Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новый биологический модулятор и препараты интерферона в противоопухолевой защите

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Новый биологический модулятор и препараты интерферона в противоопухолевой защите"

<ацшшлш(1{1 4шГфши}1иг)шр)ш(1 0-|шл1адтб11Ьр[1 Иодш^й Ш[шцЬй'1т) Ч-. ¡с. Р-тГ1||шр1шО[1 шГп]. ^1.Гшш])[цЦпп][1 Мшгфтпип ■ -, ,,

ЗЬр-'Ппфиушй £2шр)1&Ь П-гирЬС)! ■.,[ ]

кьъиириъшлги ЪПР 1тапы,38прг; и ки8ьр;ььрпъъ

^ИНРИиЗПНРъЬРР 1Ш11-П-ПМ5-Р11ШЛ., «ПиСЗ^иЪПМа-ЗПМдПНТ

<Т.00.03 - сзМЬтЛДци, 1}Ь0ишршйтр]П1й гёитШич^тгщ^шйр

^Ьбишршйш^идб сфтпщтОй{л]1(1 гр^цппр^^тш^шб штгфбшб^1н^д(1шй идпЬ0ш1ипитнр]шГ1 иЪщТик^ф

ЬГЬ'ЩЪ 2000.

Национальная Академия Наук Республики Армения Институт Биохимии им. Г.Х. Буниатяна

Тер-Погосян Зарине Рубеновна

НОВЫЙ БИОЛОГИЧЕСКИМ МОДУЛЯТОР И ПРЕПАРАТЫ ИНТЕРФЕРОНА В ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ ЗАЩИТЕ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биолог ических наук, гю специальности 03.00.03 - генетика, молекулярная биология

0§. /

ЕРЕВАН 2000

UuibOui|ununipjLuD [эЬйшО Ьша1лидлф[ t; « Üb Ц. U. bujüuipgjiüijp шйЦ. nfnnigeuipuiCiuiUaiCi ЦЬСилрпйшй: О-рспшЦщй |unphpnujirini'

р^21)шЦшй qhinrupjruODbph rjnljuinp, и|рпф. L. Ъ. UtjfimyiuCf •Пшгтпйш^шО Dürjfu5iu|unuCibp*

1. рсЗДш^иай qpuirupjntüCibpp ппЦитп, щрпф.и. U. О-шйршрт!

2. ЦЬйишршйшЦшО qfiinnipjniCiCitjp|i fyil|innp, щрпф. S. Эз. UuipqujujCi

3. рОДшЦшй qhinnipjnitiöbpp rjnl|tnnp, щргф. U. U. <iutfpujpänLiijiuü Umjajuiuniup IjuiqüiulibpLqrupjruiiQ Unibl^ni|jtup 4bCiuuiptuQru.pjuJti hüuintimnun

Т1ш21Л1чшС1П1р]П1.С»о IfiujuuCiuiiru. t; 2000 p^hLy^bJ^L)^ daiüp -¿2.00« Q-Uti <. РгиСфшэдшйр иийЦшО ЦЬйиииррйраф püuinfiLnniinpü 042 йшийшчЬ1Пш1)шЬ (unphpnniCi («. bpUiuü "Ч. UUuuljh 5/1) UmbüuitununipjujCiQ Muupbih fc дшйприиСцц. QUU <. РгиСфьирциСф шйЦшй LjbCiuuJfipCihuJjfi рйитрспгшлр яршггшршймй: Ubn^aiqhpD uji?iu.ei|uj<> !; -dg. jj. 2000p ишийшцртшЦшй (unphpnh qfruuul(LuCi еииртгицшр, ЦЬСшшршйш^шй qpunnLpjniQCipp nnLjtnnp,

Тема диссертации утверждена в МЗ РА Онкологическом научном центре им В. А. Фанарджяна Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Л. Н. Мкртчян Официальные оппоненты

доктор медицинских наук, профессор С. С. Гамбаров доктор биологических наук, профессор Т. Ф. Саркисян доктор медицинских наук, профессор А М. Амбарцумян Ведущая организация Институт Молекулярной Биологии

Защита диссертации состоится ¿3. 42. 2000 г. в d2.0Q часов на заседании специализированного совета 042 при институте биохимии им Г. X. Буниатяна HAH РА (Ереван, ул П. Севака 5/1)

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке института биохимии им Г. X. Буниатяна.

Автореферат разослан г. < I О

Р > /' Ь л " ', /Г-у

Ученый секретарь специализированного совета,

Доктор биологических наук, профессор А. А. Симонян

ъцрпфЬипр

U. U. UpünDjuiCi

Актуальность темы. Профилактика и лечение злокачественных опухолей остаются одной из жизненно важных проблем медицины. Несмотря на значительные достижения в ранней диагностике и лечении опухолей, прогресс традиционных и нетрадиционных методов терапии, заболеваемость и летальность при злокачественных опухолях, занимая второе место после сердечно-сосудистой патологии, продолжают неуклонно расти.В связи с этим, становится псе более очевидным, что приоритетным направлением в противораковой борьбе является профилактика. В последние годы был предложен и осуществлен ряд весьма дорогостоящих государственных и межгосударственных программ по защите внешней среды от канцерогенов, профилактике рака с помощью витаминотерапии, химической профилактике рака молочной железы тамоксифеном. Однако осуществление этих программ не дало ощутимых результатов, и вновь резко возрос интерес исследователей к специфической профилактике рака, которая зиждется на двух основах - в опухолях имеются опуходеспецифические антигены (АГ), и организм опухоленосителя способен к специфическому иммунному ответу в отношении их. (Eisen, 1990, Г.И. Абелен, 1994, Colis, 1996,). С момента открытия первых, онкофетальных антигенов (ОФА) у животных и человека до настоящего времени, когда их число достигает многих десятков, спи, о основном, рассматривались в качестве важных опухолевых маркеров скрининга, диагностики, мониторинга и прогноза (В.Б. Винницкий с соавт.,1988, В.Н. Самойленко с соавт., 1989, П.Н. Напалков, 1989, Gema, 1996, Tartour, Fridman, 2000). Известно, что, сравнительно с многочисленными другими патогенными актами, иммуно^нность оиухолеассоциированиых антитенои значительно слабее. Это препятствует формированию цитотоксических Т-клсток, для которых необходима связь опухолевых АГ с белками главного комплекса гистоеовместимости I и Ц классов. Однако значительные успехи молекулярной биологии и иммунологии позволили преодолеть этот барьер и вызвать Т-клеточный лизис (Tsang е.а., 1995, Milcheil, 1995, Eberline е.а., 1996). В настоящее время широко используется возможность создания вакцин, содержащих гены опухолевых АГ и различных противоопухолевых цигокинов совместно с иммуноадъювантами (Ilellstrom е.а., 1990, Sobo! е.а., 1996, Hanna, 1996, В.M. Моиссенко с соавт., 1999, Яненене с соавт., 1999, Н.Н.Носик, 2000, Nawrocki е.а., 2000, Nelson е.а., 2000).

В Онкологическом Научном Центре Армении более 10 лет изучаются нуги повышения специфического и естественною иротивоопухолевош иммунитета Исследовательская платформа зиждется на научной концепции, выдвинутой и осуществленной иод руководством проф. Л.Н. Мкртчяна (Л.Н. Мкртчян, ¡984, Л.Н. Мкртчян с соапг, 1986). Базируясь на сходстве раковых и эмбриональных клеток, продуцирующих тождественные фетальные белки, сделана попытка использовать их пул

и к постоянно возникающим трансформированным клеткам различного гистогенеза, элиминируя их на ранней стадии опухолевой» роста.

Цель и задачи рабсны. В аспекте вышесказанного, целью работы являлось изучение биологических свойств нового препарата - Эмбрионального противоопухолевого модулятора (ЭПОМ). и способности его к выработке специфического иммунитета при злокачественных новообразованиях. Кроме того, изучалась эффективность иммунокоррекции с помощью интерферона и его индуктора у онкологических больных, что могло бы способствовать усилению действия ЭПОМ при совместном их применении. Для реализации цели работы выдвинуты следующие задачи:

1. Состав Эмбрионального противоопухолевого модулятора -ЭПОМ.

2. Изучение безвредности ЭПОМ, его .мутагенного и антимуюгенного действия.

3. Противоопухолевое действие ЭПОМ в эксперименте на моделях ряда перевивных опухолей.

4. Влияние ЭПОМ на индуцированный канцерогенез.

5. Способность препарата к индукции специфического иммунного ответа и иммуномодулирующее действие ЭПОМ.

6. Антивирусное действие ЭПОМ и изучение его иитсрфсроногсшюй активности.

7. Изучение влияния ЭПОМ на показатели иммунитета у больных раком шейки матки.

