тестов по-прежнему остается актуальной задачей, поскольку, в связи о расаирением работ по безвірусному растениеводству, заметно повышаются требования к чувствительности, простоте и производительное ти методов массовой иммунодиагностики.

. Цель и задача работы. Цель настоящей.работы заключалась в создании нового метода ікдмунодиагностика фито?ярусов, отличающегося высокой чувствительностью а в то же время достаточно простого а доступного ддя массовых анализов в производственных условиях,

В задачу исследования входило: I) зшвжеяие возможности реакция агглютинация клеток золотистого стафилококка в присутствия вирионов фитовдрусов в специфических антител; 2) поиск оптимальних условие приготовления ж хранения бактериального им—

шуяодиагиоотвкума; 3) определение чувствительности, скорооти

я специфичности разработанного метода; 4) практическое использование теста для массозой диагностики вирусов картофеля, гвоздики И ШаМОЕЯЬОЕОВ,

Научная новизна работа. Предложен новый метод иммунодиагностики парусов растений - влроЗактериальная агглютинация (АБВ--тест). При создании метода был применен подход, разработанный ранее для серотяпированпя бактериальных штаммов ( Кгон-У^И? 1973). Суть его заключается в использовании уникальной способности протекна А (ПрА) золотистого стафилококка связывать Бз -фрагмент молекулы шмуноглобулдноз, ■ Сенсибдлизирозагсгай антисывороткой (АС), стафилококк становится своеобразным антителышм дяагносглкумом, область дряь:з нения которого завис иг от специфичности АС, Новлзна работы захлю-гсется в том, что предложенный подход вперзые использован для диагностика вирусов раотений, что стало возможным после коренного изменения условий приготовления иммуноди а гное тикума.

Практическая пенкостъ работа. Проведенные исследования показала, что чувствительность АБЭ-тес1а а высокая скорость реакция виробактерлалвяой агглатине^ии позволяют осуществлять эффективный вирусологический контроль. Поэтов АБЗ-тест может быть использован в работе меристемных лабораторий, хозяйств по первичному семеноводству картофеля и в других аналогичных сельскохозяйственных организациях, занимающихся получением безвирусного посадочного материала. Кроме того, АБВ-тест может быть использован в качестве экспресс-метода и при ^следоватэльской работе с вирусами растений в научно-исследовательских учреждениях соответствующего профиля и в карантинных организа/ршх.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на заседа-

»

пил кафедры вирусологии МГУ им.М.В.Ломоносова 03'.06.82.

. По материалам диссертации опубликовано 4 работы.

Структура и ой'ьем диссертация. Диссертация изложена на страницах, включает стр.текста, 18 таблиц и II рисунков и состоит ез вэедекия, 2 глав литературного обзора, 4 глав собственных исследования, выводов, приложения я списка цитируемой литературы, Еключаюаего 201 работу отечественных и зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И' МЕТОДЫ Лш приготовления иымунодиагностикума использовали микроорганизмы ¿1арку&)С0ССиз ашш$, непатогенный птаыи Сои/ан. I,

В работ6 использованы антивирусные сыворотки, полученные иммунизацией кроликов на каф.вирусологии МГУ, и в лаборатории ¡цяаг-ностичес:шх сывороток НИИ картофельного хозяйства ИСК РС£СР. Гам-К'аг.;о3улгно,>ую фракции АС получали высаливанием сульфатом аммония, специфические антитела к вирусу табачной мозаика (ЮТ) и огуречному вирусу 3 (ОВ-3) получали а^фшшой хроматографией АС на СЫ£>% -активированной сефарозе 4В,

Очищенные препараты ЕТМ, ОВ-3, вируса крапчатости гвоздика (ВКГ), вируса итриховатой мозаика ячменя (ШЛЯ) я вируса мозаики костра (К®) были предоставлены сотрудниками паф»вирусология ИГУ С.И.Ыалшеяко, С.В.БоВдовым и А.В.Куляначем. Препараты Х-вирус» картофеля (ХЕК) и У-варуса картофеля (УВК) предоставлены сотрудником Института ЩБГ ВАСХНШ В.К.Еовюсовш. Препарат вирусов шампиньонов подучен сотрудницей совхоза "Заречье" Ноок.сЗл. К.1» Алексеевой»

Основная часть работы по диагностике и У-вирусов кар-

тофеля выполнена на зараженном материале, подученном в НИИЮС, совместно с сотрудниками этого института. Клубни картофеля, искусственно зараженные 2,Си У-зирусами, бцдв содучеш от д-ра Ва£нтрауба.'

Для диагностики ВКГ использовали ы^рлотеиные растэвия гзоз-

дики, получаемые в кгристемкой лаборатории колхоза им.С,М.Кирова* Шаі'линьозн с оижтоігами вирусного заболевания а внешне здоровые плодовые тела собирали в шампиньонных хозяйствах совхозов "Московский" а "Заречье" Моск.обл. Культуру мицелия виражали на длвяом сусле.

Калелышй і.'.етод диагностлки ДО/Д) выполняла по схеке» предложенной М.С.-Дунинцм я Н.Н.Поповой (1937). Ира постановке аммо-няйно-суль:£атного метода ЦС') использовали методику, разработанную Ха&аком и Рунге (1977).

Элентронномлкроскопичеснне доследования реакции зиробакте-ряальяой агглэтинацсл выполнена в Институте шкробиологии АН СССР совместно с Й./.Сургучезэй.

РЕЗУЛЬТАТИ К ОЗЯГЕЖЦЯ 2. Изучение возможности пеакдяд вяробактериальноЯ агглятя-аадга. .

Налете ка поверхности клоток стафилококка молекул Пр4 позволяло предположить, что з присутствия вирусна частиц и специфических к этому вирусу антител будет происходить совместная агглютинация вярус":ас частзд и клеток золотистого стафилококка по Схеме, изобраненной на ряс. I.

Для выяснения принципиальной осуаестздмоста реакции варобак-териальной агглютинации использован отй$:їлояокк, выраценньй на агаризовакной среде Хоттянгера, очищенные препарати ВТ',ї, ОЕ-3 а ХБК и соответствующие антивирусные с ¡^воротки, Показано, что при о^ешинаяш с енсибилдзиро ванн о го стафилококка о варуенкм пре-паратотл наблвдается агрегація исходно гомогенной бактериальной суспепош, зсорсао видимая невооруженным глазом. Реакция бакте-риаль.ю-Еирусной агглютаиации а Ошга положена в основу разработанного нагла кстода иммунодиагностики фятовирусов (АБВ-теста)'»

2. Разработка оптимальных методов приготовления имуіуко-

лиагностикума. а) Оптимизация режима кульгнвированяя сга$ил<жоякА* О пригодности того или иного режима культявированяя стафилококка судила по конечной характеристике - чувствительности . АБВ--теста, которую можно бкло получать, используя выращенную суспензию микробных клеток. Чувствительность определяли в стандарти;« условиях на модельной системе "ВГМ - АО к ВТМ" по предельному разведению вирусного препарата о сэвестноЯ концентрацией ВТМ,еще шзшзаэдему сдьцифнческуя агрегации стафилококка. При этом мы исходила из предположения» что чувствительность реакции пропорциональна додержанню ПрА в клеточной стенке микроорганизма, поскольку стафилококк, содержащий большее количество ПрА, будет сильнее насыщен специфическими антителаш, Известно, что содержание ПрА в бактериальной стенке завкат от фаза роста бактерий С Ъогщчеъ- , 1969; Мо^і'Ґг , 1976). Подточу нами было изучено влияние рада факторов на чувствительность АБВ-теста: концентрации к возраста инскулюма, времени инкубации, количества, консистенции и состава питательных сред.

Была изучена пригодность для наша педеЗ агаразованяой среди Хоттингера и влияние различных добавок к ней: крови, плазмы я сыворотки человека, а также яичного желтка. Другую группу составляли синтетические среды на основе триатона с добавлене« глюкозы, витаминов группы В и глицерофосфата натрия, приготовленные наш с учетом литературных данных* Были использованы также дифференциально-диагностические среды для стафилококка, экстракты сердечной мышцн крупного рогатого скота и бульон Хоттингера,

Свойства микробной суспензии существенно зависела от состава питательной среды. Наиболее высокая чувствительность АБС-теста <0,1-0,2 ияг/шг ЕТЫ) была получена при использования етофидо-

—'I""

Л-^І» y

АНТИТЕЛА **

СТАФИЛОКОКК

О

ВИРУС П

f

ДИАГНОСТИКУ«

КОАГГЛЮТИНАЦИЯ

Рис . I * Схема реакции вироб;іктаряальной агглютинация

кокка, выращенного ва агарззованной средэ Хоттиягера, синтетических средах с глицерофосфатом натрия я на агаризоэаяноы экстракте сердевдой мышцы крупного рогатого енота. Следует подчеркнуть» что чувствительность АВВ-теота ігожет варьировать от експерименте к эксперименту. Возможно, это обусловлено хороио извествнм фактом варьирования содергангя ПрА в клеточной стенке стафилококка ( 1974). В кашах эксперимент?.* наиболызей воспроизводимоетыэ отягчались результаты, полученные при выралзваниа стафзлококка на агаризованной среде Хоттингсра: колебания чувствательности не превышала 0,1 мкг/мл, что вполне допустило для практического использования АБВ-тэста. Поэтому для далькейплх экспериментов била использована агаризованпая среда Хоттингера без добавок.

СодертАше колонке об разушях единиц в ішокулкліе, продолжительность хранения стафилококка на скошенном агаре перед пересевом на свежу» питательную среду (7-108 суток), голсдаа слоя питательной среда в чалках Петри (2-Ю їла) в временные параметры культивирования практически не влияли на чувствительность АБЗ-теста,

В результате проведениях исследований бі-'ли выбраны оптимальные (с т.зр. чувствительнеети АБВ-теста, количества получаемой биомассы и удобства работы) условия культивирования стафилококка: в течение 5-7 ч на скошенной агаризованной среде Хоттингера, а затеи в течение 15-17 ч на тої* хе среде в чашках Петря при 37°С. б) Способы хранения суспензии стафилококка. Установлено, что свежеприготовленный стафилококк теряет способность связывать сывороточные иммуноглобулины и необратимо агрегирует в течение 2-3 суток при хранении при +4°С, Зормалшшз^-рованный стафилококк (0,5 % формальдегидом 2 ч при комнатной температуре^ сохраняет специфическую активность кэ более 7-8 суток. Добавление консервантов {0,01 % мертиолат или 0,02 % азид натрия} ■не предотвращает падения активности а агрегадии стафилококка»

Хранение суспензии при -20°С о различными криопротекторами приводет к необратимой агрегация ст££плоконяа и утрате им специфической активности.

ЛяофилазированныЙ с кркопротектором (10 % сахароза, 0,05 % оэид натрия) стафилококк сохранял способность специфически связывать оыьороточнае галмуноглобулкш в течение 10 месяцев (срок наблюдения) хранения запаянных под вакууглоа ампул при +4°С. Поэтому в дальнейшей работе был использован сзелегрлготовлешщй ила ллофялкзарозан-ныЭ отафалококк.

в) Оптимальные условия сенсибилизации стафилококка.

Обнаружено, что применение цельной АС для сенспбглпэадии стафилококка невоз:.оаяо вгоду незпецифической (т.е. происходящей в отсутствие вируса) агглитинацяи, появляющейся ари смеїаівании этих компонентов, и вяеніяє неотлп'пко:! от специфической агглютинации. Явление неспецифической агглютинации устраняли разведением АС. Для каждой новой вартий АС разведение веобходіїїго подбирать экспериментально, но, как дрезяло, для устранек;ш несаецифпческои агглгатина-цяи АС необходимо раз во деть буфером в со-..ті: оденил І:І00-І;2С0. Для сенсибилизация ста.£«іл«кокка ;.:оадо использовать также гагліаглобулино-вую фракцию» АС или специфические антитела. Как следует из данных, приведенных в таблице І, сенсибплизаоїіЯ стафилококка специфическими антителами позволяет погноить чувствительность АБВ-теста в 100 раз.

Таблица I

Чувствительность определения ВТО я ОВ-З в АБВ-тесте при сенсибилизации стаф:шококх:а разведенкой АС, фракцией иммуноглобулинов иди специфическими .л ти телами к вирусам

Антиген - Чувствительность. мкг/г.-л

вирус АС Фракция ймг,г,■■но глобулинов Специфические антитела

вга 0,?, 0,2 0,002

ов-з 0,2 0,2 0,002

Пр;ц;ечалие; рабочее разведенке АС 1:100; концентрация иммуноглобулинов I мг/ыл, эабочге разведение 1:50; концентрация антител 0,1 ыг/ул, рабочее разведение 1:10.

Сенсибилизация стафилококка фракцией иммуноглобулинов яе повышает чувствительности АБВ-теста, видимо, потому, что из всех белков сыворотки только иммуноглобулины способны связкватьоя о ПрА. Т.о., удаляя при фракционировании АС другие белки, которые не взаимодействуют со стафилококком, мы не способствуем насыщению поверхности стафилококка специфическими антителами я, следовательно, не повышаем чувствительность АБВ-теста. Устранение неспецифических иммуноглобулинов, не обладающих активностью противовирусных антител, достигается при использовании фракция специфических антител. Однако, поскольку ввделенае чиеткх антител в больших количествах - достаточно трудоемкая процедура, в практической работе ми использовали АС в минимальном рабочем разведении, не вызывающи неспецафической агглютинации стафилококка,

Чувствительность определения вгрусов зависит также от соотношения стафилококка и АС в икмунадиагностикуме. Из графика зависимости, изображенной на рис. 2, следует, что чувствительность реакции тем выше, чем с большим объемом АС скесивают стафилококк. Практическое использование этого способа довышения чувствительности ограничено тем,-что АС, добавленная к стафилококку в соотношении большем, чем указано на рис. 2, вызывает ебнчно неспецифкческуз) агглютинацию стафилококка. Как правило, при приготовления ищунодгагноетякука АС и стафилококк смешивали поэтому в соотношении 10:1 — 5:1*

Чувствительность АБВ-теста зависит от титра АС (таблица 2). Использование.в АБВ-тесте диагностических енвороток с титром ниже,чем нежелательно, поскольку при дальнейшем падения титра происходит не только снижение чувствительности реакции, но и увеличен;'е прозоны (т.е. ингибирование реакции избытком антигене вируса), что неприемлемо при определении вирусов растений, накалллвашдася а соке 'в значительных концентрациях. Вместе с тем,данные ?абл.щы 2 чоэ-з'оляют сделать вывод о возможности использования » АБЗ-тесте АС со

Выявляемая предельная

Рлс. 2. Зазпс^ссть чувствительности определения 2ТМ в

АЕВ-тесте от соотио^гн;:я стафилококка и АС к ВТМ в им.-лунодиагн о стикуке.

