Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Протеин-дисульфид редуктаза и липоксигеназа пшеницы в ферментативной регуляции SH/SS-обмена в запасных белках зерновки: физиолого-биохимические аспекты

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Протеин-дисульфид редуктаза и липоксигеназа пшеницы в ферментативной регуляции SH/SS-обмена в запасных белках зерновки: физиолого-биохимические аспекты"

На правах рукописи

Пермяков Алексей Викторович

ПРОТЕИН-ДИСУЛЬФИД РЕДУКТАЗА И ЛИПОКСИГЕНАЗА ПШЕНИЦЫ В ФЕРМЕНТАТИВНОЙ РЕГУЛЯЦИИ SH/SS-ОБМЕНА В ЗАПАСНЫХ БЕЛКАХ ЗЕРНОВКИ: ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ

03.00.12 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск - 2004

Работа выполнена в Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН, г. Иркутск

Научный руководитель: доктор биологических наук,

В.А.Труфанов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук А.В. Колесниченко,

Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, г. Иркутск

доктор биологических наук И.И.Илли,

Иркутская государственная сельскохозяйственная академия,

г. Иркутск

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, г. Москва

Защита диссертации состоится "28" апреля 2004 г. в 10 ч на заседании диссертационного совета Д 003.047.01 при Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН по адресу: 664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132, а/я 1243. Факс (3952) 510754; E-mail: matmod@sifibr.irk.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН.

Автореферат разослан М/1ПТ<\ 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук

Г. П. Акимова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Белки пшеничного зерна, образующие клейковину, отличаются от запасных белков семян других злаков, прежде всего своими уникальными реологическими свойствами. В зависимости от сорта и условий выращивания пшеницы в зерне формируются белковые комплексы клейковины с очень разными физико-химическими и реологическими свойствами, совокупность которых принято обозначать технологическим термином "качество клейковины". В клейковине высокого качества содержание SS-связей на 22-31 % выше (Кретович, Вакар, 1974). Разнокачественность клейковины у сортов пшениц связана с содержанием и соотношением в ней SS-связей и SH-групп (Кретович, 1987, 1991; Труфанов и др., 1993). Существующая в зерновках пшеницы специфическая система ферментов тиол-дисульфидного метаболизма катализирует образование, распад и изомеризацию (перегруппировку) SS-связей в запасных белках, т.е. имеет прямое отношение к созданию SH/SS-статуса запасных белков и, следовательно, к формированию структуры белкового комплекса клейковины (Труфанов, 1994).

В этом отношении представляют интерес данные о функционировании в зерновке пшенице системы НАДФН-зависимой тиоредоксинредуктазы (Suske et al., 1979; Kobrehel ct al., 1992; Wong et al., 1996), НЛДФН-зависимой протеиндисульфид оксидоредуктазы (Hatch et al., 1960; Горпинченко и др., 1972, 1975), глутатион-зависимой протеиндисульфид оксидоредуктазы (Кузнецов, Труфанов, 1981; Труфанов, Кичатинова, 1989), восстанавливающих SS-связи в запасных белках пшеницы, и НАДФН-зависимой глутатионредуктазы, восстанавливающей SS-связи окисленного глутатиона (Проскуряков, Зуева, 1963, 1964; Lascano et. al., 2001). НАДФН-зависимая протеин-дисульфид изомераза катализирует перегруппировку в белках термодинамически напряженных SS-связей (Grynberg et al., 1977; Shimoni et al., 1995; Galili et al., 1996).

Имеются сведения об участии липоксигеназы в образовании SS-связей в запасных белках пшеницы путем опосредованного окисления SH-rpynn перекисями и гидроперекисями ненасыщенных жирных кислот (Кретович, 1991; Shiiba, 1991).

Ферментативное окисление сульфгидрильных групп запасных белков можег происходить с помощью кислород-зависимых тиолоксидаз (Труфанов и др., 1989), подобных тиолоксидазам животных клеток (Lash, Jones, 1984, 1986). Участие в тиол-дисульфидных реакциях в запасных белках пшеницы могут принимагь также глутатионтрансфераза (Pascal et al., 1988) и глутатион-зависимая дегидроаскорбат оксидоредуктаза (Every, 1996; De Gara ct al., 2002).

Таким образом, в зерновке пшеницы одновременно функционирует сложная система специфических ферментов, относящихся к классу оксидоредуктаз и регулирующих SH/SS-статус белков в клетке. Катализируя образование, распад или перегруппировку термодинамически напряженных SS-связей и обеспечивая оптимальный уровень низк

кофакторов (например, глутатионредуктаза), эти ферменты участвуют в регуляции процессов тиол-дисульфидного обмена в зерновках in vivo. .

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в изучении физиолого-биохимических аспектов регуляции тиол-дисульфидного обмена в развивающейся зерновке пшеницы на примере трех ферментов: протеин-дисульфид редуктазы, глутатионредуктазы и липоксигеназы, участвующих в создании SH/SS-статуса запасных белков.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Изучить динамику протеин-дисульфид редуктазной активности и содержание небелковых SH-групп в процессе созревания зерновки пшеницы.

2. Выделить в гомогенном состоянии протеин-дисульфид редуктазу пшеницы с использованием методов солевого фракционирования, колоночной хроматографии и электрофореза в ПЛЛГ.

3. Изучить биохимические характеристики очищенного фермента.

4. Изучить компонентный состав ферментного экстракта методами нативного и денатурирующего электрофореза в пластинках ПААГ.

5. Изучить изоферментный состав исследуемых ферментов в созревающей зерновке пшеницы.

6. Изучить особенности проявления активности липоксигеназы у разнокачественных сортов и линий пшеницы с межсортовым замещением хромосом 4 и 5 гомеологических групп.

Научная новизна. Впервые из зерновок пшеницы (Triticum aestivum L.) выделен в гомогенном состоянии фермент с тиол:протеиндисульфид оксидоредуктазной • активностью, подобный глутатион:инсулин трансгидрогепазе из животных и микробиологических объектов. В результате были изучены некоторые биохимические характеристики и свойства протеин-дисульфид редуктазы пшеницы.

Показано изменение физических свойств пшеничного теста (на альвеографе) даже при слабом действии протеин-дисульфид редуктазы. Установлена важная роль глутатионредуктазы в регуляции протеин -дисульфид редуктазной функции фермента в процессе развития зерновок пшеницы, т.е. функциональная взаимосвязь этих ферментов в процессах создания и регуляции SH/SS-статуса запасных белков.

Теоретическая и практическая значимость работы. На основе полученных результатов можно предположить, что в зерновках пшеницы {Triticum aestivum L.) одновременно с двумя системами ферментативного восстановления SS-связей в запасных белках пшеницы - НАДФН, НАДФН-зависимая тиоредоксинредуктаза, тиоредоксин и НАДФН, НАДФН-зависимая глутатионредуктаза, глутатион и глутаредоксин (Rouhier et al., 2002), существует третья система - НАДФН, НАДФН-зависимая глутатионредуктаза, глутатион и протеин-дисульфид редуктаза.

; -Установлено, что наибольшее влияние в зерновках пшеницы на

проявление удельной активности липоксигеназы оказывают структурные гены, локализованные на хромосомах 4А и 5А. Однако, учитывая то, что регуляция активности данного фермента носит полигенный характер, возможно важную роль играют также гены-регуляторы, расположенные на других хромосомах. Это обстоятельство имеет важное значение при разработке теоретических основ для создания новых генотипов (сортов) пшеницы методами хромосомной инженерии.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 18 работ. Результаты исследований были представлены на II и III съезде ВОФР (Минск, 1990; Санкт-Петербург, 1993), на IV и V съезде физиологов растений (Москва, 1999, Пенза, 2003), на международном симпозиуме «Physical-chemical basis of plant physiology», на 11 и 12 международных конференциях EWAC (Новосибирск, 2000; Norwich, 2002), международной конференции «Биотехнология на рубеже двух тысячилетей» (Саранск, 2001), на 10 международном симпозиуме по генетике пшеницы (Paestum, 2003, сентябрь, 1-6).

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 150 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, методической и экспериментальной частей, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа включает 32 рисунка и 8 таблиц. Список литературы состоит из 246 источников, в том числе 200 зарубежных авторов.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследований служили генотипически различные производственные сорта яровой мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) сибирской (Скала, Ангара 86, Тулунская 12) и краснодарской (Лютесценс 616Н5, Эритроспермум 674Н27) селекции. Для изучения влияния вклада отдельных пар хромосом в активность липоксигеназы использовались яровые мягкие пшеницы Саратовская 29 (сорт-реципиент) и Janetzkis Probat (сорт-донор) и их линии с межсортовым замещением отдельных пар хромосом 4А, 4В, 4D, 5А, 5В и 5D, созданные в лаборатории хромосомной инженерии злаков ИЦиГ СО РАН. В работе по очистке ферментов тиол-дисульфидного обмена методами колоночной хроматографии и отработке методических приемов использовали зерновки пшеницы сорта Скала и Тулунская 12 на разных фазах спелости. Отбор и фиксирование образцов семян проводили в процессе их налива и созревания, начиная с 10-12-го дня после цветения растений. Извлеченные из свежесрезанных колосьев семена фиксировали жидким азотом и хранили при -20°С или лиофильно высушивали. Фазу спелости определяли по содержанию в зерновках влаги. При изучении действия протеин-дисульфид редуктазы пшеницы на физические свойства теста (показатели альвеографа) использовали муку сортов Granmulino и Мироновская 808.

Для получения ферментных экстрактов навески измельченных семян гомогенизировали при температуре (4°С) с двойным количеством 0.1 М Трис-

НС1 буферного раствора, рН 7.5, содержащего 1 мМ ЭДТА. Полученный гомогенат отжимали через капроновую ткань и последовательно центрифугировали при 5000 и 30000 g в течение 30 мин. Полученный супернатант исчерпывающе диализовали против охлажденного экстрагента и использовали для определения концентрации белка и ферментативной активности. В отдельных сериях экспериментов препараты ферментных экстрактов подвергали дробному фракционированию сульфатом аммония. Осадки белков, полученные в интервале концентраций от 20 до 70% от полного насыщения, диализовали против исходного буферного раствора и использовали для определения содержания белка и ферментативных активностей.

Активность ^H-зависимой тиол:протеиндисульфид оксидоредуктазы определяли по увеличению содержания SH-грунп в инкубационной среде (Кузнецов, Труфанов, 1981). Количество SH-групп определяли с реагентом Эллмана (Ellman, 1959). Удельную активность выражали в единицах активности на мг белка ферментного экстракта, где Е= ASH/t.

Активность липоксигеназы определяли спектрофотометрически, используя метод определения образования конъюгированных гидроперекисей линолевой кислоты при поглощении 234 нм (Doderer et al., 1992). Удельную активность рассчитывали на 1 мг белка в ферментном экстракте.

Общее содержание сульфгидрильньгх групп и дисулъфидных связей определяли, используя метод Friedman et al. (1970). При определении содержания небелковых SH-групп использовали метод Труфанова и др. (1993).

Выделение уксусно-растворимой фракции клейковины проводили из муки сорта Тулунская 12 по модифицированной методике (Василенко, Комаров, 1987).

Для определении концентрации белка в ферментных экстрактах использовали метод Лоури (Lowry et al., 1951).

Параметры агрегации определяли по методу, предложенному японскими исследователями (Arakawa, Yonezawa, 1975; Arakawa et al., 1976).

Для ионообменной хроматографии использовали ДЭАЭ-сефадекс А-50 (Pharmacia, Швеция), элюцию белков с сорбента проводили с помощью линейного градиента концентраций NaCI в интервале 0-0.6 М.

Электрофорез нативных белков ферментных экстрактов анализировали в щелочной буферной системе по Дэвису (Devis, 1964). Восстановленные белки ферментных экстрактов анализировали в щелочной буферной системе по Лэммли (Laemmli, 1970). Определение молекулярной массы нативного белка проводили по методу Колесниченко (Колесниченко и др., 2000).

Для селективного окрашивания глутатиопредуктазы в пластинках ПААГ использовали модифицированный метод Ye et al. (1997), липоксигеназы -Heydeck et al.(1985).

Для определения гомогенности полученного препарата использовали систему капиллярного электрофореза 3D СЕ Agilent Techologies.

Все опыты проводили в трехкратной серии биологических повторностей. Полученные данные обработаны статистически по

стандартной методике (Доспехов, 1979).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние протеин-дисульфид редуктазной активности на SH/SS-статус запасных белков развивающейся зерновке пшеницы

Ранее, было выдвинуто предположение о возможном участии протеин-дисульфид редуктазы в ферментативном восстановлении SS-связей в запасных белках в ходе формирования белкового комплекса развивающегося эндосперма. Известно, что основным "поставщиком" восстановленного глутатиона (rSH) в клетке выступает глутатионредуктаза, расщепляющая SS-связи окисленного глутатиона (Торчинский,1977). Широкое распространение глутатиона в тканях животных, растений и микроорганизмов и его роль как кофактора для многих ферментов позволяло предположить регуляторную роль глутатионредуктазы в проявлении функциональной активности протеин-дисульфид редуктазы. Для проверки этого предположения мы использовали зерновки различных по происхождению и качеству клейковины сортов мягкой яровой пшеницы в разные фазы репродуктивного развития растений.

Из представленных на рис. 1 данных следует, что в фазе формирования зерновок (влажность выше 70%) идет интенсивный синтез низкомолекулярных SH-соединений, в основном цистеина и TSH - тиоловых кофакторов ферментативного восстановления SS-связей.

22

20

з 18 s s

5" 16

^ 14 12 10

70-75 60-65 50-55 40-45 30-35 15-20' влажность, % I

Рис 1. Протеин-дисульфид редуктазная активность и содержание небелковых SH-соединений в развивающихся зерновках пшеницы в зависимости от влажности зерна ( %).

1 - протеин-дисульфид редуктазная активность; 2 - небелковые 8И-соединения. -

Приведены средние данные для четырех сортов яровой мягкой пшеницы: Скала, Ангара 86, Лютесценс 616Н5 и Эритроспермум 674Н27.

Высокое содержание тиоловых кофакторов совпадало с периодом активного деления клеток формирующихся зародыша и эндосперма. В начале налива семян количество небелковых SH-rpynn снижалось при относительно низкой активности протеин-дисульфид редуктазы. По мере дальнейшего развития зерновок пшеницы количество низкомолекулярных SH-групп возрастало и на стадии молочной спелости (примерно на ЗО-й день после цветения) при влажности семян около 50% достигало максимума, а с наступлением фазы тестообразной спелости вновь снижалось.

Интенсивное образование небелковых SH-соединений в период усиленных биосинтетических процессов, связанных с наливом семян, а также поддержание необходимого уровня FSH в клетке в этот период, предполагает регуляторную роль глутатионредуктазы в проявлении функции протеин-дисульфид редуктазы, активность которой также увеличивалась в этот период, совпадая с максимумом содержания тиоловых кофакторов.

Таблица 1,. Содержание SS-связей и SH-групп (мкМ/мг белка) в созревающих зерновках пшеницы сорта Скала

Показа- Влажность зерновки, %; фазы спелости

тель 70-75 60-65 50-55 40-45 30-35 15-20

начало молочная конец тесто- восковая полная

молочной молочной образная

SS- 7.3±0.4 8.3±0.4 8.5±0,6 10.3±0.6 13.0±0,7 13.4±0.5

связи

SH- 9.4±0.8 9.2±0.5 10.2±0.6 7.7±0.5 7.3±0.5 8.2±0.7

группы

Со снижением протеин-дисульфид редуктазной активности в конце налива - начале созревания семян заметно уменьшалось содержание как свободных SH-групп, так и SH-групп в растворимых белках при одновременном увеличении (почти в два раза) количества SS-связей в суммарных белках (табл. 1), очевидно, за счет усиленного их образования в запасных белках эндосперма (Кударов, 1978; Труфанов, Кичатинова, 1989). Именно в этот период происходит интенсивное формирование сложного белкового комплекса эндосперма с образованием макромолекулярных структур глютенина, характерных для клейковины физиологически зрелого зерна пшеницы (Труфанов, 1994).

Независимо от генотипических (сортовых) различий по удельной активности протеин-дисульфид редуктазы и содержанию низкомолекулярных SH-соединений у всех исследованных сортов пшеницы в процессе генеративного развития максимум ферментативной активности проявлялся при влажности зерновок 45-55% и совпадал с максимумом содержания небелковых SH-групп. Наблюдаемые аналогии в динамике и совпадение максимумов активностей протеин-дисульфид редуктазы и глутатионредуктазы с периодом интенсивного образования надмолекулярных белковых структур, характерных для клейковины зрелого зерна, свидетельствуют об участии этих ферментов в формировании

белкового комплекса эндосперма, что является важным аргументом в пользу гипотезы о ферментативном характере образования белковых структур клейковины пшеницы.

Наличие сильной достоверной корреляционной связи (г=0,76) между количеством небелковых SH-соединений и удельной активностью протеин-дисульфид редуктазы (рис. 2). свидетельствует о важной роли глутатионредуктазы в регуляции дисульфидредуктазной функции фермента.

25

ЭН-группы, %

Рис 2. Точечный график и теоретическая линия регрессии при корреляции между содержанием небелковых SH-соединений и активностью протеин-дисульфид редуктазы.

Статистические параметры рассчитаны по средним значениям изученных показателей для четырех сортов яровой пшеницы, У=4.73 + 0.71х; г= 0.76±0.20; (1=0.58; 1с=3.8>1о.,

Судя по коэффициенту детерминации примерно 60% изменений протеин-дисульфид редуктазной активности обусловлено количеством небелковых SH-групп (в основном и около 40% изменений связано с

другими факторами.

Сходство динамики протеин-дисульфид редуктазной и глутатион-редуктазной активности позволяет предположить, что они функционируют в клетке в едином тесте, координированно регулируя не только работу белок-синтезирующей системы, но и SH/SS-метаболизм запасных белков.

Выделение и определение физико-химических свойств протеин-дисульфид редуктазы

Для препаративной очистки протеин-дисульфид редуктазы из пшеницы мы использовали анионит ДЭАЭ-сефадекс А-50 с высокой ионообменной емкостью (Остерман, 1985). Ионообменник уравновешивали 0.1 М Трис-НС1 буфером, рН 8.0, содержащим 1мМ ЭДТА, и проводили сорбцию фермента, экстрагированного водным раствором 1мМ ЭДТА, содержащего 1мМ ДТТ.

0,6

1 10 19 28 37 46 55 64 73 82 91 И1 абобаёоёё

Рис. 3. Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-сефадексе А-50.

1 - кривая десорбции белка с сорбента линейным градиентом NaCI; 2 -удельная активность протеин-дисульфидредуктазы (Е/мг белка).

Из рис.3 видно, что связанные сорбентом белки имели неодинаковый поверхностный заряд молекулы и отличались протеин-дисульфид редуктазной активностью. В 25-й фракции (табл. 2) удельная активность фермента возрастала, по сравнению с исходным экстрактом, более чем в 20 раз (от 3.06 х 10"3 до 66.4 х 10"3 Е/мг), достигая максимума в 31-й фракции (501.5 х 10"3 Е/мг, степень очистки 164). Наличие третьего пика протеин-дисульфид редуктазной активности (фракция 34), вероятно, связано с существованием в зерновке пшеницы нескольких молекулярных форм фермента (вероятно трех), различающихся поверхностным зарядом и, соответственно, различным сродством к сорбенту.

Таблица 2. Активность протеин-дисульфид редуктазы в разных фракциях после ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-сефадексе А-50

Номер Белок, мг/мл Активность, Уд.активность, Степень

фракции Е/млх 10° Е/мгх103 очистки

Исх.экстракт 9,8 30 3,06 1

25 0,11 7,3 66,4 21,7

26 0,104 23,1 222,1 72,7

27 0,105 25,6 243,8- 79,6

28 0,091 38,5 422,5 138,0

29 0,073 26,6 364,4 119,2

30 0,084 28,5 339,3 110,8

31 0,067 33,6 501,5 163,9

32 0,048 9,9 206,2 67,2

33 0,035 15,0 428,6 140,0

34 0,029 14,1 486,2 158,6

35 0,032 11,3 353,1 115,1

36 0,028 5,1 182,1 60,0

Ранее, на основе результатов по частичной очистке протеин-дисульфид редуктазы из зерновок пшеницы молочной спелости методом аффинной хроматографии на тиопропилсефарозе 4В было предположено существование нескольких изоформ ферментов, обладающих способностью расщеплять SS-связи в белковых субстратах, но различающихся содержанием SH-групп в молекуле белка (Труфанов и др., 1999). Недостаточная эффективность разделения молекулярных форм протеин-дисульфид редуктазы (рис.3) можно объяснить тем, что в процессе элюирования белков с ДЭАЭ-сефадекса А-50 происходило естественное сжимание гранул сорбента в колонке (в 1,5 раза при возрастании градиента концентрации NaCI). При этом, соответственно, снижалась скорость свободного потока буфера через колонку и нарушался процесс десорбции белка с ионообменника

Одновременно с определением протеин-дисульфид редуктазной активности, в полученных фракциях элюата контролировали присутствие других ферментов тиол-дисульфидного обмена: липоксигеназы и глутатионредуктазы. Для этой цели, после нативного электрофореза по Дэвису (Devis, 1964), использовали метод селективного окрашивания в пластинках ПААГ по модифицированным нами методикам (Ye et al., 1997; Heydeck et al., 1985).

Рис. 4. Селективное окрашивание в пластинках ПААГ на липоксигеназу (а) и глутатионредуктазу (б).

Рис. а - 22-24 - белковые фракции, полученные при ионообменной хроматографии с липоксигеназной активностью;рис. б - фракции имеющие активность глутатиопредуктазы: 1 - исходный ферментный экстракт; 2534 - фракции после градиента концентрации NaC (рис.3).

При анализе ферментативной активности в белковых фракциях методом специфического окрашивания в блоках ПААГ было обнаружено, что липоксигеназа зерновок пшеницы состоит из трех изоформ- форм, различающихся зарядом молекулы. Эти данные согласуются с результатами других исследователей ^Ы^ et э1., 1991), показавших наличие трех изоформ

11

липоксигеназы. При ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-сефадексе А-50 фермент элюировался перед протеин-дисульфид редуктазой в трех фракциях (рис.4,а). Очевидно, отрицательный поверхностный заряд молекулы липоксигеназы, по сравнению с протеин-дисульфид редуктазой, не позволяет достаточно прочно связаться с сорбентом, в результате чего фермент выходил из колонки при невысоких концентрациях градиента

Несколько иначе происходила десорбция с сорбента НАДФН-зависимой глутатионредуктазы. Селективное окрашивание фермента после нативного электрофореза в пластинах ПААГ показало присутствие его во всех белковых фракциях, в том числе обладающих липоксигеназной и протеин-дисульфид редуктазной активностью, полученных при ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-сефадексе Л-50 (рис. 4, б). При этом было выявлено, что фермент представлен двумя молекулярными формами с различной относительной электрофоретической подвижностью (ОЭП) 0.36 и 032 (GR 1 и GR 2, соответственно), которые разделились при десорбции белков с анионита линейным градиентом концентрации Исходный ферментный экстракт

содержал обе изоформы фермента (рис. 4, б, трек 1). При ионообменной хроматографии сначала элюировалась с сорбента молекулярная форма глутатионредуктазы (GR 2) с ОЭП 0.32 (треки 25-32), а затем - (GR 1) с ОЭП 0.36 (треки 33,34).

Исходя из полученных нами результатов, НАДФН-зависимая глутатионредуктаза, по всей видимости, функционирует сопряженно с глутатион-зависимой тиол:протеиндисульфид оксидоредуктазой. Сущность этой сопряженности состоит в ферментативной регенерации окисленной формы глутатиона в восстановленную форму, которая служит донором водорода при ферментативном восстановлении SS-связей протеин-дисульфид редуктазой. Интересно, что при десорбции белка с колонки линейным градиентом концентрации белковые элюаты содержали оба фермента,

причем протеин-дисульфид редуктазная активность обнаруживалась в присутствии как одной, так и другой изоформы глутатионредуктазы. Вероятно, различие в величине поверхностного заряда обеих изоформ глутатионредуктазы не влияет на сопряженность функционирования с протеин-дисульфид редуктазой.

При рехроматографии на ДЕАЕ-сефадексе А-50 в линейном градиенте

происходило разделение этой системы ферментов. Анализ полученных фракций методом ПААГ-электрофореза в присутствии ДДС-№ показал достаточно высокую степень очистки протеин-дисульфид редуктазы. Гомогенность полученного в результате рехроматографии ферментного препарата была подтверждена методом капиллярного электрофореза, показавшего присутствие в пробе единственного белкового пика (рис. 5).Выделение в гомогенном состоянии протеин-дисульфид редуктазы пшеницы позволило изучить ее некоторые биохимические свойства.

Для определения субстратной специфичности фермента применяли стандартную методику по определению активности фермента. В качестве кофактора использовали восстановленный глутатион в концентрации 1 мМ.

Рис 5. Денситограмма очищенного ферментного препарата протеин-дисульфид редуктазы, полученная в результате капиллярного электрофореза.

Кривая зависимости скорости реакции восстановления SS-связей от концентрации субстрата, инсулина, представлена на рис. 6, а при использовании в качестве субстрата бычьего сывороточного альбумина на рис. 7.

Рис. 6. Зависимость активности Рис7 Зависимость активности (MKMSHA) протеин-дисульфид (мкМ SH/t) протеин-дисульфид редуктазы от концентрации инсулина редуктазы от концентрации БСА (мкМ в реакционной среде). (мкМ в реакционной среде).

Км для инсулина, рассчитанная методом двойных обратных величин оказалась 2.18 мкМ (рис. 8,а), а для БСА - около 570 мкМ (рис. 8,6).

Из представленных данных следует, что наибольшим сродством фермент обладает к инсулину, что согласуется с данными для аналогичных по функции тиол:протеиндисульфид оксидоредуктаз из объектов животного происхождения (Carmichael et а1., 1979; Srivastava et а1., 1991). Так, у двух белков (р2 и р5), выделенных из печени крысы и имеющих тиол:протеиндисульфид оксидоредуктазную активность, при концентрации

кофактора ГSH 0,5 мМ Км для инсулина составляла 33.0 и 6.7 мкМ, а при концентрации ГSH 0.5 мкМ - 670 и 690 мкМ соответственно (Srivastava et al., 1991). При концентрации же ГSH 1.43 мМ Км для тиол:протеиндисульфид оксидоредуктазы из печени быка составила 31.0 мкМ (Ansorge et в!, 1973).

а б

Рис 8. График расчета Км для инсулина (а) и БСА (б) методом Лайнуивера-Бэрка.

1/V - величина обратная скорости реакции, 1/С — величина обратная концентрации субстрата.

Это говорит о высокой чувствительности ферментов с протеин-дисульфид редуктазной активностью к содержанию кофактора (^Н) для проявления ферментативной активности. Еще в ранних работах по изучению фермента была показана сопряженность функционирования тиолгпротеиндисульфид оксидоредуктазы с глутатионредуктазой (Tomizawa, 1962). Очевидно, в развивающихся зерновках пшеницы, также как и в объектах животного происхождения, может происходить ферментативная регуляция активности протеин-дисульфид редуктазы глутатионредуктазой, обеспечивающей реакции восстановления SS-связей окисленного глутатиона.

Для определения оптимальной температуры проявления протеин-дисульфид редуктазной активности применяли стандартную методику по определению активности фермента.

Было установлено, что для протеин-дисульфид редуктазы пшеницы оптимум температуры находился в интервале от 33 до 38°С, при этом максимальная активность проявлялась при температуре 36°С (рис. 9). Аналогичные по функции ферменты, выделенные из животных тканей, имеют близкий оптимум температуры - 37°С (Chandler, Varandani, 1972; Varandani, 1973). Очевидно, температура играет важную роль для скорости ферментативной реакции по расщеплению SS-связей, особенно на этапе образования фермент-субстратного комплекса, и не зависит от источника выделения.

Оптимум рН протеин-дисульфид редуктазной активности определяли в 0.1 М Трис-HCI буферных растворах, содержащих 1 мМ ЭДТА и имеющих интервал значений рН от 5.0 до 8.0, при постоянной температуре 36°С. В качестве кофактора использовали восстановленный глутатион в

концентрации 1 мМ.

Рис. 9. Зависимость активности Рис. 10. Определение рН-

протеин-дисульфид редуктазы оптимума протеин-дисульфид

пшеницы (мкМ SH/t) от редуктазы пшеницы при Зб°С. температуры реакции среды (С).

По нашим данным протеин-дисульфид редуктаза пшеницы проявляла максимальную активность при рН в интервале от 6.0 до 7.5, с максимальной активностью при рН 7.0 (рис. 10). Этот оптимум рН несколько отличается от оптимума рН тиол:протеиндисульфид оксидоредуктазы из животных объектов, где он составляет от 7.5 до 8.5 (Tomizawa, 1962; Carmichael et al., 1979), однако близок ферменту из микробиологических объектов, где оптимум рН находится в пределах от 6.5 до 7.5 (Ruddock et al., 1996).

Щ _67 kDa

1 2

Рис. 11. Электрофорез в присутствии 0.01% ДДС-Na в 7% ПААГ.

1- маркеры ( ферритин — 440 кДа, каталаза - 232 кДа, лактатдегид-рогеназа - 140 кДа, БСА - 67 кДа),

2- протеин-дисульфид редуктаза.

12 kDa— яж

1 2

Рис. 12. ДЦС-^-электрофорез по Лэммли в 10% ПЛАГ. 1- маркеры (гамма глобулин — 160 кДа, БСА - 67 кДа; овалъбумин -45кДа, цитохром С -12 кДа), 2-протеин-дисульфидредуктаза

Для определения молекулярной массы гомогенного нативного фермента (рис. И) использовали метод неденатурирующего электрофореза в присутствии ДЦС-№ по методике А.В.Колесниченко (Колесниченко и др., 2000). Сущность метода состоит в эффективном разделении лабильных белков и белковых комплексов в ПААГ без нарушения их нативного состояния. При наличии в электродном буфере 0.001-0.01% ДДС-№ не проявляется денатурирующая активность этого детергента и обеспечивается высокая разрешающая способность электрофореза (Голицин, 1999). Определенная молекулярная масса нативной протеин-дисульфид редуктазы оказалась около 167 кДа (рис. 11).

Для определения субъединичного состава и молекулярной массы предварительно восстановленной протеин-дисульфид редуктазы был использован метод электрофореза в ПЛАТ в присутствии ДЦС-№ по Лэммли (Laeramli, 1970). Очищенный ферментный препарат был восстановлен в присутствии 2% ДЦС-№ и 5% 2-меркаптоэтанола и проанализирован в 10% ПААГ. Было выявлено, что фермент состоит из двух субъединиц с молекулярной массой 73 и 77 кДа, которые, очевидно, связаны между собой 88-мостиками, разрушаемыми 2-меркаптоэтанолом (рис. 12).

При молекулярной массе нативного белка около 167 кДа и субъединичному составу 73 и 77 кДа, протеин-дисульфид редуктаза отличается от подобных по функции ферментов из зерновок пшеницы. По молекулярной массе протеин-дисульфид редуктаза не является протеин-дисульфид изомеразой (57 кДа (Freedman et al., 1994) и 60 кДа (Shimoni et al., 1995)), и тиоредоксинредутазой (35 кДа (Kobrehel et в1., 1992)), способных, по литературным данным также восстанавливать SS-связи в запасных белках зерновки пшеницы.

Действие протеин-дисульфид редуктазы на агрегирующую способность белков клейковины и физические свойства теста пшеницы

Для выяснения действия протеин-дисульфид редуктазы на агрегацию запасных белков клейковины пшеницы использовали уксуснорастворимую фракцию клейковинных белков, с содержанием в реакционной среде 0.01% белка в соответствии с методикой (Arakawa et в1., 1975, 1976). Как уже отмечалось выше, протеин-дисульфид редуктаза - глутатион-зависимый фермент, поэтому при проведении экспериментов и в контроль и в опыт вносили восстановленный глутатион в концентрации 1 мМ. В опытном варианте экспериментов добавляли гомогенный ферментный препарат с конечным содержанием в инкубационной среде около 0.001%.

На рис. 13. представлены результаты экспериментов по влиянию на агрегирующую способность уксуснорастворимой фракции клейковины протеин-дисульфид редуктазы. Обращает на себя внимание снижение агрегирующей способности при внесении фермента по сравнению с контролем. При этом различия агрегации между контролем и опытом составляла в среднем 15 - 22%, что характеризовалось ухудшением клейковины. Так, показатель (за 10 мин процесса), характеризующий

степень агрегации в контроле составлял 134.1 ± 4.6, при опыте - 114.6 ± 1.2. При увеличении времени эксперимента (до прекращения процесса агрегации) до 25 мин показатель агрегации составил в контроле 143.6 ± 5.1, а в опыте 119.4 ± 1.2. Следовательно, добавление з опытном варианте протеин-дисульфид редуктазы, снижало агрегирующую способность клейковинных белков.

0.8

0.7 ||||ТТТ|'1"т'"

0.6

0.5

0.4 *

0.3 ■

0.2

0.1

04

1 2 3 4 5 в 7 а 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 время агрегации, мин

Рис. 13. Агрегационные кривые уксуснорастворимых белков пшеницы Тулунская 12.

1 - контроль (без протеин-дисульфид редуктазы); 2 - опыт (в присутствии фермента).

Очевидно, что даже незначительное добавление протеин-дисульфид редуктазы при замесе теста приводит к изменению его физического состояния за счет разрыва некоторых 88-связей и зависит от сортовых особенностей муки.

Протеин-дисульфид редуктаза влияет на физические свойства муки и теста (альвеограф). Это было показано на примере двух сортов пшеницы -ОгапшиНпо и Мироновская 808, когда добавление небольшого количества фермента приводило к изменениям в основных показателях качества. При внесении в муку фермента наблюдалось повышение силы муки в 1.3-1.5 раза относительно контроля, а также увеличение упругости теста и отношения Р/Ь независимо от сортовых особенностей пшеницы. При этом, у сравнительно низкокачественного сорта Мироновская 808 увеличение показателя силы муки было статистически достоверным. У пшеницы сорта Мироновская 808, заметно возрастала также растяжимость теста, в отличие от муки сорта вгапшиИпо.

Эффекты замещения хромосом 4 и 5 гомеологических групп по удельной активности липоксигеназы у линий разнокачественных сортов пшеницы

Линии с межсортовым замещением отдельных пар хромосом, контролирующих синтез и/или активность липоксигеназы у

разнокачественных сортов пшеницы, представляют собой очень удобный генетический материал не только для изучения влияния донорских генов, но для обогащения генотипов липоксигеназной активностью. В связи с этим представляло интерес изучить эффекты замещения по величине удельной активности этого фермента каждой хромосом. 4-й и 5-й гомеологических групп.

Как видно из таблицы 3, по содержанию растворимых белков сорт-донор ДР превосходил сорт-реципиент С29 на 50%. У всех замещенных линий этот показатель также выше, чем у С29, но достоверные различия были найдены только с линиями С29/ДР 4А, С29/ДР 4В и С29/ДР 5Б.

По единицам активности ДР почти в 2,5 раза превышал сорт С29. У линий С29/ДР 4А и С29ДР 5 А активность тоже была выше, чем у реципиента С29, но ниже, чем у донора ДР. Активность липоксигеназы у остальных замещенных линий была близка к значениям С29.

Таблица 3. Активность липоксигеназы растворимой фракции белков пшеничной муки

Сорт, линия Белок, мг/мл Активность, (Е/мл) Уд. активность (Е/мг белка)

Саратовская 29, С29, сорт-реципиент 0.118±0.01 12.01±1.1 101.2±1.6

Janetzkis Probat,

JP, сорт-донор 0.176±0.005*** 28.97±0.2*** 164.7±3.5***

C29/JP 4А 0.159±0.005* 18.30±1.1* 115.0±4.6*

C29/JP4B 0.169±0.005** 10.40±0.4 63.2±3.3

C29/JP4D 0.143±0.008 12.44±0.6 88.0±1.6

C29/JP 5А 0.119±0.012 14.62±0.7 129.0±6.3*

C29/JP 5В 0.143±0.016 12.12±1.3 83.5±3.9

C29/JP 5D 0.161±0.004* 12.30±0.4 77.2±2.2

Примечание. Представлены средние арифметические значения +_стандартная ошибка, рассчитанные из трех биологических повторностей. - достоверность различий с сортом-реципиентом С29 на 5%, 1% и 0.1%-ном уровнях значимости, соответственно.

Следовательно, замещение хромосом 4В, 4Б, 5В и 5Б сорта-реципиента С-29 на гомологичные хромосомы сорта-донора ДР не приводит к увеличению активности фермента, способного окислять 8Н-группы запасных белков, повышать содержание 88-связей в белках клейковины и тем самым улучшать ее физические свойства.

По удельной активности сорт-донор JP более, чем на 60% превышал сорт-реципиент С29. Замена в геноме сорта С29 хромосом 4Л и 5Л от сорта-донора JP приводила к достоверному увеличению удельной активности соответственно на 13 и 27%. У остальных замещенных линий этот показатель оказался даже ниже, чем у С29.

Снижение удельной активности липоксигеназы при замещении хромосом 4В, 4D, 5В и 5D, вероятно, объясняется тем, что хромосомы сорта-донора Janetzkis Probat несут такие аллели липоксигеназы, которые не могут компенсировать активности соответствующих аллелей сорта-реципиента Саратовская 29. Имеются данные, что суммарная генетическая активность липоксигеназы у сорта обеспечивается генами шестью хромосом 4 и 5 гомеологических групп (Li et al., 1999). При замещении отдельных пар хромосом, естественно, нарушается этот генетически сбалансированный комплекс. Тем не менее, исходя из полученных результатов, при создании генотипов с высокой активностью фермента следует учитывать основополагающую роль хромосом 4А и 5А.

При исследовании ферментных экстрактов электрофоретическими методами с селективным окрашиванием в ПААГ нами обнаружено наличие трех форм липоксигеназы, отличающихся по заряду, как у разных сортов (Permyakov et al., 2002), так и у замещенных линий по хромосомам 4 и 5 гомеологических групп (Пермяков и др., 2000).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных экспериментов по изучению тиол-дисульфидного обмена в запасных белках зерновки пшеницы, установлено, что в регуляции этого процесса решающее значение имеют тиоловые кофакторы, такие как глутатион, выполняющий донорно-акцепторные функции в ферментативном катализе при расщеплении SS-связсй. Глутатион-зависимая протеин-дисульфид редуктаза проявляет наибольшую активность в присутствии восстановленного глутатиона, регенерация которого происходит с помощью глутатионредуктазы, расщепляющей окисленный глутатион. При исследовании серии генотипически различных сортов мягкой яровой пшеницы выявлена тесная сопряженность содержания низкомолекулярных SH-соединений (восстановленного глутатиона) с активностью протеин-дисульфид редуктазы. При этом на физиологически разных стадиях развития зерновки у различных сортов наблюдалась однотипная зависимость. Наличие сильной корреляционной связи свидетельствует о важной роли глутатионредуктазы в регуляции протеин-дисульфид редуктазной функции фермента, т.е. о функциональной взаимосвязи этих ферментов в процессах создания и регуляции SH/SS-статуса запасных белков.

Эксперименты по выделению протеин-дисульфид редуктазы из зерновок пшеницы методами дробного фракционирования сульфатом аммония, ионообменной хроматографии на ДЕЛЕ А-50, позволили очистить этот фермент до электрофорстически гомогенного состояния. В результате были изучены некоторые физико-химические характеристики и свойства протеин-

дисульфид редуктазы пшеницы и сопоставлены с аналогичными по функциям ферментами из различных объектов. При действии протеин-дисульфид редуктазы на уксуснорастворимую фракцию клейковинных белков пшеницы выявлено снижение агрегирующей способности при внесении фермента по сравнению с контролем. На примере двух сортов разного качества - Granmulino и Мироновская 808 показано изменение физических свойств теста даже при слабом действии протеин-дисульфид редуктазы (малое соотношение фермент/субстрат).

На основе полученных результатов можно предположить, что в зерновках пшеницы (Triticum aestivum К) одновременно с двумя системами ферментативного восстановления SS-связей в запасных белках пшеницы -НАДФН, НАДФН-зависимая тиоредоксинредуктаза, тиоредоксин и НАДФН, НАДФН-зависимая глутатионредуктаза, глутатион и глутаредоксин (Rouhier et а1., 2002), существует третья система - НАДФН, НАДФН-зависимая глутатионредуктаза, глутатион и протеин-дисульфид редуктаза (рис. 14).

Рис 14. Гипотетическая схема восстановления SS-связей в белках протеин-дисульфидредуктазой

GR-глутатионредуктаза; RED-протеин-дисулъфидредуктаза

На примере неродственных сортов мягкой яровой пшеницы Саратовская 29 и Janetzkis Probat и их линий с межсортовым замещением отдельных пар хромосом 4-й и 5-й гомеологических групп нами были изучены вклады хромосом 4А, 4В, 4D, 5А, 5В и 5D в проявление активности липоксигеиазы. В результате исследований было установлено, что наибольшее влияние на проявление удельной активности липоксигеназы оказывают структурные гены, локализованные на хромосомах 4А и 5А. Однако, учитывая то, что регуляция активности данного фермента носит полигенный характер (Li et al., 1999), возможно важную роль играют также гены-регуляторы, расположенные на других хромосомах.

1. В созревающей зерновке пшеницы одновременно присутствуют липоксигеназа, способная окислять SH-группы белков и система -НАДФН, НАДФН-зависимая глутатионредуктаза, глутатион и протеин-дисульфид редуктаза - катализирующая реакции восстановления SS-связей в белковых молекулах и регенерацию окисленного глутатиона.

2. Из зерновок пшеницы выделен в гомогенном состоянии фермент с тиол:протеиндисульфид оксидоредуктазной активностью, подобный

ВЫВОДЫ

глутатион:инсулин трансгидрогеназе из животных и микробиологических объектов.

3. Протеин-дисульфид редуктаза пшеницы имеет константу Михаэлиса-Ментона 2.18 мкМ для инсулина и 570 мкМ для БСА. Фермент имеет оптимум рН от 6.5 до 7.5 (max 7.0), а температуры от 33 до 38 С° (max 36 С°). Молекулярная масса фермента, состоящего из двух субъединиц с молекулярной массой 73 и 77 кДа, составляет 167 кДа.

4. Динамика активности протеин-дисульфид редуктазы в ходе развития зерновки пшеницы тесно коррелирует с активностью глутатионредуктазы (г = 0.76), а также с содержанием в запасных белках SS-связей и SH-rpynn.

5. В модельных экспериментах in vitro протеин-дисульфид редуктаза оказывает существенное влияние на SH/SS-баланс в белковом комплексе клейковины, изменяя агрегирующую способность запасных белков; силу муки, упругость, растяжимость, устойчивость и величину P/L. При этом степень изменений зависит от генотипических особенностей пшеницы и сорта муки.

6. В зерновках мягкой яровой пшеницы полной спелости, вероятно, присутствуют три молекулярные формы протеин-дисульфид редуктазы и две глутатионредуктазы. Установлено, что специфическая активность протеин-дисульфид редуктазы не зависит от типа глутатионредуктазы.

7. В зерновках мягкой яровой пшеницы различных сортов и линий с межсортовым замещением хро.мосом присутствуют 3 формы липоксигепазы, различающиеся поверхностным зарядом молекулы. Наибольший вклад в проявление активности липоксигеназы оказывают структурные гены, локализованные на хромосомах 4А и 5А.

Список работ, опубликовапных по теме диссертации

1. Кичатинова СВ., Пермяков А.В., Чеботарева О.Г., Труфанов В.А Тиол-дисульфидные ферменты разнокачественных сортов пшеницы // Н-й съезд ВОФР / Тез. докл.-Минск, 1990.

2. Кичатинова С.В , Труфанов В.А., Пермяков А.В. Активность ферментов тиол-дисульфидного обмена в клеточных органеллах развивающихся семян пшеницы // Материалы Ш-го съезда ВОФР.Санкт-ПетербурпНаука, 1993. Т.2. С. 127.

3. Кичатинова СВ., Труфанов В.А., Пермяков А.В. Тиолоксидазная и дисульфидредуктазная активности клеточных органелл пшеницы // Прикл. биохимия и микробиология. 1993. Т.29. вып.З. С. 412-417.

4. Труфанов В.А., Пермяков А.В., Кичатинова С.В. Дисульфидредуктазная и тиолоксидазная активности в зависимости от содержания низкомолекулярных тиолов в созревающей зерновке яровой пшеницы // Прикл. биохимия и микробиология. 1993. Т. 29. С 728-733.

5. Trufanov V.A., Kichatinova S.V., Permyakov A.V. The functional role of the enzymes of thiol-disulphide interchange in the formation of the wheat protein complex // Annual Symp.Thysical-chemical basis of plant physiology".

Pensa, 1996. P. 143-144.

6. Труфанов В.А., Кичатинова СВ., Пермяков А.В. Ферменты тиол-дисульфидного обмена и их действие на белки клейковины // Прикл. биохимия и микробиология. 1999. Т. 35. С. 219-222.

7. Труфанов В.А., Кичатинова СВ., Пермяков А.В., Диденко С.Л., Пермякова М.Д. Ферменты тиол-дисульфидного обмена в метаболизме белков пшеницы Triticum aestivum L. // Материалы IV -го съезда ОФР РАН. М: ИФР РАН, 1999. Тез. докл. Т.2. С715.

8. Диденко С.Л., Пермяков А.В., Труфанов В.А. Липоксигеназа мягкой яровой пшеницы: молекулярные формы, возможная физиологическая роль // Материалы IV -го съезда ОФР РАН. М.: ИФР РАН, 1999. Тез. докл. Т.2. С 567-568.

9. Труфанов В.А., Кичатинова СВ., Казарцева А.Т., Пермяков А.В. Взаимосвязь тиол-оксидазной и дисульфидредуктазной активностей с технологическим качеством пшениц // Прикл. биохимия и микробиология. 2000. Т. 36. С. 89-92.

10. Пермяков А.В., Диденко С.Л., Труфанов В .А, Пшеничникова Т.А., Майстренко О.И. Молекулярные формы липоксигеназы у замещенных линий пшеницы Triticum aestivum L. // 11-я конференция Европейского общества по апеуплоидии пшеницы, посвященная памяти О.И.Майстренко. 24-28 июля 2000. Новосибирск. С. 168.

11. Труфанов В.А., Осипова СВ., Пермяков А.В., Диденко С.Л., Пермякова М.Д., Березовская Е.В., Митрофанова Т.Н. Ферменты тиол-дисульфидного обмена в биотехнологическом улучшении качества клейковины пшеницы // Материалы межд. конференции «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий» 2001.Саранск. С. 146-148.

12. Didenko S.L., Permyakov A.V., Trufanov V.A., Pshenichnikova T.A., Maystrcnko O.I. Molecular forms of lipoxygenase from substituted line grains of wheat Triticum aestivum L. // EWAC Newsletter. 2001. PP.102-105.

13. Permyakov A.V., Didenko S.L., Trufanov V.A. Molecular forms of lipoxygenase from the grain of various cultivars of Triticum aestivum L. // Ann. Wheat Newslet. 2002.48. PP. 147-148.

14. Trufanov V.A., Permyakov A.V., Permyakova M.D., Pshenichnikova T.A. Lipoxygenase activity in common wheat lines with substitutions for chromosomes of 4 and 5 homoclogical groups // 12th International EWAC Workshop. 1-6 jule2002. Norwich. Abstracts.

15. Trufanov V.A., Permyakov A.V., Permyakova M.D., Pshenichnikova T.A. Lipoxygenase activity in common wheat lines with substitutions for chromosomes 5A and 5D // EWAC Newsletter. 2003. PP. 127-128.

16. Pshenichnikova T.A., Ermakova M.F., Popova R.K., Trufanov V.A., Osipova S.V., Permyakov A.V. Development and use of precise genetic stocks for study of technological parameters of grain in common wheat // EWAC Newsletter. 2003. PP. 21-24.

17. Пермяков А.В., Труфанов В.А., Пшеничникова Т.А. Регуляция активности липоксигеназы в зерновках замещенных линий пшеницы

Triticum aestivum L. // Материалы V-го съезда ОФР РАН. Пенза. 2003. Тез. докл. С. 421.

18. Pchenichnikova T.A., Shchukina L.V., Panina G.M., Fenina G.O., Trufanov V.A., Permyakov A.V., Permyakova M.D. Genetic study of morphological and biochemical characters introgressed into common wheat from Aegilops speltoides Tausch. // Tenth International Wheat Genetics Symposium. 1-6 sept. 2003. Paestum, Italy. PP 77-80.

»-590*

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Пермяков, Алексей Викторович

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Запасные белки пшеницы.

1.1.1. Глиадины.

1.1.2 Глюгенины

1.1.3. Биосинтез запасных белков

Ф 1.1.4. Отложение белков в запас

1.2. Роль ББ-связей в формировании и стабилизации белкового комплекса клейковины

1.3. Тиол-дисульфидные реакции в белках

1.3.1. Тпол:прогеиндисульфид оксидоредуктаза (КФ 1.8.4.2)

1.3.2. НАДФН:окислеппый глутатион оксидоредуктаза (КФ 1.6.4.2)

1.3.3. НАДФН:тиоредоксин редуктаза (КФ 1.6.4.5)

1.3.4. Тиолгиротеиндисульфид изомераза (КФ 5.3.4.1)

1.3.5. Тиолжислород оксидоредукгаза (КФ 1.8.3.2)

1.3.6. Линолеатгкислород оксидоредуктаза (КФ 1.13.11.12)

1.3.7. Глутагионтрансфераза (КФ 2.5.1.18)

1.4. Сопряженность функционирования системы ферментов БН/БЗ-метаболизма

ГЛАВА

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Объекты исследования

2.2. Выделение ферментных экстрактов

2.3. Определение содержания белка

2.4. Определение активности тиолгпрогеиндисульфид оксидоредуктазы

2.5. Определение активности липоксигеназы

2.6. Определение содержания БН-групп и ББ-связей в белках созревающих зерновок пшснинм.

2.7. Выделение уксусно-растворимой фракции белков клейковины

2.8. Определение агрегирующей способности запасных белков и показателей качества клейковины

2.9. Очистка ферментов тиол-дисульфидного обмена с помощью

Ф ионообменной хроматографии

2.10. Электрофорез белков ферментных экстрактов

2.10.1. Электрофорез пативных белков в ПААГ

2.10.2. Электрофорез в ПААГ с ДЦСМЧа.

2.10.3. Окраска и обесцвечивание гелей

2.10.4. Окраска гелей нитратом серебра

2.10.5. Определение молекулярной массы белков

2.11. Селективное окрашивание ферментов в пластинках ПААГ

2.11.1. Селективное окрашивание глутатионредуктазы

2.11.2. Селективное окрашивание липоксигеназы

2.12. Капиллярный электрофорез

2.13. Определение константы Михаэлиса-Ментон методом Лайнуивера-Бэрка

2.14. Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Влияние протеин-дисульфид редуктазной активности на БН/ЗБ-статус запасных белков в развивающейся зерновке пшеницы .•

3.2. Выделение и определение физико-химических свойств протеиндисульфид редуктазы

3.2.1. Состав белков ферментных фракций, контроль чистоты препаратов

3.2.2. Сродство фермента к различным субстратам.

3.2.3. Оптимум температуры

3.2.4. Оптимум рН

3.2.5. Молекулярная масса фермента

3.3. Действие протеин-дисульфид редуктазы на агрегирующую способность белков клейковины и физические свойства теста пшеницы

3.4. Эффекты замещения хромосом 4 и 5 гомеологических групп по удельной активности липоксигсназы у линий разнокачественных сортов пшеницы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Протеин-дисульфид редуктаза и липоксигеназа пшеницы в ферментативной регуляции SH/SS-обмена в запасных белках зерновки: физиолого-биохимические аспекты"

Белки пшеничного зерна, образующие клейковину, отличаются от запасных белков семян других злаков, прежде всего своими уникальными реологическими свойствами. В зависимости от сорта и условий выращивания пшеницы в зерне формируются белковые комплексы клейковины с очень разными физико-химическими и реологическими свойствами, совокупность которых принято обозначать технологическим термином "качество клейковины". Выделенная из пшеничной муки обычными методами клейковина содержит 80-85 % белка, 10-15 % углеводов и 2-8 % лииидов ( Вакар, 1961). В клейковине высокого качества содержание SS-связей на 22

31 % выше (Кретович, Вакар, 1974). Разнокачественность клейковины у сортов пшениц связана с содержанием и соотношением в ней SS-связей и SI 1-групп (Кретович, 1987, 1991; Труфанов и др., 1993). Существующая в зерновках пшеницы специфическая система ферментов тиол-дисульфидного метаболизма катализирует образование, распад и изомеризацию (перегруппировку) SS-связей в запасных белках, т.е. имеет прямое отношение к созданию SM/SS-статуса запасных белков и, следовательно, к формированию структур!,I белкового комплекса клейковины (Труфанов,

1994).

В этом отношении представляют интерес данные о функционировании в зерновке пшенице системы НАДФН-зависимой тиоредоксинредуктазы (Suskc et al., 1979; Kobrehel et al., 1992; Wong et al., 1996), НАДФН-зависимой иротеиидисульфид оксидоредуктазы (Hatch et al., 1960; Горпинчснко и др., 1972, 1975), глутатион-зависимой протеиндисульфид оксидоредуктазы (Кузнецов, Труфанов, 1981; Труфанов, Кичатинова, 1989), восстанавливающих SS-связи в запасных белках пшеницы, и НАДФНзависимой глутатионредуктазы, восстанавливающей SS-связи окисленного глутатиона (Проскуряков, Зуева, 1963, 1964; Lascano et. al., 2001). НАДФНзависимая протеин-дисульфид изомераза катализирует перегруппировку в белках термодинамически напряженных SS-связей (Grynberg et al., 1977; Shimoni et al., 1995; Galili et al., 1996).

Имеются сведения об участии линоксигеназы в образовании SS-связей в запасных белках пшеницы путем опосредованного окисления SH-групп перекисями и гидроперекисями ненасыщенных жирных кислот (Кретович, 1991; Shiiba, 1991).

Ферментативное окисление сульфгидрильных групп запасных белков может происходить с помощью кислород-зависимых тиолоксидаз (Труфанов и др., 1989), подобных тиолоксидазам животных клеток (Lash, Jones, 1984, 1986). Участие в тиол-дисульфидных реакциях в запасных белках пшеницы могут принимать также глутатионтрансфераза (Pascal et al., 1988) и глугатион-зависимая дегидроаскорбат оксидоредуктаза (Every, 1996; De Gara et al., 2002).

Таким образом, в зерновке пшеницы одновременно функционирует сложная система специфических ферментов, относящихся к классу оксидоредуктаз и регулирующих SH/SS-статус белков в клетке. Катализируя образование, распад пли перегруппировку термодинамически напряженных SS-связей и обеспечивая оптимальный уровень низкомолекулярных тиолоиых кофакторов (например, глутатионредуктаза), эти ферменты участвуют в регуляции процессов тиол-дисульфидного обмена в зерновках in vivo.

Одни из этих ферментов изучены более хорошо, другие недостаточно. Так, протеин-дисульфид редуктаза, катализирующая восстановление SS-связей в белках, слабо изучена в объектах растительного происхождения. Линоксигеназа, наоборот, являясь многофункциональным ферментом, часто привлекает внимание исследователей.

Цель настоящей работы заключалась в изучении физиолого-биохимических аспектов регуляции тиол-дисульфидного обмена в развивающейся зерновке пшеницы на примере трех ферментов: протеин-дисульфид редуктазы, глутатионредуктазы и липоксигеназы участвующих в создании БМ/БЗ-статуса запасных белков.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить динамику протеин-дисульфид редуктазной активности и содержание небелковых БН-групп в процессе созревания зерновки пшеницы.

2. Выделить в гомогенном состоянии протеин-дисульфид редуктазу пшеницы с использованием методов солевого фракционирования, колоночной хроматографии и электрофореза в ПААГ.

3. Изучить биохимические характеристики очищенного фермента.

4. Изучить компонентный состав ферментного экстракта методами нативного и денатурирующего электрофореза в пластинках ПААГ.

5. Выявить молекулярные формы исследуемых ферментов в созревающей зерновке пшеницы.

6. Изучить особенности проявления активности липоксигеназы у разнокачественных сортов и линий пшеницы с межсортовым замещением хромосом 4 и 5 гомеологических групп.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, главы с результатами и их обсуждением, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 150 страницах машинописного текста, включая восемь таблиц и 32 рисунка. Список литературы включает 246 наименований, из них 46 на русском языке.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Пермяков, Алексей Викторович

выводы

1. В созревающей зерновке пшеницы одновременно присутствуют липоксигеназа, способная окислять SII-группы белков и система -НАДФН, НАДФН-зависимая глутатиоиредуктаза, глутатиои и протеин-дисульфид редуктаза - катализирующая реакции восстановления SS-связей в белковых молекулах и регенерацию окисленного глутатиона.

2. Из зерновок пшеницы выделен в гомогенном состоянии фермент с тиол:протеиндисульфид оксидоредуктазной активностью, подобный глутатион:инсулин трансгидрогеназе из животных и микробиологических объектов.

3. Протеин-дисульфид редуктаза пшеницы имеет коистаиту Михаэлиса-Меитои 2.18 мкМ для инсулина и 570 мкМ для БСА. Фермент имеет оптимум рН от 6.5 до 7.5 ( max 7.0), а температуры от 33 до 38 С° ( шах 36 С0). Молекулярная масса фермента, состоящего из двух субъединиц с молекулярной массой 73 и 77 кДа, составляет 167 кДа.

4. Динамика активности протеин-дисульфид редуктазы в ходе развития зерновки пшеницы тесно коррелирует с активностью глутатионредуктазы (г = 0.76), а также с содержанием в запасных белках SS-связей и SH-групп.

5. В модельных экспериментах in vitro протеии-дисульфид редуктаза оказывает существенное влияние на SH/SS-баланс в белковом комплексе клейковины, изменяя агрегирующую способность запасных белков; силу муки, упругость, растяжимость, устойчивость и величину P/L. При этом степень изменений зависит от генотииических особенностей пшеницы и сорта муки.

6. В зерновках мягкой яровой пшеницы полной спелости, вероятно, присутствуют три молекулярные формы протеин-дисульфид редуктазы и две - глутатионредуктазы. Установлено, что специфическая активность протеин-дисульфид редуктазы не зависит от типа глутатионредуктазы.

В зерновках мягкой яровой пшеницы различных сортов и линий с межсортовым замещением хромосом присутствуют 3 формы лииоксигеназы, различающиеся поверхностным зарядом молекулы. Наибольший вклад в проявление активности липоксигеназы оказывают структурные гены, локализованные на хромосомах 4А и 5А.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных экспериментов по изучению тиол-дисульфидного обмена в запасных белках зерновки пшеницы, установлено, что в регуляции этого процесса решающее значение имеют тиоловые кофакторы, такие как глутатион, выполняющий донорно-акценторные функции в ферментативном катализе при расщеплении ЗБ-связей. Глутатион-зависимая протеин-дисульфид редуктаза проявляет наибольшую активность в присутствии восстановленного глутатиоиа, регенерация которого происходит с помощью глутатионредуктазы, расщепляющей окисленный глутатион. При исследовании серии генотипически различных сортов мягкой яровой пшеницы выявлена тесная сопряженность содержания низкомолекулярных БН-соединений (восстановленного глугатиона) с активностью протеин-дисульфид редуктазы. При этом на физиологически разных стадиях развития зерновки у различных сортов наблюдалась однотипная зависимость. С фазы формирования зерновок начинался интенсивный синтез низкомолекулярных БН-соединений, в основном Г-БН -тиолового кофактора ферментативного восстановления ББ-связей в белках. В ходе дальнейшего развития зерновки количество низкомолекулярных БН-соединений возрастало и на стадии молочной спелости (при влажности зерновки около 50%) достигало максимума, а с наступлением фазы тестообразной спелости содержание низкомолекулярных БН-груин снижалось параллельно со снижением протеин-дисульфид редуктазной активности. Интенсивное образование небелковых БН-соединепий сопровождалось увеличением активности протеин-дисульфид редуктазы, при этом максимум содержания тиоловых кофакторов совпадал с максимумом БЗ-редуктазной активности. Наличие сильной корреляционной связи (г=0.76) свидетельствует о важной роли глутатионредуктазы в регуляции нрогеин-дисульфид редуктазной функции фермента, т.е. о функциональной взаимосвязи этих ферментов в процессах создания и регуляции SII/SS-статуса запасных белков.

Эксперименты по очистке протеин-дисульфид редуктазы из зерновок пшеницы методами дробного фракционирования сульфатом аммония, ионообменной хроматографии на ДЕЛЕ А-50, позволили очистить этот фермент до электрофоретически чистого состояния. В результате были изучены некоторые биохимические характеристики и свойства протеин-дисульфид редуктазы пшеницы и сопоставлены с аналогичными по функциям ферментами. Так при молекулярной массе нативного белка 167 кДа и субъединичиому составу 73 и 77 кДа, протеин-дисульфид редуктаза пшеницы отличается от подобных ферментов из других объектов. По молекулярной массе протеин-дисульфид редуктаза не является протеин-дисульфид изомеразой (57 кДа (Freedman et al., 1994) и 60 кДа (Shimoni et al., 1995)), и тиоредоксииредутазой (35 кДа (Kobrehel et al., 1992)), способных, по литературным данным также восстанавливать SS-связи в запаенглх белках зерновки пшеницы. По субстратной специфичности фермент близок к тиол:нротеиндисульфид оксидоредуктазам из различных объектов, способен катализировать инактивацию инсулина путем восстановления SS-мостиков между А- и В-цепочками белка, ио имеет различие в константе Михаэлиса-Ментона. По оптимуму рН 7.0 фермент близок протеин-дисульфид редуктазе из холерного вибриона (Ruddock et al., 1996), а оптимуму температуры 36°С -к ферментам из животных объектов (Carmichael et al., 1979).

При действии протеин-дисульфид редуктазы на уксуснорастворимую фракцию клейковинных белков пшеницы выявлено снижение агрегирующей способности при внесении фермента но сравнению с контролем. Различие в величине показателя агрегации Тю/С между контролем и опытом составляла в среднем от 15 до 22%. Показатель агрегации Тю/С (за 10 мин процесса) контроля составлял 134.1 ± 4.6 при опыте 114.6 ± 1.2, что говорит о снижении агрегирующей способности клейковинных белков при добавлении фермента. На примере двух сортов разного качества - Granmulino и Мироновская 808 показано изменение физических свойств теста даже при слабом действии протеин-дисульфид редуктазы (малое соотношение фермент/субстрат).

На основе полученных результатов можно предположить, что в зерновках пшеницы (Triticum ciestivum L.) одновременно с двумя системами ферментативного восстановления SS-связей в запасных белках пшеницы -ПАДФН, НАДФН-зависимая тиоредоксинредуктаза, тиорсдоксин и НАДФН, НАДФН-зависимая глутатионредуктаза, глутатион и глутаредоксин (Rouhier et al., 2002), существует третья система - НАДФН, НАДФН-зависимая глутатионредуктаза, глутатион и протеин-дисульфид редуктаза (рис.32).

Рис. 32. Гипотетическая схема восстановления SS-связей в белках 11 ротеи н-ди сул ьфид реду ктазой.

GR-глутатионредуктаза; RED-протеин-дисульфид редуктаза.

Как уже отмечалось, наш интерес к липоксигеназе обусловлен, прежде всего, участием этого фермента в образовании оксидных радикалов, способных окислять in vivo SH-группы запасных белков пшеницы с образованием внутри- и межмолекулярных дисульфидных связей, стабилизирующих белковый комплекс клейковины. Это обстоятельство имеет важное значение при разработке теоретических основ для создания новых генотипов (сортов) пшеницы методами хромосомной инженерии. Действительно, межсортовое замещение определенных хромосом у высокобелковых, но с низким качеством клейковины сортов реципиентов, на гомологичные хромосомы высококачественных сортов доноров, несущих основные структурные и/или регуляторные гены липоксигеназы, перспективно для обогащения реципиентов этим ферментом и улучшения реологических показателей теста и качества клейковины на уровне copra.

На примере неродственных сортов мягкой яровой пшеницы Саратовская 29 и Janetzkis Probat и их линий с межсортовым замещением отдельных пар хромосом 4-й и 5-й гомсологических групп нами были изучены вклады хромосом 4А, 4В, 4D, 5А, 5В и 5D в проявление активности липоксигеназы. В результате исследований было установлено, что наибольшее влияние на проявление удельной активности липоксигеназы оказывают структурные гены, локализованные на хромосомах 4А и 5А. Однако, учитывая то, что регуляция активности данного фермента носит полигенный характер (Li et al., 1999), возможно важную роль играют также гены-регуляторы, расположенные на других хромосомах.

Снижение удельной активности липоксигеназы при замещении хромосом 4В, 4D, 5В и 5D, вероятно, объясняется тем, что хромосомы сорта-донора Janetzkis Probat несут такие аллели липоксигеназы, которые не могут компенсировать активности соответствующих аллелей сорта-реципиента Саратовская 29. Имеются данные, что суммарная генетическая активность липоксигеназы у сорта обеспечивается генами шестью хромосом 4 и 5 гомсологических групп (Li et al., 1999). При замещении отдельных пар хромосом, естественно, нарушается этот генетически сбалансированный комплекс. Тем не менее, исходя из полученных результатов, при создании генотипов с высокой активностью фермента следует учитывать основополагающую роль хромосом 4А и 5А.

При исследовании ферментных экстрактов электрофоретическими методами с селективным окрашиванием в ПААГ нами обнаружено наличие грех, отличающихся по заряду форм липоксигеназы как у разных сортов (Permyakov et al., 2002), так и у замещенных линий по хромосомам 4 и 5 гомсологических групп (Пермяков и др., 2000).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пермяков, Алексей Викторович, Иркутск

1. Асриян И.С., Зуева Е.С., Проскуряков Н.И. // Прикл. биохимия и микробиол. 1965. Т.1. С. 500-504.

2. Батыгииа Т.Б. Хлебное зерно ( аглас). Л.: Наука, 1987. 103 с.

3. Борисова И.Г., Чеиуренко Н.В., Будницкая Е.В. Разделение молекулярных форм липоксигеназы семян гороха // Биохимические методы. М.: Наука. 1980. С. 34-39.

4. Вакар А.Б. Белковый комплекс клейковины // Растительные белки и их биосинтез. М.: Наука, 1975. С. 38-58.

5. Вакар А.Б., Демидов B.C., Забродина Т.М. Исследование физико-химических различий клейковины разного качества // Прикл. биохимия и микробиология. 1972. Т. 8. С. 292-303.

6. Василенко И.И., Комаров В.И. Оценка качества зерна. Справочник. М.: Агропромиздат. 1987.

7. Голицин В.М. Неденатурирующий электрофорез. Фракционирование фотосинтетических пигмент-белковых комплексов и белков плазмы крови // Биохимия. 1999. Т. 64. С. 44-51.

8. Горпинченко Т.В., Забродина Т.М, Вакар А.Б. Изменение сульфгидрильных групп и дисульфидных связей в белках при созревании и прорастании пшеницы // Прикл. биохимия и микробиология. 1972. Т. 8. С.386-390.

9. Горпинченко Т.В., Вакар А.Б., Кретович В.Л. Исследование протеиндисульфидредуктазы пшеницы // Биохимия. 1975. Т.40. С. 323330.

10. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. М.:Мир, 1982. Т. 1. 392 с.

11. Евстигнеева З.Г., Соловьева H.A., Сиделышкова Л.И. Структура и функции шаиеронов п шаиеронннов (обзор) // Прикл. биохимия и микробиология. 2001. Т. 37. С. 5-18.

12. Заиров С.З. Накопление и обмен белков в зерне пшеницы. Алма-Ата: Наука, 1987. 176 с.

13. Кичатииова C.B., Труфанов В.А., Пермяков A.B. Тиолоксидазная и дисульфидредуктазная активности клеточных органелл пшеницы // Прикл. биохимия и микробиология. 1993. Т. 29. С. 412-417.

14. Кичатииова C.B. Ферменты тиол-дисульфидного обмена и их роль в формировании белкового комплекса зерновки пшеницы: Автореф. дис. на соискание ученой степени канд. биол. наук. Иркутск. 1997. 27 с.

15. Колесниченко A.B., Побежимова Т.П., Войников В.К. Характеристика белков низкотемпературного стресса растений // Физиология растений. 2000. Т. 47. С. 624-630.

16. Коиарев В.Г. Белки пшеницы. М.: Колос. 1980, 351 с.

17. Конарев В.Г. Белки растений как генетические маркеры. М.: Колос, 1983.320 с.

18. Коиарев В.Г., Гаврилкж И.П., Губарева II.К. О природе ппотенина пшеницы по данным иммупохимического анализа // Докл. ВАСХНИЛ. 1970. №. 7. С. 16-18.

19. Кретович В.Л. Биохимия зерна и хлеба. М.: Наука, 1991. 133 с.

20. Кретович В.Л., Вакар А.Б. Роль водородных и дисульфидных связей в структуре биополимеров зерна // С.-х. Биология. 1974. Т. 9. С. 175-186.

21. Кударов Б.Р. Изменение соотношения S-S/SH-груии в запасных белках созревающего зерна пшеницы // Биологическое развитие микроорганизмов и растений. Алма-Ата: Наука. 1978. С. 121-127.

22. Кузнецов А.Н., Труфанов В.А. Тиол:прогеин-дисульфидоксидоредук-тазная активность созревающих семян пшеницы // Изв. СО АН СССР. Сер. биол. наук. 1981. Т. 3. С. 86-89.

23. Мииеев В.Г., Павлов А.Н. Агрономические основы повышения качества зерна пшеницы. М.: Колос, 1981. 228 с.

24. Осборн Т.Б. Растительные белки. М.; Л.: Биомедгиз, 1935. 320 с.25