8. Состояние Т-клеточного звена иммунитета у больных раком шейки матки (РШМ) и раком молочной железы (РМЖ) и возможность иммунокоррекции их с помощью интерферона и его индуктора -ларифана.

Научная новизна.

Установлена структура и подлинность препарата, выявлено отсутствие у него токсичных свойств.

Показано выраженное антиканцерогенное и противоопухолевое действие ЭПОМ в эксперименте. Доказана способность ЭПОМ индуцировать специфический иммунный ответ и усиливать естественную противоопухолевую защиту.,

Доказана в эксперименте плейотропность ЭПОМ. выражающаяся в наличии интерфероногенного, иммуно модулирующего, антимутагенного и антивирусного действия.

Показано ингибирующее действие препарата на репродукцию вируса иммунодефицита человека in vitro.

Выявлен иммунодефицит Т-клсточного звена иммунитета и продукции интерферона у онкологических больных до начала лечения, коррегируемый препаратами рекомбинаштюго ИФН и индуктора ИФН.

Практическое значение работы. Экспериментальные исследования, доказавшие ирогикоопухолевое лействие ЭПОМ и способность к индукции специфического иммунного ответа, сочетающиеся с другими важными биологическими активностями, и. стимулирующими ccreciвенные факторы иммунитета, при отсутствии побочных реакций, послужили основанием для применения ЭПОМ у онкологических больных до общепринятого лечения, для целей иммунокоррекции и усиления противоопухолевой резистентности.

Результаты применения ЭПОМ в клинике ОНЦ у небольшого числа больных раком шейки матки до оперативного лечения, свидетельствуют о возможности использования его для усиления естественной противоопухолевой резистентности и снятия толерантности к ОФА.

Эффективность иммунокоррекции нарушений Т-клегочного иммунитета у онкологических больных с помощью ИФП и его индуктора позволяет предложить их сочеганное применение с ЭПОМ, для усиления и пролонгирования его действия.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на научных конференциях ОНЦ МЗ РА (Ереван, 1986, 1989, 1990, 1996), на X Всесоюзном Симпозиуме соц.стран по интерферону (Рига-1988). Всесоюзной Конференции «Реабилитация иммунной системы» (Цхалтубо. 1990), I Сьезде онкологов стран СНГ (Москва, 1996), I Сьездс онкологов стран Закавказья (Тбилиси, 1998), IV Конгрессе Международной Ассоциации морфологов (1998), Сессии Академии мед. наук Армении (Ереван, 1999), И Сьезде онкологов стран СНГ (Киев, 2000), а также на международных конференциях: ЕССО 6th European Conference on Clinical Oncology and Cancer Nursing (Firenze, 1990), 5a International Congress of Chimiotherapy and Cancer Nursing (Paris, 1995), «Anticancer Research» Int.Conference (Greese, 1995), 6th International Congress on Anticancer Treatment (Paris, 1996). 21-st Meeting of the International Association for Breast Cancer Research (Paris, 19%), 7th International Congress on Anticancer Treatment (Paris, 1997). 4th International Congress on Cancer, Gerontology and Ecology (Beijing,China, 1998).

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы. 7-и глав, включающих описаиие примененных методов и собственного материала, обсуждения, выводов и списка литературы (238 источника). Работа изложена на 196 страницах, иллюстрационный материал представлен 52 таблицами и 1 i рисунками.

Методы исследования.

Для изучения общетоксического действия ЭПОМ в качестве экспериментальных животных использовались крысы., мыши, кролики и морские свинки.

Острая токсичность ЭПОМ исследовалась на 38 беспородных белых мышах и на 36 сниженных мышах линии СВА, на 38 беспородных белых крысах и на 35 крысах линии Внсгар. Исследования по хронической токсичности ЭПОМ проводили на 180 беспородных крысах и на 28 кроликах породы «шиншилла». Б опытах были использованы гематологические и биохимические методы, проведены патоморфологичсские исследования внутренних органов животных, изучено состояние сердечно-сосудистой, нервной и выделительной систем, деятельность желудочно-кишечного тракта, кожная реакция.

Эксперименты проводили на шести моделях перевиваемых опухолей .животных - асцитная опухоль Эрлиха, саркома - 37, саркома-180, асцита« гепатома Зайделя, карциносаркома Уокера и лимфосаркома Плисса.

Для иммунизации ЭПОМ вводили мышам внутрибргошинно в объеме 0,3 мл, крысам в объеме 0,5 мл однократно и двукратно. Перевивку опухолевых клеток (1 х Ю5 клеток) проводили внутрибрюшинно. О повышении противоопухолевой резистентности судили но продолжительности жизни (СГГЖ) животных, степени торможения роста опухолей и проценту неразвившихся или рассосавшихся опухолей.

Эксперименты по изучению влияния препарата на индукцию опухолей проводили с использованием ДМБД (7,12-диметилбенз(а) антрацен) и Ы1 (бенз(а)пирен) производства швейцарской фирмы " Pluka, Buchs". Канцерогены вводили животным подкожно: ДМБА- в дозе 10 mi/кг и БП - в дозе 40 мг/кг. Всего в экспериментах было использовано 140 крыс . (Gelboin, 1983).

Наличие ОФА в составе ЭПОМ выявляли с помощью иммунофермеш ного (ИФА) и радаоиммунного (РИА) методов в ОНЦ МЗ РА Институте акушерства и гинекологии МЗ РА и в ОНЦ РФ. ИФА проводили с помощью имеющихся тест-наборов фирмы Roche. Содержание трофобласгического бегаг-гликопротеина (ТБГ) определялось радиоиммунным методом отечественным набором.

Для определения антигелообразования использовали общепринятые методики - реакцию связывания комплемента (РСК) и реакцию торможения пассивной гемагглютинации (РПГА) (В.М. Никитин, 1977).

Для изучения специфического клеточного иммунитета использовали методику реакции подавления прилипания мононуклеаров (РППЛ). предложенную Halliday а. Miller (1978) и основанную па снижении

адгезивных свойств прилипающих клеток иод влиянием антигена ( ЭПОМ) и сенсибилизированных к нему лимфоцитов. Применяли макрометод реакции, описанный Kalafut et al (1978).

Реакцию иммунного розеткообразования (ИМ-РОК), проводили но методу Zaalberg (1979). Иммунмй ответ определяли на 10-й день после однократной инъекции мытам биологически активной дозы - 0,5 мг ЭПОМ. Реакцию атителообразующих клеток (АОК) в селезенке мышей проводили по методу Ернс (1976).

Мононуклеары из гепаринизированной периферической крови здоровых доноров и больных PL1IM и РМЖ выделяли по методу Bovum (1968), в градиенте (р-р фиколла-гипака, France), выход живых клеток составлял 9396%.

Общее число Г-лимфоцитов и уровень регуляторных субпопуляций (СДЗ, СД4, СД8'. С Д19 I ) определяли с помощью монсклональных антител (Dvnal, Dynabeads М-450, Oslo. Norway). Определение естественных киллеров (ЕКК) проводили с помощью набора ИФА (BIO advance, France) с моноклоиалышми антителами к субпопуляции лимфоцитов СД56 .

Мононуклеары, выделенные по методу Boyum, соединяли о анти- CD4 t и CD8+ МАТ в количестве 70 мкл и инкубировали при температуре 4JC, в течение 45 минут при помешивании. Затем с помощью магнита отделяли каждую субпопуляцию лимфоцитов и подсчитывали в камере Горяева. Для выявления влияния ЭПОМ на субпопуляции Т-клеток in vitro, мононуклеары инкубировали с различными дозами ЭПОМ в течение 1 часа при температуре 37°С, отмывали и использовали для определения CD4 >- и CD81 клеток по вышеописанной методике.

Реакцию на фитогемагглютинии (ФГА) ставили с дозой 2 мкг в обьеме 0.1 мл путем введения в кожу средней грети внутренней поверхности предплечья туберкулиновым шприцом. Результаты учитывали спустя 24 часа.

Для выявления рецепторов к ЭПОМ на Т-клегках использовали метод биотинизации, основанный на большой гропности молекулы биотипа к стрептавидину. Биотин с помощью специального лигана связывали с ЭПОМ и соединяли со стрептавидшюм, связанным с быстроразлагагощимся красителем. Биотинизированный ЭПОМ инкубировали в течение 1 часа с субпопуляциями Т-клеток (CD4 + . CD8>). результаты реакции учитывали по методу пестерн-дотт.

Клеточные культуры. В работе использованы перевиваемая линия аденокарциномы гортани человека Нер-2, лимфобластондпые трансформированные клеточные линии МТ4 и СЕМ. перевиваемая линия мышиных фибробластов L-929. а также введенные в культуру лимфоциты периферической крови человека.

