Новые тиоловые оксидоредуктазы систем тиоредоксина и глутаредоксина. Их роль в регуляции окислительно-восстановительного баланса клетки

Новосёлов, Сергей Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Новые тиоловые оксидоредуктазы систем тиоредоксина и глутаредоксина. Их роль в регуляции окислительно-восстановительного баланса клетки
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Новые тиоловые оксидоредуктазы систем тиоредоксина и глутаредоксина. Их роль в регуляции окислительно-восстановительного баланса клетки"

11а правах рукописи

НОВОСЁЛОВ Сергей Владимирович

Новые тиоловые оксидоредуктазы систем тиоредоксина и глутаредоксина. Их роль в регуляции окислительно-восстановительного баланса клетки

03.00.04 - биохимия 03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

1 6 0НТ2Ш

Пущино, 2008

003448303

Работа выполнена в Институте биофизики клетки РАН, Пущино и в Университете Небраски в Линкольне (ШИЛ, Департамент биохимии, Линкольн, Небраска, США

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор О.Н. Озолинь

доктор биологических наук, профессор В.З. Ланкин

доктор биологических наук, И.П. Белецкий

Ведущая организация: Институт биоорганической химии РАН им.

акад. М.М Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Защита диссертации состоится « 23 »октября 2008 г. в 14<ю ч.

на заседании Диссертационного совета Д 002.038.01 в Институте биофизики

клетки РАН по адресу: 142290, Пущино, Московская область, ул. Институтская 3

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке Пущинского научного центра РАН

Автореферат разослан «23 » сентября 2008г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Т.И. Смолихина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Важная роль свободных радикалов и активных фэрм кислорода в процессах жизнедеятельности клеток в норме, а также при патологиях в настоящее время не вызывает сомнений Это подтверждается и тем обстоятельством, что количество оригинальных работ, опубликованных в мировой биомедицинской литературе по этой проблеме, исчисляется сотнями тысяч. Нарушение внутриклеточных процессов окисления-восстановления часто является одной из причин или сопровождает развитие таких распространённых патологий, как диабет, нейро-дегенерагивные, бронхо-легочные и онкологические заболевания, инфаркт миокарда и тд Таким образом, выяснение молекулярных механизмов действия систем, сопряженных со свободными радикалами, необходимо не только для понимания <]ундаменталы1ыч основ физиологии клетки, но и потенциально имеет колосальное практическое приложение, поскольку терапевтическое воздействие на те или иные компоненты системы окисления-восстановления теоретически может давать возможность корректировать патологические состояния К середине 70-х годов биомсдицинские иследования, объединившие биохимические, молекулярные и медицинские подходы к изучению свободных радикалов оформились в самостоятельное научное направление - редокс биология

Клеточный метаболизм перекисных соединений необыкновенно ело жен и включает в себя целый ряд систем, состоящих как из низкомолекулярных продуктов, так и из макромолекул Ферменты, называемые пероигидазами, представляют из себя гетерогенную группу многих белковых семейств, работающих по различным каталитическим принципам и выполняющих широкий спектр биологических функций, из которых детоксификация перекиси водорода, или классичесая «антиоксидантная» функция, является лишь одной из многих Н:Оа-зависимый синтез вторичных метаболитов среди re м-содержа mix пероксидаз и родственных ферментов осуществляется транзиторным катализом с участием металлов, который часто сопровождается образованием других свободных радикалов

Другой класс ферментов-антиоксидантов, включающий кофермент-независимые глугатион пероксидазы и пероксиредоксины, катализируют дву-элекгронный перенос восстановительного эквивалента, и, таким образом, нейтрализуют перекись водорода без образования свободных ради калов, появление которых само по себе может наносить вред клетке. Однако, в дополнение к антиоксидантным эффектам, у этих тиоловых оксидоредукгаз есть способность к утилизации шдропероксида для образования специфичных дисулы{идных связей внутри или между белками (Рис.1), что существенно расциряет спектр их функциональных возможностей, включающих окислительно-восстановительную регуляцию метаболических процессов, сигнализацию и тд. Между тем, до настоящего времени не било проведено достаточно широнэго исследования тиоловых оксидоредукгаз, более того, миогие белки этого суперсемейства не были идентифицированы. Полагаем, что идентификация новых тиоловых оксидоредукгаз и выяснение механизмов их функционирования в живых

организмах является весьма актуальной фундаментальной проблемой редокс-биологии

Рисунок 1 Схема, иллюстрирующая метабохизм перекиси водорода и основные ферменты, вовлеченные в этот процесс. Обозначения КАТ - каталаза, GSH -восстановленный г^татион, GSSG - окисленный глутатион, GPx — глутатион пероксицаза. Pre - пероксиредоксин, GR - глутатион редуктаза, TR - тиоредоксии редуктаза, Тг/ -тиоредоксин, Grx - глутаредоксин, RSSR - окисленный субстрат, RSH - восстановленный субстрат

Цель и задачи исследования:

В соответствии с поставленной проблемой, направленной на идентифигацию неизвестных ранее тиоловых оксидорелукгаз и выяснение механизмов ич функционирования в живых системах, были определены следующие задачи: 1. Проанализировать эволюцию тиоредоксин редукгаз для выяснения физологической значимости и причин существования их «коротких» и «длинных» форм

2 Идентифицировать и охарактеризовать недостающий митохондриальный компонент системы глутаредоксина.

3 Выяснить структурные и функциональные характеристики Тиоредоксин-глутатион редуктазы млекопитающих.

RSH RSH

I---

Н20

GPx) / Л

нси/ RSSR2RSH

4 Провести поиск новых селен-содержащих оксидоредукгаз у разных видов животных

5 Найти закономерности в структуре и биохимических характеристиках этих новых ферментов и классифицировать их

Научная новизна. Новизна представленных в работе результатов определяется несколькими обстоятельствами. Во-первых, на основании филогенетического анализа впервые было установлено, что «большая» форма тиоредоксин редуктазы произошла от GR низших эукариот путем удлинения карбокситерминального конца белка с появлением Gly-SecCys-Cys-GIy мотива в новом каталитическом окислительно-восстановительном центре, который функционально заменил глутатион в качестве транзиторного субстрата для этого фермента. Во-вторых, впервые был идентифицирован и охарактеризован новый митохондриалышй глутаредоксин (Grx2) На основании кинетических данных было доказано, что белок Grx2 обладает наиболее высоким сродством но отношению к L-цистеину, и ото сродство было эквивалентно таковому для HEDS и S-сульфоцистеина В-третьих, было доказано, что TGR структурно является тиоредоюмн-глутатион редуктазой, обладающей тиолтрансферазной, глутатион и тиоредоксин редукгазной. и протеин дисульфид изомеразной активностью in vitro, а функционально - это изомераза Gpx4, вовлеченная в образование митохондриалыюй капсулы сперматозоидов В-четвергах, был идентифицирован и охарактеризован новый селен-содержаший белок SelM, имеющий новый тип SECIS элемента lía основании анализа генома человека было выявлено 25 селен-содсржащтх белка, семь из которых ранее не были известны. Среди них имеются новая глутатион лероксидаза Gpxó, экспрсссирующаяся в обонятельном эпителии на определённых стадиях эмбриогенеза, а также SelV - белок сперматоцитов В-пятых, было доказано, что Settl - это новая тиоловая оксидоредукгаза ядрышек; имеющая необычный паттерн экспрессии И, наконец, обнаружили новую тиоловую оксидоредукгазу эукариот, названную нами Rdxl2. На основании компьютерного анализа объединили Rdxl2, SeJW, SeiV, SelT и SelH в новое семейство тиоловых оксидоредукгаз с тиоредоксин-подобной укладкой Это новое семейство белков было охарактеризовано и назвало нами Rdx. Арибация работы. Материалы диссертации были представлены на нескольких симпозиумах и конференциях: 8th International Symposium on Selenium in Biology and Medicine, (2005) Мадисон, США, Experimental Biology 2004 (EB 2004) Бостон, США; Experimental Biology 2003 (EB 2003) Сан Диего, США, Experimental Biology 2002 (EB2002) Новый Орлеан, США, 17th Joint Meeting of the International Society for Neurocheimstry (ISN) and the 13lh General Meeting European Society forNeurochemistry (ESN), 1999, Берлин, ФРГ.

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 170 страницах машинописного текста, содержит 40 рисунков и 5 таблиц Список работ, опубликованных по теме диссертации, содержит 29 статей в реферируемых журналах, главу в сборнике и заявку на Патентное разрешение.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1.Белки, непосредственно вовлечённые в Тгх и Сгх системы.

При исследовании окислительного стресса было выявлено ключевое значение ЫАОРН-зависимых тиоредоксин- и глутаредоксинсистем В сисгемстиоредоксииа (Рис.2) восстановительный эквивалент (поток электронов), противодействующий окислительному стрессу, протекает в следуюпум направлении КАБРН —» Тиоредоксин Редуктаза —»Тиоредоксин —» Тиоредоксин Пероксидаза —» перекись водорода. Таким образом, первая и наиболее изученная функция этой системы направлена на разрушение перекисных соединений, прежде всего перекиси водорода, с использованием тиоредоксина и МАОРН

Кроме того, тиоредоксин сам способен взаимодействовать по редокс типу с цистеинами ряда клеточных белков, таких как сигнальные белки (например киназы-фосфотази), факторы транскрипции, рибонугаеотид редуктаза и антиоксидантные белки (например метионин сульфоксид редукгазы и пероксиредоксины)

ЫАОРН

ЫАОР

Тиоредоксин' Редуктаза,

тя

Тгх ,эн

Тиоредоксин

? НОССП1НО!ЗлеИНЫЙ ^БН

Тгх .Б

Тиоредоксин'|

окисленный Э

Субстрат

окисленный

Субстрат

восстановленный

Рисунок 2. Система тиоредоксина

Подобный поток восстановительного эквивалента хараетерен и для системы глутаредоксина ЫАОРН—> глугатион редукгаза —> глутатион (ОЗН) —> глутатион пероксидаза —♦ перекись водорода или КАОРН —> глутатион редукгаза —» глутатион (в5Н) —> глутаредоксин —► смешанные дисульфидныс связи в белках (Рис 3) Глутаредоксин, будучи структурным и функциональным гомологом тиоредоксина, также может взаимодействовать с другими белковыми молекулами, такими гак рибонуклеотид редуктазы, пероксиредоксинами или более простыми молекулами, вовлечёнными в редокс процессы, например с витамином С.

Сгх .эн

пплр Глутаредоксин' Субстрат

О О О О V "Я восстановленный ВН

МАРРН

ЫАОР

\ / Глутатион Редуктаза, вЯ

окисленный

2й5Н

Сгх

Глутаредоксин I

окисленный

Субстрат

еосстаноплениый

Рисунок 3. Система глутаредоксина

Таким образом, наряду со способностью защищать клетку от воздействия как эндогенных, так и экзогенных активных форм кислорода (АФК), повреждающих ДНК, белки и липиды, что необходимо для поддержания нормальной жизнедеятельности, системы тиоредоксина и глутаредоксина играют фундаментальную роль в регуляции внутриклеточных процессов посредством поддержания корректного тиолового гомеостаза, белок-белковых взаимодействий, влекущих за собой пострансляционные модификации, и/или конформационные изменения целого ряда ключевых сигнальных бел ков

Тиоредоксин редуктазы.

Как уже было отмечено, тиоредоксин редуктаза и тиоредоксин являются основной окислительно-восстановительной системой, присутствующей во всех организмах Однако, в отличие от только одной формы тиоредоксина, существуют два типа тиоредоксин редуктаз: бактериального типа или «малая» (Small TR), характерная для бактерий, архей, растений и многих одноклеточных эукариот, и вторая - TR животных или «большая» (Large TR), обнаруженная только у животных и обычно содержащая С-концевой селеноцистеин в составе Gly-SecCys-Cyc-Gly мотива

Для изучения распросгранненности этих двух форм тиоредоксин редуктазы в геномах различных организмов были использованы Nonredundant, EST и геномные микробные базы данных NCBI, а также программа TBLAST для поиска гомологов человеческих TR. Мы обнаружили «большие» формы тиоредоксин редуктаз в одноклеточных организмах Tetrahymena (EST последовательности' ВМ395971.ВМ395814, ВМ395972), Toxoplasma (EST последовательности: BI997644, BG852257, BG852256, BG852259) и Chlamydomonas, при этом в геномах бактерий этих больших форм обнаружено не было. Поскольку Chlamydomonas относится к растениям, мы проанализировали EST базу данных этого организма на наличие «малых» форм тиоредоксин редуктазы и обнаружили три таких белка (первый: BF863161, AV633771, AV624607, второй. AV387919, AW758306, ВЕ122071, AV628812; и третий AV628023, AV631626, AV628019, AV629759). Таким образом, мы нашли, что Chlamydomonas содержит как «малую», так и «большую» форму TR. Это позволило предположить, что либо длинные формы TR возникли в эволюционном развитии на достаточно ранних этапах, например, когда возникли эукариоты, либо они были перенесены в некоторые низшие эукариоты из животных путем горизонтального переноса генов. Чтобы различить эти два сценария, на первом этапе был проведен филогенетический анализ белков семейства пиридин динуклеотид оксидоредуктаз (Рис. 4). Общая композиция филогенетического дерева подтвердила независимое происхождение «малых» и «больших» форм, поскольку последние ютастеризовались с липоамид дегвдрогеназами (LADH), ртуть ион редуктазами (МегА) и глутатион редуктазами (GR), тогда как «малые» формы сформировали отдельную группу, и при этом короткие формы бактерий и архей кластеризовались отдельно от низших эукариот. Примечательно, что «большие» TR сформировали группу с глутатион редуктазами эукариот, что указывает на их расхождение на уровне появления низших эукариот.

Чтобы исключить сценарий, при котором большие TR появились у низших эукариот благодаря горизонтальному переносу генов, мы проанализировали

возможность того, что другие гены высших эукариот также присутствуют в организмах этих низших эукариот, содержащих большую форму ТЯ. Для этого мы использовали все доступные на тот момент белковые последовательности СкктусЬтопса из ЗУЛЭЗ-РКОТ и ТгЕМВЬ баз данных (608 последовательностей) и сконструировали филогенетические деревья для всех этих белков Как и предполагалось, большинство из них кластеризовалось с последовательностями белков растений, однако мы обнаружили 12 последовательностей, которые кластеризовались с белками животных. Все эти белки являлись вовлеченными в образование жгутиков у СЫатуЛотопаь, однако, для них не было найдено соответствующих ортологов у растений, что не дало возможности достоверно выявить филогенетическое родство. Таким образом, мы не обнаружили примеров горизонтального трансфера генов и заключили, что «большая» форма ТИразвилась независимо

Большие * ТЯ

ТЮ МгЬлш ТК|'2Чгил>э ТК1/3 МгМфЬмаг

4.К Мгы/па (.« ГиП£1 <>К \|гм||р|>п|»г (.Щ'ПМЙч (.К |Ы-1гг1л {.К \rtWa 1Л1Ш Мгилы 1.41)11 »ивд |Д|>||Мп.1||11л|1« 1ЛМ1 ПлЮТи . I \1>|| ЛгсИап

- МггЧ Вж1ггм

. Мгт V -

. 1К(ипц1 I

- ТК \ |г(«1|р1яп1аг 1 Малые ■ ТК Пш(гги ( ТЯ

Рисунок 4 Филогенетическое дерево пцмдин динуклеотид оксидоредуктаэ

На основании полученных данных мы пришли к следующим выводам: «большая» форма тиоредоксин редукгазы животных зволюционно произошла на уровне низших эукариот значительно раньше, чем «малая» форма ТО была потеряна в организмах, от которых произошли животные. Обе эти формы сосуществовали в процессе эволюции, и мы идентифицировали организм (СНЬтусЬтопсн гегНапШ), который содержит оба фермента Среди высших эукариот «большая» форма стала преобладать у животных, тогда как «малая» сохранилась в растениях и грибах. «Большая» форма ТО произошла от в!? низших эукариот путем удлинения карбокситерминального конца белка с появлением С1у-ЗесСув-Сус-Яу редокс мотива в новом каталитическом окислительно-восстановительном центре, который функционально заменил глутатион в качестве транзиторного субстрата для этого фермента (Рис.5)

Таким образом, мы предположили возможный эволюционный механизм, по которому могут появляться новые функции в белках. За очень небольшим

исключением, С-концевая часть ферментов редко бывает консеративной и вовлеченной в активные центры Случайное (например в результате мутации стоп кодона) удлинение карбоюи-терминальной части может приводить к появлению последовательности, взаимодействующей (или модулирущей взаимодействие) с Ы-концевыми структурами, как показано для «больших» форм ТИ, что влечет за собой модификацию функции, ее «улучшение» или даже появление новой биохимической активности

Рисунок 5 Предложенный механизм эволюции белковых молекул путём удшнения С-концевой его час™ на примере таоредоксин и глутатион редуктаз.

Идентификация нового глутауедоксина (тиолтрансферазы) млекопитающих <011x2).

Семейство тиоредоксинов и семейство тутаредоксинов объединены в суперсемейство тиоловых оксидоредукгаз, содержащих тиоредоксин-подобную складку, которое включает также пероксиредоксины, протеин — дисульфид изомеразы, глутатион пероксидазы, трансферазы и ряд других белков

По структурным параметрам - это глобулярные белки с характерной тиоредоксин-подобной укладкой (р1-а1-р2-а2-(33-р4-а3) и консервативным СХХС мотивом (где С - цистеин и X - любая аминокислота), входяпим в каталитический центр (Рис 6А и 6Б) Этот каталитический центр находится в частично экспонированной петле или кармане между С-концевой альфа1 спиралью и Ы-концевым бета2 слоем. В зависимости от того, какие аминокислоты разделяют консервативные цистеины в СХХС мотиве, и каково редоксокружение (например, цитоплазматическое «восстановительное» или «окислительное», как в

Ггутатион окисленньй

эндоплазматическом ретикулуме), эти ферменты могут быть или восстановителями (например, тиоредоксины и пероксиредоксины), или окислителями, как протеин-дисульфвд изомеразы. Кроме того, было показано, что альфа спираль, следующая за СХХС мотивом, влияет на способность к ионизации консервативных цистеинов таким образом, что концевой цистеин имеет пониженный рКа в сравнении со свободным ни стенном.

A I а I л I а А I а

Тиоредоксины, Пероксиредоксины, Глутаредоксины. СххС мотив ТххС мотив CxxC/S мотив

Л IOL

Глутатион пероксидазы,

C/SecxxT мотив

Рисунок 6. Структура тиоредоксина и тиоловых оксид оредуктаз с тиоредоксин-подобной укладкой

A. Глобулярная структура тиоредоксина человека (hTrxl), а-спирапи обознанены красным, р-слои - жёлтым. (Forman-Kay JD, Clore GM, Wingfield PT, Gronenbom AM. High-resolution three-dimensional structure of reduced recombinant human thioredoxin in solution, PDB ID 1ERT).

Б. Схема, представляющая структуру тиоредоксина и таоредоксин-подобной укладки (фолда), а-спирали обозначены красным, р-слои - жёлтым. Положение консервативных цистеинов СХХС мотива обозначено зелёным цветом. Тиоредоксин-подобная укладка (фолд) (¡Sl-al-|32-a2-|33-j54-a3) показана синим цветом.

B. Каталитический центр некоторых тиоловых оксидоредуктаз таоредоксин-подобной укладки. Примечательно, что у глутаредоксинов С-концевой цистеин может быть заменён на серин (Ser), а у глутатион пероксидаз N-концевой цистеин - на селеноцистеин (Sec).

