Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Иммунохимическая и молекулярная диагностика вирусных инфекций растений
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология
Автореферат диссертации по теме "Иммунохимическая и молекулярная диагностика вирусных инфекций растений"
Чирков Сергей Николаевич
Иммунохимическая и молекулярная диагностика вирусных инфекций растений
03.00.06 - Вирусология 03.00.23 - Биотехнология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Москва 2009
003471947
Работа выполнена на кафедре вирусологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова и в лаборатории вирусологии Института микробиологии имени С.Н.Виноградского РАН.
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор, академик РАН Атабеков Иосиф Григорьевич
ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:
доктор биологических наук, профессор
Гнутова Раиса Васильевна доктор биологических наук, профессор
Добров Евгений Николаевич доктор биологических наук, профессор, академик РАМН
Егоров Алексей Михайлович
ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт биохимии имени А.Н.Баха РАН
Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.ВЛомоносова по адресу: 119991 Москва ГСП-2, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского, ауд. 536.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В Ломоносова
Защита состоится
июня 2009 года в
часов на заседании совета
Автореферат разослан «_» мая 2009 года.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук
И.А.Крашенинников
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. В России большинство вегетативно размножаемых продовольственных, кормовых, технических и цветочно-декоративных культур хронически заражено вирусами, которые вызывают ощутимые потери урожая и заметно ухудшают качество сельскохозяйственной продукции (Атабеков, 1984). Прогнозируется, что в обозримом будущем роль вирусных заболеваний будет возрастать. Глобализация сельского хозяйства, расширение международного обмена семенным и посадочным материалом способствуют интродукции вирусов в новые регионы. Среди обнаруженных за последнее десятилетие новых (emerging) инфекционных болезней растений почти половина имеет вирусную природу. Непрерывно увеличивается число известных вирусов, а глобальное потепление расширяет ареалы насекомых - переносчиков и способствует увеличению их численности (Thresh, 1982; Шпаар и др., 1986; Boonhara et ai, 2007).
В то же время хорошо известно, что использование свободного от вирусов («безвирусного») посадочного материала позволяет значительно повысить продуктивность сельскохозяйственных культур (Foster & Hadidi, 1998; Waterworth & Hadidi, 1998). Таким образом, для радикального снижения вредоносности вирусных инфекций необходим перевод растениеводства на безвирусную основу.
Производство безвирусного семенного и посадочного материала основано на отборе здоровых растений с целью их последующего размножения. При тотальном заражении сорта растения оздоравливают от вирусов с помощью термотерапии и культуры меристем, однако существующие методы оздоровления не гарантируют избавления от патогена. Поскольку безвирусное растениеводство сосуществует с традиционными технологиями, при размножении оздоровленных растений, ввиду высокого инфекционного фона, не исключено их повторное заражение. Совершенно очевидно, что для отбора здоровых растений, контроля оздоровления, сертификации посадочного материала и постоянного мониторинга вирусного заражения с целью своевременного выявления и ликвидации очагов инфекции, ограничения распространения вирусов и предупреждения эпифитотий необходимо располагать чувствительными методами массовой диагностики вирусных инфекций. Важнейшую роль в предупреждении распространения вирусов играет карантинный контроль продукции растениеводства, особенно импортируемого семенного и посадочного материала. Для предотвращения интродукции вирусов карантинная служба должна располагать быстрыми и чувствительными методами их диагностики. Высокочувствительные методы лабораторной диагностики вирусных инфекций необходимы для обеспечения селекционной и генноинженерной работы по выведению новых сортов, устойчивых к вирусам.. Таким
образом, перспективы безвирусного растениеводства определяются доступностью для сельскохозяйственной практики методов массовой экспресс-диагностики вирусных инфекций. Следует подчеркнуть, что, как показывает весь мировой опыт, затраты на диагностику несоизмеримы с потерями от заражения вирусами и с расходами на искоренение инфекции.
Осознание значимости и масштабов проблемы вирусных инфекций сельскохозяйственных культур и начало работ по оздоровлению, развернувшихся в бывшем СССР в начале 80-х годов, показало, что ключевое звено этой работы - массовая диагностика вирусных инфекций - в нашей стране практически не обеспечено. Было очевидно, что для устойчивого развития безвирусного растениеводства в РФ необходима разработка высокочувствительных, производительных и надежных методов диагностики и средств для их применения с учетом реальных запросов сельскохозяйственной практики, нормативной базы отрасли и современных тенденций в развитии методов массовой диагностики вирусных инфекций растений.
В связи с усилением экономического значения вирусных инфекций, увеличением объема анализов и количества подлежащих определению вирусов постоянно возрастают требования к чувствительности и специфичности методов массовой диагностики, обеспечивающих однозначность получаемых результатов. Первостепенное значение приобретает производительность метода, т.е. возможность выполнять большое количество анализов за короткое время, которая определяется не только скоростью выполнения анализа и подготовительных процедур, но и удобством в работе при массовом применении. В наибольшей мере этим требованиям удовлетворяют методы, основанные на иммуноферментном анализе, полимеразной цепной реакции и дот-гибридизации. Все большее внимание уделяется созданию таких методов анализа, которые позволяют одновременно выявлять все известные или, по крайней мере, наиболее вредоносные вирусы данной культуры в одном образце, что существенно ускоряет и удешевляет процедуру лабораторной диагностики. Наиболее перспективным решением этой задачи представляется развитие чиповой технологии. Наконец, растет потребность в таких средствах диагностики, которые дают возможность проводить анализ самостоятельно, непосредственно в месте нахождения образца, и для применения которых не требуется высокой профессиональной подготовки.
Целью наших исследований являлась разработка высокочувствительных методов массовой экспресс-диагностики вирусных инфекций сельскохозяйственных культур для развития безвирусного растениеводства в РФ.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1) Усовершенствование известных и разработка новых эффективных методов препаративного выделения вирусов важнейших сельскохозяйственных культур с целью получения высокоочищенных вирусных препаратов и моноспецифических кроличьих антисывороток с высоким титром;
2) Разработка методов лабораторной диагностики вирусных инфекций картофеля, плодовых, ягодных, овощных и цветочно-декоративных культур на основе иммуноферментного анализа, полимеразной цепной реакции и дот-гибридизации;
3) Разработка методов внелабораторной диагностики вирусных инфекций на основе реакции агглютинации и иммунохроматографического анализа, а также наборов для иммуноферментного определения основных вирусов картофеля и вируса шарки сливы;
4) Практическое применение разработанных методов и средств диагностики вирусных инфекций для оздоровления, контроля качества и сертификации семенного и посадочного материала картофеля, плодовых, ягодных и цветочных культур, а также для изучения распространенности ряда вирусных инфекций;
5) Изучение возможности индукции у растений устойчивости к вирусным инфекциям с помощью биогенного элиситора (хитозана).
Научная новизна. Для экспрессного определения фитовирусов во внелабораторных условиях разработан новый метод виробакгериальной агглютинации (АБВ-тест), основанный на коагглютинации вирусных частиц и протеин-А-содержащих клеток З.аигеиз, покрытых антителами к вирусу. Совместно с Институтом биохимии им. А.Н.Баха РАН впервые в России разработана технология получения мультимембранных композитов (тест-полосок) для внелабораторной диагностики вирусов растений методом иммунохроматографии, основанного на использовании поликлональных антител к вирусам и частиц коллоидного золота в качестве маркера.
Для экстракции РНК из вирусных частиц и из растений разработан новый метод, основанный на выделении нуклеиновых кислот с помощью водорастворимого нетоксичного хаотропного агента трихлорацетата аммония и их очистке на целлюлозном сорбенте на основе хлопковой ваты. Разработан новый метод лабораторной диагностики вирусов растений, основанный на дот-гибридизации вирусной РНК или продукта ее амплификации с кДНК-зондом, меченным хлордиэтилентриаминоплатиной [диен(Р1)]. Для одновременной диагностики вирусов и вироида картофеля в одном образце разработана ДНК-микроплата (прототип ДНК-чипа), в ячейках которой фиксированы молекулы ДНК, комплементарные РНК вирусов и вироида, гибридизующиеся с тотальной РНК, меченной диен(Р1).
Установлено таксономическое положение вируса мягкой мозаики фасоли как представителя рода Сагтоуггия. Впервые показана возможность создания у растений
устойчивости к заражению различными вирусами и вироидом посредством обработки растений хитозаном.
Практическое значение работы. Разработанные методы и средства диагностики вирусных инфекций были широко использованы в: аккредитованной испытательной лаборатории по вирусным и вироидным болезням в составе ЗАО «НВО Иммунотех» и в экспериментальном тепличном комбинате «Меристемные культуры» (Ставропольский край) для сертификации и контроля качества семенного картофеля, производимого в России и Республике Беларусь; ВНИИ садоводства им. И.В.Мичурина (г. Мичуринск) для получения безвирусного посадочного материала и закладки насаждений плодовых и ягодных культур высших категорий качества; Всероссийском селекционно-технологическом институте садоводства и питомниководства РАСХН (г. Москва) (ВСТИСП) и Никитском ботаническом саду - Национальном научном центре (г. Ялта, АР Крым) для изучения распространенности вирусных заболеваний косточковых культур; агрофирме «Колхоз им. С.М.Кирова» (Московская обл.) и экспериментальном тепличном комбинате «Меристемные культуры» для получения и промышленного размножения оздоровленного посадочного материала различных сортов гвоздики; Всероссийском центре карантина растений для диагностики карантинного вируса шарки сливы.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на XII Всесоюзной конференции по электронной микроскопии (Сумы, 1982), V Всесоюзном симпозиуме по ультраструктуре растений «Ультраструктурная организация растений» (Кишинев, 1983), VIII Всесоюзном совещании «Теория и практика использования иммунитета сельскохозяйственных культур к вирусным болезням» (Вильнюс, 1984), Всесоюзной конференции «Микробиологические и биотехнологические основы интенсификации растениеводства и кормопроизводства» (Алма-Ата, 1990), международных конференциях «Fundamental and Applied Problems in Phytovirology» (Ялта, 1994), «Chitin and Chitosan» (Гдыня, 1994), «Molecular responses of plants to biotic and abiotic stresses» (Хельсинки, 1994), Пятой конференции «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана» (Москва -Щелково, 1999), семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология-2000» (Пущино, 2000), II Международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2000), международной научно-практической конференции «Промышленное производство оздоровленного посадочного материала плодовых, ягодных и цветочно-декоративных культур» (Москва, 2001), Шестой международной конференции «Новые достижения в исследовании хитина и хитозана» (Москва - Щелково, 2001), всероссийском семинаре «Состояние и перспективы развития картофелеводства» (Москва, 2001), II Московском международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва,
2003), Шестой международной конференции Европейского хитинового общества (Познань,
2004), Первой Всероссийской школы-семинара «Современные достижения бионаноскопии» (Москва, 2007), Биотехнологической выставке-ярмарке «РосБиоТех-2007» (Москва, 2007), Международном конгрессе «Картофель. Россия-2007» (Москва, 2007), итоговой конференции «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007 - 2012 годы» (Москва, 2007), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), IX международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Звенигород, 2008), VIII съезде Украинского общества генетиков и селекционеров им. Н.И.Вавилова (Алушта, 2008).
Финансовая поддержка работы. Работа выполнена при поддержке международного проекта «Безвирусное растениеводство», INTAS (грант 96-1683), Федеральной целевой научно-технической программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» (госконтракт 43.050.11.1538), Российского фонда фундаментальных исследований (гранты 02-04-08026 инно, 04-04-08074 офи_а, 06-04-08290 офи), Департамента науки и промышленной политики правительства г. Москвы (госконтракт 8/3-341н-06), Федеральной целевой научно-технической программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2012 годы» (госконтракт 02.512.11.2076).
Личный вклад автора. Основные результаты работы получены лично автором, под его руководством или при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 60 работ, в том числе 23 статьи в отечественных журналах, 7 статей в международных журналах, 6 статей в составе книг и сборников, 2 патента, 1 международная заявка на патент, 20 сообщений (тезисы конференций), 1 методические рекомендации.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, где сформулированы цели и задачи исследования, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, списка цитируемой литературы из 348 наименований и 8 Приложений. Работа изложена на 239 страницах и включает 67 рисунков и 38 таблиц.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
I. Иммунохимическая диагностика вирусных инфекций.
Единственным методом массовой диагностики вирусов растений в бывшем СССР в начале нашей работы был т.н. капельный метод, основанный на преципитации вирусных частиц иммунной сывороткой в жидкой среде (капле). Этот метод применяли для определения вирусов X, S, М и Y картофеля (ХВК, SBK, МВК и YBK) в листьях сильно зараженных растений. Попытки использовать имеющиеся антисыворотки в более чувствительных методах анализа не были успешны ввиду невысокого специфического титра этих антисывороток и наличия в них антител к антигенам здорового растения (Бобкова и др., 1987). Это обстоятельство было обусловлено неэффективностью применяемых методов препаративного выделения вирусов. Низкий выход вирусного препарата и недостаточная степень его очистки не позволяли получать моноспецифические сыворотки для разработки высокочувствительных методов диагностики. Кроме того, к большинству экономически значимых фитопатогенных вирусов антисыворотки в нашей стране вообще не были получены, и, следовательно, иммунохимические методы лабораторной диагностики многих вирусных инфекций не были и не могли быть разработаны. В этой связи, первым этапом нашей работы являлась разработка или усовершенствование методов препаративного выделения ряда вирусов, важных в практическом отношении, с целью получения высокоочищенных вирусных препаратов и моноспецифических кроличьих антисывороток для создания высокочувствительных иммунохимических методов диагностики вирусных инфекций.
Разработка и усовершенствование методов препаративного выделения вирусов
растений и получение моноспецифических антисывороток.
Изолят неповируса кольцевой пятнистости малины (ВКПМ), полученный из Института фитопатологии Академии сельскохозяйственных наук бывшей ГДР (г. Ашерслебен), поддерживали и накапливали в растениях табака Nicotiana clevelandii L. или N. rustica L. Изоляты неповирусов черной кольцевой пятнистости томатов (ВЧКПТ) и мозаики арабиса (BMA), а также латентного садвавируса кольцевой пятнистости земляники (ЛВКПЗ) предоставлены H.Pospieszny (Institute for Plant Protection, Познань, Польша). Неповирусы накапливали в растениях лебеды Chenopodium quinoa Willd., а ЛВКПЗ в растениях огурца Cucumus saiivus L. Дальневосточный изолят некровируса некроза табака (ВНТ), предоставленный Р.В.Гнутовой (Биолого-почвенный институт ДВО РАН, г. Владивосток), накапливали в растениях фасоли Phaseolus vulgaris L. или Ckquinoa. Изолят потивируса А
картофеля Bll (АВК), предоставленный С. Мулетаровой (Центральная опытная станция по селекции и семеноводству картофеля, г. Пловдив, Болгария), размножали в растениях табака N.clevelandii. Изолят потивируса шарки сливы (ВШС) PPV-NAT, штамм D, предоставленный E.Maiss (Univ. Hannover, Германия), поддерживали и накапливали в растениях табака N.benthamiana. Изолят потивируса Y картофеля (YBK), штамм YBK0, предоставлен S.Marillonnet (Icon Genetics GmbH, Галле, Германия). Вирус накапливали в растениях табака N.tabacum с. Самсун. Изолят кармовируса мягкой мозаики фасоли (ВММФ) предоставлен C.I.Gabriel (US Plant Introduction Station, Glenn Dale, MD, США). Вирус поддерживали и накапливали в растениях фасоли Ph. vulgaris. Изоляты тобамовируса табачной мозаики (ВТМ) и потексвируса X картофеля (ХВК) из коллекции каф. вирусологии МГУ имени М.В.Ломоносова размножали, соответственно, в растениях табака N.tabacum и дурмана Datura stramonium L. Кармовирус крапчатости гвоздики (ВКГ) выделяли из листьев растений гвоздики. Экспериментальные растения выращивали в теплице в контролируемых условиях.
Для препаративного выделения вирусов использовали общепринятые процедуры (Hull, 2002), с учетом особенностей каждого вируса. Вместе с тем, был выработан ряд общих приемов для повышения их эффективности. Предварительный отбор материала с максимальным содержанием вируса позволял выделять достаточное его количество из небольших навесок зараженных листьев, что ускоряло и облегчало процедуру выделения. Применение 5% Тритона Х-100 (вместо органических растворителей) при экстракции нитевидных вирусов и их концентрирование путем ультрацентрифугирования на сахарозной подушке (вместо осаждения полиэтиленгликолем) существенно ускоряло процесс выделения и повышало выход вируса. Применение квазиравновесного зонального ультрацентрифугирования в градиенте плотности сульфата цезия для очистки сферических вирусов также ускоряло процесс выделения и способствовало получению вирусных препаратов высокой степени очистки.
В результате разработки и применения эффективных методов препаративного выделения были получены очищенные препараты ВКПМ, ВЧКПТ, BMA, ЛВКПЗ, ВШС и ВММФ. Кроме того, с целью ускорения процедуры получения вирусного препарата и повышения его выхода были модифицированы известные методы препаративного выделения и получены очищенные препараты ВНТ, АВК, YBK, ВКГ, ХВК и ВТМ. Высокие выход и степень очистки перечисленных вирусов и применение эффективных схем иммунизации животных (путем внутрикожных инъекций небольшого количества вируса или сочетанием внутривенной и внутрикожных инъекций) позволили получить моноспецифические кроличьи антисыворотки с высоким титром ко всем перечисленным вирусам.
Определение таксономического положения ВММФ.
Получение очищенного вирусного препарата открывает возможность изучения свойств вирусной частицы и ее отдельных компонентов. Именно эта работа представлялась весьма актуальной в отношении ВММФ, так как белковый компонент, структура и механизм экспрессии генома этого вируса не были изучены, в связи с чем его таксономическое положение выглядело неопределенным (\Vaterworth, 1981).
При электронномикроскопическом исследовании вирусного препарата на поверхности вириона можно было обнаружить оси симметрии 3-го (Рис. 1а) и 5-го (Рис.1Ь) порядков. Спайки осей пятого порядка, образующие вершины икосаэдра, выступали над поверхностью вириона на 2 - 3 нм. Изучение негативно окрашенных пустых вирусных частиц показало, что толщина белкового капсида ВММФ составляет около 3 нм.
Рис. 1. Электронная микрофотография препарата ВММФ. Негативное окрашивание 2% фосфовольфрамовой кислотой. Увеличение 260000 х.
Методами электрофореза в полиакриламидном геле и иммуноблота с использованием антисывороток к очищенному препарату вируса и к белку оболочки установлено, что основной белок оболочки вируса имеет мол. м. 40 кДа (Рис. 2). Кроме того, на перегруженных полиакриламидных гелях выявлялись еще 2 минорные зоны с мол. м. 80 и 120 кДа. Антисыворотки к интактному вирусу и к основному белку оболочки ВММФ окрашивали все три белковых зоны. Таким образом, белковые зоны с мол. м. 80 и 120 кДа являются, по всей вероятности, олигомерами белка оболочки, частично ковалентно связанными в составе вирусной частицы.
Рис. 2. Электрофорез и иммуноблот препарата ВММФ.
Белки были окрашены в геле Кумасси (1, 2) или перенесены на нитроцеллюлозную мембрану и окрашены антисывороткой к белку оболочки ВММФ (3) или нормальной кроличьей сывороткой (4). Слева -мол. масса белков-маркеров.
Анализ препарата РНК, выделенной из вирусных частиц, показал, что она практически не связывается с олиго-<1Т-целлюлозой и, следовательно, не содержит поли(А)-последовательности. При ультрацентрифугировании в градиенте концентрации сахарозы вирионная РНК седиментировала двумя зонами с пиками во фракциях 25 и 33 (Рис. ЗА). Анализ этих фракций методом электрофореза (рис. ЗБ) показал, что содержимое фракции 33 представляет собой, по всей вероятности, полноразмерную геномную РНК ВММФ длиной около 4200 нуклеотидов. Более легкий пик состоит из молекул меньшего размера длиной 1000 - 2000 нуклеотидов.
А Б В
Рис. 3. А: Анализ РНК ВММФ ультрацентрифугированием в градиенте концентрации сахарозы (10-40%). Б: Анализ РНК ВММФ электрофорезом в 1% неденатурирующем агарозном геле. 1 -
суммарная вирионная РНК; 2 - фракция 25 градиента; 3 - фракция 33 сахарозного градиента; маркеры: РНК ХВК (6500 нт) и РНК ВМК (3234, 2865, 2114 и 876 нт). В: Анализ полипептидов, синтезируемых в бесклеточной белок-синтезирующей системе на матрицах отдельных фракций РНК ВММФ из сахарозного градиента, методом электрофореза в полиакриламидном геле.
Цифры под рисунком показывают номера фракций сахарозного градиента. С - контроль без РНК. Слева - мол. масса белков-маркеров.
В бесклеточной белок-синтезирующей системе из клеток асцитной карциномы Кребс-2 и лизата ретикулоцитов кролика суммарная РНК ВММФ направляла синтез 3 полипептидов с мол. м. 27, 40 и 79 кДа, а аналог кэпа гп7ООР подавлял трансляцию. При трансляции отдельных фракций РНК ВММФ, извлеченных из сахарозного градиента, обнаружено, что синтез р79 направляется полногеномной РНК ВММФ (фракции 33 - 37) (Рис. ЗВ). Возможность синтеза р27 с матриц тяжелых фракций РНК свидетельствует в пользу предположения о его трансляции также с полногеномной РНК. Синтез полипептида р40 (белка оболочки) направляется преимущественно более легкими фракциями (25 - 29),
представляющими собой, вероятно, набор субгеномных РНК. Кроме того, легкие фракции (23 -31) направляли синтез еще двух полипептидов с мол. массой 7 и В кДа (не показаны).
Полученные результаты полностью соответствовали известным данным о структуре и механизме экспрессии генома кармовируса крапчатости гвоздики (ВКГ), а также о составе белковых продуктов, синтезируемых при трансляции вирионной РНК ВКГ in vitro (Morris & Carrington, 1978), что позволило нам отнести ВММФ к представителям рода Carmovirus.
Разработка тест-систем для иммуиоферментного определения вирусов растений.
Метод ИФА, в силу его очевидных достоинств (высокая чувствительность, возможность одновременного анализа большого количества образцов за короткое время, удобство в использовании), с момента возникновения занял ведущее место среди методов диагностики вирусных инфекций растений (Clark & Adams, 1977). Поэтому нашей целью была разработка сэндвич-варианта метода твердофазного ИФА в его планшетном формате для массовой экспресс-диагностики ряда вирусных инфекций картофеля, плодовых, ягодных и цветочно-декоративных культур.
В данной работе использовали очищенные нами препараты вирусов, а также вирусов S (SBK), М (МВК) и скручивания листьев картофеля (BCJ1K), которые были предоставлены В.К.Новиковым. Им же были получены и предоставлены кроличьи антисыворотки к этим вирусам и к YBK. Фракцию IgG получали ионообменной хроматографией антисывороток на ДЭАЭ-целлюлозе, уравновешенной 0,01 М натрий-фосфатным буфером pH 8,0. Конъюгаты IgG с пероксидазой хрена («Serva») получали периодатным методом (Nakane & Kawaoi, 1974), а конъюгаты IgG со щелочной фосфатазой («Sigma») и неорганической пирофосфатазой (НПФ) Е. coli («Labmaster», Турку, Финляндия) - с помощью глутарового альдегида (Кэтти и Райкундалиа, 1991; Baykov et al., 1988; Mizenina etal., 1991).
Для диагностики ВШС была разработана тест-система ИФА на основе НПФ. Сообразно названию фермента, этот вариант анализа получил название «Пиротест-ИФА». Как известно, НПФ расщепляет молекулу субстрата (неорганического пирофосфата) на ионы ортофосфата, которые при добавлении стоп-реагента (раствора молибдата аммония и малахитового зеленого в кислой среде) окрашиваются в яркий зелено-синий цвет. В отсутствие ионов фосфата окраска стоп-реагента не изменяется и остается желтой. Важная особенность этого варианта ИФА заключается в том, что окраска (и оптическая плотность (ОП), измеряемая при длине волны 620 нм) отрицательных контролей остается неизменной в течение продолжительного времени (до 2 - 3 ч). Поскольку ОП в зараженных образцах за это время
возрастает, удлинение времени инкубации планшетов после внесения стоп-реагента может быть использовано для повышения чувствительности анализа.
г 1.2
z
1,6
2
Рис. 4. Калибровочные кривые для определения ВШС.
Аб2о определяли через 10 мин (—▲—) и через 60 мин (— о—) после добавления стоп-реагента. Препарат вируса разводили до указанной концентрации экстрагирующим буфером. Значения А«о в отрицательном контроле (осветленный экстракт из здоровых листьев косточковых культур) составляли 0,03 и 0,035 через 10 и 60 мин, соответственно, и на рисунке не показаны.
о
< 0,8
Типичные калибровочные кривые, приведенные на рис. 4, показывают, что чувствительность определения ВШС с помощью Пиротест-ИФА составляет, при оценке результатов через 10 мин, 4-8 нг/мл, а при оценке через 60 мин 2-4 нг/мл. Крутизна кривой титрования и низкий уровень сигнала в
0,4
О
о,
,1 1 10 100 1000 Концентрация ВШС, нг/мл
отрицательном контроле обеспечивают такие различия
в ОП между вируссодержащим образцом и отрицательным контролем, которые позволяют достоверно различать положительный и отрицательный результаты анализа даже при низкой концентрации вируса. Значения ОП в отрицательных контролях и незараженных образцах не возрастали по сравнению с 10-минутной инкубацией, в то время как при положительной реакции ОП увеличивалась в 1,5 - 2 раза. Кроме того, следует отметить, что при величине ОП в положительном образце > 0,15, чувствительность выявления ВШС оказалась практически одинакова при визуальной и фотометрической оценке результатов. Это обстоятельство позволяет использовать Пиротест-ИФА в отсутствие специального фотометрического устройства («ридера») или соответствующего светофильтра для считывания результатов ИФА без ущерба для чувствительности анализа.
Важнейшим показателем качества разработанных диагностических тест-систем являются результаты их применения для анализа практического материала при сравнении с лучшими импортными аналогами, т.е. с диагностическими тест-системами фирм, продукция которых имеет давнюю и устойчивую репутацию на мировом рынке.
С этой целью мы сравнивали диагностические возможности Пиротест-ИФА и тест-системы фирмы «Bio-Rad» (TAS-ELISA kit, Bio-Rad Phyto-Diagnostics, Франция), в которой в качестве ферментной метки используется щелочная фосфатаза, при определении ВШС в образцах различных косточковых культур из тепличной коллекции ВСТИСП. В другой работе сравнивали Пиротест-ИФА и тест-систему фирмы «Agdia» (DAS-ELISA kit, Cat No
SRA 31505), в которой также используется щелочная фосфатаза, при анализе ВШС в образцах косточковых культур из коллекции Никитского ботанического сада, поддерживаемой на Южном берегу Крыма в открытом грунте. Импортные тест-системы применяли в полном соответствии с инструкциями, используя, в частности, фирменный экстрагирующий буфер, входящий в состав набора. Результаты испытаний показали одинаковую достоверность выявления зараженных растений с помощью Пиротест-ИФА и двух импортных тест-систем. Таким образом, тест-система Пиротест-ИФА, разработанная для диагностики ВШС, по аналитическим характеристикам не уступала лучшим мировым аналогам и позволяла достоверно выявлять вирус в образцах листьев различных косточковых культур.
Тест-системы Пиротест-ИФА были разработаны также для диагностики ХВК, SBK, МВК, YBK, АВК и BCJIK. Согласно действующему стандарту РФ, процедура сертификации предусматривает обязательную проверку зараженности семян картофеля этими вирусами с помощью ИФА. Типичные калибровочные кривые (рис. 5А) показывают, что тест-системы позволяют определять вирусы картофеля в концентрации несколько нанограмм в 1 мл. Поскольку эти вирусы, включая BCJIK, обычно накапливаются в зараженных растениях картофеля в большей концентрации, достигнутая чувствительность должна была обеспечить их надежное выявление в зараженных растениях. Лабораторные испытания тест-систем проводили при анализе пробирочных растений картофеля из коллекции ВНИИ картофельного хозяйства им. А.ГЛорха РАСХН и при практической работе по сертификации семенного картофеля. Результаты испытаний показали, что разработанные тест-системы позволяют выявлять все шесть вирусов в различных категориях семенного материала и пригодны для практического применения на всех стадиях производства безвирусного картофеля.
Для диагностики ВКПМ, BMA, ВЧКПТ и ЛВКПЗ разработаны тест-системы ИФА с использованием в качестве ферментной метки пероксидазы хрена, щелочной фосфатазы и НПФ. Все тест-системы позволяли выявлять неповирусы в концентрации несколько нанограмм в 1 мл экстрагирующего буфера. Самая высокая чувствительность (1 нг/мл) была достигнута при диагностике ЛВКПЗ, что, по-видимому, было обусловлено высоким титром полученной антисыворотки. Достигнутые аналитические характеристики позволяли с высокой достоверностью выявлять неповирусы в экстрактах из листьев различных ягодных культур.
Для диагностики ВНТ, ВММФ, ВТМ и ВКГ были разработаны тест-системы ИФА на основе пероксидазы хрена. Чувствительность определения вирусов с помощью этих тест-систем показана на рис. 5Б.
нс. 5A. Калибровочные кривые для определения вирусов X (—о—), М (—о—), Y (—о—), S (—•—), (—А—) и BCJIK (—•—), добавленных в осветленный экстракт из здорового растения. А6го
пределяли через 10 мин после добавления стоп-реагента. Значения А62о в отрицательных контролях осветленный экстракт из здоровых листьев картофеля) составляли 0,005 - 0,02 для разных сортов артофеля и на рисунке не показаны.
ис. 5Б. Чувствительность определения очищенных препаратов ВНТ (—■—), ВММФ (—А—), ТМ (—□—) и ВКГ (—О—) в ИФА с пероксидазой в качестве ферментной метки. Время нкубации с субстратом (на основе 2,2'-Азино-ди(3-этил)бензотиазолин-6-сульфоновой кислоты) 30 ин. Оптическая плотность в отрицательных контролях (экстрактах из здоровых растений фасоли ВНТ и ВММФ), табака с. Самсун (ВТМ) и гвоздики составляла, в среднем, 0,05 единицы и на рисунке е показана.
Таким образом, разработаны тест-системы на основе планшетного сэндвич-варианта ФА для диагностики основных вирусов картофеля (ХВК, SBK, МВК, YBK, АВК, BCJIK), еповирусов (ВКПМ, BMA, ВЧКПТ), а также ЛВКПЗ, ВШС, ВНТ, ВТМ, ВММФ и ВКГ. налитические характеристики тест-систем позволяют определять перечисленные вирусы в онцентрации до 1 нг/мл в очищенном препарате и с высокой специфичностью выявлять араженные растения картофеля, овощных, ягодных, плодовых и цветочных культур.
Разработка и характеристика наборов для иммуноферментного определения вирусов картофеля и вируса шарки сливы.
Высокая эффективность мониторинга вирусных инфекций может быть достигнута олько в том случае, когда методы диагностики доступны для региональных и оизводственных лабораторий и широко применяются в их повседневной практической аботе. Использование наборов, содержащих все необходимое для выполнения анализов,
радикально расширяет сферу, географию и масштабы применения ИФА, существенно облегчает лабораторную диагностику вирусных инфекций в те сжатые сроки, которые обычно отводятся для этой работы, и способствует получению более достовершлх результатов за счет стандартизации процедуры диагностики.
С учетом запросов практического растениеводства в России и сложившегося мирового опыта, нами, совместно с ЗАО «НЕЮ Иммунотех», были разработаны наборы реагентов для ИФА основных вирусов картофеля (ХВК, SBK, МВК, YBK, АВК и ВСЛК), а также ВШС (рис. 6). В этих наборах в качестве ферментной метки использовали НПФ. Решающее значение для выбора именно этого варианта анализа имели высокие чувствительность и специфичность" тест-систем на основе Пиротест-ИФА, стабильность компонентов субстрата и возможность достоверной визуальной оценки результатов анализа.
Каждый набор включает 96-луночный полистироловый планшет, литой или стрипованный, с нанесенными антителами, в вакуумной упаковке и готовый для
использования (на рисунке не показан). Антитела к вирусу сорбируют на планшете заранее таким образом, что их активность после высушивания не снижается и сохраняется в течение всего срока годности наборов (не менее 6 мес). Кроме того, в состав набора входят:^ лиофильно высушенные положительный и отрицательный контроли;
концентрированные буферные растворы для промывания планшета и для экстракции вируса; конъюгат кроличьих" антител к вирусу с НПФ; субстратный буферный раствор; субстрат - пирофосфат натрия; стоп-реагент, готовый для использования; крышка для закрывания планшета или пленка для его заклеивания во время инкубации; инструкция по применению набора. Таким образом, б комплектации набора предусмотрено все необходимое для выполнения анализа. Поскольку после вскрытия вакуумной упаковки в планшеты сразу вносят заранее приготовленные экстракты, анализ с помощью набора 40 - 44 образцов (в дубликатах) занимает один рабочий день. Наборы «Пиротест» были удостоены диплома I степени и медали «Лауреат ВВЦ»! Всероссийского выставочного центра и серебряной медали V Международного салонз промышленной собственности «Архимед-2002».
Методы внелабораториои диагностики вирусных инфекций
В последние годы растет потребность в таких методах диагностики, которые дают возможность проводить анализ самостоятельно, непосредственно на месте нахождения образца, и для применения которых не требуется высокой профессиональной подготовки. Эта тенденция обусловлена тем, что инструментальные методы анализа должным образом могут быть использованы только в хорошо оснащенных центрах и лабораториях. В результате, диагностика вирусных инфекций основной массы возделываемых культур проводится путем визуальной оценки симптомов заболевания. Эффективность маршрутных обследований насаждений с целью отбора проб для лабораторного анализа, фитосанитарного надзора или сертификации может быть значительно повышена при возможности быстрого и достоверного определения вируса непосредственно в полевых условиях. Кроме того, лабораторный анализ занимает несколько суток. Это обстоятельство существенно осложняет работу, например, карантинных служб в тех случаях, когда требуется получить быстрый и однозначный результат анализа.
Таким образом, для эффективного мониторинга вирусных инфекций необходимы быстрые и чувствительные неинструментальные методы анализа, которые могут быть использованы в массовых масштабах в лабораторных и, особенно, во внелабораторных условиях как специалистами, так и лицами без профессиональной подготовки. С этой целью мы разработали новый метод виробактериальной агглютинации (АБВ-тест) и метод иммунохроматографии на тест-полосках.
АБВ-тест
АБВ-тест основан на коагглютинации вирусных частиц и клеток Staphylococcus aureus, покрытых антителами к определяемому вирусу. Антитела сорбируются на бактериальных клетках вследствие сродства Fc-фрагмента молекулы IgG к протеину А - белку клеточной стенки некоторых штаммов стафилококка, локализованному на поверхности бактериальной клетки; антиген-связывающая активность антител остается при этом неизменной. В присутствии антигена клетки бактерий, нагруженные соответствующими антителами, агглютинируют, образуя видимые невооруженным глазом агрегаты (Kronvall, 1973).
Культуру Staphylococcus aureus непатогенного штамма Cowan 1, полученную в Институте эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН, поддерживали и размножали на агаризованной среде Хоттингера. Клеточную массу смывали с поверхности агара, промывали и лиофилизировали. Иммунодиагностикум готовили, смешивая 1 объем
10% суспензии клеток стафилококка в PBS (0,01 М КН2Р04 0,14 М NaCl, рН 7,2 - 7,5) с 5 - 8 объемами антисыворотки в рабочем разведении, приготовленном на PBS. Диагностикум был готов к употреблению непосредственно после смешивания компонентов.
При выполнении АБВ-теста каплю иммунодиагностикума объемом около 50 мкл|" смешивали на стеклянной пластинке с такой же каплей растительного экстракта или вирусного препарата. Агглютинация обычно проявлялась в течение 1 - 2 мин в виде белых, хлопьев агрегированного стафилококка, различимых невооруженным глазом (рис.8). Размер! хлопьев уменьшался, а время их формирования увеличивалось по мере снижения концентрации вируса в образце. При низкой концентрации вируса время оценки реакции -продлевали до 5 - 10 мин.
Рис. 8. Реакция виробактерпальной коагглютинации. А
Образование агрегатов клеток, покрытых антителами к ВКГ, в присутствии вируса, через 2 мин после смешивания иммунодиагностикума с очищенным вирусным препаратом (2 мкг/мл). Б - отрицательный контроль (PBS).
Аналитические характеристики АБВ-теста были определены с использованием очищенных вирусных препаратов и экстрактов из листьев растений, зараженных соответствующим вирусом (табл. 1).
Таблица 1.
Определение вирусов растений в АБВ-тесте
Вирус Рабочее разведение Чувствительность Разведение экстракта,
антисыворотки теста, мкг/мл'' вызывающее агглютинацию2)
ВТМ 1/100 0,1 1/2000
ВЗКМО 1/100 0,1 1/64
ВШМЯ 1/100 0,4 1/32
ХВК 1/100 0,4 1/128
YBK 1/200 0,4 1/32
ВМК 1/100 0,4 1/32
ВКГ 1/200 0,2 1/512
1) предельная концентрация вируса, выявляемая через 1 - 2 мин; 2) предельное разведение осветленного экстракта из листьев растений табака с. Самсун (ВТМ, ВЗКМО), ячменя (ВШМЯ, ВМК), картофеля (ХВК, МВК, УВК) и гвоздики (ВКГ), через 1 - 2 мин. Препараты тобамовируса зеленой крапчатой мозаики огурца (ВЗКМО), гордеивируса штриховатой мозаики ячменя (ВШМЯ) и
бромовируса мозаики костра (ВМК), зараженные ими растения и антисыворотки к этим вирусам были предоставлены В.К.Новиковым.
Поскольку из всех белков сыворотки протеин А селективно связывает только использование аффинно очищенных антител позволяет значительно повысить чувствительность АБВ-теста (табл. 2).
Таблица 2.
Сравнение чувствительности определения вирусов в АБВ-тесте с использованием антисыворотки, ДЭАЭ-очищенных ^С и аффинно очищенных антител
Вирус Чувствительность определения, мкг/мл
Антисыворотка Фракция IgG Аффинные антитела
ВТМ 0,1 0,1 0,002
ВЗКМО 0,1 0,1 0,002
*) Время анализа 2 мин. Рабочее разведение: антисыворотки - 1/100; концентрация ДЭАЭ-очищенных IgG и аффинных антител - 10 мкг/мл.
Испытания АБВ-теста были проведены при диагностике ВКГ, который распространен на ремонтантной гвоздике практически повсеместно. Для его массовой диагностики применяют реакцию радиальной иммунодиффузии в агаровом геле и метод ИФА (Brunt & Martelli, 2008). Мы сравнивали эффективность этих методов и АБВ-теста в условиях промышленного получения и размножения посадочного материала гвоздики, оздоровленного методом апикальной меристемы в меристемной лаборатории агрофирмы «Колхоз им. С.М.Кирова», и обнаружили, что АБВ-тест и ИФА выявляют зараженные растения гвоздики с одинаковой достоверностью.
Таким образом, АБВ-тест может быть использован для экспресс-диагностики вирусных инфекций в практике безвирусного растениеводства. Стабильность диагностикума в течение рабочего дня и возможность определения вирусов в неосветленных экстрактах открывают возможность для внелабораторного применения АБВ-теста, который не требует никакого оборудования, прост в выполнении и может быть использован как специалистами, так и лицами без профессиональной подготовки.
Определение вирусов растений методом иммуиохроматографии.
Одним из наиболее перспективных методов внелабораторного анализа является метод иммуиохроматографии (ИХА) в пористых мембранах (тест-полосках), на которые нанесены антитела и их конъюгаты с окрашенными коллоидными частицами, способные взаимодействовать с вирусом. Этот метод, называемый также «lateral flow device» или «strip test», был разработан для определения гормонов беременности в домашних условиях и
получил широкое распространение для диагностики инфекционных заболеваний, аллергенов, наркотических веществ, токсинов, пестицидов и т.д. (РовЛита-Тгип^е а!., 2009).
Метод ИХА, в его современном и наиболее распространенном формате применительно к диагностике вирусов растений, выглядит следующим образом. Тест-полоска (рис. 9А) представляет собой мультимембранный композит, состоящий из впитывающей мембраны, погружаемой в образец (1); мембраны для нанесения конъюгата антител с частицами коллоидного золота (2); рабочей мембраны (3), на которой в аналитической зоне (4) фиксированы антитела к определяемому вирусу, а в контрольной зоне (5) антитела к кролика (или мыши); другой впитывающей мембраны (6), поддерживающей поток жидкости по полоске. Все мембраны монтируются на пластиковой подложке, обеспечивающей единство конструкции и механическую прочность тест-полоски, и покрыты сверху прозрачной пленкой или заключены в пластиковую кассету.
А Б В Г Д
Рис. 9. Схема конструкции тест-полоски и возможных результатов анализа.
При погружении тест-полоски в экстракт вирус, продвигаясь с фронтом жидкости, связывается с конъюгатом, а затем с антителами, фиксированными в аналитической зоне. Концентрирование связанных с вирусом частиц коллоидного золота приводит к образованию в этом месте окрашенной полосы. Избыток конъюгата улавливается антивидовыми антителами, в результате чего в контрольной зоне тоже образуется окрашенная полоса (рис. 9Б). При отсутствии вируса в экстракте (здоровое растение) окрашенная полоса в аналитической зоне не образуется (рис. 9В). Если окрашенная полоса не образуется в контрольной зоне, тест признается недостоверным независимо от того, образовалась ли полоса в аналитической зоне (рис. 9Г, Д).
Высокая скорость анализа, занимающего всего несколько минут, высокая чувствительность определения вирусов, простота подготовки образцов и процедуры анализа давали основания полагать, что метод ИХА может быть эффективно использован во внелабораторных и полевых условиях. Однако, в России тест-полоски для диагностики!
вирусов растений не производились. Поэтому целью нашей работы, выполненной совместно с лабораторией иммунобиохимии Института биохимии им. А.Н.Баха РАН, было создание иммунохроматографических тест-систем для экспресс-диагностики вирусов растений с использованием в качестве маркера частиц коллоидного золота. В качестве модельных объектов были выбраны вирусы, различающиеся размером и формой вириона: сферические ВКГ и ВММФ, палочковидный ВТМ и три нитевидных вируса (ХВК, YBK и ВШС).
Частицы коллоидного золота (КЗ) диаметром 30 нм получали цитратным методом (Frens, 1973). Получение конъюгатов IgG с КЗ осуществляли по методике Hermanson (1995). Для изготовления тест-полосок использовали наборы mdi Easypack («Advanced Microdevices», .Индия), включающие рабочую мембрану CNPC на ламинате с размером пор 15 мкм, мембрану для конъюгата, впитывающую сепарирующую мембрану для образца, конечную адсорбирующую мембрану и ламинирующую защитную пленку на клейкой основе. Реагенты наносили на мембраны в количестве, при котором обеспечивается максимальная яркость окраски аналитической и контрольной зон и достигается минимальный порог детекции I вируса при отсутствии неспецифического окрашивания аналитической зоны. Для формирования аналитической зоны использовали IgG из антисывороток к соответствующему вирусу, а контрольной зоны - козьи антитела к IgG кролика.
Для проведения ИХА тест-полоску погружали в анализируемую пробу на 1,5 мин в вертикальном положении, а затем извлекали и помещали на горизонтальную поверхность. Результат анализа оценивали визуально через 10 мин. На рис. 10 приведены результаты определения YBK, разведенного до определенной концентрации экстрагирующим буфером или неосветленным экстрактом из листьев здорового растения табака.
2,5 1,28 0,64 0,32 0,16 0,08 2,5 1,28 0,64 0,32 0,16 0,08
Рис. 10. Определение \'ВК в экстрагирующем буфере (А) и в экстракте из листьев табака (Б).
Цифры под рисунком показывают концентрацию вируса (мкг/мл). Время анализа 10 мин.
Эти результаты показывают, что чувствительность определения УВК в буферном растворе и в экстракте составила не менее 80 нг/мл. Таким образом, для достоверного
выявления вируса не требуется осветления экстракта. Это обстоятельство имеет важное значение, поскольку очевидно, что при внелабораторном применении тест-полосок осветление экстракта не всегда возможно.
Чувствительность определения других вирусов, использованных в этой работе, варьировала в интервале от 0,08 до 0,5 мкг/мл в экстрагирующем буфере и в растительном экстракте и зависела главным образом от свойств поликлональных антител к соответствующему вирусу. Метод отличается высокой специфичностью: при анализе здоровых растений или зараженных неродственным вирусом, окрашенная полоса в аналитической зоне не появлялась (рис. 11). Это обстоятельство позволило создать лабораторный образец тест-полосок для одновременного определения трех вирусов - ХВК, УВК и ВТМ, путем формирования 3 аналитических зон на одной полоске. Поскольку время анализа при этом не увеличилось, применение мультиспецифичных тест-полосок способствует повышению производительности процедуры диагностики.
А Б
Рис. 11. Специфичность определения ХВК
(А) и ВТМ (Б). А: экстракт из листьев картофеля (1) и дурмана (2), зараженных ХВК; 3 — из листьев здорового картофеля. Б: 1 - экстракт из листьев табака, зараженного ВТМ; 2 - из здорового табака; 3 - из листьев табака, зараженного УВК. Время анализа - 10 мин.
12 3 12 3
Одной из очевидных проблем, возникающих при внелабораторном применении тест-полосок, является необходимость быстрого получения экстракта, пригодного для анализа методом ИХА. С этой целью были разработаны наборы, включающие, помимо собственно . тест-полоски, герметично упакованной в пакет из алюминевой фольги, также емкость для получения экстракта, содержащую экстрагирующий буфер, и инструкцию по применению тест-полоски.
Таким образом, созданы иммунохроматографические тест-системы для определения фитопатогенных вирусов, позволяющие осуществлять их экспресс-диагностику в лабораторных и внелабораторных условиях с высокой чувствительностью и специфичностью. Предварительное нанесение всех иммунореагентов на мембрану и возможность визуальной детекции окрашенных зон, образующихся в течение нескольких минут после нанесения образца, позволяют проводить анализ без вспомогательного и регистрирующего оборудования непосредственно на месте. Все необходимые манипуляции сводятся к
V _
й I :
* * I
приготовлению экстракта и нанесению образца на полоску. Простота выполнения анализа не требует от пользователя профессиональной подготовки.
II. Молекулярная диагностика вирусных инфекций.
Молекулярные методы анализа основаны на выявлении нуклеиновой кислоты вируса и наиболее востребованы в тех случаях, когда тест-системы на основе ИФА для диагностики данного вируса не разработаны, или для его обнаружения требуется чувствительность значительно более высокая, чем может обеспечить ИФА, или когда фитопатогены в принципе не могут быть выявлены иммунохимическими методами ввиду отсутствия у них белка оболочки. Кроме того, молекулярные методы диагностики очевидным образом более предпочтительны при необходимости одновременного определения зараженности растения не только вирусными, но также грибными, бактериальными, вироидными и фитоплазменными инфекциями.
Разработка нового метода экстракции нуклеиновых кислот из вирусных частиц и
из зараженных растений с помощью трихлорацетата аммония.
Одной из основных трудностей, лимитирующей применение молекулярных методов анализа для массовой диагностики, является необходимость выделения вирусной РНК из зараженного растения. Как известно, обычно для этой цели применяют фенол, гуанидинтиоцианат или смесь фенола с гуанидинтиоцианатом («Тризол»), которые эффективно депротеинизируют РНК и инактивируют рибонуклеазы. Технология ГШеазу («Qiagen»), основанная на применении гуанидинтиоцианата для экстракции РНК и силикагеля для ее выделения, не требует применения фенола и хлороформа и позволяет получить препарат РНК, лишенный примеси ДНК или полисахаридов и пригодный для большинства последующих работ.
Нами разработан метод выделения вирусной РЖ из вирусных частиц и из зараженных растений, основанный на применении нового водорастворимого хаотропного агента трихлорацетата аммония (ТХАА) для депротеинизации РНК и целлюлозного сорбента на основе хлопковой ваты для ее очистки.
Нейтральный раствор ТХАА получали путем растворения сухой трихлоруксусной кислоты в водном растворе аммиаке. На его основе готовили экстрагирующий Буфер 1 (4 М ТХАА, 0,1 М Трис-НС1, 0,025 М ЭДТА, 1,5% Тритон Х-100) и промывающий Буфер 2 (4 М ТХАА, 0,1 М Трис-НС1). Целлюлозный сорбент представлял собой 100 мг хлопковой стерильной хирургической ваты, упакованной в стерильный одноразовый шприц объемом 2
мл. Колонку монтировали в крышке стакана с отводом, присоединенным к водоструйному или механическому насосу. Сорбент промывали Буфером 2, 70% этанолом и подсушивали под негативным давлением. Для выделения РНК из вирусных частиц вирусную суспензию смешивали с Буфером 1, инкубировали 5-10 мин, добавляли изопропанол до конечной концентрации 70% и полученную смесь наслаивали на сорбент. Для выделения тотальной РНК из зараженных растений 200 мг свежих листьев гомогенизировали в 1 мл Буфера 1, инкубировали 10-20 мин и экстракт осветляли центрифугированием на настольном центрифуге. К осветленному экстракту добавляли изопропанол до конечной концентрации 70% и полученную смесь наслаивали на сорбент. Образцы проходили через колонку самотеком со скоростью 30 капель в минуту. После полного впитывания образца колонку промывали 70% изопропанолом и высушивали под негативным давлением. Связанную с сорбентом РНК элюировали MilliQ. Все операции выполняли при комнатной температуре, за исключением стадии элюции РНК, которую выполняли при 4°С.
На примере ХВК и ВТМ показано, что разработанный метод позволяет выделять вирусную РНК с выходом, близким к 100% от теоретического, с соотношением А260/А280 = 2,0-2,1, и лишенную признаков деградации (рис. 12А). Метод также позволяет выделять интактные клеточную и вирусную РНК из клеток зараженных растений (рис. 12Б). Выход тотальной РНК из листовой ткани растений табака и картофеля составлял, в пересчете на 100 мг свежей листовой ткани, 40 - 60 мкг, с соотношением А2бо/А28о = 1,9 - 2,0. Следует отметить минимальную контаминацию препарата РНК клеточной ДНК.
А Б
1 2 12 3 4
Рис. 12. А. РНК ВТМ (1) и РНК ХВК (2), выделенные из очищенных вирусных препаратов. Б. Выделение РНК ВТМ из экстракта листьев табака. 1- РНК ВТМ; 2 - РНК, выделенные из здоровых листьев табака; 3 - из здоровых листьев с подмешанным ВТМ; 4 - из листьев, зараженных ВТМ. РНК получали экстракцией 4 М ТХАА и очищали на целлюлозном сорбенте. Электрофорез в 1% агарозном геле в ТАЕ - буфере («Fermentas»), Окраска бромистым этидием.
Разработанный способ выделения РНК дешев, не требует применения токсичных соединений и позволяет получать РНК высокого качества (А260/А280 = 1,9 - 2,1) при комнатной температуре. Выход РНК из очищенного вирусного препарата достигает 100%, а выход тотальной РНК соответствует обычному для упомянутых методов выделения; при этом препарат РНК содержит значительно меньше ДНК, чем при экстракции фенолом. Процедура получения очищенного препарата РНК из одного образца занимает около 30 мин, причем возможно одновременное выделение РНК из нескольких образцов. Следует также отметить, что в известном способе очистки РНК с помощью целлюлозного сорбента последний готовят путем гомогенизации волокнистой хроматографической бумаги (Эй & Сотеаи, 1999). Этот способ достаточно трудоемок; кроме того, неравномерная структура получаемой суспензии существенно лимитирует скорость потока при хроматографии. В нашей работе мы применили хлопковую вату, которая обладала высокой сорбционной емкостью и обеспечивала необходимую скорость протекания образца по колонке.
Определение вирусов растений с помощью МГА-ИФА-технологии.
Методы, основанные на феномене дот-гибридизации, широко применяются для массовой диагностики вирусов растений в силу их высокой чувствительности и производительности. Разработанный нами метод основан на дот-гибридизации нуклеиновой кислоты вируса, фиксированной на нитроцеллюлозной мембране, с кДНК-зондом, меченным хлордиэтилентриаминоплатиной [(диен)Р1], и последующем выявлении образующихся гетеродуплексов в ИФА с помощью антител к (диен)Р1 (Рис. 13). Поскольку метод включает стадии молекулярно-гибридизационного анализа (МГА) и иммуноферментного анализа (ИФА), он получил название МГА-ИФА-технологии.
Пероксидаза хрена Антитела к (диен) Р1
1
Хемилюминесцентный субстрат
Регистрация эмиссии на рентгеновской пленке
(диен) Р1
образец мембрана
Рис. 13. А. Схема определения вирусов с помощью МГА-ИФА-технологии. Образец: вирусная РНК или ДНК, рекомбинантная плазмида со вставкой вирусной кДНК, вирусная кДНК, полученная и амплифицированная методом ОТ-ПЦР, тотальная клеточная РНК, выделенная из зараженных растений, и т.д. Б. Структурная формула (диен)Р1
Известно, что (диен)Р1 способна ковалентно связываться с N'-атомом гуанидина в молекуле ДНК или РНК и, таким образом, может быть использована для мечения нуклеиновых кислот. Введение платиновой метки не влияет на структуру меченой ДНК и на ее способность к гибридизации при условии, что плотность метки не превышает 1 молекулы (диен)Р1 на 10 нуклеотидов (Van Belkum et al., 1994).
Метод в представленном на рис. 13 виде был разработан для диагностики вироида веретеновидности клубней картофеля (ВВКК) и нашел успешное применение в элитном семеноводстве картофеля (Кондакова и Дрыгин, 1999). Цель нашей работы состояла в разработке МГА-ИФА-технологии для диагностики вирусных инфекций. В отличие от' короткой и исключительно стабильной РНК вироида, вирусные РНК значительно менее стабильны и в десятки раз длиннее. Кроме того, вирусная РНК покрыта белком оболочки вируса, в то время как РНК вироидов такой оболочки лишена. В связи с этими принципиальными различиями были изучены возможность и условия применения МГА-ИФА-технологии для детекции вирусов растений и определены аналитические характеристики метода.
Препарат (диен)Р1 предоставлен Ю.Ф.Дрыгиным (НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ), а аффинно очищенные кроличьи антитела к ДНК-(диен)Р1 -
B.И.Киселевой (Медицинский радиологический научный центр РАМН, г. Обнинск) (Киселева и др., 1994). Рекомбинантные плазмиды со вставками вирусной кДНК были сконструированы
C.В.Козловским и Р.А.Зиновкиным (табл. 3).
Таблица 3.
Характеристика рекомбинантных плазмид, использованных в работе.
Название вируса Клонируемый фрагмент1' Ген(ы) Вектор Штамм E.coli
АВК 2472-4673 P3 + CI pDrive DH-5alfa
МВК 5861 -8006 TGB (1 - 3) + CP pDrive DH-5alfa
SBK 7201 -8378 CP + pU pDrive DH-5alfa
ВМЛ 400-1900 PHK-3 р35 + CP pDrive DH-5alfa
YBK 1279-2636 НСРго pBlueScript 11 SK(+) XL-1 Blue
ХВК Полный геном pUC-19 JM109
велк 3161-5167 2b+3+4+5 pBlueScript II SK(-) JM109
ВТМ Полный геном pGEM5Zf(-) JM109
ВШС 9152-9787 CP + З'-NTR + полиА pBlueScript II SK(-) XL-1 Blue
1) Позиции нуклеотидов в вирусной РНК. СР - ген белка оболочки; З'-ШИ - З'-нетранслируемая последовательность; ТОВ - тройной блок транспортных генов карлавирусов; НСРго, РЗ, С1 - гены хелперного компонента, протеазы и белка цитоплазматических включений потивирусов, соответственно, р11 - ген обогащенного цистеином белка карлавирусов с неизвестной функцией; р35 - ген, кодирующий белок с мол. массой 35 кДа.
Для синтеза кДНК-зондов, меченных (диен)Р1, к 40 мкл плазмидной ДНК (100 нг/мкл), денатурированной в кипящей водяной бане в течение 5 мин и быстро охлажденной во льду, добавляли 28 мкл MilliQ, 8 мкл 0,1 М NaClC>4 и 4 мкл 0,5 мМ (диен)Р1. Таким образом, конечная концентрация ДНК в смеси составляла 50 нг/мкл, перхлората натрия - 10 мМ, и (диен)Р! - 25 мкМ. Смесь инкубировали в водяной бане 2,5 ч при 65°С. Препарат зонда содержали при 4°С, а при необходимости длительного хранения при -20°С.
Образцы РНК, выделенной из вирусов или из растений, и положительного контроля (серия разведений рекомбинантной плазмиды в MilliQ) денатурировали, наносили на нитратцеллюлозную мембрану Protran ВА 85/21 (Schleicher & Schuell, 0,45 (.im) и фиксировали облучением ультрафиолетовым светом. Мембраны инкубировали в предгибридизационном растворе (5Х SSC, 2Х раствор Денхардта, 0,1% додецилсульфат натрия) 2 ч при температуре 65°С. Зонд денатурировали 0,1 N NaOH в течение нескольких секунд и добавляли в предгибридизационную смесь в соотношении 1/1000 (объем/объем), так что конечная концентрация ДНК зонда составляла 50 нг/мл. Гибридизацию проводили в герметично запечатанных чашках Петри в течение 24 ч при температуре 65°С. Для обнаружения связавшегося с мишенью зонда использовали дот-вариант непрямого метода ИФА, в котором первичные антитела были против диен-платинированной ДНК, а в качестве вторичных использовали антитела к кроличьим IgG, конъюгированные с пероксидазой хрена Для выявления ферментативной активности использовали хемилюминесцентный субстрат пероксидазы.
Чувствительность метода определения вирусных РНК с помощью кДНК-зондов, меченных (диен)Р1, была изучена на примере детекции нескольких РНК, выделенных из очищенных вирусных препаратов с помощью разработанного нами метода (рис. 14).
А Б
200 100 50 25 12,5 6,25 3,0 200 100 50 25 12,5 6,25 3,0
1
2
Рис. 14. Чувствительность определения РНК ВШС (А) и РНК ХВК (Б) методой дот-гибридизации с кДНК-зондом, меченный (диен)Р1. 1. Рекомбинантная плазмида. 2. Вирусная РНК. Цифры над рисунком показывают концентрацию нуклеиновой кислоты в образце (пг/мкл). Объем образца 0,8 мкл. Время экспозиции рентгеновской пленки с мембраной - 20 мин.
Результаты этих экспериментов показывают, что чувствительность метода позволяет обнаруживать 10 - 20 пг вирусной РЖ в нанесенной пробе. Следует отметить, что чувствительность выявления РНК слабо зависела от длины вставки кДНК, которая для ВШС и ХВК составляла, соответственно, 650 и 6500 нуклеотидов (табл.3).
Метод позволяет специфично выявлять вирусную РНК в экстрактах из зараженных травянистых растений и из растений косточковых культур (рис. 15), причем уровень сигнала в МГА-ИФА соответствовал степени накопления вируса, определенной с помощью ИФА.
2000 400 80 16 3,2 0,6 0,1
5 6
Рис. 15. А. Определение ВТМ в листьях табака N. шЬасшп с. Самсун. В7 - рекомбинантная плазмида со вставкой кДНК ВТМ, 100 пг/мкл; Г7 - отрицательный контроль (рекомбинантная плазмида со вставкой кДНК ХВК, 100 пг/мкл); В(5,6) - здоровое растение; В(1,2), В(3,4), Г(1,2), Г(3,4), Г(5,6) - образцы нуклеиновых кислот, выделенных из листьев разных ярусов зараженного растения, в дубликатах. Б. Определение ВШС в листьях сливы (с. Яичная Синяя). 1: рекомбинантная плазмида со вставкой кДНК ВШС. 2: Нуклеиновая кислота, выделенная фенольным методом (1 - 4) и с помощью ТХАА (5 - 8) из (одних и тех же) здоровых (1,2,5, 6) и зараженных (3, 4, 7, 8) листьев. Цифры над рисунком показывают концентрацию плазмиды в нанесенном образце (пг/мкл).
Таким образом, разработанный вариант метода дот-гибридизации позволяет обнаруживать до 10 пг РНК различных вирусов и достоверно выявлять ВТМ, а также ХВК, УВК и ВСЛК (не показано) в экстрактах из листьев зараженных растений, в т.ч. ВШС в экстрактах из листьев косточковых культур. Продолжительность анализа составляет 2-3 суток, а количество одновременно анализируемых образцов лимитируется главным образом временем, необходимым для экстракции РЖ.
Для синтеза зондов было использовано комплексное соединение двухвалентной платины - (диен)Р1. Выбор метки определялся чрезвычайной простотой процедуры мечения, заключающейся в простом смешивании ДЖ и (диен)Р! и инкубации в мягких условиях. Поскольку (диен)Р1 количественно связывается с ДНК, отпадает необходимость дополнительной очистки зонда. Внедрение (диен)Р! в молекулу ДНК практически не влияет на специфическую гибридизацию кДЖ-зонда с РЖ мишени. Важным достоинством диен-платиновой метки является высокая иммуногенность ее комплекса с ДЖ, что позволяет
получать аффинные антитела, специфично узнающие любую ДНК, меченную (диен)Р1. Следует отметить высокую стабильность метки: срок годности ДНК-зондов, меченных (диен)Р1, составляет не менее 6 мес при хранении при -20°С (срок наблюдений).
Разработка ОТ-ПЦР-МГА-ИФА-технологии для диагностики вирусов.
Известно, что сочетание амплификации мишени с помощью обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) и амплификации сигнала посредством детекции ампликонов с помощью дот-гибридизации, ИФА или флуоресцентных зондов открывает возможность повышения чувствительности определения вирусов. С этой целью на модели ХВК были изучены, совместно с Р.А.Зиновкиным и О.А.Кондаковой (каф. вирусологии биологического факультета МГУ), возможности диагностического анализа, основанного на сочетании методов ОТ-ПЦР и МГА-ИФА.
В качестве матрицы для проведения ОТ-ПЦР использовали ряд последовательных десятикратных разведений РНК ХВК в MilliQ, начиная с 2 пг/мкл и вплоть до концентрации 2 х 10"6 пг/мкл. Для выполнения ОТ-ПЦР использовали обратный вирусспецифический праймер 5'-ACCTTGCGCTTGCCAGTTAG-3', соответствующий позициям 6085 - 6105 в геномной РНК ХВК, и прямой праймер 5'-CCGGATGGGGATTTCTTTAGTA-3\ соответствующий позициям 5755 - 5777. В ПЦР брали 1/10 объема продукта обратной транскрипции. Проводили 30 циклов ПЦР, каждый при температуре 94°С - 40 сек, 57°С - 40 сек, 72°С - 40 сек. Продукты ПЦР анализировали электрофорезом в 2% агарозном геле, окрашенном этидиумбромидом, и с помощью МГА-ИФА-технологии (рис. 16).
А Б
123456М 1234
Рис. 16. А. Электрофорсграмма продуктов ОТ-ПЦР в 2% агарозном геле I - отрицательный контроль ОТ; 2 - 0,03 фг РНК ХВК; 3-0,1 фг РНК ХВК; 4 - 1 фг РНК ХВК; 5 - 10 фг РНК ХВК: 6 -100 фг РНК ХВК; М - маркеры мол. массы (GeneRuler lkb Ladder, «Fermentas»). Стрелкой показано положение ампликона ожидаемого размера 351 нуклеотид. Б. МГА-ИФА продуктов ОТ-ПЦР РНК ХВК. 1 - 3: 10, 1 и 0,1 фг РНК ХВК в образце для ОТ, соответственно; 4 - отрицательный контроль ОТ.
Результаты этих экспериментов показывают, что вирусные РНК, полученные с помощью ТХАА, пригодны для амплификации с помощью ОТ-ПЦР. Метод ОТ-ПЦР
позволял выявлять 1 фг вирусной РНК в пробе, что соответствует уровню детекции 300 молекул вирусной РНК для реакции ОТ и 30 молекул кДНК в полимеразной цепной реакции (Рис. 16А). При гибридизации продуктов ПЦР со специфическим кДНК-зондом методом МГА-ИФА была достигнута чувствительность 0,1 фг, что соответствует уровню детекции 30 молекул вирусной РНК в исходной реакции обратной транскрипции, или 3 молекул кДНК после их размножения с помощью ПЦР (Рис.16Б). Таким образом, детекция ампликона с помощью дот-гибридизации позволяет на порядок повысить чувствительность определения вируса (по сравнению с методом электрофореза) и его специфичность. В результате совокупного применения методов амплификации мишени и усиления сигнала показана возможность выявления одиночных молекул РНК вируса в анализируемой пробе.
Диагностика вируса шарки сливы с помощью полимеразной цепной реакции.
Высокая вредоносность ВШС вызывает необходимость разработки все более совершенных методов его выявления и унификации процедуры диагностики с целью предупреждения распространения вируса с посадочным материалом косточковых культур. В этой связи по инициативе Европейской организации по защите растений (ЕРРО) разработан протокол, регламентирующий правила сбора образцов для анализа, а также методы диагностики и процедуры их применения для обеспечения максимально надежного определения ВШС (ЕРРО, 2004; Cambra et al, 2008). В частности, согласно этому протоколу, для официального подтверждения обнаружения ВШС положительный результат должен быть получен не менее чем двумя альтернативными методами анализа, среди которых ведущая роль отводится ОТ-ПЦР. Причина заключается в том, что при низкой концентрации вируса (в пробирочных растениях, отдельных частях взрослых деревьев и т.д.) для его надежного выявления необходимо применение методов диагностики, обладающих чувствительностью более высокой, чем у ИФА.
Целью нашей работы являлась разработка метода ОТ-ПЦР для выявления ВШС в пробирочных растениях, в частности, в растениях, оздоравливаемых культурой меристем. В качестве положительного контроля использовали растения табака N. benthamiana, экспериментально зараженные NAT-изолятом ВШС, и листья взрослого дерева войлочной вишни Prunus tomentosa с характерными симптомами шарки. Отрицательным контролем служили экстракты из свежих листьев вишни Р. cerasus клонового подвоя П7, не зараженного ВШС. Вирус определяли в пробирочных растениях сливы Р. domestica, оздоровленных методом термотерапии и культуры апикальных меристем, и в пробирочных растениях нескольких сортов сливы, зараженных ВШС. Все растения косточковых культур были из коллекции ВСТИСП. Наличие или отсутствие вируса во всех использованных в работе
растениях было предварительно установлено методом ИФА с помощью набора «Bio-Rad» и стандартным индикаторным тестом на листьях персика сорта GF-305.
Тотальную РНК экстрагировали из 0,1 г свежей листовой ткани, измельченной в жидком азоте, методом фенольно-хлороформенной депротеинизации с додецилсульфатом натрия. ОТ-ПЦР выполняли по методике Wetzel et al. (1991), используя новую пару праймеров («Синтол»): обратный праймер (5'-CAACAACGTTGGACTCACC-3'), комплементарный нуклеотидам 8568-8550 в гене Nib (репликазы) РНК NAT-изолята ВШС, прямой праймер (5'-CACTCCTTAAGCTTGGACAC-3 '), соответствующий позициям 8011-8030 в гене Nlb, а также обратную транскриптазу AMV («Promega») и Taq-ДНК-полимеразу («Invitrogen»). ПЦР выполняли на амплификаторе Amply-25 (ООО «Компания Биоком», Россия). В качестве положительного контроля ПЦР использовали рекомбинантную плазмиду pGEM3-PPVNAT65 (предоставленную Е. Maiss, Univ. Hannover, Германия), со вставкой кДНК-копии гена Nib ВШС. Реакция состояла из 35 циклов, каждый из которых осуществляли при температурах: 96°С - 1 мин, 50°С - 30 сек, 72°С - 1 мин. Продукты реакции анализировали электрофорезом в 1,5% агарозном геле.
12345678М
Рис. 17. Электрофорез продуктов ОТ-ПЦР в геле агарозы А: 1 - отрицательный контроль; 2, 3 -положительный контроль (экстракт из листьев табака и войлочной вишни, соответственно); 4, 5 -экстракт из замороженных листьев войлочной вишни; 6, 7, 8 - экстракты из пробирочных растений сливы сортов: Память Тимирязева, Евразия, Яичная Синяя. Б: 1 - плазмида pGEM3-PPVNAT65; пробирочные растения сливы сортов: Тульская черная (2), Яичная синяя (3), Евразия (4); Утро, клоны 1 и 2 (5, 6), Ренклод советский (7), Скороспелая красная (8). М - маркеры мол. массы (1 kb DNA ladder, «Gibco BRL»). Стрелка указывает положение ампликона ожидаемого размера 560 п.н.
С помощью ОТ-ПЦР ВШС был обнаружен в экстрактах из растений табака N. benthamiana и свежих листьев войлочной вишни (рис. 17А, дорожки 2 и 3, соответственно). Размер ампликона (560 п.н.) соответствовал расчетам, произведенным при подборе праймеров. В экстрактах из тех же листьев, предварительно замороженных при -20°С, ВШС обнаружить не удалось (4, 5). Не обнаружено зон соответствующего размера в экстрактах из
листьев вишни П7, не зараженной ВШС (рис.59А, 1) и в пробирочных растениях сливы, оздоровленных культурой апикальных меристем (6, 7 и 8).
. Те же условия реакции были использованы для выявления вируса в листьях пробирочных растений сливы, зараженных ВШС. Результаты, представленные на рис.17Б, показывают, что разработанный вариант ОТ-ПЦР позволяет достоверно выявлять ВШС в пробирочных растениях косточковых культур. Таким образом, разработанный метод позволяет осуществлять эффективный контроль процесса оздоровления от ВШС уже на самых ранних его этапах и избегать неоправданных затрат при дальнейшем размножении неоздоровленных растений.
Использованные в нашей работе праймеры были выбраны с таким расчетом, чтобы амплифицировалась консервативная последовательность внутри гена вирусной РНК-полимеразы, что, как предполагалось, должно было обеспечить выявление любого изолята ВШС вне зависимости от его штаммовой принадлежности. Результаты нашей работы, по-видимому, соответствуют этим предположениям. В то же время следует заметить, что электрофоретическая подвижность продуктов ОТ-ПЦР и, следовательно, их размер, несколько различались в зависимости от сорта сливы. Возможно, разные сорта в коллекции заражены разными изолятами ВШС, обладающими некоторой вариабельностью внутри этой достаточно протяженной нуклеотидной последовательности в гене вирусной РНК-полимеразы.
Диагностика вирусов и вироида картофеля с помощью ДНК-микроплаты.
Одной из ведущих тенденций современного развития методов диагностики вирусных инфекций является разработка подходов, которые позволяют определять все важнейшие патогены данной культуры одновременно в одном образце. Наиболее перспективным решением этой задачи является чиповая технология, которая имеет в этом отношении практически неограниченный потенциал. Однако, в настоящее время создание и применение биочипов связано с серьезными техническими трудностями, а чувствительность анализа недостаточно высока в сравнении с другими методами молекулярной диагностики, особенно ПЦР. По этой причине ДНК-чипы пока не нашли широкого применения для диагностики вирусных инфекций сельскохозяйственных растений. В этой связи целью нашего исследования, выполненного совместно с О.А.Кондаковой, была разработка более простого аналога ДНК-чипа - т.н. ДНК-микроплаты для одновременной диагностики основных вирусов и вироида картофеля в одном образце.
Для приготовление ДНК-микроштаты использовали нитратцеллюлозную разлинованную мембрану Protran ВА 85/21 (Schleicher & Schuell, 0,45 pm). Рекомбинантные плазмиды, содержащие вставку соответствующей кДНК (ХВК, SBK, МВК, YBK, АВК, ВСЖ, ВВКК и BMJI), или продукты ОТ-ПЦР-амплификации РНК ХВК денатурировали, наносили на мембрану в центр квадрата (ячейку микроплаты), и фиксировали облучением ультрафиолетовым светом. кДНК-копия вироида веретеновидности клубней картофеля (ВВКК) получена П.А.Ивановым, а фрагменты кДНК РНК ХВК различной длины с помощью обычной и асимметричной ОТ-ПЦР - Р.А.Зиновкиным (каф. вирусологии биологического факультета МГУ).
Процесс диагностического анализа с помощью ДНК-микроплаты выглядит следующим образом (Рис. 18). Тотальную РЖ выделяют из листьев картофеля, зараженных вирусами и вироидом, любым из известных методов (например, с помощью ТХАА и хроматографии на целлюлозном сорбенте), и модифицируют диен(Р1). Нами было показано, что диен-платиновая метка прочно и количественно связывается с РНК и выявляется антителами к платинированной ДНК с примерно такой же чувствительностью, как и в составе меченой ДНК. Меченая тотальная РНК гибридизуется с рекомбинантными ДНК, фиксированными на нитратцеллюлозной мембране. Образовавшиеся гетеродуплексы выявляют с помощью ИФА, как описано выше для МГА-ИФА-технологии.
Рис. 18. Принципиальная схема ДНК-мнкроплаты. Образец: тотальная клеточная РНК, выделенная из зараженных растений и меченная (диен)Р1.
Антигена к (циен) Pt
Пероксидаза хрена Хем и люминесцентный ^ ^^субстрат
Регистрация эмиссии
(диен) Pt
образец
JIII.IJ и II Li
рекомбинантная плэзмидэ мембрана
Для изучения гибридизационных свойств «платинированной» РНК была использована следующая методика. К препарату тотальной РЖ, выделенной из листовой ткани здорового растения картофеля, подмешивали различное количество очищенной РЖ ХВК. Смесь РЖ платинировали и использовали в гибридизации с ДЖ-микроплатой.
Результаты этих модельных экспериментов (рис. 19) показывают, что платинированная РЖ ХВК может быть с высокой специфичностью выявлена в гибридизации с ДНК, фиксированной в ячейках микроплаты, в концентрации по меньшей мере 10 пг/мкл. Очевидно, что чувствительность выявления платинированной РНК зависит от количества и
природы продукта, иммобилизованного в ячейке чипа. Наиболее эффективно платинированная РНК выявляется в гибридизации с рекомбинантной плазмидой: совершенно очевидно, что даже при количестве нанесенной плазмиды 50 нг, предел детекции мишени находится значительно ниже достигнутого в данном эксперименте. При фиксации в ячейках микроплаты продуктов ПЦР наилучшие результаты, как следует из рисунка, были достигнуты при использовании самого длинного фрагмента длиной 614 нуклеотидов, что, по-видимому, объясняется большей эффективностью гибридизации меченой РНК с более длинной кДНК, фиксированной в ячейке.
А Б В
Г
Г
1 2 3 4 5 6 7
12 34 567 1234567
Рис. 19. Определение платинированной РНК ХВК с помощью ДНК-микроплаты Верхний и средний ряд: кДНК ХВК. 1 - плазмида со вставкой кДНК ХВК; 2, 3, 4 - двунитевой продукт ПЦР длиной 614, 470 и 321 нуклеотид, соответственно; 5, 6, 7 - однонитевой продукт ПЦР длиной 614,470 и 321 нуклеотид, соответственно. Верхний ряд - 500 нг кДНК в ячейке микроплаты; средний ряд - 50 нг кДНК в ячейке микроплаты. Нижний ряд: отрицательный контроль (рекомбинантная плазмида со вставкой кДНК ВВКК), 1 - 500 нг; 2 - 50 нг плазмиды в ячейке микроплаты. Концентрация РНК ХВК во фракции нуклеиновых кислот, выделенных из здорового растения картофеля: 1000 (А), 100 (Б) и 10 (В) пг/мкл.
Испытание эффективности ДНК-микроплаты при диагностике вирусных и вироидных заболеваний картофеля было проведено на растениях картофеля, зараженных различными патогенами (как было предварительно установлено с помощью ИФА). Результаты испытаний, представленные на рис. 20, показали полное соответствие результатов выявления вирусов методом ИФА и с помощью ДНК-микроплаты. Кроме того, ДНК-микроплата позволяет одновременно выявлять и вироид, установить наличие которого с помощью ИФА невозможно из-за отсутствия белковой оболочки.
Таким образом, ДНК-микроплата позволяет одновременно выявлять вирусы и вироид картофеля в одном образце с чувствительностью не менее 10 пг/мкл РНК, которая сопоставима с чувствительностью, достигаемой при использовании чиповой технологии. При этом ДНК-микроплата радикально отличается от ДНК-чипов конструктивной простотой, легкостью в изготовлении и в оценке результатов анализа.
В настоящее время при конструировании ДНК-чипов для определения вирусов растений в качестве ДНК-зондов используют продукты ПЦР или синтетические однонитевые олигонуклеотиды, комплементарные выявляемой мишени. В нашей работе мы также
показали возможность использования продуктов обычной и асимметричной ПЦР для высокочувствительного выявления РНК ХВК в смеси с тотальной РНК, выделенной из листьев картофеля. Вместе с тем, использование в качестве зонда рекомбинантной плазмиды, содержащей полногеномную вставку кДНК ХВК, способствовало значительному повышению чувствительности анализа. Таким образом, применение рекомбинантной плазмиды в качестве зонда оправдано повышением чувствительности метода, особенно в том случае, когда уже имеются необходимые клонированные рекомбинантные ДНК, а количество выявляемых патогенов сравнительно невелико. Следует также отметить, что в настоящее время мишенями, выявляемыми с помощью биочипов, являются, как правило, флуоресцентно меченные вирусные кДНК. С помощью ДНК-микроплаты выявляют непосредственно меченую РНК без ее предварительной амплификации, что существенно упрощает процедуру анализа.
вмл
УВК
мвк
SBK АВК вслк ввкк
ХВК
Рис. 20. Диагностика вирусов и вироида картофеля с помощью ДНК-микроплаты. Слева: список и локализация нанесенных рекомбинантных плазмид (100 нг/мкл); А - Растение, зараженное (по результатам ИФА) ХВК и МВК; Б - незараженное; В - зараженное МВК.
Применение ДНК-микроплаты дает возможность одновременной диагностики вирусов и вироида в анализируемом образце и, таким образом, позволяет обеспечить, значительно ускорить и существенно удешевить процедуру сертификации семенного картофеля. ДНК-микроплата может являться прототипом для конструирования ДНК-чипов для диагностики вироидных и вирусных инфекций любой сельскохозяйственной культуры.
III. Применение разработанных методов диагностики для решения
практических задач безвирусного растениеводства.
Разработанные методы диагностики были использованы для контроля качества и сертификации семенного картофеля, получения безвирусного посадочного материала
ягодных, плодовых и цветочно-декоративных культур, диагностики карантинных объектов. Наиболее широкое применение получили метод ИФА и АБВ-тест.
Диагностика вирусных инфекций в элитном семеноводстве картофеля.
Современная схема семеноводства, принятая в РФ, предусматривает обязательную сертификацию оригинального и элитного семенного картофеля с использованием метода ИФА (Анисимов и др., 2005). Лабораторное тестирование в целях сертификации возложено на испытательные лаборатории, специально созданные для этой работы и аккредитованные в Системе сертификации семян Минсельхоза РФ. Результаты анализа зараженности семенного картофеля вирусами и вироидом оформляются в виде протокола испытаний, на основании которого органы Государственной семенной инспекции принимают решение о включении проанализированной партии семян в тот или иной класс.
Одна из таких испытательных лабораторий по вирусным и вироидным болезням была создана в 2001 году в составе ЗАО «НВО Иммунотех» МГУ имени М.В.Ломоносова (аттестат аккредитации в Системе сертификации семян Минсельхоза РФ № РоссГШБ ПС01.6.1.1121). В этой лаборатории в течение 2001 - 2008 годов с помощью созданных нами диагностических тест-систем ИФА было выполнено, в целях сертификации, свыше 7 тыс. анализов зараженности семенного картофеля различных репродукций и пробирочных растений картофеля вирусами X, 8, М, А, У и скручивания листьев картофеля. Крупнейшими заказчиками являлись такие производители безвирусных семян картофеля, как ООО «Дока-Генные технологии» (г. Зеленоград), ВНИИ картофельного хозяйства им. А.Г.Лорха РАСХН (Московская обл.), ООО «Русская снековая компания» (Московская обл.), ОАО «Агросервис» (г. Кашира), Зональный НИИ сельского хозяйства Северо-Востока им. Н.В.Рудницкого РАСХН (г. Киров), Удмуртский государственный НИИ сельского хозяйства (Удмуртская Республика), Уральский НИИ сельского хозяйства РАСХН (г. Екатеринбург), ООО «Агрофирма КРиММ» (г. Тюмень), и другие.
Процесс оздоровления растений от вирусов и вироида и размножение оздоровленных растений предполагает постоянный мониторинг вирусных инфекций с использованием различных методов диагностики. Мониторинг осуществляется производителями семенного картофеля, и для его обеспечения на базе ЗАО «НВО Иммунотех» было развернуто производство наборов для диагностики вирусов. В течение 2001 - 2008 годов в ЗАО «НВО Иммунотех» на основе наших разработок были произведены и реализованы наборы для иммуноферментного определения вирусов картофеля, общим количеством свыше 5 тыс. анализов. Кроме того, для обеспечения нужд Федеральной службы карантина растений налажено производство наборов для иммуноферментного определения ВШС. Основными
потребителями наборов являлись ООО «Химмед» (г. Москва), Белорусский НИИ картофелеводства (г. Минск), «Всероссийский центр карантина растений» (Московская обл.).
В течение 1998 - 2000 годов наборы для лабораторной диагностики ХВК, SBK, МВК, YBK, АВК и ВСЛК методом ИФА были использованы для контроля качества семенного картофеля в ООО «ЭТК Меристемные культуры» (Ставропольский край) - ведущем предприятии по производству семенного картофеля на юге России. С помощью этих наборов было проанализировано свыше 10 тыс. растений картофеля с. Волжанин различных репродукций: оздоровленных пробирочных растений, семенных клубней, выращенных в гидропонных теплицах, и семенного картофеля категории супер-суперэлита и суперэлита, выращенного в поле. Результатом систематического мониторинга вирусных инфекций явилось оздоровление сорта от вирусных заболеваний.
Диагностика вирусных инфекций плодовых н ягодных культур для получения
безвирусного посадочного материала.
Технология производства безвирусного посадочного материала плодовых и ягодных культур в РФ предполагает применение методов лабораторной диагностики вирусных инфекций на всех стадиях технологического процесса (Кашин, 2001).
С этой целью в 1992 - 2002 годах изготовленные нами наборы для лабораторной диагностики ВКПМ, BMA, ВЧКПТ, ЛВКПЗ и ВТМ методом ИФА регулярно использовали при мониторинге вирусных инфекций в насаждениях плодовых и ягодных культур во Всероссийском НИИ садоводства им. И.В.Мичурина (ВНИИС). С помощью этих наборов было определено фитосанитарное состояние свыше 8 тыс. сортообразцов яблони, вишни, малины, смородины, земляники, крыжовника из коллекционных и опытных насаждений ВНИИС, базовых питомников, сортоиспытательных участков и промышленных насаждений. В результате этой работы во ВНИИС и в базовых плодопитомниках Тамбовской, Липецкой и Саратовской областей на площади 16,8 га были заложены базисные маточно-черенковые сады для производства посадочного материала высших категорий качества.
Для формирования базисных клонов широко используется материал из коллекций различных плодовых и ягодных культур, поэтому определение фитосанитарного статуса коллекционных насаждений плодовых и ягодных культур имеет первостепенное значение для эффективности всей последующей работы по производству безвирусного посадочного материала С этой целью в течение 1995 - 2004 годов было проведено обследование коллекционных насаждений косточковых культур в европейской части России в отношении их зараженности, в частности, ВКПМ, ВЧКПТ, ЛВКПЗ и ВШС, для диагностики которых применяли разработанные нами тест-системы на основе ИФА. В результате проведенной
работы установлена высокая зараженность комплексом вредоносных вирусов основного и перспективного сортимента сливы, вишни и других косточковых культур. Основными источниками распространения вирусов являются селекционные коллекции и сортоиспытательные участки, широко используемые для заготовки черенков для питомников (Приходько и др., 2008).
В течение 2007 - 2008 годов было проведено изучение распространенности ВШС в коллекционных и коммерческих насаждениях косточковых культур в АР Крым, Украина. С помощью наборов для иммуноферментного определения ВШС проведено свыше 1500 анализов зараженности этим вирусом насаждений персика, сливы, алычи и абрикоса на территории Никитского ботанического сада, промышленных насаждений косточковых культур в Бахчисарайском, Севастопольском и Джанкойском районе АР Крым, а также дикорастущей флоры. В результате проведенных анализов было впервые доказано наличие ВШС в насаждениях косточковых плодовых культур на Южном берегу, в предгорной и степной зонах Крыма и выяснены некоторые пути интродукции вируса в регион.
Применение тест-системы для диагностики ВШС в карантинных исследованиях.
Поскольку ВШС является карантинным объектом (Приказ Минсельхоза России от 26 декабря 2007 г. № 673 «Об утверждении перечня карантинных объектов»), по инициативе Федеральной службы по ветеринарному и фитосанитарному надзору РФ были начаты систематические инспекции зараженности фруктовых садов, питомников и коллекционных насаждений этим вирусом. Целью работы, проводимой Всероссийским центром карантина растений, является изучение распространенности ВШС в основных регионах возделывания косточковых культур на европейской территории России для выявления и ликвидации существующих очагов инфекции и предотвращения дальнейшего распространения ВШС при размножении зараженного материала. В этих исследованиях используют разработанные нами наборы Пиротест-ИФА для иммуноферментного определения ВШС.
В 2007 - 2008 годах был проведен ряд обследований насаждений косточковых культур в Краснодарском и Ставропольском краях, Ростовской, Волгоградской, Липецкой, Тамбовской, Воронежской, Белгородской, Курской и Орловской областях на общей площади 254 га. В 24 коммерческих и экспериментальных садах, 5 коллекциях и 8 питомниках был собран 481 образец листьев с деревьев сливы, алычи, персика, абрикоса, вишни и черешни с симптомами, напоминающими шарку. Каждый образец анализировали методом ИФА с помощью 3 тест-систем: Пиротест-ИФА («НВО Иммунотех»), «Adgen» (Neogen Europe Ltd -
АООЕЫ Pytodiagnost¡cs) и ОА51-ЕЫ8А («А£п1е51», Италия), основанного на использовании универсальных моноклональных антител, распознающих все известные штаммы ВШС.
В результате анализа ВШС был выявлен в 71 образце. Все три варианта ИФА выявляли одни и те же зараженные деревья. Таким образом, доля зараженных растений составила, в среднем, 14,8%. В южных регионах России эта доля составила 26,1%, в то время как в Центральном и Центрально-Черноземном регионе около 6,5%. Значительно более высокий уровень инфекции в южных регионах обусловлен, по всей вероятности, интродукцией вируса с зараженным посадочным материалом, импортированным на рубеже 80-х - 90-х годов из бывшей Югославии, а также быстрым распространением вируса тлей из-за большой плотности насаждений. Этот вывод указывает на необходимость усиления карантинного контроля посадочного материала. В центральной России, где для закладки насаждений используют зимостойкие сорта местной селекции, основным источником вируса являлся зараженный коллекционный материал.
В этой работе нами была впервые предпринята попытка идентифицировать штаммы ВШС, присутствующие в России. Для их идентификации использовали наборы ВАБЬЕПБА («Agritest», Италия), основанные на использовании моноклональных антител, специфичных к штаммам Д М, С и ЕА. Обнаружено, что почти 60% положительных образцов заражены штаммом И. Штамм М выявлен в 24% образцов, в основном на юге России. В ряде образцов, однозначно положительных по результатам всех трех вариантов ИФА, штамм вируса идентифицировать не удалось.
Диагностика вирусных инфекций цветочно-декоративных культур для получения
безвирусного посадочного материала.
АБВ-тест бьш использован для массовой диагностики ВКГ в меристемной лаборатории агрофирмы «Колхоз им. С.М.Кирова» (Московская обл.) при промышленном получении и размножении оздоровленного посадочного материала ремонтантной гвоздики. С помощью АБВ-теста было проанализировано свыше 10 тыс. растений гвоздики различных репродукций. Это позволило отказаться от менее производительного и несравнимо более затратного биотеста на растениях-индикаторах для выявления ВКГ в меристемных растениях гвоздики и осуществлять диагностику ВКГ в осеннее-зимний период, когда концентрация вируса в растениях существенно снижалась по сравнению с весенне-летним периодом.
В 2000 - 2001 году в ООО «ЭТК Меристемные культуры» с помощью наборов для диагностики ВКГ методом ИФА было проанализировано свыше 2 тысяч меристемных растений гвоздики. Результатом этой работы явилось оздоровление маточника нескольких сортов гвоздики от вируса крапчатости.
Таким образом, разработанные тест-системы для диагностики вирусных инфекций растений с помощью ИФА и АБВ-теста были широко использованы в Системе сертификации семян Минсельхоза РФ, производителями безвирусного посадочного материала в России, Белоруссии и на Украине для контроля качества и производства безвирусного посадочного материала картофеля, плодовых, ягодных и цветочно-декоративных культур и Федеральной службой карантина растений РФ для диагностики карантинного вируса шарки сливы.
IV. Индукция у растений устойчивости к заражению вирусами.
Возделывание устойчивых к вирусам растений существенно снижает потери от вирусных заболеваний. Один из подходов к созданию устойчивости основан на стимуляции защитных механизмов растения с помощью элиситоров. Например, биогенные элиситоры олигосахаридной природы (Р-1,3-глюканы, фрагменты хитина и хитозана, галактурониды, ксилоглюканы) - важнейшие сигнальные молекулы у растений. Возникая in vivo при деструкции клеточных стенок, они индуцируют экспрессию защитных генов и запускают каскад местных и системных реакций, препятствующих дальнейшему размножению фитопатогена (Ryan, 1988; Shibuya & Minami, 2001).
Одним из самых известных элиситоров является хитозан (Р-1,4-поли-0-глюкозамин), который обычно получают деацетилированием хитина ракообразных в щелочных условиях (рис. 21).
Поскольку реакция Ы-деацетилирования сопровождается одновременным разрывом гликозидных связей полимера, хитозан, полученный химическим путем, представляет собой полидисперсный по молекулярной массе гетерополимер М-ацетилглюкозамина и глюкозамина, содержащий обычно 5 - 15% 2-ацетамидных групп.
В нашей лаборатории было впервые обнаружено, что обработка листьев фасоли раствором хитозана приводит к уменьшению количества местных некрозов, развивающихся после механического заражения листьев ВМЛ. Этот факт свидетельствовал об ингибировании хитозаном вирусной инфекции, поэтому было проведено детальное исследование данного явления с использованием различных видов растений, вирусов и молекулярных форм
Рис. 21. Структура полностью деацетилированного хитозана.
хитозана. В этой работе были использованы разработанные нами тест-системы для диагностики вирусов методом ИФА.
В большинстве экспериментов использовали высокомолекулярный хитозан с мол. массой 120 кДа и степенью ацетилирования 30%, полученный из панциря криля (Sea-Fishering Institute, Гдыня, Польша). Хитозан растворяли в 0,05% уксусной кислоте на магнитной мешалке и доводили pH раствора до 6,0 с помощью 0,1 М КОН. Листья опрыскивали раствором хитозана до или после инокуляции один или несколько раз в зависимости от цели эксперимента. Дтя заражения растений использовали очищенный вирусный препарат или экстракт из зараженных растений. Дозу инокулюма подбирали заранее таким образом, чтобы на листьях контрольных растений получать 50 - 75 местных некрозов на половине листа, или использовали инокулюм с концентрацией вируса 30 - 50 мкг/мл, определенной ИФА. На половину листа наносили 20 - 30 мкл инокулюма.
Характеристика противовирусной устойчивости, индуцированной хитозаном.
Результаты проведенных исследований подытожены в таблице 4 и сводятся к следующему: (1) Хитозан ингибирует образование местных некрозов при заражении некротического хозяина данного вируса; (2) Хитозан ингибирует системную инфекцию. Подавление размножения вируса в инокулированном листе (обработанном хитозаном) приводит к замедлению или отсутствию системного распространения вируса; (3) Протективный эффект хитозана неспецифичен в отношении вида вируса. Хитозан индуцирует устойчивость у ряда экспериментальных растений к заражению различными РНК- и ДНК-содержащими вирусами и ВВКК; (4) Противовирусная активность хитозана опосредована его влиянием на растение, поэтому степень подавления инфекции зависит от вида растения. Из исследованных нами растений максимальной восприимчивостью к хитозану обладали бобовые растения. У представителя семейства крестоцветных Brassica campestris (с. Just Right) устойчивость к заражению каулимовирусом мозаики цветной капусты, потивирусу мозаики турнепса и комовирусу мозаики редиса индуцировать не удалось: системная инфекция в обработанных хитозаном растениях развивалась так же, как и в необработанных; (5) Протективный эффект хитозана зависит от его концентрации. Как правило, использовали раствор хитозана в концентрации 1 мг/мл или более низкие концентрации.
Таблица 4.
Противовирусная активность хитозана в растениях
Растение Вирус" Тип инфекции 4 Степень ингибирования 3)
Фасоль Phaseolus vulgaris ВМЛ с/мн ++++
ВЗМФ с ++++
BKA с 1 1 1 1
ВММФ с ++-Н-
ВТМ мн ++++
ВНТ мн ++++
Горох Pisum sativum ВМЛ с 1 '1 1 1
BKA с ++++
Табак Nicotiana tabacum Самсун NN ВТМ мн +++
ВМЛ мн 4+
Табак Nicotiana tabacum Самсун nn ВТМ с ++
Табак Nicotiana tabacum Ксанти nc ВТМ мн ++
Табак Nicotiana glutinosa ВТМ мн ++
Табак Nicotiana paniculata BKA мн ++
Томаты Lycopersicon esculentum ВТМ с 4++
ХВК с +++
ВВКК с +++
Картофель Solanum tuberosum ХВК с +++
YBK с +++
Лебеда Chenopodium quinoa ВНТ мн ++
ВОМ мн +++
Лебеда Chenopodium amaranticolor ВТМ мн +++
ВМЛ мн +++
Дурман Datura stramonium ВМН с +++
ВТМ мн +++
1) сокращения в тексте; 2) «с» - системная инфекция; «мн» - местные некрозы; 3) при обработке хитозаном (1 мг/мл) за сутки до инокуляции: «++» - 25 - 50%; «+++» - 50 - 75%; «++++» -75-100%; Изоляты альфамовируса мозаики люцерны (BMJI), комовируса карликовости арахиса (BKA) и ВВКК предоставлены H.Pospieszny; геминивирус золотистой мозаики фасоли (ВЗМФ) - F. Morales (Morales & Niessen, 1988); Рекомбинантная плазмида, содержащая полногеномную копию ДНК каулимовируса мозаики норичниковых (ВМН, figwort mosaic virus) была предоставлена RJ.Shepherd (Shepherd et al., 1987) и использована для механической инокуляции растений дурмана Datura stramonium.
Роль структуры в противовирусной активности хитозапа.
Хитозан представляет собой сополимер глюкозамина и Ы-ацетилглюкозамина и в кислой среде обладает свойствами поликатиона за счет протонирования аминогрупп. Следовало выяснить, какую роль играют величина молекулярной массы (степень полимеризации), количество ацетамидных групп (степень ацетилирования) и поликатионные свойства молекулы в его противовирусной активности.
Для решения первого вопроса в Центре «Биоинженерия» РАН методом фильтрации через мембраны с уменьшающимся размером пор были получены препараты хитозапа, однородные по мол. массе (М\у). Их активность изучали на растениях фасоли, заражаемой ВММФ, концентрацию которого определяли с помощью ИФА. Данные, приведенные в табл. 5, показывают, что наибольшей активностью обладали препараты низкомолекулярного хитозана.
Таблица 5.
Накопление ВММФ в растениях фасоли, обработанных хитозаном (% от контроля)
Образцы хитозанов Концентрация хитозана, мкг/мл
10 | 100 10 1 100
8 сутки 14 сутки
В инокулированных листьях
М\У 40,4 (до фракционирования) 5 - 0,8 -
Мш 10,1 6 0 19 -
Муу2,2 0 0 0,5 -
М«' 1,2 0,6 0 0,3 -
В системных листьях
40,4 (до фракционирования) 0 0 39 0,2
Мш 30,3 0 0 33 4,2
10,1 0 0 35 0,04
2,2 0 0 0 0
М\у 1,2 0 0 0 0
«-»- не определяли.
Исследование активности 6-О-сульфата хитозана и б-О-сульфат-Ы-сукцината хитозана, предоставленных А.И.Гамзазаде (Институт элементоорганических соединений им. А.Н.Несмеянова РАН), показало, что анионные производные хитозана обладают в 10— 100 раз меньшей противовирусной активностью, чем поликатионные молекулы хитозана с такой же мол. массой, при ингибировании образования местных некрозов на листьях фасоли после инокуляции ВМЛ. Таким образом, поликатионные свойства хитозана, по-видимому, важны для проявления его противовирусной активности.
Изучение механизма противовирусной активности хитозана.
Обнаружено, что при обработке хитозаном нижней поверхности листа фасоли устойчивость к заражению ВМЛ развивалась и на его верхней поверхности, при обработке одной половины листа устойчивость развивалась и в другой, необработанной хитозаном половине, при обработке нижних листьев устойчивость наблюдали также и в верхних. Аналогичные данные были получены при заражении растений фасоли ВТМ, а также при обработке корней растений фасоли перед их заражением ВМЛ. Эти результаты показывают, что хитозан индуцирует в растениях системную устойчивость.
В растениях с индуцированной системной устойчивостью мишенью для защитных реакций может являться любая стадия инфекционного процесса (ОШПапс! е/ а/., 2006; Ра1икаШ5 & Сагг, 2008). При изучении динамики устойчивости, развивающейся в растениях картофеля в результате обработки хитозаном, была обнаружена положительная корреляция между содержанием каллозы и уровнем рибонуклеазной активности, с одной стороны, и степенью устойчивости к вирусной инфекции, с другой. Это позволяет предположить, что индукция хитозаном отложений каллозы и рибонуклеазной активности может быть слагаемым механизма противовирусной устойчивости.
Методом ИФА установлено, что хитозан подавляет размножение ВТМ и ХВК в культуре протопластов табака ЫЛаЬасит сортов Самсун NN. Самсун пп и Ксанти пс, зараженных вирусом или вирусной РНК методом электропорации и стимулирует продукцию нескольких клеточных белков, в частности белка с мол. массой около 130 кДа (р130) (рис. 22). При этом уровни экспрессии этого белка и накопления вируса были связаны обратной зависимостью.
Рис. 22. Электрофоретический анализ лизатов протопластов, зараженных ВТМ. 1,2,3- концентрация хитозана, соответственно, 25, 50 и 100 мкг/мл; 4 - с хитозаном (100 мкг/мл) без инкубации; 5 - без хитозана; 6 - белки-маркеры. Сверху вниз: 94, 67,43, 30,20,1 и 14,4 кДа.
В то же время, хитозан не ингибировал накопления ВТМ и ХВК в изолированных протопластах ячменя и не индуцировал образования в них белка с близкой молекулярной массой. Таким образом, р130 может играть роль в ингибировании вирусной инфекции. Принимая во внимание молекулярную массу этого белка и то обстоятельство, что в лизатах протопластов обнаружена РНК-полимеразная активность, можно предположить, что р130 является клеточной РНК-зависимой РНК-полимеразой, а противовирусная
1 2 3 4 5 6
устойчивость, штудируемая хитозаном, частично опосредована механизмом РНК-интерференции.
Выводы
1. Разработаны тест-системы на основе планшетного сэндвич-варианта ИФА для лабораторной диагностики основных вирусов картофеля (ХВК, SBK, МВК, YBK, АВК, ВСЛК), неповирусов (ВКПМ, ВМА, ВЧКПТ), а также ЛВКПЗ, ВШС, ВНТ, ВТМ, ВММФ и ВКГ. Аналитические характеристики тест-систем позволяют определять перечисленные вирусы в концентрации до 1 нг/мл в очищенном препарате и с высокой специфичностью выявлять зараженные растения картофеля, овощных, ягодных, плодовых и цветочных культур.
2. Для экспресс-диагностики фитовирусов во внелабораторных условиях разработаны метод виробактериальной агглютинации (АБВ-тест), основанный на коагглютинации вирусных частиц и клеток Staphylococcus aureus, покрытых антителами к вирусу, и метод иммунохроматографии на тест-полосках, основанный на применении поликлональных антител и наночастиц коллоидного золота в качестве маркера. Методы позволяют выявлять вирусы с чувствительностью до 80 нг/мл за 2 - 10 мин и проводить анализ без вспомогательного оборудования как специалистами, так и лицами без профессиональной подготовки.
3. На основе иммуноферментного анализа с использованием неорганической пирофосфатазы E.coli в качестве ферментной метки разработаны наборы реагентов для определения основных вирусов картофеля, а также вируса шарки сливы, содержащие все необходимое для выполнения анализа.
4. Разработан способ экстракции РНК из вирусных частиц и из растений, основанный на выделении нуклеиновых кислот с помощью нового хаотропного агента трихлорацетата аммония и очистке РНК с помощью целлюлозного сорбента на основе хлопковой ваты. Способ не требует применения токсичных соединений и позволяет получать РНК высокого качества при комнатной температуре. Процедура получения очищенного препарата РНК из одного образца занимает 30 мин.
5. Разработан метод определения вирусов растений с помощью дот-гибридизации с кДНК-зондами, меченными (диен)Р1, и последующем выявлении образующихся гетеродуплексов в непрямом ИФА с помощью антител, специфичных к (диен)Р1. Метод позволяет выявлять до 10 пг вирусной РНК в образце объемом 1 мкл и, в силу его высокой чувствительности, специфичности и производительности, пригоден для массовой диагностики вирусных заболеваний растений.
6. Разработан метод диагностики вируса шарки сливы, основанный на применении полимеразной цепной реакции. При наличии в образце вируса амплифицированный фрагмент гена Nib (репликазы) идентифицируется в агарозном геле как зона размером 560 пар нуклеотидов. Метод позволяет выявлять вирус в пробирочных растениях косточковых культур.
7. Для одновременной диагностики вирусов и вироида картофеля разработан прототип ДНК-чипа - ДНК-микроплата, в ячейках которой фиксированы рекомбинантные ДНК, комплементарные РНК определяемого патогена. ДНК-микроплата позволяет выявлять меченную (диен)Р1 РНК вируса или вироида в концентрации не менее 10 пг/мкл. Применение ДНК-микроплаты позволяет обеспечить, значительно ускорить и существенно удешевить процедуру сертификации семенного картофеля.
8. Разработанные тест-системы для диагностики вирусных инфекций растений с помощью ИФА и АБВ-теста были широко использованы в Системе сертификации семян Минсельхоза РФ, производителями безвирусного посадочного материала в России, Белоруссии и на Украине для контроля качества и производства безвирусного посадочного материала картофеля, плодовых, ягодных и цветочно-декоративных культур и Федеральной службой карантина растений РФ для диагностики карантинного вируса шарки сливы.
9. Установлено таксономическое положение вируса мягкой мозаики фасоли (ВММФ). Изучение структуры вирусной частицы и вирусного генома, а также состава белковых продуктов, образующихся при трансляции вирионной РНК in vitro, позволили отнести ВММФ к представителям рода Carmovirus.
10. Показана возможность индукции противовирусной устойчивости у различных видов растений хитозаном. Протекгивный эффект опосредован влиянием хитозана на растение и зависит от вида растения, концентрации и молекулярной формы хитозана.
Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:
Патенты
1. Чирков С.Н., Оловников A.M., Сургучева H.A., Оловникова Н.И., Пирузян JI.A., Атабеков
И.Г. (1981). Способ определения зараженности растений. Авторское свидетельство СССР № 924099.
2. Дрыгин Ю.Ф., Атабеков И.Г., Кондакова O.A., Чирков С.Н., Гаврюшина Е.С. (2008). Применение трихлорацетата аммония в качестве средства для диссоциации природных комплексов нуклеиновых кислот и способ выделения РНК. Международная заявка № PCT/RU2007/000310. Номер международной публикации WO 2008/150187 Al.
3. Дрыгин Ю.Ф., Кондакова O.A., Чирков С.Н., Зиновкин P.A., Киселева В.И., Атабеков И.Г.
(2008). Способ одновременного обнаружения множества РНК-последовательностей в биологическом образце. Международная заявка № PCT/RU2008/000198.
Статьи в научных журналах:
4. Чирков С.Н., Оловников A.M., Сургучева H.A., Оловникова Н.И., Пирузян Л.А., Кулинич
A.B., Атабеков И.Г. (1981). Виробактериальная агглютинация (АБВ-тест) - новый метод иммунодиагностики вирусов сельскохозяйственных растений. Докл. ВАСХНИЛ № 7,9-11.
5. Чирков С.Н., Оловников A.M., Варицев Ю.А., Атабеков И.Г. (1982). Диагностика X, S, M и Y
вирусов картофеля методом виробактериальной агглютинации. Сельскохоз. биол. № 2, 272277.
6. Чирков С.Н., Варицев Ю.А., Герасимова К.Ф., Атабеков И.Г. (1982). Сравнение трех серологических методов диагностики X, S, M и Y-вирусов картофеля на разных стадиях развития растений. Докл. ВАСХНИЛ № 3,14-16.
7. Бобкова А.Ф., Чирков С.Н. (1983). Применение иммунофермеитного анализа для диагностики вирусных заболеваний растений. Сельскохоз. биол. № 5, 32-36.
8. Одинец А.Г., Кулинич A.B., Чирков С.Н., Козицкий Ю.Н., Атабеков И.Г. (1983). Сравнительное испытание иммунологических методов для массовой диагностики вируса крапчатости гвоздики. Сельскохоз.биол. № 5,37-41.
9. Чирков С.Н. (1983). АБВ-тест: экспресс-метод иммунодиагностики фитовирусов. Сельскохоз. биол. № 5,42- 46.
10. Chirkov S.N., Olovnikov A.M., Surguchova N.A., Atabekov J.G. (1984). Immunodiagnosis of plant viruses by a virobacterial test. Ann. appl. Biol. 104,477-483.
11. Бойков C.B., Чирков C.H., Сургучева H.A., Атабеков И.Г. (1984). Сравнение флокулляционных методов иммунодиагностики вирусов растений. Биохимия № 2, 272-274.
12. Бобкова А.Ф., Нацвлишвили Н.М., Чирков С.Н., Сургучева H.A., Варицев Ю.А., Атабеков И.Г. (1987). Характеристика отечественных коммерческих антисывороток к вирусам картофеля в АБВ-тесте и иммуноферментном анализе. Изв. АН СССР, Сер. биол. № 1, 2834.
13. Karasev A.V., Chirkov S.N., Kaftanova A.S., Miroshnichenko N.A., Surgucheva N.A., Fedotina V.L. (1989). Characterization of bean mild mosaic virus: particle morphology, composition and RNA cell-free translation. Intervirology 30,285-293.
14. Федотина В.Л., Сургучева H.A., Чирков С.Н., Кочкина З.М. (1990). Очистка и иммуноферментный анализ вируса кольцевой пятнистости малины. Сельскохоз. биол. № 5, 74-181.
15. Сургучева H.A., Федотина В.Л., Чирков С.Н., Кочкина З.М. (1990). Очистка и иммунофермеитиый анализ вируса некроза табака. Вестн. сельскохоз. науки № 8, 144-148.
16. Чирков С.Н., Сургучева H.A., Федотина В.Л., Кочкина З.М. (1991). Очистка и иммуноферментный анализ вируса черной кольцевой пятнистости томатов и латентного вируса кольцевой пятнистости земляники. Биол. науки № 4, 22-29.
17. Pospieszny H., Chirkov S., Atabekov J. (1991). Induction of antiviral resistance in plants by chitosan. Plant Sei. 79,63-68.
18. Chirkov S.N., Surguchova N., Atabekov J.G. (1994). Chitosan inhibits systemic infections caused by DNA-containing plant viruses. Arch. Phytopath. Plant Protection 29,21-24.
19. Чирков C.H., Сургучева H.A., Атабеков И.Г. (1995). Стимуляция синтеза клеточных белков и ингибирование вирусной инфекции хитозаном в изолированных протопластах табака. Доклады РАН № 6,836-838.
20. Чирков С.Н., Сургучева H.A., Гамзазаде А.И., Абдулабеков И.М., Поспешны Г. (1998). Сравнительная эффективность производных хитозана при подавлении вирусной инфекции растений. Доклады РАН №2,271-273.
21. Surguchova N., Chirkov S., Atabekov J. (1998). ELISA-test bei Nepoviren mit einem neuen Enzym - einer anorganischen Pyrophosphatase aus Escherichia coli. Arch.Phytopath.Pflanz. 31, 535-541.
22. Surguchova N.A., Yu.A.Varitsev, Chirkov S.N. (2000). The inhibition of systemic viral infections in potato and tomato plants by chitosan treatment. J.Russ.Phytopath.Soc.,1, 59-62.
23. Чирков C.H., Новиков B.K., Бобкова А.Ф., Атабеков И.Г. (2000). Пиротест -усовершенствованный вариант иммуноферментного анализа вирусов картофеля. Защита и карантин растений № 12,15-16.
24. Добржанская Е.О., Приходько Ю.Н., Чирков С.Н. (2001). Диагностика вируса шарки сливы методом полимеразной цепной реакции. Докл. РАСХН № 2,11-12.
25. Чирков С.Н., Ильина A.B., Сургучева H.A., Летунова Е.В., Варицев Ю.А., Татаринова Н.Ю., Варламов В.П. (2001). Влияние хитозана на системную вирусную инфекцию и некоторые защитные реакции в растениях картофеля. Физиол. растений № 6, 890-896.
26. Чирков С.Н., Осипов А.П., Атабеков И.Г. (2002). Наборы «Пиротест» для лабораторной диагностики вирусов картофеля. Картофель и овощи № 1, 29.
27. Чирков С.Н. Противовирусная активность хитозана. (2002). Прикл. биохим. микробиол. № 1,5-13.
28. Бобкова А.Ф., Блинцов А.Н, Чирков С.Н. (2003). Пиротест - метод иммуноферментного анализа вирусов картофеля. Аграрная Россия № 3,23 - 27.
29. Nemtsev S.V., Il'ina A., Varlamov V.P., Ozeretskovskaya O.L., Vasyukova N.I., Chirkov S.N., Skryabin K.G. (2003). Stimulation of plant growth and induction of potato resistance to diseases by low molecular weight chitosan. Bull. Polish Acad. Sei. Biol. Sei. 51,243 - 249.
30. Куликов C.H., Чирков C.H., Ильина A.B., Лопатин O.A., Варламов В.П. (2006). Влияние молекулярной массы хитозана на его противовирусную активность в растениях. Прикл. биохим. микробиол. № 2,224 - 228.
31. Чирков С.Н., Варицев Ю.А., Русецкий Н.В. (2007). Усовершенствованный способ очистки вируса А картофеля и разработка тест-системы для его диагностики методом иммуноферментного анализа. Сельскохоз. биол. № 5, 114 - 118.
32. Приходько Ю.Н., Чирков С.Н., Метлицкая К.В., Цубера Л.В. (2008). Распространенность вирусных болезней косточковых культур в европейской части России. Сельскохоз. биол. № 1,26-32.
33. Вызова H.A., Сафенкова И.В., Чирков С.Н., Жердев A.B., Блинцов А.Н., Дзантиев Б.Б., Атабеков И.Г. (2009). Разработка иммунохроматографических тест-систем для экспрессной детекции вирусов растений. Прикл. биохим. микробиол. № 2,225-231.
Статьи в книгах и сборниках
34. Pospieszny Н., Struszczyk Н., Chirkov S.N., Atabekov J.G. (1995). New applications of chitosan in agriculture. «Chitin World». Karnicki Z.S., Brzeski M.M., Bykovski P.J., Wojtasz-Pajak A„ Eds. Gdynya: Wirtschaftsverlag NW, 246-254.
35. Чирков C.H., Поспешны Г. (1999). Индукция противовирусной устойчивости у растений хитозаном. Материалы Пятой конференции «Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана». Москва - Щелково, 25 - 27 мая, с. 111-114.
36. Чирков С.Н. (2002). Противовирусные свойства хитозана. «Хитин и Хитозан. Получение, свойства и применение». М.: Наука, 327 - 338.
37. Куликов С.Н., Чирков С.Н., Ильина A.B., Лопатин С.А., Шумилина Д.В., Джавахия В.Г. (2006). Использование хитозана для защиты растений от вирусных болезней. Материалы Восьмой Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана». Казань, 13-17 июня, с. 330 - 332.
38. Drygin, Yu.F., Chirkov S.N., Kondakova, O.A., Zinovkin, R.A., Ivanov, P.A., Blintsov, A.N., Gavryushina, E.S., Zherdev, A.V., Byzova, N.A., Dzantiev, B.B., Atabekov J.G. (2007). Highsensitive technologies for molecular diagnostics of potato virus and viroid infections. «Potato Production and Innovative Technologies». A.J. Haverkort, B.V. Anisimov, Eds. Wageningen: Acad.Publishers, 274-285.
39. Митрофанова О.В., Лесникова-Седошенко Н.П., Чирков С.Н., Смыков А.В., Вожегова Р.А. (2008). Биотехнологические системы оздоровления косточковых плодовых культур и получения безвирусного посадочного материала. «Фактори експериментально! еволюцп оргашзм1в». Киев: Логос, 410-415.
Избранные тезисы
40. Н.А.Сургучева, С.Н.Чирков, И.Г.Атабеков. (1982). Электронно-микроскопическое исследование виробактериальных комплексов в АБВ-тесте. Сборник тезисов XII Всесоюзной конференции по электронной микроскопии. Сумы, октябрь, с. 256-257.
41. Чирков С.Н., Сургучева Н.А., Федотина В.Л., Кочкина З.М. (1990). Разработка тест-систем иммунодиагностики фитовирусов. Сборник тезисов Всесоюзной конференции «Микробиологические и биотехнологические основы интенсификации растениеводства и кормопроизводства». Алма-Ата, октябрь, с. 110.
42. Chirkov S.N., Pospieszny Н., Surguchova N.A. (1994). Chitosan protects plants against virus diseases. Abstracts of the International Conference on Fundamental and Applied Problems in Phytovirology». Yalta, 22-26 May, p. 17.
43. Pospieszny H., Struszczyk H., Chirkov S.N., Atabekov J.G. (1994). New application of chitosan in agriculture. Abstracts of the 6h International Conference on Chitin and Chitosan. Gdynya, 16-19 August, p. 26.
44. Chirkov S., Dmitrieva Т., Atabekov J.G. 1994. Chitosan inhibits virus replication in tobacco protoplasts. Abstracts of the International Conference on Plant Virology. Town of Trojan, 19-23 September, p. 29.
45. Chirkov S.N. (1994). Features of chitosan-induced antiviral resistance in plants. Abstracts of the Symposium on molecular responses of plants to biotic and abiotic stresses. Helsinki, 8-9 December, p. 7-8.
46. Чирков C.H., Новиков B.K., Бобкова А.Ф., Атабеков И.Г. (2000). Пиротест -усовершенствованный вариант иммуноферментного анализа вирусов картофеля. Сборник тезисов семинара-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология-2000». Пущино, 26 - 28 сентября, с. 26 - 27.
47. Кондакова О.А., Чирков С.Н., Козловский С.В., Дрыгин Ю.Ф.", Атабеков И.Г. (2003). Высокочувствительная и доступная технология молекулярной диагностики вироидных и вирусных заболеваний растений. Материалы II Московского международного Конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва, 10-14 ноября, с. 170-171.
48. Kulikov S.N., Chirkov S.N, Il'ina A.V., Lopatin S.A., Varlamov V.P. (2006). Antiviral activity of chitosan. Abstraéis of íhe 6th International Conference of the European Chitin Society. Poznan, August 31 - September 3, p. 53.
49. Сафенкова И.В., Жердев A.B., Блинцов A.H., Чирков С.Н. (2007). Изучение взаимодействия антител с вирусами растений различной структуры. Сборник тезисов Первой Всероссийской школы-семинара «Современные достижения бионаноскопии». Москва, 11—17 июня, 50 — 51.
50. Киселев В.Н., Майсурян А.Н., Серенко Е.К., Чирков С.Н., Кондакова О.А., Дрыгин Ю.Ф., Зиновкин Р.А., Гаврюшина Е.С., Атабеков И.Г. (2007). Создание высокочувствительных технологий молекулярной диагностики вирусных и вироидных заболеваний растений для развития безвирусного растениеводства. Сборник тезисов Итоговой конференции «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России па 2007 - 2012 годы». Москва, 6-7 декабря, 100 - 101.
51. Сафенкова И.В., Жердев А.В., Вызова Н.А., Чирков С.Н., Блинцов А.Н., Дрыгин Ю.Ф., Дзантиев Б.Б., Атабеков И.Г. (2008). Изучение взаимодействия вирусов растений с антителами и их конъюгатами с коллоидными наночастицами. Сборник тезисов IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, 11-15 мая, 374.
52. Митрофанова О.В., Чирков С.Н., Лесникова-Седошенко Н.П. (2008). Вирусные болезни косточковых плодовых культур и биотехнологические системы оздоровления растений. Сборник тезисов IX международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнологияЗвенигород, 8-12 сентября, с. 254.
Методические рекомендации
53. Атабеков И.Г., Чирков С.Н. (1985). Методические рекомендации по применению реакции виробактериальной агглютинации (АБВ-теста) для диагностики вирусов растений. М.: ВАСХНИЛ. - 22 с.
V
Подписано в печать: 24.04.2009
Заказ № 1938 Тираж -120 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru
Содержание диссертации, доктора биологических наук, Чирков, Сергей Николаевич
Список сокращений
Введение
Обзор литературы
Глава 1. Иммунохимические методы определения вирусов растений
Метод иммуноферментного анализа (ИФА)
Метод иммунохроматографии (ИХА)
Глава 2. Молекулярные методы определения вирусов растений
Молекулярно-гибридизационный анализ (МГА)
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
ПЦР в реальном времени
ДНК-чипы
Экспериментальная часть
Глава 3. Разработка и усовершенствование методов препаративного 51 выделения вирусов растений и получение моноспецифических анти сывороток
Препаративное выделение вируса кольцевой пятнистости малины 57 Препаративное выделение неповирусов черной кольцевой пятнистости томатов и вируса мозаики арабиса Препаративное выделение латентного вируса кольцевой пятнистости 61 земляники
Препаративное выделение вируса некроза табака
Препаративное выделение вируса А картофеля
Препаративное выделение вируса шарки (оспы) сливы
Препаративное выделение вирусов X картофеля, табачной мозаики,
Y картофеля и крапчатости гвоздики
Препаративное выделение вируса мягкой мозаики фасоли
Определение таксономического положения ВММФ
Глава 4. Разработка тест-систем для иммуноферментного определения 83 вирусов растений
Аналитические характеристики тест-системы для диагностики вируса шарки сливы
Аналитические характеристики тест-систем для диагностики 93 вирусов картофеля
Аналитические характеристики тест-систем для диагностики неповирусов
Аналитические характеристики тест-систем для диагностики вирусов некроза табака, мягкой мозаики фасоли, табачной мозаики и крапчатости гвоздики Разработка и характеристика наборов для диагностики вирусов картофеля и вируса шарки сливы
Глава 5. Определение вирусов растений методом виробактериальной агглютинации (АБВ-тест)
Глава 6. Разработка имунохроматографических тест-систем для диагностики вирусов растений
Конструирование и оптимизация тест-полосок
Определение аналитических характеристик тест-полосок
Апробация тест-полосок для анализа зараженности растений картофеля 126 Разработка набора для внелабораторного применения тест-полосок
Глава 7. Определение вирусов растений с помощью МГА-ИФА-технологии 129 Разработка нового метода экстракции нуклеиновых кислот из вирусных частиц и растений с помощью трихлорацетата аммония Аналитические характеристики МГА-ИФА-технологии и ее применение для определения вирусов растений Разработка ОТ-ПЦР-МГА-ИФА-технологии для диагностики вирусов
Глава 8. Диагностика вируса шарки сливы с помощью полимеразной цепной реакции
Глава 9. Диагностика вирусов и вироида картофеля с помощью ДНКмикроплаты
Глава 10. Применение разработанных методов диагностики для решения 165 практических задач безвирусного растениеводства
Диагностика вирусных инфекций в элитном семеноводстве картофеля 165 Диагностика вирусных инфекций плодовых и ягодных культур для получения безвирусного посадочного материала Применение тест-системы для диагностики вируса шарки сливы в карантинных исследованиях Диагностика вирусных инфекций цветочно-декоративных культур для 173 получения безвирусного посадочного материала
Глава 11. Индукция у растений устойчивости к заражению вирусами
Характеристика противовирусной устойчивости, индуцированной 178 хитозаном
Роль структуры в противовирусной активности хитозана
Изучение механизма противовирусной активности хитозана
Введение Диссертация по биологии, на тему "Иммунохимическая и молекулярная диагностика вирусных инфекций растений"
Вирусные инфекции культурных растений вызывают ощутимые потери урожая, заметно ухудшают качество сельскохозяйственной продукции и все чаще рассматриваются как серьезная угроза продовольственной безопасности. Эта проблема касается всех продовольственных, кормовых и технических культур, возделываемых в любом регионе мира, и особенно актуальна для вегетативно размножаемых растений, поскольку прогрессирующее накопление вирусов в ряду поколений приводит к полному заражению и вырождению сорта. Ежегодные убытки (когда их удается оценить), причиняемые вирусами одной культуре в определенном регионе, нередко выражаются сотнями миллионов и миллиардами долларов (Кеглер и др., 1986; Hull & Davies, 1992; Waterworth & Hadidi, 1998; Strange & Scott, 2005).
Прогнозируется, что в обозримом будущем роль вирусных заболеваний растений будет возрастать. Глобализация сельского хозяйства, развитие международной торговли продуктами растениеводства и расширение международного обмена семенным и посадочным материалом способствуют интродукции вирусов в новые регионы. Особую опасность в этом отношении могут представлять цветочно-декоративные культуры, часто зараженные комплексом вирусов, в связи с огромными объемами торговли и динамично меняющимся разнообразием видов, вовлеченных в обмен. При этом возникают резервуары новых для данного региона вирусных инфекций, имеющих экономическое значение также для продовольственных и садоводческих культур. Среди обнаруженных за последнее десятилетие новых (emerging) инфекционных болезней растений почти половина имеет вирусную природу. Непрерывно увеличивается число известных вирусов, а глобальное потепление расширяет ареалы насекомых — переносчиков и способствует увеличению их численности (Thresh, 1982; Rodoni, 2007; Boonham et al., 2007).
С другой стороны, мировая практика показывает, что использование свободного от вирусов («безвирусного») семенного и посадочного материала позволяет на десятки процентов повысить продуктивность сельскохозяйственных культур (Foster & Hadidi, 1998; Waterworth & Hadidi, 1998). Такая возможность интенсификации растениеводства особенно актуальна в связи с прогнозируемым ростом потребности в продовольственных, кормовых и топливных ресурсах (Edgerton, 2008). Для радикального снижения вредоносности вирусных инфекций необходим перевод растениеводства на безвирусную основу.
В настоящее время производство безвирусного семенного и посадочного материала основано главным образом на выбраковке зараженных и отборе здоровых растений с целью их последующего размножения. Очевидно, что для осуществления такого отбора необходимо располагать чувствительными методами массовой диагностики вирусов.
При тотальном заражении сорта, когда отбор неэффективен, растения оздоравливают от вирусов с помощью термотерапии и культуры меристем. Однако, существующие методы оздоровления не гарантируют полного избавления от патогена. Поэтому все этапы получения безвирусных растений должны сопровождаться анализами на присутствие вирусов с помощью высокочувствительных методов лабораторной диагностики вирусных инфекций.
Полученные здоровые растения поддерживаются в условиях защиты от повторного заражения и перед дальнейшим размножением подлежат сертификации, т.е. определению соответствия степени их зараженности требованиям государственных и отраслевых стандартов. Процедура сертификации предполагает тестирование большого количества образцов за короткое время, т.е. требует наличия быстрых и чувствительных методов массовой диагностики вирусных инфекций.
Поскольку безвирусное растениеводство обычно сосуществует с традиционными технологиями, при размножении, безвирусных растений не исключено их повторное заражение ввиду высокого инфекционного фона. Для постоянного мониторинга вирусных инфекций в насаждениях культурных растений (и в окружающей дикорастущей флоре) с целью своевременного выявления и ликвидации очагов инфекции, ограничения распространения вирусов и предупреждения эпифитотий нужны чувствительные методы точной идентификации вирусов.
Хорошо известно, что возделывание устойчивых сортов существенно снижает урон от вирусных заболеваний. Для обеспечения селекционной и генноинженерной работы по выведению новых сортов, устойчивых к вирусам, и изучения механизмов противовирусной устойчивости необходимы высокочувствительные методы лабораторной диагностики вирусных инфекций.
Важнейшую роль в предупреждении распространения вирусных инфекций играет карантинный контроль продукции растениеводства, особенно импортируемого семенного и посадочного материала. Для предотвращения интродукции вирусов карантинная служба должна располагать быстрыми и чувствительными методами их диагностики.
Таким образом, массовая диагностика вирусных инфекций является ключевой задачей безвирусного растениеводства, успешное решение которой зависит от доступности быстрых, чувствительных, специфичных, легко-выполнимых и недорогих методов детекции и идентификации вирусов. Следует подчеркнуть, что, как показывает весь мировой опыт, затраты на диагностику несоизмеримы с потерями от заражения вирусами и с расходами на искоренение инфекции (Martin et al., 2000).
В России большинство вегетативно размножаемых культур хронически заражено вирусами (Атабеков, 1984). Повсеместное использование зараженного семенного материала является главной причиной того, что Россия занимает одно из последних мест в мире по урожайности картофеля. Отмечается распространение и возрастание вредоносности тяжелых форм вирусного заражения на многих сортах картофеля, находящихся в хозяйственном и торговом обороте. В ряде случаев вызываемые ими потери достигают 90% (Малько и др., 2003; Симаков, 2004; Анисимов и др., 2005). Вирусные заболевания существенно снижают продуктивность плодовых, ягодных и овощных культур, возделываемых в РФ (Кашин, 2001; Белошапкина, 2005; Ахатов и др., 2006). Серьезной фитосанитарной проблемой для нашей страны является интродукция из-за рубежа зараженного семенного и посадочного материала (Санин и Филиппов, 2003).
Осознание значимости и масштабов проблемы вирусных инфекций сельскохозяйственных культур и начало работ по» оздоровлению, развернувшихся в бывшем СССР в начале 80-х годов, показало, что важнейшее звено этой работы — массовая диагностика вирусных инфекций — в нашей стране практически не было обеспечено.
Единственным методом массовой лабораторной диагностики фитопатогенных вирусов был в то время серологический метод, основанный на преципитации вирусных частиц антителами иммунной сыворотки в жидкой среде (т.н. «drop precipitation test», известный в России как «капельный метод диагностики»), который использовали для выявления четырех вирусов картофеля в листьях сильно зараженных растений. Однако, чувствительность капельного метода оказалась недостаточна для выявления вирусов в пробирочных растениях, получаемых при оздоровлении сорта методом культуры меристем. Поэтому его применение на ранних стадиях оздоровления и вегетативного размножения оздоровленного материала было неэффективным. Кроме того, ассортимент имеющихся антисывороток совершенно не отвечал реальным потребностям безвирусного растениеводства.
В то же время, в связи с ростом экономического значения вирусных инфекций, увеличением объема анализов и количества подлежащих определению вирусов существенно возрастали требования к чувствительности и специфичности методов массовой диагностики, обеспечивающих однозначность получаемых результатов. Первостепенное значение приобретала производительность метода, т.е. возможность выполнять большое количество анализов за короткое время, которая определяется не только скоростью выполнения анализа и подготовительных процедур, но и удобством в работе при массовом применении. Все большее внимание уделялось созданию таких методов анализа, которые позволяют одновременно выявлять все известные или, по крайней мере, наиболее вредоносные вирусы данной культуры в одном образце, что существенно ускоряет и удешевляет процедуру лабораторной диагностики. Отчетливо обозначилась потребность в быстрых и простых методах внелабораторного анализа, которые дают возможность проводить анализ самостоятельно, непосредственно в месте нахождения образца, и для применения которых не требуется высокой профессиональной подготовки.
Таким образом, было совершенно очевидно, что для устойчивого развития безвирусного растениеводства в РФ необходима разработка новых высокочувствительных, производительных и надежных методов диагностики и средств для их применения с учетом реальных запросов сельскохозяйственной практики, нормативной базы отрасли и современных тенденций в развитии методов массовой ~ диагностики вирусных инфекций растений.
Целью наших исследований* являлась разработка высокочувствительных методов массовой экспресс-диагностики вирусных инфекций сельскохозяйственных культур для развития безвирусного растениеводства в РФ.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1) Усовершенствование известных и разработка новых эффективных методов препаративного выделения вирусов важнейших сельскохозяйственных культур с целью получения высокоочищенных вирусных препаратов и моноспецифических кроличьих антисывороток с высоким титром; >
2) Разработка методов лабораторной диагностики вирусных инфекций картофеля, плодовых, ягодных, овощных и цветочно-декоративных культур на основе иммуноферментного анализа, полимеразной цепной реакции и дот-гибридизации;
3) Разработка методов внелабораторной диагностики вирусных инфекций на основе реакции агглютинации и иммунохроматографического анализа, а также наборов для иммуноферментного определения основных вирусов картофеля и вируса шарки сливы;
4) Практическое применение разработанных методов и средств диагностики вирусных инфекций для оздоровления, контроля качества и сертификации семенного и посадочного материала картофеля, плодовых, ягодных и цветочных культур, а также для изучения распространенности ряда вирусных инфекций.
5) Изучение возможности индукции у растений устойчивости к вирусным инфекциям с помощью биогенного элиситора (хитозана).
Обзор литературы
К настоящему времени разработаны различные методы детекции вирусов, большинство из которых основано на обнаружении вирусспецифических антигенов (иммунохимические методы) или вирусной нуклеиновой кислоты (молекулярные методы) (Cheng et al., 2009). Однако, с учетом поставленных в диссертационной работе задач, целесообразно проанализировать в первую очередь те из них, которые широко используются для массовой диагностики вирусных инфекций растений или имеют необходимый для этого потенциал.
Безусловно доминирующими в лабораторной диагностике вирусов являются метод иммуноферментного анализа (ИФА), различные варианты полимеразной цепной реакции (ПЦР) и молекулярно-гибридизационный анализ (МГА) ввиду их высокой чувствительности, специфичности и производительности. Для одновременного выявления нескольких патогенов в одном образце предложены различные технические решения, из которых наиболее перспективным представляется развитие чиповой технологии. Ведущую роль среди методов внелабораторной диагностики играет в настоящее время метод иммунохроматографии (ИХА) в пористых мембранах (тест-полосках).
Таким образом, предметом данного обзора является сопоставление аналитических характеристик, диагностического потенциала и ближайших перспектив этих методов для массовой диагностики вирусных инфекций растений.
Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Чирков, Сергей Николаевич
Выводы
1. Разработаны тест-системы на основе планшетного сэндвич-варианта ИФА для лабораторной диагностики основных вирусов картофеля (ХВК, SBK, МВК, YBK, АВК, ВСЛК), неповирусов (ВКПМ, ВМА, ВЧКПТ), а также ЛВКПЗ, ВШС, ВНТ, ВТМ, ВММФ и ВКГ. Аналитические характеристики тест-систем позволяют определять перечисленные вирусы в концентрации до 1 нг/мл в очищенном препарате и с высокой специфичностью выявлять зараженные растения картофеля, овощных, ягодных, плодовых и цветочных культур.
2. Для экспресс-диагностики фитовирусов во внелабораторных условиях разработаны метод виробактериальной агглютинации (АБВ-тест), основанный на коагглютинации вирусных частиц и клеток Staphylococcus aureus, покрытых антителами к вирусу, и метод иммунохроматографии на тест-полосках, основанный на применении поликлональных антител и наночастиц коллоидного золота в качестве маркера. Методы позволяют выявлять вирусы с чувствительностью до 80 нг/мл за 2 — 10 мин и проводить анализ без вспомогательного оборудования как специалистами, так и лицами без профессиональной подготовки.
3. На основе иммуноферментного анализа с использованием неорганической пирофосфатазы E.coli в качестве ферментной метки разработаны наборы реагентов для определения основных вирусов картофеля, а также вируса шарки сливы, содержащие все необходимое для выполнения анализа.
4. Разработан способ экстракции РНК из вирусных частиц и из растений, основанный на выделении нуклеиновых кислот с помощью нового хаотропного агента трихлорацетата аммония и очистке РНК с помощью целлюлозного сорбента на основе хлопковой ваты. Способ не требует применения токсичных соединений и позволяет получать РНК высокого качества при комнатной температуре. Процедура получения очищенного препарата РНК из одного образца занимает 30 мин.
5. Разработан метод определения вирусов растений с помощью дот-гибридизации с кДНК-зондами, меченными (диен)Р1, и последующем выявлении образующихся гетеродуплексов в непрямом ИФА с помощью антител, специфичных к (диен)Р1. Метод позволяет выявлять до 10 пг вирусной РНК в образце объемом 1 мкл и, в силу его высокой чувствительности, специфичности и производительности, пригоден для массовой диагностики вирусных заболеваний растений.
6. Разработан метод диагностики вируса шарки сливы, основанный на применении полимеразной цепной реакции. При наличии в образце вируса амплифицированный фрагмент гена Nib (репликазы) идентифицируется в агарозном геле как зона размером 560 пар нуклеотидов. Метод позволяет выявлять вирус в пробирочных растениях косточковых культур.
7. Для одновременной диагностики вирусов и вироида картофеля разработан прототип ДНК-чипа - ДНК-микроплата, в ячейках которой фиксированы рекомбинантные ДНК, комплементарные РНК определяемого патогена. ДНК-микроплата позволяет выявлять меченную (qneH)Pt РНК вируса или вироида в концентрации не менее 10 пг/мкл. Применение ДНК-микроплаты позволяет обеспечить, значительно ускорить и существенно удешевить процедуру сертификации семенного картофеля.
8. Разработанные тест-системы для диагностики вирусных инфекций растений с помощью ИФА и АБВ-теста были широко использованы в Системе сертификации семян Минсельхоза РФ, производителями безвирусного посадочного материала в России, Белоруссии и на Украине для контроля качества и производства безвирусного посадочного материала картофеля, плодовых, ягодных и цветочно-декоративных культур и Федеральной службой карантина растений РФ для диагностики карантинного вируса шарки сливы.
9. Установлено таксономическое положение вируса мягкой мозаики фасоли (ВММФ). Изучение структуры вирусной частицы и вирусного генома, а также состава белковых продуктов, образующихся при трансляции вирионной РНК in vitro, позволили отнести ВММФ к представителям рода Carmovirus.
10. Показана возможность индукции противовирусной устойчивости у различных видов растений хитозаном. Протективный эффект опосредован влиянием хитозана на растение и зависит от вида растения, концентрации и молекулярной формы хитозана.
Заключение
Перспективы развития безвирусного растениеводства в РФ определяются доступностью для сельскохозяйственной практики надежных методов массовой экспресс-диагностики вирусных инфекций растений.
Результатом проведенных исследований явилась разработка нескольких методов определения вирусов, основанных на принципе иммуноферментного анализа, дот-гибридизации, полимеразной цепной реакции, агглютинации и иммунохроматографии, которые, в силу их высокой чувствительности, специфичности и производительности, позволяют с высокой достоверностью выявлять зараженные растения различных сельскохозяйственных культур на всех стадиях производства безвирусного семенного и посадочного материала. Ряд усовершенствований процедуры диагностики и применение новых технических решений, таких как ДНК-микроплата и способ выделения вирусных РНК с помощью трихлорацетата аммония, существенно облегчают повседневное практическое применение этих методов.
Создание наборов для иммуноферментного определения вирусов и иммунохроматографических тест-систем дает возможность производителям безвирусного материала самостоятельно и постоянно контролировать его качество, а службам фитосанитарного надзора и карантинного контроля быстро и эффективно осуществлять диагностику во внелабораторных условиях, непосредственно в месте нахождения образца. Таким образом, применение наборов и тест-полосок позволяет расширить сферу, географию и масштабы мониторинга вирусных инфекций растений и способствует радикальному повышению его эффективности.
Широкое применение разработанных методов диагностики в Системе сертификации семян РФ, производителями безвирусного посадочного материала и службой карантина растений РФ позволяло осуществлять эффективный контроль экономически значимых вирусных инфекций и получать высококачественный семенной и посадочный материал картофеля, плодовых, ягодных и цветочно-декоративных культур.
Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Чирков, Сергей Николаевич, Москва
1. Амбросова С.М., Малофеева Ю.С., Дзиркале JI.T. 1994. Характеристика моноклоиальных антител к вирусу аспермии томатов и их применение в диагностике. Биоорг. химия 20, 1169 1174.
2. Анисимов Б.В. 2003. Состояние семеноводства и проблемы обеспечения качества оригинального, элитного и репродукционного семенного картофеля. Агр. Россия № 3, 5 — 9.
3. Анисимов Б.В., Усков А.И., Симаков Е.А., и др. 2005. Методика проведения полевых обследований и послеуборочного контроля качества семенного картофеля. М.: «ИКАР». -112 с.
4. Атабеков И.Г. 1984. Иммунодиагностика вирусов растений — резервные миллиарды в сельском хозяйстве. Биотехнология. М.: Наука, 234 238.
5. Атабеков И.Г., Чирков С.Н. 1985. Методические рекомендации по применению реакции виробактериальной агглютинации (АБВ-теста) для диагностики вирусов растений. М.: ВАСХНИЛ 20 с.
6. Атабеков И.Г., Морозов С.Ю., Дрыгин Ю.Ф., Кондакова О.А., Савенков Е.И., Можаева К.А., Васильева Т.Я., Кастальева Т.Б. 1999. Методические указания по диагностике вироида веретеновидности клубней картофеля. М.: РАСХН, ВНИИФ, МГУ, ВНИИКХ. 24 с.
7. Ахатов А.К., Джалилов Ф.С., Белошапкина О.О., Стройков Ю.М., Чижов В.Н., Трусевич А.В. 2006. Защита овощных культур и картофеля от болезней. М. — 352 с.
8. Банникова Г.Е., Тимофеева Г.Н., Лопатин С.А., Варламов В.П., Рогожин С.В. 1988. Лигандообменная хроматография бактериальной эндонуклеазы Serratia marcescens. Биотехнология 4,231-234.
9. Барский В.Е. Колчинский A.M., Лысов Ю.П., Мирзабеков А.Д. 2002. Биологические микрочипы, содержащие иммобилизованные в гидрогеле нуклеиновые кислоты, белки и другие соединения: свойства и приложения в геномике. Мол. биол., 36, 563 584.
10. Белошапкина О.О. 2005. Биологические и технологические основы оздоровления посадочного материала земляники от вирусов. М.: Изд-во МСХА.- 162 е.
11. Бобкова А.Ф., Чирков С.Н. 1983. Применение иммуноферментного анализа для диагностики вирусных заболеваний растений. Сельскохоз. биол., № 5, 32 — 36.
12. Бобкова А.Ф., Нацвлишвили Н.М.,. Новиков В.К., Дзантиев Б.Б., Егоров A.M., Атабеков И.Г. 1985. Диагностика Y-вируса картофеля методом иммуноферментного анализа. Изв. АН СССР, сер. биол. № 1, 128-133
13. Бобкова А.Ф., Нацвлишвили Н.М., Чирков С.Н., Сургучева Н.А., Варицев Ю.А., Атабеков И.Г. 1987. Характеристика отечественных коммерческих, антисывороток к вирусам картофеля в АБВ-тесте и иммуноферментном анализе. Изв. АН СССР, сер. биол., № 1, 28-34.
14. Брок И. 1979. Выделение иммуноглобулина G. Иммунологические методы. Под ред. Х.Фримеля. М.: Мир, 264 273.
15. Бунцевич JI.JI. 2004. Изучение восприимчивости различных сортов сливы к вирусу шарки. Плодоводство и ягодоводство России. Т. XI, 361-364.
16. Быкова В.М., Немцев С.В. 2002. Сырьевые источники и способы получения хитина и хитозана. Хитин и хитозан: получение, свойства и применение. Под ред. К.Г.Скрябина, Г.А.Вихоревой, В.П.Варламова. М.: Наука, 7 - 23.
17. Вердеревская Т.Д., Маринеску В.Г. 1985. Вирусные и микоплазменные заболевания плодовых культур и винограда. Кишинев: Штиинца — 312 с.
18. Вуд К.Р. 1989. Методы культуры тканей в фитопатологии: вирусы. Биотехнология' растений: культура клеток. Под ред. Р.Г.Бутенко. М.: Агропромиздат, 234 — 258.
19. Гамзазаде А.И. 2002. Структурная неоднородность как фактор изменчивости свойств хитина и хитозана. Хитин и хитозан: получение, свойства и применение. Под" ред. К.Г.Скрябина, Г.А.Вихоревой, В.П.Варламова. — М.: Наука, 112—118.
20. Гиббс А., Харриеон Б. Основы вирусологии растений. М.': Мир, 1978. 430 с.
21. Гнутова Р.В. 1993. Серология и иммунохимия вирусов растений. М.: Наука. — 301 с.
22. Гнутова Р.В. 2005. Стратегия подходов при изучении вирусов, поражающих картофель в дальневосточном регионе. Сельскохоз. биол., № 1, 46 54.
23. ГОСТ 29267-91. Картофель семенной. Одоровленный исходный материал. Приемка и методы анализа.
24. ГОСТ 29268-91. Картофель семенной. Оздоровленный семенной f материал. Технические условия.
25. Демидова А.А. 2001. Ставропольский центр производства безвирусного картофеля. Картофель и овощи, №1,10—11.
26. Дзантиев Б.Б., Жердев А.В., Попов В.О., Венгеров Ю.Ю., Старовойтова Т.А., Тогузов Р.Т. 2002. Системы экспрессной иммунодетекции биологически активных соединений. Клин. лаб. диагн., № 8, 25-32.
27. Дрампян А.Х., Бобкова А.Ф., Новиков В.К., Атабеков И.Г. 1986. Диагностика вируса скручивания листьев картофеля методом иммуноферментного анализа. Докл. ВАСХНИЛ №9; 20-22.
28. Дрыгин Ю.Ф., Афонина И.А., Байер К., Николаева О.В., Атабеков И.Г. 1989. Детекция Х- и М-вирусов картофеля с помощью ДНК-зондов, меченных пероксидазой хрена. Биоорг. химия 15, 947-951.
29. Дыкман JI.A., Богатырев В.А. 1997. Коллоидное золото в твердофазных методах анализа. Биохимия 62, 411—418.
30. Дымшиц Г.М. 2001. Нерадиоактивно меченые олиго- и полинуклеотидные зонды -инструмент изучения структуры генома и диагностики. Сорос, обр. журнал № 9, 30 37.
31. Ерохина Т.Н. 1995. Моноклональные антитела к вирусу желтой карликовости ячменя. Иммуноферментная тест-система для диагностики вируса. Биоорг. химия 21, 35 -41.
32. Ильина А.В., Варламов В.П. 2002. Энзимология синтеза и деградации хитина и хитозана. Хитин и хитозан: получение, свойства и применение. Под ред. К.Г.Скрябина, Г.А.Вихоревой, В.П.Варламова. М.: Наука, 79 - 90.
33. Ильина А.В., Ткачёва Ю.В., Варламов В.П. 2002. Деполимеризация высокомолекулярного хитозана ферментным препаратом целловиридин Г20х. Прикл. биохим. микробиол., 38, 132-135.
34. Кастальева Т.Б., Можаева К.А. 2002. Оптимизация методики определения вируса желтой карликовости ячменя с помощью иммуноферментного анализа. Вестн. защиты растений 2, 49 52.
35. Каплан И.Б., Тальянский М.Э., Алексеева К.Л., Атабеков И.Г. 1986. Методические указания по иммунодиагностике и профилактике вирусных болезней шампиньонов. М.: ВАСХНИЛ, МГУ-21 с.
36. Кашин В.И., ред. 2001. Технологический процесс получения безвирусного посадочного материала плодовых и ягодных культур. Методические указания. М.:ВСТИСП. 109 с.
37. Кеглер X., Клейнхемпель X., Эртель К., Презелер Г., Шимански Х.-Х., Шмидт X., Шпаар Д., Вердеревская Т.Д. 1986. Борьба с вирусными болезнями растений. М.: Агропромиздат. — 480 с.
38. Киселева В.И., Турчинский М.Ф., Колесник Т.В., Поверенный A.M., 1994. Использование диэтилентриаминхлорплатины в гибридизационном анализе специфических последовательностей нуклеиновых кислот. Биоорг. химия 20, 14 — 20.
39. Козлов Л.П., Хазенсон С.Л., Обручков B.C., Шосталь В.П. 1983. АБВ-тест -высокочувствительная реакция для быстрой диагностики вирусов картофеля и овощных культур. Биол. науки № 5, 109 —111.
40. Кондакова О.А., Дрыгин Ю.Ф. 1999. Диагностика вироидного заболевания картофеля зондами (диен)Р^ДНК. Биотехнология № 4, 83 90.
41. Кондакова О.А., Дрыгин Ю.Ф., Мусин С.М., Бойко В.В., Бабоша А.В., Атабеков И.Г., 2000. Проблема вироида в семеноводстве картофеля: диагностика, формирование генобанка, производство исходного материала. Картофель и овощи № 2, 38 40.
42. Куликов С.Н., Варламов ВП. 2008. Роль структуры в элиситорной активности хитозана. Уч. зап. Казанского гос. университета 150, 1-16.
43. Куст С.В. 2002а. Различные методы выделения очищенного препарата ВТМ. Практикум по общей вирусологии. Под ред. И.Г.Атабекова. М.: Изд-во МГУ, 52 - 58.
44. Куст С.В. 20026. Выделение очищенного препарата Х-вируса картофеля (ХВК). Практикум по общей вирусологии. Под ред. И.Г.Атабекова. М.: Изд-во МГУ, 58 - 60.
45. Кэтти Д., Райкундалиа Ч. 1991. Иммуноферментный анализ. Антитела. Методы. В 2-х кн. Кн.2. Под ред. Д.Кэтти. М.:Мир, 152 - 238.
46. Малько А.М., Анисимов Б.В., Трофимов Н.В., и др. 2003. Контроль качества и сертификация семенного картофеля (практическое руководство). М.: ФГНУ «Росинформагротех». 316 с.
47. Метлицкая К.В., Приходько Ю.Н., Цубера Л.В. 1997. Вирусные болезни сливы в средней полосе России и вопросы совершенствования технологии получения безвирусных клонов этой культуры. Плодоводство и ягодоводство России. Т. IV, 90-95.
48. Метлицкая К.В. 1999. Распространенность сокопереносимых вирусов на косточковых культурах в Центральной России. Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями. М., 154-155.
49. Метлицкая К.В. 2000. Вирусные болезни косточковых пород в Европейской части России. Плодоводство и ягодоводство России. T.VII, 237-242.
50. Метлицкая К.В., Холод Н.А. 2001. Диагностика и распространенность вирусных болезней косточковых пород в Европейской части России. Теория и практика борьбы спаразитарными болезнями. М., 158-160.
51. Мусин С.М., Бабоша А.В., Кондакова О.А., Дрыгин Ю.Ф., Атабеков И.Г. 2001. Диагностика и контроль вироида веретеновидности клубней картофеля. Защита и карантин растений № 10, 22 23.
52. Николаева О.В., Новиков В.К., Каграманов В.Н., Бобкова А.Ф., Атабеков И.Г. 1985. Определение М и S-вирусов картофеля методом иммуноферментного анализа. Сельскохоз. биол., № 2, 96-102
53. Одинец А.Г., Кулинич А.В., Чирков С.Н., Козицкий Ю.Н., Атабеков И.Г. 1983. Сравнительное испытание иммунологических методов для массовой диагностики вируса крапчатости гвоздики. Сельскохоз. биол., № 5, 37-41.
54. Озерецковская O.JL, Роменская И.Г. 1996. Олигосахарины как регуляторные молекулы растений. Физиол. раст., 43, 743 752.
55. Озерецковская О.Л., Васюкова Н.И., Зиновьева С.В. 2002. Хитозан как элиситор индуцированной устойчивости растений. Хитин и хитозан: получение, свойства и применение. Под ред. К.Г.Скрябина, Г.А.Вихоревой, В.П.Варламова. М.: Наука, 339 -345.
56. Озерецковская О.Л., Васюкова Н.И., Панина Я.С., Чаленко Г.И. 2006. Действие иммуномодуляторов на устойчивость и восприимчивость картофеля к Phytophthora infestans. Физиол. растений 53, 546-553.
57. Практикум по общей вирусологии. Под ред. И.Г.Атабекова. М.: МГУ, 2002. - 184 с.
58. Приходько Ю.Н., Чирков С.Н., Метлицкая К.В., Цубера Л.В. 2008. Распространенность вирусных болезней косточковых культур в европейской части России. Сельскохоз. биол., № 1, 26 — 32.
59. ПЦР в реальном времени. Под ред. Д.В.Ребрикова. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний. 2009.-215 с.
60. Рязанцев Д.Ю., Завриев С.К. 2009. Эффективный метод диагностики и идентификации вирусных патогенов картофеля. Мол. биол., в печати.
61. Санин С.С., Филиппов А.В. 2003. Проблемы фитосанитарии. Защита и карантин растений № 1, 10-12.
62. Сибирякова И.В., Гнутова Р.В., Толкач В.Ф., Рублева Н.В., Чуян А.Х., Крылов А.В. 1987. Биологические свойства местного изолята вируса некроза табака и получение специфических антисывороток. Сельскохоз. биол., № 5, 55 60.
63. Симаков Е.А. 2004. О совершенствовании научного обеспечения производства оригинального, элитного и репродукционного семенного картофеля в России. М.: ВНИИКХ. 31 с.
64. Ситник Т.С., Аваева С.М. 2007. Связывание субстрата в эффекторном центре пирофосфатазы увеличивает скорость гидролиза субстрата в активном центре. Биохимия 72, 80-90.
65. Трофимов Н.В., Уланов В.И., Кокина Т.П., Анисимов Б.В., Семенова JI.H. 2003. Система классификации и схема сертификации семенного картофеля в России и странах ЕС. Агр. Россия № 3, 10 14.
66. У сков А.И. 2003. Лабораторная идентификация вирусных и бактериальных фитопатогенов в системе контроля качества и сертификации семенного картофеля. Агр. Россия №3,21 -23.
67. Усов А.И. 1993. Олигосахарины — новый класс сигнальных молекул в растениях. Успехи химии 62, 1119 1144.
68. Халл Р. 1988. Очистка, биофизическая и биохимическая характеристика вирусов (преимущественно вирусов растений). Вирусология. Методы. Под ред Б.Мейхи. М.: Мир, 12 - 43.
69. Харбоу Н., Ингильд А. 1977. Иммунизация, выделение иммуноглобулинов, определение титра антител. Руководство по количественному иммуноэлсктрофорезу. Методы и применение. Под ред. Акссльсен Н., Крелль Й., Вееке Б. М: Мир, 200 - 205.
70. Цуканова Е.М. 1998. Состояние насаждений вишни и сливы в ЦЧР и выращивание безвирусного посадочного материала. Автореф. канд. дис. Мичуринск.
71. Чирков С.Н., Осипов А.П., Атабеков И.Г. 2002. Наборы «Пиротест» для лабораторной диагностики вирусов картофеля. Картофель и овощи № 15 29.
72. Шутская О.В., Бардышев М.А. 1978. Нарушение метаболизма минеральных веществ у растений картофеля при поражении А-вирусом. Защита растений (Минск) № 2, 32-38.
73. Adams A.N., Davies D.L., Kirby M.J. 2001. Virus and phytoplasma detection in fruit trees. Outlook in Agriculture 30, 45 54.
74. Agindotan В., Perry К. 2007. Maeroarray detection of plant RNA viruses using randomly primed and amplified complementary DNAs from infected plants. Phytopathology 97, 119 — 127.
75. Agindotan В., Perry K. 2008. Maeroarray detection of eleven potato-infecting viruses and Potato spindle tuber viroid. Plant Dis., 92, 730 740.
76. Al Rwahnih M., Myrta A., Herranz M.C., Pallas V. 2004. Monitoring american plum line pattern virus in plum by ELISA and dot-blot hybridization throughout the year. J. Plant Pathol., 86, 167- 169.
77. Alsberheim P., Darvill A., Augur A., Cheong J.J., Eberhard S., Hahn M.G., Marfa V., Mohnen D., O'Neil M.A., Spiro M.D., York W.S. 1992. Oligosaccharins: oligosaccharide regulatory molecules. Acc. Chem. Res., 25, 77 83.
78. Anes-Lingerfclt M., Fox G.E., Willson R.C. 2009. Reduction of DNA contamination in RNA samples for reverse transcription-polymerase chain reaction using selective precipitation by compaction agents. Analyt. Biochem., 384, 79 — 85.
79. Aparico F., Soler S., Aramburu J., Galipienso L., Nuez F., Pallas V., Lopez C. 2009. Simultaneos detection of six RNA plant viruses affecting tomato crops using a single digoxigenin-labelled polyprobe. Eur. J. Plant Pathol., 123, 117— 123.
80. Audy P., Parent J., Asselin A. 1991. A note on four non-radioactive labeling systems for dot hybridization detection of potato viruses. Phytoprotection 72, 81 86.
81. Avrameas S. 1969. Coupling of enzymes to proteins with glutaraldehyde. Immunochemistry 6, 43 — 52.
82. Baranwal V.K., Majumder S., Ahlavat Y.S., Singh R.P. 2003. Sodium sulphite yields improved DNA of higher stability for PCR detection of citrus yellow mosaic virus from citrus leaves. J. Virol. Meth., 112, 153 156.
83. Bartels R. 1971. Potato virus A. CMI/AAB Descriptions of plant viruses, № 54.
84. Baulcombe D., Flavell R.B., Boukton R.E., Gellis G.J. 1984. The sensitivity and specificity of a rapid nucleic acid hybridization method for the detection of potato virus X in crude sap samples. Plant Pathol., 33, 361 370.
85. Baykov A.A., Kasho V.N., Avaeva S.M. 1988. Inorganic pyrophosphatase as a label in heterogeneous enzyme immunoassay. Analyt. Biochem., 171, 271 276.
86. Beemster D., de Bokx J.A. 1987. Survey of properties and symptoms. Viruses of potato and seed-potato production, de Bokx, J.A., van der Want, J.P.H., Eds. Wageningen: Pudoc, 84 -113.
87. Beffa R.S., Hofer R.-M., Thomas M., Meins F., Jr. 1996. Decreased susceptibility to viral disease of P-l,3-glucanase-deficient plants generated by antisense transformation. Plant Cell 8, 1001 1011.
88. Bell A.A. 1981. Biochemical Mechanisms of Disease Resistance. Annu. Rev. Plant Physiology 32, 21 -81.
89. BenhamouN. 1996. Elicitor-induced plant defence pathways. Trends in Plant Sci., 1, 233 —240.
90. Bergervoet J.H.W., Peters J., van Beckhoven J.R.C.M., van den Bovenkamp G.W., Jacobson J.W., van der Wolf J.M. 2008. Multiplex microsphere immuno-detection of potato virus Y, X and PLRV. J. Virol. Meth., 149, 63 68.
91. Bertolini E., Moreno A., Capote N., Olmos A., de Luis A., Vidal E., Peres-Panades J., Cambra M. 2008. Quantitative detection of Citrus tristeza virus in plant tissue and single aphids by real-time PCR. Eur. J. Plant Pathol., 120, 177 188.
92. Billitewski U. 2009. DNA microarrays: an introduction to the technology. Meth. Mol. Biol., 509, 1 14.
93. Boben J., Kramberger P., Petrovic N., Cankar K., Peterka M., Strankar A., Ravnikar M. 2007. Detection and quantification of tomato mosaic virus in irrigation waters. Eur. J. Plant Pathol., 118, 59-71.
94. Boonham N., Walsh K., Mumford R.A., Barker I. 2000. Use of multiplex real-time PCR (TaqMan) for the detection of potato viruses. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 30, 427 430.
95. Boonham N., Walsh K., Smith P., Madagan K., Graham I., Barker I. 2003. Detection of potato viruses using microarray technology: towards a gencrie method for plant viral disease diagnosis. J. Virol. Meth., 108, 181-187.
96. Boonham N., Tomlinson J., Mumford R. 2007. Microarrays for rapid identification of plant viruses. Annu. Rev. Phytopathol., 45, 307 — 328.
97. Boonham N., Glover R., Tomlinson J., Mumford R. 2008. Exploiting generic platform technologies for the detection and identification of plant pathogens. Eur. J. Plant Pathol., 121, 355-363.
98. Boscia D., Zeramdini H., Cambra M., Potere O., Gorris M.T., Myrta A., Di Terlizzi В., Savino V. 1997. Production and characterization of a monoclonal antibody specific to the M serotype of plum pox potyvirus. Eur. J. Plant Pathol., 103, 477 480.
99. Braisted A.C., Wells J.A. 1996. Minimizing a binding domain from protein A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 5688 5692.
100. Brodelius P., Funk C., Haner A., Villegas M. 1989. A procedure for the determination of optimal chitosan concentrations for elicitation of cultured plant cells. Phytochemistry 28, 2651 -2654.
101. Brunt A.A., Martelli G.P. 2008. Carnation mottle virus. CMI/AAB Descriptions of plant viruses, № 420.
102. Bucher G.L., Tarina C., Heinlein M., Di Serio F., Meins F., Jr., Iglesias V.A. 2001. Local expression of enzymatically active class I p-l,3-glucanase enhances symptoms of TMV infection in tobacco. Plant J., 28, 361 369.
103. Bystricka D., Lenz O., Mraz I., Dedic P., Sip M. 2003. DNA microarray: parallel detection of potato viruses. Acta Virologica 47, 41 — 44.
104. Bystricka D., Lenz O., Mraz I., Piherova L., Kmoch S., Sip M. 2005. Oligonucleotide-based microarray: a new improvement in microarray detection of plant viruses. J. Virol. Meth. 128, 176-182.
105. Caciagli P., Bosco D. 1996. Quantitative determination of tomato yellow leaf curl geminivirus DNA by chemiluminescent assay using digoxigenin-labelled probes. J. Virol. Meth., 57, 19-29.
106. Cambra M., Capote N., Myrta A., Llacer G. 2006. Plum pox virus and the estimated costs associated with sharka disease. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 36, 202 204.
107. Cambra M., Boscia D., Myrta A., Palkovics L., Navratil M., Barba M., Gorris M.T., Capote N. 2006. Detection and characterization of plum pox virus: serological methods. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 36, 254 261.
108. Candresse Т., Mac Quaire G., Lanne M., Bousalem M., Quoit-Douine L., Quoit J.B., Dunez L. 1995. Analysis of plum pox virus variability and development of strain-specific PCR assay. Acta Horticulturac 386, 357 369.
109. Candresse Т., Cambra M., 2006. Causal agent of sharka disease: historical perspective and current status of Plum pox virus strain. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 36, 239 246.
110. Canning E.S.G., Penrose M.J., Barker I., Coates D. 1996. Improved detection of barley yellow dwarf virus in single aphids using RT-PCR. J. Virol. Meth., 56, 191 197.
111. Chandelier A., Dubois N., Baelen F., De Leener F., Warnon S., Remacle J., Lepovivre P. 2001. RT-PCR-ELOSA tests on pooled sample units for the detection of virus Y in potato tubers. J.Virol. Meth., 91, 99- 108.
112. Chang S., Puryear J., Caimcy J. 1993. A simple and efficient method for isolating RNA from pine trees. Plant Mol. Biol. Rept., 11, 113 116.
113. Cheng X., Chen G., Rodriguez W.R. 2009. Micro- and nanothcchnology for viral detection. Anal. Bioanal.Chem., 393, 487 501.
114. Chia T.-F., Chan Y.-S., Chua N.-H. 1992. Detection and localization of viruses in orchids by tissue print hybridization. Plant Pathol., 41, 355 361.
115. Chomczynski P. 1993. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. BioTechniqucs 15, 532 537.
116. Clark M.F., Adams A.N. 1977. Characterization of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. J. Gen. Virol., 34, 475 483.
117. Crowther J.H. 2009. Monoclonal antibodies. Methods in Mol. Biol. The ELISA Guidebook 516, 225-289.
118. Danks C., Barker I. 2000. On-site detection of plant pathogens using lateral flow devices. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 30, 421 426.
119. DeDent A.C., McAdow M., Schneewind O. 2007. Distribution of protein A on the surface of Staphylococcus aureus. J. Bacteriology 189, 4473 — 4484.
120. De Roe C., Courtoy P. J., Baudhuin P. 1987. A model of protein-colloidal gold interaction. J. Histohem. Cytochem., 35, 1191 1198.
121. Deyong Z., Willingmann P., Heinze C., Agam G., Pfunder M., Frey В., Frey J.E. 2005. Differentiation of cucumber mosaic virus isolates by hybridization to oligonucleotides in a microarray format. J. Virol. Meth., 123, 101 108.
122. De Wald D.B., Adams L.D., Pearson J.D. 1986. A nonurea electrophoretic gel system for resolurion of polypeptides of Mr 2000 to Mr 200,000. Analyt. Biochem., 154, 502 508.
123. Doares S.H., Syrovets Т., Weiler E.W., Ryan C.A. 1995. Oligogalacturonides and chitosan activate plant defensive genes through the octadecanoid pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 4095 4098.
124. DSMZ Catalogue of Plant Viruses, Antisera and Cloned Nucleic Acids, 1998.
125. Du Z.Y., Chen J.S., Hiruki C. 2005. Optimization and application of a multiplex RT-PCR system for simultaneous detection of five potato viruses using 18S rRNA as an internal control. Plant Disease 90, 185- 189.
126. Du Z., Jin В., Liu W., Chen L., Chen J. 2007. Highly sensitive fluorescent-labelled probes and glass slide hybridization for the detection of plant RNA viruses and viroid. Acta Biochem. Biophys. Sinica 39, 326 334.
127. Dunez J., Ravelonandro M., Candresse T. 1994. Plum pox: advances in research on the disease and its causal agent, and possible means to control. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 24, 537 542.
128. Durrant W.E., Dong X. 2004. Systemic acquired resistance. Annu.Rev.Phytopathol., 42, 185-209.
129. Eads В., Cash A., Bogart K., Costello J., Andrews J. 2006. Troubleshooting microarray hybridization. Meth. Enzymol., 411, 34 49.
130. Edgerton M.D. 2009. Increasing crop productivity to meet global needs for feed, food and fuel. Plant Physiol., 149, 7-13.
131. EPPO, 2004. Diagnostic protocols for regulated pests. Plum pox potyvirus. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 34, 247 256.
132. EPPO, 2004. Diagnostic protocols for regulated pests. Tomato spotted wilt tospovirus, impatiens necrotic spot tospovirus and watermelon silver mottle tospovirus. OEPP Bulletin/EPPO Bulletin 34, 271 279.
133. EPPO, 2006. Diagnostic protocols for regulated pests. Beet necrotic yellow vein virus (benyvirus). OEPP Bulletin/EPPO Bulletin 36, 429 440.
134. Eun A.J.-Ch., Wong S.-K. 2000. Molecular beacons: a new approach to plant virus detection. Phytopathology 90, 269 275.
135. Fabre F., Kervarrec C., Mieuzet L., Riault G., Vialatte A., Jacquot E. 2003. Improvement of Barley yellow dwarf virus PAV detection in single aphids using a fluorescent real time RT-PCR. J. Virol. Meth., 110, 51 - 60.
136. Faoro F., Sant S., Iriti M., Maffi D., Appiano A. 2001. Chitosan-elicited resistance to plant viruses: a histochemical and cytochemical study. Chitin Enzymology. Muzzarelli R.A.A., Ed. Atec Edizioni, 57 62.
137. Flores R., Hernandez C., Martinez de Alba A.E., Daros J.-A., Di Serio F. 2005. Viroids and viroid-host interactions. Annu. Rev. Phytopathol., 43, 117 139.
138. Forsgren A., Sjoquist J., 1966. «Protein А» from Staphylococcus aureus. I. Pseudo-immune reactions with human y-globulin. J. Immunol., 97, 822 — 826.
139. Forsgern A., Forsum U. 1972. Agglutination of Staphylococcus aureus by rabbit sera. Infection and Immunity 5, 524 — 530.
140. Foster J.A., Hadidi A. 1998. Exclusion of plant viruses. «Plant Virus Disease Control». Hadidi A., Khetarpal R.K., Koganezawa H., Eds. St. Paul: APS Press, 208 - 229.
141. Frens G. 1973. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions. Nat. Phys. Sci., 241, 20 22.
142. Gallitelli D. 2004. Nucleic acid-based assay for the diagnosis of viral pathogens. Phytopathol. Mediterr., 43, 221 227.
143. Gentit P., 2006. Detection of Plum pox virus: biological methods. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 36, 251 -253.
144. Geoghegan W.D. 1988. The effect of three variables on adsorbtion of rabbit IgG to colloidal gold. J. Histochem. Cytochem., 36, 401-407.
145. Ghosh A., Dasgupta R., Salerno-Rife Т., Rutgers Т., Kaesberg P. 1979. Southern bean mosaic viral RNA has a 5'-linked protein but lacks 3' terminal poly(A). Nucl. Acids Res., 7, 2137-2146.
146. Gilliland A., Murphy A.M., Carr J.P. 2006. Induced resistance mechanisms. Natural Resistance Mechanisms of Plant to Viruses. G. Loebenstein & J.P.Carr, Eds. Springer, 125 — 145.
147. Glasa M., Candresse T. 2005. Plum pox virus. CMI/AAB Descriptions of plant viruses, №410.
148. Gnutova R.V., Krylov A.V. 1975. Potato A virus diagnosis by serological methods. Phytopath. Z. 83, 311-319.
149. Gratecos D., Astier M., Semeriva M., 1987. A new approach to monoclonal antibody production. In vitro immunization with antigen on nitrocellulose using Drosophila myosin heavy chain as an example. J. Immunol. Meth., 103: 247 252.
150. Gray A.P., Barber M.S. 1994. Purification and biological activity of partially acetylated chitosan oligosaccharides. Plant Physiol. Suppl. 105, 161.
151. Gruden K., Pompe-Novak M., Baebler S., Krecic-Stres H., Toplak N., Hren M., Kogovcek P., Gow L., Foster G.D., Boonham N., Ravnikar M. 2008. Expression microarrays in plant-virus interaction. Meth. Mol. Biol., 451, 583 613.
152. Guilley H., Carrington J.C., Balazs E., Jonard G., Richards K., Morris T.J. 1985. Nucleotide sequence and genome organization of carnation mottle virus RNA. Nucl. Acids Res., 13, 6663-6677.
153. Guo Z., Chen Yu., Zang E., Sadler P.J. 1997. 'N,1sN. Nuclear magnetic resonance studies of [Pt(dien)Cl]+ (dien = diethylentriamine): hydrolysis and reactions with nucleotides. J.Chem.Soc., Dalton Trans., 4107 -4111.
154. Hadidi A., Flores R., Randies J.W., Semancik J.S., Eds. 2003. Viroids. CSIPO Publ. 392pp.
155. Hadidi A., Czosnek H., Barba M. 2004. DNA microarrays and their potential applications for the detection of plant viruses, viroids and phytoplasmas. J. Plant Pathol., 86, 97 104.
156. Hadwiger L.A., Ogawa Т., Kuyama H. 1994. Chitosan polymer sizes effective in inducing phytoalexin accumulation and fungal suppression are verified with synthezied oligomers. Mol. Plant-Microbe Interact., 7, 531 533.
157. Harrison B.D., Murant A.F., Mayo M.A. 1972. Evidence for two functional RNA species in raspberry ringspot virus. J. Gen. Virol. 16, 339 348.
158. Harrison B.D., Murant A.F. 1977. Nepovirus group. CMI/AAB Descriptions of plant viruses, № 185.
159. Harrison B.D., Reavy B. 2002. Potato mop-top virus. CMI/AAB Descriptions of plant viruses, № 389.
160. Hayes R.J., Brunt A.A., Buck K.W. 1988. Gene mapping and expression of tomato bushy stunt virus. J.Gen. Virol., 69, 3047 3057.
161. Helias V., Jaquot E., Guillet M., Le Hingrat Y., Giblot-Ducray D. 2003. Production of recombinant Potato mop-top vims coat protein in Escherichia coli and generation of antisera recognizing native virus protein. J. Virol. Meth, 110, 91 — 97.
162. Henson J.M., French R. 1993. The polymerase chain reaction and plant disease diagnosis. Annu. Rev. Phytopathol., 31, 81 109.
163. Hermanson G.T. 1995. Bioconjugate techniques. London: Acad.Press 785 p.
164. Hill S.A., Jackson E.A. 1984. An investigation of the reliability of ELISA as a practical test for detecting potato leaf roll virus and potato virus Y in tubers. Plant Pathol., 33, 21 — 26.
165. Hinrichs J., Berger S., Shaw J.G. 1997. Induction of antibodies to plant viral proteins by DNA-based immunization. J. Virol. Meth., 66, 195 202.
166. Holland P.M., Abramson R.D., Watson R., Gelfand D.H. 1991. Detection of specific polymerase chain reaction by utilizing the 5' to 3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7276 7280.
167. Howe G.A., Lighter J., Browse J., Ryan C.A. 1996. An octadecanoid pathway mutant (JL5) of tomato is compromised in signaling for defense against insect attack. Plant Cell 8, 2067 -2077.
168. Hsu H. 2009. Development of enzyme linked, tissue blot and dot dlot immunoassays for plant virus detection. Meth.Mol. Biol., 508, 15 25.
169. Hull R. 1976. The behavior of salt-labile plant viruses in gradients of cesium sulphate. Virology 75, 18-25.
170. Hull R., Davies J.W. 1992. Approaches to nonconventional control of plant virus diseases. Crit. Rev. Plant Sci., 11, 17 33.
171. James D., Vagra A., Thompson D., Hayes S. 2003. Detection of a new and unusual isolate of plum pox potyvirus in plum {Primus domestica). Plant Dis., 87, 1119 1124.
172. James D., Vagra A. 2005. Nucleotide sequence analysis of plum pox virus isolate W3174: evidence of a new strain. Virus Res., 110, 143 150.
173. James D., Varga A., Pallas V., Candresse T. 2006. Strategies for simultaneous detection of multiple plant viruses. Can. J. Plant Pathol., 28, 16 29.
174. Jendeberg L., Tashiro M., Tejero R., Lyons B.A., Uhlen M., Montelione G.T., Nilsson B. 1996. The mechanism of binding staphylococcal protein A to immunoglobulin G does not involve helix unwinding. Biochemistry 35, 22 31.
175. Johnson N.P., Macquet J.P., Wiebers J.L., Monsarrat B. 1982. Strucrure of the adducts formed between Pt(dien)Cl.Cl and DNA in vitro. Nucl. Acids Res., 10, 5255 5271.
176. Jones P., Qiu J., Rickwood D. 1994. RNA Isolation and Analysis. Oxford: BIOS. 220 pp.
177. Kassanis B. 1970. Tobacco necrosis virus. CMI/AAB Descriptions of plant viruses, № 14.
178. Kauss H., Jeblick W., Domard A. 1989. The degree of polymerization and N-acylation of chitosan determine its ability to clicit callose formation in suspension cells and protoplasts of Cathranthus roseus. Planta 178, 385 392.
179. Kerlan C. 2006. Potato virus Y. CMI/AAB Descriptions of plant viruses, № 414.
180. Kim S.-K., Rajapakse N. 2005. Enzymatic production and biological activities of chitosan oligosaccharides (COS): a review. Carbohydr. Polymers 62, 357 368.
181. Knoblauch M., van Bel A.J.E. 1998. Sieve Tubes in Action. Plant Cell 10, 35 -50.
182. Kohle H., Jeblick W., Poten F., Blaschek W., Kauss H. 1985. Chitosan-elicited callosenisynthesis in soybean cells as a Ca dependent process. Plant Physiol., 77, 544-551.
183. Kohler G., Milstein C. 1975. Continuous culture of fused cells secrcting antibody of predicted specificity. Nature 256, 495 497.
184. Korschinek I., Himmler G., Sagl R., Steinkeller H., Katinger H.W.D. 1991. A PCR membrane spot assay for the detection of plum pox virus RNA in bark of infected trees. J. Virol. Meth., 31, 139- 145.
185. Kronvall G., Seal U.S., Finstad J., Williams R.C. 1970. Phylogenetic insight into evolution of mammalian Fc fragments of G globulin using staphylococcal protein A. J. Immunol., 104, 140 147.
186. Kronvall G., Quie P.G., Williams R.G., Jr. 1970. Quantitation of staphylococcal protein A: determination of equilibrium constant and number of protein A residues on bacteria. J. Immunol., 104, 273-277.
187. Kronvall G. 1973. A rapid slide agglutination test for typing pneumococci by means of specific antibodies adsorbed to protein A-containing staphylococci. J. Med. Microbiol., 6, 187 -195.
188. Kurstack E., Ed. 1981. Handbook of Plant Virus Infections and Comparative Diagnosis. Amsterdam: Elsevier/North Holland Biomedical Press. 944 p.
189. MacKenzie D.J., McLean M.A., Mukeiji S., Green M. 1997. Improved RNA extraction from woody plants for the detection of viral pathogens by reverse transcription polymerase chain reaction. Plant Dis., 81, 222 226.
190. Maiss E., Timpe U., Brisske A., Jelkmann W., Casper R., Himmler G., Mattanovich D., Katinger H.W. 1989. The complete nucleotide sequence of plum pox virus RNA. J.Gen. Virol., 70,513- 524.
191. Maniatis Т., Fritsch E.F., Sambrook J. 1989. Molecular Cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.
192. Mansky L.M., Andrews R.E., Durand D.P., Hill J.H. 1990. Plant virus lacation in leaf tissue by press blotting. Plant Mol. Biol. Rept., 8, 13 17.
193. Martin R.R., James D., Levesque C.A. 2000. Impact of molecular diagnostic technologies on plant disease management. Annu. Rev. Phytopathol., 38, 207 239.
194. Matic S., Minafra A., Boscia D., da Cunta A.T.P., Martelli G.P. 2009. Production of antibodies to Little cherry virus 1 coat protein by DNA prime and protein boost immunization. J. Virol. Meth., 155, 72-76.
195. Maule A.J., Hull R., Donson J. 1983. The application of spot hybridization to the detection of DNA and RNA viruses in plant tissues. J. Virol. Meth., 6, 215 224.
196. Mavrodieva V., Mock R., Levy L. 2006. Molecular characterization of PPV isolates from plum germplasm illegally imported from Ukraine. 20th International Symposium on Virus and Virus-like diseases of Temperate Fruit Crops, Antalya, Turkey, 112.
197. Menzel W., Jelkmann W., Maiss E. 2002. Detection of four apple viruses by multiplex RT-PCR assays with coamplification of plant mRNA as internal control. J. Virol. Meth., 99, 81 92.
198. Miller G.L. 1959.Use of Dinitrosalicylic Acid Reagents for Determination of Reducing Sugar. Anal. Chem., 31, 426-428.
199. Mizenina O.A., Borisova O.V., Novikov V.K., Evtushenko O.A., Baykov A.A., Atabekov J.G. 1991. Inorganic pyrophosphatase from E. coli as a label for the detection of plant viruses by ELISA. J. Phytopathol., 133, 278-288.
200. Moks Т., Abrahmsen L., Nilsson В., Hellman U., Sjoquist J., Uhlen M. 1986. Staphylococcal protein A consists of five IgG-binding domains. Eur.J.Biochem. 156, 637 643.
201. Morais S., Marco-Moles R., Puchades R., Maquieira A. 2006. DNA microarraying on compact disc surface. Application to the analysis of single nucleotide polymorphisms in plum pox virus. Chem. Commun., 22, 2368 — 2370.
202. Morales F.J., Niessen A.I. 1988. Comparative response of selected Phaseolus vulgaris germ plasm inoculated artificially and naturally with bean golden mosaic virus. Plant Dis., 72, 1020- 1023.
203. Moreno P., Ambros S., Albiach-Marti M.R., Guerri J., Pena L. 2008. Citrus tristeza virus: a pathogen that changed the course of the citrus industry. Mol. Plant Pathol., 9, 251 268.
204. Morris, T. J. and Carrington, J. C. 1988. Carnation mottle virus and viruses with similar properties. The Plant Viruses, Vol. 3, Polyhedral Virions with Monopartite RNA Genome Koenig R., Ed! New York: Plenum Press, 73-112.
205. Morris J., Clover G.R.G., Haiju V.A., Hugo S.A., Henry C.M. 2001. Development of a highly sensitive nested RT-PCR method for beet necrotic yellow vein virus detection. J. Virol. Meth., 95, 163 169.
206. Mullis K.B., Foloona F. 1987. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Meth. Enzymol., 155, 335 — 350.
207. Mumford R., Boonham N., Tomlinson J., Barker I. 2006. Advances in molecular phytodiagnostics new solutions for old problems. Eur. J. Plant Pathol. 116, 1 -19.
208. Murant A.F. 1970a. Arabis mosaic virus. СМ1УААВ Descriptions of plant viruses, № 16.
209. Murant A.F. 1970b. Tomato black ring virus. СМ1УААВ Descriptions of plant viruses, №38.
210. Murant A.F. 1974. Strawberry latent ringspot virus. CMI/AAB Descriptions of plant viruses, № 126.
211. Murant A.F., Mayo M.A., Harrison B.D., Goold R.A. 1972. Properties of virus and RNA components of raspberry ringspot virus. J. Gen. Virol. 16, 327 338.
212. Murant A.F. 1978. Raspberry ringspot virus. CMI/AAB Descriptions of plant viruses, №198.
213. Murant A.F. 1981. Nepoviruses. Handbook of Plant Virus Infections and Comparative Diagnosis. Kurstack E., Ed. Amsterdam: Elsevier/North Holland Biomedical Press, pp. 198 — 238.
214. Murphy J.F. 2006. Applied aspects of induced resistance to plant virus infection. Natural Resistance Mechanisms of Plants to Viruses. Loebenstein G. & Carr J.P., Eds. Springer, 1 — 11.
215. Myrta A., Potere O., Boscia D., Candresse Т., Cambra M., Savino V. 1998. Production of a monoclonal antibody specific to the El Amar strain of plum pox virus. Acta Virologica 42, 248 -250.
216. Myrta A., Potere O., Crescenzi A., Nuzzaci M., Boscia D. 2000. Properties of two monoclonal antibodies specific to the cherry strain of Plum pox virus. J. Plant Pathol., 82, 95 -101.
217. Nakane P.K., Kawaoi A. 1974. Peroxidase-labelled antibody. A new method of conjugation. J. Histochem. Cytochem. 22, 1084- 1091.
218. Nassuth A., Pollari E., Helmeczy K., Stewart S., Kofalvi S.A. 2000. Improved RNA extraction and one-tube RT-PCR assay for simultaneous detection of control plant RNA plus several viruses in plant extracts. J. Virol. Meth., 90, 37 49.
219. Nie X., Singh R.P. 2001. A novel usage of random primers for multiplex RT-PCR detection of virus and viroids in aphids, leaves and tubers. J. Virol. Meth., 91, 37 49.
220. Nikolaeva O.V., Morosov S.Yu., Zakhariev V.M., Skryabin K.G. 1990. Improved dot-blot hybridization assay for large-scale detection of potato viruses in crude potato tuber extracts. J. Phytopathol., 129, 283 290.
221. Nikolaeva O.V., Karasev A.V., Gumpf D.E., Lee R.F., Garnsey S.M. 1995. Production of polyclonal antisera to thr coat protein of citrus tristeza virus expressed in Escherichia coli: application for immunodiagnosis. Phytopathology 85, 691 694.
222. Ning W., Chen F., Мао В., Liu Z., Gao Z., He Z. 2004. N-acetylchitooligosaccharides elicit rice defense responses including hypersensitive response-like cell death, oxidative burst and defense gene expression. Physiol. Mol. Plant Pathol., 64, 263 271.
223. Olmos A., Cambra M., Dasi M.A., Candresse Т., Esteban O., Gorris M.T., Asensio M. 1997. Simultaneuods detection and typing of plum pox potyvirus (PPV) isolates by Heminested-PCR and PCR-ELISA. J. Virol. Meth., 68, 127 137.
224. Olmos A., Capote N., Candresse T. 2006. Detection and characterization of Plum pox virus: molecular methods. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 36, 262 266.
225. Oosten H.J. van, 1972. Purification of plum pox (sharka) virus with the use of Triton X-100. Neth. J. Plant Pathol., 78: 33 44.
226. Oostendorp M., Kunz W., Dietrich В., Staub T. 2001. Inducer resistance in plants by chemicals. Eur. J. Plant Pathol., 107, 19-28.
227. Pallas V., Mas P., Sanchez-Navarro J.A. 1998. Detection of plant RNA viruses by nonisotopic dot-blot hybridization. Meth. Mol. Biol., 81, 461 -468.
228. Palukaitis P., Carr J.P. 2008. Plant Resistance responses to viruses. J. Plant Pathol., 90, 153 -171.
229. Parella G., Gognalons P., Gebre-Selassie K., Vovlas C., Marchoux G. 2003. An update of the host range of tomato spotted wilt virus. J. Plant Pathol., 85, 227 264.
230. Pospieszny H., Atabekov J.G. 1989. Effect of chitosan on the hypersensitive reaction of bean to alfalfa mosaic virus. Plant Sci., 62, 29 31.
231. Pospieszny H. 1995a. Inhibition of tobacco mosaic virus (TMV) infection by chitosan. Phytopath. Polonica № 10, 69 74.
232. Pospieszny H. 1995b. Use of chitin derivatives in control of viruses in bean. XIII International Plant Protection Coingress. The Hague, the Netherlands. Abstract № 1305.
233. Pospieszny H. 1997. Antiviroid activity of chitosan. Plant Protection 16, 105 106.
234. Pospieszny H. 1999. Potential use of chitosan in plant protection. Chitin and Chitosan. Struszczyk H., Pospieszny H., Gamzazade A., Eds. Lodz: Polish Chitin Society, 115 130.
235. Posthuma-Trumpie G.A., Korf J., van Amerongen A. 2009. Lateral flow (immuno)assay: its strengths, weakness, opportunities and threats. A literature survey. Anal. Bioanal. Chem., 393, 569 582.
236. Prichodko Y. 2006. Plum pox virus (PPV) in Russia. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 36,213.
237. Prins M., Laimer M., Noris E., Schubert J., Wassenegger M., Tepfer M. 2008. Strategies for antiviral resistance in transgenic plants. Mol. Plant Pathol., 9, 73-83.
238. Querfurth G., Paul H.L., 1979. Protein A-coated latex-linked antisera (PALLAS): new reagent for a sensitive test permitting the use of antisera unsuitable for the latex test. Phytopathol. Z., 94: 282 285.
239. Quin Sh., Bau H.H. 2003. A mathematical model of lateral flow bioreactions applied to sandwich assays. Analyt. Biochem., 322, 89 98.
240. Quintero A., Fritsch C., Hirth L. 1988. In vitro translation of tomato bushy stunt virus RNA. Arch. Virology, 100, 273 278.
241. Richins R.D., Scholthof H.B., Shepherd R.J. 1987. Sequence of figwort mosaic virus DNA (caulimovirus group). Nucl. Acids Res., 15, 8451 8466.
242. Robinson D.J. 2003. Tobacco rattle virus. CMFAAB Descriptions of plant viruses, № 398.
243. Rodoni B. 2007. The role of plant biosecurity in preventing and controlling emerging plant virus disease epidemics. Abstracts of the 10th Plant Virus Epidemiology Symposium, 15 19 October, ICRISAT, India, 14.
244. Rott M.E., Jelkmann W. 2001. Characterization and detection of several filamentous viruses of cherry: adaptation of an alternative cloning method (DOP-PCR), and modification of an RNA extraction protocol. Eur. J. Plant Pathol. 107, 411 420.
245. Rowhani A., Biardi L., Routh G., Daubert S.D., Golino D.A. 1998. Development of a sensitive colorimetric-PCR assay for detection of viruses in woody plants. Plant Dis., 82, 880884.
246. Rowhani A., Uyemoto J.K., Colino D.A., Martelli G.P. 2005. Pathogen testing and certification of Vitis and Primus species. Annu. Rev. Phytopathol., 43: 261 — 278.
247. Ruiz L., Janssen D., Velasco L., Segundo E., Cuadrado I.M. 2002. Quantitation of cucurbit yellow stunting disorder virus in Bemisia tabaci (Genn.) using digoxigenin-labelled hybridization probes. J. Virol. Meth., 101, 95 103.
248. Ryan C.A. 1987. Oligosaccharide signaling in plants. Annu. Rev. Cell Biol., 3, 295 317.
249. Ryan C.A. 1988. Oligosaccharides as recognition signals for the expression of defensive genes in plants. Biochemistry 27, 8879 8883.
250. Ryan C.A., Farmer E.E. 1991. Oligosaccharide signals in plants: a current assessment. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 42, 651 674.
251. Saiki R.K., Scharf S., Faloona F., Mullis K.B., Horn G.T., Erlich H.A., Arnheim N. 1985. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230, 1350 — 1354.
252. Salazar L.F. Potato viruses and their control. Lima: International Potato Center, 1996. -213 p.
253. Saldarelli P., Barbarossa L., Grieco F., Gallitelli D. Digoxigenin-labelled riboprobes applied to phytosanitary certification of tomato in Italy. Plant Dis., 80, 1343 1346.
254. Salomone A., Roggero P. 2002. Host range, seed transmission and detection by ELISA and lateral flow of an italian isolate of pepino mosaic virus. J. Plant Pathol., 84, 65 68.
255. Salomone A., Bruzzone C., Minuto G., Minuto A., Roggero P. 2002. A comparison of lateral flow and ELISA for the detection of tomato mosaic virus in tomato. J. Plant Pathol., 84, 193.
256. Sanchez-Navarro J.A., Canizares M.S., Cano E.A., Pallas V. 1999. Simultaneos detection of five carnation viruses by non-isotopic molecular hybridization. J. Virol. Meth., 82, 167 175.
257. Sathiyabama M., Balasubramanian R. 1998. Chitosan induces resistance components in Arachis hypogaea against leaf rust caused by Puccinia arachidis Speg. Crop Protection 17, 307 — 313.
258. Schena L., Shalon D., Davis R.W., Brown P.O. 1995. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science 270, 467 470.
259. Schiebel W., Haas В., Marinkivic S., Klanner A., Sanger H.L. 1993. RNA-directed RNA-polymerase from tomato leaves. I. Purification and physical properties. J. Biol. Chem., 263, 11851 11867.
260. Schiebel W., Pelissier Т., Riedel L., Thalmcir S., Schiebel R., Kempe D., Lottspeich F., Sanger H.L., Wassenegger M. 1998. Isolation of an RNA-directed RNA-polymerase specific cDNA clone from tomato. Plant Cell 10, 2087 2101.
261. Schoen C.D., Knorr D., Leone G. 1996. Detection of potato leafroll virus in dormant potato tubers by immunocapture and a fluorogenic 5' nuclease RT-PCR assay. Phytopathology 86, 993 -999.
262. Shamloul A.M., Abdallah N.A., Madkour M.A., Hadidi A. 2001. Sensitive detection of the Egyptian spesies of sugarcane streak virus by PCR-probe capture hybridization (PCR-ELISA) and its complete nucleotide sequence. J. Virol. Meth., 92, 45 54.
263. Shepherd R.J., Richins R.D., Duffus J.E., Handley M.K. 1987. Figwort mosaic virus: properties of the virus and its adaptation to a new host. Phytopathology 77, 1668 1673.
264. Shibuya N., Minami E. 2001. Oligisaccharide signalling for defence responses in plant. Physiol. Mol. Plant Pathol., 59, 223 233.
265. Shukla D.D., Strike P.M., Tracy S.L., Gough K.H., Ward C.W. 1988. The N and С terminal of the coat proteins of potyviruses are surface-located and the N terminus contains the major virus-specific epitopes. J. Gen. Virol., 69, 1497 1508.
266. Shukla D.D., Jilka J., Tosic M., Ford R.E. 1989. A novel approach to the serology of potyviruses involving affinity-purified polyclonal antibodies directed towards virus-specific N-termini of coat protein. J. Gen. Virol., 70, 13 23.
267. Singh M., Singh R.P. 1995. Digoxigcnin-labelled cDNA probes for the detection of potato virus Y in dormant potato tubers. J. Virol. Meth., 52, 133 — 143.
268. Singh R.P., Kurz J., Boiteau G. 1996. Detection of stylet-bome and circulative potato viruses in aphids by duplex reverse transcription polymerase chain reaction. J. Virol. Meth., 59, 189- 196.
269. Singh R.P. 1999. Development of the molecular methods for potato virus and viroid detection and prevention. Genome 42, 592 604.
270. Sjodahl J., 1977. Repetitive sequences in protein A from Staphylococcus aureus. Arrangement of five regions within the protein, four being highly homologous and Fc-binding. Eur.J.Biochem. 73: 343 351.
271. Stevens M., Hull R., Smith H.G. 1997. Comparison of ELISA and RT-PCR for the detection of beet yellows closterovirus in plants and aphids. J. Virol. Meth., 68, 9 16.
272. Sticher L., Mauch-Mani В., Metraux J.-P. 1997. Systemic acquired resistance. Annu.Rev.Phytopathol., 35, 235 270.
273. Strange R.N., Scott P.R. 2005. Plant disease: a threat to global food security. Annu. Rev. Phytopathol., 43, 83-116.
274. Struszczyk M.H., Pospieszny H., Schanzenbach D., Peter M.G. 1998. Biodegradation of chitosan. Progress on chemistry and application of chitin and its derivatives. Vol. 4. Struszczyk H., Ed. Lodz: Polish Chitin Society, 73 77.
275. Su X., Comcau A.M. 1999. Cellulose as a matrix for nucleic acid purification. Analyt. Biochem., 267, 415-418.
276. Sukhacheva E., Novikov V.K., Plaksin D., Pavlova I., Ambrosova S. 1996. Highly sensitive immunoassays for detection of barley stripe mosaic virus and beet necrotic yellow vein virus. J. Virol. Meth., 56, 199 207.
277. Tada Y., Hata S., Takata Y., Nakayashiki H., Tosa Y., Mayama S. 2001. Induction and signaling of an apoptotic response typified by DNA laddering in the defence response of oat to infection and elicitors. Mol. Plant-Microbe Interact., 14, 477-486.
278. Talley J., Warren F.H.J.B., Torrance L., Jones R.A.C. 1980. A simple kit for detection of plant viruses by the latex serological test. Plant Pathol., 29, 77 79.
279. Tanaka S., Nishii H., Ito S., Kameya-lwaki M., Sommartya P. 1997. Detection of cymbidium mosaic potexvirus and odontoglossum ringspot tobamovirus from Thai orchids by rapid immunofiltcr paper assay. Plant Dis., 81, 167-170.
280. Thompson D., Dietzgen R.G. 1995. Detection of DNA and RNA plant viruses by PCR and RT-PCR using a rapid virus release protocol without tissue homogenization. J. Virol. Meth. 54, 85-95.
281. Thresh J.M. 1982. Cropping practices and virus spread. Annu. Rev. Phytopathol., 20, 193
282. Tommeraas К., Varum K.M., Christensen B.E., Smidsrod O. 2001. Preparation and characterization of oligosaccharides produced by nitrous acid depolymerization of chitosan. Carbohydr. Res., 333, 137 144.
283. Torrance L., 1980. Use of protein A to improve sensitization of latex particles with antibodies to plant viruses. Ann. Appl. Biol., 96: 45- 50.
284. Torrance L., Jones R.A.C. 1981. Recent developments in serological methods suited for use in routine testing for plant viruses. Plant Pathol., 30, 1 — 24.
285. Towbin H., Staehelin Т., Gordon E., 1979. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci.USA 76:4350-4354.
286. Tsuda S., Kameya-Iwaki M., Hanada K., Kouda Y., Hikata M., Tomaru K. 1992. A novel detection and identification technique for plant viruses: rapid immunofilter paper assay (RIPA). Plant Dis., 76, 466-469.
287. Uyemoto J. K. 1981. Tobacco necrosis and satellite viruses. Handbook of Plant Virus Infections and Comparative Diagnosis. Kurstak E., Ed. Amsterdam: Elsevier/North Holland, 123-146.
288. Vaira A.M., Vecchiati M., Masenga V., Accotto G.P. 1996. A polyclonal antiserum against a recombinant viral protein combines specificity with versatility. J. Virol. Meth., 56, 209 219.
289. Vallad G.E., Goodman R.M. 2004. Systemic acquired resistance and induced systemic resistance in conventional agriculture. Crop Science 44, 1920 — 1934.
290. Van Belkum A., Linkels E., Jelsma Т., van den Berg F.M., Quint W. 1994. Non-isotopic labeling of DNA by newly developed hapten-containing platinum compounds. BioTechniques 16, 148- 153.
291. Van Regenmortel M.H.V. 1982. Serology and Immunochemistry of Plant Viruses. New York & London: Acad. Press.
292. Vander P., Varum K.N., Domard A., El Gueddari N.E., Moerschbachter B.M. 1998. Comparison of the ability of partially N-acetylated chitosans and chitooligosaccharides to elicit resistance reactions in wheat leaves. Plant Physiol.,118, 1353 1359.
293. Varvery C., Ravelonandro M., Dunez J. 1987. Construction and use of a cloned cDNA probe for the detection of plum pox virus in plant. Phytopathology 77, 1221 1224.
294. Vernet G. 2002. DNA-chip technology and infectious diseases. Virus Res., 82, 65 71.
295. Vincelli P., Tisserat N. 2008. Nucleic acid-based pathogen detection in applied plant pathology. Plant Dis., 92, 660 669.
296. Vunsh R., Rosncr A., Stein A. 1990. The use of the polymerase chain reaction (PCR) for the detection of bean yellow mosaic virus in gladiolus. Ann. Appl. Biol., 117, 561 569.
297. Walker-Simmons M., Ryan C.A. 1984. Proteinase inhibitor synthesis in tomato leaves. Induction by chitosan oligomers and chemically modified chitosan and chitin. Plant Physiol., 76, 787 790.
298. Wang D., Coscoy L., Zylberberg M., Avila P.C., Boushey H.A., Ganem D., DeRisi J.L. 2002. Microarray-based detection and genotyping of viral pathogens. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 15687- 15692.
299. Warsinke A., 2009. Point-of-care testing of proteins. Anal. Bioanal. Chem., 393, 1393 —1405.
300. Waterworth H. 1981. Bean mild mosaic virus. CMI/AAB Descriptions of plant viruses, №231.
301. Waterworth H.E., Meiners J.P., Lawson R.H., Smith F.F. 1987. Purification and properties of a virus from El Salvador that causes mild mosaic in bean cultivars. Phytopathology 67, 169 -173.
302. Waterworth H.E., Hadidi A. 1998. Economic losses due to the plant viruses. Plant Virus Disease Control. Hadidi A., Khetarpal R.K., Koganezawa H., Eds. St. Paul: APS Press, 1-13.
303. Watt G.W., Cude W.A. 1968. Diethylentriamine complexes of platinum (II) halides. Inorg. Chem., 7, 335-338.
304. Webster C.G., Wylie S.J., Jones M.G.K. 2004. Diagnosis of plant viral pathogens. Curr. Sci., 86, 1604- 1607.
305. Wetzel Т., Candresse Т., Ravelonandro M., Dunez J. 1991. A polymerase chain reaction assay adapted to plum pox virus detection. J. Virol. Meth., 33, 355 365.
306. Wetzel Т., Candresse Т., Macquaire G., Ravelonandro M., Dunez J. 1992. A highly sensitive immunocapture polymerase chain reaction method for Plum pox potyvirus detection. J. Virol. Meth., 39, 27 37.
307. Xie Z., Fan В., Chen C., Chen Z. 2001. An important role of an inducible RNA-dependent RNA-polymerase in plant antiviral defense. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 6516 6521.
308. Yang L., Biswas M. E., Chen P. 2003. Study of binding between protein A and immunoglobulin G using a surface tension probe. Biophys. J., 84, 509 522.
309. Yang S.-J., Carter S.A., Cole A.B., Cheng N.-H., Nelson R.S. 2004. A natural variant of a host RNA-dependent RNA-polymerase is associated with increased susceptibility to viruses by Nicotiana benthamiana. Proc. Natl. Acad. Sci USA 101, 6297 6302.
310. Young D.H., Kohle H., Kauss H. 1982. Effect of chitosan on membrane permeability of suspension-cultured Glycine max and Phaseolus vulgaris cells. Plant Physiol., 70, 1449 — 1454.
311. Youssef S.A., Shalaby A.A., Mazyad H.M., Hadidi A. 2002. Detection and identification of Prune dwarf virus and Plum pox virus by standard and multiplex RT-PCR probe capture hybridization (RT-PCR-ELISA). J. Plant Pathol., 84, 113 119.
312. Yu D., Fan В., MacFarlane S.A., Chen Zh. 2003. Analysis of the involvement of an inducible Arabidopsis RNA-dependent RNA-polymerase in antiviral defense. Mol. Plant-Microbe Interact., 16, 206 216.
313. Zhang G., Guo J., Wang X. 2009. Immunochromatographic lateral flow strip test. Meth. Mol. Biol., 504, 169- 183.
314. Zhao X.M., Du Y.G., Bai X.F. 2004. Field experiments of oligochitosan controlling plant virus disease. Chinese Agricult. Sci. Bull., 20, 245 247.
315. Zhao J., Davis L.C., Verpoorte R. 2005. Elicitor signal transduction leading to production of plant secondary metabolites. Biotechnol. Adv., 23, 283 333.
316. Zhao X.M., She X.P., Yu W., Liang X.M., Du Y.G. 2007. Effects of oligochitosans on tobacco cells and role of endogenous nitric oxide burst in the resistance of tobacco to tobacco mosaic virus. J. Plant Pathol., 89, 55 65.1. ИНСТРУКЦИЯ
317. ПО ПРИМЕНЕНИЮ НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИРУСА СКРУЧИВАНИЯ ЛИСТЬЕВ КАРТОФЕЛЯ (ИммуноФА-ВСЛК-ПФ)1. НАЗНАЧЕНИЕ
318. Набор «ИммуноФА-ВСЛК-ПФ» предназначен для качественного определения вируса скручивания листьев картофеля (ВСЛК) в экстракте из листьев картофеля и других растений методом твердофазного иммуноферментного анализа.
319. Набор рассчитан на проведение анализа 46 неизвестных образцов экстрактов, 1 образца положительного контроля, 1 образца отрицательного контроля, в дубликатах, всего 96 определений.2. ПРИНЦИП РАБОТЫ НАБОРА
320. Все компоненты набора, за исключением стоп-реагента, в используемых концентрациях нетоксичны.
321. Приготовление рабочего раствора промывающего буфера.
322. Примечание: Если используется не весь планшет, а только часть стрипов, необходимый объем промывающего буфера следует рассчитать, исходя из того, что для промывания 1 лунки необходимо 2 мл рабочего раствора.
323. Приготовление рабочего раствора экстрагирующего буфера.
324. Примечание 1: Если используется не весь планшет, а только часть стрииов, необходимый объем экстрагирующего буфера следует рассчитать, исходя из того, что для экстракции 1 образца (0,2 г листовой ткани) необходимо 4 мл рабочего раствора.
325. Приготовление положительного контроля.
326. Приготовление отрицательного контроля.
327. К содержимому флакона с отрицательным контролем добавить 1 мл дистиллированной воды.
328. Неиспользованный остаток отрицательного контроля хранить при +4°С в течение ночи или замороженным при -20°С. Допускается только однократное замораживание и размораживание разведенных образцов отрицательного контроля.
329. Приготовление рабочего раствора конъюгата.
330. Развести необходимое количество конъюгата в рабочем растворе промывающего буфера (п. 6.1) в соотношении 1:100, тщательно перемешать. Готовится непосредственно перед использованием. Рабочий раствор конъюгата хранению не подлежит.
331. Приготовление рабочего раствора субстрата.
332. К 12 мл субстратного буферного раствора добавить 200 мкл субстрата, тщательно перемешать. Готовится непосредственно перед использованием, хранению не подлежит.7. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
333. Павеску листьев (0,2 г листовой ткани) гомогенизировать в 4 мл экстрагирующего буфера (приготовленного согласно п. 6.2). Экстраю- осветлить центрифугированием (10 000 об/мин, 3 мин).
334. Вскрыть упаковку планшета, извлечь необходимое количество стрипов. Неиспользованные стрипы закрыть пленкой для заклеивания планшета и поместить обратно в упаковку. Хранить при (2-8)°С.
335. Внести в лунки по 100 мкл осветленного экстракта. Для каждого образца следует использовать отдельный сменный наконечник. В отдельные лунки внести по 100 мкл положительного контроля и по 100 мкл отрицательного контроля.
336. Закрыть планшет (стрипы) пленкой и инкубировать 1 ч при температуре +37°С.
337. Примечание: Предпочтительна инкубация на термостатируемом шейкере.
338. Опустошить планшет, вытряхнув содержимое лунок в раковину.
339. Примечание: ванночка для промывающего буфера (при использовании многоканальной пипетки) должна быть химически чистой.
340. Внести во все лунки по 100 мкл рабочего раствора конъюгата (п. 6.5).
341. Закрыть планшет (стрипы) пленкой и инкубировать 1 ч при температуре +37°С.
342. Опустошить планшет, вытряхнув содержимое лунок в раковину.
343. Промыть лунки промывающим буфером 5 раз, как описано в п. 7.6.
344. Внесли во все лунки по 100 мкл рабочего раствора субстрата (п. 6.6). Закрыть планшет пленкой и инкубировать 25 мин при температуре +37°С.
345. Измерить оитическую плотность в лунках планшета на спектрофотометре вертикального сканирования при длине волны 620 630 нм.
346. ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ АНАЛИЗА
347. Величина оптической плотности положительного контроля должна быть не менее 0,8 ед.опт. пл. через 10 мин инкубации со стоп-реагентом. >
348. Величина оптической плотности любого из отрицательных контролен не должна превышать 0,05 ед. опт. пл. через 10 мин инкубации со стоп-реагентом.
349. Положительными, т.е. содержащими вирус, считаются образцы, средняя арифметическая величина оптической плотности которых в три и более раз превышает значение оптической плотности в отрицательном контроле соответствующей косточковой культуры.
350. Этот критерий оценки положительных образцов применяется и при более длительной инкубации со стоп-реагентом при условии, что величина оптической плотности в отрицательных контролях не превышает 0,1 ед.опт. пл.
351. УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ НАБОРА
352. Набор реагентов «ИммуноФА-ВСЛК-ПФ» должен храниться в упаковке предприятия-изготовителя при температуре (2-8)°С в течение всего срока годности — 6 месяцев.
353. Решением Международного Жюри1. СЕРЕБРЯНОЙ МЕДАЛЬЮнаграждается
354. Институт микробиологии РАН (Чирков С.Н.) за разработку <<Наборы для иммунодиагностики вирусных болезней сельскохозяйственных культур>>
355. Президент Салона Председатель1. Международного Жюри1. Д.И.Зезюлин И. С.О1. Силаев
356. Россия, Москва, 27.03 — 31.03.2002г.1. Инструкцияпо применению Комплекта иммунохроматографического для выявления Y-вируса картофеля в листьях картофеля1. Назначение
357. Комплект упакован в пластиковый пакет
358. Оборудование и материалы, необходимые для проведения анализа• металлическая ложка• ножницы• часы4. Приготовление экстракта
359. Извлечь тест-полоску и положить ее на горизонтальную поверхность {рис. 1д). Через 10-12 мин, но не более чем через 15 мин, визуально оценить результат реакции.
360. Для получения надежных результатов комплект следует применять при температуре
361. Оценка результатов анализа
362. Появление на тест-полоске двух параллельных линий разового цвета (рис. 2а) свидетельствует о положительном результате анализа, указывая на то, что в экстракте содержится YBK.
363. В тех случаях, когда не образуется ни одной окрашенной линии (рис, 2в) или образуется только нижняя линия {рис, 2г), результат анализа является недостоверным. Анализ следует повторить с использованием другой тест-полоски.1. Рис. 2.
364. Условия хранения и эксплуатации
365. Комплект иммунохроматографический для выявления YBK должен храниться при комнатной температуре (+18-25*С) в оригинальной упаковке в сухом месте в течение всего срока годности.
366. Срок годности комплекта -12 месяцев.
367. После вскрытия упаковки тест-полоски должны быть использованы в течение 2 часов при хранении в сухом мосте при комнатной температуре.
368. Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение настоящей Инструкции.8. Меры предосторожности
369. Комплект предназначен только для in vitro диагностики и не может быть использован для других целей.
370. Все компоненты комплекта в используемых концентрациях являются нетоксичными.
371. МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
372. СИСТЕМА СЕРТИФИКАЦИИ СЕМЯН0018511. АТТЕСТАТ
373. АККРЕДИТАЦИИ ИСПЫТАТЕЛЬНОЙ ЛАБОРАТОРИИ1. Росс /Ш-SnCOI.6.1.11211. Действителен до" 21 " 0320 (Ж г.
374. Настоящий аттестат удостоверяет, что лаборатория ПО ВИРУСНЫМ ТЛ ВИроИДНЫМ бОЛбЗНЯМнаименование организации
375. Заместитель Министра сельского хозяйства Российской Федерации1. Г.Ю. Сажиновфамилия, инициалы
376. ЗАРЕГИСТРИРОВАН В государственном реестре системы09 ■■ 04 01 г.
-
Чирков, Сергей Николаевич
-
доктора биологических наук
-
Москва, 2009
-
ВАК 03.00.06
- Научно-технологические основы оздоровления сортов картофеля от вирусов в условиях Приамурья
- Иммунологические основы паразитизма и болезнеустойчивости растений
- Характеристика отдельных представителей потивирусов и методы их индикации
- Особенности производства безвирусного посадочного материала земляники и малины в ЦЧР
- Гидрозольные препараты - бесприборные иммунохимические экспресс-диагностикумы