Антивирусная активность препарата в отношении вируса гриппа (ВГ) типа А. иггамма A/Aichi 2/68(IbN2), и вируса зпцефаломиокардита - Вг0М (семейство пикорпавирусои) изучалась на белых нелинейных мышах.

Противовирусная активность ЭПОМ в отношении вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), штамм LAV. исследована in vitro па перевиваемой лимфобластоидиой клеточной линии МТ4. Методика основана на цитопаюгешюм действии ВИЧ на клеточную линию МТ4. выражающемся в формировании синтициев, приводящем к клеточной гибели на 8-й день заражения. Параллельно производилось также измерение вирусной обратной транскриптазы(ОТ) в надосадочной жидкости.

Об угнетении репродукции ВИЧ под действием ЭПОМ в суспензионных культурах лимфоцитов из периферической крови человека судили по количеству обратной вирусной транскриптазы, измеряемой с помощью радиоактивной метки. Результаты учитывали в гамма -счетчике по количеству импульсов.

Ингерферогенная способность препарата у мышей исследовалась методом титрования па культуре клеток мышиной линии L - 929. В качестве тест-вируса использовали вирус энцефаломиокардита. Определение ИФН в изучаемых образцах плазмы пациентов проводили методом ИФА с помощью моноклональных антител к альфа- и гамма-ИФН (Roche, Francc).

Результаты и обсуждение

На протяжении нескольких десятков лет ученые ведут поиск наиболее иммуногенных опухолевых антигенов, способных вызвать у иммунизированных животных не только гуморальный, но и выраженный клеточный ответ, способный отторгнуть опухоль. Попытки иммунотерапии онкологических больных с помощью аутологических вакцин из опухолевых клеток предпринимались с начала 70-х годов (Нитр1ил- еа., 1973. Сите, 1973. Ьситв с.а.. 1975).

В качестве вакцин против различных опухолей в первый период их исследования применялись не только аугологичньге. но и аллогелные. сингепные клетки опухолей, гетерогенизированиые различными методами опухолевые клетки, экстракты из них. а также очищенные антигены мембран этих клеток (Grant е.а. 1974, Г.И.Авдеев, 1975. В.В.Городилоиа и М.Н.Боева. 1983, М.Д. Моисеснко с еоавг.. 1987, Т.С. Шалимова с соавт., 1996).

ОФА как наиболее постоянные и консервативные АГ многих опухолей, всегда были в поле интересов ученых. рано установивших противоопухолевый эффект эмбриональных тканей и их :>ксфактов, связанный с иммуногенпоетыо эмбриональных АГ (В.И. Г'овалло с соавг.. 1983, В.М. Дильмаи с соавт.. 1983, В.В. Винницкий с соавт., 1990, Chakravarty е.а.,1991. Katsanis ca., 1997). В последнее десятилетие была показана целесообразность включения ОФА в состав противоопухолевых вакцин (Tsang е.а., 1995, Mitchell. 1995. В.М. Моисеенко с соавт., 1999, Яненене с соавт., 1999, H.H.Носик, 2000). В згой связи, представлялось интересным изучить противоопухолевое действие нового биологического препарата полученною из эмбрионального органа, в составе которого имеется широкий пул эмбриональных антигенов.

Биохимический состав ЭПОМ. Препарат содержит пул белков гликопротеидов, извлеченных т эмбрионального органа методом спиртового осаждения. Согласно результатам аналитического электрофореза, в 10% гюлиакриламидном геле по Денису, препарат содержит 5 фракций белка.

Помимо белков, в составе ЭПОМ имеется около 1,5°-о свободных и 8-10% связанных углеводов. Из ферментов присутствуют алании аминотрансфераза (AJ1T), аспаргатаминотрансфераза (ACT), лактачдегидрогеназа (ЛДГ). щелочная фосфатаза (ЩФ), содержатся также микроэлементы Mg, К, Р, Ca. Содержание ферментов и микроэлементов в вакцине представлены в табл 1.

В составе гликопротеидов обнаружен ряд эмбриональных АГ АФП. ТБГ, ХГ, РЭА Са-1 5-5 и Ca 19-9, в концентрациях во много раз превышающих их содержание в сыворотке крови здоровых взрослых лиц.

Таблица ¡.Величина некоторых биохимических показателей в препарате ЭГТОМ

Тест 95-1У 96-Ш 98-1У Ед. Изм. N в сыв. |

Общ. Бел 3.525 3.350 3.430 г/л 66-87 |

Ходест. 0.0 0.0 0.0 Ммоль.'л 1.3-6.47 |

лдг 3.0 2.7 2.75 ел/л 0.0-450 ! 1

Глюк. 0.3 0.3 0.3 М моль'л 3.3-5.5 1 1

ТГ 0.0 0.0 0.0 Ммоль/л 0.0-2.3 |

Мочев. 0.07 0.1 0.09 1 М моль/л 1.7-8

АЛТ 1.47 1.4 1.3 ед'л 0.0-40 |

Альб 0.7 0.4 0.8 г/л 35-50

Креат 5.25 4.0 4.7 мкм/л 45-115

ЩФ 24.7 21 22.5 ед/'л 50-250

АКТ 71.92 71.9 71.9 Ммоль/л

мё 1.7 1.7 1.6 Ммоль/л 0.7-1.05

Р 0.52 0.50 0.47 Ммоль/л 0.87-1.4

К 0.96 0.8 0.9 Ммоль/л 0.4

Са 0.65 0.58 0.6 Ммоль/л 2.0-2.6

Примечание: серия препарата обозначается годом получения и месяцем.

Безвредность ЭГЮМ. Изучение острой и хронической токсичности 31 ЮМ было проведено на различных видах животных, при введении максимально возможных доз, во много раз превышающих биологически активную. Судя по результатам опытов, оцениваемых с использованием биохимических, гематологических и морфологических методов, препарат не токсичен, не имеет аллергизирующих свойств. Согласно данным Л.Н. Мкргчяна, А.К, Нерсесяна (1996). АК. Нерсесяна (1998), ЭПОМ не обладает кластогенными свойствами и не канцерогенен.

Противоопухолевое действие ЭПОМ. Исходя из наличия в ЭПОМ ■эмбриональных АГ. прежде всего было изучено его противоопухолевое и

антиканцерогенное действие на индуцированных и перевивных опухолях живо i пых.

Противоопухолевое действие ЭПОМ доказано па 5-и из 6-и перевиваемых опухолях мышей и крыс (опухоль Орлика, и Зайделя. саркома 37, лимфосаркома Плисса. карцнпосаркома Уокера), в которых, по данным литературы, также наблюдается ресин гез ОФА. сходных с таковыми у человека ( Kellen е.а.. 1982, H.A. Зорина, P.M. Зорин, 1988, Coggin o.a., 1993, Г. И. Абелев, 1994). Данные о влиянии ЭПОМ на развитие асцитных опухолей - Эрлиха и Зайделя - представлены п габл. 2.

Таблица 2. Влияние иммунизации ЭПОМ на продолжительность жизни мышей с опухолью Эрлиха.

Опух. Группы Число СПЖ (дни) % удлинения Число жив.

штамм ЖИВОЛ1. жив. СПЖ с рассосапш. OÜVK.(%)

'Jnvxo.ii. Однокр. 10 14.2! 1.2 19.2 -

Эрлиха мыши) иммуниз.

Двукраг. иммуниз. 10 17.8 + 2.6 74.5* 30-2.1

кои гроль 10 10.2+1.8 - -

"епатома Однокр. 12 18.4+2.0 г 12.9 25.0+3.3

?айделя крысы) иммуниз.

Двукраг. иммуниз. 12 33.4 i 3.7 1 04.9* 58.3+7.4

Контроль 12 16.312.9 - -

- разница между контролем и опытом достоверна (р < 0,01).

Согласно данным таблицы, н однократная, и двукратная иммунизация длиняли СПЖ животных, при этом у трех из Ю животных возникшие пухоли полностью рассасывались. Однократная иммунизация существенно ¡е увеличивала СПЖ крыс с асцитной гепатомой Зайделя. однако у 5 из 12 сивогных наблюдалось обратное развитие накопленною асцита.

1ри двукратном предварительном введении ЭПОМ до перевивки аблмдаемый нами противоопухолевый лффект был гораздо значительнее, и

выражался в достоверном подавлении роста опухолей, в удлинении средней продолжительности жизни и, что особенно важно, в рассасывании част» возникших опухолей.

Согласно рис. 1, двукратная иммунизация ЭПОМ достоверно тормозил; развитие трех из четырех перевиваемых опухолей. В отношении саркомы 3"/ ■эффект был выражен слабее.