сравнительно низким титром {нияе 1:128),

Табл"ла 2

ЗаЕаск.-.ость чувстзательности определения ВТМ от титра АС

Тзтр АС ^УБОТВИТ ЗЛЬНОСТЬ АБВ-теста, мкг/мл

0,2 0.5 1.0 . 5.0 50 500

1:4 - - ++ ■¥ —

1:8 - + +++ + -

1:32 + + ■+++ ■м-м- +++ +

1:64 + ++ ++++ +44+ 4++

1:128 + ++ ++-Г. ++++ ++++ +++

Примечание .* тс.тр АС определен методов двоено? игг.'унодиЗфузия;

Количество "+■" характеризует четкость аггдаги нации: '++++" - крушше, бистро формиоуюс'.еся агрегаты» +ч— мелкиз, медленно Формируаадеся агрегаты, - отсутствие видимой реакции

г) Постановка АБВ-теста.

Надунодиагностркум готовили непосредственно перед употреблением,

смешивая 10 % суспензию стафилококка в забуференном физрастворе (0,14 ИЛ&С1, 0,003 Ц фосфатный буфер, рН 7,2-7,4) а АС в рабочем разведепил. Кашш иммунодяагностикума леремесивали на стеклянной пластинке с каплей сока растения ила вирусного препарата, Реакцая появляется обычно в течение 1-2 мин и сопровождается образованием хлопьев агрегированного стз^шококка, хорошо будимых невооруженным глазом. Величина хлопьев укезалгается, а врем их формирования увеличивается при уменьшения концентрации вируса в пробе, поэтому для получения более четкой реакреи, а иногда и для достижения большей чувствительности смесь можно инкубировать в течечхе 10-20 мин во влад-ной камере при комнатной температуре. Аналогичного, хотя и менее выраженного эффекта можно добиться, сс.еиивал с куплей аммунодиагасоти-кума не I, а ¿-3 капли антигена» 3, Характеристика АБЗ-теста.

Причиной реакции агглютинации, со-видклотду, является образование еззававдпх "мостиков" из антигена между агрегируюцамя частицами * {рис л) . ПрИ электронноь-лкроскошческом изучении CTpjK^ypLi вибробактериальных комплексов "мостика" из вирионов фитовируссв практически не вшйлялясь. Обычно набдадала то,чысо специфическую сорбцию вирусных частиц на поверхности бактериальных tлеток. Можно, однако, пред-полоаить, что на фоне агрегатов стафилококка вирусные сшивки просто не видны,

' Основные свойства реакции вироб актерлальней агглютинации были определена с несколькими вирусными препаратами.

Чувствительность. При сенсибилизация стафилококка АС чувствительность АБВ-теста позволяет определить 0,2-0,5 гясг/мл вируса. Чув-.с тви тельное ть и внешний вид реакции виробалтериальной агглгтинации не зависят от формы вирусной частица и одинаковы для палочковидных (ВТМ, ОБ-Э, ВСШ) .нитевидных (ХВК, УШ, вирус карликовой мозаяки кукурузы) а сферических (ШК, ЖГ) вирусов (таблигл 3),

Таблица З

Чувствительность определения фитовкрусов в реакции виробактериальной агглютинации

Вирус Размер варионов, км Титр АС Рабочее р ведение А ■аз- Чувствительность С метода, мкг/мл

■ НЕМ 300x18 1:64 1:100 0,2

ОВ-3 300x1В 1:128 1:100 0,2

БНІ.ІЯ 110-150x20 1:123 1:100 0,5

ХВК 520x13 1:256 1:100 0,2

УВК 760x11 1:128 1:200 0,5

вида 750 1:200 0,2

ВЖ 25 1:64 1:100* 0,5

вкг 30 1:256 1:200 0,2

Примечание; титр АС к сферическим и палочковидным вирусам определяли методом двой!ой иммунодиф'йузда, к нитевидные: вирусам - в кпкрояреципатация.

Сок здорового растения, как было установлено в специальных експериментах, не влияет на чувствительность реакции.

Скорость оеакиаи. Время реакции вяробахтерг.альной агглютинации -обычно не превышает 1-2 млн. ' ■

Расход и титр АС. АБВ-тест экономичен в отношении специфических АСі I мл АС достаточно для выполнения в среднем 2500 анализов.

То обстоятельство, что в АВВ-теста ээзмокао использование АС со сравнительно низким титром, связано, видимо, с концентрированием антител на ПрА в их упорядоченной ориентацией относительно поверхности стафилококка, поскольку ПрА акцептирует Го -фрагмент молекулы антител, и йнтиген-связызавдпе центры ориентированы при этом наружу, Аналогичный эффект обнаружен в латекс-тесте при использовании частиц латекса, покрытых ПрА (г,а,., 1579; Тоггепсе , 1980).

Специфичность. Постановкой контрольных реакций показано, что агглютикеции не наблвдается при смешивании любого из исследованных Kav.ii вирусов с нес енсибилизі> ро ванным стафилококком или со стафилококком, сенсг^плизированным нормальной кролачьей сывороткой или гетеро- *

логичной АС. Однако в некоторых случаях неодёцифяческая агглютинация может иметь место, Неспецафическая агглютинация наблюдается при использовании для сенсибилизации стафилококка недостаточно разведенной АС. Способностью веспецифически агрегировать стафилококк обладают сока некоторых растений, например, табак-сорта Самоун, ростков клубней картофеля, плодовых тел шампиньонов. Большинство неспецифических реакций с соком устраняли использованием для тестирования осветленного центрифугированием (8000 об/мин, 20 мин) сока.

4. Использование АБВ-теста для диагностики вирусов картофеля. гвоздика и шампиньонов. а) Диагностика М и У-вирусов картофеля.

АБВ-тест был использовав для определения мозаичных вирусов картофеля в глазках, в ростках зараженных клубней и в листьях раоте^ий картофеля. Результаты определения вирусов в глазках и ростках зараженных клубней в АББ-тесїе представленії в таблице 4.

Таблица 4

Диагностика мозаичных вирусов картофеля в экстрактах из глазков и ростков зараженных клубней (АБВ-тест)

Антисыворотка к вяртсу Предельное разведение экстрактов аз глазков, зараженных; ез ростков, зараяенніас:. ХЕК SHK МВК УНЕС XBK+SBK ХВЙ SEK ¿ЗК+УШ ЗЯоровый клубень

ХМ 4-8 - - 64' . 32 - *- ■ -

SEK - 4-16 - 32-64 - '32-64 64 -

мвк - - 8-16 _ . - - - - ■ -

УБК - - Т—4 - • - 32 • -

Примечание: ,-п - отсутствие реакции.

Dpa диагностике мозаичных вирусов картофеля в листьях эффективность АБВ-теста сравнивали с диагностическими возможностями КЭД и ACtЛ, обычно используемых в повседневной работе. С этой целью определяли предельное разведение экотрактов.из листьев зараяенвих растений, при котором найлвдалась положительная реакция в КМД, АОІ и в АБВ-теоте.

Результаты сравнения трех методов при диагностике X, -С, -/, и

У-вяруоов картофеля на разних стадиях развития растений представлены в таблице 5. Концентрация вирусов в растениях одного сорта и находящихся на одной стадии развития, варьировала от растения к растению, поэтому в таблице 5 представлены среднеарифметические величины обратных предельных разведения.

Наши исследования показали, что АБВ-тест обладает заметными преимуществами перед КМД и АСМ;

I) АБВ-тест в 2-4 раза чувствительнее АСЫ и в 4-10 раз чувствительнее KLU. Более вусокая чувствительность АЕВ-теста дает возмотаю-сть более надежной индикации вирусов (таблицы 6, 7). В частности, во .многих растениях, признанных безвирусными при анализе ЗДД к АШ, АБВ-тест позволил обнаружить вирус. Следует отмотать, что сравнение АСМ и АБВ-теста было проведено при индексация клубневого материала (т.е.в листьях растений^выращенных из глазков), а КЭД и АЕВ-тесу ■.

сравнивали при диагностике вирусов в полевых растениях на стадии буто-tj яизации - начала цветения, т.е. в период максимальной концентрации вирусов в растении. Видимо, этим и объяснятся сравнительно небольшие отличия в результатах диагностики, выполненной КГ.Щ и АБВ-тестом.

Большая чувствительность АБВ-теста позволяет, в принципе, рас* 1 •

ширить период комплексной индикации мозаичных вирусов вплоть до конца цветения, а, о другой оторокы, за ,ечет ранних стадий развития

4 * *

раотений - в глазках или ростках, т.е. до посадки. Т.о., открывается возможность непосредственной проверки клубневого материала, Сле-

с • •

дует подчеркнуть, что для проверки в КМД и АШ клубни (точнее, глазка о окружающей мякоть») необходимо проращивать до образования листьев.

Возможность' использования в АБЗ-тесте полиспецифических сьгео-V'otok % иозакчным вирусам картофеля значительно сокращает количество необходима анализов я облегчает комплексную проверку исходного материала в семеноводстве. Необходимо отметить,'что при сенсибилиза-

Таблица 5

Сравнение чувствительности методов диагностики Х,<5", М, У-вирусов картофеля в разные фазы-развития растений (средняя величина обратит предельных разведений сока).

Выявляемый Сорт Всходы Бутонизация - начало цветения Конек цзгтения

вирус - КГ® лея АБВ т АСЫ АБВ тш АШ АБВ

Ш. Сотка 8 35 70 25 58 230 32 32 . 64

іюбимец 53 ІОІ 439 73 - 155 585 32 40 104

6ВХ " Детскосельскай 6 10 ■29 II 8 56 16 8 32

Фалг. 8 12 48 32 32 40 12 16 48

ДОЫОДвДОБСКИЙ II 35 35 18 ■ 34 230 8 II 21

Ласточка 6 8 24 - ■ _ *> 8 8 16

Ш Сотка 32 32 123 К 16" 16 8 16 32 ■

Лорх 32 64 128 24 24 96 16 16 32

Яра . 24 32 128 32 32 % 8 16 64

Домодедовский 27 © 213 7 24 64 8 12 40

Заречный \ 32 43 213 8 27 75 8 16 37

Ш Дружный 8 28 114 6 8 30 2 4 5

^ не определяли.

Таблица 6

Сравнение КЗД и АБЗ-теста при определении зараженности картофеля К, S, М и У-вирусамд

Метод _количество растений

диагностики проанализированных, зараженных {%) безвярусных (%)

_. ит _ХВК -SBK ГЯВК УВЖ

.ВДД 105 42,8 38,1 41,9 2,8 16,2 АБВ-тест 105_56,2' S5.2 6?,5 12,4 3,8

> Таблица 7

Сравнение,АСМ я АБВ-теста при индексации клубневого материала

Метод _Количество растений

диагностики проанализированных, зараженных (.%) без вирусных (%) ____шт. ХВК аш ШЭД Ш

АСЯЛ 852 3,4 11,0 26,5 8,1 59,8

АБВ-тест 852 5,4 32,1 69,0 9,8 28,6

ции стафилококка иолислецифическида сыворотками X,*?, Ми У-вирусы выявляли в концентрациях вдвое больших, чем при использовании моновалентных гомологичных АС (таблица 8), Причиной снижения чувствительности является, вероятно, то, что рабочее разведение полисяеци-фических АС было вдвое выше, чем ыоноэалентных АС,

Таблица 8

Чувствительность определения Х,<5» М и У-вирусов картофеля при использовании в АВВ-тесте полиспецифччее ких АС (обратные величины предельных .разведения сока)

Выявляемый Иоточник _Антиснворот/а к вирусам_'

вйруо ХГ^У Х+^М Коноспецкфическая

гомологичная

. ХВК Любимец 256 256 512

5ВК Домодедовский 128 64 256

UBK Заречный 16 16 32

УЖ Дружный_32 - 32

2) Реакция вяробадиераалъной агглютинации сопровождается об-рзэопагсиаы значительно более массивного, чем в КЩ я АСЫ, агглюти-жатп, что заметно облегчает 'р&сп?звараЕие больна*, растений и способ-

ствуег более достоверной диагностике вирусов.

3) Использование АБВ-теста позволяет економить АС, поскольку их расход в АБВ-тесте в 50-100 раз меньше, чем в КЭД и АСМ.

4) Реакция виробактериальной агглютинации при диагностике ХВК а МВК в соке растения завершается обычно в течение 2-3 мин, при диагностике SBX и УЖ она занимает не более 10 мин. Т.о., АБВ-теот позволяет ускорять анализ, поскольку КЛД требует не менее 30 мин, а

в АСМ реакция учитывает не ранее, чем через 3 ч после ее постановки. .

5) При адаптации к поточной серологической линия (НПО "Агрояри-бор") АБВ-тест, за счет большей скорости реакции, оказывается производительнее КЭД и ACSJ, позволяя за X ч проанализировать еокіі около 200-250 растений. '

6) Диагностика вируса крапчатоети гвоздики.■

Сравнивали эффективность выявления больных растений АБВ-тестом, методом иммуно ферментного анализа (EL ISA), выполненного сотрудницей каф. вирусологии МГУ А .Г.Одинец, и иммунодйффузиошшми тестами; радиальной и двойной яммуноди&йуэяи (РИД я РДЕ), выполненных сотруд-' ником каф. вирус о логаи МГУ А.В.Кулиничем. Результаты сравнения пред-, ставлены в таблице 9. '

Таблица 9

Чувствительность методов иммунодиагностики ВЕС

Метод диагностики Количество анализов Среднее количество положительных реакций, %

АБВ-теот 1404 €7

ELISA 1078 69

РИД 1324 47

ад 288 22 ^

Из приведенных в таблице 9 данных следует, что чувствительность АБВ-теста и ELISA оказалась одинакова. Оба метода выявляли одинаковое количество зараженных растений; более показательно, что сди-

наковыми били и дределыше разведения экстрактов чз листьев гвоздики (1:128-1:1024), вызывающе положительную реакцию в Е1Л5Ди в АБВ-теста. Следует подчеркнуть, что АБЗ-тест оказался значительно чувствительнее имцунодя$фузконн1сс тестов, в) Диагностика вирусов шампиньонов.

Вирусы шампиньонов определяли в экотрактат аз мицелия, выращенного в культуре, и в экстрактах из шгодогшс тел. Гезультаты опреде-

I

ления вирусов шампиньонов в йшцелиа предотаглены в таблице 10.

Таблица 10

Диагностика вирусов шампиньонов в мицелии

' Сорт__Метод. диагност яки

гриб и Электронная РИД АКВ-тест

микроскопия с та1 Hf млококк,сеясиоллизкрованный [С АС

Бролянг + - + , +

КД-2 + — + + +

273 + + -

ГДР-2 + - - - +

Д-2Э/2 _ - -

Примечание: X) - наличие реакции, - отсутствие реакции; 2 ) ИКС - нормальная кроличья сыворотка;

Как видно из таблицы iO, результаты диагностики в АБЗ-тесте и

в ьаетоде электронной микроскопии совпадали. АЕВ-тест чувствительнее

икмуноди|фуэионных тестов. Кроме того, формирование отчетливых ли-

t

ний преципитация в РДЦ занимало 2-4 суток, а в АБВ-тесте реакция завершалась за 1-5 шт.. Однако при индикации вирусов в мицелии сортов Бролинг я КД-2 в АБВ-тесте наблюдалась неспецифическая агглютинация яммунодиагностикума экстрактом »шцелия. Сок плодовых тал также еэспецафическя агглютинировал стафилококк. Неслецифическая агглвта-вчция не устранялась при осветления, прогревания или истощенна сока ста¿¡глоксккои. Поэтому для диагностики вирусов в плодовых телах АБВ-тест аопользовать нецелесообразно.

19 .

закдшеш

Сравнение АБВ-теста с другим методами определения вирусов рао-тений позволяет дать более полную и объективную характеристику разработанного нами метода. Некоторое характеристики различных методов приведены в таблице II, при составлении которой были использованы данные, обобщенные ранее другими авторами (Мзтьюз, 19?3; «Д,

1981). Очевидно, что обладающие высокой чувствительностью метода электронной микроскопия, икмуноэлектронной микроскопии, а также не указанные в таблице методы радионммуноанализа, иммунофдуоресценшш и иммукоэлектрофореза не могут быть использованы для масоовых анализов по причине их низкой производительности г необходимости сложной аппаратуры. Несомненными преимуществами АБВ-теста перед этой группой методов является его простота и высокая производительность, особенно при условии автоматизация АБВ-теста с помощь« поточной серологической линии.

По сравнению с КЗД г иммунодкффузионныма тзетами, наиболее широко используемыми для массовых анализов, АБВ-тест, как следует из. данных таблицы, обладает больней чувствительностью и, следовательно, дает возможность более достоверной диагностики вирусов.

Согласно данным таблицы II, АБЗ-тест уступает по чувствительности латекс-тесту и методу аммуноферментного анализа. Однако следует иметь ввиду, что высокая чувствительность латекс-теста реализуется лишь при высоком титре АС (Маа^, 1970). В АБВ-тесте возможно исполь-' зование АС со сравнительно низким титром, без потери чувствительности теста. Кроме того, поскольку латекс неспецифически сорбирует бедок, для сенсибилизация желательно использовать гашаглобулиновую фракцию АС, Для сенсибилизации стафилококка очистка гакмаглобулшюв не требуется, поскольку ПрА селективно сорбирует иммуноглобулины, пе обладая сродством к другим белкам АС,

Метод вмчуноферментного анализа обладзет более высокой, го срак-

Метод диагностики

.тельное ть.

Время реакции

Электронная микроскопия Иммуноэлектровная микроскопия Тест на инфекционноеть Иммуноферментный анализ Латеко-Аст

Метод флокулляции бентонита АБВ-теот. Мокронрещшй топая Иымунохиффузпя Капел: *ый метод

0,1 с 0,ОГ 0,05 ¿0,01

. 1-3 ч 2-4 ч

0,01-0,1 0,1-0,3

0,2 -0,Е

0,5 1,0 10

несколько дней 2-4 ч 16-60 мин 15-30 мин 1-10 мин 24 ч 24-48 Ч 3C-SC мин

нению о АБВ-тестом, чувствительность», видимо, лишь условии автоматической регистрация результатов анализа. При визуальной оценке чувствительность ELISA, как доказано в на^ей работе, практически не отличается от чувствительности АБВ-теста. Кроме того, следует иметь ввиду возможность значительного повышения чувствительности АБВ-теста прд использовании для сенсибилизации стафилококка специфически! антител, а также то обстоятельство, что использование иммуно-феркентного анализа для массовой иммунодиагноотикя фитовирусов в настоящее время одерживается дефицитом необходимого оборудования я рвактивЬв, ,

Результаты проведенных экспериментов позволяют заключить, что АБВ-feox удовлетворяет эйновщш требованиям, предъявляемым к серологическим реакциям, - быть специфичным, высокочувствительным, воспроизводимым я относительно вроотыы а аовтааоЕке методом (Дяченкс, 1979), который м?хвт быть яодользовая для массовое вммуводиахяоотя-к* бируоо« растений.

В настоящее время АЕВ-те« /*в исао^ауътоя для маосовой. дяаг-иоомкз вирусе кг>ахгчатоотя гвоздики, в кс иоза оц.с.и.Киров& Моск.

обл. в условиях промышленного получения и раэмнохенил оздоровленного посадочного материала ремонтантной гвоздики, что позволяло отказаться от значительно менее производительного биотеота на растениях-«опдхкаторах ДЛЯ выявления ВКГ в кериотемных растениях гвоздики.

Следует также отметить, что в Отделе исходного безвирусного материала и вирусологии НКИКХ налажено производство отафилококка, ио-аояьзуемого в АБВ-тесте для проведения массовых анализов полевых я •гчялачных растений.

вывода

1, Разработан новый ахспреоо-мзтод иммунодиагноотики варуоов растений - реакция Еяробактериальной агглютинации (АБВ-тест), Метод основан на коагглютинацка вирусных чаотиц и клеток золотистого стафилококка, сенсибилизированных через протеин А гомологичной вяруоу антисывороткой,

2, Определены оптимальные условия культивирования стафилококка

на агаразованной среде Хоттивге^а ц способы сенсибилизации отафало-• »

кокка антисывороткой или ее фракциями.

3, Метод позволяет.определять изометрические, палочковидные и ' нитевидные вирусы в соке зараженных растений с чувствительностью 0,2-0,5 мкг/шг. Сенсибилизация стафилококка фракцией специфических антител повышает чувствительность реакции я 100 раз и дает возможность определять ВТО а СЗ-З в концентрации 2 нг/мл,

4, Реакция виробактериаи той агглютивацал развивается в течение-нескольких (1-10)мин после омепшваная иммукодиагностякума с еоком инфицированного растения. АБЗ-тест, т.о., является одним из саэдх быстрих методов иммунодиагностики фитовируоов, что может иметь важное значение при массовых анализах.

5, АБВ-тест отличается экономичностью а отношении специфических антисывороток: I мл аятясыворотки достаточно для выполнения свыше

ш

2500 анализов (оря расходе итуноки агн о с т и кума 0,05 на I «иалла

К ари среднем - 1:32 - 1:256 - тигре диагностической сыворотки). Для того же'количества анализов необходимо 2-2,5 г сырой массы стафилококка.- Возможно длительное хранение лиофглизированного стафилококка при +4°С без потери активности (срок наблюдений 10 месяцев).

6. Методом определения предельных разведений сока зараженных растений показано, что АБВ-тест в 4-10 раз чувствительнее капельного метода и в 2-4 раза чувствительнее аммонийно-сульфатного метода диагностики* при индикация М я У-вярусов картофеля д чувствительнее иимунодифТузионннх тестов при диагностике изометрического вируса кралчатосга гвоздакя.

7. Метод виробактеряальной аггл-зтин&цки дает возможность осущест-Ждят! эффективную диагностику вирусов на ранних стадиях развития растений; 1,2, М и У-вирусы картофеля определятся в АБВ-тесте в глазках и ростках заражениях клубней, вирус краячатости гвоздили в мери-стемных растениях гвоздики, вирусы шампиньонов - в мицелии.

Основное содержание диссертации опубликовано в следусоих работах:

1. Чирков С.Н., Словников A.M., Сургучева H.A., Оловнккова H.H.» Пируэян i.A., Кудднич A.B., Атабеков И.Г. Варобактериалъная агглютинация (АВВ-теот) - ноанй метод имчрюдяагноотгки вирусов сеяьсаохо-вяйствепвлг раотенай, - Докл.ЕАСХНИЛ, I98I,,Jt 7, о.Э-XI.

2. Чирков С.Н., Еарвдев D.A., Герасимова К.Ф.» Атабеков И.Г. Сравнена« трех серологических методов* диагностика Ii a У-вируоов картофеля на равных стадиях развитая растений. - Докл.ВАСЛШД, 1932, * 3,«с. 14-16, /'

- 3* Чярко» СЛ;, Оловнвков A.M., Варицев D.A., Атабеков Л.Г, Диагностика U в У-вируоов картофеля методом виробактериальной аг-

гдлинакм. - С.-Х. Ввод,, Idas, Т.27, К 2, с.292-297.

* к

4, *.С, A S24099 (СССР). Способ определения зараженности растений (0,«.Чирков, А.Ы.Олопяиков, H.A.Сургучева, Н.И.Оловнядова, л.А. Oep/яяч, И.ЛЛтабеко»). - Опубл. в В.И., 1962, * 16,

я *

Л-Л0324 от _3«кдз 37fi* Тираж tfiQ Формат 60x84/Id

ТктїогрАфнв ВА СХНШ) Москва, Б ,Хлр(т>кь0»скив пер, 21