Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ферментативная регуляция SS/SH редокс статуса запасных белков и качества клейковины пшеницы

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Ферментативная регуляция SS/SH редокс статуса запасных белков и качества клейковины пшеницы"



Оснпова Светлана Владимировна

ФЕРМЕНТАТИВНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ вв/вН РЕДОКС СТАТУСА ЗАПАСНЫХ БЕЛКОВ И КАЧЕСТВА КЛЕЙКОВИНЫ ПШЕНИЦЫ

03.01.05 — физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

1 4 АПР 2011

Иркутск-2011

4843903

Работа выполнена в лаборатории технической биохимии Учреждения Российской академии наук Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, Иркутск

Научный консультант: доктор биологических наук |В.А.Труфанов|

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Н.Н.Новиков

доктор биологических наук, профессор Д.Ю.Щербаков

доктор биологических наук

Н.В.Озолина

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН, г. Москва

Защита состоится 2 июня 2011 г. в 10 ч. на заседании диссертационного совета Д 003.047.01 при Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН по адресу: 664033, Иркутск, ул. Лермонтова, 132, а/я 317. Факс (3952) 510 754; e-mail: matmod@sifibr.irk.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО

РАН.

Автореферат разослан &. & 3

2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Г.П.Акимова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Исследования молекулярной подоплеки вязкоэластичных свойств клейковины пшеницы проводятся давно и во многих лабораториях мира. Было установлено, что различия сортов пшеницы по признаку "качество клейковины" связаны в основном с нерастворимой фракцией глютенина, образующейся путем полимеризации субъединиц глютенина в процессе созревания зерновки (Payne et а!., 1987, Shewry and Halford, 2002). Ключевыми взаимодействиями, стабилизирующими трехмерную структуру глютениновых полимеров, являются межмолекулярные дисульфидные связи.

Вместе с тем известно, что вариабельность качества клейковины в большей степени зависит от физиологических факторов, связанных с нестабильностью условий среды во время созревания зерновки, нежели от вариабельности количества высокомолекулярных субъединиц глютенина (Lemelin et al., 2005).

Решающая роль межмолекулярных дисульфидных связей в формировании структуры клейковины предполагает, что процесс полимеризации глютениновых полипептидов при созревании зерна может регулироваться различными клеточными редокс агентами. Однако роль редокс окружения в формировании реологических свойств клейковины остается слабо изученной и спорной (Li et al., 2004; Every et al., 2006).

В связи с этим изучение в зерновке пшеницы активности ферментных систем, катализирующих тиол-дисульфидный метаболизм белков, их роли в процессах полимеризации запасных белков при созревании зерновки и в формировании технологического качества клейковины является актуальным как в теоретическом, так и в практическом аспектах.

Цель и задачи исследования. Цель работы - изучение роли ферментативного регулирования полимеризации запасных белков в формировании надмолекулярных белковых структур зерна пшеницы и установление механизмов высокой вариабельности качества клейковины в разных условиях среды.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи: 1) изучить в созревающей зерновке пшеницы сопряженность баланса SS/SH и активностей ферментов тиол-дисульфидного метаболизма; 2) изучить вариабельность содержания и физических свойств клейковины у различных генотипов мягкой пшеницы в разных условиях выращивания; 3) выявить ■ взаимосвязь параметров качества клейковины с активностью ферментов тиол-дисульфидного метаболизма; 4) провести очистку и изучить биохимические характеристики тиол:протеиндисульфид оксидоредуктазы из I. 1 зерна пшеницы; 5) изучить влияние экзогенной дисульфидредуктазы из зерновки пшеницы на физические свойства клейковины; 6) картировать локусы количественных признаков, ассоциированные с активностью дисульфидредуктазы; 7) изучить соотношение фракций по Осборну в

белковом комплексе семян реликтового злака перловник Турчанинова (Роасеае) из различных ценопопуляций Восточного Забайкалья.

Положения, выносимые на защиту

1. Полимеризация субъединиц глютенина в процессе созревания зерна регулируется эндогенными оксидоредуктазами, катализирующими реакции тиол-дисульфидного метаболизма в запасных белках.

2. Высокая вариабельность качества клейковины в разных условиях среды обусловлена вариабельностью активности ферментов, катализирующих ЗБ/БН редокс превращения в запасных белках созревающей зерновки.

3. В созревающей зерновке пшеницы функционирует высокомолекулярный глутаредоксин подобный белок с тиол:протеиндисульфид оксидоредуктазной активностью (КФ 1.8.4.2), катализирующий редукцию межмолекулярных дисульфидных связей полимерных белков эндосперма пшеницы, что приводит к ослаблению белковой решетки клейковины.

Научная новизна. Впервые установлено, что в созревающей зерновке пшеницы присутствуют активности тиол:кислород оксидоредуктазы (ТО, КФ 1.8.3.2) и <38Н-зависимой протеиндисульфид оксидоредуктазы (ТПДО, КФ 1.8.4.2), катализирующие соответственно образование и восстановление дисульфидных связей в запасных белках. СБН-зависимая протеиндисульфид оксидоредуктаза зерна пшеницы была выделена, очищена до электрофоретической гомогенности и охарактеризована. Фермент имеет молекулярную массу около 167 кДа и состоит из двух субъединиц, около 73 и 77 кДа. Установлено, что дисульфидредуктаза зерна пшеницы по энзиматическим характеристикам имеет сходство с ферментами из животных тканей, принадлежащими к суперсемейству тиоловых оксидоредуктаз. Влияние дисульфидредуктазы на физические свойства клейковины указывает на специфичность фермента к межмолекулярным 88 связям глютенина, что отличает его от известного в зерновке тиоредоксина /».

Динамика активности ферментов тиол-дисульфидного метаболизма в созревающей зерновке, синхронность изменения соотношения 88/8Н и баланса ферментативных активностей свидетельствуют, что ферменты вовлечены в процесс полимеризации глютениновых субъединиц на первом (при образовании разветвленного глютенина) и втором (образование нерастворимых полимеров клейковины) уровнях агрегации белков. Впервые показана взаимосвязь между балансом ферментативных активностей, регулирующих ББ/ЗН статус запасных белков, и физическими свойствами клейковины.

Впервые на хромосомах мягкой пшеницы картированы локусы количественных признаков, ассоциированные с активностью дисульфидредуктазы, положение которых совпало с положением локусов, ассоциированных с параметрами физических свойств клейковины.

Высокая активность дисульфидредуктазы, обнаруженная в прорастающей зерновке, свидетельствует об участии фермента в подготовке протеолитической деградации глютениновых агрегатов при прорастании. Предполагается, что редуцирующие системы, подобные системе ТПДО, играют важную роль в прорастании семян злаков из филогенетически древних таксонов, так как среди запасных белков в семенах реликтовых злаков преобладают труднорастворимые полимерные глютелины.

Научная и практическая значимость работы. Установлено, что ферменты тиол-дисульфидного метаболизма, присутствующие в созревающей зерновке пшеницы, вовлечены в процесс полимеризации запасных белков и формирование физических свойств клейковины, вариабельность качества зерна связана с функционированием этих ферментных систем. Изучение GSH-зависимой протеиндисульфид оксидоредуктазы зерновки пшеницы позволило оценить роль редуцирующей системы глутаредоксина в созревающем и прорастающем зерне. Результаты картирования локусов количественных признаков для активности дисульфидредуктазы могут служить основой для выявления кандидатных генов, контролирующих процесс полимеризации запасных белков и качество клейковины пшеницы. Полученные результаты вносят значительный вклад в познание процессов формирования надмолекулярных белковых структур в созревающей зерновке, расширяют и углубляют понимание природы высокой вариабельности качества клейковины в меняющихся условиях среды и могут быть использованы в селекции пшеницы на качество зерна. Разработан и защищен патентом способ получения тиол:протеиндисульфид оксидоредуктазы из растительного сырья.

Публикации и апробация работы. Основное содержание и защищаемые положения диссертации отражены в 40 работах, в том числе 15 из них опубликованы в изданиях из перечня ВАК. Результаты исследований по теме диссертации были доложены и обсуждены на 3 Всесоюзной конференции молодых ученых по физиологии растительной клетки (Петрозаводск, 1988); на 2-м (Минск, 1990), 3-м (Санкт-Петербург, 1993) и 4-м (Москва, 1999) съездах Всероссийского общества физиологов растений; на ежегодном симпозиуме ВОФР (Пенза, 1996), на 2-м съезде ВОГИС России (Санкт-Петербург, 1999), на международной конференции "Биотехнология на рубеже двух тысячелетий" (Саранск, 2001); на 11-й (Новосибирск, 2000), 12-й (Норидж, Англия, 2002), 13-й (Прага, Чехия, 2006) и 14-й (Стамбул, Турция, 2007) международных конференциях EWAC (Европейского общества по анеуплоидии пшеницы); на 10-м (Paestum, Италия, 2003) и 11-м (Brisbane, Австралия, 2008) международных симпозиумах по генетике пшеницы, на 4-м съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), а также на научных сессиях Сибирского института физиологии и биохимии растений (Иркутск, 1994,1996,1998,2000,2002, 2004, 2006).

Декларация личного участия автора. В диссертационной работе использованы экспериментальные материалы, полученные лично автором, а также совместно с коллегами лабораторий технической биохимии и физико-химических методов исследования СИФИБР СО РАН, сотрудниками ИЦИГ СО РАН (Новосибирск), КНИИСХ им. П.ПЛукьяненко (Краснодар), Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research (IPK) (Gatersleben, Germany) и Читинской государственной медицинской академии. Автору принадлежит разработка планов исследований, организация и ведение экспериментов, анализ опытного материала и обобщение результатов. Суммарное личное участие автора ~ 85 %. В диссертацию включены некоторые данные из кандидатской диссертации А.В.Пермякова "Протеин-дисульфид редуктаза и липоксигеназа пшеницы в ферментативной регуляции SS/SH-обмена в запасных белках зерновки: физиолого-биохимические аспекты" (2004), в планировании, получении и обсуждении которых автор диссертации принимала личное участие.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 265 страницах, содержит 42 рисунка и 31 таблицу, состоит из введения, обзора литературы, объектов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы (456 источников). Приложение содержит 2 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В работу были вовлечены сорта яровой мягкой пшеницы Triticum aestivum L.: Скала, Ангара, Тулунская 12, Омская, Салют, Светояр, Спектр, Ферругинеум, Свободар, Трансдункант, Пиротрикс 28/33, Пиротрикс 28/14, Лютесценс 750Н4, Лютесценс 851Н1, Лютесценс 851Н5, Лютесценс 616Н5, Лютесценс 34Н5, Эритроспермум 674Н27, Дружина, Мироновская 808, Саратовская 29, Ладе, сорт озимой пшеницы Иркутская, а также:

- 6 межсортовых замещенных линий Диамант 2/Новосибирская 67 по хромосомам 1-й и 6-й гомеологичных групп и их родители, двойная замещенная линия Диамант 2/Новосибирская 67 по хромосомам 1А и 6D;

- 63 рекомбинантные инбредные линии ITMI (International Mapping Triticieae Initiative) картированной популяции и их родители. Всего 97 различных генотипов мягкой пшеницы.

Растения выращивали в полевых условиях на базе Иркутской сельскохозяйственной академии, Краснодарского НИИСХ им. П.П. Лукьяненко (г. Краснодар), ИЦИГ СО РАН (г. Новосибирск), IPK (Gatersleben, Germany) и на экспериментальном участке СИФИБР СО РАН. Растения выращивали также в условиях фитотрона СИФИБР СО РАН.

При изучении ферментативной активности в процессе созревания зерновки образцы семян отбирали в разные сроки налива и созревания, замораживали жидким азотом и лиофильно высушивали.

Кроме того, материалом исследования служили семена дикого злака перловник Турчанинова (M turczaninowiarta Ohwi), собранные в 2007 и 2008 гг в разных ценопопуляциях на территории двух ботанико-географическнх районов Восточного Забайкалья — Даурии Ононской и Даурии Яблоновой.

Методы исследования. Для получения ферментных экстрактов 2 г муки грубого помола из зерна полной спелости гомогенизировали с 0.1 M трис-НС1 буфером pH 7.5 + 1 мМ ЭДТА (рабочий буфер) в соотношении 1:3 в течение 20 мин. Гомогенат последовательно центрифугировали при 5000 и 30000 g в течение 20 мин. Полученный ферментный экстракт диализовапи в течение ночи против исходного буфера и использовали для определения тиолоксидазной и дисульфидредуктазной активностей. Зерновки более ранних фаз спелости гомогенизировали в фарфоровой ступке. Растворимые семенные липоксигеназы получали экстракцией муки грубого помола с рабочим буфером в отношении 1:10 (V/V) в течение 20 мин. Экстракт центрифугировали при 8000g в течение 30 мин. Все операции по выделению ферментных экстрактов проводили при 4 "С.

Для определения активности дисульфидредуктазы (ТПДО) использовали модифицированный метод Minoda et al. (1973). В типичном случае в рабочий буфер вносили инсулин (4 мг/мл), БСА (19 мг/мл) или уксуснорастворимые белки клейковины (4 мг/мл) в качестве субстратов. Кроме субстратов в инкубационную среду добавляли ферментный экстракт с известным содержанием белка, либо очищенный фермент (20-30 мкг) и кофактор GSH (1 мМ). Аликвоты инкубационной среды по 0.2 мл вносили в пробирки, содержащие 3 мл подкисленного ацетона для осаждения белка. Через 2 часа осажденный белок дважды промывали подкисленным ацетоном, растворяли в рабочем буфере pH 8.0, содержащем 1 % ДДС-Na и 0.27 % реактива Эллмана и измеряли содержание SH-rpynn при 412 нм. Единицу активности (Е) определяли как количество фермента, катализирующее увеличение содержания SH-rpynn на 1 микромоль в минуту при 37° и pH 7.5.

Активность тиолоксидазы определяли по скорости окисления SH-rpynn дитиотреитола (Ю-3 М), восстановленного глутатиона (10~3 М) (Lash, Jones, 1986) или уксуснорастворимых восстановленных белков клейковины (4 мг/мл). За единицу активности (Е) принимали количество фермента, катализирующее уменьшение содержания SH-rpynn в минуту при 37° и pH 7.5.

Активность липоксигеназы определяли спектрофотометрически, измеряя поглощение коньюгированных пероксидов при 234 нм по модифицированной методике Zimmerman and Vick (1970). Для субстрата эмульсию линолевой кислоты в этаноле (1:1) растворяли в 0.1 M трис-HCl буфере, pH 6.8. За единицу липоксигеназной активности принимали изменение оптической

плотности на 0.01 за 1 мин в сравнении с контрольным вариантом опыта, не содержащим ферментного экстракта.

Удельную активность ферментов выражали в единицах на мг белка ферментного экстракта. Содержание белка в экстрактах определяли по Lowry (1951) или Bradford (1976) используя БСА как стандарт.

Очистку тиол:протеиндисульфид оксидоредуктазы проводили с использованием тиол-активированной сефарозы 4В или тиопропилсефарозы 6В (аффинная хроматография), сефадексов G-25 (гель-фильтрация) и ДЭАЭ-А-50 (ионообменная хроматография).

Электрофоретические методы. Нативные белки ферментных экстрактов анализировали в щелочной буферной системе по Davis (1964). Восстановленные белки анализировали в щелочной буферной система по Laemmli (1970). Определение молекулярной массы нативного белка проводили по методу Колесниченко и соавторов (2000). Для проверки гомогенности очищенной ТПДО использовали систему капиллярного электорофореза 3D СЕ Agilent Technologies.

Для селективного окрашивания глутатионредуктазы в пластинках ПААГ использовали метод Ye et al. (1997), липоксигеназы — Heydeck et al. (1985).

Константу Михаэлиса определяли по методу Лайнуивера-Бэрка (Диксон, Уэбб, 1982) pH- и температурный оптимумы ТПДО — с БСА (40 мг/мл) в качестве субстрата.

Ингибиторный анализ проводили с 0.5 и 1 мМ N-этилмалеимидом и 0.5 и 1 мМ п-хлормеркурибензоатом, а также с 0.5 и 1 мМ растворами ZnS04 и CuS04. Определяли остаточную активность ТПДО после прединкубации фермента с ингибиторами в течение 30 мин.

Выделение уксуснорастворимой фракции клейковины проводили по методике Василенко и Комарова (1987).

Параметры агрегации определяли по методу, предложенному японскими исследователями (Arakava and Yonezawa, 1975; Arakawa et al., 1976).

Содержание SH групп и SS связей определяли в экстрактах, полученных гомогенизацией образцов зерна с 0.1М натрий-фосфатным буфером, pH 7.5, содержащим 7М мочевину. SH группы алкилировали 4-винилпиридином Friedman et al. (1970) и после гидролиза белков проводили количественное определение пиридилцистеина на аминокислотном анализаторе. О содержании SS связей судили по разнице между содержанием пиридилцистеина до и после восстановления SS связей ß-меркаптоэтанолом. Содержание небелковых тиолов определяли по методу Труфанова и соавторов (1993).

Центрифугирование в градиенте плотности сахарозы проводили по методу Miflin et al. (1981).

Технологические показатели качества муки, теста и хлеба определяли в лабораториях Краснодарского НИИСХ им. П.П. Лукьяненко и Института цитологии и генетики СО РАН (г. Новосибирск) с применением методик

Государственного сортоиспытания сельскохозяйственных культур (Методика..., 1988).

Фракционирование белков семян дикого злака Mélica turczaninowiana проводили по методикам, стандартным для фракционирования белков зерна пшеницы (Конарев, 1980).

Статистическая обработка. Все биохимические определения проводили не менее чем в двух биологических и 3-4 аналитических повторностях. При определении технологических показателей зерна число повторностей было 4-5. Расчеты средней, ошибки средней, достоверности различий признаков, а также корреляционный и дисперсионный анализы проводили с использованием пакета программ STATISTICA, версия 5.0 (StatSoft) и MExcell. QTL-анализ проводили с использованием программы QGENE (Nelson, 1997).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

GSH-зависимая лротеинднсульфид оксидоредуктазная и тнолоксидазяая активности в зерновке пшеницы

Физические свойства клейковины зависят от размеров нерастворимых полимерных агрегатов глютенина. Ключевая роль в образовании и стабилизации глютениновых полимеров принадлежит межмолекулярным дисульфидным связям (Shewry, 2009).

Одна из задач первого этапа исследований заключалась в поиске в зерновке пшеницы ферментативных активностей, подобных тиолоксидазам и протеиндисульфид оксидоредуктазам, катализирующим тиол-дисульфидный метаболизм в секреторных белках тканей животного происхождения, и изучение их специфичности по отношению к SS связям и SH группам глютениновых белков.

Под воздействием ферментного экстракта, полученного из зерновок на стадии поздней молочной спелости и очищенного от низкомолекулярных примесей диализом в течение 16 часов при 4 °С, в зависимости от присутствия GSH SS/SH редокс равновесие уксуснорастворимых белков клейковины пшеницы, представляющих главным образом низкомолекулярные субъединицы глютенина, менялось в ту или другую сторону (табл. 1). В этом эксперименте использовали лиофилизированные уксуснорастворимые белки клейковины пшеницы сорта Скала. В реакционную смесь 1 вносили клейковинные белки, растворимые в 0.1 М трис-HCI буфере, рН 7.5, содержащем 10 % салицилата натрия (4 мг/мл). Из данных таблицы 1 следует, что внесение в инкубационную среду ферментного экстракта (2) приводило к снижению количества SH групп на 20.8 % за 60 мин инкубации в аэробных условиях. Поскольку низкомолекулярные редокс партнеры отсутствовали в инкубационной среде, а спонтанное окисление SH групп было незначительным (1), логично предположить, что окисление осуществляют ферменты, подобные тиол.кислород оксидоредуктазам животных тканей (тиолоксидазы, ТО, КФ

1.8.3.2), окисляющим SH группы тиоловых соединений путем прямого переноса электронов от тиола на молекулярный кислород (Lash, Jones, 1984). Редуцирующие системы в этих условиях были неактивны.

Таблица 1. Изменение содержания вН групп (мкмоль/мл) в уксуснорастворимых белках клейковины пшеницы при действии ферментного экстракта из зерновок молочной спелости

Время Клейковина+ Клейковина Клейковина+

инкуба- Клейковина ферментный + GSH(1MM) ферментный

ции, экстракт эксграктК38Н(1мМ)

мин 1 2 3 4

0 234.3 ± 6.0 256.1 ±5.7 239.5 ± 5.0 292.6 ± 1.0

30 236.4 ± 2.0 234.9 ± 1.0 254.2 ± 6.3 366.9 ±4.3**

60 225.9 ± 4.6 202.9 ±7.5*** 258.2 ±2.0** 408.5 ± 15.0***

Приведены средние значения из трех аналитических повторностей. * — достоверность различий с содержанием 8Н групп в нулевой точке. ** - Р < 0.01; *** -Р < 0.001.

В реакционной среде, содержащей белки клейковины и 08Н (3), количество БН групп за 60 мин инкубации увеличилось на 7.7 %. Дополнительное внесение ферментного экстракта (4) привело к существенному (в 6.2 раза) возрастанию скорости реакции, в результате за 60 мин инкубации количество БЫ групп увеличилось на 39.6 %.

Данные, представленные в этом разделе, свидетельствуют, что в созревающей зерновке пшеницы присутствуют ферментные системы, катализирующие как окисление белковых БН групп, так и редукцию Б8 связей белков клейковины. Для функционирования тиолоксидазы не требовались низкомолекулярные кофакторы, однако в анаэробных условиях активность не проявлялась. Активность ТПДО проявлялась только в присутствии вБИ, что характерно для СБН-зависимых протеиндисульфид оксидоредуктаз (ТПДО, КФ 1.8.4.2), известных в различных животных тканях (Уагапс1аш, 1973; СаггшсЬае1 е1 а1., 1979).

Активность тиолоксидазы, дисульфидредуктазы, содержание 88 связей

и 8Н групп в развивающихся зерновках пшеницы сорта Скала. Динамика активности дисульфидредуктазы в зерне разнокачественных

сортов пшеницы

Из данных рисунка 1А, видно, что максимум активности ТПДО в зерне пшеницы сорта Скала проявлялся в конце молочной - начале восковой спелости зерновок (содержание воды 55-45 %) с последующим снижением ее к концу созревания. Тиолоксидазная активность была достаточно высокой в течение всего периода созревания зерна от ранней молочной до полной спелости (рис. 1А). В период восковой спелости в зерновках возрастало соотношение активностей ТО/ТПДО (рис. 1С), одновременно увеличивалось суммарное количество 88 связей (Рис. 1В) и соотношение 88/8Н (рис. 1С).

В период с конца молочной (55 % влажность) до полной спелости отношение активностей ТО/ТПДО и баланс ЗБ/вН в зерновках были связаны тесной положительной корреляционной связью (г = 0.90, Р < 0.05). Эти данные свидетельствуют о вовлеченности ферментов в регуляцию БЗ/БН статуса белков зерновки.

Рисунок 1. ТО и ТПДО (А) активности (мкмоль вН/мин/мг белка х КГ3), содержание вв-связей и вН-групп (В), отношение активностей ТО/ТПДО и вв/вН (С) в созревающих зерновках пшеницы сорта Скала.

Представлены средние значения из трех независимых опытов.

На рисунке 2 отображена динамика активности ТПДО в развивающихся зерновках шеста сортов яровой пшеницы разного качества и скороспелости (Osipova et al., 2007). В этом опыте пшеницу выращивали в течение двух лет в полевых условиях в окрестностях Иркутска. Активность ТПДО у сортов в независимых экспериментах различалась, однако динамика активности для каждого сорта была сходной. У большинства сортов активность ТПДО в зерновках достигала максимума на третьей и четвертой неделях после цветения, в последующем снижалась в разной степени у различных сортов. Эти данные показывают, что в период максимального синтеза белков клейковины, который начинается со второй недели после цветения (Grunwade et al., 1996), и интенсивного образования надмолекулярных структур глютенина (Abonyi, 2010) в зерновке высока активность ТПДО, катализирующей разрушение белковых дисульфидов. В тот же период развития зерновки, как было установлено Every и соавторами (2006), в зерновке высока активность протеин дисульфид изомеразы, катализирующей изомеризацию дисульфидных связей белков. Начиная с ранней молочной спелости и на протяжении всего периода созревания в зерновке активна тиолоксидаза (рис. 1). Эти данные свидетельствуют, что редокс окружение в клетках эндосперма в период синтеза запасных белков и формирования полимеров клейковины определяется балансом как

низкомолекулярных редокс агентов, так и активности эндогенных оксидоредуктаз, способных регулировать интенсивность полимеризации запасных белков.

-—-А'

г \

П г

Неделя после цветшшя

Рисунок 2. Активность ТПДО (мкмоль SH/мин/зерновка х кг3) и содержание воды (%, гистограммы) в развивающихся зерновках пшеницы сортов: а) Лютесценс 616Н5, б) Эритроспермум 674Н27, в) Дружина, г) Скала, д) Пиротрикс 28/14, е) Свободар.

Представлены результаты определения активности ТПДО как среднее значение из двух повторностей в рамках одного независимого эксперимента ± ошибка средней.

Взаимосвязь активностей тиолоксидазы и дисульфидредуктазы

с качеством клейковины в зерновках яровой мягкой пшеницы сибирской и кубанской селекции

Наиболее чувствительными к изменениям структуры глютениновых полимеров являются реологические тесты, которые используют в качестве индикаторов состояния макромолекулярных белковых комплексов (Dobraszczyk and Morgenstern, 2003). Показатели альвеографа и фаринографа, использующиеся в технологических лабораториях для оценки качества клейковины, хорошо отражают реологические (альвеограф) и смесительные (фаринограф) свойства теста.

Чтобы установить взаимосвязь активности эндогенных ТПДО и ТО с физическими свойствами клейковины от 7 (в Иркутске) до 15 (в Краснодаре) сортов яровой мягкой пшеницы были выращены в период с 1986 г. по 1988 г. в разных почвенно-климатических условиях на опытных полях Иркутского

НИИСХ и Краснодарского НИИСХ им. П.П. Лукьяненко. Умеренно-континентальный климат Краснодарского края благоприятен для возделывания зерновых, а в Предбайкалье созревание зерна происходит при постоянном нарастании дефицита тепла, который в фазе восковой спелости достигает 10 °С (Илли, 2010). Всего в этой серии экспериментов были проанализированы технологические характеристики 78 образцов зерна мягкой пшеницы.

Анализ генотипической вариабельности параметров качества зерна и клейковины показал, что содержание белка и клейковины у пшениц, выращенных как в Краснодаре, так и в Иркутске, характеризовались незначительной вариабельностью (коэффициент вариации V - от 1.5 до 5 %).

Генотипическая вариабельность показателей, характеризующих физические свойства клейковины, была средней как в условиях Иркутска, так и в условиях Краснодара (коэффициенты вариации для различных показателей составляли от 5 до 22 %).

Модификационная изменчивость содержания белка и клейковины также была незначительной, и для всех изученных сортов пшеницы коэффициенты вариации этих показателей не превышали 10 % (табл. 2). По объемному выходу хлеба наиболее стабильными оказались сорта Скала (V = 1.9 %) и Пиротрикс 28/14 (V = 3.6 %), у других сортов коэффициенты вариации колебались в пределах 13-17 %. Необходимо отметить, что лабораторные выпечки производили только из муки пшеницы, выращенной в Краснодаре.

В то же время показатели качества теста характеризовались значительной модификационной изменчивостью. Коэффициенты вариации для устойчивости теста составили у разных сортов от 11 до 56 %, для разжижения теста - от 20 до 54 %. По валориметрической оценке коэффициенты внутрисортовой изменчивости у разных сортов колебались от 5 до 19 %. Столь же значительной модификационной изменчивостью характеризовались активность тиолоксидазы (V = от 8 до 49 %) и дисульфидредуктазы (V = от 7 до 67 %) в зерне на стадии поздней молочной спелости.

Сравнение по i-критерию (табл. 3) показателей качества для семи сортов, выращенных в разных географических регионах и представленных в таблице 2, показало, что в условиях Иркутска существенно снижалось время образования и устойчивости теста, валориметрическая оценка и более чем в 3 раза возрастало разжижение теста. Анализ активности ферментов в зерне тех же сортов на стадии поздней молочной спелости выявил, что в Иркутске была снижена тиолоксидазная активность, повышена активность ТПДО, и более чем в два раза снижено отношение активностей ТО/ТПДО (табл. 3).

Приведенные данные не только отражают высокую модификационную изменчивость удельной активности ферментов и фаринографических показателей качества теста, но и свидетельствуют о существовании вполне определенной взаимосвязи между ними. Корреляционный анализ дает

Таблица 2. Изменчивость активности ТО и ТПДО (Е/мг * 103) и показателей качества у отдельных сортов пшеницы в разных условиях выращивания (стационары КНИИСХ и ИрНИИСХ, 1986-1988 гг.)

Удельная активность ферментов Мука Тесто Хлеб

Сорт Устойчи- Разжиже- Вапо- Объемный Общая хл-

ТО ТПДО то/тпдо Белок, % Клейковина, % вость, мин ние, е.ф. риметр, е.ф. выход пек. оценка, баллы

Спектр 9.5 ±2.1 4.0 ± 1.5 3.1 ±0.7 16.8 ±0.6 33.5 ± 1.3 8.3 ±09 81.8± 16.3 70 ±3.6 647 ± 52.5 4.7 ±0.3

11 = 4 22.0 37.5 22.6 3.6 3.9 10.8 20.0 5.1 8.1 6.4

Светояр 7.1 ±2.0 3.0 ±0.5 2.8 ± 1.0 15.7 ±0.7 32.0± 1.1 10.1 ±5.7 101 ±27.7 64 ± 12 629 ± 94 4.6 ±0.5

п = 4 28.0 16.7 35.7 4.5 3.4 56.4 27.3 19.1 15 10.9

Скала 9.7 ± 0.8 2.9 ± 0 2 3.4 ± 0.3 15.1 ±0.9 32.0 ±2.6 15.5 ± 7.1 78 ±21.7 79± 7.1 652 ± 12.5 4 6 ± 0.1

п = 5 8.2 6.9 8.8 6.0 8.1 45.8 27.8 9.0 1.9 1.0

Лютесценс 8.1 ±1.5 2 0 ± 0.3 4.0 ± 0 5 15.9 ± 1.4 34.2 ±2.3 15.6 ±4.7 130 ±61.5 79 ±3.6 630± 105 4.7± 0.3

615Н5 п = 4 18.5 15.0 12.5 8.5 6.7 30.1 47.3 17.6 17.0 6.4

Свободар 4.7 ±2.3 2.1 ±0.2 2.0 ±0.9 15.7 ± 1.1 32.7 ± 1.9 15.6 ±6.4 75 ±18.6 79 ±8.6 593 ± 77.5 4.7 ±0.2

п = 5 49.0 9.5 45.0 7.0 5.8 41.0 24.8 11.0 13.1 6.4

Эритроспермум 674Н5 п = 5 7.2 ±2.2 1 8± 1.2 4.3 ± 1.4 15.0 ±0.4 31.7 ± 0 8 14.6 ± 2.4 53± 19 5 90±5 6 645 ± 85 4.8 ±0.2

30.6 66.7 32.6 2.6 2.5 16.4 36.8 6.3 13.2 4.2

Пиротрикс 7.6 ± 1.1 1.5 ±0.2 5.7 ± 1.3 17.3 ± 1.4 34.2 ±2.3 24.5± 8.5 51.7 ± 28 96 ± 9.5 618 ±22.5 4.8± 0.2

28/14 п = 3 14.5 13.3 23.0 8.1 6.7 34.7 54.2 9.9 3.6 4.2

В числителе - средние значения показателей ± станд. откл., в знаменателе жирным шрифтом - коэффициенты вариации.

Таблица 3. Изменчивость активности тиолоксидазы (ТО), дисульфидредуктазы (ТПДО) и показателей качества в зависимости от условий выращивания

Краснодар, Иркутск,

Признаки 1986-1987 гг. 1986-1988 гг.

Удельная активность

ТО, Е/мг х ю-3 9.2 ± 0.7 6.3 ± 1.1*

ТПДО, Е/мг х Ю"3 2.0 ± 0.2 2.9 ± 0.4

ТО/ТПДО 4.9 ± 0.5 2.3 ±0.4***

Масса 1000 зерен, г 32.9 ± 1.5 32.7 ±1.3

Содержание клейковины, % 31.8 ±0.4 34.4 ±0.8

ИДК, единицы прибора 66.4 ±5.9 71.1 ±4.5

Время образования и

устойчивости теста, мин 21.4 ±3.1 8.8 ±0.8**

Разжижение теста, е.ф. 40.0 ± 6.7 135.7 ± 17.6***

Валориметрическая оценка, е.ф. 92.1 ±5.5 67.7 ±4.0**

Приведены средние значения ± станд. откл. для сортов Свободар, Скала, Спектр, Светояр, Лютесценс 616Н5, Пиротрикс 28/14, Эритроспермум 674Н27. * - достоверность различий признаков в разных климатических условиях. * Р < 0.05; ** Р<0.01; *** Р<0.001. е. ф. - единицы фаринографа.

представление о количественной стороне этой взаимосвязи (табл. 4). Отрицательные корреляционные связи между разжижением теста, показателем ИДК-1 и тиолоксидазной активностью вполне логичны, так как с увеличением ББ связей в запасных белках тесто должно быть более устойчивым, а для более упругой клейковины сильных пшениц характерны низкие значения показателя ИДК-1. Сильные положительные достоверные корреляционные связи обнаружены между силой муки, растяжимостью, устойчивостью теста, и активностью тиолоксидазы. Можно ожидать, что у сортов с более высокой тиолоксидазной активностью технологические характеристики муки, теста и качество хлеба будут лучше.

Активность дисульфидредуктазы проявляла противоположную связь с показателями качества (табл. 4). С первого взгляда дисульфидредуктазная активность не играла существенной роли в определении технологических свойств клейковины, но она оказывала непосредственное влияние на баланс активностей ТО/ТПДО и, тем самым, на ЗЗ/БН равновесие в белковом комплексе клейковины и его реологические параметры.

Несмотря на общую высокую оценку качества хлеба у всех изучаемых сортов, между активностью ферментов и отдельными показателями качества хлеба обнаружились корреляционные связи — средние отрицательные связи между расплывчатостью хлеба, цветом мякиша и активностью тиолоксидазы, средние положительные - с активностью дисульфидредуктазы, и тесные

достоверные корреляционные связи — между показателями качества хлеба и ТО/ТПДО (табл. 4).

Таблица 4. Корреляционные связи между активностью тиолоксидазы (ТО), дисульфидредуктазы (ТПДО), отношением ТО/ТПДО и технологическими показателями качества пшениц

Показатель ТО ТПДО ТО/ТПДО

п = 12 п = 20 п = 12 п = 20 п= 12 п = 20

Мука: - белок - клейковина - сила муки -впс - ИДК-1 -0.09 -0.27 -0.58* -0.78*** 0.53 0.51* -0.41 -0.69** -0.25 -0.64** -0.34 -0.13 0.16 -0.12 0.42 0.05 0.25 0.24 0.16 0.04 0.14 0.10 -0.58* -0.59** 0.64* 0.56** -0.62* -0.60** -0.58* -0.58**

Тесто: - растяжимость - устойчивость - разжижение - вапориметр 0.75** 0.49* 0.60* 0.35 -0.51 -0.05 0.59* 0.23 -0.07 0.11 -0.56 -0.18 0.31 -0.04 -0.39 -0.01 0.76** 0.31 0.92*** 0.58* -0.67* -0.20 0.77** 0.42

Хлеб: - расплывчатость - цвет мякиша - объем хлеба - общая х.п. оценка -0.37 -0.27 0.34 0.34 -0.51* -0.42 -0.46* -0.49* 0.67**

Примечание. Приведены значения коэффициентов корреляции для пшениц, выращенных в 1987 г (л = 12) и в 1986-1987 гг (п = 20); * Р < 0.05; ** Р< 0.01; *♦* Р < 0.001.

Тесные корреляционные связи между отношением активностей ферментов (ТО/ПДО), регулирующих БЗ/БН статус запасных белков, и технологическими показателями муки, теста и хлеба свидетельствуют об участии этих ферментов в формировании надмолекулярных структур клейковины пшеницы.

Активность дисульфидредуктазы, липоксигеназы и качество клейковины в зерне межсортовых замещенных линий Диамант 2/Новосибирская 67 по хромосомам 1-й и 6-й гомеологичных групп

Межсортовые замещенные линии (ЗЛ) Диамант 2/Новосибирская 67 по хромосомам 1-й и 6-й гомеологичных групп были созданы в Институте цитологии и генетики СО РАН под руководством О.И.Майстренко.

Реципиентом служил низкокачественный, но высокобелковый сорт Диамант 2 (содержание клейковины в зерне 40-50 %), а донором хромосом -высококачественный сорт Новосибирская 67 (содержание клейковины 30 %). Родительские сорта различались по составу почти всех запасных белков эндосперма (Пшеничникова, Майстренко, 1999; Obukhova et al., 2001).

Линии Диамант 2/Новосибирская 67 были проанализированы по 16 технологическим параметрам (Пшеничникова и др., 2006). Все ЗЛ сохранили присущее реципиенту высокое содержание клейковины, однако качество клейковины улучшились только у 3JI по хромосомам 1А и 6D и у двойной ЗЛ по хромосомам 1А, 6D.

Замещенные линии и родительские сорта были выращены в 1997 на экспериментальном участке СИФИБР СО РАН (Иркутск, опыт I) и в 1999 г. в двух повторностях на экспериментальном поле ИЦИГ СО РАН (Новосибирск, опыты II и III). В зерновках полной спелости из каждого независимого опыта активность ферментов определяли в двух биологических и 3-4 аналитических повторностях.

Из данных таблицы 5 видно, что родительские сорта не различались по активности ТПДО. У ЗЛ этот признак варьировал, в 1997 г. наиболее значительно, от 0.8 до 5.3. Уровень активности липоксигеназы (ЛОГ) в 1997 г. варьировал меньше, поэтому вариабельность отношения ЛОГ7ТПДО определялась в основном вариабельностью уровня активности ТПДО.

Таблица 5. Удельная активность ТПДО и липоксигеназы в зерновках межсортовых замещенных линий Диамант 2/Новосибирская 67 (Дм.2/Нов.67) и их родителей

Сорт, линия

Удельная активность ТПДО, Е/мг х КГ3

Независимые опыты I II III

Удельная активность липоксигеназы, Е/мг х 10

Независимые опыты I II III

Диамант 2 Новосибирская 67 Дм. 2/Нов. 67 1А Дм. 2/Нов. 67 1В Дм. 2/Нов. 67 Ю Дм. 2/Нов. 67 6А Дм. 2/Нов. 67 6В Дм. 2/Нов. 67 60 Дм. 2/Нов. 67 1А, бО

Коэффициент

вариации у линий, %

1.6 ±0.1 1.8 ±0.6 0.8 ±0.1* 2.6 ±0.6*

2.5 ± 0.6 2.0 ±0.1

3.6 ±0.3» 5.3 ±0.5*

19.2

2.1±0.1 2.5 ±0.1 2.0 ±0.1 1.8 ± 0.1

2.4 ± 0.3 2.2 ± 0.2

2.5 ± 0.2 2.3 ±0.1

6.7

1.9±0.1 1.6±0.1

1.4 ± 0.1* 1.9 ±0.1 1.9 ±0.2

1.5 ± 0.1* 2.1 ± 0.1 2.3 ± 0.2

1.8 ±0.1* 1.4 ±0.1*

6.0

5.8 ±0.2

4.9 ±0.1 5.9 ±0.2 4.9 ± 0.3

5.1 ±0.1

5.2 ±0.1

5.4 ± 0.2

5.5 ±0.1

5.1

6.6 ±0.6 5.3 ±0.2

4.7 ±0.3* 3.4 ±0.7 7.2 ±0.3 5.3 ±0.2

8.8 ±0.5* 5.3 ±0.2 8.5 ±0.5 5.5 ±0.1 7.0 ±0.1 4.9 ±0.5 7.2 ±0.3 4.8 ±0.3 7.7 ±0.5 5.5 ±0.1 8.7 ±0.4* 5.1 ±0.1

4.7

4.0

* - достоверность различий с сортом-реципиеотом, Р < 0.05.

Корреляционный анализ выявил в опыте I достоверные корреляционные связи между отношением ЛОГ7ТПДО в зерне и физическими свойствами теста по данным фаринографа: положительные со временем образования и устойчивости теста (г = 0.78, Р < 0.05) со стабильностью теста (г = 0.74, Р < 0.05) и валориметрической оценкой (г = 0.83, Р < 0.05), и отрицательную связь с разжижением теста (г = - 0.79, Р < 0.05), высокие значения которого характеризуют клейковину плохого качества.

В опытах II и III г изменчивость по уровню активности ТПДО была невысокой (табл. 5). Активность липоксигеназы достоверно и отрицательно коррелировала с силой муки (г = - 0.83, Р < 0.01), упругостью теста (г = - 0.87, Р < 0.01), объемом хлеба (г = - 0.76, Р < 0.05) и общей хлебопекарной оценкой (г = - 0.86, Р < 0.01).

Пермяковой и соавторами (2010) было показано, что влияние эндогенной ЛОГ зерновки пшеницы на качество муки и теста может быть как положительным, так и отрицательным, в зависимости от уровня активности фермента. Ухудшение качества клейковины под влиянием высокой активности ЛОГ, вероятно, может быть следствием уменьшения поверхностной гидрофобности глютенинов, вызванного связыванием продуктов окисления ЛОГ (ЗЬнЬа е1 а1., 1991).

В общей выборке, включающей данные трех независимых опытов, линии были сгруппированы по уровню активности ТПДО, и в группах были сопоставлены показатели физических свойств теста по /-критерию (табл. 6). В группе линий с относительно низкой активностью ТПДО (ТПДО < 1.6 Е/мг), в которую вошли замещенная линия по хромосоме 1А и двойная замещенная линия по хромосомам 1А и 6Э, наблюдали лучшие показатели физических свойств теста.

Таблица б. Активность ТПДО, ЛОГ и показатели физических свойств теста в зерне замещенных линий Диамант 2/Новосибирская 67, сгруппированных по уровню активности ТПДО

Показатель 1 группа 2 группа

ТПДО 5 1.6 ТПДО 1.6

Активность ТПДО, Е/мг х 10"3 1.3 ± 0.1 2.3 ±0.2***

Активность ЛОГ, Е/мг х 10 4.9 ± 0.3 6.2 ±0.3*

Сила муки, е.а. 275 ±48.1 174 ± 14.1*

Упругость, е.а. 87.1± 10.4 71.7 ±2.2*

Время устойчивости теста, мин 4.9 ±1.0 2.3 ±0.5*

Сопротивление теста, мин 9.9 ± 1.6 6.3 ±0.7*

Разжижение теста, е.ф. 38.5 ±11.9 65.8 ±5.0*

Валориметрическая оценка, е.ф. 78.1 ± 5.7 65.5 ±2.2*

* — достоверность различий по /-критерию между группами, * - Р < 0.05, * * * - Р < 0.001. е.а. — единицы альвеографа; е.ф. — единицы фаринографа.

Таким образом, в наборе замещенных линий Диамант 2/Новосибирская 67 замена неактивного в отношении реологических свойств аллеля глютенина на активный не всегда приводила к улучшению параметров качества, однако прослеживалась связь физических свойств клейковины с активностью ТПДО и ЛОГ.

Представленные в предыдущих разделах данные свидетельствуют, что формирование физических свойств клейковины зависит не только от генетически детерминированных характеристик сорта - состава субъединиц глютенина и содержания белка, но и прочих факторов, среди которых существенное влияние на процессы полимеризации белков при созревании зерновки может оказывать редокс окружение клеток эндосперма. Помимо низкомолекулярных редокс агентов в формировании SS/SH редокс окружения эндосперма участвуют оксидоредуктазы, специфически катализирующие тиол-дисульфидные превращения в запасных белках. Высокая активность ТПДО в развивающейся зерновке приводит к редукции межмолекулярных SS связей и деполимеризации субъединиц глютенина, снижению устойчивости белковой решетки клейковины и ухудшению её реологических параметров - снижению времени образования и устойчивости теста и повышению разжижения теста. Высокая активность ТО способствует полимеризации субъединиц глютенина и укреплению клейковины. Влияние ЛОГ неоднозначно, в популяции замещенных линий Диамант 2/Новосибирская 67 и их родителей высокая активность ЛОГ приводила к ухудшению качества клейковины. Эндогенные оксидоредуктазы, сохраняющие высокий уровень активности в зрелой зерновке, могут быть вовлечены в окислительно-восстановительные реакции при гидратации запасных белков во время замеса теста.

Очистка и определение молекулярной массы

тиол:протеиндисульфид оксидоредуктазы из зерновки пшеницы

Очистка и характеристика тиол:протеиндисульфид оксидоредуктазы из зерновки пшеницы представляли большой интерес, так как в литературе не было обнаружено сведений о подобных ферментах у растений.

Очистка ТПДО из зерна пшеницы Тулу некая 12 полной спелости была проведена с использованием ионообменной хроматографии на сефадексе ДЭАЭ А-50. Аналитический вариант эксперимента (из 50 г муки) позволял получить фракции с высокой степенью очистки ТПДО за один цикл очистки (табл. 7, рис. 3).

В препаративном варианте очистку вели из 150 г муки. Вероятно, из-за значительного увеличения нагрузки на колонку с сефадексом, пик активности ТПДО в препаративном варианте ионообменной хроматографии сместился в область белкового пика (рис. 4). Фракции с активностью ТПДО анализировали на наличие глутатион редуктазы и липоксигеназы методом селективного окрашивания в пластинах ПААГ (Ye et al., 1997; Heydeck et al., 1985) после нативного электрофореза по Davis (1964) (рис. 5).

Таблица 7. Основные этапы очистки ТПДО из зерновки пшеницы полной спелости сорта Тулунская 12

Объем

Процедура фракций, мл Е/мл х 10"3 Белок, мг/мл Е/мг белка х 10"3 Очистка

Экстракция, Центрифугирование Высаливание, 75 6.6 10.8 0.6 1

20-80 %(NH4)2S04, 20 10.1 14.2 0.7 1.2

Диализ или гель-фильтрафия на сефадексе G-25

Ионообменная хроматография на сефадексе ДЭАЭ А-50

Номер фракции 49 15 7.8 0.3 26.0 43.3

50 15 3.5 0.1 31.7 52.9

51 15 0.9 0.07 13.3 22.2

54 15 17.4 0.03 646 1077

55 15 12.5 0.02 660 1100

58 15 27.3 0.04 719 1158

62 15 2.3 0.07 32.5 54.2

Рисунок 3. Ионообменная хроматография на сефадексе ДЭАЭ А-50 экстракта из зерновки пшеницы Тулунская 12.

На рисунках 3, 4, 6 - 1 - кривая десорбции белка линейным градиентом NaCl; 2 - активность ТПДО.

Рисунок 4. Препаративная ионообменная хроматография на сефадексе ДЭАЭ А-50 экстракта из зерновки пшеницы Тулунская 12.

ч

х-2

>■». л - ЦЦ

22 23 24 а 1 25 26 27 28 29 30 3132 33 34 б

Рисунок 5. Селективное окрашивание в пластинах ПААГ на липоксигеназу (а) и глутатион редуктазу (б):

а - 22-24 — белковые фракции с активностью ЛОГ, полученные при ионообменной хроматографии; б - фракции с активностью глутатион редуктазы, 1 - исходный экстракт, 25-34 - фракции, десорбированные градиентом концентраций ЫаС1 (рис. 4).

В препаративном варианте хроматографии липоксигеназа элюировала раньше ТПДО. Начиная с 25-й фракции (рис. 4) липоксигеназной активности мы не обнаруживали. Наибольшую сложность представляло очистить ТПДО от глутатион редуктазы. Для достижения этой цели провели рехроматографию частично

очищенных фракций с

активностью ТПДО (рис. 6). Степень чистоты ТПДО во фракциях контролировали ПААГ-ДЦС-Ыа электрофорезом (рис. 7).

номер фракции

Рисунок 6. Ионообменная рехроматография на колонке с сефадексом ДЭАЭ А-50 частично очищенной ТПДО.

Фракции с высокой степенью очистки (например, фракции № 54-58, рис. 3 или фракция № 8, рис. 5 и 7) проверяли на электрофоретическую гомогенность капиллярным электрофорезом, который показал присутствие в некоторых из этих фракций единственного белкового пика (рис. 8).

В результате процедур очистки мы получили два препарата, содержащих активность ТПДО: первый — электрофоретически гомогенный препарат -использовали для изучения молекулярной массы и энзиматических характеристик ТПДО; второй — частично очищенный препарат - не содержащий примесей других ферментов тиол-дисульфидного метаболизма,

использовали в дальнейших опытах по влиянию экзогенной ТПДО на реологические свойства клейковины и агрегацию запасных белков.

■ЩШШЩШШ* д™. 7 j jJqJJ 10* - SOkC

! * 1 i 1 i 1 !

jL/ V

.....

•••*,•,••. .... .....** ........... * ** ««

6 7 8

Рисунок 7. ДЦС-1Ма-ПААГ электрофорез (по ЬаеттН, 1970) белковых фракций, полученных при рехроматографии. 6-8 -белковые фракции элюата (рис. 5).

Рисунок 8. Денситограмма очищенного ферментного

препарата ТПДО, полученная в результате капиллярного

электрофореза.

Для определения молекулярной массы гомогенной нативной ТПДО использовали метод неденатурирующего электрофореза в присутствии ДЦС-Na по методике А.В.Колесниченко и соавторов (2000). Неденатурирующим электрофорезом было показано, что нативная молекула ТПДО имеет молекулярную массу около 167 кДа(рис. 9).