Рис. 1 Сравнительное влияние ЭПОМ на развитие перевиваемых опухолей

140 -120100-

К 80 с 60 О

4020 0-

12 3 4 перевиваемые опухоли

ОАаитная стухотъ Эргиха

□ Гелагом За/дата

О Лимфэсаркома ГТгюса

□ Сэрссма37

Антиканцерогенное действие ЭПОМ было установлено в отношении дву сильных канцерогенов, ДМБА и БП, вызывающих при однократно! введении образование опухолей спустя 2-2.5 месяца. Предварительно двукратное введение ЭПОМ линейным крысам достоверно снижало частот выхода опухолей, достоверно подав.индо их рост и вызывало удлинени лат ентного периода но сравнению с контролем (табл. 3).

Таблица 3. Влияние ЭПОМ на канцерогенез, индуцируемый ДМБА и БП

Группы животных ДМ НА Число живот ных в группе Ъффск тив-ное число Выход опухолей. Число % г Р< Латентный период, сутки Масса опухолей, (г) Индекс шрмо жения (%) !>0.6 ""

20 19 19 100+4,3 45,4-3,9 6.8012.21 1

ЭПОМ ДМБА БП 20 18 14 77,8+9,2 0.05 58,8+5,3 0.05 2,68 Ю,24

20 19 15 78,9+9,1 То 57,9111,0 76.6+6,8 5,16+1,32

ЭПОМ 4- БП 20 19 0.05 89,2+5,4 0.05 2,2510,9 56.3

Выраженный антиканцерогенный эффект ЭПОМ важен, так как индуцированные опухоли, в отличие от перевивных, по ряду параметров (зарождение и медленное развитие в одном и том же организме, реализация эффекта посредством иммунной системы) ближе к спонтанным опухолям человека (И.В. Аникин с соавг., 1993). ОФА, как известно, не обладают видовой специфичностью, и синтезируются как в опухолях человека, так и в опухолях животных, они сходны по структу ре и функции и дают перекрестные иммунные реакции. О развитии у животных специфического иммунитета к ЭПОМ свидетельствуют выявленные нами клеточные и гуморальные реакции у иммунизированных ЭПОМ мышей.

Специфический иммунитет, создаваемый ЭПОМ. Иммупогенносгь ЭПОМ была изучена на мышах, получивших препарат двукратно (с интервалом в 10-12 дней) до перевивки опухолевых клеток. О наличии активного иммунного ответа у онуходеностелей свидетельствовали титры антител в РПГА и РСК (табл. 4).'

Таблица 4. Действие ЭПОМ на активный иммунный ответ у мышей в тестах РСК и РПГА

Группы мьгшей Кол-во мышей РСК (среднегсомстричл игр в кщ 2 ) РПГА (средне! сом. титр в 1од г)

ЭПОМ (1 опыт) 20 4.3+0.7* (20.0) 5.610.5*

ЭПОМ (2 опыт) 18 4.5+0.4* (22.6) 16.2+0.7*

Контре» ль 10 <2.7(1:5) ¡<2.3

* -достоверно по сравнению с контролем.

О развитии специфического клеточного иммунитета свидетельствовали положительные результаты в РШШ, указывающие на сенсибилизацию лимфоцитов под воздействием ЭПОМ (табл. 5).

Таблица 5. Развитие специфического клеточного иммунною ответа к ЭПОМ у мышей в РППЛ

Группы животных Частота | Усредненный индекс :

положит, реакции ингибиции 1

ЭПОМ 17/20 0.63+0.05 |

Контроль(плацебо) 0/15 1 0.17-0.02 !

Учитывая сложный состав препарата и наличие в нем, помимо эмбриональных антигенов, и других гликопротеидов, мы сочли целесообразным изучить и другие возможные биологические активности ЭПОМ, в частности, его антивирусный эффект.

Антивирусное действие ЭПОМ было установлено в о!ношении вируса 1~риппа человека типа «А» и вируса энцефаломиокардита мышей па моделях вызванных, ими экспериментальных инфекций. Введение ЭПОМ за 24 часа до заражения обоими вирусами вызывало достоверное снижение летальности животных и подавление репродукции указанных вирусов в организме зараженных мышей. Данные о действии профилактического введения двух доз ЭПОМ на экспериментальные инфекции у мышей, вызванные ВГ и ВЭМ. представлены в табл. 6.

Таблица 6. Влияние ЭПОМ на развитие экспериментальных инфекций у мышей.

Экспер. инфекции Группы мышей Число мышей Кол-во павших % легальности 1

Вирус гриппа ЭПОМ (0.5мг) + Ш" 15 7 46.6+5.1* <0.02 | 1

человека ЭПОМ (1.0мг) + ВГ 18 7 38.8+4.1* <0.02 !

Контроль (ре мант. + ВТ") 16 5 31.2+4.3* <0.01

Контроль ВГ 16 13 81.2+6,1 -

Вирус энцефало- ЭПОМ (0.5мг) + ВЭМ 12 4 33.3+5.6 0.05

миокардита мышей ЭПОМ (1.0мг) + ВЭМ 13 4 30.715.1 Ч).05

Контроль ВЭМ | 11 6 54.0+7.2

* -достоверно по сравнению с контролем.

Согласно данным шбл. 6, ЭПОМ достоверно снижал % летальности животных и обоих опытах по сравнению с контролем, при этом действие двух испытанных доз препарата было приблизительно одинаковым.

Интерфероногенное действие ЭПОМ. Учитывая значительный антивирусный эффскг ЭПОМ на течение и исход двух вирусных инфекций, была исследована возможность индукции им интерферона - важного неспецифического фактора противовирусного иммунитета. Согласно данным рис. 2, ЭПОМ индуцироцал синтез сывороточного ИФН у мышей через 24 часа после введения, уровень которого снижался к 72 часам. Титры индуцированного ЭПОМ интерферона уступали титрам, индуцированным дсРНК - ларифаном, однако, интерфероногецная способность ЭПОМ несомненно, является одним из механизмов антивирусного действия препарата.

Рис. 2 Динамика уровня сывороточного ИФН индуцированного ЭПОМ у

мышей

24 48 72

часы

Действие ЭПОМ на репликацию нируса иммунодефицита человека (ВИЧ) Учитывая антивирусную активность ЭПОМ в отношении экспериментальных вирусных инфекций ВГ И ВЭМ. представлялось небезынтересным изучить его воздействие на репликацию ВИЧ in vitro. Эти исследования проводились в Национальном институте здоровья Франции, в отделе ретровирусов.

Клетки лимфобласгоидной линии МТ4 преинкубировали с различными дозами ЭПОМ в течение 1 часа. О репродукции ВИЧ в клеточной культуре судили по интенсивности образования синтициев и степени синтеза вирусной ОТ. Полученные результаты представлены в табл. 7.

и

Таблица 7. Тесг ингибиции синцитиев в клеточной линии МТ4

ЭПОМ \i.-Ml Дни Активн.вирусн. О'Г-импулъсы ' (на 8-й день)

4-й 5-й 6-й 7-й 8-й

2,5 - - - - 720 (27*

1.0 - - (0 -»-+ 567326+438

0,5 - + 1 11 323660+270

МТ4 (не - - - 690)45

инфиц.) ■

МТ4/ ВИЧ ++ ++ ++ ++/Т 242822+764

Примечание.

— — нет синцитиев;

(+) — появление синцитиев;

— малочисленные синцитии; ++ — многочисленные синцитии, ++/Т клепочная смерть. *— достоверно но сравнению с контролем.

Согласно данным табл.7, предварительная инкубация клеток с ЭПОМ в концентрации 2.5 мг/мл подавляла образование синтициев вплоть до В-го дня, и достоверно снижала активность ОТ, тогда как две меньшие дозы вызывали ишь незначительную задержку.

Данные о влиянии ЭПОМ на лимфоциты здоровых доноров, инфицированных ВИЧ в двух разведениях - исходном и 10"1, представлены в

табл. В.

Таблица В. Действие ОПОМ на репликацию вируса в лимфоцитах, зараженных ВИЧ

Исслед. пробы лимфоц. Исходи Активность вирусн. ОТ (импульсы)

кол-во 3-й 7-й день 10-й 14-й 17-й

клеток день день день день

ЭПОМ+ 5x106 1210+ 698+47 386+35 1186+ 1286+

ВИЧ 270 227 286

ЭПОМ+ 5x10* 650+52 1144+ 458164 876+75 2106+

ВИЧ"1 230 340

ВИЧ 5x104 4980+ 13468+ 30628+ 10259+ 85454+

205 1030 5200 1250 5700

ВИЧ1 5x10' 962+ 5878 * 10166+ 45398) 63118+

220 840 7500 9780 6200

Контроль 5x106 436+95 1234+ 230 300+95 1480+ 310 1348) 260

Примечание: начиная от 5000 импульсов - заражение клеток вирусом.

Полученные результаты свидетельствуют, что в лимфоцитах, обработанных ЭПОМ, синтез ОТ был значительно ниже в течение всего срока наблюдения.

Итак, есть основание полагать, что ЭПОМ, с сто противоопухолевой активностью и способностью подавлять репликацию ВИЧ, может быть испытан при опухолях, ассоциированных со СПИДом.

Иммуномодулируклцее действие ЭГЮМ. Ранее, в эксперименте, была выявлена способность препарата усиливать первичный иммунный ответ. Вследствие этого представлялось интересным исследовать иммуномодулирующее действие препарата у человека. Мы изучали действие ЭПОМ на уровень и соотношение субпопуляций Т-клеток здоровых доноров и больных РШМ in vitro. Согласно результатам, биологически активная доза существенно не влияла на содержание общих Т-клеток и на их субпопуляции, и только доза, в 10 раз превышающая биологически активную, вызывала увеличение Т-супрессоров без изменения числа Т-хелперов, как у доноров, гак и у больных РШМ (рис. 3). Полученные данные

ш

свидетельствуют об отсутствии у ЭПОМ иммуносупрессивного эффекта, которым обладают отдельные ОФЛ опухолей (MedofTf е.а., 1984, Sjorgen с.а.,1987, М.С. Ломакин, 1990, Д.Д. Максумова, 1994, Paul е.а., 1998). По-видимому, при сочетанием взаимодействии пула ОФЛ, как это имеет место при применении ЭПОМ, супрессивного действия на иммунные реакции не наблюдается.

Рис.3 влияние двух доз ЭПОМ на показатели регуляторных су б п о пул я ц и й Т-клеток

доноры больные Р III М

Влияние ЭПОМ на показатели имммюреактипности у больных раком шейки матки. Обнадеживающие результаты, полученные в эксперименте, и разрешение Фармкомитета РА и Ученого совета ОНЦ на использование его в клинике, позволили применить ЭПОМ у группы онкологических больных -препарат получали больные РШМ в стадии Т^оМо, до хирургического лечения. Вакцинация проводилась у них для усиления специфического противоопухолевого иммунитета и стимуляции факторов естественной резистентности организма.

Наблюдения за получившими ЭПОМ не выявили у них общей реакции на препарат. Местная реакция проявлялась инфильтратом и гиперемией, что, на наш взгляд, также может свидетельствовать о развитии сенсибилизации к ЭПОМ.

Показатели неспоцифической противоопухолевой защиты у получивших ЭПОМ спустя 7-10 дней после его введения, свидетельствовали об иммунокоррекции, которая выражалась в увеличении общего числа Т-клеток и естественных клеток-киллерои. а также стимуляции кожной РГЗТ на ФГА по сравнению с исходными данным!. Выявлено также развитие сенсибилизации лимфоцитов к ЭПОМ по данным РППЛ (табл. 9).

Таблица 9. Иммунологические показатели у вакцинированных 31 ЮМ больных раком шейки матки.

Иммунологические показатели До | вакцинации После вакцинации Р

■

ЕКК в 1млн. лимф. (%) 7.842.5 9.712.3 >0.2

РГЗТ с ФГА ++ (19 < 1.7 мм) -1 -rt- (26*2.3 мм) 0.05

% СД4+ 35 + 3.2 39.8+3.3

%СД&+ 16 ±0.9 20.5 ±2.2

Абс. число СД4+ 458+5) 521 +37

Абс. число СД8 > 209 ± 35 268 + 44

% Т-клеток 51 ±2.1 60.3 ±4.1 -0.05

Абс. число Т-клеток 667 + 72 789 ± 59

Индекс СД4/СД8 2.16 1.94

% высокодиф. Т-кл. 12 + 0.9 18 ± 1.5 <0.01

% В- лимфоцитов 14 + 3.1 16 +2.9

Абс число В-клеток 183 ±17 209 + 33

Индекс РПИЛ 0.47+0.02 0.56+0.03

i % положит, рсакц. в РП1Ш 16.6+3.3 i 50+4.7 ..... 0.001

Помимо количественного и функционального состояния Т-клеток. мы изучали также влияние ЭПОМ на вырабатываемые ими лимфокины. важные факторы как в противоопухолевой, гак и в противовирусной защите, - альфа и -гамма шггерфероны. Продукция сывороточного ИФН у больных РШМ и здоровых была изучена до и через 24 часа после введения ЭПОМ (табл. 10).

Таблица 10. Продукция сывороточного альфа-ИФП и гамма-ИФП под влиянием 31 ЮМ

Группы больных Число больных ИФП до вакцинации ИФН после вакц.

% индукции Титр в МЕ/мл % индукции Титр в МК/мл

Г РШМ альфа-ИФН 19 31 16.7+2.5 53+3.4 44.6+2.8*

РШМ гамыа-ИФН 19 - Нет Нет 31 34.3+2.2

Здоровые доноры аяъфа-ЙФН 15 13 7.2 <1.1 20< 1.5 57.9-М.5*

Здоровые доноры гамма-ИФН 15 Нет Нет 46 46.7*4.9

* -достоверно по сравнению с результатами до вакцинации (р<0.05).

Согласно данным табл., у больных РШМ ЭПОМ вызывал синтез ИФН-алъфа и -гамма, хотя и в достоверно более низких тиграх по сравнению с здоровыми добровольцами.

Таким образом, ЭПОМ является препаратом, создающим специфический противоопухолевый иммунитет и одновременно усиливающим неспецифическую противоопухолевую защиту. На рис.4 представлено схематическое изображение показанных в эксперименте разнообразных активностей ЭПОМ.

Рис. 4. Механизмы противоопухолевого действия ЭПОМ

Активация СД8+

гуморальный (АТ)

ИФН-альфа

^Ч^ Естеств. иротивооп.

Специфич.

ЭПОМ -о

иммунитет

клеточный (сенсибшт. лимфоциты)

апоптоз

Активация ЕКК\

демаскировка опух, клеток

Однако, применение ЭПОМ желательно сочетать с использованием иммуномодуля горов. способных, пролонгировать и усиливать ■эффекты ЭПОМ. В число таких препаратов входят изучаемые нами в течение ряда лет илтерфероны, индукторы интерферона и метод иммунокоррскции с помощью микроволновой резонансной терапии.

Влияние интерферона и его индуктора-ларифана на иммунореактивность больных РМЖ и РШМ. Курсы иммунотерапии рекомбинангнъш интерфероном (рсафероном), применялись у больных РМЖ при наличии у них иммунодефицита до начала общепринятого лечения, с целью коррекции иммунных нарушений. До начала лечения у больных наблюдалось уменьшение уровня Т-клеток за счет Т-хслперов, угнетение РГЗТ на туберкулин или ФГА и снижение в крови уровня Б1'Л - естественных клеток-киллеров (табл. ] 1).

Таблица 1 I. Показатели неспецифической противоопухолевой резистентности у больных, получивших рсаферои.

Группы больных Т-клегки ("о) РГЗТ(%) БГЛ (%)

СД4+ СД8< 17.5+ 4.7 Индекс Тх/Тс

Больные РМЖ до лечения 25.22.7 1.4410.3 57.117.2Ж 1бЖ+1.3ж

Больные РМЖ после лечения 42.8 + 4.1 19.2 т 3.8 2.05+0.6 6.81+1.3

Здоровые 38.9. 4.8 20 4 < 6.9 1.84+ ¡71.4+8.1* 0.45 | 16.5+3.1 *

р ; -0.05 -0.01 >0.2 ! >0.4 1 ________ <0.02

* - разница между показателями у больных до лечения и у здоровых достоверна.

Согласно данным табл. 11, после курса иммунотерапии реафероном нарушенные показатели числа Т-хелперов не только достигли величин, наблюдаемых у здоровых но и несколько превысили их. Разница абсолютных л относительных показателей Т-хелперов до и после иммунотерапии была достоверной, соответственно, р<0.01, и р '0.01. Таким образом, иммунотерапия способствовала дифференциации и пролиферации ключевых клеток иммунного ответа Т-хелперов.

При исследовании способности мононуклеаров крови больных РМЖ к продукции ИФН-гамма in vitro до и после иммунотерапии, реаферон вызывал достоверное увеличение усредненных титров ИФН у больных РМЖ с 64 до 160 МВ'мл. Корреляция между уровнем Т-хелперов и титром ИФН-гамма у больных РМЖ до и после иммунотерапии свидетельствует о способности реаферона вызывать не только количественные сдвиги Т-хелпероп, но и активизировать их димфокинную функцию, ибо именно Г-хелперы являются основными продуцентами ИФН-гамма.

Согласно данным таблицы, сниженный по сравнению со здоровыми % положительных реакций на ФГА у больных РШМ после курса реаферона возрос почти до уровня, отмкченного у здоровых, хотя разница была статистически недостоверна. Ослабление РГЗТ. как известно, является ранним признаком нарушения клеточно-опосредованпых иммунных реакций.

п

и у 20-30% больных наблюдается раньше количественных сдвигов числа Гх (Ф.И. Ершов, 1996.М.М. ДейлиДж.К. Форме». 1998).

Важным фактором естественной противоопухолевой резистентности является также количественное содержание и функциональная активность ЕКК. в дифференциации и активации которых большую роль играют ИФН-ы (Л.П. Киндзельский с соавг.,1986, Я.В. Шларык с соавт.,1991. Ф.И. Ершов, 1996). Естественные юштки-киллеры и система интерферонов, тесно взаимодействующие между собой, являются первым рубежом защиты против рака (ЯтИЬ, 1987, Л.Н. Мкртчян, Л А. Камалян, 1989, I лп§ег е.а., 1991, 8е1Ьу. Р1Шпап, 1993, Ф.И. Ершов, 1996). Согласно таблице, реафсрои вызывал достоверный нодьем числа БГ'Л.

Влияние индуктора интерферона — ларифана. на иммунореактивность больных РШМ. Нами были исследованы показатели иммунореактивносги у больных РШМ стадии Т^тЫоМг,, получивших до операции курс иммунотерапии ларифаном - деРНК" фагового происхождения. Прежде

(-введение 11-введенке Ш-еведение

всего у них.была изучена способность к продукции сывороточного интерферона после введения ларифана (рис.5).

Как показано на рисунке, у больных РШМ I стадии ларифан индуцировал синтез ИФН, титры которого снижались после повторных введений в связи с развитием рефрактерности к нему. После иньекции ларифана наблюдалась выраженная тенденция к увеличению числа Т-кдеток (р- - 0.2) и достоверный

л

подьсм уровня Т-хелперов (р =0.05) без существенных сдвигов числа Т-супрсссороп.

Согласно полученным результатам, до курса ларифана у больных выявлена выраженная тенденция к снижению % положительных реакций ГЗТ у больных, по сравнению со здоровыми (р>0.05), свидетельствующая об угнетении функциональной активности Т-хелперов и макрофагов. Иммунотерапия ларифаном вызывала выраженную коррекцию РГЗ'Г, о чем свидетельствует увеличение числа положительных реакций почти до уровня, наблюдаемого у здоровых (р>0.05).

В качестве одного из маркеров эффективности терапии ларифаном был определен уровень больших гранулярных лимфоцитов (БГЛ) в крови. Согласно нашим данным, БГЛ среди выделенных из крови лимфоцитов здоровых составляли 11.4+3.5%, тогда как у больных РШМ уровень их был достоверно снижен до 4.7+1.7".о (р<0.05). После применения ларифана содержание БГЛ возросло до 10.2' 2.2% (р>0.05). Следует отметить, что у 8 из 18 больных после иммунотерапии ларифаном значительно нарастало число азурофильных гранул в БГЛ, показателей функциональной активности этих клеток.

Итак, иммунокоррекция у больных РМЖ и РШМ после применения реаферона и ларифана выражалась в достоверном повышении уровня Т-хелперов, содержания БГЛ и нормализации синтеза ИФН-гамма. а также в тенденции к повышению процента положительных реакций ГЗТ.

Иммунокорригирующес действие ИФН и ларифана было сходным, поскольку индуктор реализовал свои эффекты, в основном, посредством индуцируемого им интерферона. Однако иммуномодулирутощин эффект реаферона превосходил таковый ларифана. так как индуцируемые им у больных РШМ титры интерферона значительно уступали титрам реаферона. Результаты исследований позволяют рассматривать интерферон в качест веактиватора Т-лимфоцитов и продуцируемых, ими цитокинов Курсы иммунотерапии интерфероном и его индуктором являются эффективным методом нормализации вторичного иммунодефицита, развивающегося уже на первых стадиях опухолевого процесса при РШМ и РМЖ. Преимуществом этих препаратов является, помимо иммунокоррегирутогцего действия, их плейотропный эффект - противоопухолевый, антимутагеиный и антивирусный.

В последние юды появляется все больше работ о целесообразности сочетания противоопухолевых вакцин ' с иммуномодулнрующими препаратами. В частности, исследуется целесообразность одновременного или последующего применения антимеланомных вакцин с ИФП-альфа

(Hancock, Kirkwood, 1997, Cascinelli, 1999). Проведенный указанными авторами анализ работ свидетельствует о синергидном эффекте ан 1 имеланомиой вакцины, усиливающем специфический иммунитет к ИФН-

0. оказывающее иммуномодулирующее и противоопухолевое дейстие. Эффективность сочетанного введения вакцины и ИФН подтверждается удлинением безрецидивпого периода и увеличением сроков выживаемости больных.

На основании многолетних исследований ЭПОМ, способного к индукции специфического противоопухолевого иммунитета и усилению факторов неспецифической противоопухолевой резистентности, мы полагаем, что препарат может применяться у онкологических больных на ранних стадиях заболевания, на фоне общепринятого лечения, для иммунокоррекции и усиления естественной противоопухолевой резистентности организма. Эффект ЭПОМ целесообразно усилить и удлинить с помощью курсов иммунотерапии интерфероном и его индукторами, поскольку эти препараты обладают прямым антипролиферативным действием, антивирусным эффектом (при виру «индуцированных опухолях) и способностью предупреждать опухолевый рост на генетическом уровне, ингибируя функцию ряда онкогенов и активируя гены-супрессоры опухолевого роста.

Выводы

С целью исследования механизмов повышения противоопухолевой резистентности организма изучалась биологическая активность нового препарата - ЭПОМ. полученного из эмбриональной ткани, и способность его к выработке специфического иммунитета при злокачественных новообразованиях.

1. Противоопухолевый препарат биологического происхождения -ЭПОМ-содержит пул гликопротеидов, включающих различные онкофетальные антигены в концентрациях, во много раз превышающих их норму у здорового взрослого человека, способные формировать специфический иммунитет одновременно к ряду опухолевых антигенов, а, следовательно, и к постоянно возникающим трансформированным клеткам различного гистогенеза, элиминируя их на ранней стадии опухолевого роста.

2. ЭПОМ в экспериментах на различных видах животных, при введении максимально возможных доз, во много раз превышающих биологически активную, не проявляет, согласно проведенным биохимическим, гематологическим и морфологическим исследованиям, острой и хронической токсичности, и не обладает мутагенными, аллергизирующими и пирогенными свойствами.

3. Превентивное действие ЭПОМ на индуцированный с помощью БП и ДМБА канцерогенез у крыс проявляется достоверным снижением частоты возникновения опухолей (57.9 и 78.9 %), ингибицией их роста (56 и 60%),

а также удлинением инкубационного периода. О формировании у иммунизированных животных специфического иммунитета к ЭПОМ свидетельствуют развивающиеся у них клеточные и гуморальные иммунные реакции.

4. При двукратном профилактическом введении, в опытах на мышах и крысах, ЭПОМ оказывает противоопухолевое действие в отношении ряда перевиваемых опухолей различного гистогенеза (асцитпой гепатомы Зайдела, асцитной опухоли Эрлиха, карциносаркомы Уокера, лимфоеаркомы Плисеа, саркомы 37). Иммуногенность ЭПОМ в эксперименте, у мышей, проявляется синтезом специфических антител (РСК И РПГА) и развитием сенсибилизации лимфоцитов к препарату (РППЛ и РГЗТ).

5. Антивирусное действие ЭПОМ у мышей, при предварительном введении, установлено в отношении двух экспериментальных вирусных инфекций, вызванных вирусом гриппа типа «А» и вирусом энцефаломиокардита мышей, и выражается в достоверном снижении летальности животных н угнетении репродукции вирусов в организме.

Доказана способность ЭПОМ к индукции интерферона - у мышей, а также в культуре лимфоцитов периферической крови человека in vitro.

6. ЭПОМ, при предварительной инкубации, ингнбирует репликацию вируса иммунодефицита человека в культуре лимфоцитов периферической крови человека и в лимфобластоидной линии МТ4, что выражается в уменьшении формирования синтициев и в достоверном снижении уровня обратной вирусной транскриптазы. Активность последней в клетках, обработанных ЭПОМ, более, чем в 40 раз ниже, чем в контроле.

7. Полученные экспериментальные данные (in vitro и in vivo) о противоопухолевой, антивирусной и интерфероногенной активности ЭПОМ были экстраполированы в клинику. Иммуномодулирующий эффект ЭПОМ, при подкожном введении больным раком шейки матки стадии T,NoMo - выражается в увеличении количества Т-лимфоцитов, усилении реакции гиперчувствителыгости замедленного типа на ФГА и увеличении количества естественных ¡слеток-киллеров. ЭПОМ индуцирует сывороточный интерферон (типа альфа и гамма) у больных раком шейки матки и у здоровых.

8. Доказана эффективная иммунокоррекция нарушенных факторов естественной противоопухолевой резистентности у онкологических больных с помощью кратких курсов рекомбинантного интерферона и индуктора ИФН - ларнфана, что позволяет предложить их применение в сочетании с ЭПОМ, для пролонгирования и усиления его действия.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Мкртчян Л.Н., Камалян Л.А , Тер-Погосян З.Р, Геворкян Р.А., Дадурян М.А. Об иммунокорритнрующем влиянии резонансной терапии. / В кн. Реабилитация иммунной системы. Цхалгубо, 1990, с. 138.

2. Мкртчян Л.Н., Тер-Погосян З.Р, Саакян A.M. Влияние иммуномодуляторов на показатели иммунной системы у больных раком желудка./Иммунология, 1990, 5, с. 57-58.

3. Мкртчян Л.Н., Тер-Погосян З.Р, Нерсесян А.К., Петанова Э.В. Мартиросян С.О. Противоопухолевое действие экстракта пуповины человеческого плода. / Вопр. онкологии, 1990, 8, с. 956-960.

4. Ter-Pogossian Z.R.,. The influense of immunomodulatory agents on some parameters of T-cells immunity in patients with stomach cancer /ЕССО 6 European Conference on Clinical Oncology and Cancer Nursing, 1991 p.463.

5. Мкртчян Л.Н., СитькоС.П., Тер-Погосян З.Р, Геворкян Р.А., Камалян Л.А. Влияние микроволновой резонансной терапии па иятерфероновый статус и другие показатели иммунореактивносги у больных раком шейки матки. /Иммунология, 1992, 1, с. 52-56.

6. Mkrtchian L.N.,Ter-Poghossian Z.R.,Nersissian А.К. Clastogenic and anticlastogenic action of polyvalent embriospecific anti-cancer vaccinc. 5 International Congress of Chimiotherapy and Cancer Nursing, Paris, 1995, p. 407

7. Mkrtchian I,.M.,Ter-Pcghossian Z.R.,NerscssiaA.KInhibition of carcinogenic effects of benzo(a)pyrene in rats immunized with human umbilical cord extract./Anticancer Res.., 1995, v.lS.U 5A,p.l782. Ter-Pogossian Z.R.,Mkrtchian L.N.,Kamalian L.A,Correction of immunological Breaches of the patients with Cancer of Stomach Treated with ImmunomoduIators./5 International Congress of Chimiotherapy and Cancer Nursing,Paris, 1995,p.202.

8. Mkrtchian L.N.,Ter-Poghosian Z.R.,Nersissian A.K.,KaraIian Z.A,Kamalian L.A., Anticancerogenic and antitumor effect of polivalent embryospccific vaccinc in experiment. /6 International Congress on Anticancer Treatment,Paris, 1996, p.102

9. Ter-Poghossian Z.R.,Gasparian M.H.,Kamalian L.A.,.The opportunity of correction of resistance factors in patients with cervical dysplasia and cancer./6-Intemational Congress on Anticancer Treatment,Paris, 1996, p.231.

10.Kersessian A. K.,Ter-Poghossian Z..R., Prevention of mammary gland tumors induction in rats./21 Meeting of the International Assos.for Breast Cancer Research, Paris, 1996,p.88

11 .Gasparian M.H.,KamaIian L.A.,Ter-Poghossian Z.R., Dadurian

M.H.,Karalian Z.A.,,Immunotherapy of patients with breast eancer./21 Meeleng of Intern.Assos. for Breast Cancer,Paris, 1996, p.87

12.Mkrtchian L.N.,Ter-Poghossian Z.R.,Karalian Z.A-Kamalian L.A.,.Immunomodulating influence of anticancer polyvalent embryonic vaccine./7 International Congress on Anticancer Treatment,Paris, 1997, p.236/

13.Mkrtchian L.N.,Ter-Poghossian Z.R.,Nersissian A.K., lastogenic and anticlastogenic action of polyvalent embriospecific anti-cancer vaccine /7 International Congress on anticancer Treatment,Paris, 1997, p.238.

14.Тер-Погосян З.Р.,Шерман Ж.-К.,Мкртчян J1.H., ДориаЕ. Влияние поливалентной эмврнональной вакцины на репликацию ВИЧ in vitro. ,/Мед.Наука Армении,. 1997, N 3-4, с.101.

15.Камалян Л.А., Джагацпапяи Н.Г., Тер-Погосяп З.Р. Биологическая активность нового препарата - ИОС-177, аналога изопринознна./Мед.Наука Армении, 1998. N 1-2, с. 67-72.

16.Тер-Погосян З.Р., Мкртчян Л.Н., Каралян З.А., Давтян Г.А., Камалян Л.А. Влияние поливалентной эмбриональной вакцинына регуляторные сувпопуляции Т-лимфоцитов у здоровых и больных раком молочной железы /Мед.Наука Армении, 1998. N3-4, с.17-23.

17.Джллавян Г.А., Тер-Погосян З.Р. Поливалентная эмвриоспецифнческая противоопухолевая ваыцша в комплексном лечении рака шейки матки./Тез. Конф. Онкологов Закавказья, Твилиси-1998,с.112.

18.Каралян 3.А.,Тер-Погосян З.Р., Гаспарян М.Г. 1998. Противоопухолевое действие поливалентной эмбриональной вакцины. /Тез. Конф.Онкологов Закавказья, Тбилиси, с. 132.

19.Тер-Погосян З.Р. Действие эмбрионального противоопухолевого модуляшра на репликацию ВИЧ. /Тез. Конф. Онкологов Закавказья, Твнлиси-1998., с.236.

20.Камаляи Л.А.,Гаспарян М.Г.,Тер-Погосяя З.Р.,Джагацпанян Н.Г..Каралян З.А. Сравнительная оценка Т-клеточного иммунитета.при раке молочной железы и рецидивирующем герпесе гениталий. /Тез: Конф.Онкологов Закавказья, Тбилиси-1998.,с. 131 .

21 .Каралян З.А., Тер-Погосян З.Р.,Гаспарян М.Г., Камалян Л.А.

Действие онкофетальиых антигенов на цитотоксическую активность естественных клеток-киллеров у здоровых и больных раком молочной железы./Морфология, 1998. N 3, с.55-56,

22.Gasparian M.II.,Ter-Poghossian Z.R.,Djaghatspanian N.G.,Karalian Z.A.,Kamalian L.A., Correction of resistance factors in patients with cervical dysplasia and cancer. The 4th International Congress on Cancer,Gerontology and ecology, 109-12 novembre, Beijing, Chin a, 1998. p. 0884

23. Ter-Pogossian Z.R.,Mkrtchian L.N. Preclinical study of original preparation - Polyvalent embryospecific vaccine./Cancer Vaccine Week

1998,New-York City, October 5-8.

24. Тер-Погосян З.Р. Действие эмврнонального протнвооиухолевого модулятора на вирус иммунодефицита человека in vitro./I Междун.Конференцня морфологов, Ереван-1998., с. 107-108.

25. Тер-Погосяп З.Р.Действие эмврионалыюго противоопухолевого модулятора на клеточные факторы иммунитета./ Мед.Наука Армении,

1999, N 2, с.57-60.

26. Мкртчян Л.Н.,Тер-Погосян З.Р.Джнлавян I .A. Попытка усиления неепецифической противоопухолевой резистентности у лиц из групп риска н онкологических больных./ МедНаука Армении, 1999, N 2 с.78-83.

27.Базикян Г.К., Тер-Погосян З.Р., Бабикян Ю.А. Новый препарат растительного происхождения - индуктор гамма-ИФН у людей. Вопрлеор. и (слинич. медицины, 1999, том 2, 4 (11), с.28-29.

28.Камалян Л. А., Джагацпаган Н. Г., Гаспарян М. Г., Каралян З.А., Тер-Погосян 3. Р. Противоопухолевое действие интерферонов и индукторов интерферона в эксперименте и клинике. Вопросы теоретической н клинической медицины. Ереван, 1999, т 2, N4, стр 44 - 52.

29.Тер-По1х>сян З.Р. Применение эмбрионального иротвооиухолевою модулятора для первичной и вторичной профилактики рака./Теоретич. и прикл. аспекты профилактич. онкологии. Ереван-1999, Тезисы Медицинской Академии Наук Армении, с.78-79.

30.Камалян Л. А., Гаспарян М. Г... Тер-Погосян 3. Р., Джагацпанян Н. Г. Роль интерфероновой системы в задаче противоопухолевой защиты организма./ Теоретич. и прикл. acncKibi нрофилакшч. онкологии. Тезисы Академии Мед. Наук Армении, Ереван-1999.

31.Тер-Погосян З.Р. Влияние ЭПОМ на продукцию гамма-интерферона у человека. 1999, Сборн. Научн. Трудов и сообш. НИЗ РА, с.76-77.

32 .Тер-Погосян З.Р. Антивирусное действие ЭПОМ в эксперименте. 1999, Сборн. научн. трудов и сообщ. НИЗ РА с.77-78.

33.Камалян Л.А., Тер-Погосян З.Р., Ильин А.И. Достижения науки в изучении ВИЧ-инфекции. Доклады Акад. Наук HAH РА, 1999, сдано в печать.

34.Камалян Л.А., Джагацпанян Н.Г., Гаспарян М.Г., Тер-Погосян З.Р, Каралян З.А. Влияние герпесвирусной инфекции на показатели Т-клеточного иммунитета у больных раком молочной железы. 2000, II съезд онкологов стран СНГ, 23-26 мая, Киев, с. 868.

35.Камалян Л., Хангельдян А., Тер-Погосян 3., Гаспарян М„ Джагацпанян М.Г. 2000. /Влияние персистируютцей герпесвирусной инфекции на иммунореактивиость больных раком шейки матки. II съезд онкологов стран СНГ, 23-26 ,Киев 2000, с. 1015.

36. Тер-Погосян 3.. Джилавян Г., Мкргчян Л. Индукция сывороточного интерферона эмбриональным противоопухолевым модулятором (ЭПОМ) у больных раком молочной железы. /II съезд онкологов стран СНГ, 23-26, Киев 2000, с. 88.

37.Каралян З.А., Азнаурян Л.В., Тер-Погосян З.Р, Каралян З.А. Естественные киллерные клетки при противотуберкулезной химиотерапии. Морфология, 2000, 3,с. 276.

38.KaraIova Е.М., Gasparian М.Н., Jaghatspanian N.G., Karalian Z.A., Ter-Pogossian Z.R. e.a. The cytologic characteristic of continious cell of human larynx carcinoma during development cell culture and under action of dc-RNA./Proceedings, 9th Annual Conf., 17-20 october, 2000, p.71.

ШГФИФПМХ

Siupjilibp ?uipniíiiuli qlunúuilituüíibpQ фпрЛЬ| Ufi hiu.iinliuipbpUi.1 uiuuu|ti| liiïniûaqliti ninnigpiuj|i(i luûuiliqbûbp huiliummniyi>utj|i(i uidiuii[iuuui¡uiüjnip uuiiuíiiupu hutifuip: ОШ{п.1>Ьшш|. uiQinfiqbCbpn JH-PЬ liuiûïu|u, Ьш(пфи|Ш[ uiuippbp nmniypCihpiuii npiqbu uii(b\li lpi(iubpL|uim|u( ixiíiiiifiqlitihpu üjyut quiüilbj b(j htunuiqiminqUhpli ni^miHinipjmü l|bliuipnünuS, риЛф np (¡puiCiq hiuliummni{jpiuj|i(i Ц^ицпр bpphüií u|puilpn|il|uijnid шриииЬшрпфш! ,l.¡ uu|biJi i|iuij: b|libjml uijii Jupniinipjniiiiig puiqü'uil|fi nmniiKiuii|}ipilb| I. uiuqCifiiujftfi uiiim|iqb(ihp|i jui|(i фпц mbuuiljuitiji ириршйш^пн, |itiju|Üu Ь шц <lltiljnujpnmblniQbp, tybpiSbíiwübp ni iijil|pntlhdbüipübp u|Qjpniliuilpiq finp muiiiïliujjJiû |ii5niüminqni|jiuuin|i|i l|btiuuipiutiuil]iu(i uipiuniiiuulbmmpjniüp: чшйшйшфй t:l|iui|hp]níl¡üii)uii unljuqlibpli »lxnpáiiipl|i¡uj0 iiuiii|iüuij]ili 1и5п1йт5пцпщшитрд oiiuit(iuö jl. и nip Ь рриСфЦ шп^и^Цшйпц^шйр, ui|ibpqh(i Ь iSniiniuqUG hiuinl|mpjmfiíibpniJ: Uun]iííiuij|)ü }idni(iniïni]ni|jiuiniip|} uinniq ottmi}uiù t huil|umimu(jpiuj|iG uiqrjbíjnipjiuú'p ú'ljúhpli b umiitunûbpf^hiulirçbùi /l:pi|itu|i nuiniyp, auijrçb|Ji hbupuinniîui, ишрЦпй'ш 37, 'Пфтф iJuS.jmuuipliniiui, llbnlibpli ljuipatiüntíui/L НищМигфй tii5m(iniïnrpni|iuump[\ uupiUyiiipjuiCip DMBA l< BP Ciliiuimímiíp unquujiitcjiJmö I. йЬцш()1ц{шйг iiinnlypiibpti luiiuijuigi'iuiü hui6iu|uuil]iuünipjuii5p, íipiuíig qiupqiugiSuiti щulir]tuiihi[íjujiÍjí l. niimiypli ujniuçuijjiîiuli [штЬОш ?pjmfi|i lîbôuiyiiiuiîp uuiniqlvl1 Judnh luuiíbiíuiinmpjiuiíp: UmrpiiiiujliU JuîruûmJnnnujunnnpli huUiumi^mjjpuijliü uiqribyrupjuiü hliiíüiuljuiü iSb]uui(ifiqiS[} huiüqliuuiCimii" t opquiüjiqiinitf hnuínpiui, U pçgiujJiQ Jiiínifi щиппиш^ишСф übuillnpmdn: l^tuy]) qpiulijig üuiqúüuijtiü liiíniíindnqnujuimnpo odmijuií) t liúmbptybpnQnqbü U huiljuiLtJiiiniuiuj(-iíi tuqrçbyiupjuitfp: <uiliuiiHipniuiujt»Q luqqUgnipjmüp npii2i}li| I diiipql|UÚKj qpliuili b ЬСаЬфицпйрпЦшрфиф ijjipniutibpti hmünbtq: *11 p 14 u'i í» Ц l¡u|LUUiiuljnil (ibpuiplji[md ишпй'Скифй {iiSniíimíniiniuuiii)npp in \jitro u|uijii4uüühpruü' IpuubgpUi t й'шрг^шйц ]itínitinqb^Jiglun]í i{fipniuji nbiqitiljuujfiujtí, úliütip{i itnui umiugiugümtf t 2llöl,il|iuj[iü liQiribjitytipnQli liliiyiilmliuj, ünijOp tyuíiniupijnul1 й'шрпЦшйд tSnününüi|bujp(ibp|i uniuy|h(iq|in[i Ipnpjimpmjntú: hü^ujhu U umtuguitínuS t a U y litimUpfyUpnüli jiüipulmlmi miinqj iíiupql)u)üg U nmmypmj тшпшщпц uiüáuilkj dum: > lljuiqjiunil uiui)ii(iuij}i(i |nîn i Ii iiiínqn qjui m np p Ьшйгфишйшй' > t ЦЫкииршйиЛций uipbupupuim, npp »pquítijicpinuí lunuigiuyünuí t uiqbtj¡i;¡>¡il| huilpuruimi;<]piuj|iíi |iü'niíi|iinliin U ünpduquiyünuí I opqm(¡fiqü'(i püuilpuü i]JuÏLuqpnriiu[|UJ(i;iij>jiitCî[i: íimgli umriü'öiujbli.biiniflnilnnniijiuuinpjiü líbp ф npá ш p li imUi b pp y mj <j tj(i uu[b| iibiutybpnliiul h рнрЦадйт! ри'тйпрЬршифш^г puipôp t4)til[uiln{uipjni(iii liiíni£ini)b.1>lig}iui lutibtjpq piuq<jl|br|ni] hfii]Lufir}übp]i línm ii|i(i; gi[luii]|i(j)in(¡ iSbpniiûbpnil pmilnnS üiüíjl)uiytib|p: \»2(1шй uipbuiujpiiiuitibpnil1 liú'niíinljnpljljylimjJi uipqjnitimi[binnipjniü|] gnyy t iniu)|iu lipuiíiy t¡lipi,uinuOiQ uiui\i5(iiuj|iQ Jiiïniünilniiniijuiluhbm qniqmliyiliuí» l.^ihljinp иинийицт liuiúiup: