Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Биологические особенности У-вируса картофеля и способы его идентификации на основых пасленовых культурах

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Биологические особенности У-вируса картофеля и способы его идентификации на основых пасленовых культурах"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ лп ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ

•р-В—ОД-—-

г ..........На правах рукописи

ОБРУЧКОВ Владимир Степанович

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ У-ВИРУСА КАРТОФЕЛЯ И СПОСОБЫ ЕГО ИДЕНТИФИКАЦИИ НА ОСНОВНЫХ ПАСЛЕНОВЫХ КУЛЬТУРАХ

Специальность: 06.01.11 — Защита растений от вредителей

и болезней

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ ПУШКИН 1993

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты растений.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Ю. И. Власов.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук В. А. Колооа-С 5; кандидат сельскохозяйственных наук, доцент Е. Д. Васильева.

Ведущее учреждение: Всероссийский научно-исследовательский институт растениеводства им. Н. И. Вавилова.

Защита диссертации состоится « » ОК-ИАЗСдЬя. ¡993 г.

в ! 7 часов на заседании Специализированного совета, шифр Д 020.01.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты растений но адресу: 189620, Санкт-Петербург—Пушкин-6, шоссе Подбельского, д. 3, ВИЗР.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института защиты растений.

Автореферат разослан

1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

Г. А. Наседкина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Среди патогенов, поражавших посадки картофеля и табака в России и других странах С1Г наиболее вредоносным • является У-вирус картофеля (УВК). На картофеле этот вирус вызывает важные в экономической отношении заболевания типа морщинистой и полосчатой мозаик, Согласно данным литературы их распространенность в разных регионах нашей страны варьирует от до 20-305?. По приблизительным оценкам эти болезни снижаот урожайность картофеля в среднем на 20-30$, а в отдельные годы на 50% и более.

Помимо картофеля и табака этот патогеи поражает и другие пасленовые культуры, в т.ч.: перец, томаты, баклаланы и физалис. Так, по данным Амбросова и Блоцкой (197*0 УВК приносит ощутимый ущерб культуре томатов, в республике Беларусь. Лытаева (1975) и Тиыина (i960) сообщают о поражении им посадок перца на иге России й в Молдове. К сожалеют, этй исследования оказались в СНГ единственными и не получили дальнейшего разйития. Поэтому целый, ряд вопросов, связанных с распространенность!), вредоносностью и особенностями биологии УВК на этих видах пасленовых Культур, остался неизученный. ,'•••'* ' '

В борьбе о УВК, как и с другими фитрпатогенннш вирусами, обычно попользуют комплекс профилактических мер, направленных, в первуп очередь, на раннее выявление и выбраковку больных растений, а также создание устойчивых к этому патогену сортов пасленовых культур. Однако их реализация на практике нередко осложняется ' иэ-эа трудностей идентификации УВК и низкой надежности сушествув-щих диагностических приемов.

Цель и. задачи исследований. Исходя из йыиеизлояеиного перед нами была пос.тавяена цель: усовериенствовать способы диагностики УВК и изучить с их помощы) биологии этого патогена на основных пасленовых культурах: картофеле, табаке, перце и томатах. В,связи с этим автору потребовалось решить следующие научные задачи:

- выделить УВК из различных видов пасленовых растений и провести его штаммовуо идентификации на растениях индикаторах;

- провести препаративное выделение одного из штаммов УВК;

- получить диагностическую) антисыворсщ к этому итаиму;

- испытать её в различных способах иммунодиагностики УВК и по возможности улучшить их надежность; . •

- изучить симптоматику и динамику накопления первичной и

вторичной инфекции УВК на отечественных сортах картофеля, в той числе; ъ листьях зараженных растений, свежеубрашшх клубнях и ростках картофеля;

- изучить сиыптоиатику и динамику накопления штаммов УВК на разных сортах: табака, перца и томатов и выделить.устойчивые к нему формы пасленовых растения.

Научная новизна, йа полевых образцов томатов, перца и бархатцев, собранных автором в Приднестровской части Молдовы, на Черно- -морском побережье Грузии и в Краснодарской крае России, был выделен целый ряд нзолятов УВК.

Изучена возможность использования метода виробактериальной агглотинации (АБВ-тест), латекс-теста и ииыуносорбентной электронной микроскопии с белкой (протеином) Л (ПА-ЖЭМ) в диагностике УВК на разных пасленовых культурах.

Показано, что высокие фоновые реакции в кетодё иммуноферментного анализа (ИФА) могут возникать из-за леспецифического связывания меченых антител с растительными лектинами на твердой фазе. Поиск способов устранения этих мекфазных взаимодействий позволил автору разработать достаточно надежный метод диагностики УВК, который был впоследствии оформлен как изобретение.

При проведении статистической обработки резудьтатов'ЙФА нами была испытана непараметрическая процедура их интерпретации. Она обеспечила не только васокус точность определения положи тельн.о-отрицагелгного порога, но и объективную оценку диагностической информативности всех испытанных вариантов этого теста.

Впервые в нашей стране апробирована'методика тестирования вторичной инфекции в све¡неубранной клубневом материале -картофеля. Статистический анализ этих результатов позволил выявить четкуп взаимосвязь межд^-весом зараженных клубнеплодов и величиной оптической плотности, полученной в методе ИФА.

Изучена симптоматика и динамика накопления ряда штаммов УВК на различных сортах табака, перца и томатов, Впервые показана возможность "самооздоровления" зараженных растений перца от обычного и некротического штаммов этого вируса.

практическая значимость. Предложена достаточно эффективная методика очистки УВК, Получена диагностическая антисыворотка к одному из некротических штаммов отого вируса и апробирована в АБВ-теств, латекс-тесте и ПА-ИСЭМ. Отработаны способы повышения

их специфичности при тестировании основных пасленовых культур.

■ Предложена оригинальная методика устранения неспецифических реакций, возникавших в методе ИФА при сохранении высокого уровня положительных реакций с тестируемыми экстрактами зараженных растений.

Разработана простая и надежная методика интерпретации результатов ИЗА и оценки диагностической информативности разных вариантов этого теста.

Установлены оптимальные срони для тестирования первичной- и вторичной инфекции УВК на отечественных сортах картофеля методом ИФА. Показана возможность определения этого вируса в свенеубранном и естественно проросшем 'клубневом материале на второй год после его заражения.

Изучены особенности проявления мокоинфекции УВК и смешанной вирусной инфекции (УВК + ВТМ) на разных видах'и сортах-томатов и перца. Проведено детальное изучение симптоматики й динамики накопления разных штатов'УВК на картофеле, табаке, перце и томатах.

Среди представителей семейства 5о1аласеа« выделены' дикие и культурные формы растений, обладавшие абсолютной устойчивость» к УВК. '

Апробация работы. Разработанные нами способы проведения АБВ-теста, латекс-теста и ИФА прошли успешные испытания в лаборатории вирусных, микоплазменных и нематодных болезней растений ВИЗРа, лаборатории семеноводства картофеля Всероссийского научно-исследовательского института растениеводства им. Н.И.Вавилова и в отделе семеноводства НПО "Белогорка",.

Основные положения'диссертации доложены: на Всесовзном совещании "Теория и практика использования сельскохозяйственных культур устойчивых к вирусным болезням",. Вильнюс. (1984); на 8-ом Всесосз-. ном совещании по иммунитету сельскохозяйственных растений к болезням и вредителям, Рига (1986); на Научно-практической конференции "Биологически активные вещества в сел ъс ко Н.;,®03" Ястве", Ленинград [1987); на Научной конференции, посвященной ЮО-лйтии со дня открытия вирусов Д.И.Ивановским, Ростов-на-Дону (1992).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ [ получено авторской .свидетельства на изобретение.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 120 ¡границах машинописного текста и состоит из введения, шести глав,

M -

•общих выводов, методических рекомендаций и приложения. Список использованной литературы включает 293 наименования, из них - 217 ка иностранных языках. Диссертационная работа проиллюстрирована 32 таблицами и 35 рисунками.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении показана актуальность проблемы и ее научная новизна, определены цель и задачи исследования.

Глава 1: СОВРЕМЕННЫЕ ДАННЫЕ ОБ У-ВИРУСЕ КАРТОФЕЛЯ (УВК) И 1ЕТ0ДАХ ЕГО ДИАГНОСТИКИ (обзор литературы)

Приведена общая характеристика УВК с кратким описанием его биохимических и физических свойств. Обобщены литературные сведения о штаммовоц составе, симптоматике, распространенности и вредоносности этого вируса на основных пасленовых культурах. Представлен критический анализ данных литературы о способах диагностики УВК.

Глава 2. МАТЕРИАЛ И - И МЕ.Т0ДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.1. Общие данные

Основную часть исследований по теме диссертационной работы проводили в лаборатории вирусных, микоплазмеиных и нематодных болезней ВЙЗРа в течение IS83-I990 гг. Образцы растений," зараженных УВК, собиралив Северо-Западной зоне России и в Краснодарском крае, а такие в Узбекистане, Азербайджане, Грузии, Молдове и на Украине. Биологические свойства выделенных изолятов и йтаммов" 'этого вируса изучали как в тепличных, так и в полевых условиях.

Электронноишфоскопические исследования и очистку УВК осуществляли на базе соответствующих научно-технических служб ВИЗР 'и ВНИИСХМ. Иммунизацию подопытных кроликов очищенными вирусными препаратами, выделение антисыворотки к этому вирусу и испытание ее в АБВ-тесте проводили совместно с сотрудниками нашей лаборатории: Козловым Л.П. и.Шосталь В.П,

•С^атрстическус обработку результатов исследований проводили" не только Общепринятыми способами, но и по ординальным методикам, разработанным совместно с сотрудником ВИЗР Васильевым C.B.

2.2. Материалы исследований

В идентификации УВК использовали следупщйе виды тест-растений: гибрид А-б (Solanum tuberosum , сорт Аквила х 3. damissum ), ТЕ-Г ( 3. ohacoense ), BdY (внутривидовой гибрид Sjdemisscm) , ChenopodiUM amarantioolpr, Datura mete!, Phyealis floridana, Hicotiana-tabaoum ( сорта: Самсун красно-цветковый, Самсун 47/10, Самсун 535, Самсун I5S/7, Берлей 21, Иммунный I,Fixed A-I, Hicks Resistant, White Burley ), H.aiata, N.bigelovii (var, raiiltivalvls), If. debneyl, K.excelsior, N.glutinosa, N.langadorffii, M.megaloeiphon, N.repanda, N.rustica, IT.s'uaveolens, N.sylvestris u N. trigonophyllat

Кроме того этот вирус изучали на таких формах пасленовых растений, как: capsicum annuum (сорта: Болгарский 79, Винни-Пух, Здоровье, Ласточка, Находка 20, Нежность, Подарок Молдовы, SP-50, Yolo Wonder, Yolo Y), C.bacoatum (K-5402), C.frutescens (K-27I0)t С.pendulum (K-2I50, K-5659)l. ЪусорегвЮоп chálense (K-9764)¡ . L. esoulentum (полуокультурешше формы! K-29I4, К-4221 и сорта: Волгоградский 5/95, Гигант, Драгоценность, Зарница, Невский, Новинка Приднестровья, Радуг а Молдовы, Ракета, Советский 679, . Факел); L.hirsutum (K-_5947)l L.peruvianum, var.í dentatum (K-3962), huraifuBUm (K-3968) t b.pimpinellif olium (к-2921) И Solanum tuberosum (сорта: Арина, Весна, Гатчинский, Детскосельс-кий. Невский, ПриекульскиЯ ранний, Столовый 19).

При постановке АБВ-теста и ПА-ЮЭМ ncm»ib30BáflH лиофилизиро-ванные препараты золотистого стафилококка и выделенный из него белок А, изготовленные-в НИИ эпидемиологии и микробиологии ,им. Пастера, В латекс-тесте применяли синтетический полистироловыЯ латекс, произведенный чешской фирмой "sevao" и набор готовых реагентов для полевой диагностики УВК, который был получен из Международного центра картофеля (clP) ri Лимы (Перу).

При проведении Шк пользовались коммерческими наборами реагентов, имеющими в своем составе следушцие виды-кешытатов: моно-кл о нал ыше (мышиные) антитела, меченные пелйжеидазой хрена-(институт химической и биологической физики Эстонии); поликлональные

- б -

(кроличьи) антитела с той же меткой ("НПО по картофелеводству") и полнклональные (овечьи) антитела, меченные щелочной фосфатазой (фирмы BÖehrlngör Mannheim).

2.3. Методы исследований

Передачу УВК на большинство видов индикаторных растений и сортов картофеля осуществляли в период достиаения ими возраста Э-Ь настоящих ЛКСТьев. Ch.amacanticolor, Piw f 1 oridana, SdY перец и томаты инокулировали в возрасте 5-7 настоящих листьев,

Инокулви, используемый Для их заракения УВК, готовили путем растирания инфекционных растительных тканей в фарфоровой ступке с добавлением 0,1 М тркс-глицииового' буфера, РН=8,3 или 0,01 И налий-яатрий-фосфатногс буфера РН=7,0 (при разведениях инфекционного сока буферным раствором от 20 до 50 раз), 0,005 М диэтил-дигиокарбамата (ДЙЭКА) и 0,3$ активированного угля.

Разиноке кие УВК проводили в растениях H.rustica и к.sylvestris , выращиваемых в теплице при температуре +25° - +28? Приблизительно через месяц после заражения с них срезали листья, которые использовали в процедуре выделения этого вируса.

Очистку УВК осуществляли по разработанной нами методике, которая включала: несколько циклов дифференциального центрифугирования, ресуспендирование образующихся осадков в больших объемах экстракционного буфера с добавкой неионного детергента тритона X-IOO и центрифугирование вирусной суспензии на сахарозной подуйте.

Очищенные препараты этого вируса использовали для иммунизации подопытных кроликов по схеме, вклвчаоте^ две внутримышечных инъекции с неполным адьпвантоы Фрейнда и три внутривенных инъекции.

Тестирование УВК на изучаемых пасленовых культурах проводили при помощи: метода растений индикаторов, электронной микроскопии, ПА-ЙСЭМ, метода виробактериальной агглптинации или АВВ-теста, латекс-теста я твердофазного ИФА. При отработке последнего диагностического приема были испытаны три разных его модификации: фирмы Böehringer Mannheim , стандартная методика ЙОД (Бобкова и др;, 1$85) и собственная методика автора.Чтение реакций этого теста осуществляли на микрофотометре мд - 700 фирмы Dynatech (Швейцария).

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЯДЕНИЕ

Глава 3. ИЗУЧЕНИЕ ШТАММОВОГО СОСТАВА, СИМПТОМАТИКИ И

РАСПРОСТРАНЕННОСТИ Ш НА ОСНОВНЫХ ПАСЛЕНОВНХ • КУЛЬТУРАХ

В результате выполненных исследований нами был собран обширный экспериментальный материал об особенностях распространения и симптоматике этого вируса на основных пасленовых'культурах, выра-. щиваемых на территории бывшего советского Cocía. Гак, в 1985.г. УВК. обнаружили в Краснодарском крае на полевых растениях перца с симптомами мозаики и окйймления жилок листьев. Кроме .того у отдельных сортов этой культуры-УВК мог вызывать некрртизаций листовых пластинок и стеблей, сближение междоузлий- и задержку роста зараженных растений.

В 1986 году автор зарегистрировал массовое заражение полевых растений томатов УВК в окрестностях г.Тирасполя (Молдова). По своему внешнему виду онй мало отличались от здоровых растений, за исключением слабого посветл'ения жилок верхних листьев и закручивания листовых пластинок книзу. Однако в случае их дополнительного заражения ВТК признаки вироза Заметно усиливались: листовые пластинки желтели и покрывались некрозайй.

В течений I98t-J987 гг. нами были отмечена эпифитотии УВК на посадках Табака в Краснодарском краеГ, Азербайджане и Груйии. Судя по проявление внешних, признакой виройа их чаще всего вызывали некротические штаммы УВК. Лишь на отдельных табачных плантациях растения были поражены'белой пестрицей, вызываемой как правило штаммами из группы УВК0.

Среди всех обследованных автором культур наибольшая распространенность УВК отмечена на картофеле. В частности, этот патоген неоднократно обнаруживали в образцах клубней и листьев картофеля,' присылаемых-к нам для лабораторного анализа ¡из .разных регионов России, Украина и Узбекистана; Кроме того, значительное число изолятов УВК ваделено автором с вегетйрующ?х растений картофеля на которых проявлялись типичные симптомы морщинистой или полосчатой мозаик. В ряде случаев его изолировали из внешне' здоровых • растений этой культуры. . " . '

Наряду с восприимчивыми-сортами картофеля 'УВК также удалось обнаружить на сортообразце Bison из коллекции клубнеплодов

- в -

"ВНЛИРа, являющемся по данным 1>е1Ьву (1975) иммунным к этому -вирусу.

Поиски УВК,. предпринятые автором на других культурах оказались успешными лишь при тестировании бархатцев вида ТацеЬез собранных вблизи г.Сухуми. Во всех проанализированных образцах этого вида вирусная инфекция присутствовала в.латентной форме.

Как показали проведенные исследования, основная часть выделенных нами изолятов вируса оказалась по своим биологическим свойствам блике всего к группе некротических штаммов УВК и только три из них - к обычным штаммам УВК0. При тестировании этих изодятов методом ИФА было также подтверждено сходство их антигенных свойств со штаммами УВК, полученными от других исследователей.

Глава ПРЕПАРАТИВНОЕ ВЫДЕЛЕНИЕ УВК И ПОЛУЧЕНИЕ

ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ АНТИСЫВОРОТКИ К ЭТОМУ ВИРУСУ

Препараты УВК, приготовленные по разработанной нами методике очистки, имели типичные для нитевидных, вирусов спектры поглощения при соотношении экстиккций Е 260/ Е 280 в пределах: 1,1 - 1,2. Полученная на их основе диагностическая антисаворотка в капельном преципетационном тесте показывала рабочий титр 1:512 и практически нз реагировала со здоровым'соком табана.

Глава 5. СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СПОСОБОВ

■ ИММУНОДИАГНОСТИКИ УВК •

5.1. Агглютинационнне тесты

Испытания изготовленных нами диагностикумов и коммерческого ' набора реагентов (сц> ) в латекс-тесте и методе виробактериалькой агглютинации подтвердили их практическую пригодность для тестирования УВК в зараженной листовом материале картофеля и табака. Однако с растительными, экстрактами других культур и клубней картофеля вти диагностические реагенты могли давать неспецифические реакции. Кроме тоао испытанные автором1 агглютйиационные тесты оказались недостаточно чувствительными для' диагностики УВК в этих равтителышх органах.

5.2, ПА-ИСЭМ

При проведении Г1А-ШЭи наии была взята за основу диагности-

ческая процедура, разработанная Shultla ü'Gough (1983). Согласно исследованиям автора ПА-ИСЭМ позволяет осуществлять эффективную диагностику УВК на всех испытанных пасленовых культурах, зараженных этим вирусом. Однако в сравнении с другими иммунологическими тестами этот диагностический прием является слишком трудоемким и малопроизводительным. Поэтому его модно рекомендовать лишь для выборочной проверки зараженности оцениваемых образцов УВК.

5.3. Методы ИФА

5.3.1. Испытания разных тест-систем и совершенствование методики ®А

■ При испытании отечественных и зарубежных наборов диагностикумов в сэндвич-варианте ИФА между ними были отмечены существенные различия как по чувствительности определения УВК, так и по специфичности тестирования отдельных растительных органов'пасленовых культур. В частности, из результатов оценки свежеубранных клубней картофеля, представленных на рис. 2, видно, что уровень фона при' регистрации пероксидазной метки .мог достигать 1,00 оптической плотности (ОП) и выше. В то время кап для реагентов фирмы Boehrin-gar Mannheim , меченных щелочной фосфатазой, фоновые реакции • обычно не выходили за пределы 0,15 ОП (см.рис.1).

Поскольку отдельные исследователи (Йеустроева и др., 1989)' склонны увязывать причину низкой специфичности стандартной методики ИФА с сорбцией свободной растительной пероксидазы на твердой . фазе, мы осуществили экспериментальную проверку этого утверждения. Суть ее заключалась в измерении интенсивности окрашивания раствора субстрата в лунках планшета непосредственно после инкубации и отмывки не зараженного клу бневого сока.

Анализ результатов этого эксперимента показал, что компоненты растительного сока, сорбирующиеся на поверхности носителя, могли вызывать лишь незначительное повышение фона, интенсивность которого обычно не превышала 0,1 - 0,2 ОП. Если добавлению субстратного раствора предшествовала стадия нанесения и отмывки антител, меченных пероксидазой, то вероятность его неспецифического окрашивания резко возрастала.

Таким образом, высокий уровень фона в данном случае создавался' не в результате сорбции эндогенной пероксидазы на твердой фазе, а

Рис.! I Полигон распределения положительных и отрицательных результатов ИМ, подученных при испытании тест-системы фирмы вие11г1пкег иаппЬе1в!По оси абсцисс - значения ОП, измеренные фотометром мй -700 на длине волны 405 нм.; по оси ординат - сглаженные частости, выраженные в %.

Рис. 2, Полигон распределения положительных и отрицатель--ных результатов, полученных при испытании стйндартной методики двойного сэндвича.

На этом и последующем рисунке приняты следующие об означения: по оси абсцисс - значения 011, измеренные фотометром HR-700 на длине волны 490 им.; по оси ординат - сглаженные частости, выраженные в %\ (•) - положительные результаты; f?) -.отрицательные результаты ИФА. ^

из-за неспецифического связывания меченых антител с иммобилизованными компонентами клубневого сока.

Согласно исследованиям автора в роли последних могут выступать растительные лентины. Так, в опыте с коммерческим препаратой кон-канавалина А было зарегистрировано значительное (не менее повышение уровня фона даже тех проб, где его концентрация не выходила за пределы 0,01$.

Далее, мы изучили возможность подавления [«специфических реакций путем, введения в состав пробноконыгайюго буфера (ПКВ) ингибиторов связывашцей' активности растительных лектянов. Среди испытанных н'^ми добавок этот эффект проявлялся у Д-глскозы, иертиолата натрия и казеина. Однако, некоторые из них, например: мертиолат натрия при'определенных условиях могли точно также янгибировать и положительные реакции этого теста.

В связи с этим был предпринят поиск дополнительных способов повышения его диагностической информативности. В частности,, мы вве-т в стандартную процедуру двойного сэндвича такая методический прием, как блокировку твердой фазы "инертными" белками.'до и после нанесения тестируемого сока. Для этой цели использовали 5-105? обезжиренное молоко (ОН), разведенное в 0,1 U трис-глициновои буфере, РН=9,0 и законсервированное мертиолатом натрия. Чтобы избегать многослойной сорбции компонентов ОМ при длительных периодах блокировки рабочей поверхности планшета (60 мин. и более) его трижды промывали буфером отпивания (БО).

Другой способ устранения высоких фоновых реакций заключался в усилении десорбции неспёцифических компонентов с поверхности носителя за счет увеличения концентрации хаотропных ионов в БО.

Испытания всех указанных выше методических приемов в единой диагностической процедуре показали, что они способствувт заметному повышение специфичности сэндвич-метода при сохранении достаточно высокого уровня положительных реакций этого .теста (см.рис.3).

5.3.2. Оценка диагностической информативности и интерпретации результатов И5А

Последние данные литературы (Sutula s.a., 1986: Rowland -е.а., 1989) и собственные исследования автора, свидетельствует о ^корректности оценки результатов ЙФА по параметрическим критери-[и статистики. Поэтому нами бия испытан принципиально иной способ

-0.1 ао ОЛ 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.0 10

Рис. 3. Полигон распределения полокительных и отрицательных результатов, полученных при испытании оптимизированной методики ИФА

интерпретации результатов ИФА, который' основывался на применении метода альтернативной диагностики (Гублер, Генкин, 1973'). '

В соответствии с этой кепараметрической процедурой величину положительно-отрицательного порога (порог, П) определяли при помощи таких оценочных критериев, как: вероятности правильной оценки зараженных ( Ы ) и незаракенных образцов ( $ ), диагностические коэффициенты и диагностическая информативность (ВК;д) - положительных (1+ ) и отрицательных результатов ИЗ>А (1-). Их рассчитывали по следующим формулам:

Ч'(«»-*)• ; И^т^Н100"^

ЗЖ1+

У-1-

Р.

• вк =ю1о

.-амкД!^ Ё,-); шикЦV

где: и кумулятивные сгланенные частости, рассчиты-.. ваеыые в % для отдельных диапазонов ОП с начала распределения положительных и отрицательных результатов;

и Ц^ кумулятивные сглаженные частости, рассчитиваещщ' в % для отдельных диапазонов ОП с конца распределения полокителыип и отрицательных .результатов;

у- - допустимая вероятность совершения ошибки, обусловленная влиянием неучтенных факторов: дефектов планшет, погрешностей мпетирования и т.п.; обычно ее устанавливают на уровне 4 1%.

Значения коэффициентов К|_- и К(_ + находили в специальной габлице, приведенной в работе Гублера и Г,енкина (1973).

По разнице 100 - с* определяли вероятность ложного признания збраэца зараженным (вероятность ложноположительной оценки) з а по разнице 100 - £ устанавливали вероятность ложного признания образца незараженкым (вероятность локнаотрицательной оценки) в %, Как показызапт приведенные расчеты (см.табл.1) метод альтернативной диагностики обеспечивал более высокуо точность, определения порога по сравнению с традиционными методами статистики, В частности, этот способ интерпретации результатов ИФА позволил сократить доле ложнооцененных неэаражеяных образцов с 50% (П=Х+2Е, где: X - средняя величина ОП; Е - стандартное отклонение) до практически нулевого уровня.'

Таблица I

Сравнительная оценка достоверности разных способов интерпретации результатов ИФА

Способ интерпретации Величина ОП, устанавливаемая в качестве порога Вероятность лонног.оложи-тельной оценки в % Фактическая доля ложнооцененных не зараженных образцов в %

П=Х+2Е 0,015 4 5 50

П=Х+ЗЕ 0,017 ■ ^ I

П=Х+ЧЕ ■ 0,019 « 0,01 35

Метод альтернативной диагностики 0,15.0 « <» ' .0

Глава б. ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИИ УВК НА ОСНОВНЫХ ПАСЛЕНОВЫХ КУЛЬТУРАХ'

6.1. Динамика накопления УВК на разных сортах картофеля

Исследования, проведенные на отечественных сортах картофеля', показали, что в .первые две недели после их инокуляции УВК

вирусная инфекция наиболее интенсивно накапливалась в ни я не и и «средней ярусах зараженных растений. Исклочение составил только сорт Арина, в которой развитие вирусной инфекции с самого начала доминировало в верхних листьях.

Внешние признакилирЬэа к этому периоду времени успевали проявиться не на всех сортах •картофеля. В частности, у сортов Весна и Гатчинский симптомы мозаики и некротических пятен на листьях развивались только Через месяц после их инокуляции УВК.

Е началу бутонизации концентрация этого вируса во всех надземных частях зараженных растений картофеля достигала максимума, а в период цветения начинала резко падать.

В отличие от первичной инфекции темпы накопления УВК во вторично зараженных растениях картофеля оказались существенно ниже. Тем не менее в динамике развития-вторичной инфекции на всех изученных сортах этой культуры были отпечены .приблизитель- . яо те же тенденции, как и в первый год их заражения УВК.

Далее, мы изучили особенности развития вторичной инфекции в клубневом материале картофеля. С этой целью в период формирования урожая зараженные растения выборочно подкапывали и проводили тестирование разных фракций клубневого потомства методом ИОД. '

.Как можно видеть из результатов этого эксперимента, представленных в табл. 2, с увеличением массы зараженных „клубней, происходит снижение общего уровня положительных-реакций сэндвич-метода на всех протестированных сортах картофеля; Поскольку они имегт разные сроки созревания, то этот фактор является.решавшим в выборе оптимальных сроков диагностики УВК. • "

ПовГорное тестирование клубневой инфекции, проведенное, вас вой следующего года,, показало, что темпы ее накопления в естественно проросших клубнях картофеля практически не зависели от их веса. Однако на эффективность диагностики УВК в атот период оказывали существенное влияние размеры и местополокеше тестируемых ростков на клубне. У большинства изученных сортов картофеля наиболее высокие концентрации УВК отмечали в вершинных частях клубнеплодов с величиной ростков 5-7 сн.

Таблица 2

Распределение свежеубранных вторично зараженных клубней картофеля по весу в зависимости от •результатов их оценки в ИТ-А

Диапазоны ОП (А-490)

Сорта 0,00-0,20 0,21-1,00 - 1,01'и вике

Средний вес клубней (г)

Арина . 185*35 111*22 14* 6

Весна 133*14 76* 3 • 52*10

Гатчинский -- 84*20 20*10

Детскосельский 133*17 - 21*15

Невский . 67*35 - II* 5

Приекульский ранний 103*28 • 38* 8- -

Столовый 19 125*25 , 55*14 29*17

В среднем 12 8-14 ■ 73*12 25* 6

6.2. Динамика накопления УВК на разных видах и сортах перца

Характер развития инфекции УВК в растениях перца зависел в первую очередь от штаммового состава этого вируса. Так, практически у всех сортов перца, зараженных штаммами УВК0 и СН-605 из Нидерландов, вирусная инфекция сохранялась, только.в течение 4-6 недель после их инокуляции. В дальнейшем ее концентрация падала до такого низкого уровня, что она не могла быть обнаружена ни одним из испытанных нами тестов. Внешние признаки вироза, первоначально проявившиеся на этих растениях з виде мозаики и окаймления жилок листьев, через 10 недель после их инфицирования полностью исчезали и они уже ничем не отличались от здоровых контролёй.

Если исследуемые сорта пе.рца заражали другими штаммами или изолятами УВК, то динамика накопления вирусной инфекции была принципиально иной. В частности, через две недели после их передачи вирусную инфекцию обнаруживали при помощи ИФА и биотеста на табаке в листьях нижнего яруса. В течение последующего месяца эти штаммы и изоляты УВК могли быть достоверно обнаружены во всех частях зараженных растений, в т.ч. ив плодах этой- культуры.

Дополнительное заражение ратных сортов перца ВТИ позволило

изучить особенности развития вироза в случае смешанной инфекции С УВК. Как и В исследовании Sherwood, Reddik, Conway (I98B), нами отмечено усиление симптомов болезни практически на »сех сортах этой культуры(. зараженных смесью УВК и ВТМ.

Полный иммунитет ко всем выделенный изолятам и штаммам УВК бал обнаружен у следующих видов и сортов перца: c.annuum ( сорта: SP-50, Yolo Wonder, Yolo Y), C.baQcatum (K-5402) u C.pendulum (K-2I50, K-5659).

6,3. Особенности развития инфекции УВК на томатах

Развитие симптомов УВЙ на большинстве изученных видов и сортов томатов оказалось Достаточно сходным. Обычно через 9-II дней после его передачи на заражениях растениях этой культуры появлялись 'симптомы посветлейия жилок и "темнозеленой пятнистости на листьях. С течением времени ати пятна желтели, переходили в некрозы и сливались друг с другом. При этом края пластинок полностью усыхали и они загибались книзу ,

По нашим наблюдениям эти симптомы могли заметно усиливаться, если растения томатов дополнительно заражали ВТМ. Периодическое тестирование зараженных растений томатов проводившееся в разные фазы их роста и развития, показало, что в первые две недели после инокуляции инфекция УВК концентрировалась преимущественно в листьях нижнего 'и среднего ярусов. На третью или четвертую неделю УВК достоверно обнаруживали как-в верхнем ярусе, так и во вновь образовавшихся пасынках. В дальнейшем концентрация вирусной инфекции заметно падала во всех частях зараженных растений, а в листьях • нижнего яруса она.нередко оказывалась .ниже порогов чувствительности используемых нами диагностических тестов.

Согласно.исследованиям автора УВК способен проникать в плоды этой культуры сразу же после их завязывания На зараженных растениях. Однако, его надежная диагностика в этих растительных органах оказывалась возможной только при достижении ими волной зрелости.

Среди испытанных нами видов .томатов полный иммунитет к УВК был отмечен только- у. b.hirsutum (K-39'i7).

б.Динамика накопления УВК на разных видах 1 и сортах табака

Практически во всех видах и сортах табака, зараженных УВК, уровень накопления этого вируса достигал максимума уже на вторую неделе после их инокуляции. Однако у отдельных растений этой культуры вирусная инфекция иногда оказывалась локализованной в пределах одного или двух ярусов инокулированных листьев.

Повторные диагностические анализы, проведенные через 7 недель после заражения исследуемых видов и сортов табака УВК, позволили установить, что к этому периоду времени темпы 'его размножения в зараженных растительных тканях резко падали. Как и при первом тестировании автором били отмечены случаи локализации вирусной инфекции в отдельных частях инокулированных растений.

выводи

1. Получены новые данные о симптоматике, распространенности и штаммах-УВК на основных пасленовых культурах, выращиваемых в Северо-Западной зоне и Краснодарском крае России, а.также в Грузии, Молдове, Азербайджане, Узбекистане и на Украине. Помимо картофеля, табака, томатов и перца этот вирус впервые удалось выделить из растений бархатцев вида 'Г. signata.

2.' Методом.ИФА и индикаторным методом подтверждено сходство антигенных и биологических свойств выделенных изоллтов УВК с известными штаммами этого вируса.

3. Разработана эффективная методика очистки УВК и получена диагностическая антисываротка к этому вирусу. Проведено ее успешное испытание в АБВ-тесте, латекс-тесте и ПА-ИЗЭН.

4. Предложена оригинальная методика ИФА, обеспечивавшая значительное снижение уровня фоновых реакция при сохранении высокой чувствительности определения .УВК.

5. Разработана непараметрическая процедура статистической обработки результатов №?А, которая позволяет не только проводить определение положительно-отрицательного порога, но и оценивать диагностическую информативность разных вариантов этого теста.

6. Изучена симптоматика и динамика развития инфекции УВК на разных формах картофеля, табака, томатов и перца. 'Определены оптимальные сроки для тестирования УВК "в отдельных растительных

'органах этих культур.

7. Изучены особенности проявления моноинфекции (УВК) и смешанной вирусной инфекции (УВК + ВТМ) на разных видах и сортах томатов и перца. Установлено, что внешние симптомы вироза на зтих культурах могут значительно усиливаться при их совместном заражении УВК и ВТМ.

8. Среди представителей семейства, solanaceae полным иммунитетом ко всем выделенным изолятам и.штаммам УВК обладают: с.ап-nuum (сорта: SP-50, Yolo Wonder, Yolo Y); C.baccatum (К-5402)!

С.pendulum (к-2150 ,K-5659) u L.hirautum (K-3947).

ПРАКТИЧЕСКИЕ И МЕТОДИЧЕСКИ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При проведении профилактических мер.борьбы с УВК, в частности,' на семеноводческих посадках картофеля необходимо учитывать возможность его переноса с участков, занятых другими культурами (перец, табак, томаты)..

2."В селекции на устойчивость к УВК целесообразно привлекать следушцие, формы паслёновых растений» с. annuum (сорта: sp-50, Yolo Wonder, Yolo Y)| C.baccatum (К-5402)! C.pendulum (K-2I50, K-5659> u L.hirautum (K-3947).

3. Для экспресс-диагностики УВК на разных пасленовых культурах следует использовать Оптимизированную автором методику ИФА

• (Обручков, 1991). В. качестве дополнительной меры, способствующей повышению диагностической информативности этого теста, мы также рекомендуем проводить двойную блокировку твердой фазы: до и после нанесения анализируемого сока.

При тестировании УВК в растениях картофеля, табака, томатов И-перца необходимо принимать во внимание наши данные о динамике его накопления в отдельных органах этих культур,

По материалам диссертации опубликрваны следующие^работы:

1. Обручков В,С. Диагностика штаммов У~вируса картофеля (УВК) методом иммунофермёнтного анализа с использованием моноклональных антител //VIII Боесоюз.сов. по иммунитету.с.-х. растений к болезням и вредителям: Тез.докл. - Рига, 1.986, - ч.11.-С.39-40.'

2.' Обручков BiC. Способ диагностики вирусных заболеваний пасленовых культур: Авторское свидетельство .6 1705344. - 1991. -8с." '. •■"■••'

3. ,Обручков В.С, Диагностика вторичной инфекции У-вируса картофеля (УВК) в свежеубранноц я естественно проросшем клубневом материале картофеля методом Шк.А/ Материалы науч.конф., посвященной IOO-летйп со дня открытия вирусов Д.й.ИванОвскии: Тез.докл. -Ростов-на-Дону, 1992. - С.,95-97,

Обручков B.C.* Изучение динамики накопления штаммов У-вируса картофеля (УВК) на разных сортах перца // Материалы науч.конф.', посвященной IOO-летип со дня открытия вирусов Д,И,Ивановскии: Тез.докл. - Ростов-на-Дону, 1992, - С.97-98,

5. Обручков B.C.1, Козлов Л.П, Виро-бактереальная агглютинация в капиллярных трубках // Теория и практика иппользованйя иммунитета с.-х. культур к вирусным болезням. - Вильнюс, 1984. - С;251-252.

6." Обручков В.О.'-, Матевосян Г.Л. Применение регулятора роста риндита на клубнях картофеля при тестирований У-вируса методом имиунофериентнсго анализа (ИФА) // Иатериалы к науЧкПракт.конф. "Биологически активные вещества.в сельском хозяйстве"} Тез.докл. -Л;, 1988. - С.14. ..»'..