Для определения субъединичного состава и молекулярной массы субъединиц ТПДО использовали ДДС-Ыа-ПААГ электрофорез по Laemmli (1970). Гомогенный препарат ТПДО был восстановлен в присутствии 2 % ДДС-Na и 5 % 2-меркаптоэтанола и проанализирован в 10 % ПААГ. Было выявлено, что ТПДО состоит из двух субъединиц с молекулярной массой около 73 и 77 кДа, которые вероятно, связаны между собой SS мостиками, поскольку они восстанавливались 2-меркаптоэтанолом (рис. 10).

Протеиндисульфидредуктаза, выделенная нами из зерновки пшеницы, имела более высокую молекулярную массу нативного белка и отдельных субъединиц по сравнению с ранее описанными глутатион-зависимыми протеиндисульфидредуктазами из животных тканей (Chandler, Varandani, 1975; Freedman, 1979), а также более высокую молекулярную массу по сравнению с уже известными в зерновке пшеницы ферментами SH-метаболизма.

«МО U>;i —- mi

132 к DA —«- §4

1 2

«кЕ» -« kDa .

____ "Ы»

am г ркш

Ш

1 2

Рисунок 9.

Неденатурирующий ДДС-Ыа-электрофорез ТПДО зерновки пшеницы в 7 %-м ПААГ;

1 - маркеры (ферритин -440 кДа, каталаза — 223 кДа, лактатдегидрогеназа -140 кДа, БСА -67 кДа);

2 - нативная ТПДО.

Рисунок 10.

ДДС-Ыа-электрофорез ТПДО зерновки пшеницы по Laemmli в 10% -м ПААГ; - 1- маркеры (у - глобулин -160 кДа; овальбумин -45 кДа, цитохром с - 12 кДа); 2 - ТПДО, восстановленная р-меркаптоэтанолом.

Протеин дисульфид изомераза, очищенная Shimoni et al. (1995) из созревающей зерновки пшеницы, имела молекулярную массу 60 кДа. Тиоредоксинредуктаза пшеницы, по данным разных авторов, 35 или 65 кДа (Suske et al., 1979; Kobrehel et al., 1992). Тиолтрансфераза, состоящая из двух субъединиц с молекулярной массой около 23 кДа-около 50 кДа (Pascal et al., 1998). Хлоропластная глутатионредуктаза листьев пшеницы состояла из двух субъединиц с молекулярной массой 56 кДа и ассоциированным полипептидом 32 кДа, при общей молекулярной массе 150 кДа (Lascano et al., 2001). Известно, что типичные тиоредоксины и глутаредоксины представляют собой низкомолекулярные белки с молекулярной массой 11-14 кДа (Buchanan, Balmer, 2005; Rouhier, 2010).

Субстратная специфичность протеиндисульфидредуктазы, сродство к инсулину и БСА

Субстратную специфичность определяли для стандартных субстратов: инсулина, имеющего три SS связи, две из которых - межмолекулярные и бычьего сывороточного альбумина (БСА), имеющего 17 внутримолекулярных SS связей, а также для уксуснорастворимых белков клейковины, в состав которых входят преимущественно низкомолекулярные глютенины.

В таблице 8 показано восстановление ББ связей различных белков эндогенной гомогенной ТПДО зерновки пшеницы. В отсутствие СБН восстановления 88 связей не происходило вовсе (1). Количество БН групп в инкубационной среде несколько снижалось, очевидно, за счет спонтанного окисления. Добавление к раствору инсулина восстановленного глутатиона в концентрации 1 мМ приводило к восстановлению 88 связей инсулина, количество 8Н групп в инкубационной среде возрастало в течение часа со скоростью 12 х 10"3 мкмоль 8Н/мин (2).

Объединение в одной инкубационной среде инсулина, ТПДО и СБН приводило к десятикратному повышению скорости восстановления 88 связей, до 138 * 10~3 мкмоль 8Н/мин (3). Подобные закономерности наблюдали при восстановлении дисульфидредуктазой ББ связей БСА и уксуснорастворимых белков клейковины. ОБН восстанавливал 88 связи этих белков, однако добавление в инкубационную среду дисульфидредуктазы существенно повышало скорость реакции, в инкубационной среде с БСА — в 2 раза (5), с белками клейковины - почти в 4 раза (7).

Таблица 8. Содержание БН групп (мкмоль/мл) в аликвотах реакционной смеси (3, 5, 7) и контрольных вариантах (1,2, 4, 6) в процессе инкубации ТПДО (0.02 мг/мл) с инсулином (4 мг/мл), БСА (19 мг/мл) и белками клейковины (4 мг/мл)

Состав инкубационной Время инкубации, мин

смеси 0 30 60

1 Инсулин, ТПДО 3.1 ±0.0 - 2.7 ±0.1

2 Инсулин, в8Н 2.1 ±0.2 - 2.8 ± 0.2

3 Инсулин, ТПДО, С8Н 3.3 ±0.2 - 11.6 ±0.2

4 БСА, С8Н 14.4 ±0.2 17.5 ±0.2 19.2 ± 0.9

5 БСА, ТПДО, ввН 15.5 ± 0.2 20.5 ±0.2 24.5 ± 0.3

6 Белки клейковины, ввН 5.3 ±0.1 5.5 ± 0.5 6.3 ± 0.8

7 Белки клейковины, 6.1 ±0.0 6.9 ± 0.4 9.7 ±1.0

ТПДО, С8Н

Представлены средние значения ± стандартное отклонение, п = 3.

Максимальная скорость реакции восстановления связей инсулина наблюдалась при концентрации инсулина 3.1 мкМ, Кт при этом составила 2.18 ± 0.2 мкМ, что в 5-10 раз меньше, чем значения Кт для инсулина аналогичных ферментов из животных тканей (вИотЬи^ а1., 1994). Для БСА при тех же условиях максимальная скорость реакции проявлялась при концентрации 700 мкМ, а Кт составила 570 ± 15.7 мкМ. Сравнительно высокое сродство к инсулину делает ТПДО зерновки пшеницы сходной с протеиндисульфидредуктазами из животных тканей (Апво^е е1 а1., 1973; СалшсЬае! й а1., 1979; Бгп^ауа е! а1., 1991). Определение Кт для запасных

белков пшеницы затруднено из-за их плохой растворимости в средах, пригодных для определения активности ферментов, однако в таблицах 1 и 8 показано, что ТПДО специфична в отношении ББ связей уксуснорастворимых белков клейковины.

Взаимосвязь активности дисульфидредуктазы и содержания низкомолекулярных тиолов в развивающейся зерновке

На рисунке 12 показана сопряженность активности ТПДО и содержания низкомолекулярных тиолов в развивающихся зерновках пшеницы. Средние данные для четырех сортов пшеницы приведены в % от суммарного содержания низкомолекулярных тиолов и суммарной активности ТПДО в зерновке на протяжении созревания.

Относительное содержание низкомолекулярных тиоловых соединений достигало максимума на стадии молочной спелости (примерно 30 день после цветения, влажность семян около 50 %), а с наступлением фазы тестообразной спелости снижалось. Максимум активности ТПДО совпадал с максимальным содержанием небелковых тиолов в зерновке (рис. 12). Наличие достоверной корреляционной связи (г = 0.76, Р < 0.05) между содержанием тиолов и активностью ТПДО в созревающей зерновке свидетельствует о важной роли низкомолекулярных тиолов, которые в зерновке пшеницы представлены в основном глутатионом (Нййпег, Wieser, 2001) в регуляции активности ТПДО. Судя по коэффициенту детерминации, примерно 60 % вариабельности активности ТПДО обусловлено содержанием небелковых БН групп и около 40 % —другими факторами.

Рисунок 12. Активность ТПДО (1) и относительное содержание небелковых тиолов (2) в развивающихся зерновках пшеницы в зависимости от влажности зерна.

Приведены средние данные для сортов Скала, Ангара 86, Люгесценс 616Н5 и Эритроспермум 674М27. Бары -стандартное отклонение.

Поскольку пул СБН в клетке поддерживается глутатионредуктазой, логично предположить, что обнаруженный нами фермент с протеиндисульфид редуктазной активностью относится к редуцирующей системе глутаредоксина. Нетипично высокая для глутаредоксинов молекулярная масса нативного белка ТПДО позволяет отнести дисульфидредуктазу из зерновки пшеницы к классу высокомолекулярных

22

20

з 18

2

3 >. 16

и

н о 14

12

10

70-75 60-65 50-55 40-45 30-35 15-20 содержание воды в зерне, %

глутаредоксин подобных белков (Buchanan, Balmer, 2005), функционирующих в редуцирующей системе НАДФН/глутатионредуктаза/ GSH/ТПДО.

Оптимумы рН, температуры и ингибиторный анализ тиол:протеиндисульфид оксидоредуктазы из зерновки пшеницы

Оптимальные для активности ТПДО значения температуры были определены в диапазоне 33-38° С, максимальная активность наблюдалась при 36° С. В этом у ТПДО из пшеницы больше сходства с ферментами тиол-дисульфидного метаболизма из животных тканей (Varandani, 1973), нежели с тиоредоксином А из зерновки пшеницы, имеющим температурный оптимум при 25 °С (Suske et al., 1979). Оптимальные значения рН - в интервале 6.57.5, с максимальной активностью при рН 7.0. Значения рН оптимума для ТПДО пшеницы в целом сходны с таковыми для дисульфидредуктаз животных (Ansorge et al., 1973).

Для ингибиторного анализа мы использовали специфические реагенты на SH-группы (табл. 9). Двухвалентные ионы меди и цинка, связывающие SH-группы с образованием меркаптидов, на 100 % ингибировали активность ТПДО. Алкилирующие агенты N-этилмалеимид (N-ЭМ) и п-хлормеркурибензоат (ПХМБ) также ингибировали активность ТПДО, причем N-ЭМ сильнее, что, вероятно, можно объяснить разной доступностью для этих соединений, SH групп активного центра (табл. 9).

Таблица 9. Влияние ингибиторов на активность ТПДО из зерновки пшеницы

Ингибитор Концентрация, мМ Ингибирование, %

CuS04 0.5 100

1.0 100

ZnS04 0.5 100

1.0 100

N-ЭМ 0.5 70

1.0 100

ПХМБ 0.5 20

1.0 53

Представлены средние значения из трех независимых экспериментов, стандартное отклонение меньше 10 %.

На основании ингибиторного анализа можно предположить, что ТПДО из зерновки пшеницы, является представителем суперсемейства тиоловых оксидоредуктаз, имеющих в активном центре два цистеиновых остатка в тиоредоксинподобном домене -Сув-Х-Х-Суз-

Влияние ТПДО из зерновки пшеницы на агрегирующую способность уксуснорастворимых запасных белков

Способность запасных белков к агрегации является одним из важных показателей, характеризующих реологические свойства теста и качество клейковины. Параметры агрегации белков сильных пшениц заметно выше по сравнению с таковыми слабых пшениц, причем в случае высококачественной клейковины процесс образования белковых агрегатов интенсивнее на начальных этапах и более продолжителен по времени (Агака\уа, Уопегачуа, 1975). На рисунке 13 А представлены результаты экспериментов, проведенные при рН 5.6, согласно стандартной методике (Агака\уа е1 а1., 1975, 1976). Агрегирующая способность запасных белков в присутствии ТПДО снижалась по сравнению с контролем. Различие в величине показателей агрегации тЮ /С между контролем и опытом составляло в среднем от 15 до 22 %. Так, тЮ /С за 10 мин составлял в контроле 134.1 ± 4.6, в опыте - 114.6 ± 1.2. В следующие 25 мин (до прекращения агрегации) соответственно 143.6 ± 5.1 и 119.4 ± 1.2. При оптимальной для активности ТПДО рН 7.5 (рис. 13 (В)) показатель агрегации тЮ /С в присутствии фермента снижался ещё больше, на 25-30 %, что, очевидно, связано с усилением диссоциации ББ связей запасных белков под влиянием ТПДО.

Рисунок 13. Влияние ТПДО зерновки пшеницы на агрегацию уксуснорастворимых белков клейковины.

А - рН 5.6; В - рН 7.5. 1 - контроль (без ТПДО), 2 - опыт (+ТПДО), Представлены средние данные из трех независимых экспериментов, ошибка не превышала 5 %.

Заметное влияние ТПДО на агрегирующую способность запасных белков свидетельствует о важной роли дисульфидных связей в агрегации белков зерновки и потенциальной возможности регулирования агрегации белков с помощью ТПДО.

Влияние добавок экзогенной дисульфидредуктазы на физические свойства теста разнокачественных сортов пшеницы

На рисунке 14 представлены результаты определения силы муки, упругости и растяжимости теста на альвеографе Шопена до и после добавления в муку препарата очищенной дисульфидредуктазы. В муку до замеса теста добавляли частично очищенный из зерновки пшеницы (не содержащий примесей других ферментов тиол-дисульфидного метаболизма) препарат ТПДО в соотношении 5 мг/50 г муки.

Как видно из рисунка, добавление ТПДО не влияло на упругость теста ни одного из трех изученных сортов, но значительно увеличивало растяжимость теста — на 17 % у сорта Мироновская 808, имеющего высокую растяжимость, на 11 % у сорта Омская, клейковина которого отличалась очень высокой упругостью и малой растяжимостью, и почти на 50 % у озимого сорта Иркутская. У последнего сорта отношение упругости теста к растяжимости приближалось к единице, но сила муки была довольно низкой. Соответственно, для сортов Омская и Иркутская достоверно снижалось отношение упругость/растяжимость теста.

Таким образом, добавление к муке препарата очищенной ТПДО заметно изменяло физические свойства теста, увеличивая его растяжимость, что свидетельствует о специфичности ТПДО в отношении не только внутри-, но и межмолекулярных дисульфидных связей.

Е з

Ь

Н

£ 1

-1 1 "ta

Рисунок 14. Влияние добавок ТПДО на физические свойства теста различных сортов пшеницы: 1 — Мироновская 808, 2 — Омская, 3 — Иркутская.

Представлены средние значения из трех новторностей ± стандартное отклонение. * - Р < 0.05, **-Р<0.01.

Картирование локусов количественных признаков (QTLs), ассоциированных с активностью дисульфидредуктазы в зерне мягкой пшеницы популяции рекомбинантных инбредных линий ITMI

Для картирования локусов количественных признаков, ассоциированных с активностью дисульфидредуктазы, мы использовали 63 случайно отобранные рекомбинантные инбредные линии (РИЛ) картирующей популяции ITMI (международный проект "International Triticeae Mapping Initiative"), в состав которой вошли РИЛ, полученные от скрещивания мягкой пшеницы мексиканского сорта Опата 85 и синтетической гексаплоидной пшеницы W7984. Синтетик выделен при скрещивании твердой пшеницы сорта Altar 84 и Aegilops íauschii CIGM 86.940 (Nelson et al., 1995). РИЛ и родительские генотипы были выращены в г. Гатерслебен (Германия) в течение двух полевых вегетации - в 2000 и в 2003 гг. В 2000 г. линии высевали в озимом посеве, при этом погодные условия в июле и августе были благоприятны по температурному режиму и осадкам. В 2003 г. линии выращивались при яровом посеве, период налива зерна был жарким и засушливым. Каждая из этих вегетаций считалась повторностью.

По полученным нами данным сорт Опата 85 имел более высокую активность ТПДО по сравнению с Синтетиком W7984, это соотношение сохранялось в разных условиях среды. Среднее значение активности ТПДО у линий было ниже, чем у родителей за счет линий, имевших очень низкую активность (табл. 10). Двухфакторный дисперсионный анализ изменчивости активности ТПДО выявил, что вклад генотипа составил — 54 %, вклад средовых факторов — 29 %. Велик был вклад в изменчивость иных неучтенных факторов, среди которых, по нашему мнению, ключевым является содержание в зерновке несвязанного с белками восстановленного глутатиона, кофактора ТПДО. Данные дисперсионного анализа свидетельствуют о сложном характере контроля активности ТПДО и зависимости ее полиморфизма от большого числа факторов.

Таблица 10. Средние значения удельной активность (мкмоль БН/мин/мг х 10"3) дисульфидредуктазы (ТПДО) у рекомбинантных инбредных линий 1ТМ1 и их родительских форм в различных условиях среды

Биохимические Родительские формы Линии ITMI

признаки Опата 85 Синтетик Среднее Стандарт- Размах

W7984 значение ное откло- изменчи-

нение вости

Удельная

активность ТПДО, I 179.0±2.9 123.4±3.7 67.4±4.9 36.0 0.1-175.2

II 103.0±2.1 85.50±10.4 59.3±3.5 26.1 0.1-124.0

1-2000 г.; II-2003 г.

В таблице 11 и на рисунке 15 представлены результаты картирования (^ТЬб для удельной активности ТПДО.

Таблица 11. Обозначения ОТЬв, выявленных в популяции РИЛ 1ТМ1 для активности ТПДО

Признак Ассоциированный QTL

Удельная активность ТПДО QDsr.ipk- 7D; QDsr.ipk-4A; QDsr.ipkSD; QDsr. ipk-бЛ

Обозначения даны в соответствии с рекомендациями Каталога генных символов (Mcintosh et al., 1998).

OOflMiO

оияал-ю

QDs ifih-вА

Ol.lf l-k fc-'S CO

£> Уют «до мен от О паты-as

Укдежкомж от с шпатам & W7084

L003.0

OD> LOD>20(<3I1

О 1> LOIK2.0

Облает* ICMiy

Рисунок 16. Локусы количественных признаков, выявленные на хромосомах 4А, 50, 6А и 70 для активности ТПДО в популяции РИЛ 1ТМ1 в контрастных условиях выращивания.

Для удельной активности дисульфидредуктазы было выявлено четыре ОТЬв различного уровня достоверности. Наиболее достоверными были локусы, проявившиеся в благоприятных условиях первой повторности. Это

локус в хромосоме 7D вблизи маркера Xfba204a (LOD > 3.0), в хромосоме 4А вблизи маркера Xksud9 (LOD < 3.0, но > 2.0) и в хромосоме 5D вблизи маркера Xfbal37 (LOD < 3.0, но > 2.0). Донором более высокой активности ТПДО в этих случаях был сорт Опата 85. Четвертый локус Xfba020 в хромосоме 6А имел невысокую достоверность (LOD < 2.0), но проявлялся в обоих повторностях, донором более высокой активности был Синтетик.

На этих же хромосомах и в тех же положениях ранее были маркированы локусы, ассоциированные с различными технологическими показателями качества зерна (Пшеничникова и др., 2006, 2008). В хромосоме 7D вблизи маркера Xfba204a был обнаружен общий QTL для силы муки и упругости теста с максимальной степенью влияния на фенотипическое разнообразие. В хромосомах 5D и 4А это были локусы, связанные с упругостью и силой муки, а также водопоглотительной способностью (4А), в хромосоме 6А — с диаметром частиц муки и ее удельной поверхностью. Эти данные указывают на связь между активностью ТПДО и физическими свойствами клейковины в зерне мягкой пшеницы и имеют практическое значение для поиска кандидатных генов, контролирующих процесс полимеризации запасных белков и качество клейковины.

Соотношение белковых фракций по Осборну в семенах реликтового злака Mélica turczaninowiana (Роасеае) из различных ценопопуляций Восточного Забайкалья

Данные о соотношении белковых фракций по Осборну в семенах дикого злака Mélica turczaninowiana Ohwi (перловник Турчанинова) приводятся как повод обсудить роль редуцирующих систем тиоредоксина и глутаредоксина в проявлении злаками высоких адаптационных возможностей.

По данным рисунка 17 глютелины составляли 80-90 % от суммы растворимых белков семян перловника Турчанинова.

Рисунок 17. Соотношение белковых фракций в семенах перловника Турчанинова из различных ценопопуляций Восточного Забайкалья.

Это значительно больше по сравнению с относительным содержанием глютелиновых белков у других ксерофитных злаков, распространенных в Восточном Забайкалье и других регионах страны (Якимова, 1999; Семихов и др., 2006). Относительное содержание спирторастворимых проламинов в семенах М. turczaninowiana из разных популяций и ценопопуляций колебалось от 3.3 до 7.9 % от суммы всех растворимых белков (рис. 17).

Соотношение белковых фракций в семенах М. turczaninowiana, а именно низкое (10-20 %) суммарное содержание водо-, соле- и спирторастворимых белков, и очень высокое (до 80-90 %) содержание труднорастворимых глютелинов характерно для древних родов семейства Роасеа, что согласуется с существующим мнением (Семенова, 2007) о реликтовом происхождении М. turczaninowiana.

Наибольшие различия в содержании суммарного белка и относительном содержании отдельных белковых фракций наблюдали в семенах из урочищ "Ангаихата" и "Ингода". Место сбора семян в популяции "Ингода" отличалось затененностью и высокой влажностью почвы. Территория урочища "Ангаихата", располагающаяся в зоне горных степей Даурии Олонской более южная, характеризуется меньшим количеством осадков и крайней неравномерностью их выпадения по сезонам и годам.

В семенах из популяции "Ингода" было обнаружено наибольшее количество суммарного растворимого белка, наибольшее относительное содержание глютелинов (90 %) и самое низкое относительное содержание проламинов (3.3 % по сравнению с 7.9 % в семенах из популяции "Ангаихата") (рис. 17).

Наши данные поддерживают гипотезу В.Ф. Семихова об исключительно важной адаптивной роли спирторастворимых проламинов у злаков. Специфическую адаптивную функцию этих белков связывают с тем, что они легко гидролизуются и в первую очередь расходуются на прорастание. Быстрая утилизация спирторастворимых проламинов при прорастании связана с тем, что эти мономерные белки имеют только внутримолекулярные дисульфидные связи. Способствует быстрой деградации проламинов при прорастании редуцирующая система тиоредоксина h (Kobrehel et al., 1992; Lozano et al., 1996). Таким образом, вероятно, редуцирующая система тиоредоксина h вовлечена в адаптационный механизм, позволивший злакам стать истинно космополитическим семейством. Поскольку запасные белки эволюционно древних злаков преимущественно представлены глютелинами, логично предположить, что белки, подобные ТПДО, также как и тиоредоксины, играют важную роль в адаптации злаков и их распространении на огромных пространствах планеты.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основную сложность в поиске путей направленной регуляции качества клейковины на уровне генотипа представляет высокая вариабельность ее физических свойств в меняющихся условиях среды. В наших экспериментах

при выращивании одних и тех же сортов пшеницы в условиях Иркутска и Краснодара наблюдалась высокая внутрисортовая вариабельность физических свойств теста и низкая вариабельность содержания белка и клейковины. Выращивание сортов пшеницы кубанской селекции в условиях Сибири приводило к существенному (в 2-9 раз) повышению разжижения теста при незначительных изменениях параметра "содержание клейковины". Сорта, выращенные в Иркутске, имели значения показателя ИДК-1 от 85 до 100 единиц, что характерно для слабых пшениц. В условиях Краснодара те же сорта сформировали сильную клейковину (ИДК-1 от 50 до 80 единиц). Рекомбинантные линии популяции ITMI в условиях жаркого и засушливого лета в 2003 г сформировали более упругую клейковину, чем в комфортных условиях оптимальных температур и достаточном водообеспечении в 2000 г. Эти данные хорошо согласуются с существующим мнением (Lemelin et al., 2005), что вариабельность молекулярных размеров глютениновых полимеров, определяющих качество зерна, в большей степени зависит от физиологических факторов, обусловленных нестабильностью условий среды во время созревания зерновки, и в меньшей — от вариабельности количества субъединиц глютенина.

Решающая роль межмолекулярных дисульфидных связей в формировании качества клейковины предполагает зависимость её физических свойств от различных клеточных редокс агентов, влияющих на интенсивность полимеризации запасных белков через регуляцию их SS/SH статуса.

Мы показали, что в созревающей зерновке пшеницы функционируют ферменты, подобные тиол:кислород оксидоредуктазам и тиол:протеин-дисульфид оксидоредуктазам, известным для животных тканей. Тиол:кислород оксидоредуктаза катализирует окисление непосредственно SH групп уксуснорастворимых запасных белков (представленных в основном низкомолекулярным глютенином), а также низкомолекулярных тиоловых соединений, например, GSH. Последняя реакция в зерновке пшеницы может приводить к образованию окисленного глутатиона, что защищает лабильные белковые SH группы от глутатионилирования и последующего ингибирования полимеризации запасных белков. Перекись водорода, образующаяся наряду с дисульфидом в результате реакции, катализируемой тиолоксидазой, в свою очередь, способна окислять SH группы остатков цистеина (Moller, 2007). Для группы сортов с более высоким уровнем тиолоксидазной активности в период созревания и в зрелом зерне были характерны лучшие фаринографические показатели - более высокое время образования и устойчивости теста, высокая валориметрическая оценка и низкое разжижение теста. Это свидетельствует о взаимосвязи между уровнем тиолоксидазной активности в клетках зерновки и конечным технологическим качеством клейковины.

Влияние на реологические параметры клейковины эндогенной липоксигеназной активности зависит от ее уровня. Превышение некоего оптимального уровня активности липоксигеназы может привести к

ослаблению клейковины. Механизмы влияния на реологию теста продуктов липоксигеназного пути не поняты до конца и, по-видимому, не сводятся только к окислению белковых SH групп, как принято считать.

Из двух основных редуцирующих систем клетки на начало наших исследований в зерновке пшеницы была изучена система тиоредоксина А. В нашей работе впервые была выделена и очищена до электрофоретической гомогенности GSH протеиндисульфид оксидоредуктаза (ТПДО), которую на основании изучения ее специфичности и ингибиторного анализа, можно отнести к глутаредоксин подобным белкам суперсемейства тиоловых оксидоредуктаз.

В условиях in vitro добавление ТПДО в 4 раза повышало скорость редукции SS связей уксуснорастворимых глютениновых белков и снижало показатели агрегации этих белков. Добавление экзогенной ТПДО к муке разнокачественных сортов пшеницы приводило к повышению растяжимости теста. Активность эндогенной ТПДО положительно коррелировала с разжижением теста и отрицательно - с устойчивостью теста.

Изменение реологических параметров всегда связано с изменением структурного состояния белков. Характер влияния дисульфидредуктазы на реологические параметры клейковины показывает, что фермент катализирует восстановление межмолекулярных SS связей глютенина, следовательно, функционирование этого фермента in vivo может влиять на формирование белкового матрикса в созревающей зерновке пшеницы и конечное технологическое качество клейковины.

Косвенным подтверждением этому служит проведенное с помощью рекомбинантных инбредных линий 1TMI картирующей популяции картирование уровня активности эндогенной ТПДО, которое обнаружило, что положение на хромосомах локусов количественных признаков, ассоциированных с активностью дисульфидредуктазы, совпало с положением локусов, ассоциированных с физическими свойствами теста -силой муки, упругостью, водопоглотительной способностью.

Высокая активность дисульфидредуктазы в прорастающей зерновке предполагает, что этот фермент наряду с тиоредоксином h подготавливает протеолитическую деградацию запасных белков и, следовательно, так же как и тиоредоксин h , необходим для успешного развития и адаптации проростка на ранних стадиях развития. При этом редуцирующая система тиоредоксина способствует быстрой деградации глиадинов при прорастании, а физиологическая роль дисульфидредуктазы, вероятно, состоит в редукции SS связей полимерных белков.

Учитывая высокое относительное содержание глютелинов в семенах злаков, принадлежащих к филогенетически древним таксонам, можно предположить важную роль редуцирующих систем, подобных системе ТПДО, в адаптации реликтовых злаков на ранних стадиях развития.

Влияние редуцирующей системы ТПДО на запасные белки в созревающей зерновке пшеницы отличается от влияния редуцирующей системы тиоредоксина А. По данным ряда авторов (Kobrehel et al., 1992,

Shewry and Tatham, 1997; Buchanan, 2002 Angioloni and Rosa, 2007) тиоредоксины специфичны только в отношении внутримолекулярных SS связей, и либо не оказывают никакого действия на реологию теста, либо укрепляют его в результате переорганизации SS связей в полимерных белках. К тому же в зерновке пшеницы уровень накопления НАДФН-зависимой тиоредоксинредуктазы, необходимой для регенерации тиоредоксина, очень низкий (Serrato et al., 2002). Содержание же эндогенного свободного GSH в зерновке пшеницы достаточно высоко, чтобы обеспечить эффективность функционирования редуцирующей системы с участием ТПДО (Hüttner and Wieser, 2001; Li et al., 2004).

Основываясь на литературных источниках и результатах собственных исследований, мы предлагаем схему, демонстрирующую основные этапы процесса полимеризации глютениновых субъединиц и роль редокс окружения в этом процессе (рис. 18).

Образование межмолекулярных SS связей и белковых агрегатов 1-го уровня, представляющих разветвленные структуры глютенина, начинается сразу после синтеза высоко- (HMW-GS) и низкомолекулярных (LMW-GS) субъединиц глютенина в эндоплазматическом ретикулуме, продолжается в транспортных органеллах и в белковых телах. Этот процесс длится примерно три недели, с 7-10-го по 30-32-й день после цветения, зависит от генетически детерминированного состава HMW-GS и LMW-GS, а также от содержания низкомолекулярных редокс агентов (GSH/GSSG и аскорбат/дегидроаскорбат) и ферментов, поддерживающих пул восстановленного GSH и аскорбата (глутатион редуктаза, дегидроаскорбат редуктаза). В нашей работе показано, что на этой стадии наряду с низкомолекулярными редокс агентами в зерновке пшеницы функционирует лабильная система оксидоредуктаз, катализирующих тиол-дисульфидный метаболизм в запасных белках. Баланс активностей этих ферментов меняется в разных условиях среды, что приводит к различиям в молекулярных размерах белковых полимеров, сформировавшихся в этот период.

Последующее образование белковых агрегатов второго уровня (нерастворимых полимеров глютенина) зависит от результатов первого этапа агрегации, от состава агрегатов первого уровня и редокс окружения клеток эндосперма, и совпадает со стадией десикации зерна, поэтому влияние редокс окружения на этом этапе снижается.

Формирование клейковины при замесе теста на 60-80 % зависит от размеров белковых полимеров, сформировавшихся на втором этапе агрегации и от суммарного редокс SS/SH статуса муки.

Таким образом, по-видимому, наибольшее влияние на формирование клейковины редокс окружение оказывает на первом этапе агрегации белков при образовании разветвленного глютенина, а также непосредственно в процессе замеса теста, когда белковые полимеры, сформировавшиеся в каждой клетке эндосперма, объединяются в единую структуру — белковую решетку клейковины.

С 7-10 дня после цветения

[До 30-32

дня после цветения

С 32-35 дня после цветения ло полной спелости_

Эндоплазматичсский ретину лум (ЭПР)

ЭПР, аппарат Гольджи, белковые тела

Белковые тела, глютениновые ча

I Полная спелость

Мука

и с\

Синтез, ко- и посттрансляционный фолдинг HMW-GS С и LMW-GS

Протеин дисульфид Изомераза (ПДИ) Пептидил-пролил-цис-транс-изомераза Шаперон BiP

Образование агрегатов 1-ого уровня

(разветвленный глютенин) (Hamer, van Vliet, 2000)

J>

Состав HMW-GS и LMW-GS

GSHA3SSG

аскорбат/

дегидроаскорбат

липоксигеназа

тиолоксидаза

редуцирующая

система ТПДО

Образование агрегатов 2-ого уровня

(нерастворимые полимеры С глютенина)

Состав агрегатов 1-го уровня

GSH/GSSG

аскорбат/

дегидроаскорбат

липоксигеназа

тиолоксидаза

редуцирующая

система ТПДО

60-80 % стабильности хлебопекарного качества

(Lemelin et at, 2005)

Состав агрегатов 2-го уровня

GSH/3SSG аскорбат/ дегидроаскорбат липоксигеназа тиолоксидаза редуцирующая система ТПДО

Рисунок 18. Роль редокс окружения в образовании нерастворимых полимеров глютенина и формировании реологических свойств клейковины (НМ\У-С8 -высокомолекулярные субъединицы глютенина; Ь\Г\У-С8 — низкомолекулярные субъединицы глютенина).

выводы

1. В созревающей зерновке пшеницы одновременно присутствуют тиол:кислород оксидоредуктаза (ТО, КФ 1.8.3.2) и ОБН-зависимая протеиндисульфид оксидоредуктаза (ТПДО, КФ 1.8.4.2), катализирующие соответственно образование и распад дисульфидных связей в запасных белках. Синхронность изменения соотношений Бв/БН и ТО/ТПДО в созревающей зерновке свидетельствует, что ферменты регулируют БЗ/БН статус белков зерновки.

2. Уровень активности тиолоксидазы, дисульфидредуктазы и липоксигеназы в созревающем и зрелом зерне, так же как и физические свойства клейковины, характеризуются высокой модифихационной изменчивостью, что показано на сортах и межсортовых замещенных линиях мягкой пшеницы, выращенных в разных почвенно-климатических условиях.

3. Баланс ферментативных активностей, регулирующих 8Б/8Н статус запасных белков в созревающей зерновке, влияет на формирование физических свойств клейковины. В изученных популяциях пшеницы активность тиолоксидазы положительно, активность дисульфидредуктазы и липоксигеназы отрицательно коррелировали с физическими свойствами клейковины. Генотипы с низким отношением тиолоксидаза/ дисульфидредуктаза имели низкие показатели технологического качества.

4. 08Н-зависимая протеиндисульфид оксидоредуктаза зерновки пшеницы имеет молекулярную массу нативной молекулы около 167 кДа, состоит из двух субъединиц — около 73 и 77 кДа, по энзиматическим характеристикам имеет сходство с протеиндисульфид оксидоредуктазами из животных тканей и, вероятно, принадлежит к суперсемейству тиоловых оксидоредуктаз.

5. Дисульфидредуктаза зерна пшеницы является глутаредоксин подобным белком и функционирует в редуцирующей системе НАДФН/глутатион редуктаза/ОБН/ТПДО.

6. Экзогенная дисульфидредуктаза из зерновки пшеницы снижает показатель агрегации глютениновых белков на 25-30 % и увеличивает растяжимость теста на 11-50 % у разнокачественных сортов. Это указывает на специфичность ТПДО к межмолекулярным ББ связям глютенина.

7. Локусы количественных признаков (ОТЬб), ассоциированные с активностью дисульфидредуктазы в зерне мягкой пшеницы, картированы на хромосомах 4А, 50, 6А и 70. Положение этих локусов на хромосомах совпало с положением локусов, ассоциированных с показателями физических свойств клейковины.

8. Высокая активность дисульфидредуктазы в прорастающей зерновке свидетельствует об участии фермента в подготовке протеолитической деградации глютениновых агрегатов при прорастании.

9. Обнаружено очень высокое содержание глютелинов в семенах дикого злака перловник Турчанинова (Роасеае) (до 80-90 % от белкового комплекса семян), что характерно для представителей древних таксонов.

Гипотетически, редуцирующие системы, подобные ТПДО, играют важную роль в прорастании семян злаков из филогенетически древних таксонов. 10. Экспериментально подтверждена гипотеза, что модификационная изменчивость показателей качества клейковины обусловлена функционированием в созревающей зерновке пшеницы эндогенных ферментов тиол-дисульфидного метаболизма. В обобщающей схеме показано, что в созревающей зерновке ферменты вовлечены в процесс полимеризации глютенина при образовании разветвленного глютенина и нерастворимых полимеров клейковины. Эндогенные оксидоредуктазы формируют суммарный SS/SH статус муки и влияют на образование клейковины при замесе теста.

Список основных работ по теме диссертации Публикации в изданиях из перечня ВАК

1. Труфанов В.А., Кичатинова C.B. Дисульфидредуктазная и тиолоксидазная активности созревающих семян пшеницы // Прикладная биохимия и микробиология. 1989. Т. 25. С. 361-367.

2. Труфанов В.А., Кичатинова C.B.. Шатилов В.Р., Кретович ВЛ. Ферменты тил-дисульфидного обмена белков (обзор) // Прикладная биохимия и микробиология. 1990. Т. 26(1), С. 3-10.

3. Кичатинова C.B.. Труфанов В.А., Пермяков A.B. Тиолоксидазная и дисульфидредуктазная активности клеточных органелл зерновки пшеницы // Прикладная биохимия и микробиология. 1993. Т. 29(3), С. 412-417.

4. Пермяков A.B., Кичатинова C.B.. Труфанов В.А. Дисульфидредуктазная и тиолоксидазная активности в зависимости от содержания низкомолекулярных тиолов в зерновке пшеницы // Прикладная биохимия и микробиология. 1993. Т. 29(5) С. 728-734.

5. Труфанов В.А., Кичатинова C.B.. Пермяков A.B. Ферменты тиол-дисульфидного обмена и их действие на белки клейковины // Прикладная биохимия и микробиология. 1999. Т. 35(2). С. 219-222.

6. Труфанов В.А., Кичатинова C.B.. Пермяков A.B., Казарцева А.Т. Тиолоксидазная и дисульфидредуктазная активности зерна пшениц Triticum aestivum L. и их технологические свойства // Прикладная биохимия и микробиология. 2000. Т. 36(1), С. 76-79.

7. Осипова C.B.. Пермяков A.B., Митрофанова Т.Н., Дударова Л.В., Труфанов В.А. Характеристика тиол:протеиндисульфнд оксидоредуктазы из зерна пшеницы Triticum aestivum L. II Биохимия, 2005. T. 70, вып. 8. С. 1130-1136.

8. Osipova S.V.. Permyakov A.V., Mitrofanova T.N., Trufanov V.A., Ermakova M F., Chistyakova A.K., and Pshenichnikova T.A. Thiol:proteindisulphide oxidoreduetase of wheat grain: Activity in maturing wheat kernels, and relationship with rheological properties of dough // Cereal Research Communication. 2007. 35(3). P. 1477-1486.

9. Осипова C.B.. Пермяков A.B., Митрофанова Т.Н., Труфанов. В.А. Способ получения тиол:протеиндисульфид оксидоредуктазы из растительного сырья // Пат. 2310648 Российская Федерация, МПК(51) C12N 9/00 C12N 9/02. № 2004125010/13; заявл. 16.08.2004; опубл. 20.11.2007, Бюл. № 32.

10. Пшеничникова Т А., Осипова C.B.. Пермякова М.Д., Митрофанова Т.Н., Лохвассер У., Рёдер М., Бернер А. Картирование локусов количественных признаков (QTL) ассоциированных с активностью дисульфидредуктазы и липоксигеназы в зерне мягкой пшеницы Triticum aestivum L. Генетика. 2008. T. 44(5). С. 654-662.

11. Osipova S.. Dudareva L., Bondarenko N., Nasarova A., Sokolova N., Obolkina L., Timoshkin O. Temporal variation in fatty acid composition of Ulotrix zonata (Chlorophyta) from ice benthic communities of Lake Baikal // Phycologia, 2009. V. 48(2), P. 130-135.

12. Бондаревич E.A., Осипова C.B. Высокое содержание глютелинов в семенах реликтового злака Melica turczaninowiana (Poaccac) // Журнал СФУ. Биология. 2010. Т.3(4). С. 384-390.

13. Осипова C.B.. Пермякова М.Д., Пшеничникова Т.А., Ермакова М.Ф. Активность липоксигеназы и глутатион-зависимой протеиндисульфид оксидоредуктазы в зерновках межсортовых замещенных линий пшеницы Triticum aeslivum L. с различным качеством клейковины // Физиология и биохимия культурных растений. 2011. (принята к печати).

14. Osipova S.V.. Pcrmyakov A.V., Permyakova M.D., Davydov V.A., Pshenichnikova T.A., Börner A. Tolerance of prolonged drought among a set of bread wheat chromosome substitution lines // Cereal Research Communication. 2011. V. 39(3).

15. Osipova S.. Permyakov A., Permyakova M., Pshenichnikova T., Börner A. Leaf dehydroascorbate reductase and catalase activity is associated with soil drought tolerance in bread wheat // Acta Physiologiae Plantarum (принята к печати).

Материалы международных конференций

16. Trufanov V.A., Osipova S.V.. Permyakova M.D., Mitrofanova T.N., Pshenichnikova T.A., Maystrenko O.I. // SH/SS metabolism enzyme activity and gluten quality of wheat lines with intervarietal substitution of 1 and 6 homoeoloqical groups of chromosomes II EWAC Newsletter. Proc. 11-th EWAC Conference, Novosibirsk, 2001, P. 176-180 (Ed.A.J.Worland and T. A. Pshenichnikova).

17. Pshenichnikova T.A., Ermakova M.F., Popova R.K., Osipova S.V. Trufanov V.A. Development and use of precise genetic stocks for study of technological parameters of grain in parameters of grain in common wheat // EWAC Newsletter. Proc. 12-th EWAC Conference. Norwich (UK). 2003. P. 21-24 (Ed. A.Böncr, J.W.Snape and C.N.Law).

18. Osipova S.V.. Permyakov A.V., Mitrofanova T.N., Trufanov V.A., Ermakova M.F., Chistyakova A.K., and Pshenichnikova T.A. The role of disulfide-reductase in determination of technological properties of grain in Triticum aeslivum L. // EWAC Newsletter. 2006. Proc. 13-th EWAC Conference 27 June - 1 July 2005, Prague (Czech Republic). P. 106-108 (Ed. A.Börner, K.Pankova and J.W.Snape).

19. Ermakova M.F., Pshenichnikova T.A., Shchukina L.V., Osipova S.V.. Mitrofanova T.N., Börner A., Lohwasser U., Röder M. The history of the development of precise genetic stocks of bread wheat in Novosibirsk and their application for investigation of grain quality // EWAC Newsletter. Proc. 14-th EWAC Conference 6-10 May 2007, Istanbul, Turkey, 2008. P. 12-17 (Ed. A.Börner and J.W. Snape).

20. Ermakova M.F., Pshenichnikova T.A., Chistyakova A.K., Shchukina L.V., Osipova S.V.. Röder M., Börner A. From cytogenetic to molecular approach and backwards: investigations of grain quality in bread wheat. Proc. 11-th International Wheat Genetics Symposium, Brisbane 24-August 2008 (ed. by R.Appels, R.Eastwood, E.Lagudah, P.Langridge, M.Mackay, L.McIntyre, P.Sharp) Sydney, Sydney University Press, paper № 244.

21. Osipova S.V.. Bondarenko N.A., Obolkina L.A, Permyakov A.P, Dudareva L.V., Timoshkin O.A. Communities in the ultrapure ice of Lake Baikal: distinctive characteristics and adaptive strategies of the inhabitants // Proc. 20th IAHR Intern. Symp. on Ice, 14-17 June 2010, Lahti, Finland (ISBN 978-952-10-5979-7), paper № 40.

22. Osipova S.V.. Permyakov A.V., Permyakova M D., Kovalenkova M.V., Pshenichnikova T.A., Börner A. Leaf dehydroascorbate reductase and catalase activity is associated with drought tolerance in bread wheat // The Intern. Conf "Plant Genetics, Genomics and Biotechnology" (PlantGen 2010), Novosibirsk, Russia, June 7-10,2010. p. 72.

Сборники статей и ежегодники

23. В.А.Труфанов, С.В.Кичатинова. И.Н.Трофимова Дисульфидредуктазная и сульфгидрилоксидазная активности пшеницы // Физиология роста и развития растений в условиях Сибири. Иркутск: СИФИБР СО АН СССР. 1985. С.54-57.

24. С.В.Кичатинова. В.А.Труфанов. К вопросу о субклеточной локализации ферментов тиол-дисульфидного обмена // Физиология роста и развития растений в условиях Сибири. Иркутск: СИФИБР СО АН СССР. 1987. С. 54-56.

25. Osipova S.V.. Trufanov V.A., Pshenichnikova Т.А. Disulfide reductase activity and gluten quality in common wheat lines with intervarietal substitution for chromosomes of homoeological groups 1 and 6 // Annual Wheat Newsletter. 2002. V. 48. P. 147-148.

26. Osipova S.V.. Mitrofanova T.N., Permyakov A.V., Trufanov V.A. Thiol:protein disulfide Oxidoreductase (EC 1.8.4.2) in wheat caiyopses. A. Substrate specificity of a homogenous preparation//Annual WheatNewletter. 2004. V. 50. P. 141-142.

27. Osipova S.V.. Permyakov A.V., Mitrofanova T.N., Trufanov V.A. Thiol:protein disulfide oxidoreductase (EC 1.8.4.2) in wheat caryopses. B. Enzymatic characteristics// Annual Wheat Newletter. 2004. V. 50. P. 143-144.

28. Osipova S.V.. A.V Permyakov., T.N. Mitrofanova., V.A. Trufanov. Thiol:protein disulfide oxidoreductase (EC 1.8.4.2) in wheat caryopses. C. Impact on aggregation of wheat storage proteins // Annual Wheat Newletter. 2004. V. 50. P. 144-145.

29. Osipova S.V.. Permyakov A.V., Mitrofanova T.N., Pshenichnikova T.A., Ermakova M.F., Chistyakova A.K. Impact of disulfide reductase from wheat caryopsis on certain technological characteristics of wheat flour and dough//Annual Wheat Newletter. 2005. V. 51. P. 126-127.

30. Permyakov A.V., Osipova S.V.. Mitrovanova T.N. Isofoims of glutathione reductase in wheat grains Triticum aeslivum L // Annual Wheat Newletter. 2005. V. 51. P. 127-128.

Список сокращений БСА — бычий сывороточный альбумин ДЭАЭ - диэтиламиноэтил ДЦС-Na - додецил сульфат натрия

ИДК-1 - прибор, условные единицы которого характеризуют силу пшеницы ЛОГ - липоксигеназа ТО - тиолоксидаза

ТПДО - тиол:протеиндисульфид оксидоредуктаза

РИЛ — рскомбинантные ипбредные лилии

ЗЛ - межсортовые замещенные линии

GSH — восстановленный глутатион

QTL(s) - локус(ы) количественных признаков

Подписано к печати 16.03.2011 г. Формат 60*84/16. Объем 2,3 п.л. Тираж 120 экз. Заказ № 503. Издательство Института географии им. В.Б. Сочавы СО РАН 664033 г. Иркутск, ул. Улан-Баторская, 1

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Осипова, Светлана Владимировна

Список используемых сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Характеристика белков пшеницы.

Классификация белков эндосперма пшеницы.

Полимерные белки:

1.1.1. Высокомолекулярные субъединицы глютенина (НМ\¥-СЗ).

1.1.2. Низкомолекулярные субъединицы глютенина (ЬМ\¥-03).

1.1.3. Тритицины.

1.1.4. Высокомолекулярные альбумины.

1.1.5. Образование глютениновых полимеров и взаимосвязь с качеством клейковины.

Мономерные белки:

1.1.6. Глиадины.

1.1.7. Альбумины и глобулины.

1.1.8. Некоторые аспекты эволюции белков семян злаков.

1.1.9. Синтез запасных белков в созревающей зерновке и отложение в запас.

1.2. Ферменты, катализирующие фолдинг белков в полости ЭПР.

1.2.1. НАДФН протеин дисульфид изомераза.

1.2.2. Пептидилпролил цис-транс- изомераза.

1.2.3. Связывающий белок В1Р.

1.3. Характеристика факторов, определяющих редокс ЗН/БЭ баланс в клетках зерновки пшеницы.

1.3.1. Низкомолекулярные редокс БН/ЗЗ агенты клеток эндосперма пшеницы.

1.3.2. Эндогенные оксидоредуктазы, регулирующие редокс ЗН/ЗЗ баланс в клетках зерновки пшеницы.

1.3.3.Система НАДФН/тиоредоксин редуктаза/тиоредоксины.

1.3.4. Система НАДФН/глутатион редуктаза/ОБН/глутаредоксины.

1.3.5. Липоксигеназы.

1.3.6. Влияние других редокс ферментов эндосперма пшеницы на хлебопекарные свойства муки.

1.4. Генетическое картирование признаков качества пшеницы.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Осипова, Светлана Владимировна

выводы

1. Впервые обнаружено, что в созревающей зерновке пшеницы одновременно присутствуют тиол:кислород оксидоредуктаза (ТО, КФ 1.8.3.2) и GSH-зависимая протеиндисульфид оксидоредуктаза (ТПДО, КФ 1.8.4.2), катализирующие соответственно образование и распад дисульфидных связей в запасных белках. Синхронность изменения соотношений SS/SH и ТО/ТПДО в созревающей зерновке свидетельствует, что ферменты регулируют SS/SH редокс статус белков зерновки.

2. Уровень активности тиолоксидазы, дисульфидредуктазы и липоксигеназы в созревающем и зрелом зерне, так же как и физические свойства клейковины, характеризуются высокой модификационной изменчивостью, что показано на сортах и межсортовых замещенных линиях мягкой пшеницы, выращенных в разных почвенно-климатических условиях.

3. Баланс ферментативных активностей, регулирующих SS/SH статус запасных белков в созревающей зерновке, влияет на формирование физических свойств клейковины. В изученных популяциях пшеницы активность тиолоксидазы положительно, активность дисульфидредуктазы и липоксигеназы отрицательно коррелировали с физическими свойствами клейковины. Генотипы с низким отношением тиолоксидаза/дисульфидредуктаза имели низкие показатели технологического качества.

4. GSH-зависимая протеиндисульфид оксидоредуктаза зерновки пшеницы имеет молекулярную массу нативной молекулы около 167 кДа, состоит из двух субъединиц - около 73 и 77 кДа, по энзиматическим характеристикам имеет сходство с протеиндисульфид оксидоредуктазами из животных тканей и принадлежит к суперсемейству тиоловых оксидоредуктаз.

5. Дисульфидредуктаза зерна пшеницы является глутаредоксин подобным белком и функционирует в редуцирующей системе НАДФН/глутатион редуктаза/ОЗН/ТПДО.

6. Экзогенная дисульфидредуктаза в опытах in vitro снижает показатель агрегации глютениновых белков на 25-30 % и увеличивает растяжимость теста на 11-50 % у разнокачественных сортов. Это указывает на специфичность ТПДО к межмолекулярным SS связям глютенина.

7. Локусы количественных признаков (QTL), ассоциированные с активностью дисульфидредуктазы в зерне мягкой пшеницы, картированы на хромосомах 4А, 5D, 6А и 7D. Положение этих локусов на хромосомах совпало с положением локусов, ассоциированных с показателями физических свойств клейковины.

8. Высокая активность дисульфидредуктазы в прорастающей зерновке свидетельствует об участии фермента в подготовке протеолитической деградации глютениновых агрегатов при прорастании.

9. Обнаружено очень высокое содержание глютелинов в семенах дикого злака перловник Турчанинова (Роасеае) (до 80 — 90 % от белкового комплекса семян), что характерно для представителей древних таксонов. Гипотетически, редуцирующие системы, подобные ТПДО, играют важную роль в прорастании семян злаков из филогенетически древних таксонов.

10. Экспериментально подтверждена гипотеза, что модификационная изменчивость показателей качества клейковины обусловлена функционированием в созревающей зерновке пшеницы эндогенных ферментов тиол-дисульфидного метаболизма. В обобщающей схеме показано, что в созревающей зерновке ферменты вовлечены в процесс полимеризации глютенина при образовании разветвленного глютенина и нерастворимых полимеров клейковины. Эндогенные оксидоредуктазы формируют суммарный SS/SH статус муки и влияют на образование клейковины при замесе теста.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Достоинство сортов пшеницы характеризуется их урожайностью, устойчивостью и качеством зерна, которое определяет технологическое использование зерна и его стоимость. Одной из важнейших составляющих понятия "качество зерна" является качество клейковины.

Клейковина пшеницы образуется при гидратации запасных белков эндосперма - проламинов. Разносторонние исследования этих белков выявили их чрезвычайно высокую гетерогенность и множество кооперативных взаимодействий, посредством которых белки связываются в единый полимерный агрегат, которому присущи вязкоэластичные свойства. Эти свойства, в конечном счете, выражаются в показателях качества хлеба (объем, пористость и т.п.).

Основную сложность в поиске путей направленной регуляции качества клейковины на уровне генотипа представляет высокая вариабельность ее физических свойств в меняющихся условиях среды.

Несмотря на интенсивные исследования проламинов в последние десятилетия, остается множество вопросов относительно времени и биохимии фолдинга и агрегации белков клейковины, отложения их в запас, структуры клейковинного комплекса, а также физиологической подоплеки формирования того или иного качества клейковины (Shewry and Halford, 2002; Shewry, 2009).

По общим оценкам 60-80 % стабильности параметров хлебопекарного качества обусловлены стабильностью распределения молекулярных размеров полимерных белков клейковины. По данным Lemelin et al. (2005), вариабельность распределения молекулярных размеров глютениновых полимеров в большей степени зависит от физиологических факторов, обусловленных нестабильностью условий среды во время созревания зерновки, и в меньшей - вариабельностью количества субъединиц глютенина. В наших экспериментах, при выращивании одних и тех же сортов пшеницы в условиях Иркутска и Краснодара, также наблюдалась высокая внутрисортовая вариабельность физических свойств теста и низкая вариабельность содержания белка и клейковины. Выращивание сортов пшеницы кубанской селекции в условиях Сибири приводило к существенному (в 2-9 ' раз) повышению разжижения теста при незначительных изменениях параметра "содержание клейковины". Сорта, выращенные в Иркутске, имели значения показателя ИДК-1 от 85 до 100 единиц, что характерно для слабых пшениц. В условиях Краснодара те же сорта сформировали сильную клейковину (ИДК-1 от 50 до 80 единиц). Рекомбинантные линии популяции 1ТМ1 в условиях жаркого и засушливого лета формировали более упругую клейковину, чем в комфортных условиях оптимальных температур и достаточном водообеспечении.

На начало наших исследований выяснение физиологических причин разнокачественности белковых полимеров клейковины в разных условиях среды сводилось в основном к исследованию роли белков-резидентов эндоплазматического ретикулума - протеин дисульфид изомеразы, пептидил-пролил-цис-транс-изомеразы и молекулярного шаперона связывающего белка В1Р. Однако доказательств того, что эти белки влияют на конечное технологическое качество клейковины, не было получено.

С появлением новых аналитических технологий получила неоспоримые доказательства роль межмолекулярных дисульфидных связей как главной молекулярной подоплеки реологических свойств клейковины, что предопределяет зависимость её физических свойств от различных клеточных агентов, вступающих во взаимодействие с межмолекулярными 88 связями или свободными сульфгидрильными группами белков. Мы предположили, что воздействие условий среды на формирование реологических свойств полимерного белка клейковины может быть опосредовано системой оксидоредуктаз, катализирующих ЗЭ/ЭН редокс превращения в запасных белках. Ферменты, специфичные к лабильным межмолекулярным Б8 связям глютенина и 8Н группам глютениновых субъединиц, могут регулировать 88/8Н статус белков, смещая его в ту или другую сторону, что неизбежно должно приводить к изменению структурного состояния белковой решетки, влиять на процесс полимеризации и реологические характеристики теста.

В нашей работе показано, что активность тиол:кислород оксидоредуктаз из зерновки пшеницы, приводит к окислению непосредственно SH групп уксуснорастворимых запасных белков (представленных главным образом низкомолекулярным глютенином), а также низкомолекулярных тиоловых соединений, например, GSH. Последняя реакция в зерновке пшеницы может приводить к образованию окисленного глутатиона, что защищает лабильные белковые SH группы от глутатионилирования и последующего ингибирования полимеризации запасных белков. Перекись водорода, образующаяся наряду с дисульфидом в результате реакции, катализируемой тиолоксидазой, в свою очередь, способна окислять SH группы остатков цистеина (M0ller, 2007). Для группы сортов с более высоким уровнем тиолоксидазной активности в период поздней молочной спелости (Табл. 16) были характерны лучшие фаринографические показатели: более высокое время образования и устойчивости теста, высокая валориметрическая оценка и низкое разжижение теста, что свидетельствует о взаимосвязи между уровнем тиолоксидазной активности в период созревания зерновки и конечным технологическим качеством клейковины.

Влияние на реологические параметры клейковины эндогенной липоксигеназной активности зависит от ее уровня, превышение некоего оптимального уровня активности липоксигеназы может привести к ослаблению клейковины. Механизмы влияния на реологию теста продуктов липоксигеназного пути не поняты до конца и, по-видимому, не сводятся только к окислению белковых SH групп, как принято считать. Липоксигеназа зерновки пшеницы подробно изучается как агент, окисляющий каротиноиды и влияющий на цвет муки (Simone et al., 2010).

Из двух основных редуцирующих систем клетки на начало наших исследований в зерновке пшеницы была изучена система тиоредоксина h. В нашей работе впервые была выделена и очищена до электрофоретической гомогенности глутатион-зависимая протеиндисульфид оксидоредуктаза (ТПДО), которую на основании изучения ее специфичности и ингибиторного анализа, можно отнести к глутаредоксин подобным белкам, принадлежащим к суперсемейству тиоловых оксидоредуктаз.

В условиях in vitro добавление ТПДО в 4 раза повышало скорость редукции SS связей уксуснорастворимых глютениновых белков и снижало показатели агрегации этих белков. Добавление экзогенной ТПДО к муке разнокачественных сортов пшеницы приводило к повышению растяжимости теста. Активность эндогенной ТПДО положительно коррелировала с разжижением теста и отрицательно - с устойчивостью теста.

Изменение реологических параметров всегда связано с изменением структурного состояния белков. Характер влияния дисульфидредуктазы на реологические параметры клейковины показывает, что фермент катализирует восстановление межмолекулярных SS связей глютенина, следовательно, функционирование этого фермента in vivo может приводить к ослаблению клейковины, а уровень активности эндогенной глутатион-зависимой ТПДО в процессе созревания зерновки может влиять на формирование белкового комплекса клейковины пшеницы и конечное технологическое качество.

Косвенным подтверждением этому служит проведенное с помощью рекомбинантных инбредных линий ITMI' картирующей популяции картирование уровня активности эндогенной ТПДО, которое обнаружило, что положение локусов количественных признаков, ассоциированных с активностью дисульфидредуктазы, совпало с положением локусов, ассоциированных с физическими свойствами теста - силой муки, упругостью, водопоглотительной способностью.

Высокая активность дисульфидредуктазы в прорастающей зерновке предполагает, что этот фермент наряду с тиоредоксином h подготавливает лротеолитическую деградацию запасных белков и, следовательно, так же как и тиоредоксин h , необходим для успешного развития и адаптации проростка на ранних стадиях развития. При этом редуцирующая система тиоредоксина А способствует быстрой деградации глиадинов при прорастании, а физиологическая роль дисульфидредуктазы, вероятно, состоит в редукции Б8 связей полимерных белков.

Учитывая высокое относительное содержание глютелинов в семенах злаков, принадлежащих к филогенетически древним таксонам, можно предположить важную роль редуцирующих систем, подобных системе ТПДО, в адаптации злаков на ранних стадиях развития и их распространении на огромных территориях планеты.

В редуцирующей системе ТПДО поток электронов протекает аналогично тому, как это происходит в редуцирующей системе глутаредоксина:

НАДФН —» Глутатион редуктаза —> С8Н —> ТПДО —» Мишеневый белок (Рис.40).

Т<Г^Е>:е> СУЗЫ К-82

Рисунок 40. Редуцирующая система с участием глутаредоксин-подобного белка ТПДО

Фундаментальная роль систем тиоредоксина и глутаредоксина заключается в противодействии окислительному стрессу, регуляции клеточных функций путем поддержания корректного тиолового гомеостаза и активной конформации ферментов, имеющих в активном центре свободные 8Н группы. Подобные антиоксидантные функции, по всей видимости, выполняет редуцирующая система ТПДО в созревающей зерновке.

Влияние редуцирующей системы ТПДО на запасные белки в созревающей зерновке пшеницы отличается от влияния редуцирующей системы тиоредоксина к. По данным ряда авторов (КоЬге11е1 е1 а1., 1992,

Shewry and Tatham, 1997; Buchanan, 2002 Angioloni and Rosa, 2007) тиоредоксины специфичны только в отношении внутримолекулярных SS связей, и либо не оказывают никакого действия на реологию теста, либо укрепляют его в результате переорганизации SS связей в полимерных белках. К тому же в зерновке пшеницы уровень накопления НАДФН- зависимой тиоредоксинредуктазы, необходимой для регенерации тиоредоксина, очень низкий (Serrato et al., 2002). Содержание же эндогенного свободного GSH в зерновке пшеницы достаточно высоко, чтобы обеспечить эффективность функционирования редуцирующей системы с участием ТПДО (HDttner and Wieser, 2001; Li et al., 2004)

Повышение активности дисульфидредуктазы на третьей - четвертой неделях после цветения, в период образования четвертичных структур глютенина (Abonyi et al., 2010) свидетельствует, что эндогенная ТПДО зерновки пшеницы вовлекается в процесс полимеризации запасных белков в период созревания. Достаточно высокая активность фермента в зрелой зерновке указывает, что дисульфидредуктаза участвует в создании суммарного SS/SH редокс статуса белков муки и формировании клейковины при замесе теста.

По-видимому, специфичность дисульфидредуктазы в отношении межмолекулярных SS связей или труднодоступных внутримолекулярных SS связей полимерных белков зерновки обусловлена ее конформационной лабильностью, благодаря которой повышается доступность "скрытых" и малодоступных SS связей полимерных белков эндосперма.

Анализ взаимосвязи между балансом тиолоксидазной и дисульфидредуктазной активностей и соотношением SS/SH в созревающей зерновке (от ранней молочной до полной спелости), а также распределение дисульфидредуктазной и тиолоксидазной активностей во фракциях градиента плотности сахарозы при ультрацентрифугировании свидетельствуют, что ферменты могут быть вовлечены в пострансляционную модификацию запасных белков как внутри ЭПР, так и в белковых телах.

Цитоплазматические оксидоредуктазы, вероятно, могут взаимодействовать с лабильными БН группами и Б Б связями глютениновых частиц, образованных путем слияния белковых тел.

Влияние ферментов, катализирующих БЗ/БН превращения в белках, на процесс полимеризации глютениновых субъединиц доказывают существенные корреляционные связи между соотношением ферментативных активностей и параметрами физических свойств теста по альвеографу и фаринографу, выявленные в популяциях разнокачественных пшениц, выращенных в разных климатических условиях. Например, корреляционные связи между реологическими характеристиками и соотношением ферментативных активностей: тиолоксидаза/ТПДО в популяции пшеницы кубанской и сибирской селекции (Табл. 17, 18), липоксигеназа/ТПДО - у замещенных линий Диамант 2/Новосибирская 67 и их родителей (Табл. 20). Кроме того, выявлены достоверные различия в активности ферментов у разнокачественных генотипов по критерию Стыодента (Табл. 16, 21).

На рисунке 41 приведена схема, демонстрирующая вклад различных оксидоредуктаз в создание 88/8Н редокс статуса запасных белков.

Нативные Б8 связи

СБИшротеиндисульфид оксидоредуктаза

Линолеат:кислород оксидоредуктаза Тиол: кислород оксидоредуктаза

Протеин дисульфид .изомераза

8Н группы

Спонтанное окисление термодинамически напряженные 8в связи

Рисунок 41. Ферментативная регуляция 88/8Н статуса запасных белков зерновки пшеницы.

Основываясь на литературных источниках и результатах собственных исследований, мы предлагаем схему, демонстрирующую основные этапы процесса полимеризации глютениновых субъединиц и роль редокс окружения в этом процессе (Рис. 42).

Образование межмолекулярных ББ связей и белковых агрегатов 1-ого уровня, представляющих разветвленные структуры глютенина, начинается сразу после синтеза высоко- (НМ\¥-08) и низкомолекулярных (ЬМЛУ-ОЭ) субъединиц глютенина в эндоплазматическом ретикулуме, продолжается в транспортных органеллах и в белковых телах. Этот процесс длится примерно три недели, с 7-10-го по 30-32-ой день после цветения, зависит от генетически детерминированного состава НМЛУ-С8 и ЬМ\¥-08, а также от содержания низкомолекулярных редокс агентов (ОЗНАЗЗЗО и аскорбат/дегидроаскорбат) и ферментов, поддерживающих пул восстановленного ОЭН и аскорбата (глутатион редуктаза, дегидроаскорбат редуктаза). В нашей работе показано, что на этой стадии наряду с низкомолекулярными редокс агентами в зерновке пшеницы функционирует лабильная система оксидоредуктаз, катализирующих тиол-дисульфидный метаболизм в запасных белках. Баланс активностей этих ферментов меняется в разных условиях среды, что приводит к различиям в молекулярных размерах белковых полимеров, сформировавшихся в этот период.

Последующее образование белковых агрегатов второго уровня (нерастворимых полимеров глютенина) зависит от результатов первого этапа агрегации, от молекулярной массы агрегатов первого уровня и редокс окружения клеток эндосперма, и совпадает со стадией десикации зерна, поэтому влияние редокс окружения на этом этапе снижается.

Формирование клейковины при замесе теста на 60-80 % зависит от размеров белковых полимеров, сформировавшихся на втором этапе агрегации и от суммарного редокс БЗ/ЗН статуса муки. Таким образом, по-видимому, наибольшее влияние на формирование клейковины редокс окружение оказывает на первом этапе агрегации белков при образовании

С 7-10 дня после цветения

До 30-32 дня после цветения

С 32-35 дня после цветения до полной спелости

Полная спелость

Эндоплазматический ретикулум (ЭПР)

ЭПР, аппарат Гольджи, белковые тела

Белковые тела, глютениновые частицы

Мука

Синтез, ко- и посттрансляционный фолдинг HMW-GS с и LMW-GS

Протеин дисульфид Изомераза (ПДИ) Пептидил-пролил-цис-транс-изомераза Шаперон ВІР

Образование агрегатов 1-ого уровня разветвленный глютеннн) Е (Hamer, van Vliet, 2000)

Состав HMW-GS и LMW-GS

GSH/GSSG аскорбат/ дегидроаскорбат липоксигеназа тиолоксидаза редуцирующая система ТПДО

Образование агрегатов 2-ого уровня нерастворимые полимеры I глютенина)

Состав агрегатов 1-ого уровня

GSH/GSSG аскорбат/ дегидроаскорбат липоксигеназа тиолоксидаза редуцирующая система ТПДО

60-80 % стабильности хлебопекарного качества

Lemelin et al, 2005)

GSH/GSSG аскорбат/ дегидроаскорбат липоксигеназа тиолоксидаза редуцирующая система ТПДО

Рисунок 42. Роль редокс окружения в образовании нерастворимых полимеров глютенина и формировании реологических свойств клейковины (НМ\У-08 -высокомолекулярные субъединицы глютенина; ЬМЛУ-ОБ -низкомолекулярные субъединицы глютенина) разветвленного глютенина, а также непосредственно в процессе замеса теста, когда белковые полимеры, сформировавшиеся в каждой клетке эндосперма, объединяются в единую структуру — белковую решетку клейковины.

Изучение генетических факторов, связанных с активностью ТПДО, имеет большое практическое значение для поиска кандидатных генов, которыми можно манипулировать, используя генетическую трансформацию растений, хромосомную инженерию или маркер-ассоциированную селекцию для регулирования реологических характеристик клейковины.

Использование ферментов в производстве продуктов из злаковых культур имеет всё возрастающее значение в мире, химические технологии замещаются или модифицируются с привлечением различных ферментов, создаются компании, специализирующиеся на отборе подходящих ферментных препаратов и их внедрении в производство (РаиШБ еі а1., 2009). Дисульфидредуктаза зерновки пшеницы, может иметь практическое применение как агент для коррекции хлебной муки с излишне упругой малоэластичной клейковиной или в кондитерском производстве.

Вся совокупность полученных данных служит доказательством гипотезы о том, что варьирование конечных технологических характеристик клейковины пшеницы, выращенной при флуктуациях условий среды, обусловлено лабильной системой оксидоредуктаз, катализирующих БЗ/БН редокс превращения в глютениновых субъединицах и полимерных белках зерновки. Результаты нашей работы вносят значительный вклад в познание процесса формирования полимерных белковых агрегатов в эндосперме созревающей зерновки, расширяют и углубляют понимание природы высокой вариабельности параметров качества клейковины в меняющихся условиях среды.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Осипова, Светлана Владимировна, Иркутск

1. Абдулов Н.П. Кариосистематические исследования семейства злаков//Тр. по прикл. ботанике, генетике и селекции. Прилож. 44. 1931. С.3-428.

2. Благовещенский A.B., Александрова Е.Г. Белковые комплексы семян эволюционно примитивных и продвинутых растений // Проблемы филогении высших растений / Под ред. Благовещенского A.B. и др. М.: Наука, 1974. С.7-15.

3. Благовещенский A.B., АлександроваЕ.Г. Биохимические закономерности эволюции и филогении некоторых семейств двудольных растений //Биохимические аспекты филогении высших растений/ Под ред. Благовещенского и др. М.: 1981, с.3-12.

4. Бунтина М.В. Агрегирующая способность клейковины разных сортов мягкой пшеницы // Тр. по прикл. бот., генет. и селекции. 1981. Т.70, вып. 2. С.35-38.

5. Вакар А.Б. Клейковина пшеницы. -М.:Изд-во АН ССР, 1961. 252 с.

6. Вакар А.Б. Белковый комплекс клейковины // Растительные белки и их биосинтез. М.: Наука, 1975. С.38-58.

7. Василенко И.И, Комаров В.И. Оценка качества зерна. М.:Агропромиздат, 1987. с. 207.

8. Голицын В.М. Неденатурирующий электрофорез. Фракциониование фотосинтетических пигмент-белковых комплексов и белков плазмы крови // Биохимия. 1999. №.64. С.44-51.

9. Диксон М., УэббЭ. Ферменты. М.: Мир, 1982. T.l. С.392.

10. Драгович А.Ю. Закономерности формирования биоразнообразия вида мягкой пшеницы Triricum aestivum L. по генам запасных белков //Автореферат дисс. на соискание ученой степени доктора биол. наук. Москва. 2008. С.39.

11. Егоров Ц.А., Одинцова Т.Н., Мусолямов А.Х. Определение дисульфидных связей в глиадине у-46 // Биохимия. 1999. Т.64. С.354-357.

12. Кичатинова C.B. Ферменты тиол-дисульфидного обмена и их роль в формировании белкового комплекса зерновки пшеницы: Дисс. на соискание ученой степени канд. биол. наук. Иркутск. 1997. 148 с.

13. Колесниченко A.B., Побежимова Т.П., Войников В.К. Характеристика белков низкотемпературного стресса растений //Физиология растений. 2000. Т. 47. С. 624-630.

14. Конарев В.Г. Белки пшеницы. М.: Колос, 1980. -351 с.

15. Кретоеич В.Л. Биохимия зерна и хлеба // М.:Изд-во АН СССР, 1958. 175 с.

16. Кретоеич В.Л., Вакар А.Б. Проблемы качества белка зерновых культур // Труды ВНИИЗ. 1967. Вып.58. С.5-22.

17. Кретоеич В.Л., Вакар А.Б. Роль водородных и дисульфидных связей в структуре биополимеров зерна// Сельскохозяйственная биология. 1974. Т. 9. С.175-186.

18. Кретоеич В.Л., Жмакина O.A. О природе связей в клейковине // Докл. АН СССР. 1978. Т.238. № 4. С.985-987.

19. Кретоеич В.Л. Усвоение и метаболизм азота у растений. М. 1987.

20. Кретоеич В.Л. Биохимия зерна и хлеба. М.: Наука, 1991. -133 с.

21. Кузнегре А.Н., Труфанов В.А. Тиол:протеиндисульфид оксидоредуктазная активность созревающих семян пшеницы //Изв. СО АН СССР, сер. биол. 1981. Т.З. С.86-89.

22. Кузнецов В.В., Шевякоеа H.H. Пролин при стрессе: биологическая роль, метаболизм, регуляция//Физиология растений. 1999. Т.46. С.321-326.

23. Майстренко О.И., Трошина A.B., Палъчикова Г.М., Лбова М.И. Внутрисортовая изменчивость мягкой пшеницы по содержанию и качеству клейковины//Весник с-х науки. 1965. №8. С.118-123.

24. Мельникова Н.В., Митрофанова О.П., Ляпунова O.A., Кудрявцев A.M. Мировое разнообразие твердой пшеницы (Triticum durum Desf.) по аллелям глиадинкодирующих локусов// Генетика. 2010. Т.46. С.51-57.

25. Методика государственного сортоиспытания сельскохозяйственных культур. М., 1988.

26. Осборн Т.Е. Растительные белки. -M-JI: Биомедгиз, 1935. 219 с.

27. Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В. Редокс-регуляция клеточных функций // Биохимия. 2007. Т.72. С. 158-174.

28. Павлов А.Н. Накопление белка в зерне пшеницы и кукурузы. М., Наука, 1967. 339с.

29. Пермякова М.Д. Роль липоксигеназы в определении качества пшеницы и физиолого-генетические аспекты регуляции ее активности. Дисс. на соиск. уч. ст. канд. биол. наук. Иркутск. 2007. 147с.

30. Пермякова М.Д., Труфанов В.А., Пшеничникова Т.А., Ермакова М.Ф. Роль липоксигеназы в определении качества зерна пшеницы // Прикл. биохим. и микробиол. 2010. Т. 46. С. 96-102.

31. Плиев Б.К., Гурвиц Б.Я. Структура и функции пептидилпролил-г/ио /иранс-изомераз // Биохимия. 1999. т.64. С.883-898.

32. Попов Е.М., Демин В.В., Шибанова Е.Д. Проблема белка. Т.2. Пространственное строение белка. М.: Наука, 1996. 478 с.

33. Пшеничникова Т.А., Майстренко О.И. Изучение ранних этапов создания замещенных линий Диамант/Новосибирская 67 по экспрессии генов глиадина/Генетика, 1999. Т.26. С. 965-970.

34. Пшеничникова Т.А., Ермакова М.Ф., Попова Р.К. Технологические качества зерна и муки мягкой пшеницы в линиях с межсортовымзамещением хромосом 1 и 6 гомеологичных групп // С.-х. Биол. 2006. №1. С.57-63.

35. Пшеничникова Т.А., Ермакова М.Ф., Чистякова Ф.Л.,Щукина JI.B.,, Бёрнер А., Рёдер М. Молекулярное картирование локусов, связанное с показателями качества зерна мягкой пшеницы // С.-х. Биология. 2006. №5. С.41-47.

36. Свердлов Е.Д. Взгляд на жизнь через окно генома. Т.1. Москва, Наука. 2009.

37. Семенова Г.П. Редкие и исчезающие виды флоры Сибири: биология, охрана. Н., Принтинг. 2007. 399 с. 525 с.

38. Семихов В.Ф. Роль проламинов в эволюции злаков // Ботанический журнал. 1980. Т.65. С.1766-1771.

39. Семихов В.Ф. Спирторастворимые белки семян, их адаптивная роль в эволюции и распространении растений // Сиб. Экол. журн. 2006. Т. 13. № 6. С.809-824.

40. Семихов В.Ф., Тимощенко A.C., Арефьева Л.П., Новожилова O.A., Прусаков А.Н., Харченко П.Н. Адаптивный потенциал злаков в интродукции растений. Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН, 2006.

41. Тимощенко А. С., Семихов В.Ф., Харченко П.Н. Возможность адаптации однолетних злаков (на примере яровой пшеницы) к неоптимальным условиям произрастания // Доклады РАСХН. 2009. №1. С. 8-10.

42. Торчинский Ю.М. Сера в белках. —М.: Наука, 1977. 301 с.

43. Точиева Л.Б. Рынок пшеницы в 2009г/Аналитик ID Marketing, Март 2010 r./www.ID-Marketing.ru

44. Труфаное В.А. Клейковина пшеницы: проблемы качества. Новосибирск: Наука, 1994.- 165 с.

45. Труфаное В.А., Чернов А.Б. Разобщенность биосинтеза глютениновых белков с процессом формирования надмолекулярных структур клейковины // Операт. Информ. Мат-лы (Физиология роста и развития растений). 1980. Иркутск. С.55-56.

46. Уонг Чи-чен. Изомеразная и шаперонная активности протеин дисульфид изомеразы необходимы для ее функционирования как фолдазы // Биохимия. 1998. №4. с.483-489.

47. Флора Центральной Сибири /Под ред. Л.И.Малышева, Г.А.Пешковой. Н., Наука. 1979. Т. 1.536 с.

48. Флора Сибири:Ропсеае (Gramineae) / Сост. Г.А.Пешкова, О.Д.Никифорова, М.Н.Ломоносова и др. в 14 т. Н., Наука, 1990. Т.2. 361 с. 998. Т.63. С.483-490.

49. Чернов А.Б., Труфаное В.А. Влияние различных способов выделения на определяемый состав глиадиновых и глютениновых белков пшеницы // Прикл. биохим. и микробиол. 1985. Т.21. С. 665-670.

50. Цвелев Н.Н. Злаки СССР. / Н.Н. Цвелев. Л: Наука, 1976. С. 5-61, 547-556

51. Шумный В.К. Генная и хромосомная инженерия для растений. 2007. http://www.ras.ru

52. Якимова Е.П. Эколого-физиологические особенности адаптации ксерофитных злаков Забайкалья к среде обитания: Автореф. дис. к-та биол. наук. Чита. 1999. 21 с.

53. Abonyi T., Tomoskozi S., Gergely Sz., Scholz E., Lasztity D., Lasztity R. Gluten formation from flour of kernels in developing wheat grain // Cer. Res. Com. 2010. V.38(l). P.90-100.

54. Anderson O.D., Green F.C. The characterization and comparative analysis of high-molecular-weight glutenin genes from genomes A and B of a hexaploid bread wheat // Theor. Appl. Genet. 1989. V.77. P. 689-700.

55. Andrews J.L., Hay R.L., Skerritt J.H., Sutton K.H. HPLC and immunoassay-based glutenin subunit analysis: screening for dought properties in wheats grown under different environmental conditions// J.Cer.Sci. 1994. V.20. P. 203-215.

56. Anfinsen C.B. Principles that govern the folding of protein chains // Science. 1973. V.181. P.223-230.

57. Angioloni A., Rosa M.D. Effect of cysteine and mixing conditions on white/whole dough rheological properties // J. Food Engineer. 2007. V.80. P. 1823.

58. Ansorge S., Bohley P., Kirschke H. Metabolism of insulin and glucagons glutathione-insulin transhydrogenase from microsomes of rat liver//Europ.J.Biochem. 1973. V.39. P.27-35.

59. Arakawa T., Yonezawa D. Composition difference of wheat flour glutens in relation to their aggregation behaviors // Agr. Biol. Chem. 1975. V.39. P.2123-2128.

60. Arakawa T., Morishita H., Yonezawa D. Aggregation behaviors of glutens, glutenins and gliadins from various wheats // Agr. Biol. Chem. 1976. V. 40. P. 1217-1220.

61. Aussenac T., Carceller J.L. SDS-unextractable glutenin polymer formation in wheat kernels/AVheat Gluten / Eds. P.R.Shewry, A.S.Tatham. 2000. R. Soc. Chem. Cambridge.

62. Balmer Y., Koller A., delVal G., Manieri W., SchUrmann P., Buchanan B.B. Proteomics gives insight into the regulatory function of chloroplast thioredoxin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002. V.200. P. 370-375.

63. Barone R., Briante R., DAuria S., Febbraio F., Vaccaro C., Guidice L.D., Borrelli G.M., Di Fonzo N., Nucci R. Purification and Characterization of the lipoxygenase enzyme from durum wheat semolina // J. Agric. Food Chem. 1999. V.47. P. 1924-1931.

64. Bartels D., Altosaar I., Harberd N.P., Barker R.F., Thompson R.D. Molecular analysis of y-gliadin gene families at the complex Gli-1 locus of bread wheat (:T.aestivum L.) // Theoretical and Applied Genetics. 1986. V. 72. P.845-853.

65. Bauer N, Schieberle P. Model studies on the reaction parameters govering the formation of disulphide bonds in LMW-type peptides by disulphide isomerase (DSI)//Wheat gluten/Ed. Shewry P.R., Thatam A.S. 2000. Royal Society of Chemistry, UIC, P.219-222.

66. Bean S.R., Lookhart G.L. Ultrafast capillary electrophoresis analysis of cereal storage proteins and its applications to protein characterization and cultivar differentiation//;.Agric. Food Chem. 2000. V.48. P.344-353.

67. Bechtel D. W., Wilson J.D., Shewry P.R. Immunocytochemical localization of the wheat storage protein triticin in developing endosperm tissue // Cer. Chem. 1991. V.68. P.573-577.

68. Bechtel D.B., Wilson J.D. Endosperm structural changes in wheat during drying of maturing caryopses // Cer.Chem. 2005. V.82. P.385-389.

69. Beckwith A.C., Nielsen H.C., Wall J.S., Huebner F.R. Isolation and characterization of a high-molecular-weight protein from wheat gliadin// Cereal Chemistry. 1966. V.43. P.14-28.

70. Belton P.S., Colquhoum I.J., Field J.M., Grant A., Shewry P.R.Tatham A.S., Wellner N. FTIP and NMR studies on the hydration of a high Mr subunits of glutenin//Int. J.Biol. Macromol. 1995.V. 17.P.74-80.

71. Bekkers A.C., de Boef E., van Dijk A.A., Hamer R.J. The central domain of high molecular weight glutenin subunits is water-soluble//J.Cereal Sci. 1999.V. 29.P.109-112.

72. Belton P.S. On the elasticity of wheat gluten // J.Cereal Sci. 1999. V.29. P. 103107.

73. Belton P.S. New approaches to study the molecular basis of the mechanical properties of gluten// J. Cer.Sci. 2005. V.41. P. 203-211.

74. Benedettelli S., Margiotta B., Porceddu E., Ciaffi M., Lafiandra D. Effect of the lack of proteins controlled by genes at the Gli-Dl/Glu-DS loci on the breadmaking quality of wheat// J. Cer.Sci. 1992. V.16. P.69-79.

75. Benmoussa M., Vezina L.-P., Page M., Yelle S., Laberge S. Genetic polymorphism in low-molecular-weight glutenin genes from Triticum aestivum, variety Chinese Spring // Theor. Appl. Genet. 2000. Y.100. P.789-793.

76. Bietz J.A., Wall J.S. Wheat gluten subunits: Molecular weights determined by sodium sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis// Cer.Chem.1972, V. 49. P.416-430.

77. Bietz J.A., Wall J.S. Isolation and characterization of gliadin-lilce subunits from glutenins // Cereal Chem. 1973. V.50. P.537-547.

78. Bietz J.A., Huebner F.R., Sanderson J.E., Wall J.S. Wheat gliadin homology revealed through N-terminal amino acid sequence analysis // Cereal Chem. 1977. V.54. P.1070-1083.

79. Bietz J.A., Wall J.S. Identity of high molecular weight gliadin and ethanol-soluble glutenin subunits of wheat: Relation to gluten structure// Cereal Chem. 1980. V.57. P.415-421.

80. Bloksma A.H. Thiol and disulfide groups in dough reology // Cer. Chem. 1975. V. 52.P.170-183.

81. Boggini G., Ponga N.E. The breadmalcing quality and storage protein composition of Italian durum wheat//J. Cer. Sci. 1989. V.9. P. 131-138.

82. Bottomley R.C., Kearns H.F., Schofield J.D. Characterisation of wheat flour and gluten proteins using buffers containing sodium dodecyl sulphate // J.Sci. Food Agric. 1982. V.33. P.481-491.

83. Boyington J.C., Gaffney B.J., Amzel L.M. The three-dimensional structure of an arachidonic acid 15-lipoxygenase// Science, 1993. V. 260. P. 1482-1486.

84. Branlard G., Dardevet M. Diversity of grain protein and bread wheat quality. II. Correlation between high molecular subunits of glutenin and flour quality characteristics//J.Cereal. Sci. 1985. V.3. P.345-354.

85. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding //Anal.Biochem. 1976. V.72. P.248-254.

86. Branlard G., Autran J., Monneveux P. High molecular weight glutenin subunits in durum wheat (Triticum durum) // Theor. Appl. Genet. 1989. V.78. P.353-358.

87. Brash A.R. Lipoxygenase: occurrence, function, caralysis, and acquisition of substrate // J. Biol. Chem. 1999. V.274. P. 23679-23682.

88. Brites C., Carrillo M.J. Influence of high molecular weight (HMW) and low molecular weight (LMW) glutenin subunits controlled by Glu-1 and Glu-3 loci on durum wheat quality// Cer.Chem. 2001. V.78. P. 59-63.

89. Brown J. W.S., Flavell R.B. Fractionation of wheat gliadin and glutenin subunits by two-dimensional ekectrophoresis and the role of group 6 and group 2 chromosomes in gliadin synthesis // Theor. Appl. Genet. 1981.V.59. P.349-359.

90. Buchanan B.B., Kobrehel K., Yee B.C., Wong J.H., Lozano R.M., Jiao J.A., Shin S. Use of thiol redox proteins for reducing protein intramolecular disulfide bonds, for improving the quality of cereal products, dough and baked goods. EP 0863154 Al. 1998.

91. Buchanan B.B. Thioredoxin: a photosynthetic regulatory protein finds application in food improvement // J. Sci. Food Agric. 2002. V.82. P.45-52.

92. Buchanan B.B., Balmer Y. Redox regulation: A broadening horizon // Ann. Rev. Plan Biol. 2005. V.56. P. 187-220.

93. Buchanan B.B., Frick O.L. Thioredoxin and food allergy // J.All. Clin.Imm. 2007.V.119. P.513-514.

94. Buchanan B.B., del Val G., Lozano R.M., Wong J.H., Yee B.C., Frick O.L. Alleviation of the allergenic potential of airborne and contact allergents by thioredoxin // USP 6555116. 29.04.2003.

95. Bulleid N.J., Freedman R.B. Defective co-translational formation of disulphide bonds in protein disulphide-isomerase-deficient microsomes// Nature. 1988. V.335. P.649-651.

96. Caballero P.A., Gomez M., Rosell C.M. Improvement of dough rheology, bread quality and bread shelf-life by enzymes combination // J. Food Eng. 2007. V.81.P. 42-53.

97. Campbell W.P., Lee J.W., O^Brien T.P., Smart M.G. Endosperm morphology and protein body formation in developing wheat grain // Austr. J. Plant Physiol. 1981. V.8. P.5-19.

98. Carceller J.-L., Aussenac T. Accumulation and changes in molecular size distribution of polymeric proteins in developing grains of hexaploid wheats : role of the desiccation phase//Austr.J. Plant Physiol. 1999. V.26. P.301-310.

99. Carmichael D.F., Keefe N., Pace M., Dixon J.E. Interchangeable forms of thiol:protein disulfide oxidoreductase//J. Biol. Chem. 1979. V.254. P.8386-8390.

100. Carolino S., Vaez J., Irsigler A., Valente M., Rodrigues L., Fontes E. Plant BiP gene family: differential expression, stress induction and protective role against physiological stresses //Braz. J. Plant. Physiol. 2003. V.15. N.2. P. 59-66.

101. Cassidy B.G., Dvorac J., Anderson O.D. The wheat low-molecular-weight glutenin genes: characterization of six new genes and progress in understanding gene family structure// Theor. Appl. Genet. 1998. V.96.P.743-750.

102. Cazalis R., Pulido P., Aussenac T., Perez-Ruiz J.M., Cejudo F.J. Cloning and characterization of three thioredoxin h isoforms from wheat showing differential expression seeds // J. Exp. Bot. 2006. V.57. P. 2165-2172.

103. Chandler M.L., Varandani P.T. Kinetic analysis of the mechanism of insulin degradation by glutathione-insulin transhydrogenase ( thiol: protein-disulfide oxidoreductase)//Biochemistry. 1975. V. 14. P. 2107-2115.

104. Chen C.H., Bushuk W. Nature of proteins in triticale and its parental species. I. Solubility characteristics and amino acid composition of endosperm proteins // Can.J.Plant Sci. 1970. V.50. P. 9-14.

105. Chen X., Schofield J.D. Determination of protein glutathione mixed disulfides in wheat flour// J. Agric. Food Chem. 1995. V.43. P. 2362-2368.

106. Ciaffi M., Dominiei L., Tanzarella O.A., Poreeddu E. Chromosome location of genes encoding for protein disulfide isomerase (PDI) in common wheat // Proc. 9-th IWGS, Saskatoon, Saskatchewan, Canada, 2-7 Aug. 1998. P.l02-104.

107. Ciaffi M., Lee Y.-K., Tamas L., Gupta R., Skerritt R., Apples R. The low-molecular-weight glutenin subunits proteins of primitive wheats. III. The genes fromD-genome species//Theor. Appl. Gen. 1999. V.98. P. 135-148.

108. Ciaffi M., Paolaeei A.R., dAloisio E., Tanzarella O.A., Poreeddu E. Cloning and characterization of wheat PDI (Protein Disulfide Isomerase) homoeologous genes and promoter sequences // Gene. 2006. V.366. P.209-218.

109. Cineo-Moroyoqui F.J., MaeRitehie F. Quantitation of LMW-GS to HMW-GS ratio in wheat flours // Cer.Chem. 2008. V.85. P. 824-829.

110. Clayton W.D. Chorology of the genera of Gramineae II Kew Bui., 1975. V.30(l).

111. Cornish G.B., Bekes F., Allen H.M., Martin D.J. Flour proteins linked to quality traits in an Australian doubled haploid wheat population // Austr. J. Agric. Res. 2001. V.52. P.1339-1348.

112. Coutrin C.M., Roelants A., Delcour J.A. Fractionation-reconstitution experiments provide insight into the role of endoxylanases in bread-making // J. Agric. Food Chem. 1999. V.47. P. 1870-1877.

113. Coutrin C.M., Delcour J.A. Arabinoxylans and endoxylanases in wheat flour bread-making // J. Cer. Sci. 2002. V.35. P. 225-243.

114. Couturier J., Jacquot J.P., Rouhier N. Evolution and diversity of gluteredoxins in photosynthetic organisms // Cell. Mol. Life Sci. 2009. V.66. P. 2539-2557.

115. Creighton T.E., Hillson D.A., Freedman R.B. Catalysis by protein disulphide isomerase of the unfolding and refolding of proteins with disulphide bonds // J. Mol. Biol. 1980. V.142. P. 43-62.

116. Curioni A., Ponga N.E., Peruffo A.D.B. The quantity of bound beta-amylases is related to the size of gluten polymers//Gluten 96. 1996. ed. C.W. Wrigley, RACI: Melbourne, Austria.

117. DAloisio E., Dhanapal A., Tanzarella O.A., Cieffi M., Porceddu E. The PDI (Protein Disulfide Isomerase) gene family in wheat // Proc.llth IWGS (Eds. R.Appels, R.Eastwood et al.) 2008. Sydney: Sydney University Press. P. 1-3.

118. Day L., Greenwell P., Lock S., Brown H. Analysis of wheat flour proteins related to grain hardness using capillary electrophoresis // J. Chromatography. 1999. V.836. P.147-152.

119. Darby N.J., Creighton T.E. Functional properties of the individual thioredoxin-like domains of protein disulfide isomerase 11 Biochemistry. 1995. V.34. P.l 1725-11735.

120. Darby N.J., Creighton T.E. Characterization of the active site cysteine residues of the thioredoxin-like domains of protein disulfide isomerase // Biochemistry. 1995a. P. 16770-1678.

121. Davis B.J. Disc electrophoresis. II. Method and application to human serum proteins // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1964. V.121. P.404-427.

122. Debyser W., Peumans W.J., Van Damme E.J.M., Delcour J.A Triticum aestivum xylanase inhibitor (TAXI), a new class of enzyme inhibitor affecting breadmaking performance // J. Cer. Sci. 1999. V.30. P.39-43.

123. De Gara L„ de Pinto M.C., Moliterni V.M.C., D'Egidio M.G. Redox regulation and storage processes during maturation in kernels of Triticum durum II J. Exp. Bot. 2003. V. 54. P. 249-258.

124. De Lamotte F, Vianey-Liaud N, Duviau MP, and Kobrehel K. 2000. Glutathione reductase in wheat grain. 1. Isolation and characterization// J. Agric. Food Chem. V.48. P.4978-4983.

125. Denesyuk A.I., Vihinen M., Lundell J., Zav%yalov V.P., Korpela T. Structural similarity of the binding sites of cyclophilin A-cyclosporin A and FKBP-FK506 systems //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. V. 192. P. 912-917.

126. De Simone V., Menzo V, De Leonardis A.M., Ficco D.B.M., Trono D., Cattivelli L., De Vita P. Different mechanisms control lipoxygenase activity in durum wheat kernels//J. Cer. Sci. 2010. V.52. P. 121-128.

127. D'Ovidio R., Porceddu E, Lafiandra D. PCR analysis of genes encoding allelic variants of high molecular weight glutenin subunits at the Glu-Dl locus // Theor. Appl. Genet. 1994. V.88. P. 175-180.

128. D 'Ovidio R., Masci S., Porceddu E. Development of a set of oligonucleotide primers specific for genes at the Glu-1 complex loci of wheat// Theor. Appl. Genet. 1995. V.91.P.189-194.

129. Dx Ovidio R., Marchitelli C., Ercoli CardelliL., Porceddu E. Sequence similarity between allelic Glu-B3 genes related to quality properties of durum wheat //Theor. Appl. Gen. 1999. V.98. P. 455-461.

130. D 'Ovidio, Masci S. The low-molecular-weight glutenin subunits of wheatgluten (review)//! Cereal Sci. 2004. V.39. P.321-339.

131. Dobraszczyk B.J., Morgenstern M.P. Rheology and the breadmaking process//J.Cereal.Sci. 2003. V.38. P. 229-245.

132. Dong R., Hao C.Y., Wang A.L., Cai M.H., Yan Y.M. Characterization of HMW glutenin subunits in bread and tetraploid wheats by reversed-phase high-perfomance liquid chromatography// Cer. Res. Comm. 2009. V.37. P. 65-73.

133. Dornez E., Gebruers K., Cuyvers S., Delcour J.A., Coutrin C.M. Impact of wheat flour-associated endoxylanases on arabinoxylan in dough after mixing and resting // J. Agric. Food Chem. 2007. V.55. P. 7149-7155.

134. Dunnewind B., van Vielet T., Orsel R. Effect of oxidative enzymes on bulk rheological properties of wheat flour dought // J. Cer. Sci. 2002. V.36. P.357-366.

135. DuPont F.M., Hurkman W.J., Tanaka C.K., Chan R. BiP, HSP70, NDK and PDI in wheat endosperm. I. Accumulation of mRNA and protein during grain development// Physiologia Plantarum. 1998. V.103. P. 70-79.

136. DuPont F.M., Hurkman W.J., Vensel J., Tanaka C.K., Kothan K.M., Chung O.K., Susan B. Protein accumulation and composition in wheat grains: effects of mineral nutrients and high temperature // Eur. J.Agron. 2006a. V.25. P.96-107.

137. Egorov T.A., Odintsova T.I., Shewry P.R., Tatham A.S. Characterisation of high Mr wheat glutenin polymers by agarose gel electrophoresis and dynamic light scattering // FEBS Lett. 1998. V.434, P. 215-217.

138. Edman J.C., Ellis L., Blancher R.W., Roth R.A., Rutter W.J. Sequence of protein disulphide isomerase and implications of its relationship to thioredoxin // Nature. 1985. V.317. P.267-270.

139. Eklund H., Cambillau C., Sjöberg B.M., Holmgren A., Jörnvall H., Höög J.O., Brândén C.I. Conformational and functional similarities between glutaredoxin and thioredoxins // EMBO J. 1984. V.3. P.1443-1449.

140. Ellman G.J. Tissue sulfhydryl groups // Arch. Biochem. Biophys. 1959. V.82. P. 70-77.

141. Every D., Simmons L.D., Ross M.P., Morrison S.C. Biochemical properties of millistream flours relating to the ascorbate improver effects in baking (AIRB) //Proc. 48,h Austr.Cer.Chem.Conf. 2001. Eds. M.Wootton, I.L. Batey, C.W.Wrigley. RACI: Melbourne.

142. Every D., Simmons L.D., Ross M.P. Distribution of redox enzymes in millstreams and relationships to chemical and baking properties of flour // Cer.Chem. 2006. V.83. P.62-68.

143. Every D., MotoiL., Rao S.P., Shorter S.C., Simmons L.D. Predicting wheat quality consequences of the ascorbic acid improver effect // J. Cer. Sci. 2008. V.48. P.339-348.

144. Ewart J.A.D. Glutenin structure//J.Sci. Food Agric. 1979. V.30.P.482-492.

145. Ewart J.A.D. Comments on recent hypothesis of glutenin// Food Chem. 1990. V.38.P. 159-169.

146. Faubion J.M., Hoseney R.C. Lipoxygenase — its biochemistry and role in breadmaking //Cer.Chem. 1981. V.58. P. 175-180.

147. Faulds C.B., Juge N., Svensson B. Enzymes in grain processing // J. Cer. Sci. 2009. V.50. P.305.

148. Field J.M., Shewry P.R., Burgess S.R., Forde J., Parmar S., Miflin B.J. The presence of high molecular weight aggregates in the protein bodies of developing endosperm of wheat and other cereals // J. Cer. Sci. 1983a. V.l. P. 33-41.

149. Field J.M., Shewry P.R., Miflin B.J. Solubilization and characterization of wheat gluten proteins; correlations between the amount of aggregated proteins an baking quality // J.Sci. Food Agric. 1983. V.34. P. 370-377.

150. Freedman R.B. How many distinct enzymes are responsible for the several cellular processes involving thiol-disulphide interchange? // FEBS Lett. 1979. V. 97. P.201-210.

151. Freedman R.B. Native disulphide bond formation in protein biosynthesis: evidence for the role of protein disulphide isomerase // Trends Biochem. Sci. 1984. V.9. P.438-441.

152. Freedman R.B., Hawldns H.C., Murant S.J., Reid L. Protein disulfide-isomerase: a homologue of thioredoxin implicated in the biosynthesis of secretory proteins // Biochem. Soc. Trans. 1988. V.l6. P.96-99.

153. Freedman R.B., Hirst T.R., Tuit M.F. Protein disulphide isomerase: building bridges in protein folding // Trends Biochem. Sci. 1994. V.l9. P.331-336.

154. Friedman M., Krull L.H., Gavins J.E. The chromatographic determination of cystine residues in proteins as S-P-(4-pyridylethyl)cystein // J.Biol.Chem.-1970.1. V.245. N.15. P.3668-3871.

155. Fuchs S., De Lorenzo F., Anfinsen C.B. Studies on the mechanism of the enzymic catalysis of disulfide interchange in proteins. // J. Biol. Chem. 1967. V.242. P. 398-402.

156. Funk C.D. The molecular biology of mammalian lipoxygenases and the quest for eicosanoid functions using lipoxygenase-deficient mice // Biochim. Biophys. Acta. 1996. V.1304. P. 65-84.

157. Galili G., Altschuler Y., Levanony H. Assembly and transport of seed storage proteins // Trends Cell Biol. 1993. V.3. P. 437-443.

158. GaoL., Wang A., Li X., Dong K., Wang K., Appels R., Ma W., Yan Y. Wheat quality related differential expressions of albumins and globulins by two-dimensional difference gel electrophoresis (2-D DIGE) //J. Proteomics. 2009. V.73. P. 279-296.

159. Gebruers K., Debyser W., Goesaert H., Proost P., Van Damme J., Delcour J.A. Triticum aestivum L. endoxylanase inhibitor (TAXI) consist of two inhibitors, TAXI I and TAXI II, with different specificities // Biochem. J. 2001. V.353. P. 239-244.

160. Gelhaye E., Rouhier N., Jacquot J.P. The thioredoxin h system of higer plants // Plant Physiol.Biochem. 2004. V.42. P. 265-271.

161. Gianibelli M.C., Larroque O.R., MacRitchie F., Wrigley C.W. Biochemical, Genetic, and Molecular Characterization of Wheat Endosperm Proteins// Cer. Chem. 2001. V. 78. P.635-646.

162. Gibson L.M., Dingra N.N., Outten C.E., Lebioda L. Structure of the thioredoxin-like domain of yeast glutaredoxin 3// Acta Crystallogr.,Sect. D 2008. V.64. P. 927-932.

163. Gillikin J.W., Boston R.S. Plant BiP proteins/ Guidebook to molecular chaperones and protein-folding catalysis (Ed. M-J. Gething). Oxford University Press, Oxford, New Jork. 2002. P.38-41.

164. Gillmor S.A., Villasener A., Fletterick R., Sigal E., Browner M.F. The structure of mammalian 15-lipoxigenase reveals similarity to the lipases and the determinants of substrate specificity//Nat. Struct Biol. 1997. V.4. P. 1003-1009.

165. Gobin P., Ng P.K.W., Buchanan B.B., Kobrehel K. Sulfhydryl-disulfide changes in proteins of developing wheat grain // Plant Physiol. Biochem. 1997. V.35. P.777-783.

166. GorgA., Postel W., Wesir J., Schiwara H.W., Boesken W.H. Horisontal SDS electrophoresis in ultrathin pore-gradient gels for analysis of urinary proteins //Sciense Tools. 1985. V. 32. P. 5-9.

167. Grasch W., Wieser H. Redox reactions in wheat dough as affected by ascorbic acid//J. Cer.Sci. 1999. V.29. P. 1-16.

168. Graveland A., Bosveld P., Lichtendonk W.J., Marseille J.P., Moonen J.H.E., Scheepstra A. A model for the molecular structure of glutenins from wheat flour// J.Cereal Sci. 1985. V.3.P.1-16.

169. Gupta R.B., Singh N.K., Shepherd K.W. The cumulative effect of allelic variation in LMW and HMW glutenin subunits on dough properties in the progeny of two bread wheats // Theor. Appl. Gen. 1989. V.77. P.57-64.

170. Gupta R.B., Shepherd K.W. Two-step one-dimensional SDS-PAGE analysis of LMW subunits of glutenin. I. Variation and genetic control of the subunits in hexaploid wheats//Theor. Appl.Genet. 1990. V.80.P.65-74.

171. Gupta R.B., MacRitchie F. A rapid one-step one-dimensional SDS-PAGE procedure for analysis of subunit composition of glutenin in wheat // J.Cereal Sci. 1991. V.14. P.105-109.

172. Gupta R.B., Shepherd K. W., MacRitchie F. Genetic control and biochemical properties of some high molecular .weight albumins in bread wheat// J. Cereal Sci. 1991. V.13.P.221-235.

173. Gupta R.B., Khan K, MacRitchie F. Biochemical basis of flour properties in bread wheats. I. Effects of variation in the quality and size distribution of polymeric protein//J. Cer. Sci. 1993. V.18. P. 23-41.

174. Gupta R.B., MacRitchie F. Allelic variation at glutenin subunit and gliadin loci, Glu-1, Glu-3 and Gli-1 of common wheats. II. Biochemical basis of the allelic effects on dough properties// J.Cereal Sci. 1994. V.19. P. 19-29.

175. HadiNezhad M., Bulter F. Association of glutenin subunit composition and dough rheological characteristics with cookie baking properties of soft wheat cultivars // Cer.Chem. 2009. V.86. P. 339-349.

176. Hamer R., van Vliet T. Understanding the structure and properties of gluten: and overview // Wheat Gluten / Eds. Schewry P.R., Tatham A.S. Royal Society of Chemistry, Cambridge, 2000. P. 125-131.

177. Hart G.E., Langstone P.J. Chromosome location and evolution of isozyme structural genes in hexaploid wheat // Heredity. 1977. V.39. P.263-277.

178. Hessler G., Thomson M.J., Bensher D., Nachit M.M., Sorrells M.E. Association of lipoxygenase locus, Lpx-Bl, with variation in lipoxygenase activity in durum wheat seeds// Crop Sci. 2002. V.42. P. 659-1700.

179. HeydeckD., Schewe T. Improved procedure for the detection of activity of lipoxygenases on electrophoregrams // Biochem. Biophys. Acta 1985. V.44.1. P.1261- 1263.

180. Holmgren A. Thioredoxin and glutaredoxin systems // J. Biol. Chem. 1989. V.264.P. 13963-13966.

181. Hoseney R.C., Rao H, Faubion J., Sighu J.S. Mixograph studies. IV. The mechanism by which lipoxyganase increases mixing tolerance // Cereal Chem. 1980. V.57. P. 163-166.

182. Howitt C.A., Gale K.R., Juhasz A. Diagnostic marker for quality// Gliadin and glutenin. The uniquebalance of wheat quality/ Eds. C.Wrigley, F. Bekes, W.Bushuk. AACC International PRESS. 2006. P. 333-353.

183. Hsia C.C., Anderson O.D. Isolation and characterization of wheat co- gliadin genes // Theor. Appl. Genet. 2001. V. 103. P. 37-44.

184. Hsieh C.C., McDonald C.E. Isolation of lipoxygenase isoenzymes from flour of durum wheat endosperm// Cereal Chem. 1984. V. 61. P. 392-398.

185. Huebner F.R. and Wall J.S. Fractionation and quantitative differences of glutenin from wheat varieties varyng in baking quality // Cer.Chem. 1976. V.53. P. 258-269.

186. Huimel W.U., Wensley E., Bhave M. Identification and analysis of gene encoding a novel cyclophilin B in wheat potentially involved in storage protein folding // Plant Sci. 2009. V.176. P. 420-423.

187. Hurkman W.J., Vensel W.H., Tanaka C.K., Whitehand L., Altenbach S.B. Effect of high temperature on albumin and globulin accumulation in the endosperm proteome of the developing wheat grain // J. Cer.Sci. 2009. V.49. P. 12-23.

188. Hutter S., Wieser H. Studies on distribution and binding of endogenousglutathione in wheat dough and gluten // Eur. Food Res. Technol. 2001. V.213. P.329-334.

189. Humphris A.D.L., McMaster T.J., Miles M.J., Gilbert S.M., Shewry P.R., Tatham A.S. Atomic force microscopy (AFM) study of interactions of HMW subunits of wheat glutenin// Cereal Chemistry. 2000. V. 77. P.107-110.

190. Janolino KG., Clare D.A., Swaisgood H.E. Characteristics of sulfhydryl oxidase isolated by a simple chromatographic procedure// Biochim. Biophys. i Acta. 1981. V. 658. P. 405-409.

191. Johansson E., Henriksson P., Svensson G., Heneen W.K. Detection, chromosomal location and evaluation of the functional value of a novel high Mr glutenin subunit found in Swedish wheats // J.Cereal. Sci. 1993. V.17. P.237-245.

192. Johnson J.C., Clarke B.C., Bhave M. Isolation and characterization of cDNAs encoding protein disulfide isomerase and cyclophilins in wheat // J. Cer. Sci. 2001. V. 34. P. 159-171.

193. Johnson J.C., Bhave M. Molecular characterisation of the protein disulfide isomerase genes of wheat // Plant Science. 2004. V.167. P. 397-410.

194. Johnson J.C., Bhave M. Characterisation and physical mapping of cyclophilin A genes and identification of new classes of cyclophilins in wheat // J. Cer. Sci. 2004 a. V. 40. P. 137-150.

195. Johnson J.C., Apples R., Bhave M. Genetic mapping of the pdi genes of wheat and synteny between these and the espl locus of rice // Proc. 55th Austr. Cer. Chem. Conf. 2005. Sydney, Ausralia.

196. Johnson J.C., Appels R., Bhave M. The PDI genes of wheat and their syntenic relationship to the esp2 locus of rice // Func. Integr. Genom. 2006. V.6. P. 104-121.

197. Jones H.D. Wheat transformation: current technology and application to grain development and composition // J. Cer. Sci. 2005. V.41. P.137-147.

198. Josephides C.M., Joppa L.R., Youngs V.L. Effect of chromosome IB on gluten strength and other characteristics of durum wheat // Crop Sci. 1987. V.27. P.212-216.

199. Joye I.J., Lagrain B., Delcour J.A. Endogenous redox agents and enzymes that affect protein network formation during breadmalcing A review// J. Cer. Sci. 2009. V.50. P. 1-10.

200. Joye I.J., Lagrain B., Delcour J.A. Use of chemical redox agents and exogenous enzymes to modify the protein network during breadmaking A review //J. Cer. Sci. 2009a. V.50. P. 11-21.

201. Joudrier P., Gautier M.F., de Lamotte F., Kobrehel K. The thioredoxin h system: potential application // Biotech. Advances. 2005. V.25. P. 81-85.

202. Kaczkowski J., Meleszko T. The role of disulfide bonds and their localization in wheat protein molecules // Ann. Technol. Agric. 1980. V. 29. P.377-384.

203. Kanazawa H., Yonezawa D. Studies on polypeptide composition of low molecular weight glutenin// J.Agric.Chem. Soc.Japan. 1973. V.47. P.17-22.

204. Kasarda D.D., Autran J.C., Lew E. J.-L., Nimmo C.C. Shewry R.P. N-terminal amino acid sequences of co-gliadins and co-secalins; Implication for the evolution of prolamin genes // Biochim. Biophys. Acta. 1983. V.747. P.138-150.

205. Kasarda D.D., Okita T.W., Bernardin J.E., Baecker P.A., Nimmo C.C., Lew E.J.L., Dietler M.D., Green F.C. Nucleic (cDNA) and amino acid sequences of atype gliadins from wheat (Triticum aestivum) II Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1984. V.81. P. 4712-4716.

206. Kasarda D.D. Glutenin structure in relation to wheat quality//Wheat is Unique.Ed. Pomeranz Y. 1989. AACC, St. Paul, MN, P 277-302.

207. Kim W.T., Francesghi V.R., Krishnan H.B., Okita T.W. Formation of wheat protein bodies: involvement of the Goldgi apparatus in gliadin transport // Planta. 1988. V.176. P. 173-182.

208. Kobrehel K., Wong J.H., Balogh A., Kiss F., Yce B.C., Buchanan B.B. Specific reduction of wheat storage proteins by thioredoxin L // Plant Physiol. 1992. V.492. P. 919-924.

209. Kreis M., Forde B.G., Rahman B.J., Miflin B.J., Shewry P.R. Molecular evolution of the seed storage proteins of barley, rye and wheat // J. Mol. Biol. 1985. V. 183. P. 499-502.

210. Kreis M., Shewry P.R. Unusual features of cereal seed protein structure and evolution//BioEssays. 1989. V.10. P.201-207.

211. Kuninori T., Nishiyama J., Matsumoto H. Effect of mushroom extract on the physical properties of dough // Cereal Chem. 1976. V.56. P. 420-428.

212. Kurek L, Aviezer K, Erel N., Herman E., Breiman A. The wheat peptidyl prolyl cis-trans- isomerase FKBP77 is heat induced and developmentally regulated // Plant Physiology. 1999. V.l 19. P. 693-703.

213. Kurek /., Pirki F., Fischer E., Buchner J., Breiman A. Wheat FKBP73 functions in vitro as a molecular chaperone independently of its peptidyl prolyl cis-trans isomerase activity // Planta. 2002. V. 215. P. 119-126.

214. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the bacteriophage T4 //Nature. 1970. V.277. P. 680-685.

215. Lagrain B., Leman P., Goesaert H, Delcour J.A. Impact of thermostable amylases during bread making on wheat bread crumb structure and texture // Food Res. Intern. 2008. V.41. P. 819-827.

216. Lai C.S., Davis A.B., Hoseney R.C. Production of whole wheat bread with good loaf volume // Cereal Chem. 1989. V.66. P.224.

217. Lander E.S., Botstein D. Mapping Mendelian factors underlying quantitative traits using RFLP linkage maps // Genetics. 1989. V. 121. P. 185-199.

218. Langridge P., Lagudah E.S., Holton T.A., Appels R., Sharp P.J., Chalmers K.J. Trends in genetic and genime analyses in wheat: a review// Aust. J. Agric. Res. 2001. V. 52. V. 104301047.

219. Lash L.H., Jones D.P. The renal thiol (glutathione) oxidase. Subcellular localization and properties// Biochim. et Biophys. Acta. 1984.V.779. P. 191 200.

220. Lasztity R. Correlation between chemical structure and rheological properties of gluten //Ann. Thechnol. Agric. 1980. V. 29. P. 339-361.

221. Lascano H.R., Casano L.M., Melchiorre M.N., Trippi V.S. Biochemical and molecular characterization of wheat chloroplastic glutathione reductase // Biologia Plant. 2001. V. 44. P. 509-516.

222. Lash L.H., Jones D.P. Purification and Properties of the mambranal thiol oxidase from porcine kidney // Arch. Biochem. Biophys. 1986. V. 247. P. 120-130.

223. Laurent T.C., Moore E.C., Reichard P. Enzymatic synthesis of deoxyribonucleotides. Isolation and characterization of thioredoxin, the hydrogen donor from Escherichis coli B // J. Biol. Chem. 1964. V.239. P. 3436-3444.

224. Lee Y.-K., Bekes F., Gras P., Ciaffi M., Morell M.K., Appels R. The low-molecular-weight glutenin proteins of primitive wheats. IV. Functional properties of products from individual genes// Theor. Appl. Genet. 1999. V.98.P.149-155.

225. Leenhardt F., Lyan B., Rock E., Boussard A., Potus J., Chanliaud E., Remesy C. Wheat lipoxigenase activity induces greater liss of carotenoids than vitamin E during breadmaking // J. Agric. Food Chem. 2006. V.54. P. 1710-1715.

226. Lemaire S.D., Collin V., Keryer E., Quesada A., Miginiac-Maslow M. Characterization of thioredoxin y, a new type of thioredoxin identified in the genome of Chlamydomonas reinbardtii//FEBS Lett. 2003. V.543. P. 87-92.

227. Lemaire S.D., Collin V., Keryer E., Lssakidis-Bourquet E., Lavergne D. Miginiac-Maslow M. Chlamydomonas reinbardtii: a model organism for the study of the thioredoxin family // Plant Physiol. Biochem. 2003a. V.41. P.513-521.

228. Lemelin E., Branlard G., Salvo L., Lein V., Aussenac T., Dayde J. Breadmakig stability of wheat flour: Relation between mixing properties andmolecular weight distribution of polymeric glutenins // J. Cer. Sei. 2005. V. 42. P. 317-326.

229. LevanonyH., Rubin R., Altsghuler Y., Galili G. Evidence for a novel route of wheat storage proteins to vacuoles // J. Cell Biol. 1992. V.l 19. P. 1117-1128.

230. Li X., Wu Y., Zhang D-Z., Gillikin J.W., BostonR.S., Franceschi V.R., Okita T. W. Rice prolamin protein body biogenesis: a BiP-mediated process // Science. 1993. V.262. P. 1054-1056.

231. Li W.L., Faris J.D., Chittor J.M., Leach J.E., Hulbert S.H., Liu D.J., Chen P.D., Gill B.S. Genomic mapping of resistance genes in wheat // Theor. Appl. Genet. 1999. V.98. P. 226-233.

232. Li W., Bollecker S.S., Schoßeid J.D. Glutathione and related thiol compounds. I. Glutathione and related thiol compounds in flour // J. Cereal Sei. 2004. V.39. P. 205-212.

233. Li W, Tsiami A.A., Bollecker S.S., Schoßeid J.D. Glutathione and related thiol compounds. II. The importance of protein bound glutathione and related protein-bound compounds in gluten proteins // J. Cereal Sei. 2004. V.39. P. 213224.

234. Lindsay M.P., Skerritt J.H. Examination of the structure of the glutenin macropolymer in wheat fliur and doughs by stepwise reduction// J. Agric. Food Chem. 1998. V. 46. P. 3447-3457.

235. Lindsay M.P., Skerritt J.H. The glutenin macropolymer of wheat flour dough: Structure-function perspectives// Trends Food Sci. Technol. 1999. V.10.P.247-253.

236. Lindsay M.P., Skerritt J.H. Immunocytochemical localization of gluten proteins uncovers structural organization og glutenin macropolymer// Cer.Chem. 2000. V.77. P.360-369.

237. Liu L., He Z.H., Ma W.J., Liu J.J., XiaX.C., Pena R.J. Allelic variation at the Glu-D3 locus in Chinese bread wheat and effects on dough properties, pan bread and noodle qualities // Cer. Res. Comm. V.37. P. 57-64.

238. Loussert C., Popineau Y., Mangavel C. Protein bodies ontogeny and localization of prolamin component in the developing endosperm of wheat caryopses //J. Cer. Sci. 2008. V.47. 445-456.

239. Lowiy O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L. and Randall R.J. Protein measurement with the folin phenol reagent// J. Biol.Chem. 1951. 93: 265-275.

240. Lozano R.M., Wong J.H., Yee B.C., Peters A., Kobrehel K., Buchanan B.B. New evidence for a role for thioredoxin h in germination and seedling development // Planta. 1996. V.200. P. 100-106.

241. Luo C., Giffin W.B., Branlard G., McNeil D.L. Comparison of low- and high molecular-weight wheat glutenin allele effects on flour quality // Theor. Appl. Genet. 2001. V.102. P. 1088-1098.

242. Mackintosh S.H., Meade S.J., Healy J.P., Sutton K.H., Larsen N.G., Squires A.M., Gerrard J A. Wheat glutenin proteins assemble into a nanostructure with unusual structural features// J. Cer. Sci. 2009. V.49. P.157-162.

243. MacRitchie F, du Cros D.L., Wrigley C.W. Flour polypeptides related to wheat quality// Adv. Cereal Sci. Technol. 1990. V.10. P. 79-145.

244. MacRitchie F. Physicochemical properties of wheat proteins in relation to functionality// Adv. Food Nutr.Res. 1992. V.36. P. 1-87.

245. Marx C., Wong J.H., Buchanan B.B. Thioredoxin and germinating barley: targets and protein redox changes // Planta 2003. V.216. P. 454-460.

246. Masci S., Lafiandra D., Porceddu E., Lew E., Tao HP., Kasarda D.D. Dglutenin subunits:N-terminal sequences and evidence for the presence of cysteine //Cereal Chem. 1993. V. 70. P.581-585.

247. Masci S., Egorov T.A., Ronchi C., Kuzmicky D.D., Kasarda D.D. Lafiandra D. Evidence for the presence of only one cysteine residue in the D-type low molecular weight subunits of wheat glutenin// J.Cereal Sci. 1999. V.29.P.17-25.

248. Masci S., Rovelli L., Kasarda D.D., Vensel W.H., Lafiandra D. Characterisation and chromosomal localization of C-type low-molecular-weight subunits in the bread wheat cultivar Chinese Spring// Theor. And Appl. Genetics. 2002. V. 104. P.422-428.

249. Margiotta B., Urbano M., Colaprico G., Johansson E., Buonocore F., D^Ovidio R., Lafiandra D. Detection of y-type subunit at the Glu-Al locus in some Swedish bread wheat lines // J.Cereal Sci. 1996. V.23. P.203-211.

250. Marchylo B.A., Lukow O.M., Kruger J.E. Quantitative variation in high molecular weight glutenin subunits 7 in some Canadian wheats// J.Cereal Sci. 1992. V.15.P.29-37.

251. Marino C.L.,Nelson J.C., Lu Y.H., Sorrells M.E., Leroy P., TuleenN.A., Lopes C.R., Hart G.E. Molecular genetic maps of the group 6 chromosomes of hexaploid wheat (Triticum aestivum L. em. Thell.)//Genome. 1996. V.39. P.359-366.

252. Marx C., Wong J.H., Buchanan B.B. Thioredoxin and germinating barley: targets and protein redox changes I I Planta 2003. V.216. P.454-460.

253. Maucher T., Figueroa J.D.C., Reule W., Peha J. Influence of low molecular weight glutenins on viscoelastic properties of intact wheat kernels and their relation to functional properties of wheat dough // Cer. Chem. 2009. V.86. P.372-375.

254. Maystrenko O.I., Pshenichnikova T.A., Popova O.M. The development of 1A, 6D double substitution line Diamant/Novosibirskaya 67: the final stage // EWAC Newsletter, Proc. 10-th EWAC Meeting. Italy, Viterbo, 1998. P. 123-127.

255. Mcintosh R.A., Hart G.E., Devos K.M., Gale H.D., Rogers W.Y. Cataloque of gene symbols for wheat. In: Proc. 9 th Inter. Wheat Genet. Symp. Y.5. University Extension Press. Saakatchewan, Saskatoon. Canada (ed. A.E. Slinkard) P. 1-236.

256. Mcintosh S., Watson L., Bundock P., Crawford A., White J., Cordeiro G., Barbary D., Rooke L., Henry R. SAGE of the developing wheat caryopsis // Plant Biotech. J. 2007. V.5. P.69-83.

257. Merlino M., Leroy P., Chambon C., Branlard G. Mapping and proteomic analysis of albumin and globulin proteins in hexaploid wheat kernels (Triticum aestivum L.)// Theor. Appl. Genet. 2009. V.l 18. P. 1321-1337.

258. Mestres-Ortega D., Meyer Y. The Arabidopsis thaliana genome encodes at least four thioredoxins m and a new procariotic-like thioredoxin // Gene 1999. V.240.P. 307-316.

259. Metakovsky E. V, Felix I., Branlard G. Association between dough quality (W values) and certain gliadin alleles in French common wheat cultivars // J. Cereal Sci. 1997. V.26. P.371-373.

260. Meyer M.P., Tomchick D.R., Klinman J.P. Enzyme structure and dynamics affect hydrogen tunneling: the impact of a remote side chain (1553) in soybean lipoxygenase-1// Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2008. V.105. P. 1146-1151

261. Meyer Y., Verdoucq L., Vignols F. Plant thioredoxins and glutaredoxins: identity and putative roles // Trends Plant Sci. 1999. V. 4. P. 388-394.

262. Meyer Y, Siala W., Bashandy T., Riondet C., Vignols F., Phillipe J. Glutaredoxins and thioredoxins in plants // BBA 2008. V.l783. P. 589-600.

263. Meyer Y, Buchanan B.B., Vignols F., Reichheld J-P. Thioredoxins and glutaredoxins: unifying elements in redox biology // Ann. Rev. Genet. 2009. V. 43. P. 335-367.

264. Miflin B.J., Burgess S.R., Shewry P.R. The development of protein bodies in the storage tissues of seeds: subcellular separation of homogenates of barley, maize and wheat endosperm and of pea cotyledons // J. Exp. Bot. 1981. V. 32. P. 199219.

265. Miflin B.J., Field J.M., Shewry P.R. Cereal storage proteins and their effects on rheological properties. Seed Proteins. 1983. Academic Press: London. P. 255319.

266. Minoda Y., Kurane R. and Yanada K. Thiol-disulfide transhydrogenase from Baker's Yeast and a new method for the direct assay of an enzyme-catalyzed thiol-disulfide interchange activity//Agric. Biol. Chem. 1973. V.37. P. 2511-2516.

267. Moller I.M., Jensen P.E., Hansson A. Oxidative modification to cellular components in plants // Annu. Rev. Plant Biol. 2007. V.58. P.459-481.

268. Morell S., Follmann H., Haberlein I. Identification and localization of the first glutaredoxin in leaves of a higher plant // FEBS Lett. 1995. V.369. P. 149-152.

269. Morel M., Kohler A., Martin F., Gelhaye E., Riuhier N. Comparison of the thiol-dependent antioxidant systems in the ectomycorrhizal Laccaria bicolor and the saprotrophic Phanerochaete chrysosporium II New Phytol. 2008. V.180. P. 391-407.

270. Motohashi K, Kondoh A., Stumpp M.P., Hisabori T. Comprehensive survey of proteins targeted by chloroplast thioredoxin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001. V. 98. P. 11224-11229.

271. Mtiller S. and Wieser H. Disulphide bonds of a-type gliadins // J. Cer. Sci. 1995. V.22. P. 21-27.

272. Miiller S., Vensel W.H., Kasarda D.D., Kohler P., WieserH. Disulphide bonds of adjacent cysteine residues in low molecular weight subunits of wheat glutenin// J. Cer. Sci. 1998. V.27. P. 109-116.

273. Münstedt H., Kurzbeck S., Egersdörfer L. Influence of molecular structure on rheological properties of polyethylenes. Part II. Elongational behavior // Rheologica Acta. 1998. V.37. P.21-29.

274. Nakamura M., Kurata T. Effect of L-ascorbic acid on the rheological properties of wheat flour water dough // Cer. Chem. 1997. V. 74. P. 647-650.

275. Nelles E.M., Randall P.G., Taylor J.R.N. Improvement of brown bread quality by prehydration treatment and cultivar selection of bran 11 Cereal Chem. 1998. V.75. P.536-540.

276. Nelson J.C., Deynze A.E., Autrique E., Sorrells M.E., Lu Y.H. Negre S., Bernard M., Leroy P. Molecular mapping of wheat. Homoeologous group 3 // Genome. 1995. V.38. P.525-533.

277. Nelson J.C. QGENE: software for mapping based genomic analysis and breeding//Mol. Breed. 1997. V. 3. P. 239-245.

278. Nelson J.C., Autrique J.E., Fuentes-Davila G., Sorrells M.E. Chromosomal location of genes for resistance to Karnal bunt in bread wheat // Crop Sei. 1998. V.38. P.231-236.

279. Nelson J.C., Andreescu C., Breseghello F., Finney P.L., Gualberto D.G.,Bergman C.J., Pena R.J., Perretant M.R., Leroy P., Qualset C.O., Sorrells M.E. Quantitative trait locus analysis of wheat quality traits // Euphytica. 2006. V.149. P.145-159.

280. Nicolas J., Drapron R. Lipoxygenase and some related enzymes in breadmalcing I I Lipids end Cereal Technology. P.J. Barnes, ed. 1983. Academic Press. London.

281. Nieto-TaladrizM.T., Perretant M.R., Rousset M. Effect of gliadins and HMW and LMW subunits of glutenin on dough properties in the F6 recombinant inbred lines from a bread wheat cross // Theor. Appl. Genet. 1994. V.88. P. 81-88.

282. Nieto-Taladriz M.T., Ruiz M., Martinez M.C., Vazquez J.F., Carrillo J.M. Variation and classification of B low-molecular weight glutenin subunits alleles in durum wheat // Theor. Appl. Genet. 1997. V.95. P. 1155-1160.

283. Noctor G., Foyer C. Ascorbate and glutathione: keeping active oxygen under control// Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1998.V.49. P. 249-279.

284. Okita T.M., Rogers J.C. Compartmentation of proteins in the endomembrane system of plant cells 11 Annu. Rev. Plant Phys. Plant Mol. Biol. 1996. V. 47. P. 327-350.

285. Orsi A., Sparvoli F., Ceriotti A. Role of individual disulphide bonds in the structural maturation of a low molecular weight glutenin subunits// J.Biol. Chem. 2001. V.276. P. 32322-32329.

286. Osborne T.B. The proteins of the wheat-kernel. Carnegie Institution of Washington. 1907. P. 119.

287. Ostrowski M., Kisten W. Properties of a flavoprotein sulfhydryl oxidase from rate seminal vesicle secretion // Biochemistry. 1980. V.19. P. 2639-2645.

288. Payne P.I., Corfield K.G. Subunit composition of wheat glutenin proteins, isolated by filtration in a dissociating medium // Planta. 1979. V.145. P. 83-88.

289. Payne P.I., Law C.N., Mudd E.E. Control by homoeologous group 1 chromosomes of the high-molecular-weight subunits of glutenin, a major protein of wheat endosperm // Theor. Appl. Genet. 1980. V.58. P.l 13-120.

290. Payne P.L., Holt L.M., Law C.N. Structural and genetic studies on the high-molecular-weight subunits of wheat glutenin. I. Allelic variation in subunits amongst varieties of wheat (Triticum aestivum)// Theor. Appl. Genet. 1981. V.60. P.229-236.

291. Payne P.L, Lawrence G.J. Catalogue of alleles for the complex gene loci, Glu-Al, Glu-Bl and Glu-Dl which code for the high-molecular-weight subunits of glutenin in hexaploid wheat// Cereal Res. Commun. 1983. V.l 1. P.29-35.

292. Payne P.L., Holt L.M., Jackson E.A., Law C.N. Wheat storage proteins: Their genetics and their potential for manipulation by plant breeding// Philos. Trans. R. Soc. Lond. 1984. V.304. P.359-371.

293. Payne PJ., Jackson E.A., Holt L.M. The association between y-gliadin 45 and gluten strength in durum wheat varieties. A direct causal effect on the result of genetic linkage //J. Cer. Sci. 1984. V.2. P. 73-81.

294. Payne P.L., Holt L.M., Jarvis M.G., Jackson E.A. Two-dimensional fractionation of the endosperm proteins of bread wheat (Triticum aestivum): Biochemical and genetic studies // Cereal Chem. 1985. V.62. P.319-326.

295. Payne P.L, Nightingale M.A., Krattiger A.F., Holt L.M. The relationship between HMW glutenin subunit composition and the bread-making quality of British- grown wheat varieties I I J. Sci. Food Agric. 1987. V.40. P. 51-65.

296. Parker M.L. Protein accumulation in the developing endosperm of a high protein line of Triticum dicoccoides II Plant. Cell Environ. 1982. V.5. P.37-43.

297. Pascal S., Debrauwer L., Ferte M-P., Anglade P., Rouimi P., Scalla R. Analysis and characterization of glutathione S-transferase subunits from wheat

298. Triticum aestivum L.) // Plant. Sci. 1998. V. 134. P. 217-226.

299. Pastory G.M., Foyer C.H. Common components, networks, and pathways of cross-tolerance to stress. The central role of "redox" and abscisic acid-mediated controls // Plant Physiol. 2002. V.129. P. 460-468.

300. Patacchini C., Masci S., D^Ovidio R., Lafiandra D. Heterologous expression and purification of native and mutated LMW-GS from durum wheat// J. Chromatography. 2003. V.786. P.215-220.

301. Pitts E.G., Rafalski J.A., Hedgcoth C. Nucleotide sequence and encoded amino acid sequence of a genomic gene region for a low molecular weight glutenin// Nucleic Acids Research. 1988. V.16. P. 11376.

302. Pirozi M.R., Margiotta B., Lafiandra D., MacRitchie F. Composition of polymaric proteins and bread-making quality of wheat lines with allelic HMW-GS differing in number of cysteines// J. Cer.Sci. 2008. V.48. P. 117-122.

303. Ponga N.E., Lafiandra D., Feillet P., Autran J-C. Evidence for a direct causal effect of low molecular weight glutenin subunits on gluten vescoelasticity in durum wheats // J. Cer. Sci. 1988. V.7. P. 211-214.

304. Ponga N.E., Autran J.C., Mellini F., Lafiandra D., Feillet P. Chromosome IB-encoded gliadins and glutenin subunits in durum wheat: genetics and relationship to gluten strength//J. Cereal Sci. 1990.V.l l.P. 15-34.

305. Porta H., Rocha-Sosa M. Plant lipoxygenases. Physiological and Molecular Features//Plant Physiology. 2002. V.130. P.15-21.

306. Prioul J.-L., Pelleschi S., Sene M., Thevenot C., Causse M., de Vienne D., Leonardi A. From QTL for enzyme activity to candidate genes in maize //J. Exp. Bot. 1999. V. 50. P. 1281-1288.

307. Puig A., Gilbert H.R. The role of the thiol/disulfide centers and peptide binding site in the chaperone and anti-chaperone activities of protein disulfide isomerase // J.Biol. Chem. 1994. V.269. P. 7764-7771.

308. Quail P.H. Plant cell fractionation // Annu. Rev. Plant Physiol. 1979. V.30. P. 425-484.

309. Rafalski J.A. Structure of wheat gamma-gliadin genes // Gene. 1986. V.43. P.221-229.

310. Rakszegi M., Bekes F., Lang L., Tamas L., Shewry P.R., Bedo Z. Technological quality of transgenic wheat expressing an increased amount of a HMW glutenin subunit // J.Cer.Sci. 2005. V.42. P.15-23.

311. RhaziL., Cazalis R., Aussenac Y. Sulfhydryl-disulfide changes in storage proteins of developing wheat grain; influence on the SDS-unextractable glutenin polymer formation// J. Cer. Sci. 2003. V. 38. P. 3-13.

312. Rhazi L., Cazalis R., Lemelin E., Aussenac Y. Changes in the glutathione thiol-disulfide status during wheat grain development// Plant Physiol. Biochem. 2003a. V.41. P.895-902.

313. Roden L.T., Miflin B.T., Freedman R.B. Protein disulfide isomerase is located in the endoplasmic reticulum of developing wheat endosperm 11 FEBS Lett. 1982. V.132. P.121-124.

314. Rothfus J.A., Kennel S.J. Properties of wheat beta-amylase adsorbed on glutenin// Cer. Chem. 1970. V.47.P.140-146.

315. Rouhier N., Gelhaye E., Jacquot J.-P. Plant glutaredoxins: still mysterious reducing systems // Cell. Mol. Life Sci. 2004. V. 61. P. 1266-1277.

316. Rouhier N., Villarejo A., Srivastava M., Gelhave E.,Keech O., Droux M., Finkemeier I., Samuelsson G., Dietz K.J., Jacquot J-P., Wingsle G. Identification of Plant Glutaredoxin Targets // Antiox. Redox Sign. 2005. V.7. P. 919-929.

317. Rouhier N., Lemaire S.D., Jacquot J.-P. The role of glutathione in photosynthetic organism: emerging function for glutaredoxins and glutathionylation // Annu. Rev. Plant Biol. 2008. V.59. P. 143-166.

318. Rouhier N. Plant glutaredoxins: pivotal players in redox biology and iron-sulphur centre assembly // New Phytol. 2010. V.186. P. 365-372.

319. Rubin R., Levanony H., Galili G. Characterization of two types of protein bodies in developing wheat endosperm // Plant Physiol. 1992. V.99. P.718-724.

320. Ruiz M., Corrillo J.M. Linkage relationships between prolamin genes on chromosomes 1A and IB of durum wheat// Theor. Appl. Genetics. 1993. V.87. P.353-36.

321. Ruiz M., Corrillo J.M. Relationships between different prolamin proteins and some quality properties in durum wheat // Plant Breed. 1995. V.l 14. P.40-44.

322. Sabatini D., Kreibich G., Morimoto T., Adesnik M. Mechnism for the incorporation of proteins in membranes and organelles // J. Cell Biol. 1982. V.92. P.1-22.

323. Serrato A.J., Perez-Ruiz J.M., Cejudo F.J. Cloning of thioredoxin h reductase and characterization the thioredoxin reductase-thioredoxin h system from wheat // Biochem. J. 2002. V.367. P. 491-497.

324. ShaniN., Rosenberg N., Kasarda D.D., Galili G. Mechanisms of assembly of wheat high molecular weight glutenins inferred from the expression of wild-typeand mutant subunits in transgenic tobacco// J.Biol.Chem. 1994. V.269.P.8924-8930.

325. SharpP.J., Jhonston S., Brown G. Mcintosh R.A., Pallota M., Carter M„ Potter R., Jones G.K. Validation of molecular markers for wheat breeding // Austr. J. Agric. Res. 2001. V.52. P. 1357-1366.

326. Shewry P.R., Tatham A.S., Forde J., Kreis M, Miflin B.J. The classification and nomenclature of wheat gluten protewins: a reassessment //J.Cer.Sci. 1986.V.4. P.97-106.

327. Shewry P.R., Tatham A.S. The prolamin storage proteins of cereal seeds: structure and evolution // Biochemical Journal. 1990. V.267. P. 1-12.

328. Shewry P.R., Halford N.G., Tatham A.S. The high molecular weight subunits of wheat glutenin // J.Cereal Sci. 1992. V.15. P.105-120.

329. Shewry P.R., Tatham A.S. Disulphide bonds in wheat gluten proteins // J. Cer.Sci. 1997. V.25. P. 207-227.

330. Shewry P.R. The synthesis, processing and deposition of gluten proteins in the developing wheat grain // Cereal Foods World. 1999. V. 44. P. 587-589.

331. Shewry P.R., Halford N.G. Cereal seed storage proteins: structure, propertiesand role in grain utilization // J. Exp. Bot. 2002. V.53. P.947-958.

332. Shiiba K., Negishi Y., Okada K., Nagao S. Purification and characterization of lipoxygenase isozymes from wheat germ//Cereal. Chem. 1991. V. 68. P. 115-122.

333. Shimoni Y., Zhu X.Z., Levanony H., Segal G., Galili G. Purification, characterization, and intracellular localization of glycosylated protein disulphide isomerase from wheat grains // Plant Physiol. 1995. V.108. P. 327-335.

334. Shimoni Y., Segal G., ZhuX.Z., Galili G. Nucleotide sequence of a wheat cDNA Encoding protein disulfide isomerase // Plant Physiol. 1995 a. V.107. P. 281.

335. Shimoni Y, Galili G. Intramolecular disulfide bonds between conserved cysteins in wheat gliadins control their deposition into protein bodies- // J, Biol. Chem. 1996. V. 271. P.18869-18874.

336. Shomburg D., Salzmann M., Stephan D. /Enzyme Handbook, V. 7. (Stephan D. ed.), Springer-Verlag, Berlin, 1994, P. 1-7.

337. Siedow J.N. Plant lipoxygenase: structure and function // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1991. V.42. P. 145-188.

338. Singh N.K., Shepherd K. W. The structure and genetic control of a new class of disulphide-linked proteins in wheat endosperm// Theor. Appl. Genet. 1985. V.7. P.79-92.

339. Singh N.K., Shepherd K.W. Linkage mapping of the genes controlling endosperm proteins in wheat. 1. Genes on the short arms of group 1 chromosomes// Theor.Appl. Genet. 1988. V.66. P.628-641.

340. Singh N.K., Shepherd K.W., Langridge P., Green L.C. Purification and biochemical characterization of triticin, a legume-like protein in wheat endosperm// J.Cereal Sci. 1991. V.3.P.207-219.

341. Singh N.K., Donovan G.R., Carpenter H.C., Skerritt J.H., Langridge P. Isolation and characterization of wheat triticins cDNA revealing a unique lysine-rich repetitive domain//Plant Mol.Biol. 1993. V.22.P.227-237.

342. Singh R.P., Nelson J.C., Sorrels M.E. Mapping Yr28 and other genes for resistance to stripe rust in wheat // Crop. Sci. 2000. V.40. P. 1148-1155.

343. Sissons M.J., Bekes F., Skerritt J.H. Isolation and functionality testing of low molecular weight glutenin subunits// Cereal Chem. 1998. V.75.P.30-36.

344. Skylas D.J., Van DykD., Wrigley C.W. Proteomic of wheat grain // J. Cer.Sci. 2005. V.41. P.165-179.

345. Slivinski E.L., Kolster P., Prins A., van Vliet T. On the relationship between gluten protein composition of wheat flours and large-deformation properties of their doughs// J. Cer.Sci. 2004. V.39. P.247-264.

346. Southan M., MacRitchie F. Molecular weight distribution of wheat proteins// Cer.Chem. 1999. V.76. P.827-836.

347. Sreeramulu G., Singh N.K. Genetic and biochemical characterization of novel low molecular weight glutenin subunits in wheat (Triticum aestivum L.)// Genome. V.40. P. 41-48.

348. Starke D.W., Chen Y., Bapna C.P., Lesnefsky E.J., Mieyal J.J. Sensitivity of protein sulfhydryl repair enzymes to oxidative stress // Free Radic. Biol. Med. 1997. V.23.P. 373-384.

349. Steiner R. F., De Lorenzo F., Anfinsen C. B. Enzymically catalyzed disulfide interchange in randomly cross-linked soybean trypsin inhibitor // J. Biol. Chem. 1965. V. 240. P. 4648-51.

350. Stewart D.E., Sarkar A., Wampler J.E. The Occurrence and Role of cis Peptide Bonds in Protein Structures // J. Mol. Biol. 1990. V.214. P. 253-260.

351. Sugiyama T., Rafalski A., Soil D. The nucleotide sequence of a wheat y-gliadin genomic clone // Plant Sci. 1986. V.44. P.204-209.

352. Suske C., Wagner W., Follman H. NADPH-dependent thioredoxin reductase and a new thioredoxin from wheat// Zeitschrift fiir Naturforschung. 1979. V.34. P.214-221.

353. Sutton K.H. Qualitative and quantitative variation among high molecular weight subunits of glutenin detected by reverse-phase high-performance liquid chromatography//J.Cereal Sci. 1991. V.14. P.25-34.

354. Sutton K.H. Analysis of wheat glutenin protein aggregate size using photon correlation spectroscopy // Gluten / Ed.W.Wrigley RACI: Melbourne. 1996. P.317-320.

355. Swaisgood H.E. Sulphydryl oxidase: properties and applications// Enzyme Microb.Thechnol. 1980. V.2. P.265-272.

356. Takamory K, Thorpe J., Goldsmith L. Skin sulfhydryl oxidase (Purification and some properties) // Biochem. Biophys. Acta. 1980. V.615. P. 309-323.

357. Takemoto Y., Coughlan S.J., Okita T.W., Satoh H., Ogawa M., Kumamaru T. The Rice Mutant esp2 Greatly Accumulates the Glutelin Precursor and Deletes the Protein Disulfide Isomerase // Plant Physiol. 2002. V. 128. P. 1212-1222.

358. Tao H.P., Kasarda D.D. Two-dimensional gel mapping and N-terminal sequencing of LMW-glutenin subunits // J.Exp.Bot. 1989. V.40.P. 1015-1020.

359. Tatham A.S., Miflin B.J., Shewry P.R. The beta-turn conformation in wheat gluten proteins: Relationship to gluten elasticity // Cereal Chem. 1985. V.62. P.405-442.

360. Tatham A.S. and Shewry P.R. The conformation of the wheat gluten proteins. The secondary structures and thermal stabilities of alpha- beta-, gamma- and omega gliadins // J. Cereal Sci. 1985. V.3. P. 103-113.

361. Tatham A.S., Field J.M., Shewry P.R. The conformations of wheat gluten proteins.II. Aggregated gliadins and low molecular weight subunits of glutenin// J. Cereal Sci. 1987. V.51. P. 203-214.

362. Tatham A.S., Shewry P.R., Belton P.S. Structural studies of cereal prolamins, including wheat gluten // Advances in Cereal Science and Technology/ Ed. Pomeranz Y. Am.Assoc. Cer. Chem.: St.Paul, 1990. V.X. P. 1-78.

363. Tatham A.S. and Shewry P.R. The S-poorprolamins of wheat, barleyand rye 11 J.Cer.Sci. 1995. V.22. P.l-16.

364. Thompson S., Bishop D.H.L., Madgwick P., Tatham A.S., Shewry P.R. Highlevel expression of a wheat LMW glutenin subunits using a baculovirus system// J. Agric. Food Chem. 1994. V.42.P.426-431.

365. Tomizawa H.H. Properties of glutathione insulin transhydrogenase from beef liver//J. Biol. Chem. 1962. V. 237. P. 3393-3396.

366. Tosi P., Parker M., Gritsch C.S., Carzaniga R., Martin B., Shewry P.R. Trafficking of storage proteins in developing grain of wheat // J. Exp. Bot. 2009. V.60. P. 979-991.

367. Toth B., Galiba G., Feher E., Sutka J., Snape J.W. Mapping genes affecting flowering time and frost resistance on chromosome 5B of wheat // Theor. Appl. Genet. 2003. V.107. P.509-514.

368. Tranbarger T.J., Franceschi V.R., Hildebrand D.F., Grimes H.D. The soybean 94-kilodalton vegetative storage protein is a lipoxigenase that is localized in paraveinal mesophyll cell vacuoles // Plant Cell 1991. V.3. P. 973-987.

369. Varandani P.T. Insulin degradation. V. Unmasking of glutathione-insulin transhydrogenase in rat liver microsomal membrane // Biochim. Biophys. Acta. 1973. V. 304. P. 642-659.

370. Varshney R.K., Tuberosa R. (eds.) Genomic-Assisted Crop Improvement, V.2. Genomics Applications in Crops. Springer. 2008. 509 p.

371. Vensel W.H., Janaka C.K., CaiN., Wong J.H., Buchanan B.B., Hurkman W.J. Developmental changes in the metabolic protein profiles of wheat endosperm 11 Proteomics. 2005, V.5. P. 1594-1611.

372. Veraverbeke W.S., Larroque O.R., Bekes F., Delcour J.A. Oxidation of high and low molecular weight glutenin subunits isolated from wheat//Wheat gluten/ Ed. Shewry P.R., Thatam A.S. Royal Society of Chemistry, UK, 2000. P.223-226.

373. Vlamins-Gardikas A., Holmgren A. Thioredoxin and glutaredoxin isoforms // Meth. Enzyrn. 2002. V.347. P.286-296.

374. Wagner M.H., Bastian H., Hachmann P., Meissner J., Kurzbeck S., Miinstedt H., Langouche F. The strain hardening behaviour of linear and long-chain-branched polyolefin melts in extensional flows // Rheologica Acta. 2000. V.39. P. 97-109.

375. Waga J., Zientarski J., Obtulowiez K, Bilo B., Stachowicz M. Gliadin immunoreactivity and dough rheological properties of winter wheat genotypes modified by thioredoxin // Cer. Chem. 2008. V. 85. P. 488-494.

376. Waines J.G., Payne P.I. Electrophoretic analysis of the high-molecular weight glutenin subunits of Tritieum monoeoecum, T. urartu, and the A genome of bread wheat (T.aestivum) // Theor.Appl. Genet. 1987. V.74. P.71-76.

377. Wang C.C., Tsou C.L. Protein disulfide isomerase is both an enzyme and a chaperone. // FASEB J. 1993. V.7. P. 1515-1517.

378. Wang C. C. Protein disulfide isomerase as an enzyme and a chaperone in protein folding // Meth. Enzymol. 2002. V. 348. P. 66-75.

379. Wang Y.G., Khan K, Hareland G., Nygard G. Distribution of protein composition in bread wheat flour mill streams and relationship to breadmaking quality // Cer.Chem. 2007.V.84. P.271-275.

380. Watanabe E., Bell A.E., Broekway B.E. The effect of protein disulfide isomerase on dough rheology assessed by fundamental and empirical testing // Food Chem., 1998. V. 4. P. 481-486.

381. Watanabe N., Masum Akond A.S.M.G., Naehit M.M. Cenetic mapping of the gene affecting polyphenol oxidase activity in tetraploid durum wheat // J. Appl. Genet. 2006. V. 47. P. 201-205.

382. Weegels P.L., Hamer R.J. Imoroving the bread-making quality of gluten // Cereal Foods World. 1992. V.37. P. 379-385.

383. Weegels P.L. Theoretical considerations on glutenin polymerisation//Gluten 96. 1996. P. 163-168. ed. C.W. Wrigley. RACI: Melbourne, Australia.

384. Werner W.E., Adalstein A.E., Kasarda D.D. Composition of high-molecular-weight glutenin subunit dimmers formed by partial reduction of residue glutenin// Cereal Chem. 1992. V.69.P.535-541.

385. Wetterau J.R., Combs K.A., Spinner S.N., Joiner B.G. Protein disulfide isomerase is a component of the microsomal triglyceride transfer protein complex // J. Biol. Chem. 1990. V. 265. P. 9800-9807.

386. Wieser H., Kieffer R. Correlation of the amount of gluten protein types to the technological properties of wheat flours determined on a micro-scale // J. Cer. Sci. 2001. V.34. P. 19-27.

387. Wieser H. Chemistry of gluten proteins // Food Microbiol. 2007. V. 24. P. 115-119.

388. WongJ.H., KobrehelK, Nimbona C., Yee B.C., Balogh A., Kiss F., Buchanan 2?. 5. Thioredoxin and bread wheat 11 Cer.Chem. 1993. V.70. P. 113-114.

389. Wong J.H., Cai N., Balmer Y., Tanaka C.K., Vensel W.H., Hurkman W.J., Buchanan B.B. Thioredoxin targets of developing wheat seeds identified by complementary proteomic approaches// Phytochemistry. 2004. V.65. P. 16291640.

390. Wrigley C.W and Shepherd K.W. Electrofocusing of grain proteins from wheat genotypes // Ann. New York Acad. Sci. 1973. V.209. P. 154-162.

391. Wrigley C.W. Giant proteins with flour power // Nature. 1996. V.381. P.738-739.

392. Wu H., Bhave M. Molecular characterization of cyclophilin B genes and promoter sequences in wheat and rice // Proc.l 1th IWGS (Eds. R.Appels, R.Eastwood et al.) 2008. Sydney: Sydney University Press.

393. Xu Q., Xu J., Liu C.L., Chang C., Wang C.P., You M.S., Li B.Y., Liu G.T. PCR-based markers for identification of HMW-GS at Glu-Blx loci in common wheat // J.Cer.Sci. 2007. V.47. P.394-398.

394. Yamamoto S., Suzuki H., Ueda N. Arachidonate 12-lipoxygenases // Prog. Lipid. Res. 1997. V.36. P.23-41.

395. Ye B., Gilter C., Gressel J. A high-sensitivity, single-gel, polyacrylamide gel electrophoresis method for the quantitative determination of glutathione reductases // Analyt. Biochem. 1997. V. 246. P. 159-165.

396. Zawistowska U., Langstajf J., Bushuk W. Improving effects of a natural alpha-amylase inhibitor on the baking quality of wheat-flour containing malted barley flour // J. Cer. Sci. 1988. V.8. P.207-209.

397. Zhang P., He Z., Chen D., Zhanq Y., Larroque O.R., Xia X. Contribution of common wheat protein fraction to dough properties and quality of northern-style Chinese steamed bread // J.Cer.Sci. 2006. V.46. P.l-10.

398. Zhu J., Khan K. Characterization of glutenin protein fractions from sequential extraction of hard red spring wheats of different breadmaking quality //Cer.Chem. 2004. V.81. P. 681-685.

399. Zimmerman D.C., Veck B.A. Hydroperoxide isomerase. A new enzyme of lipid metabolism // Plant Physiol. 1970. V. 46. P. 445-453.