Для системы тиоредоксина млекопитающих, состоящей из тиоредоксин редуктазы, тиоредоксина и тиоредоксин пероксидаз было показано наличие как цитоплазматических, так и митохондриальных её компонентов, кодируемых различными генами (цитоплазматические тиоредоксин редуктаза (TRI), тиореодоксин (Trxl), и, соответственно, митохондриальныеТИЗ и Тгх2).

Напротив, в случае системы глутаредоксина млекопитающих, только её цитоплазматические формы были хорошо изучены. Однако, для глутатион редуктазы мыши и человека было показано наличие её митохондриальных изоформ, образующихся в результате альтернативного сплайсинга единственного гена GR. Кроме того, как минимум для двух глутатион пероксидаз (GPxl и GPx4) были охарактеризованы их митохондриальные изоформы. Более того, было показано, что порядка 10% общего клеточного глутатиона приходится на митохондрии. Очевидна также необходимость поддержания оптимального окислительного-восстановительного баланса в этих клеточных органеллах. Таким образом, было бы логично предположить, что недостающий компонент -митохондриачьный глугоредоксин - должен присутствовать в этих структурах

Глугаредоксины - это небольшие (10-14 кДа) белки с характерным СХХС мотивом (обычно Cys-Pro-Tyr-Cys) в N-коцевом участке молекулы и консервативным тутатион-связывающим доменом в С-концевой части. Цистеины каталитического центра СХХС служат донорами электронов, образуя обратимые дисульфидные связи с молекулами субстрата с последующим их восстановлением глугатионом.

В момент проведения данной работы ни один из геномов млекопитающих не был расшифрован, поэтому компьютерный анализ методом поисков гомологов проводился прошв EST баз данных млекопитающих. Используя известные последовательности Grx, мы обнаружили несколько гомологичных, но неописанных ранее последовательностей в базе данных EST человека, содержащие последовательность, кодирующую открытую рамку считывания (ORF) белковой последовательности длиной 164 аминокислот. Используя згу последовательность для поиска гомологии, мы нашли, что такая последовательность также кодируется у мыши, крысы и свиньи, что указывает на ее консервативность среди млекопитающих.

В наших экспериментах нуклеотидная последовательность была подтверждена методом сиквенирования, и этот новый сиквенс показал 36% идентичности с известным человеческим глутаредоксином (Grxl) и был назван нами Grx2. Множественное выравнивание (Multiple alignment) обнаруженных новых последовательностей с известными Grxl показало, что GRx2 белки имеют консервативный дисульфидный каталитический центр и консервативный GSH-связывающий участок.

Дальнейшее исследование Grx2 последовательностей с помоад>ю программ SignalP и PSORT показало наличие возможного митохондриального сигнала, представляющего из себя гидрофобную последовательность с высоким содержанием лизинов и аргининов, формирующих альфа-спираль. Для того, чтобы проверить это компьютерное предсказание, мы экспрессировали ряд химерных Grx2-GFP белков в клеточной линии NIH ЗТЗ с последующей визуализацией GFP флуоресценции спомощью конфокальной микроскопии (Рис. 7).

Когда 1Ч-концевой сигнальный пептид или полноразмерный Огх2 был объединён с ОН3, флуоресценция наблюдалась в митохондриях, а Сгх2-ОРР последовательность с отсутствующим [Ч-концевым сигналом не показала какой-либо специфичной внутриклеточной локализации. Таким образом, компьютерные предсказания топологии &х2 белка были подтверждены, и было доказано, что белок является митохондриальным.

МБ

Сгх2 ШВШ

МБ йРР

вгх2 вРР

вРР МБ вгх2

Рисунок 7. Исследование локализации (?гх2 в клетке. Слева схематично показаны химеры рекомбинатных форм Бгх2 с зелёным флуоресцентным белком, использованные для трансфекций в клеточной пинии N1Н ЗТЗ. Справа - на центральной панели показано окрашивание митохондриальным маркером МИоТгаскег.

Для биохимического анализа нового человеческого глутаредоксина, рекомбинантный йгх2 был экспрессированы в Е.СоИ с полигиститдиновым № концевым кластером для последующей аффинной очистки на никель-агарозе. Полученный рекомбинантный Огх2 был использован для сравнения в стандартных реакциях, параллельно с рекомбинантным Огх1 человека.

Рекомбинантный человеческий Сгх2 катализировал восстановление смешанных дисульфидных связей, сформированных между йвН и НЕОв, Б-сульфоцистеином или Ь-цистеином. При этом Кга значения составляли 1.68, 1.77 и 0.30 тМ соответственно. Каталитическая эффективность (ксаьТст) была различной для этих трёх субстратов. Таким образом, белок вгх2 обладает наиболее высоким сродством по отношению к Ь-цистеину, и это сродство было эквивалентно таковому для НЕОЭ и Э-сульфоцистеина.

Тиоредоксин-Глутатион редуктазы.

Тиоредоксин-Глутатион редуктаза (TGR) - недавно обнаруженный фермент семейства тиоредоксин редуктаз. В отличие от двух других тиоредоксин редуктаз млекопитающих, он содержит N-концевой глутаредоксиновый домен (Рис. 8) и имеет очень широкий спетр биохимических активностей in vitro. Для выяснения реакционного механизма и регуляции данного фермента мы получили полноразмерную рекомбинантную мышиную TGR, а также ряд её мугантных форм и индивидуальныхдоменов.

TGR

Пиридин нуклеотид-дисульфид оксидоредуктззныи домен

"Л

Grx домен —

FAD свяэывэ-ошая посгедовательюст© NAOPH связывающая последовательность Димеризационный домен

Рисунок 8. Схема строения «малых» и «больших» TR, GR и TGR.

Мы показали, что ТОН структурно является тиоредоксин-глугатион редуктазой, биохимически обладает тиолтрансферазной, глутатион и тиоредоксин редуктазной и протеин дисульфид изомера зной активностью. Столь широкий спектр биохимических активностей был ожидаем и не давал ответа на вопрос о физиологической роли данного белка. Посюлку мы показали, что основная часть ТвЛ экспрессирована в тестикулах млекопитающих, эти антитела были использованы в иммуногистохимических реакциях с тестикулами мыши на световом и элекгроннно-микроскопичесюм уровне (Рис.9).

Мы показали, что Твй локализован в перемитохондриальном пространстве сперматоцитов определённых стадий развития. Известно, что митохондрии являются основным местом локализации Орх4, поэтому мы использовали этот

белок в реакции изомеризации с ТОЙ и показали, функционально Тиоредоксин-Глутатион редуктаза является изомеразой врх4, вовлечённой в образование митохондриальной капсулы сперматозоидов.

ж, &

Рисунок 9. Иммуногистохимическое исследование локализации TGR. А. Световая микроскопия. Б. Электронная микроскопия.

Глава 2. Новые селен-содержащие белки.

Особенностью катализа селен-содержаших оксидоредуктаз является наличие селеноцистеина вместо цистеина в каталитическом центре. Селен и сера, будучи халькогенами, являются неполными электронными аналогами. Таким образом, цистеин и селеноцистеин, в какой-то степени похожи, с той разницей, что рКа свободного цистеина при нормальном рН составляет 8.18, а селеноцистеина - 5.73, поэтому селеноцистеин обладает намного более высокой реакционной активностью.

С точки зрения молекулярной биологии селеноцистеин представляет собой исключительный интерес. Являясь 21-ой природной встречаемой в белках аминокислотой, он кодируется TGA кодоном, обычно служащим сигналом терминации трансляции. Ряд цис и транс-факторов вовлечены в биосинтез селен-содержаших белков (Рисунок 9). К цис-факторам, наряду с TGA кодоном, относится SECIS элемент (SECIS: selemcysteine insertion sequence) - структура, находящаяся в 3' нетранслированной области селенопротеиновой мРНК эукариот

или немедленно за TGA шдоном у прокариот. К транс-факторам относятся Sec тРНК (отмечена красным на рисунке 10), Бес-специфичный фактор эллонгации EFsec и SBP2 (SEClS-связываюший белок-2, отмечен зелёным).

Рисунок 10. А - схема, показывающая механизм встраивания селеноиистеина в белки; Б - структура SECIS элемента. (Hatfield DL, Gladyshev VN, How selenium has altered our understanding of the genetic code, Mol Cell Biol. 200 2.;22(11):3565-76.)

В последние годы с развитием технологий определения нуклеотидных последовательностей количество информации в биологических базах данных нарастает с очень большой скоростью. Анализ этих баз данных позволяет идентифицировать новые, ранее неизвестные гены, кодирующие, в частности, тиоловые оксидоредукгазы. Изучение этих новых оксидоредукгаз, а именно их биохимическое исследование, поиск белков-мишеней, изучение механизмов регуляции и экспрессии на клеточном и тканевом уровнях очень важно для более глубокого понимания фундаментальных проблем редокс биологии.

Поиск новых селено-содержаших оксидоредуктаз представляется сложным из-за того, что при автоматическом компьютерном анотировании раеши4рованных геномов TGA кодоны узнаются соответствующими программами как стоп кодоны, что приводит к их ошибочному анотированию.

Новый селен-содержащий белок SelM.

Одним из способов идентификации новых селен-содержаших белков является поиск гомологов уже известных белков. Используя этот метод с помощью программ PSI-BLAST/PHI-BLAST, мы обнаружили кДНК последовательность длиной 0.7-kb, гомологичную последовательности ранее охарактеризованного белка Sepl5 в EST базе данных млекопитающих, и назвали этот белок SelM. кЦНК последовательности из базы данных мышиного и человеческого SelM были подтверждены методом сиквенирования. Открытая рамка считывания содержала 148 аминокислот и предсказанный селеноцистеин, кодируемый TGA кодоном, находился в положении 48. Гомологичные белки были также обнаружены нами у крысы, рыбы (Zebra fish) и у ряда других позвоночных Эти белки имели примерно 50% идентичности, и селеноцистеин в этих гомологах был абсолютно консервативен.

Дальнейший анализ нуклеотидной последовательности 3' нетранслированной области мРНК SelM показал, что в апикальной петле вместо абсолютно

консервативных аденозинов находятся цитозины. Для доказательства того, что данный белок действительно является селен-содержащим, мы использовали ранее предложенный метод, суть которого заключается в транзиторной экспрессии химерного ОРР-8е1 белка методом трансфекции клеток мле коп и тающих с одновременным метаболическим мечением этих клеток радиоактивным изотопом селена Бе75 и последующей визуализацией радиоавтографа белков, разделенных в ПААГ-электрофорезе. В данных условиях в случае, если селен встраивается в полипептидную цепь химерного белка, на радиоавтографе в дополнение к полосам, соответствующим эндогенным селен-содержащим белкам, появляется дополнительная полоса предсказанного размера (Рис. 12).

Рисунок 11. А - схема, иллюстрирующая структуру испохьзуемых химер SelM. Б-вторичная структура мутантных вариантов SECIS элементов, используемых в экспериментах.

Мы приготовили следующий набор химерных конструкций мышиного SelM с GFP: GFP- MSelM дикого типа, GFP- MSeIM(Sec TGA>TGT) (седеноцистеиновый кодон TGA заменён на TGT), GFP- MSelM(TGA корня SECIS элемента TGA>ATC)(TGA триплет в SECIS элементе мутирован на ACT для предотвращения встраивания селеноцистеина), GFP- м8е]М(ДСС)(цитозины апикальной петли в положении 576 и 568 были удалены), GFP- MSelM(CC>AA)( цитозины в положении 576 и 568 были мутированы на аденозины), GFP-м5е1М(СС>СО)(цитозины в в положении 576 и 568 были заменены на гуанозины), GFP- м5е!М(СС>ТТ)(цитозины заменены на тимидины) и, наконец, химеру, в которой мышиная апикальная петля была заменена на человеческую (Рис. 11 Б). Мы трансфецировали CV-1 клети с этими конструкциями одновременно с

радиоактивным мечением, и на радиоавтографах ПААГ гелей выявили дополнительную полосу размером 44 кДг для химеры ОРР с диким типом ЭеМ, когда цитозины были заменены на аденины, а мышиная апикальная петля была замена на человеческую. Таким образом, были сделаны следующие выводы: БеМ действительно является новым селен-содержащим белком и новая форма БЕС15 элемента в которой ранее считавшиеся абсолютно консервативными аденозины могут быть замены на цитозины, явлется функциональной.

GFP-SilM. 4+ kD:v

TRI. 57 U>;|

гасг ~

• **

Рисунок 12. Метаболическое мечение c75Se CV1 клеток, трансфецированных с указанными конструкциями.

1-GFP-MSelM дикого типа

2- GFP- MSelM(CC>AAX цитозины в в положении 576 и 568 Выли мутарованы на

аденозины) -т^-п

3 - GFP- MSelM(Sec TGA>TG1) (селеноиистеиновыи кодон TGA заменен на те. I)

4 -GFP- MSelM(TGA корня SECIS элемента TGA>ATC)(TGA триплет в корне SECIS элемента мутирован на ACT для предотвращения встаивания сепенсщистеина)

5 - GFP- mSelM (мышиная апикальная петля заменена человеческую)

6 -GFP- MSelM(: СС)(цитозины апикальной петли в положении 576 и 568 были удалены),

7 - GFP- мЗе1М(СС>ТТ)(иитозины заменены на тимидины)

8- GFP-MSelM(CC>GG)(UHTO3HHbiB в положении 576 и 568 были заменены на гуанозины)

На следующем этапе была изучена экспрессия SelM мРНК в различных тканях методом Норзерн блоттинга. Мы показали, что SelM мРНК присутствует во многих тканях, а максимальный уровень экспрессии наблюдается в головном мозге (Рис.13).

- (1.7 (SelM)

- 4.7(28.4)

- 1.8(ISS)

Рисунок 13. Экспрессия SelM мРНК в тканях мыши.

Селенопротеом млекопитающих

Ранее при расшифровке генома человека многие селен-содержащие белки были потеряны в процессе автомагической анотации с использованием стандартных программ из-за присутствия TGA юдонов внутри открытой рамки считывания. Поскольку селен играет очень важную роль и его эффекты обусловлены селенопротеинами, было необходимо иденти(}ииировать и охарактеризовать все селен-содержащие белки.

В отличие от других исследователей, мы использовали следующий алгоритм для идентификации: 1) провели поиск всех теоретически возможных кандидатов SECIS с помощью программы SECISSearch 2.0 в геноме. Эта програма анализирует структурные и термодинамические признаки SECIS элементов. 2) Поскольку между SECIS элементами ортологов существует детектируемая гомология, мы идентифицировали далее все возможные человек/мышь и человек/крыса SECIS пары с помощью програмы SECISblastn, которая анализирует консервативность возможных SECIS элементов. 3) Проанализировали последовательности, находящиеся перед предполагаемым SECIS элементом программой gsneid, которая позволила обнаруживать открытые рамки считывания с высоким кодирующим потенциалом и которые предположительно содержат TGA кодоны внутри этих рамок. 4) Наконец, предсказанные кандидаты были проанализированы по MSGS (mammalian selenoprotein j^ne signature) критериям, что позволило проскринировать селен-содержащие гомологи на наличие и консервативность открытых рамок считывания, содержащих TGA кодоны и SECIS элементы.

Первоначально (ATGA_AA_GA) паттерн был использован программой SECISSearch 2.0, что позволило идентифицировать 7146 возможных кандидатов на SECIS элемент. Далее программа SECISblastn обнаружила 1031 пару человек/мышь и 276 пару человек/крыса среди найденных на первом этапе кандидатов. Далее, отфильтровав повторяющиеся последовательности в геномах мыши и крысы, мы

WNÜMUMUUWUyUUU

нашли 56 уникальных человек/мышь и 58 человек/крыса пар, из которых 40 были общими для всех 3-х организмов. Последующий анализ набора этих пар с помощью geneid программы и критериев MSGS уменьшил количество кандидатов до 20-ти. Среди них было 15 уже известных селеновых белков, а 5 - были новыми, которые мы назвали соответственно SelH, Sell SelK, SelS и SelV.

Аналогичный компьютерный анализ с использованием ATGA__CC_GA паттерна позволил обнаружить SeM белок и ещё один новый, названный SelO.

Только два из известных генов селен-содержащих белков не были идентифицированы - SPS2 (селено-фосфат синтетаза), ген которой отсутствовал в базе данных, и тиоредоксин редуктаза 2, в которой в аденозин перед корнем SEC1S элемента заменён на тимидин.

Далее эти 24 селеновых белка были проанализированы на наличие гомологов, и этот анализ позволил обнаружить 25-й селен-содержащий белок человека, названный плутатион-пероксидазой 6 (GPx6). Этот белок не был найден в SECISsearch анализе, поскольку его мышиный и крысиный ортологи имели цистеин на месте селеноцистеина и не содержали SECIS элемента.

Для экспериментального подтверждения того, что найденные генетические последовательности действительно являются кодирующими для селен-содержащих белков, был использован тот же метод, что описан выпе для SelM - трансфекции с конструкцией GFP-селен-содержашнй белок химеры клеток млекопитающих и меченияс Se75. Мы клонировали SelH. SelK, SelO. SelVn SelS в pEGFP-C3 вектор и трансфецировали с полученными конструкциями CV-1 клетки, пометив их радиоактивным изотопом селена (Рис.14).

ОР Р-8еВ. <9 ЯОэ агр-энн 40 кОа 0РР.5еЮ( N1. М к0.1 ОРР-вШК. 37 кОа вГР-ЗоЩ N1.37 Юа

К V

Рисунок 14. Клетки С\М, трансфецированные и меченные радиоактивным изотопом Эе75

Кроме того, мы использовали поликлональные антитела для экспериментов по иммунопреципитации метаболически меченых селеновых белков и технологию

GPxl, 25 kDa-

Не1_а НЕК 293

5 2 с х т о. гч сл ш 5 о с

V сл о а о со а. СЛ Ф о

б О ю 2 сл о

О. О) О СЛ

98_„

62—*- _. ,___ -ТНГ/ТНЗ

49 —— -ЭРЭг

* 4

38-^

28-

1 тттттт

-СРхТ

«М -вей

-<ЗРх4

-э^т

~Зе1Н/ве1М ~~5ер15/МзгВ1 -Эе^ -МэгВ!

л О О О ^

[ о. а. а а. о. о

10 0 0 0 0 0

[О-Щй; 0> Щ ф 1Л О) Оу>Ои>у>(Л£и1

эШЫА Иммунопреципитация

Рисунок 15. А - РНК интерференция некоторых матричных РНК, колирующих селеновые белки, выявленные методом мечения радиоактивным изотоп ом белкового продукта соответствующего гена. Названия генов указаны на рисунке. Б - Левая панель -индивидуальный, двойной и тройной нокдаун 6Рх 1, вРх 4 и 8е1Б в НЕК 293 клетках. Правая панель - иммунопреципитация меченых селен-содержащих белков с соответствующими поликлональными антителами.

РНК интерференции для того, чтобы выяснить соответствие эндогенных селеновых белков специфичным полосам на радиоавтографах (Рис. 15).

Гпутапшон пероксидаза 6(GPx6).

Глутатион пероксидаза 6 является гомологом ранее охарактеризованных белков этого семейства. Как уже отмечалось, это единственный пример среди млекопитающих, когда внутри этой таксонометрической группы среди ортологов селеноцистеин в каталитическом центре человеческого белка заменён на цистеин у грызунов.

Крысиная глутатион пероксидаза 6 была ранее клонирована и названа запах-метаболизирующий белок, поскольку согласно результатам in situ гибридизации она была локализована в Боуменовых железах где синтезируются и секретируются многие компоненты обонятельной слизи.

Мы клонировали Gpx6 мыши и свиньи, и провели Норзерн блот анализ, при этом используя Gpx3 в качестве контроля (Рис. 16). Показали, что матричная РНК Gpx6 экспрессируется не только в обонятельном эпителии, но и в эмбрионах мышей на ранних этапах эмбрионального развития. Таким образом, доказано, что этот белок играет определённую роль в эмбриогенезе.

Ткани мыши на различных стадиях Свинья Мышь эмбрионального развития

»-< J £ 7 31

GPx6 свиньи проба

GPx6 мыши п

GPx3 мыши проба

роба 4 т т • щ Ш Ф mm

>•1

Рисунок 16. Норзен блотанагиз различных тканей мыши и свиньи.

Вовлеченность белка Срхб в эмбриональные процессы делает его исключительно важным, поскольку роль пищевых добавок селена в диетах для эмбриогенеза в настоящее время доказано для целого ряда животных моделей и не вызывает сомнений. Однако точные механизмы этого эффекта до конца не известны. Поскольку именно селенсодержащие белки опосредуют эти механизмы, детальное изучение каждого из членов семейства селенсодеожащих белков в отдельности, а также их взаимодействие позволит детально описать многообразие метаболических путей и физиологических эффектов селенав эмбриогенезе.

Селеновый белок V ($е1У)

Новый селеновый белок V (БеГУ) являлся гомологом известного банка 5е1\¥, однако его ^концевая последовательность содержаза дополнительный домен, богатый пролином. Согласно проведённым экспериментам по его локализации на органном и тканевом уровнях, мы заключили, что, поскольку белок локализован в семенниках (сперматоцитах), он может играть важную роль в сперматогенезе.

I cvvty-y'WVAH'.-ur'j-уни-и1V.Y у,*' ¡¡¡v\\i

i щфЩ |ГП Ляуч^УГ'г.?! i ri"

»1 m:tуш-щшrjTTi'.'i''irnv\ jin'si^ii [mu\ iм: к\ tirvjminuinifirtrtr

|м> 11 Pfl VJI'Vani'mniK^M"? trcmHJ>F>S*» r UM-J I-MM-M" If MIT'S

JIV |iriIv'.i Ц1 n'jrjmi MUM^I [Щ

¿л JiJt («.цшДДшт.....

12 3 4

Рисунок 17 А Множественное выравнивание последовательностей SelV и SelW Б Норзерн дот габридизац1я SelV В In situ гибридизация семенников мыши с антисмысловой пробой гена SelV

Одним из основных эффектов селена считается его влияние на мужскую фертильность, что особенно хорошо показано на мышиных моделях, в которых с помощью генетических манипуляций нарушен нормальный синтез и/или метаболизм селен-содержащих белков Эти белки, в свою очередь, являются посредниками, обеспечивающими эффекты селена, и очевидно, что селен-содержащий белок SelV является одним из ключевых составляющих селенопротеома семенников млекопитающих

Исследование селенового белка Н (SelH)

Множественное выравнивание доступных последовательностей SelH белков показало наличие консервативного CXXU мотива, окруженного N-юнцевым бета слоем и С-концевой альфа спиралью, что характерно для тиоредоксин-подобной укладки тиоловыхоксидоредуктаз (Рис 17). Таким образом, мы предположили, что

5е1Н является оксидоредукгазой, в которой СХХ11 мотив играет роль в обратимой окислительно - восстановительной группе

Последующий анализ последовательности показал возможное наличие Сигнала -Ядерной Локализации (ЯКЯК), при этом аргинины в положении 6 и 8 (нумерация по последовательности БеИ мыши) являлись абсолютно консервативными, что указывает на их существенную роль в ядерном импорте как части Сигнала Ядерной Локализации (Рис 18).

Сигнал

Ядерной сх*и

Локализации Мотив

Рисунок 18. Множественное выравнивание ряда селеновых белков Н Сигнал ядерной локализафи и консервативный редокс мотив указаны

Для исследования внутриклеточной локализации белга SelH мы приготовили химерные конструкции, схематично изображенные на рисунке 19 Сначала мы заменили TGA кодон (Sec) внутри открытой рамки считывания на TGT, кодирующий цистеин для предотвращения терминации трансляции Используя полученную последовательность, мы клонировали полноразмерный цистеиновый мутант SelH в pEGFP-N2 вектор, клонировали N-концевую его часть, предположительно содержащую Сигнал Ядерной Локализации

Кроме того, мы приготовили мутантные формы для обеих вышеописанных конструкций, в которых аргинины (R) в положении 6 и 8 были заменены на серины, таким образом нарушая ядерный сигнал (Рис 19).

5чгга нкнки

-шг

З'итп

-ААААА

Рисунок 19 Схема, иллострирующая структуру использованных химерньк конструкций Сверху -структура мРНК Бе1Н 5'иТЯ и - З'иТЙ нетранолированнаые последовательности.

Трансфекция клеток млекопитающих с последующей визуализацией с помощью конфокальной микроскопии показала, что химеры с полноразмерной и И-концевой последовательностью имеют ядерную локализацию, тогда как в случае замены консервативных аргининов на серины флуоресценция наблюдалась как в ядре, так и в цитоплазме, соответственно ядерная локализация БеИ действительно определяется предсказанным сигналом, ключевыми компанентами которого действительно являются аргинины в позиции 6 и 8 (Рис 20)

Рисунок 20 Локализация БЕШ-вЕР химер в трансфецированных клетках Нумерация конструкций соответствует таковой на предыдущей схеме.

Поскольку в случае конструкции образовался белок, содержащий полноразмерный веИ, при этом наблюдали преимущественное окрашивание определенных структур внутри эдра, мы использовали эту конструкцию в экспериментах по одновременному тройному мечению с маркерами для ядрышек (нуклеолы, маркер - нуклеолин) и нуклеоплазмы (1Т2В). Как видно на рисунке, зеленая флуоресценция, соответствую 1щя БеН, соответствует красной, что указывает на то, что ЭеЩ является белком ядрышгк (Рис 21) Таким образом, мы показали, что БеШ локализуется в ядрышках клеток млекопитающих

SelH-GFP

U2B

Совмещение

Рисунок 21 Тройное мечение ядер NIH ЗТЗ клеток трансфецированной SELH-GFP химерой, маркером ядрышек (анти-нуклео/ин), и маркером нуклеоплазмы (анти-и2В) антителами

In silico анализ экспрессии гена SelH показал, что и мышиная, и человеческая мРНК этого гена присутствует во многих, если не во всех тканях и органах Однако, большинство EST происходило либо из эмбриональных, либо из малигнизированных тканей, в частности из карцином Более того, анализ SAGE баз данных позволил предположить, что экспрессия человеческого SelH усилена в опухолях щитовидной железы, легких и печени, а у мыши - в развивающемся мозге Мы напрямую проанализировали экспрессию мРНК SelH методом Норзерн блотгинга, используя мышиные эмбриональные ткани и ткани половозрелых животных (Рис. 22 и 23) Наиболее сильный сигнал был выявлен в образцах тканей, полученных на ранних стадиях эмбрионального развититя, а во взрослом состоянии - в тимусе, мозге и тестикулах. В проанализированных клеточных линиях самый сильный сигнал наблюдался в LCC1 (рак легкого), LNCaP (человеческая карцинома простаты), MCS1 (клетки Сертоли мыши), и NIH ЗТЗ (мышиные фибробласты) клеточных линиях Методом Вестерн блотгинга мы показали, что SelH белок наиболее представлен в селезенке и мозге, а в остальных

тканях —не определялся. Также, согласно данными Норзерн блоттинга, наиболее высокая экспрессия белка БеЩ наблюдалась в ЬИСаР и ЬСС1 клеточных линиях.

О) —

SelH

28S 18S

Рисунок 22. Тканевое распределение SelH.

Эти две клеточные линии были использованы для дальнейших экспериментов по метаболическому мечению и субклеточному фракционированию с последующим анализом радиоавтографов ПААГ гелей (Рис. 24). Полоса размером 14 кДа, соответствующая размеру SelH, была обогащена в ядерной фракции. Эта фракция была разделена на ядрышковую фракцию и нуклеоплазму, и проанализирована методом Вестерн блоттинга Подобно нуклеолину, ядрышковому маркеру, SelH находился в нуклеолах. Дальнейшие иммуногистохимические эксперименты подтвердили локализацию SelH в ядрышках.

Поскольку SelH предположительно вовлечён в окислительно-восстановительные реакции, мы исследовали его физиологическое значение для клетки, используя технологию РНК интерференции. Были приготовлены стабильные клеточные нокдауны на основе LCC1 клеточной линии. Отсутствие экспрессии гена проверялось методом Норзерн блоттинга (Рис. 25А, верхняя панель), а отсутствие экспрессии белка - методом Вестерн блоттинга (Рис. 25А. нижняя панель).

В дальнейшем, эти клетки инкубировались с различными редокс активными агентами, включая перекись водорода, третбугил гидропероксид, ДТТ, менадион и паракват. В инкубированных клетках измерялась выживаемость и сравнивалась в нокдаунах по сравнению с контрольными клетками, трансфецированными с вектором. Мы не наблюдали изменений в выживаемости клеток в эксперименте по сравнению с контролем, за исключением случая, когда использовалась HjOz- При концентрации 0.1-0.4 мМ выживаемость клеток с отсутствующим SelH была существенно снижена (Рис.25Б). Таким образом, мы заключили, что белок SelH может играть важную роль в сопротивляемости этих клеток к оксидативному стрессу, индуцированному перекисью водорода.

H1299

HT1080

RCC45

ACNH

HCT116

PC3

DU1445

C4-2

DU145

NKE-hTREP

Liver ' Brain Kidney Lung ( Spleen Heart Skin Testis Uterus

{/> (1> X

NIH3T3

HEK293

MIN6

LLC1

LNCaP

22RV

PC3

CV1

Hep1

HepG2

HeLa

MSC1

m ! Brain

X Heart

• Lung

* Liver

t Spleen

i Kidney

Stomach

Small Intestine

t Skeletal Muscle

• Thymus

9 Testis

* Uterus

Placenta

(17.5 d.p.c)

ч®

/ .о*

o^ ^ #

Ü»

SelH, 14kDa

Nucleolir», 106kDa

a-SelH

Phase Contast

Merge

Рисунок 24. Субклеточное фракционирование методом дифференциального центрифугирования клеточной линии 1_СС1 с последующим выявлением сигнала 5е1Н методом Вестерн-блотинга (чистота фракций нуклеол показана на нижней панели). Прямое иммуногистохимическое выявление эндогенного Зе>Н в клеточной линии 1СС1.

О) >

сс

со

SeIH probe

GAPDH

a-SeIH antibody

100

С? 80

>; 7o

E 60 n „ и 50

> 40

V -♦- Vector

\ -•-SeIH RNAi

\ V л, \

\ \ \

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1

н202 (шМ)

Рисунок 25. А - Стабильный нокдаун SeIH в клеточной линии LCC1, проверенный методом Норзерн блот анализа (вверху) и Вестерн блот анализа (внизу), Б - Повышенная чувствительность SelH-дефицитных клеток к перикиси водорода в сравнении с контрольными трансфецированными с вектором клетками.

Для того, чтобы выяснить биохимическую основу этого эффекта, мы использовали рекомбинантный мышиный БеИ в ряде стандартных биохимических реакций. Был

использована система тиоредоксина ("ГО. и Тгх), протекторная активность по отношению к глугамин синтетазе и система GR - GSH Кроме того, в качестве контроля мы использовали мутантную форму, в которой sec был заменен на серии, что теоретически должно было нейтрализовать редокс- активность

Мы не обнаружили отличий в активностях исследуемых реакций у СХХС и CXXS мугантных форм, кроме случая с шутатионом На рисунке 26 представлены данные по глутатион пероксидазной активности SelH с перекисыо водорода и трет бутил гидропероксидом Как видно, SelH СХХС вариант обладал способностью восстанавливать перекись используя глутатион, и эта способность существенным образом зависела от присутствия цистеина в каталитическом центре

то Е э Е

3000 2500 2000 1500 1000 500

Г-ВООН

Н202

/-ВООН

Н202

cxxs сххс cxxs сххс

Selenoprotein Н Liver

Рисунок 26 Глутатион пероксидазная активность SelH с различными вицами перекиси Указанные рекомбтантные мутантные формы (CXXS или СХХС) SelH иш лизат печени мыши в качестве контроля были использованы в стандартной спаренной реакции Единица активности определена как колжество белка, необходимого для окисления 1 pmol NADPH/мин Реакции были инициированы добавлением 300 рМ или 233 рМ (-ВООН в качестве субстрата

Drosophila melanogaster SelH3

Drosophila simulans SelH3

Drosophila yakuba SelH3

UfdSóphilá métáiiógáStéf SélH2

Drosophila simulaos SelH2

Drosophila yakuba SelH2

Anopheles SdH2

Orosophilo melanogaster BthD

Drosophila simulans BthD

Drosophila yakuba BthD

Anopheles SelH1(8tK0)

Ciena intestinal!«

Ciona savignyi

Fugu

Tetra don

Zebrafi?h

Mouse

Rat

Human

PiO

Chicken

Arabidopsis SelH1 Arabidopsis SelH2

ICXXR TXXC

e I

exxu

Рисунок 27. Эволюционный анализ SeIH последоватегьностей эукариот.. Для построения филогенетического дерева были использованы следующие последовательности из генетического банка (GenBank™): Gallus gallus SeIH (46017578), Danio rerio SeIH (31342376), Tetradon SeIH (56 30 5185), Anopheles gambiae SeIH (27645579), Drosophila melanogaster BthD (14718671), Arabidopsis thaliana SelH1 (3068901 1), Arabidopsis thaliana SelH2 (500 58 858), Drosophila melanogasterSelH3 (24584864), Drosophila melanogasterSelH2 (113194556), Mouse SeIH (8 2546880), Rat SeIH (109470184), Pig SeIH (87230686), Human SeIH (3516960), Ciona savgnyiSeIH (51695500), Ciona intestinalis SeIH (56 083593), Drosophila yakuba SelH3 (84681766), Drosophila simulans SelH3 (61736437), Drosophila yakuba SelH2 (84681627), Drosoptt/a simulans SelH2 (1 11276688), Drosophila yakuba BthD (84679567) и Drosophila simulans BthD (61 714200).

Далее мы провели филогенетический анализ этих белков (Рис 27). SeIH белки у животных разделяются на три ветви, основная из которых содержит последовательности селенсодержаших форм данного белка. У различных видов дрозофил были найдены гомологи, содержащие в каталитическом центре CxxR или ТххС последовательности. Таким образом, мы показали, что SeIH является новой селен-содержащей оксидоредукгазой ядрышек, вовлеченной в зашиту клеток от оксидативнош стресса

Семейство Rdx белков.

Целый ряд селен-содержаших белков млекопитающих имеют селеноцистеин, разделённый 0-2 аминокислотными остатками с консервативным цистеином. Среди них ЗеГГ, 5е№, 8е1Н и ЭеГУ содержат СХХи, при этом этот мотив расположен между предсказываемым бета слоем и альфа спиралью, что указывает на возможные аналогии с белками тиоредоксин-подобной укладки и подразумевает наличие окислительно-восстановительных функций.

Попарное сравнительное выравнивание этих последовательностей (веГГ, БеГУУ, БеН и БеГУ) не выявило значительной гомологии между ними, однако при использовании в программе РБЬВЬАЗТ последовательности БеГГ в качестве запроса в ЫопгедшДат базе данных мыобнаружили дополнительный неохаракгеризованный белок молекулярной массой 12 кДа, содержащий СХХС мотив в месте СХХи мотива 5еГГ Данный белок был назван нами Мх12. Используя последовательность И(1х12 в качестве запроса в дальнейших поисках программой Р51-ВЬА5Т, мы обнаружили гомологию 11с1х12 с рядом последовательностей 5е1\У, БеШ и БеIV сЕ величной, отражающую достоверность, ниже 01 (£-уа1ие ниже 0.1). Более того, множественное выравнивание этих последовательностей выявило консервативность положения СХХС или СХХЛ (Рис. 28) в предполагаемом редокс каталитическом центре Дальнейший поиск гомологов Ю3х12 белка позволил выявить такие белки у рыб, и у этих белков на месте второго цисгеина в белке млекопитающих находился селеноцистеин (СХХи мотив в 11(1x12 белке рыб)

Предсказания вторичной структуры этих белков показали наличие тиоредоксин-подобной укладки, с той разницей, что у ряда представленных последовательностей отсутствовала спираль Эта спираль может отсутствовать в ряде тиоредоксин-подобных белков, как было погазано для семейства 5ер15/5е1М Другим консервативным участком у гомологов Мх12 была последовательность, находящаяся в середине концевой области 1СхРЕ1(У)

Таким образом, базируясь на данных анализа первичной и вторичной структуры, мы заключили, что вышеописанные белки формируют собой новое семейство оксидоредуктаз, имеющих тиоредоксино-подобную укладку и консервативный редок: мотив, и назвали его - Шх-подобным семейством (Яс1х-подобные белки)

ЕЕЕЕЕЕЕЕЕ 6677917 1 МЕЬЕЕ'">7\Е'£-.;Т1

2384721 Нз 1 ЧЕЬЕ'.ЕЕ/Еу!";.Т

29643542 Эг 1 МГУКУЧУУУКаЯ 32492911 Нз 261 КЯУ1. 1РУТу5е [Ж 34873611 Еп 21

ЕЕЕЕ

1пЬо_А М)_ 1 МУШТЕУГСЕР!® 11499728 Аг 1 МУЧЧКЕРТЕРтф 4 53 59198 1 МУК1ЕУЕТЗР>«;

15897143 Ээ 143 ЕЕ7Е:ЕТУ7ТЕ 'Ч

14600959 Ар 133 С-НУ-ПЕТПТРЗ^

ннннннннннннн еее ее ее ее ееееее нннннннннннннн

"/егуеее-'ее ее е е—е.еее еееее—троут—срееутуасгаунзкк(5|уэт1:з<ек1<1лта1к 81 [ 88] 1уее.:уеее-е'е'ееееее—с^еиссес—трсат—ееее'-ее'а" е 1.1,у.;"у1!>ее: тее'ееееееаее 81 i 87]

ее ре е : ее ете ееее с р---жьенвис---трбтт---сш.еу2ужж1,ук31(к (5 ) уэзэземск 1ута1е 81 [ 86,

егеееуе:е-'еее"ссе?—[етееееее—ааоат—ее." е7;у|;е">еееее- i; 1е.'е-г.ее:гееуее' 34 0 1346] : ее ае уе е е а е еееее ур----е1е : ее"----ее-ет---еееееееиее. еуееее (5 ) руек0ьмеа1чвазн 98 [115]

НННННННННН ЕЕЕЕ ННННН ЕЕЕЕ ЕЕЕЕ НННЯНННННН

еуееех:еее е—е'ее7ее :е::ееееееА( е)ае^ееаепеЕ'у-г/ее..—Г""Еееееа:|:ее'-е. 85 [ 85]

"л?еаекууз<уакеес---'."а! ii ее vi] ее ее е ее аi 6 ) еее/хутке еуе ееее---рееееееее 1;1-еее 84 [ 91,

'[яраа^ягуоетакехе----е ее ее"! ее'е'е е"е -'А ' е) А ерг.'ее нее'-"-:г.".:л---1т ее ее i ее 80 [ 80]

>уд?УААШАНМУАРЕАС(4) "ее;: е г.'ее ее е'к.ее а ( 6 i е ее ее ее се е ее ееее"---ру еече е "ее 1е ееее 231 [233

>узруау1.1.ан>1рауеая(4}ру11.3еауеауенроеа(6) ееееьене'уеег/'е,"---ругееех ее еееа.-е 226 [2 43]

Рисунок 28 Множественное выравнивание РИх12 белков эукариот

Тканевая экспрессия Шх подобных белков млекопитающих

Для изучения экспрессии Яс1х12 белков был использован метод норзерн блоттинга с различными тканями мыши. Согласно нашим данным, наиболее высокая экспрессия БеГТ мРНК наблюдалась в почках, затем в мозге, сердце и тимусе, тогда как 11(1x12 мРНК была наиболее представлша в почках, а также в мозге и в яичниках. 5е№ мРНК была наиболее представлена в мозге и скелетных мышц ах мыши (Рис 29)

12 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 13 БеИ ш — • - - ~ А

• « • « - • в

ЭеМ • С

Рисунок 29. Норзерн блот анализ различных тканей мыши с указанными пробами. Ткани приведены в следующем порядке - слева направо: мозг, серцце, легкое, печень, селезенка, почка, желудок, тонкий кишечник, скелетная мышца, тимус, яичник, матка и плацента.

Внутриклеточная локализация Кс/х/2 белков. Ранее было показано, что 5е/\У является цитоплазматическим белком, однако о локазизации новых Яс1х12 и БеГТ до настоящего времени ничего не было известно. Анализ последовательности Яс1х12 не выявил специ(|ических сигналов внутриклеточной локализации, и дальнейшие эксперименты с химерами 1Мх12 и вРР это подтвердили. При трансфекции клеток N111 ЗТЗ с конструкциями, содержащими эти химеры, флуоресценция распределялась по всей клетке и не отличалась от таковой в контроле, когда клетки трансфецировались с вРР. Таким образом, также как 5е№, Кс1х12 имеет преимущественно цитоплазматическую, и возможно, частично ядерную, локализацию.

Множественное выравнивание Яс1х12 белков выявило удлинение концевой последовательности у 8е1Т белка, и этот !Ч-концевой участок обладает характерными признаками сигнального пептида. Чтобы проверить, вовлечена ли эта последовательность в субклеточную локализацию белка БеГГ, мы приготовили ряд конструкций химер полноразмерного ЭеГГ или без И-концевого участка с вРР, и трансфецировали клетки. Какпоказано на рисунке 30, полноразмерный БеГГимел необычное распределение по клетке, и оно не зависело от присутствия [Ч-конца, т.к. редуцированная без М-конца форма была локализована подобно полноразмерной. Напротив, когда Ы-концевой пептид был соединён с вРР. флуоресценция наблюдалась равномерно по клетке, что указывало на независимость внутриклеточной локализации белка от этой Ы-концевой последовательности.

В дальнейшем мв использовали различные маркеры клеточных органелл, для выяснения внутриклеточной локализации БеГТ. Мы исключили лизосомальную, митохондриальную и пероксисомальную локализацию ЭеГТ, однако сигнал частично перекрывался при использовании маркеров ЭПР или аппарата Гольджи (Рис. 30). Таким образом, мы показали, что 5е1Т локализован в аппарате Гольджи и, возможно, частично в ЭПР ицитозоле.

Рисунок 30. Внутриклетсчная локагазация SelT.

Левая панель - ЭПР маркер, правая панель - Гольджи маркер. Образцы на левой и правой панелях идентичны.

Поиск белков-партнёров Rdxl2 и Se/W у млекопитающих.

Наличие тиоредоксин-подобной уклацки и СХХС мотива предполагает дальнейшие аналогии с тиредокеином в контексте механизма его каталитического цикла. Во время реакции тиоредоксины формируют временные межмолекулярные дисульфидные связи с белками-мишенями с помощью N-концевого цистеина, который восстанавливается вторым цистеином каталитического редо кс-центра. Замена восстанавливающего цистеина на серии приводит к стабилизации межмолекулярной связи, и, соответственно, селективного связывания тноредоксина с белком-партнёром с дальнейшгй возможностью разрушения данной связи дитиотрийтолом и идентификации этих партнёров с помощью масс-спекгрометрии. Этот принцип был применен при поиске белков, взаимодействующих с SelW и Rd xl 2.

Мы приготовили рекомбинатные формы SelW и Rdxl2 белков в виде экспрессированых в Е. coli мутантных CXXS и SXXC форм, содержащих также концевой полигистидиновый кластердляаффинной очистки.

CXXS и SXXC рекомбинантные формы Rdxl2 белка были очищены и иммобилизированны на бром-циан сефарозе. и цитоплазматическая фракция клеток печени была использована для поиска мишеней. На рисунке 31 представлен ПААГ элюатов с соответствующих аффиных матриксов, покрашенный серебром. Наиболее ярко прокрашенные белковые полосы были выделены и проанализированы методом масс спектрометрии.

Среди возможных партнёров были идентифицированы, сам Кёх12 (белок, смытый в небольшом количестве с матрикса), а также глутатион пероксидаза 1 (вРх1), пероксиредокеин 1 и глутатион-с-трансфераза. Чтобы оценить специфичность этих взаимодействий, мы напрямую исследовали возможность Яс1х12 связывать СРх1. Для этого меченные Эе75 печеночные ткани мыши инкубировались с БХХС формой 11(1x12. Сравнение, показанное на рисунке , между грубым экстрактом (линия 1), проскоком и аффинно связанной фракцией показывает значительное обогащение полосы размером 25 кДа, соответствующей глутатион пероксидазе 1, подтверждая то, что последний является партнёром белка Яёх12.

1 2 3

17 14

• А4

■ АЗ

■ А2

• А1

В *

ТР1 -51кОа

вРх1-25к0а

Рисунок 31. А - покрашенные серебром ПААГ белков-мишеней (ЭДх 12. Б - аффинное обогащение вРх1 на Яйх 12 матриксе.

Подобная процедура была применена для Зе1\У. В качестве мишгни была использована цитоплазматическая фракция мозга мыши, т.к. согласно данным норзерн блот анализа, это была самая обогащенная по мРНК Бе 1\¥ ткань.

На рисунке 32 представлен прокрашенный серебром ПААГ гель, содержащий полученные белки-партнёры БеРЛ1. Среди них были идентифицированы пероксиредокеин 1 (полоса В1), 14-3-3 (полоса В2), дигидро пиримидиназа-связанный белок 2 (полоса ВЗ), и белки теплового шока 70 и 90 (полосы В5 и В6, соответственно).

Подобные результаты были получены в том случае, когда мы использовали цитоплазму кардиомиоцитов. В этом случае наиболее обогатившимися были пероксиредокеин 1 и 14-3-3 белок. Этот факт дал нам основание заключить, что

5е1\¥ возможно имеет одинаковый набор партнёров в этих тканях, среди которых представлены: пероксиредоксин 1, 14-3-3 белок и белки теплового шока 70 и 90; более того, каждый из этих наборов содержит ферменты, вовлечённые в окислительно-восстановительные реакции.

кРа

188 ■

СО X X

X X </)

Рисунок 32. Покрашенные серебром ПААГ белков-мишеней Эе1\Л/.

Суммируя вышесказанное, можно заключить, что идентифицировано новое семейство белков, названное нами Яёх, которое имеет большое количество селеноцистеин-содержащих представителей. Четыре из двадцати пяти селен-содержащих белков человека (БеГТ, 5е№, БеН и 5е!У) являются его представителями, как показано на схеме (Рис. 33). Консервативность СХХС(Ц) мотива и тиоредоксин-подобной укладки указывают на наличие окислительно-восстановительной функции этих белков. Не исключено, что количество балков-партнёров значительно больше, среди них БеЛУ взаимодействует с белком 14-3-3 и Ябх с глутатион пероксидазой 1. Наиболее характерным признаком этого семейства белков является многообразие вариантов строения каталитического центра (Рис. 33).

Агд

Рисунок 33 Схема строения каталитического центра РИх белков

Существование многих форм членов семейства ВДх, которые локализованы в различных органеллах клетки, а также неравномерно распределены по тканям организма животных свидетельствуют о том, что разные представители этого семейства могут нести различные функциональные нагрузки. Это указывает на возможное различие как субстратной специфичности этих белков, так и их ферментативной активности Соответственно, разные представители этого семейства могут быть вовлечены в различные пути метаболизма клетки, что открывает новые возможности и направления будущих исследований.

1. На основании проведенного филогенетического анализа было установлено, что из существующих двух форм тиоредоксин редукгазы животных («большая» и «малая»), «большая» форма эволюционно образовалась на уровне низшихэукариот значительно раньше, чем «малая» форма "ГО была утеряна в организмах, от которых произошли животные Обе эти формы сосуществовали в процессе эволюции. Мы идентифицировали организм (СМатуЛотопая гыЪагйи), который содержит оба фермента Среди высших эукариот «болышя» форма стала преобладать у животных, тогда как «малая» сохранилась в растенияхи грибах

2. «Болышя» форма тиоредоксин редукгазы произошла от глутатион редукгазы низших эукариот путем удлинения карбокситерминального конца белка с появлением консервативного О у- Я ее С у5- С ус- в [у мотива в новом гаталитическом окислительно-восстановительном центре, который функционально заменил глутатион в качестве промежуточного (транзиторного) субстрата для этого фермента

3. Идентифицирован и охарактеризован новый митохондриальный глутаредоксин (Огх2). Сгх2 человека и мыши катализирует восстановление смешанных дисульфвдных связей, сформированных между шутатионом и НЕБв, 5-сульфоцистеином или 1^цисгеином На основании кинетических данных

Выводы

установлено, что Grx2 обладает наиболее высоким сродством по отношению к L-цистслну, и это сродство было эквивалентно таковому для HEDS и S-сульфодистеина

4 Показано, что белок TR2 структурно является тиоредокенн-глугатион редуктазой (TGR), при этом m vino он обладает тиолтрансферазной, глутатион и тиоредоксин редуктазпой, а также протеин дисульфид изомеразной активностью. Функционально TGR представляет собой изомеразу, одним из субстратов которой выявлена глутатион пероксидаза 4 (Gpx4), и, следовательно, TGR вовлечена в образование митохондриалъной капсулы сперматозоидов

5 1^(центифицирован и охарактеризован новый селен-содержащий белок SelM, имеющий новый тип SECIS элемента

6. Компьютерный анализ генома человека показал, что селснопротеом состоит из 25 селен-содержаших белка, семь из которыхранес небыли известны. Среди них охарактеризованы новая глутатион пероксидаза Gpx6, зкспрессирующаяся в обонятельном эпителии на определенных стадиях эмбриогенеза, а также селен-содержаа^й oc.tokSgIV- белоксперматоцитов.

7 Установлено, что селен-содержаиий белок Se!H - новая тиоловая оксидоредуктаза ядрышек, имеющая необычный паттерн экспрессии

8. Обнаружена новая тиоловая оксидоредуктаза эукариот, названная начи Rdxl2 На основании компьютерного анализа белок RdxJ2, сепен-содержаший белок SelW, селен-содержащий белок SelV, селен-содержащий белок SelT и селен-содержашцй белок SelH были объединены в новое семейство тиоловых оксидоредукгаз с тиоредоксин-нодобной укладкой Это семейство было охарактеризовано и названо нами RAx.

Список публикаций

1 NovosebvSV. Lobanov AV, Hua D, Kasaikina MV, Hatfield DL,Gladyshev VN.

A highly efficient form of the selenocysteine insertion sequence element in protozoan parasites and its use m mammalian cells Proc Natl Acad Sci USA 2007 May 8,104(19) 7857-7862

2 NovosebvSV. Kryukov GV, Xu XM, Carlson BA, Hatfield DL, Gladyshev VN. Selenoprotein H isa nucleolar thioredoxin-like protein witha unique expressionpattern. JBwlChem 2007 Apr20,282(16) 11960-11968

3 NovoselovSV, Hua D, Lobanov AV, Gladyshev VN

Identification and characterization of Fepl5, a new selenocysteine-containing member of

the Sepl5 protein family

Biocliem J. 2006 Mar 15,394(Pt 3)575-579.

4 Novosebv SV. Calvsi DF, Labunskyy VM, Factor VM, Carlson BA, Fomenko DE, Moustafa ME, Hatfield DL, Gladyshev VN.

Selenoprotein deficiency and high levels of selenium compounds can effectively inhibit hepatocaicinogenesis in transgenic mice Oncogene. 2005 Dec 1;24(54)'8003-8011

5 Novosebv SV. Gladyshev VN.

Non-animal origm of animal thioredoxin reductases, implications for selenocysteine evolution and evolution of protein function thioughcarboxy-termmalextensfons Protein Sci. 2003 Feb;12(2) J72-378.

6 NovosetovSV. Rao M, Onoshko NV, Zhi H, Kryukov GV, Xiang Y, Weeks DP, Hatfield DL, Gladyshev VN

Selenoproteins and selenocysteire insertion system m the model plant cell system, Chlamydomonas reirihatdtu. EMBOJ. 2002 Jul 15,21(14).3681-3693

7 Novosetov SV. Peshenko IV. Popov VI. Novoselov VI. BystrovaMF, EvdokimovVA, Kamzalov SS, Merkulova MI, ShuvaevaTM, Liptcin VM, Fcscnko EE

Localization of 28-kDa peroxiredoxm in rat epithelial tissues and its antioxidant properties

Cell Tissue Res. 1999 Dec,298(3) 471-480

8 Bonilla M, Demcola A, Novoselov SV. Turarov AA, Protasio A, Izmendi D, Gladyshev VN, Salinas G.

Platyhelmmth mitochondrial and cytosohc redox homeostasis is controlled by a single thioiedoxin glutathione reductase and dependenton selenium and glutathione J Biol Chem. 2008 Jun 27;283(26)-l 7898-17907.

9. Sengupta A, Carlson BA, Weavei JA. Novoselov SV, Fomenko DE, Gladyshev VN, Hatfield DL.

A functional link between housekeeping selenoproteins and phase II enzymes. Siocliem J 2008 Jul 1,413(1) 151-161

10 Merchant SS, Prochnik SE, Vallon O, Harris EH, Kaipowicz SJ, Witman GB, Terry A, Salamov A, Fritz-Laylin LK, Marechal-Drouard L, Marshall WF, Qu LH, Nelson DR, Sanderfoot AA, Spalding MH, Kapitonov W, Ren Q, Fenrs P, Lindquist E, Shapiro H, Lucas SM, Grimwood J, Schmutz J, CardolP, Ccruttill, Chanfreau G, ChenCL, Cognat V, Croft MT, Dent R, Dutcher S, Fernatilcz E> Fukuzav.-a H, Gonzätez-Ballester D, Gonzälez-Halphen D, Hallmann A, Hanikenne M, Hippler M, [tiwood W, Jabbari K, Kalanon M, Kuras R, Lefebvre PA, Lemaire SD, I-obanov AV, Lohr M, Manuell A, Meier I, Mets L, Mittag M, Mittelmeier T, Moroney JV, Moseley J, Napoli C, Nedelcu AM, Niyogi K, Novoselov SV. Paulsen IT, Pazour G, Purton S, Rai JP, Riano-Pachön DM, Riekhof W, Rymarquis L, Schroda M, Stem D, Urnen J, Willows R, Wilson N, Zimmer SL, Allmer J, Balk J, Bisova K, Cten CJ, Elias M, Gendler K, Häuser C, Lamb

MR, Ledford H, Long JC, Minagawa J, Page MD, Pan J, Pootakham W, RojeS, Rose A, Stahlberg E, Terauchi AM, Yang P, Ball S, Bowler C, Dcckmann CL, Gladyshev VN, Green P, Jorgensen R, Mayfield S, Mueller-Roeber B, Rajamam S, Sayre RT, Brokstein P, Dubchak I, Goodstein D, Hornick L, Huang YW, Jhavcri J, Luo Y, Martinez D, Ngau WC, Otillar B, Poliakov A, Porter A, Szajkowski L, Werner G, Zhou K, Grigoriev iV, Rokhsar DS, Grossman AR.

TheChlamydomonas genome reveals the evolution of key animal and plant functions Science 2007 Oct 12,318(5848)245-250

11 Shchednna VA, NowselovSV, Mahnouski MY, Gladyshev VN

Identification and characterization of a selenoprotein family containing a diselenidebond

ma redox mouf

Proc Natl A cad Sci USA. 2007 Aug 28,104(35) 13919-13924.

]2 Dikiy A, Novosetov SV. Fomenko DE, Sengupta A, CailsonBA.Cerny RL, Ginalski K, Grishm NV, Hatfield DL, Gladyshev VN

SelT, SelW, SelH, and Rdxl2 <£nomics and molecular insights into the functions of selenoproteins of a novel thioredoxin-like family Biochemistry. 2007 Jun 12,46(23)6871-6882.

13 Shrimali RK, Weaver JA, Miller GF, Staiost MF, Carlson BA, Novoselov SV, Kumaraswamy E, Glady>hev VN, HatGeld DL

Selenoprotein expression is essential m endothelial cell development and cardiac muscle function

NeuromusculDisord 2007 Feb,17(2) 135-142

14 Lobanov AV, Delgado C, Rahlfs S, NoroselovSV, Kryukov GV, Gromcr S, Hatfield DL, Becker K, Gladyshev VN

The Plasmodium selenoprotcome Nucleic Acids Res. 2006 Jan 20,34(2 ) 496-505

15 SunQA, Su D.Novoselov SV. Carlson BA, Hatfield DL, Gbdystev VN Reaction mechanism and regulation of mammalian thioredoxin/glutathione reductase. Biochemistry. 2005 Nov 8,44(44).14528-14537.

16 Castellano S, Lobanov AV, Chappie C, Novoselov SV. AlbrechtM, Hua D, Lescure A, Lengauer T, Krol A, Gladyshev VN, Guigo R

Diversity and fuittional plasticity of eukaryotic selenoproteins: identification and characterization of the SeLT family

Proc Natl Acad SciUSA 2005 Nov S; 102(45) -16188-16193.

17. Su D, Novosetov SV, Sun QA, Moustafa MB Zhou Y, Oko R, Hatfield DL, Gladyshev VN.

Mammalian selenoprotein thioredoxin-glutathione reductase Roles m disulfide bond formation and sperm maturation J Biol C/iem. 2005 Jul 15,280(28).26491-26498.

18 Castellano S, Novoselov SV. Kryukov GV, Lescure A, Blarco E, Krol A, Gladys he v VN, Guigo R

Reconsidering the evolution of eiicaryotic selenoproteins: a norel nonmammalian family with scattered phylogenetic distribution EMBORep 2004 Jan,5(1).71-77

19. Carlson BA, Novoselov SV. Kumaraswamy E, Lee BJ, Anver MR, Gladyshev VN, Hatfield DL

Specific excision of ite selenocysteme tRNA[Ser]Sec (Trsp) gene in rrousc liver demonstrates an essential role of selenoproteins m liver function. J Biol Chem 2004 Feb 27,279(9)3011-8017.

20 Rao M, Carlson В A. Novoselov SV. Weeks DP, Gladyshev VN, Hatfield DL. Chlamydomoras remhaidtu selenocysteme tRNA[Ser]Sec. RNA 2003 Aug,9(8).-923-93 0

21. Kryiicov GV, Castellano S, Novoselov SV, Lobanov AV, Zehtab O, GuigS R, Gladyshev VN

Characterization of mammalian selenoproteomes Science. 2003 May 30,300(5624) 1439-14343.

22 Романова ЛГ. Новоселов СВ. Егоров ММ, Костина МБ, Шакшпаронов МИ Экспрессия H+,K-bATPase каталитической субъединици в эпидермисе крысы Биоорганическая химии 2002 JukAug;28(4)351-356

23 Korotkov KV, Novoselov SV. Hatfield DL, Gladyshev VN

Mammalian selenoprotein in which seknocysteine (Sec) incorporatrm is supported by a new form of Sec insertion sequence element Mol Cell Biol 2002 Mar,22(5) 1402-1411.

24 Gladyshev VN, Liu A, Novosebv SV. Krysan K, Sun QA, Kryukov VM, Kryukov GV, LouMF

Identification and characterization of a new mammalian glutaredoxin (thioltransferase), Grx2

J Biol Chem 2001 Aug 10;276(32).30374-30380

25. Новоселов ВИ, Амелина СЕ, Кравченко ИН, Новоселов СВ. Янин ВА, Садовников ВБ, ФесенкоЕЕ

Рольпероксиредоксинав антиоксидантной системе лепсих. Доклады да 2000 Jul-Dec,373-375 64-66.

26 Новоселов ВИ, Пешенко ИВ, Новосёлов СВ. Камзалов СС, Быстрова МФ, Евдокимов ВА, Николаев ЮВ, Фесенко ЕЕ.

Протекторная активность 28 кДа 1-дис пероюиредоксина определяется его пероксидазной активностью. Биофизика. 1999 44(3)568-570

27. Merkulova MI, Andreeva SG, Shuvaeva TM, Novosetov SV. Peshenko IV, Bystrova MF, Novosetov VI, Fesenko EE, Lipkin VM

A novel 45 kDa secretory protein from rat olfactory epithelium- primary structure and localisation.

FEBSLeU 1999,450(1-2).126-130

28. Андреева СГ, Меркулова МИ, Шуааева ТМ, Новоселов ВИ, Пецепко ИВ, Новоселов СВ, Фссенко ЕЕ Липкин ВМ

Структурные исследования секреторного 28 кДа из обонятельного эпителия крысы Биоорганическая химия 1998:24(П):816-821

29 Новоселов ВИ, Пешенко ИВ, Евдокимов ВА, Камзалов СС, Новоселов СВ, Николаев ЮВ, Быстрова МФ, Фесенко ЕЕ

Свойства каталитического центра секреторного 28 кЦа белка из обонятельного эпителия крысы

Биофизика 1998;43(4) 610-616. 30. Gladyshev VN and Novosetov SV

Compositions and Methods for the Expression of Selenoprotein m Eukaryotie Cells Заявка в Патентное бюро США -US Provisional Patent Application Serul No б 1/125,822 от 29 арпеля2008

31 Carlson BA, Xu ХМ, Shrimarh R, Sengupta A, Yoo MH, Zhong N, Hatfield DL Irom R, Davis CD, Lee BJ, Novosetov SV, Gladyshev VN. Mouse models for assessing the role ofselemum m health and development В сборнике: Selenum: Its Mofecular Biology and role in Human Health Springer, 2006. 333-343

Список сокращений:

АФА - активные формы азота АФК- активные формы кислорода EST-(expressed sequence tag) генетические транскрипты КАТ- каталаза

GFP-зеленый флуоресцентный белок

GPx - гпугатаон лероксидаза

GR - глутатион редуктаза

Grx -глутаредоксин

GSH - восстановленный глутатион

GSSG - окисленный глутатион

LADH - липоамид дегидрогеназами

NADPH -никотинамидадениндинуклеотид фосфат

Ргх - лероксиредоксин

RSH- восстановленный субстрат

RSSR - окисленный субстрат

Sec - селеноцистеин

TR-тиоредоксин редуктаза

Тгх -тиоредоксин

Подписано в печать 18 09 2008 г

Печать трафаретная

Заказ № 759 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (499) 788-78-56 аиЮгеГега1 ги

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Новосёлов, Сергей Владимирович

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Супероксиддисмутаза и каталаза

1.1. CuZnSOD

1.1.2. История открытия CuZnSOD и распространённость в биологических системах

1.1.3 Структура и каталитические характеристики CuZnSOD

1.2. Марганец содержащая SOD (SOD2)

1.2.1 Общая характеристика и локализация

1.2.2. Структура MnSOD

1.3 Экстрацеллюлярная форма SOD. (SOD3)

2.1. Каталаза

2.1.1. История открытия и структура

2.1.2. Внутриклеточная локализация каталаз эукариот

Глава 2. Системы тиоредоксина и глутаредоксина

2.1 Общая характеристика

2.2 Тиоредоксины и тиоредоксинредуктазы

2.3 Глутаредоксины, глутатионпероксидазы и трансферазы

2.3.1. Глутаредоксины

2.3.2. Глутатионпероксидазы

2.3 .3. Глутатион-Б-трансферазы

3. Пероксиредоксины

4. Селен-содержащие белки.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Белки, непосредственно вовлечённые в Тгх и Сгх системы 47 11. Тиоредоксинредуктазы

1 2. Идентификация нового глутаредоксина (тиолтрансферазы) млекопитающих (СЯх2)

1.3. ТиоредоксинГлутатионредуктазы(ТСЯ)

2. Новые селен-содержащие белки

2.1. Новый селен-содержащий белок Бе1М

2.2. Селенопротеом млекопитающих

2.3. Глутатионпероксидаза 6 (СРхб)

2.4. Селеновый белок V (8е1У)

2.5. Исследование селенового белка Н (БеШ)

2.6. Семейство ЯсЬс белков

2.6.1. Тканевая экспрессия ЯсЬс подобных белков млекопитающих

2.6.2. Внутриклеточная локализация 11(1x12 белков

2.6.3. Поиск белков-партнёров Яйх12 и БеШу млекопитающих

3. Исследования физиологической роли пищевого Селена у мышей

Введение Диссертация по биологии, на тему "Новые тиоловые оксидоредуктазы систем тиоредоксина и глутаредоксина. Их роль в регуляции окислительно-восстановительного баланса клетки"

В настоящее время у исследователей в области биологии и медицины имеется понимание важности окислительно-восстановительных процессов для жизнедеятельности организмов в норме, а также при патологиях. В последние десятилетия происходил очевидный прогресс в биомедицине, связанный с развитием биохимии и молекулярной биологии, с появлением принципиально новых подходов и технологий, а также с накоплением большого массива биологической информации, что привело еще к более ясному пониманию фундаментальной роли окислительно-восстановительных реакций в функционировании живых организмов [1, 2]. Известно, что существует очень широкий спектр биологических молекул с антиоксидантными свойствами, которые классифицированы по ряду признаков, в частности, по молекулярному весу (низко- и высокомолекулярные), по степени гидрофобности (липо- и водорастворимые) и т.д. При этом каждая из этих молекул имеет отличительные особенности, такие как специфичность субстрата, распределение на клеточном и тканевом уровне, регуляцию, зависимость от внешнего поступления и т.д. Кроме того, поскольку внутриклеточные окислительно-восстановительные системы функционируют одновременно, и при этом часто прямо или косвенно связаны через взаимную регуляцию, становится понятной необходимость изучения этих систем во всем многообразии их взаимодействий.

На молекулярном уровне биохимические реакции с вовлечением антиоксидантов, которые более целесообразно называть редокс-активными агентами, не ограничиваются простым удалением «вредных» свободных радикалов и/или их производных. Достаточно перечислить такие перспективные научные направления как апоптоз, трансляция РНК, регуляция клеточного цикла и т.д, в которых доказано прямое или косвенное участие редокс-агентов.

Из многообразия механизмов и биологических аспектов их действия становится понятной центральная роль редокс реакций, включающих мноц'численные каскады молекулярных превращений при целом ряде патологических состояний. По этой причине очевидна важность результатов фундаментальных исследований, посвященных роли антиоксидантов для практической медицины [3-5].

С позиций классической биохимии окислительно-восстановительные реакции проходят с участием кислорода, который в атмосфере присутствует в виде диатомной молекулы Ог- За исключением некоторых анаэробных и кислородо-устойчивых одноклеточных организмов, все животные, растения и бактерии нуждаются в кислороде для эффективной продукции энергии с использованием Ог-зависимых электронно-транспортных цепей. Однако это не противоречит тому, что кислород является токсичным и мутагенным газом, представляющим собой опасность для живых организмов, которые нуждаются в защите от избытка кислорода.

Принято считать, что первые примитивные бактерии, появившиеся на Земле, жили в условиях очень низкого содержания кислорода в атмосфере, и таким образом, были анаэробами. Анаэробные организмы до сих пор сохранились на планете, но их рост сильно замедлен, и они часто не выживают под воздействием действующей в настоящее время концентрации кислорода в атмосфере (21% Ог). При эволюционном процессе, по мере повышения концентрации кислорода в атмосфере, примитивные организмы либо вымерли, либо приспособились к изменяющимся условиям, и в настоящее время заселяют те биологические ниши, куда кислород не проникает Г6]. Однако в других организмах началось эволюционное развитие антиоксидантных защитных систем для борьбы с токсичными эффектами кислорода, и в ретроспективе это был очень продуктивный путь. Те бактерии, которые могли выживать в условиях высокой концентрации кислорода, начали использовать его в различных биохимических реакциях с участием оксидаз, оксигеназ и гидроксилаз, таких как тирозин-гидроксилазы или цитохром Р450, особенно для эффективной продукции энергии с использованием электронно-транспортных цепей, где кислород является конечным акцептором электронов. У современных эукариот этот процесс локализован преимущественно в митохондриях, производящих до 80% клеточного АТФ - универсального источника энергии для подавляющего числа биохимических процессов, протекающих в живых системах.

По мере эволюционного усложнения организации одноклеточных и появления многоклеточных организмов развивались ферментативные системы защиты от токсичных эффектов кислорода и продуктов его метаболизма, а также совершенствовались системы, использующие возможности его участия в метаболических процессах [6].

При рассмотрении конкретных ферментов, относящихся к системам редокс биологии, общий объём накопленных сведений по многим из них огромен, и по большому счёту число фактов выраженных, например, в количестве оригинальных научных публикаций фактически не поддаётся «абсолютному» анализу. Так, например, читатель, интересующийся каталазой, может найти более тридцати тысяч работ, так или иначе посвященных этому ферменту. Более шестнадцати тысяч источников посвящены ферменту супероксиддисмутазе. И это лишь два примера. По этой причине автор не ставит перед собой задачу представить всю информацию по этим белкам и не претендует на «полноту» и «абсолютность» обзора литературы - это заведомо невыполнимая задача. Вместо этого в первой части обзора была предпринята попытка на примере некоторых ферментов-антиоксидантов показать историю открытия и дальнейших работ по установлению их их свойств для иллюстрации общепринятого «алгоритма» и логики исследований в области редокс биологии. Для исследователей, интересующихся более подробным и полным обзором как общих, так и конкретных аспектов по данной теме на русском языке, автор рекомендует книгу, изданную в 2006, - «Окислительный стресс», написанную замечательным коллективом авторов: Е.Б. Меньщиковой, В.З. Панкиным, Н.К.Зеньковым, И.А. Бондарем, Н.Ф.Кругловых и В.А.Труфакиным, где не только подробно, но что очень важно - современно, с учётом последних открытий, охвачен практически весь спектр проблем по данной теме. Ссылка на этот труд представляется необходимой, поскольку, во-первых, поражает объём проделанной авторами работы, что делает по состоянию на современный момент (2008 год) любые литературные обзоры формата диссертаций в области редокс биологии лишь попыткой повтора отдельных её глав, и, во-вторых, что особенно необходимо подчеркнуть, в теме диссертации не отражены аспекты, относящиеся к биохимии низкомолекулярных редокс активных агентов, таких как витамин Е, коэнзим О, флавоноиды и т.д., которые, безусловно, играют очень важную роль.

Во второй части обзора будет более детально и систематизировано рассмотрена литература, относящаяся к тиоловым окидоредуктазам с тиоредоксин подобной укладкой (фолдом) - ферментам, имеющим непосредственное отношение к теме данной диссертации.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Новосёлов, Сергей Владимирович

выводы

1. На основании проведенного филогенетического анализа было установлено, что из существующих двух форм тиоредоксин редуктазы животных («большая» и «малая»), «большая» форма эволюционно образовалась на уровне низших эукариот значительно раньше, чем «малая» форма ТЯ была утеряна в организмах, от которых произошли животные. Обе эти формы сосуществовали в процессе эволюции. Мы идентифицировали организм (СЫатуйотопаь геНгагскГ), который содержит оба фермента. Среди высших эукариот «большая» форма стала преобладать у животных, тогда как «малая» сохранилась в растениях и грибах.

2. «Большая» форма тиоредоксинредуктазы произошла от глутатионредуктазы низших эукариот путём удлинения карбокситерминального конца белка с появлением консервативного Иу-БесСуз-Суз-Иу мотива в новом каталитическом окислительно-восстановительном центре, который функционально заменил глутатион в качестве промежуточного (транзиторного) субстрата для этого фермента.

3. Идентифицирован и охарактеризован новый митохондриальный глутаредоксин (Сгх2). вгх2 человека и мыши катализирует восстановление смешанных дисульфидных связей, сформированных между глутатионом и НЕБ Б, Б-сульфоцистеином или Ь-цистеином. На основании кинетических данных установлено, что вгх2 обладает наиболее высоким сродством по отношению к Ьцистеину, и это сродство было эквивалентно таковому для HEDS и S-сульфоцистеина.

4. Показано, что белок TR2 структурно является тиоредоксинглутатионредуктазой (TGR), при этом in vitro он обладает тиолтрансферазной, глутатион- и тиоредоксинредуктазной, а также протеин дисульфид изомеразной активностью. Функционально TGR представляет собой изомеразу, одним из субстратов которой выявлена глутатион пероксидаза 4 (Gpx4), и, следовательно, TGR вовлечена в образование митохондриальной капсулы сперматозоидов.

5. Идентифицирован и охарактеризован новый селен-содержащий белок SelM, имеющий новый тип SECIS элемента.

6. Компьютерный анализ генома человека показал, что селенопротеом состоит из 25 селен-содержащих белка, семь из которых ранее не были известны. Среди них охарактеризованы новая глутатион пероксидаза Gpx6, экспрессирующаяся в обонятельном эпителии на определённых стадиях эмбриогенеза, а также селен-содержащий белок SelV - белок сперматоцитов.

7. Установлено, что селен-содержащий белок SelH - новая тиоловая оксидоредуктаза ядрышек, имеющая необычный паттерн экспрессии.

8. Обнаружена новая тиоловая оксидоредуктаза эукариот, названная нами 11(1x12. На основании компьютерного анализа белок 1?.с1х12, селен-содержащий белок селен-содержащий белок БеГУ, селен-содержащий белок БеГГ и селен-содержащий белок БеШ были объединены в новое семейство тиоловых оксидоредуктаз с тиоредоксин-подобной укладкой. Это семейство было охарактеризовано и названо нами Ыс1х.

Список публикаций автора по теме диссертации

1. Novoselov SV. Lobanov AV, Hua D, Kasaikina MV, Hatfield DL, Gladyshev VN.

A highly efficient form of the selenocysteine insertion sequence element in protozoan parasites and its use in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci USA. 2007 May 8;104(19):7857-7862.

2. Novoselov SV. Kryukov GV, Xu XM, Carlson BA, Hatfield DL, Gladyshev VN. Selenoprotein H is a nucleolar thioredoxin-like protein with a unique expression pattern. J Biol Chem. 2007 Apr 20;282(16): 11960-11968.

3. Novoselov SV, Hua D, Lobanov AV, Gladyshev VN.

Identification and characterization of Fepl5, a new selenocysteine-containing member of the Sep 15 protein family.

Biochem J. 2006 Mar 15;394(Pt 3):575-579.

4. Novoselov SV, Calvisi DF, Labunskyy VM, Factor VM, Carlson BA, Fomenko DE, Moustafa ME, Hatfield DL, Gladyshev VN.

Selenoprotein deficiency and high levels of selenium compounds can effectively inhibit hepatocarcinogenesis in transgenic mice. Oncogene. 2005 Dec 1;24(54):8003-8011.

5. Novoselov SV, Gladyshev VN.

Non-animal origin of animal thioredoxin reductases: implications for selenocysteine evolution and evolution of protein function through carboxy-terminal extensions. Protein Sci. 2003 Feb;12(2):372-378.

6. Novoselov SV, Rao M, Onoshko NV, Zhi H, Kryukov GV, Xiang Y, Weeks DP, Hatfield DL, Gladyshev VN.

Selenoproteins and selenocysteine insertion system in the model plant cell system,

Chlamydomonas reinhardtii.

EMBOJ. 2002 Jul 15;21(14):3681-3693.

7. Novoselov SV, Peshenko IV, Popov VI, Novoselov VI, Bystrova MF, Evdokimov VA, Kamzalov SS, Merkulova MI, Shuvaeva TM, Lipkin VM, Fesenko EE.

Localization of 28-kDa peroxiredoxin in rat epithelial tissues and its antioxidant properties.

Cell Tissue Res. 1999 Dec;298(3):471-480.

8. Bonilla M, Denicola A, Novoselov SV, Turanov AA, Protasio A, Izmendi D, Gladyshev VN, Salinas G.

Platyhelminth mitochondrial and cytosolic redox homeostasis is controlled by a single thioredoxin glutathione reductase and dependent on selenium and glutathione. J Biol Chem. 2008 Jun 27;283(26): 17898-17907.

9. Sengupta A, Carlson BA, Weaver JA, Novoselov SV, Fomenko DE, Gladyshev VN, Hatfield DL.

A functional link between housekeeping selenoproteins and phase II enzymes. Biochem J. 2008 Jul 1;413(1):151-161.

10. Merchant SS, Prochnik SE, Vallon O, Harris EH, Karpowicz SJ, Witman GB, Terry A, Salamov A, Fritz-Laylin LK, Maréchal-Drouard L, Marshall WF, Qu LH, Nelson DR, Sanderfoot AA, Spalding MH, Kapitonov VV, Ren Q, Ferris P, Lindquist E, Shapiro H, Lucas SM, Grimwood J, Schmutz J, Cardol P, Cerutti H, Chanfreau G, Chen CL, Cognat V, Croft MT, Dent R, Dutcher S, Fernández E, Fukuzawa H, González-Ballester D, González-Halphen D, Hallmann A, Hanikenne M, Hippler M, Inwood W, Jabbari K, Kalanon M, Kuras R, Lefebvre PA, Lemaire SD, Lobanov AV, Lohr M, Manuell A, Meier I, Mets L, Mittag M, Mittelmeier T, Moroney JV, Moseley J, Napoli C, Nedelcu AM, Niyogi K, Novoselov SV. Paulsen IT, Pazour G, Purton S, Ral JP, Riaño-Pachón DM, Riekhof W, Rymarquis L, Schroda M, Stern D, Urnen J, Willows R, Wilson N, Zimmer SL, Allmer J, Balk J, Bisova K, Chen CJ, Elias M, Gendler K, Hauser C, Lamb MR, Ledford H, Long JC, Minagawa J, Page MD, Pan J, Pootakham W, Roje S, Rose A, Stahlberg E, Terauchi AM, Yang P, Ball S, Bowler C, Dieckmann CL, Gladyshev VN, Green P, Jorgensen R, Mayfield S, Mueller-Roeber B, Rajamani S, Sayre RT, Brokstein P, Dubchak I, Goodstein D, Hornick L, Huang YW, Jhaveri J, Luo Y, Martínez D, Ngau WC, Otillar B, Poliakov A, Porter A, Szajkowski L, Werner G, Zhou K, Grigoriev IV, Rokhsar DS, Grossman AR. r\

The Chlamydomonas genome reveals the evolution of key animal and plant functions. Science. 2007 Oct 12;318(5848):245-250.

11. Shchedrina VA, Novoselov SV, Malinouski MY, Gladyshev VN.

Identification and characterization of a selenoprotein family containing a diselenide bond in a redox motif.

Proc Natl Acad Sci USA. 2007 Aug 28; 104(35): 13919-13924.

12. Dikiy A, Novoselov SV, Fomenko DE, Sengupta A, Carlson BA, Cerny RL, Ginalski K, Grishin NV, Hatfield DL, Gladyshev VN.

SelT, SelW, SelH, and Rdxl2: genomics and molecular insights into the functions of selenoproteins of a novel thioredoxin-like family. Biochemistry. 2007 Jun 12;46(23):6871-6882.

13. Shrimali RK, Weaver JA, Miller GF, Starost MF, Carlson BA, Novoselov SV, Kumaraswamy E, Gladyshev VN, Hatfield DL.

Selenoprotein expression is essential in endothelial cell development and cardiac muscle function.

Neuromuscul Disord. 2007 Feb;17(2): 135-142.

14. Lobanov AV, Delgado C, Rahlfs S, Novoselov SV, Kryukov GV, Gromer S, Hatfield DL, Becker K, Gladyshev VN.

The Plasmodium selenoproteome.

Nucleic Acids Res. 2006 Jan 20;34(2):496-505.

15. Sun QA, Su D, Novoselov SV, Carlson BA, Hatfield DL, Gladyshev VN. Reaction mechanism and regulation of mammalian thioredoxin/glutathione reductase. Biochemistry. 2005 Nov 8;44(44): 14528-14537.

16. Castellano S, Lobanov AV, Chappie C, Novoselov SV, Albrecht M, Hua D, Lescure A, Lengauer T, Krol A, Gladyshev VN, Guigó R.

Diversity and functional plasticity of eukaryotic selenoproteins: identification and characterization of the SelJ family.

Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Nov 8;102(45):16188-16193.

17. Su D, Novoselov SV. Sun QA, Moustafa ME, Zhou Y, Oko R, Hatfield DL, Gladyshev VN.

Mammalian selenoprotein thioredoxin-glutathione reductase. Roles in disulfide bond formation and sperm maturation. J Biol Chem. 2005 Jul 15;280(28):26491-26498.

18. Castellano S, Novoselov SV, Kryukov GV, Lescure A, Blanco E, Krol A, Gladyshev VN, Guigó R.

Reconsidering the evolution of eukaryotic selenoproteins: a novel nonmammalian family with scattered phylogenetic distribution. EMBO Rep. 2004 Jan;5(l):71-77.

19. Carlson В A, Novoselov SV, Kumaraswamy E, Lee В J, Anver MR, Gladyshev VN, Hatfield DL.

Specific excision of the selenocysteine tRNA[Ser]Sec (Trsp) gene in mouse liver demonstrates an essential role of selenoproteins in liver function. J Biol Chem. 2004 Feb 27;279(9):8011-8017.

20. Rao M, Carlson BA, Novoselov SV. Weeks DP, Gladyshev VN, Hatfield DL. Chlamydomonas reinhardtii selenocysteine tRNA[Ser]Sec.

RNA. 2003 Aug;9(8):923-930.

21. Kryukov GV, Castellano S, Novoselov SV. Lobanov AV, Zehtab O, Guigo R, Gladyshev VN.

Characterization of mammalian selenoproteomes. Science. 2003 May 30;300(5624): 1439-14343.

22. Романова JIT, Новосёлов СВ. Егоров MM, Костина МБ, Шакшпаронов МИ. Экспрессия H+,K+-ATPase каталитической субъединици в эпидермисе крысы. Биоорганическая химия. 2002 Jul-Aug;28(4):351-356.

23. Korotkov KV, Novoselov SV, Hatfield DL, Gladyshev VN.

Mammalian selenoprotein in which selenocysteine (Sec) incorporation is supported by a new form of Sec insertion sequence element. Mol Cell Biol. 2002 Mar;22(5): 1402-1411.

24. Gladyshev VN, Liu A, Novoselov SV, Krysan K, Sun QA, Kryukov VM, Kryukov GV, Lou MF.

Identification and characterization of a new mammalian glutaredoxin (thioltransferase), Grx2.

J Biol Chem. 2001 Aug 10;276(32):30374-30380.

25. Новосёлов ВИ, Амелина СЕ, Кравченко ИН, Новосёлов СВ, Янин В А, Садовников ВБ, Фесенко ЕЕ.

Роль пероксиредоксина в антиоксидантной системе лёгких. Доклады АН. 2000 Jul-Dec;373-375:64-66.

26. Новосёлов ВИ, Пешенко ИВ, Новосёлов СВ, Камзалов СС, Быстрова МФ, Евдокимов ВА, Николаев ЮВ, Фесенко ЕЕ.

Протекторная активность 28 кДа 1-цис пероксиредоксина определяется его пероксидазной активностью. Биофизика. 1999. 44(3):568-570.

27. Merkulova MI, Andreeva SG, Shuvaeva TM, Novoselov SV, Peshenko IV, Bystrova MF, Novoselov VI, Fesenko EE, Lipkin VM.

A novel 45 kDa secretory protein from rat olfactory epithelium: primary structure and localisation.

FEBSLett. 1999;450(l-2): 126-130.

28. Андреева СГ, Меркулова МИ, Шуваева ТМ, Новосёлов ВИ, Пешенко ИВ, Новосёлов СВ, Фесенко ЕЕ, Липкин ВМ.

Структурные исследования секреторного 28 кДа из обонятельного эпителия крысы. Биоорганическая химия. 1998;24(11):816-821.

29. Новосёлов ВИ, Пешенко ИВ, Евдокимов ВА, Камзалов СС, Новосёлов СВ, Николаев ЮВ, Быстрова МФ, Фесенко ЕЕ.

Свойства каталитического центра секреторного 28 кДа белка из обонятельного эпителия крысы.

Биофизика. 1998;43(4):610-616.

30. Gladyshev VN and Novoselov SV

Compositions and Methods for the Expression of Selenoprotein in Eukaryotic Cells. Заявка в Патентное бюро США - U.S. Provisional Patent Application Serial No. 6 1/125,822 от 29 арпеля 2008

31. Carlson В A, Xu XM, Shrimarli R, Sengupta A, Yoo MH, Zhong N, Hatfield DL, Irons R, Davis CD, Lee BJ, Novoselov SV. Gladyshev VN.

Mouse models for assessing the role of selenium in health and development. В сборнике: Selenium: Its Molecular Biology and role in Human Health. Springer, 2006. 333-343.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Свободнорадикальные процессы в биологических системах привлекают внимание исследователей на протяжении более ста лет, за этот период накоплено огромное количество фактического материала по этой проблеме. Более того, в последние 5-7 лет, в течение которых был расшифрован геном человека и других организмов, т.е. в «постгеномную эру», стало понятно, что стандартные биохимические и молекулярные подходы и методы, разработанные и многократно апробированные в исследованиях «классических» антиоксидантных белков, применённые к новым, ранее неизвестным генам, число которых в геноме человека исчисляется многими сотнями, значительно ускорит появление новых открытий. В конечном итоге это может привести к качественным изменениям в современных представлениях о роли свободных радикалов во многих, если не во всех областях биомедицины. Вместе с тем всё ускоряющееся накопление биологической информации требует принципиально новой философии в подходах к методам её обработки и анализа, что также ставит перед исследователем сложную задачу выбора приоритетов среди огромного числа возможных направлений исследований. Иными словами, на практике в условиях одной конретной лаборатори едва ли возможно экспериментально охарактеризовать сразу «все» неизвестные ранее, но анотированные в геноме как «предположительные» (putative) представители белковых семейств или даже суперсемейств, к которым, в частности, относятся и тиоловые оксидоредуктазы с тиоредоксин подобной укладкой систем тиоредоксина и глутаредоксина. Таким образом, необходим компромисс между научным любопытством, новыми идеями, экспериментальным опытом, с одной стороны, и ограниченностью в ресурсах и времени, с другой стороны. Мы обратили внимание на наиболее важные, на наш взгляд, белки суперсемейства тиоловых оксидоредуктаз, большинство из которых является селеновыми белками. При этом мы руководствовались следующими соображениями: 1) если белок содержит селеноцистеин, энергетически «дорогую» и эволюционно консервативную молекулу - то весьма вероятно, что его функция критична для выживания конкретного вида животных; 2) сам по себе поиск в геномах селенсодержащих белков - сложная задача, требующая особых подходов в силу нестандартности кодирования селеноцистеина ТвА кодоном. Последнее обстоятельство делает невозможным использование обычных компьютерных программ по автоматическому аннотированию, которые читают этот кодон как сигнал терминации трансляции. В случае успеха при таком подходе появляется возможность проведения коррекции в аннотации конкретного генома и, таким образом, можно внести важный вклад в решение фундаментальной проблемы, связанной с расшифровкой роли ферментов-антиоксидантов; 3) открытие новых селенсодержащих белков и изучение их свойств может принести достаточно быстрый и значительный практический вклад в биомедицину, так как селен, а следовательно, и селенсодержащие белки, обладают широким спектром фармакологических свойств, но при этом механизмы их действия во многом остаются неизвестными; 4) приобретённый практический опыт параллельной работы с десятью и более белками в лаборатории (высокопродуктивный подход) может быть применён в других проектах, направленных на изучение множества неизвестных генов одновременно, что в постгеномную эру становится особенно актуальным.

Руководствуясь этой логикой и поставленными конкретными задачами, мы провели большую работу, основные достижения и успехи которой отражены в главе «Результаты и обсуждение» и в статьях, опубликованных по теме данной диссертации. Можно перечислить основные достижения, полученные при выполнении работы:

- Был предложен простой механизм эволюции белков путём удлинения С-концевого участка, приводящего к «улучшению» или модификации функции белковой молекулы или даже появления у неё новых свойств.

- Был открыт и охарактеризован недостающий компонент системы глутаредоксина в митохондриях.

- Была охарактеризована недавно обнаруженная тиоредоксин глутаредоксин редуктаза млекопитающих (ТвЫ) - фермент, в котором функциональные субъединицы двух разных систем (тиоредоксина и глутаредоксина) объединены в одном белке. Мы обнаружили у этого белка весь спектр активностей, присущих представителям обеих систем, наличие которых объяснялось необычной доменной организацией ТвК. Сопоставляя и анализируя полученные данные иммуногистохимического анализа, профайл белков-партнёров, идентифицированных масспектрометрически, регуляцию экспрессии ТОЙ и других селеносодержащих белков в зависимости от возраста животного, селена в диете и генетически детерминированого селеленодефицита, мы предположили наличие неизвестных ранее функций у ТОК, а именно изомеризацию другого селенового белка вРх4 (РНСРх), который в тестикулах на ранних этапах сперматогенеза играет обычную для себя роль защиты биологических мембран, но по мере созревания сперматозоидов начинает претерпевать структурные изменения, приводящие к его полимеризации вокруг митохондрий, что ведёт к формированию капсулы сперматозоида. Мы обнаружили изомеризационную активность TGR по отношению к GPx4 и сделали вывод о том, что, скорее всего, большинство биохимических активностей этого фермента in vitro не являются физиологически значимыми, in vivo TGR является изомеразой GPx4, а его биологическая роль - это участие в сперматогенезе посредством катализируемой реакции изомеризации GPx4.

- Разработали очень чувствительный и специфичный биоинформационный метод поиска TGA кодонов, ответственных за встраивание селеноцистеина в полипетидные цепи, и проанализировав геном человека этим методом, мы нашли десять новых селенсодержащих белков, доказав, таким образом, что селенопротеом человека состоит из двадцати пяти селенопротеинов. С момента открытия первого представителя этой группы элитных белков в середине семидесятых годов прошлого века - классической или цитоплазматической глутатион пероксидазы (GPxl млекопитающих - по современной классификации), прошло более тридцати лет интенсивных исследований многих лабораторий. При этом до сих пор во всем мире было найдено всего пятнадцать селенсодержащих белков. Нам удалось практически удвоить этот список, что доказывает высокую эффективность применения компьютерных технологий в редокс биологии.

-С применением новейших приемов молекулярной биологии и биохимии был достигнут значительный прогресс при выяснении свойств восьми из ряда новых селенсодержащих белков. Особенно значительные результаты были получены при изучении БеШ, 8е1Т, 8е1У, 8е1\\^ и ранее неизвестного Кс1х12, родственного им цистеинового гомолога. На основании биоинформационного анализа эти белки были объединены в новое семейство тиоловых оксидоредуктаз с тиоредоксин подобной укладкой (фолдом), названное нами Кс1х белками. Необходимо заметить, что впоследствии компьютерные данные, на основании которых это было сделано, подтвердились структурными исследованиями белка 8е1\У человека.

- Был проведен детальный анализ свойств белков 8е1Н, 8е1Т, 8е1У и К(1х12, что позволило доказать их дифференциальную экспрессию на клеточном и тканевом уровнях, на разных стадиях эмбриогенеза и в различных клеточных линиях, как на основе мониторинга матричной РНК, так и по измерению продукции белка. Кроме того, был проведен поиск возможных белков-партнёров для 8е1Н, 8е1\У и Ис1х12. Полученные в этих экспериментах данные, оформленные ввиде двух статей и опубликованные в престижных международных журналах, станут отправной точкой для дальнейшей работы по выяснению билогической роли представителей семейства 11с1х, что поможет выяснить механизмы влияния селена на здоровье человека.

- Предварительные данные по другим новым селенсодержащим белкам человека также являются основой для дальнейших исследований, имеющих, по нашему мнению, очень хорошие перспективы.

- Не отраженные в тексте диссертации работы автора по изучению селенопротеомов ряда простейших - паразитов, насекомых и рыб перечислены в списке литературы. Помимо ожидаемых, но, тем не менее, новых данных по тиоловым оксидоредуктазам тиоредоксин подобного фолда, в частности их роли в эволюции, было обнаружено два новых организм-специфичных (встречающихся только в определённом виде и не имеющих эволюционой консервативности) селен-содержащих белка. На этом основании был сделан вывод о пластичности селенопротеомов и значительной чувствительности этих генов к эволюционному давлению. Так, самым представительным из известных к настоящему моменту селенопротеомов обладают рыбы Damio rerio, содержащие как минмиум 34 таких белка, что может объясняться доступностью селена, как предшественника биосинтеза селеноцистеина для рыб в воде. И, напротив, животные, населяющие сушу, где, как правило, селен не так распространен, имеют тенденцию редуцировать количество генов, кодирующих эти молекулы. При этом млекопитающие являются исключением, что подчёркивает значение селена для человека и необходимость как можно более полного анализа всех селенсодержащих белков.

- В тексте диссертации не отражены результаты исследований по генетике и геномике Chlamidomonas reidhardtii, включая полученные в составе международного консорциума по расшифровке генома этого популярного для исследований организма. Эти результаты содержатся в четырёх публикациях, приведённых в списке публикаций. Автор сознательно не включил эту информацию в текст диссертации, чтобы не нарушать логики описания и не усложнять читателю восприятие ключевых фактов и выводов, отвлекая его внимание на частности. Главным же достижением анализа EST и генома Chlamidomonas reidhardtii стало открытие факта присутствия селеновых белков в этом организме, что было сделано прямыми методами MOLDI анализа, метаболического мечения с радиоактивным изотопом Se75 и биоинформационного поиска. Открытие присутствия селенопротеинов и системы его биосинтеза у Chlamidomonas reidhardtii, относящейся к царству растений, которые, как считалось, не имеют таких редокс молекул, продемонстрировало, что селенсодержащие белки встречаются у представителей всех царств живых организмов без исключения. Анализ гомологии отдельных компонентов системы биосинтеза и встраивания Sec показал её консервативность и указал на существование общих предшественников для всех эукариот.

- Наконец, результаты ряда проектов по изучению влияния селена в диетах на целый организм мышей с модифицированными генетическими параметрами, в частности, на процессы канцерогенеза у трансгенных животных. Это мыши, активно экспрессирующие онкогены TGF-alfa и с-тус, что приводит к спонтанному возникновению аденокарцином печени у 100% животных к концу пятого месяца жизни. Вопреки ожиданиям, в данной модели добавка селена в терапевтической дозе приводила к ухудшению состояния животных, ускорению процессов малигнизации по сравнению как с контрольной, так и селенодефицитной группами мышей. Поскольку этот эффект был противоположен тому, что наблюдался в этой модели при использовании Витамина Е, который, как и селен, считается редокс активным антираковым агентом, рекомендованным к регулярному применению в виде биологически активной добавки. Для объяснения этого несоответствия мы провели дифференциальный анализ экспрессии всех генов печени в зависимости от типа селеновой диеты методом генетических чипов, и обнаружили, что как при экстремальном селенодефиците, так и при приеме субтоксических доз селена, очень схожий набор из 150-200 генов регулируется одинаково (большинство из них были глутатион трансферазами (GST) и цитохромом С (CYP450). Таким образом, и селенодефицит, и сильный избыток селена может приводить к активации похожих путей детоксикации, которые приводили к подавлению роста карциномы. Напротив, при нормальном содержании селена в диете, а также при использовании его терапевтических доз, аденомы и аденокарценомы развивались со скоростью, обычной для этих животных, характеризующихся сверхпродукцией одновременно двух онкогенов.

Таким образом, были использованы самые разнообразные подходы, модельные системы и объекты для исследований тиоловых оксидоредуктаз с тиоредоксин подобной укладкой, при этом был сделан акцент на те из них, которые с высокой долей вероятности обладают высокой активностью и физиологической значимостью.

Кроме упомянутых важных результатов настоящего исследования, необходимо отметить следующие выводы, сделанные автором при систематизировании всех данных и их анализе в контексте глобального значения окислительно-восстановительных реакций, протекающих в живых организмах:

Во-первых, опыт и прибретённые знания, полученные во время данной работы с различными тиоловыми оксидоредуктазами, сделал для нас очевидным то, что при изучении какого либо процесса с вовлечением этих белков (например, клеточный стресс различного генеза или влияние диет на целый организм) необходимо проводить одновременный мониторинг как можно большего числа редокс компонентов. Это связано с тем, что эти молекулы часто взаиморегулируются, или взаимокомпенсируются, или при сочетанном однонаправленном действии может возникать кумулятивный эффект и, соответственно, фенотипические последствия таких сочетанных реакций имеют совершенно неожиданные и парадоксальные последствия.

Во-вторых, систематика и классификация белков-антиоксидантов с учетом распространённости и многобразия тиоловых оксидоредуктаз, по нашему мнению, требует серьезных уточнений. Так, например, часто встречаемое в обзорах и монографиях простое перечисление ферментов-антиоксидантов виде: «каталазы, супероксид дисмутазы, тиоредоксины, глутатион пероксидазы, пероксиредоксины и др.» не отражает современных представлений о ферментативных окислительно-восстановительных системах, и более того привносит много разночтений и несоответствий. Поскольку тиоредоксины, глутатионпероксидазы и пероксиредоксины являются структурно-, биохимически- и функционально родственными ферментами, принимающими участие в процессах редокс регуляции и сигнализации, все тиоловые оксидоредуктазы с тиоредоксиновой укладкой должны быть объединены в одно суперсемейство. Принимая во внимание полученные в настоящей работе результаты, полагаем, что классификация редокс белков должна выглядеть следующим образом: «каталазы, супероксиддисмутазы, суперсемейство тиоловых оксидоредуктаз с тиоредоксин подобной структурой», и дальнейшую систематику конкретных семейств (тиоредоксины, глутаредоксины, глутатионпероксидазы и т.д.) следует проводить внутри суперсемейства тиоловых оксидоредуктаз с тиоредоксин подобной структурой.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Новосёлов, Сергей Владимирович, Пущино

1. Владимиров, Ю.А., Арчаков, А.И., Перекиспое окисление липидов в биологических мембранах. 1972. 252.

2. Меньшикова, Е.Б., Ланкин, В.З., Зенков, Н.К., Бондарь, И.А., Круговых, Н.Ф., Труфакин, В.А., Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. 2006, Москва: Слово. 553.

3. Ланкин, В.З., Перекиси липидов и атеросклероз. Гипотеза: роль холестерина и свободнорадикального перекисного окисления липидов в изменении свойств клеточных мембран при гиперхолестеринемии и атеросклерозе. Кардиология, 1980. 20(8): р. 42-48.

4. Ланкин, В.З., Тихазе, А.К., Котелевцева, Н.В., Перекиси липидов и атеросклероз. . Кардиология, 1976. 16(2): р. 58-60.

5. Ярема, Н.И., Коновалова, Г.Г., Ланкин, В.З., Изменение активности антиоксидантных ферментов у больных гипертонической болезнью. Кардиология, 1992. 32(3): р. 46-48.

6. Скулачев, В.П., О биохимических механизмах эволюции и роли кислорода. . Биохимия, 1998. 63(11): р. 23-30.

7. Fridovich, I., Superoxide dismutases. An adaptation to a paramagnetic gas. J Biol Chem, 1989. 264(14): p. 7761-4.

8. Porter, H., M. Sweeney, and E.M. Porter, Human Hepatocuprein. Isolation of a Copper Protein from the Subcellular Soluble Fraction of Adult Human Liver. Arch Biochem Biophys, 1964.105: p. 319-25.

9. Porter, H. and J. Folch, Cerebrocuprein I. A copper-containing protein isolated from brain. J Neurochem, 1957.1(3): p. 260-71.

10. McCord, J.M. and I. Fridovich, Superoxide dismutase. An enzymic function for erythrocuprein (hemocuprein). J Biol Chem, 1969. 244(22): p. 6049-55.

11. Liochev, S.I. and I. Fridovich, The effects of superoxide dismutase on H202 formation. Free Radic Biol Med, 2007. 42(10): p. 1465-9.

12. Zelko, I.N., T.J. Mariani, and R.J. Folz, Superoxide dismutase multigene family: a comparison of the CuZn-SOD (SODJ), Mn-SOD (SOD2), and EC-SOD (SOD3) gene structures, evolution, and expression. Free Radic Biol Med, 2002. 33(3): p. 337-49.

13. Fridovich, I., Superoxide radical and superoxide dismutases. Annu Rev Biochem, 1995.64: p. 97-112.

14. Wanders, R.J. and S. Denis, Identification of superoxide dismutase in rat liver peroxisomes. Biochim Biophys Acta, 1992. 1115(3): p. 259-62.

15. O'Neill, P., et al., The effects ofpH and various salts upon the activity of a series of superoxide dismutases. Biochem J, 1988. 251(1): p. 41-6.

16. Hough, M.A. and S.S. Hasnain, Structure of fully reduced bovine copper zinc superoxide dismutase at 1.15 A. Structure, 2003.11(8): p. 937-46.

17. Tainer, J.A., V.A. Roberts, and E.D. Getzoff, Protein metal-binding sites. Curr Opin Biotechnol, 1992. 3(4): p. 378-87.

18. Zanma, A., Y. Matsumoto, and Y. Masuho, Conjugates of superoxide dismutase with the Fc fragment of immunoglobulin G. J Biochem, 1991.110(6): p. 868-72.

19. Marklund, S.L., Human copper-containing superoxide dismutase of high molecular weight. Proc Natl Acad Sci USA, 1982. 79(24): p. 7634-8.

20. Marklund, S.L., Expression of extracellular superoxide dismutase by human cell lines. Biochem J, 1990. 266(1): p. 213-9.

21. Hassan, H.M. and L.W. Schrum, Roles of manganese and iron in the regulation of the biosynthesis of manganese-superoxide dismutase in Escherichia coll. FEMS Microbiol Rev, 1994.14(4): p. 315-23.

22. Alscher, R.G., N. Erturk, and L.S. Heath, Role of superoxide dismutases (SODs) in controlling oxidative stress in plants. J Exp Bot, 2002. 53(372): p. 1331-41.

23. Schmidt, M., et al., Solution Structure of a Functional Biomimetic and Mechanistic Implications for Nickel Superoxide Dismutases. Chembiochem, 2008. 9(13): p. 2135-2146.

24. Bonomini, F., et al., Atherosclerosis and oxidative stress. Histol Histopathol, 2008. 23(3): p. 381-90.

25. Paravicini, T.M., G.R. Drummond, and C.G. Sobey, Reactive oxygen species in the cerebral circulation: physiological roles and therapeutic implications for hypertension and stroke. Drugs, 2004. 64(19): p. 2143-57.

26. Noor, R., S. Mittal, and J. Iqbal, Superoxide dismutase—applications and relevance to human diseases. Med Sci Monit, 2002. 8(9): p. RA210-5.

27. Maier, C.M. and P.H. Chan, Role of superoxide dismutases in oxidative damage and neurodegenerative disorders. Neuroscientist, 2002. 8(4): p. 323-34.

28. Ланкин B.3., В.Д.Б., Тихазе A.K., Косых В.А., Помойнецкий В.Д., Вихерт A.M., Влияние гипероксии на активность супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы в тканях мышей. Докл. АН СССР, 1981. 259(1): р. 229-231.

29. Schroeder, W.A., et al., The amino acid sequence of bovine liver catalase: a preliminary report. Arch Biochem Biophys, 1969. 131(2): p. 653-5.

30. Murthy, M.R., et al., Structure of beef liver catalase. J Mol Biol, 1981. 152(2): p. 465-99.

31. Reid, T.J., 3rd, et al., Structure and heme environment of beef liver catalase at 2.5 A resolution. Proc Natl Acad Sci USA, 1981. 78(8): p. 4767-71.

32. Chance, В., H. Sies, and A. Boveris, Hydroperoxide metabolism in mammalian organs. Physiol Rev, 1979. 59(3): p. 527-605.

33. Mates, J.M., et al., Intracellular redox status and oxidative stress: implications for cell proliferation, apoptosis, and carcinogenesis. Arch Toxicol, 2008. 82(5): p. 273-99.

34. Holmgren, A., Thioredoxin and glutaredoxin systems. J Biol Chem, 1989. 264(24): p. 13963-6.

35. Berndt, C., C.H. Lillig, and A. Holmgren, Thioredoxins and glutaredoxins as facilitators of protein folding. Biochim Biophys Acta, 2008.1783(4): p. 641-50.

36. Meister, A., Glutathione-ascorbic acid antioxidant system in animals. J Biol Chem, 1994. 269(13): p. 9397-400.

37. Meister, A., Glutathione, ascorbate, and cellular protection. Cancer Res, 1994. 54(7 Suppl): p. 1969s-1975s.

38. Meyer, A. J., The integration of glutathione homeostasis and redox signaling. J Plant Physiol, 2008. 165(13): p. 1390-403.

39. Rouhier, N., E. Gelhaye, and J.P. Jacquot, Plant glutaredoxins: still mysterious reducing systems. Cell Mol Life Sci, 2004. 61(11): p. 1266-77.

40. Sengupta, A., et al., A functional link between housekeeping selenoproteins and phase II enzymes. Biochem J, 2008. 413(1): p. 151-61.

41. Linke, K. and U. Jakob, Not every disulfide lasts forever: disulfide bond formation as a redox switch. Antioxid Redox Signal, 2003. 5(4): p. 425-34.

42. Azevedo, D., et al., Two redox centers within Yapl for H202 and thiol-reactive chemicals signaling. Free Radic Biol Med, 2003. 35(8): p. 889-900.

43. Delaunay, A., et al., A thiol peroxidase is an H202 receptor and redox-transducer in gene activation. Cell, 2002. 111(4): p. 471-81.

44. Veal, E.A., et al., A 2-Cys peroxiredoxin regulates peroxide-induced oxidation and activation of a stress-activated MAP kinase. Mol Cell, 2004. 15(1): p. 12939.

45. Juarez, J.C., et al., Superoxide dismutase 1 (SOD1) is essential for H202-mediated oxidation and inactivation of phosphatases in growth factor signaling. Proc Natl Acad Sci USA, 2008.105(20): p. 7147-52.

46. Salmeen, A., et al., Redox regulation of protein tyrosine phosphatase IB involves a sulphenyl-amide intermediate. Nature, 2003. 423(6941): p. 769-73.

47. Ilbert, M., et al., The redox-switch domain of Hsp33 functions as dual stress sensor. Nat Struct Mol Biol, 2007.14(6): p. 556-63.

48. Jakob, U., M. Eser, and J.C. Bardwell, Redox switch of hsp33 has a novel zinc-binding motif. J Biol Chem, 2000. 275(49): p. 38302-10.

49. Dalle-Donne, I., et al., S-glutathionylation in protein redox regulation. Free Radic Biol Med, 2007. 43(6): p. 883-98.

50. Dalle-Donne, I., et al., Molecular mechanisms and potential clinical significance of S-glutathionylation. Antioxid Redox Signal, 2008.10(3): p. 445-73.

51. Sun, J., C. Steenbergen, and E. Murphy, S-nitrosylation: NO-related redox signaling to protect against oxidative stress. Antioxid Redox Signal, 2006. 8(9-10): p. 1693-705.

52. Krezel, A., Q. Hao, and W. Maret, The zinc/thiolate redox biochemistry of metallothionein and the control of zinc ion fluctuations in cell signaling. Arch Biochem Biophys, 2007. 463(2): p. 188-200.

53. Kim, J.W. and C.V. Dang, Multifaceted roles of glycolytic enzymes. Trends Biochem Sci, 2005. 30(3): p. 142-50.

54. Zavasnik-Bergant, T. and B. Turk, Cysteine proteases: destruction ability versus immunomodulation capacity in immune cells. Biol Chem, 2007. 388(11): p. 11419.

55. Zhang, F.L. and P.J. Casey, Protein prenylation: molecular mechanisms and functional consequences. Annu Rev Biochem, 1996. 65: p. 241-69.

56. Martin, J.L., Thioredoxin--a fold for all reasons. Structure, 1995. 3(3): p. 245-50.

57. Engstrom, N.E., et al., Isolation and characterization of calf liver thioredoxin. J Biol Chem, 1974. 249(1): p. 205-10.

58. Holmgren, A., Bovine thioredoxin system. Purification of thioredoxin reductase from calf liver and thymus and studies of its function in disulfide reduction. J Biol Chem, 1977. 252(13): p. 4600-6.

59. Holmgren, A., The function of thioredoxin and glutathione in deoxyribonucleic acid synthesis. Biochem Soc Trans, 1977. 5(3): p. 611-2.

60. Holmgren, A., B.B. Buchanan, and R.A. Wolosiuk, Photosynthetic regulatory protein from rabbit liver is identical with thioredoxin. FEBS Lett, 1977. 82(2): p. 351-4.

61. Luthman, M. and A. Holmgren, Rat liver thioredoxin and thioredoxin reductase: purification and characterization. Biochemistry, 1982. 21(26): p. 6628-33.

62. Moutevelis, E. and J. Warwicker, Prediction of pKa and redox properties in the thioredoxin superfamily. Protein Sci, 2004.13(10): p. 2744-52.

63. Powis, G. and W.R. Montfort, Properties and biological activities of thioredoxins. Annu Rev Biophys Biomol Struct, 2001. 30: p. 421-55.

64. Arner, E.S. and A. Holmgren, The thioredoxin system in cancer. Semin Cancer Biol, 2006.16(6): p. 420-6.

65. Holmgren, A., Thioredoxin. Annu Rev Biochem, 1985. 54: p. 237-71.

66. Das, K.C., c-Jun NH2-terminal kinase-mediated redox-dependent degradation of IkappaB: role of thioredoxin in NF-kappaB activation. J Biol Chem, 2001. 276(7): p. 4662-70.

67. Kabe, Y., et al., Redox regulation of NF-kappaB activation: distinct redox regulation between the cytoplasm and the nucleus. Antioxid Redox Signal, 2005. 7(3-4): p. 395-403.

68. Sen, C.K., Cellular thiols and redox-regulated signal transduction. Curr Top Cell Regul, 2000. 36: p. 1-30.

69. Arrigo, A.P., Gene expression and the thiol redox state. Free Radic Biol Med, 1999. 27(9-10): p. 936-44.

70. McEligot, A.J., S. Yang, and F.L. Meyskens, Jr., Redox regulation by intrinsic species and extrinsic nutrients in normal and cancer cells. Annu Rev Nutr, 2005. 25: p. 261-95.

71. Hainaut, P. and K. Mann, Zinc binding and redox control of p53 structure and function. Antioxid Redox Signal, 2001. 3(4): p. 611-23.

72. Williams, C.H., et al., Thioredoxin reductase two modes of catalysis have evolved. Eur J Biochem, 2000. 267(20): p. 6110-7.

73. Lundstrom, J. and A. Holmgren, Protein disulfide-isomerase is a substrate for thioredoxin reductase and has thioredoxin-like activity. J Biol Chem, 1990. 265(16): p. 9114-20.

74. Kumar, S., M. Bjornstedt, and A. Holmgren, Selenite is a substrate for calf thymus thioredoxin reductase and thioredoxin and elicits a large non-stoichiometric oxidation of NADPH in the presence of oxygen. Eur J Biochem, 1992. 207(2): p. 435-39.

75. Bjornstedt, M., et al., Selenium and the thioredoxin and glutaredoxin systems. Biomed Environ Sci, 1997.10(2-3): p. 271-9.

76. Bjornstedt, M., S. Kumar, and A. Holmgren, Selenodiglutathione is a highly efficient oxidant of reduced thioredoxin and a substrate for mammalian thioredoxin reductase. J Biol Chem, 1992. 267(12): p. 8030-4.

77. Nikitovic, D. and A. Holmgren, S-nitrosoglutathione is cleaved by the thioredoxin system with liberation of glutathione and redox regulating nitric oxide. J Biol Chem, 1996. 271(32): p. 19180-5.

78. Bjornstedt, M., et al., The thioredoxin and glutaredoxin systems are efficient electron donors to human plasma glutathione peroxidase. J Biol Chem, 1994. 269(47): p. 29382-4.

79. Zhong, L. and A. Holmgren, Essential role of selenium in the catalytic activities of mammalian thioredoxin reductase revealed by characterization of recombinant enzymes with selenocysteine mutations. J Biol Chem, 2000. 275(24): p. 18121-8.

80. Bjornstedt, M., et al., Human thioredoxin reductase directly reduces lipid hydroperoxides by NADPH and selenocystine strongly stimulates the reaction via catalytically generated selenols. J Biol Chem, 1995. 270(20): p. 11761-4.

81. Holmgren, A. and C. Lyckeborg, Enzymatic reduction of alloxan by thioredoxin and NADPH-thioredoxin reductase. Proc Natl Acad Sci USA, 1980. 77(9): p. 5149-52.

82. Arner, E.S., J. Nordberg, and A. Holmgren, Efficient reduction of lipoamide and lipoic acid by mammalian thioredoxin reductase. Biochem Biophys Res Commun, 1996. 225(1): p. 268-74.

83. May, J.M., et al., Reduction of dehydroascorbate to ascorbate by the selenoenzyme thioredoxin reductase. J Biol Chem, 1997. 272(36): p. 22607-10.

84. Becker, K., et al., Thioredoxin reductase as a pathophysiological factor and drug target. Eur J Biochem, 2000. 267(20): p. 6118-25.

85. Moore, E.C., P. Reichard, and L. Thelander, Enzymatic Synthesis of Deoxyribonucleotides.V. Purification and Properties of Thioredoxin Reductase from Escherichia Coli B. J Biol Chem, 1964. 239: p. 3445-52.

86. Holmgren, A., Hydrogen donor system for Escherichia coli ribonucleoside-diphosphate reductase dependent upon glutathione. Proc Natl Acad Sci USA, 1976. 73(7): p. 2275-9.

87. Bushweller, J.H., et al., Structural and functional characterization of the mutant Escherichia coli glutaredoxin (C14—S) and its mixed disulfide with glutathione. Biochemistry, 1992. 31(38): p. 9288-93.

88. Holmgren, A. and F. Aslund, Glutaredoxin. Methods Enzymol, 1995. 252: p. 28392.

89. Holmgren, A., et al., Thiol redox control via thioredoxin and glutaredoxin systems. Biochem Soc Trans, 2005. 33(Pt 6): p. 1375-7.

90. Wells, W.W., et al., Mammalian thioltransferase (glutaredoxin) and protein disulfide isomerase have dehydroascorbate reductase activity. J Biol Chem, 1990. 265(26): p. 15361-4.

91. Bandyopadhyay, S., et al., Thioltransferase (glutaredoxin) reactivates the DNA-binding activity of oxidation-inactivated nuclear factor I. J Biol Chem, 1998. 273(1): p. 392-7.

92. Hirota, K., et al., Nucleoredoxin, glutaredoxin, and thioredoxin differentially regulate NF-kappaB, AP-1, and CREB activation in HEK293 cells. Biochem Biophys Res Commun, 2000. 274(1): p. 177-82.

93. Daily, D., et al., Glutaredoxin protects cerebellar granule neurons from dopamine-induced apoptosis by dual activation of the ras-phosphoinositide 3-kinase and jun n-terminal kinase pathways. J Biol Chem, 2001. 276(24): p. 21618-26.

94. Mills, G.C., Hemoglobin catabolism. I. Glutathione peroxidase, an erythrocyte enzyme which protects hemoglobin from oxidative breakdown. J Biol Chem, 1957. 229(1): p. 189-97.

95. Hafeman, D.G., R.A. Sunde, and W.G. Hoekstra, Effect of dietary selenium on erythrocyte and liver glutathione peroxidase in the rat. J Nutr, 1974. 104(5): p. 580-7.

96. Flohe, L., W.A. Gunzler, and H.H. Schock, Glutathione peroxidase: a selenoenzyme. FEBS Lett, 1973. 32(1): p. 132-4.

97. Epp, O., R. Ladenstein, and A. Wendel, The refined structure of the selenoenzyme glutathione peroxidase at 0.2-nm resolution. Eur J Biochem, 1983. 133(1): p. 5169.

98. Ren, B., et al., The crystal structure of seleno-glutathione peroxidase from human plasma at 2.9 A resolution. J Mol Biol, 1997. 268(5): p. 869-85.

99. Sevanian, A., S.F. Muakkassah-Kelly, and S. Montestruque, The influence of phospholipase A2 and glutathione peroxidase on the elimination of membrane lipid peroxides. Arch Biochem Biophys, 1983. 223(2): p. 441-52.

100. Grossmann, A. and A. Wendel, Non-reactivity of the selenoenzyme glutathione peroxidase with enzymatically hydroperoxidized phospholipids. Eur J Biochem, 1983.135(3): p. 549-52.

101. Ursini, F., M. Maiorino, and C. Gregolin, The selenoenzyme phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase. Biochim Biophys Acta, 1985. 839(1): p. 62-70.

102. Roved, A., et al., Purification and characterization of phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase from rat testis mitochondrial membranes. Biochim Biophys Acta, 1994.1208(2): p. 211-21.

103. Maiorino, M., et al., The thioredoxin specificity of Drosophila GPx: a paradigm for a peroxiredoxin-like mechanism of many glutathione peroxidases. J Mol Biol, 2007. 365(4): p. 1033-46.

104. Delaunay, A., A.D. Isnard, and M.B. Toledano, H202 sensing through oxidation of the Yapl transcription factor. Embo J, 2000.19(19): p. 5157-66.

105. Kho, C.W., et al., Gpx3-dependent responses against oxidative stress in Saccharomyces cerevisiae. J Microbiol Biotechnol, 2008. 18(2): p. 270-82.

106. Menezes, R.A., et al., Contribution of Yapl towards Saccharomyces cerevisiae adaptation to arsenic-mediated oxidative stress. Biochem J, 2008. 414(2): p. 30111.

107. Gallogly, M.M. and J.J. Mieyal, Mechanisms of reversible protein glutathionylation in redox signaling and oxidative stress. Curr Opin Pharmacol, 2007. 7(4): p. 381-91.

108. Ланкин, B.3., Бондарь, Т.Н., Тихазе. А.К, Влияние свободных жирных кислот на липопероксидазную активность антиоксидантных ферментов-Se-содержащей глутатионпероксидазы и неселеновой глутатион-S-трансферазы. Докл. АН СССР, 1997. 357(6): р. 828-831.

109. Wallig, М.А., Xenobiotic metabolism, oxidant stress and chronic pancreatitis. Focus on glutathione. Digestion, 1998. 59 Suppl 4: p. 13-24.

110. Ketterer, B. and D.J. Meyer, Glutathione transferases: a possible role in the detoxication and repair of DNA and lipid hydroperoxides. Mutat Res, 1989. 214(1): p. 33-40.

111. Carlson, B.A., et al., Specific excision of the selenocysteine tRNASer.Sec (Trsp) gene in mouse liver demonstrates an essential role of selenoproteins in liver function. J Biol Chem, 2004. 279(9): p. 8011-7.

112. Townsend, D.M., V.L. Findlay, and K.D. Tew, Glutathione S-transferases as regulators of kinase pathways and anticancer drug targets. Methods Enzymol, 2005. 401: p. 287-307.

113. Manevich, Y., S.I. Feinstein, and A.B. Fisher, Activation of the antioxidant enzyme 1-CYS peroxiredoxin requires glutathionylation mediated by heterodimerization with pi GST. Proc Natl Acad Sci USA, 2004. 101(11): p. 3780-5.

114. Ralat, L.A., et al., Direct evidence for the formation of a complex between 1-cysteine peroxiredoxin and glutathione S-transferase pi with activity changes in both enzymes. Biochemistry, 2006. 45(2): p. 360-72.

115. Ralat, L.A., et al., Characterization of the complex of glutathione S-transferase pi and 1-cysteine peroxiredoxin. Arch Biochem Biophys, 2008. 474(1): p. 109-18.

116. Fomenko, D.E., et al., High-throughput identification of catalytic redox-active cysteine residues. Science, 2007. 315(5810): p. 387-9.

117. Fomenko, D.E., S.M. Marino, and V.N. Gladyshev, Functional Diversity of Cysteine Residues in Proteins and Unique Features of Catalytic Redox-Active Cysteines in Thiol Oxidoreductases. Mol Cells, 2008. 26(3).

118. Hofmann, B., H.J. Hecht, and L. Flohe, Peroxiredoxins. Biol Chem, 2002. 383(3-4): p. 347-64.

119. Poole, L.B. and H.R. Ellis, Flavin-dependent alkyl hydroperoxide reductase from Salmonella typhimurium. 1. Purification and enzymatic activities of overexpressed AhpFand AhpCproteins. Biochemistry, 1996. 35(1): p. 56-64.

120. Bryk, R., P. Griffin, and C. Nathan, Peroxynitrite reductase activity of bacterial peroxiredoxins. Nature, 2000. 407(6801): p. 211-5.

121. Rhee, S.G., H.Z. Chae, and K. Kim, Peroxiredoxins: a historical overview and speculative preview of novel mechanisms and emerging concepts in cell signaling. Free Radic Biol Med, 2005. 38(12): p. 1543-52.

122. Kim, K., S.G. Rhee, and E.R. Stadtman, Nonenzymatic cleavage of proteins by reactive oxygen species generated by dithiothreitol and iron. J Biol Chem, 1985. 260(29): p. 15394-7.

123. Kim, K., et al., The isolation and purification of a specific "protector" protein which inhibits enzyme inactivation by a thiol/Fe(III)/02 mixed-function oxidation system. J Biol Chem, 1988. 263(10): p. 4704-11.

124. Chae, H.Z., et al., Cloning and sequencing of thiol-specific antioxidant from mammalian brain: alkyl hydroperoxide reductase and thiol-specific antioxidantdefine a large family of antioxidant enzymes. Proc Natl Acad Sci USA, 1994. 91(15): p. 7017-21.

125. Chae, H.Z., et al., Cloning, sequencing, and mutation of thiol-specific antioxidant gene of Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem, 1993. 268(22): p. 16815-21.

126. Jackson, A.L., et al., Position-specific chemical modification of siRNAs reduces "off-target" transcript silencing. Rna, 2006.12(7): p. 1197-205.

127. Manevich, Y., et al., 1-Cys peroxiredoxin overexpression protects cells against phospholipid peroxidation-mediated membrane damage. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002. 99(18): p. 11599-604.

128. Monteiro, G., et al., Reduction of 1-Cys peroxiredoxins by ascorbate changes the thiol-specific antioxidant paradigm, revealing another function of vitamin C. Proc Natl Acad Sci USA, 2007.104(12): p. 4886-91.

129. Pedrajas, J.R., et al., Mitochondria of Saccharomyces cerevisiae contain one-conserved cysteine type peroxiredoxin with thioredoxin peroxidase activity. J Biol Chem, 2000. 275(21): p. 16296-301.

130. Rhee, S.G., et al., Sulfiredoxin, the cysteine sulfinic acid reductase specific to 2-Cys peroxiredoxin: its discovery, mechanism of action, and biological significance. Kidney Int Suppl, 2007(106): p. S3-8.

131. Poole, L.B. and K.J. Nelson, Discovering mechanisms of signaling-mediated cysteine oxidation. Curr Opin Chem Biol, 2008.12(1): p. 18-24.

132. Driscoll, D.M. and P.R. Copeland, Mechanism and regulation of selenoprotein synthesis. Annu Rev Nutr, 2003. 23: p. 17-40.

133. Hatfield, D.L. and V.N. Gladyshev, How selenium has altered our understanding of the genetic code. Mol Cell Biol, 2002. 22(11): p. 3565-76.

134. Carlson, B.A., et al., Identification and characterization of phosphoseryl-tRNASer.Sec kinase. Proc Natl Acad Sci USA, 2004.101(35): p. 12848-53.

135. Xu, X.M., et al., New developments in selenium biochemistry: selenocysteine biosynthesis in eukaryotes and archaea. Biol Trace Elem Res, 2007. 119(3): p. 234-41.

136. Benton, D., Recent changes in the GenBank On-line Service. Nucleic Acids Res, 1990.18(6): p. 1517-20.

137. Benson, D.A., et al., GenBank. Nucleic Acids Res, 2006. 34(Database issue): p. D16-20.

138. Bairoch, A., et al., Swiss-Prot: juggling between evolution and stability. Brief Bioinform, 2004. 5(1): p. 39-55.

139. Boeckmann, B., et al., The SWISS-PROT protein knowledgebase and its supplement TrEMBL in 2003. Nucleic Acids Res, 2003. 31(1): p. 365-70.

140. Fumoto, M., S. Miyazaki, and H. Sugawara, Genome Information Broker (GIB): • data retrieval and comparative analysis system for completed microbial genomes and more. Nucleic Acids Res, 2002. 30(1): p. 66-8.

141. Adams, M.D., et al., Complementary DNA sequencing: expressed sequence tags and human genome project. Science, 1991. 252(5013): p. 1651-6.

142. Lee, Y., et al., The TIGR Gene Indices: clustering and assembling EST and known genes and integration with eukaryotic genomes. Nucleic Acids Res, 2005. 33(Database issue): p. D71-4.

143. Bonilla, M., et al., Platyhelminth mitochondrial and cytosolic redox homeostasis is controlled by a single thioredoxin glutathione reductase and dependent on selenium and glutathione. J Biol Chem, 2008. 283(26): p. 17898-907.

144. Dikiy, A., et al., SelT, SelW, SelH, and Rdxl2: genomics and molecular insights into the functions of selenoproteins of a novel thioredoxin-like family. Biochemistry, 2007. 46(23): p. 6871-82.

145. Lobanov, A.V., et al., Evolutionary dynamics of eukaryotic selenoproteomes: large selenoproteomes may associate with aquatic life and small with terrestrial life. Genome Biol, 2007. 8(9): p. R198.

146. Novoselov, S.V., et al., Identification and characterization of Fepl5, a new selenocysteine-containing member of the Sepl5 protein family. Biochem J, 2006. 394(Pt 3): p. 575-9.

147. Castellano, S., et al., Reconsidering the evolution of eukaryotic selenoproteins: a novel nonmammalian family with scattered phylogenetic distribution. EMBO Rep, 2004. 5(1): p. 71-7.

148. Kryukov, G.V., et al., Characterization of mammalian selenoproteomes. Science, 2003. 300(5624): p. 1439-43.

149. Novoselov, S.V. and V.N. Gladyshev, Non-animal origin of animal thioredoxin reductases: implications for selenocysteine evolution and evolution of protein function through carboxy-terminal extensions. Protein Sei, 2003. 12(2): p. 372-8.

150. Novoselov, S.V., et al., Selenoproteins and selenocysteine insertion system in the model plant cell system, Chlamydomonas reinhardtii. Embo J, 2002. 21(14): p. 3681-93.

151. Gladyshev, V.N., et al., Identification and characterization of a new mammalian glutaredoxin (thioltransferase), Grx2. J Biol Chem, 2001. 276(32): p. 30374-80.

152. Altschul, S.F., et al., Basic local alignment search tool. J Mol Biol, 1990. 215(3): p. 403-10.

153. Gish, W. and D J. States, Identification of protein coding regions by database similarity search. Nat Genet, 1993. 3(3): p. 266-72.

154. Madden, T.L., R.L. Tatusov, and J. Zhang, Applications of network BLAST server. Methods Enzymol, 1996. 266: p. 131-41.

155. Altschul, S.F., et al., Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res, 1997. 25(17): p. 3389-402.

156. Zhang, Z., et al., A greedy algorithm for aligning DNA sequences. J Comput Biol, 2000. 7(1-2): p. 203-14.

157. Zhang, J. and T.L. Madden, PowerBLAST: a new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation. Genome Res, 1997. 7(6): p. 649-56.

158. Gardy, J.L., et al., PSORTb v.2.0: Expanded prediction of bacterial protein subcellular localization and insights gained from comparative proteome analysis. Bioinformatics, 2005. 21(5): p. 617-623.

159. Horton, P. and K. Nakai, Better prediction of protein cellular localization sites with the k nearest neighbors classifier. Proc Int Conf Intell Syst Mol Biol, 1997. 5: p. 147-52.

160. Bannai, H., et al., Extensive feature detection of N-terminal protein sorting signals. Bioinformatics, 2002. 18(2): p. 298-305.

161. Gasteiger, E., et al., ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Res, 2003. 31(13): p. 3784-8.

162. Pagni, M., et al., My Hits: improvements to an interactive resource for analyzing protein sequences. Nucleic Acids Res, 2007. 35(Web Server issue): p. W433-7.

163. Emanuelsson, O., et al., Predicting subcellular localization of proteins based on their N-terminal amino acid sequence. J Mol Biol, 2000. 300(4): p. 1005-16.

164. Tusnady, G.E. and I. Simon, Principles governing amino acid composition of integral membrane proteins: application to topology prediction. J Mol Biol, 1998. 283(2): p. 489-506.

165. Hirokawa, T., S. Boon-Chieng, and S. Mitaku, SOSUI: classification and secondary structure prediction system for membrane proteins. Bioinformatics, 1998.14(4): p. 378-9.

166. Matsuda, S., et al., A novel representation of protein sequences for prediction of subcellular location using support vector machines. Protein Sci, 2005. 14(11): p. 2804-13.

167. Soding, J., A. Biegert, and A.N. Lupas, The HHpred interactive server for protein homology detection and structure prediction. Nucl. Acids Res., 2005. 33(suppl2): p. W244-248.

168. Bendtsen, J.D., et al., Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0. J Mol Biol, 2004. 340(4): p. 783-95.

169. Jia, P., et al., Prediction of subcellular protein localization based on functional domain composition. Biochem Biophys Res Commun, 2007. 357(2): p. 366-70.

170. Claros, M.G. and P. Vincens, Computational method to predict mitochondrially imported proteins and their targeting sequences. Eur J Biochem, 1996. 241(3): p. 779-86.

171. Small, I., et al., Predotar: A tool for rapidly screening proteomes for N-terminal targeting sequences. Proteomics, 2004. 4(6): p. 1581-90.

172. Kneller, D.G., F.E. Cohen, and R. Langridge, Improvements in protein secondary structure prediction by an enhanced neural network. J Mol Biol, 1990. 214(1): p. 171-82.

173. Rost, B., G. Yachdav, and J. Liu, The PredictProtein server. Nucleic Acids Res, 2004. 32(Web Server issue): p. W321-6.

174. Via, A., A. Zanzoni, and M. Helmer-Citterich, Seq2Struct: a resource for establishing sequence-structure links. Bioinformatics, 2005. 21(4): p. 551-3.

175. Shi, J., T.L. Blundell, and K. Mizuguchi, FUGUE: sequence-structure homology recognition using environment-specific substitution tables and structure-dependent gap penalties. J Mol Biol, 2001. 310(1): p. 243-57.

176. Bryson, K., et al., Protein structure prediction servers at University College London. Nucleic Acids Res, 2005. 33(Web Server issue): p. W36-8.

177. Jones, D.T., Improving the accuracy of transmembrane protein topology prediction using evolutionary information. Bioinformatics, 2007. 23(5): p. 53844.

178. Jones, D.T., W.R. Taylor, and J.M. Thornton, A model recognition approach to the prediction of all-helical membrane protein structure and topology. Biochemistry, 1994. 33(10): p. 3038-49.

179. Painter, J. and E.A. Merritt, Optimal description of a protein structure in terms of multiple groups undergoing TLS motion. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2006. 62(Pt 4): p. 439-50.

180. Korotkov, K.V., et al., Mammalian selenoprotein in which selenocysteine (Sec) incorporation is supported by a new form of Sec insertion sequence element. Mol Cell Biol, 2002. 22(5): p. 1402-11.

181. Higgins, D.G. and P.M. Sharp, CLUSTAL: a package for performing multiple sequence alignment on a microcomputer. Gene, 1988. 73(1): p. 237-44.

182. Chenna, R., et al., Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. Nucleic Acids Res, 2003. 31(13): p. 3497-500.

183. Larkin, M.A., et al., Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics, 2007. 23(21): p. 2947-8.

184. Fink, W.L., Microcomputers and Phylogenetic Analysis. Science, 1986. 234(4780): p. 1135-1139.

185. DeSalle, R., C. Wray, and R. Absher, Computational problems in molecular systematics. Exs, 1994. 69: p. 353-70.

186. Page, R.D., Visualizing phylogenetic trees using TreeView. Curr Protoc Bioinformatics, 2002. Chapter 6: p. Unit 6 2.

187. Morrison, D.A., Phylogenetic tree-building. Int J Parasitol, 1996. 26(6): p. 589617.

188. Highton, R., Molecular phytogeny of plethodonine salamanders and hylid frogs: statistical analysis of protein comparisons. Mol Biol Evol, 1991. 8(6): p. 796818.

189. Gascuel, O. and M. Steel, Neighbor-joining revealed. Mol Biol Evol, 2006. 23(11): p. 1997-2000.

190. Kryukov, G.V., V.M. Kryukov, and V.N. Gladyshev, New mammalian selenocysteine-containing proteins identified with an algorithm that searches for selenocysteine insertion sequence elements. J Biol Chem, 1999. 274(48): p. 33888-97.

191. Castellano, S., et al., In silico identification of novel selenoproteins in the Drosophila melanogaster genome. EMBO Rep, 2001. 2(8): p. 697-702.

192. Kryukov, G.V. and V.N. Gladyshev, Mammalian selenoprotein gene signature: identification and functional analysis of selenoprotein genes using bioinformatics methods. Methods Enzymol, 2002. 347: p. 84-100.

193. Boon, K., et al., An anatomy of normal and malignant gene expression. Proc Natl Acad Sei USA, 2002. 99(17): p. 11287-92.

194. Pylouster, J., C. Senamaud-Beaufort, and T.E. Saison-Behmoaras, WEBSAGE: a web tool for visual analysis of differentially expressed human SAGE tags. Nucleic Acids Res, 2005. 33(Web Server issue): p. W693-5.

195. Studier, F.W. and B.A. Moffatt, Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol, 1986.189(1): p. 113-30.

196. Rosenberg, A.H., et al., Vectors for selective expression of cloned DNAs by T7 RNA polymerase. Gene, 1987. 56(1): p. 125-35.

197. Studier, F.W., et al., Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Methods Enzymol, 1990.185: p. 60-89.

198. Derman, A.I., et al., Mutations that allow disulfide bond formation in the cytoplasm of Escherichia coli. Science, 1993. 262(5140): p. 1744-7.

199. Sun, Y., et al., The molecular mechanism of protecting cells against oxidative stress by 2-selenium-bridged beta-cyclodextrin with glutathione peroxidase activity. Biochim Biophys Acta, 2005.1743(3): p. 199-204.

200. Sawadogo, M. and M.W. Van Dyke, Indirect use of immobilized metal affinity chromatography for isolation and characterization of protein partners. Genet Eng (N Y), 1995.17: p. 53-65.

201. Hochuli, E., H. Dobeli, and A. Schacher, New metal chelate adsorbent selectiveifor proteins and peptides containing neighbouring histidine residues. J Chromatogr, 1987. 411: p. 177-84.

202. Kunkel, T.A., Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci USA, 1985. 82(2): p. 488-92.

203. Zhdanov, R.I., O.V. Podobed, and V.V. Vlassov, Cationic lipid-DNA complexes-lipoplexes-for gene transfer and therapy. Bioelectrochemistry, 2002. 58(1): p. 5364.

204. Rocha, A., S. Ruiz, and J.M. Coll, Improvement ofDNA transfection with cationic liposomes. J Physiol Biochem, 2002. 58(1): p. 45-56.

205. Graham, F.L. and A.J. van der Eb, A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology, 1973. 52(2): p. 456-67.

206. Wigler, M., et al., Biochemical transfer of single-copy eucaryotic genes using total cellular DNA as donor. Cell, 1978.14(3): p. 725-31.

207. Kassavetis, G.A., et al., Bacteriophage SP6-specific RNA polymerase. II. Mapping of SP6 DNA and selective in vitro transcription. J Biol Chem, 1982. 257(10): p. 5779-88.

208. Kessler, C., et al., Non-radioactive labeling and detection of nucleic acids. I. A novel DNA labeling and detection system based on digoxigenin: anti-digoxigenin ELISA principle (digoxigenin system). Biol Chem Hoppe Seyler, 1990. 371(10): p. 917-27.

209. Fedorov, Y., et al., Different delivery methods-different expression profdes. Nat Methods, 2005. 2(4): p. 241.

210. Boese, Q., et al., Mechanistic insights aid computational short interfering RNA design. Methods Enzymol, 2005. 392: p. 73-96.219.220.221.222.223.224.225.226.

211. Birmingham, A., et al., A protocol for designing siRNAs with high functionality and specificity. Nat Protoc, 2007. 2(9): p. 2068-78.

212. Anderson, E., et al., Identifying siRNA-induced off-targets by microarray analysis. Methods Mol Biol, 2008. 442: p. 45-63.

213. Mieyal, J.J., et al., Thioltransferase in human red blood cells: purification and properties. Biochemistry, 1991. 30(25): p. 6088-97.

214. Raghavachari, N. and M.F. Lou, Evidence for the presence of thioltransferase in the lens. Exp Eye Res, 1996. 63(4): p. 433-41.

215. Ursini, F., et al., Diversity of glutathione peroxidases. Methods Enzymol, 1995. 252: p. 38-53.

Информация о работе

Новосёлов, Сергей Владимирович
доктора биологических наук
Пущино, 2008
ВАК 03.00.04

Диссертация

Новые тиоловые оксидоредуктазы систем тиоредоксина и глутаредоксина. Их роль в регуляции окислительно-восстановительного баланса клетки - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы