Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ферменты тиол-дисульфидного обмена и их роль в формировании белкового комплекса зерновки пшеницы

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Ферменты тиол-дисульфидного обмена и их роль в формировании белкового комплекса зерновки пшеницы"

1 ^ , . с И? И 1

Российская академия наук Сибирское отделение Сибирский институт физиологии и биохимии растений

На правах рукописи УДК 577.15: 633.11

Кичатинова Светлана Владимировна

ФЕРМЕНТЫ ТИОЛ-ДЙСУЛЬФИДНОГО ОБМЕНА К КХ РОЛЬ В ФОРМИРОВАНИИ БЕЛКОВОГО КОМПЛЕКСА ЗЕРНОВКИ ПШЕНИЦЫ

03.00.12. - физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск, 1997

Работа выполнена в лаборатории технической биохимии Сибирского института физиологии и биохимии растений Сибирс отделения РАН, Иркутск

Научные руководители: кандидат химических наук В.А.Труф;

член-корреспондент РАН Р.К.Салж

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор, Д.И.Стом;

доктор биологических наук Ю.М.Константинов.

Ведущая организация - Институт биохимии им.А.Н.Ваха РАН

г.Москва.

Защита состоится "29" апреля 1997 г. в 10 часов на засе. специализированного совета К.003.25.01 по защите кандидатски диссертаций при Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН по адресу: 664033, Иркутск-33, ул. Лермонти 132, а/я 1243.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Сибирского института физиологии и биохимии растений

Автореферат разослан 1997г.

Учёный секретарь специализированного

совета, кандидат биологических наук ¡¿¡ки^р/Г-П.Акимов;

Актуальность проблемы. С формированием макромолекулярного комплекса запасных белков зерновки тесно связаны показатели качества пшеницы- Количественное накопление запасных белков в пшеничном эндосперме ещё не является гарантом еысокого качества. Реологические свойства клейковины зависят от содержания в запасных белках дисульфидных связей и сульфгидрильных групп (Кретовяч, 1958, 1991; Bloksma, 1975).

В последние десятилетия активно изучались ферменты, катализирующие тиол-дисульфидный обмен белков животных тканей и микроорганизмов (Minoda et al., 1973; Carmlchael et al., 1977; Grei-qhton et al., 1980). На растительных объектах подобные реакции изучены недостаточно полно. Имеются сообщения о существовании в зерновках пшеницы цистинредуктазы и глутатионредуктаза (Проскуряков, Зуева, 1953, 1964), достаточно подробно описана НАДФ-зави-симая протетадисульфидредуктаза (Горпинченко и др., 1972, 1975; Suske et al., 1979), глутатион-зависимая тиол:протеиндисульфид оксидоредуктаза (Кузнецов, Труфанов, 1981), расщепляющие дисуль-фидные связи в белках, и тиол:протеиндисульфид изомераза (Gryn-berg et al., 1978; De Azevedo et al., 1984; Shimoni et al.,1995), осуществляющая перегруппировку "неправилько" сшитых S-S-связей.

Еместе с тем, для образования дисульфидных связей в белках растений необходимо окисление SH-групп остатков цистеина, которое мояет ooympriTB.'LiTbcn с помощъы -шолоксидаз (тиол:кислород оксидо-редуктаз), аналогичных по функции ферментам животных тканей (Lash et al., 1584, 1986). Об этой стороне тиол-дисульфидного обмена в запасных белках пшеницы сведений в литературе наш? не обнаружено.

Совместное функционирование ферментов с дисульфидредуктазной и тиолокеидазной активностями создаёт условия для тиол-дисульфидного обмена и постсинтетических преобразований запасных белков путём образования внутри- и межмолекулярных S-S-связей, стабилизирующих ыакромолекулярную структуру белков эндосперма и определяющих их физические свойства (Труфанов, 1994).

В этой связи обстоятельные исследования физиологической функции ферментов тиол-дисульфидного обмена пшеницы представляются несомненно актуальными как в теоретическом, так и в практическом отношениях.

Цели и задачи исследования. Цель работа заключалась в то чтобы изучить роль ферментов таол-дисульфидного обмена в фо вании белкового комплекса клейковины пшеницы. Основное вним было уделено двум функционально противоположным ферментам -БН-оксидазе (тиол:кислород оксидоредуктаза, КФ 1.8.3.2.) и редуктазе (тиолгпротеиндисульфид оксидоредуктаза, К$ 1.8.4.

Были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Изучить активность в зерновках пшеницы БН-оксидазы и редуктазы, катализирующих соответственно образование и расп Б-Б-связей.

2. Сопоставить динамику активности ферментов в развивакц зерновках генотипически различных пшениц с динамикой содерж в белках Б-Б-связей и БН-групп.

3. Установить внутриклеточную локализацию ферментов. Про их очистку и испытать действие ферментов на запасные белки ницы.

4. Изучить сортовую вариабельность и модификационную изм вость активности БН-оксидазы и Б-Б-редуктазы в зависимости условий выращивания.

5. Выявить взаимосвязь между уровнен активности ферменто технологическими свойствами пшеницы. Обосновать гипотезу об участии ферментов в процессах формирования белкового коыпле клейковины.

Научная новизна и практическая ценность работы. Установл изучена активность тиолоксидазы и дисульфидредуктазы в ходе ва и созревания зерновки пшеницы; выявлена сопряжённость не: активностью и содержанием дисульфидных связей и сульфгидрил групп на разных фазах развития зерновки. Показано прямое де: ферментов на Б-Б-связи и БН-группы запасных белков зерновки зультаты позволили выдвинуть гипотезу об участии БН-оксидаз] Б-Б-редуктазы в образовании мзкромолекулярных структур клей ны. Отработаны приёмы выделения и частичкой очистки этих фе] тов; центрифугированием в градиенте плотности сахарозы изуч' внутриклеточная локализация. Изучена активность БН-оксидазы редуктазы различных сортов яровой пшеницы, выращенных в кок ных экологических зонах, определены уровни ферментативной а] ности и фенотипической изменчивости по основным технологиче»

¡азателям качества. Показано, что удельная активность ферментов юшо коррелирует с рядом показателей, определяющих физические >йетва клейковины и реологические характеристики теста. Этот :т позволяет предполагать, что уровень удельной активности >л-дисульфидных ферментов может служить биохимическим критерием !нки селекционного материала на качество клейковины. Обоснована ложность улучшения качества муки слабых сортов пшеницы путём юльзования ферментов тиол-дисульфидного обмена Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и ¡уждены на: V-ом Всесоюзном биохимическом съезде (Москва, 16); научно-практической конференции "Пути повышения с.-х. «зводства Восточной Сибири" (Красноярск, 1937); III Всессвз-; конференции молодых ученых по физиологии растительной клетки трозаводек, 1988); 11-ом и Ill-ем съездах ВОФР (Минск, 1990, кт-Петербург, 1993); симпозиуме ОФР "Physical-chemical basis plant physiology" (Penza,1996), на регулярных научных сессиях ирского института физиологии и биохимии растений СО РАН. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ, абота принята в печать.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 139 страни-машинописного текста и состоит из введения, обзора литерату-экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выво-, списка литературы и приложения. Работа гп/торпгт 3 рисунков и artjnm. Спг.сск цитируемой литературы включает 156 публикации, них зарубежных III.

Список сокращений

А - бычий сывороточный альбумин

[I - восстановленный глутатисн

Г - дитиотреитол

АГ - полиакриламидный гель

Р - эндоплазматический ретикулум

С - водопоглотительная способность

K-I - показатель, определяющий физические свойства клейковины

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основным объектом экспериментальных исследований служила : вая мягкая пшеница сорта Скала, а также другие сорта (Ангара Ладе, Ферругинеуы), распространённые в Восточной Сибири. В га по изучению динамики активности ферментов, содержания Б-Б-св: и БН-групп, технологических свойств были использованы также ] ницы из коллекции Краснодарского НИИСХ им.П.П.Лукьянекко (Др; на, Лютесценс 616Н5, Лютесценс 750Н4, Лютесценс 851Н5, Лютее] 841Н5, Пиротрикс 28/14, Пиротрикс 28/33, Свободар, Светояр, I ктр, Салют, Саратовская 29, Трансдувкант, Эритроспермум 674И

Для изучения влияния факторов среды на фенотипическую изм! вость активности ферментов тиол-дисульфидного обмена, содерж. Б-Б- и БН-групп и технологические показатели пшеницы выращив; в разные годы (1986-1988 гг.) в экологически контрастных зон: (опытные поля Краснодарского НИИСХ и Иркутского НИИСХ).

При изучении тиол-дисульфидных процессов в ходе налива и < ревания зерновок свежесрезанные колосья фиксировали жидким а: тон, обмолачивали вручную и хранили при -Ю°С или лиофильно ] шивали.

Для получения ферментных экстрактов навеску размолотых се] гомогенизировали с двукратным объёмом 0,1 М трис-НС1 буфера, 7,5, содержащего 5x10 М ЭДТА. Гомогенат последовательно цен-фугировали при 5000 и 30000 & в течение 30 мин, супернатант ] рпывавде диализовали против охлаждённого зкстрагента. В некс случаях экстракты подвергали солевому фракционированию (суды аммония) с последующей гель-фильтрацией осадков на колонке с< декса С-25 и лиофилизацией.

Активность тиол:протеикдисульфид оксидоредуктазы определи, скорости увеличения количества БН-груш в инкубационной сред содержащей инсулин (4 кг/ил инкубационной среды), бычий сыво] точный альбумин (19 мг/мл) или растворимую фракцию белков ши вины (4 мг/мл) в качестве субстратов, а также ферментный экс с известным содержанием белка и восстановленный глутатион в : центрации I мМ в качестве кофактора (Кузнецов, Труфанов, 198! Количество БН-групп определяли с реагентом Эллмана (Е11тап,Г

За единицу активности (Е) принимали увеличение оптической

эсти или содержания SH-rpyim, рассчитанное по калибровочной юой, за минуту. Удельную активность выражали в Е на иг белка рментного экстракта.

Активность тиолоксидазы оценивали по скорости окисления SH-щп в дитиотреитоле, восстановленном глутатионе (Lash, Jones, 36) или в растворимой фракции белков клейковины. За единицу >локсидазной активности (Е) принимали уменьшение количества -груш в инкубационной среде за минуту. Удельную активность зажали в Е на мг белка ферментного экстракта. Приготовление препарата клейковиннных белков проводили ;дующим образом: клейковину из обезжиренной муки отмывали 1чала 0,1 М раствором пирофосфата Na, рН 7,0, затем водой. >ую клейковину растворяли в 0,1 М уксусной кислоте и высу-!али лиофильно. Для опытов использовали фракцию, растворимую ),I М трис-HCl буферном растворе, рН 7,5, содержащем 10 % шцилата Na (Вакар, 1962, 1974).

Общее содержание сульфгидрильных групп и дисульфидкых связей >еделяли в экстрактах, полученных гомогенизацией зерновок с М натрий-фосфатным буферным раствором, рН 7,5, содержащим I мочевину, с последующим центрифугированием. В определезшую ть экстракта вносили {3-меркаптоэтанол до 5 Я-ной конечной кон-трацяи и смесь инкубировали при 37°С 2,5 ч. Образовавшиеся группы алкилировали с помощью 4-винилпиркдина et

. 147л) ii прсБОa4jm количественное определение пиридилэтил-теина на аминокислотном анализаторе AAA-88I после гидролиза изводного соляной кислотой в стандартных условиях. О содержа-дисульфидных связей судили по разнице между общим количеством групп в восстановленном образце и количеством SH-rpyrai в аэце до восстановления S-S-связей.

Для определения концентрации бежа в ферментных экстрактах ис-ьзовали метод Лоури (Lowry et al., 1951).

Центрифугирование в градиенте плотности проводили в интервале центраций сахарозы 16-60 % в ультрацектрифуге VAC-602 при симальном ускорении 90000 g г; течение 2,5 ч '.Miflin et al., 1). Содержимое центрифужных пробирок фракционировали по 2 мл, лизовали против 0,1 М трис-HCl буферного раствора, рН 7,5, и ользовали для определения удельной активности ферментов. Цент-

рифугированию подвергали гоиогенаты зерновок разных фаз спелости, полученные их растиранием при t=4°c в 0,1 М трицин-ацетатном буферной растворе, рН 7,5, содержащий 5 ыМ ЭДТА и 10 Ж сахарозы и последующим отжатием через капроновую ткань или центрифугированием при 1000 g.

Для аффинной хроматографии использовали тиол-активированную сефарозу 4В или тиопропилсефарозу 6В (Pharmacia Fine Chemicals), элоцию сорбированного белка проводили с помощью линейного градиента концентраций ДТТ в интервале 0-30 мМ.

Электрофорез глиадиновых белков проводили в 0,067 М А1-лактат-ном буферном растворе, рН 3,1, в 9 %-ном ПААГ (Bushuk, Zillman, 1978). ДЦС-ПААГ-злектрофорез глютениновых белков проводили в трис-глициновом буферном растворе, рН 8,3, содержащем 0,1 % ДДС, 3 %-ный концентрирующий гель, рН 6,8, и 10 %-ный разделяющий гель, рН 8,8, содержащий 0,1 % ДДС-Na (Laemnli, 1970).

Технологические показатели пшениц определяли 6 лаборатории технологии зерна Краснодарского НИИСХ им.П.П.Лукьянёнко. Показатели качества муки и теста оценивали с помощью альвеографа Шопена и фаринографа Брабендера, упругие свойства клейковины - на приборе ИДК-IM. Качество хлебных изделий ( объёмный выход, расплывчатость, форма и цвет мякиша, эластичность, пористость и общую хлебопекарную оценку (в баллах) определяли по результатам пробных лабораторных выпечек в стандартных условиях.

Результаты всех экспериментов по определению ферментативных активностей и технологических показателей обрабатывали с использованием пакета компьютерных программ (С.В.Мизрохи).

Учитывали среднее (X), ошибку средней (S^), коэффициент вариации (V,%) и рассчитывали коэффициент корреляции (г); существенность разности выборочных средних оценивали по критерию Стывден-та (t).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Б-Б-редуктазная и БН-оксидазная активности в зерновке пшеницы

позиций развиваемых представлений о физиологических и биохи-::ких основах формирования белкового комплекса эндосперма в таащихся зерновках пшеницы и роли в этих процессах специфики системы ферментов тиол-дисульфидного обмена наибольший ин-з представляют два фермента этой системы: тиол:кислород цоредуктаза (БН-оксидаза, КФ 1.8.3.2), окислящая БН-группы эвых молекул в постсинтетический период, и тиол:протеинди-Ешд оксидоредуктаза (Б-Б-редуктаза, КФ 1.8.4.2), восстанав-шцая дисульфидные связи.

гевидно, что одновременное действие этих ферментов обеспечи-реакции тиол-дисульфидного обмена, создавая определённое ЗН-равновесие в белковом комплексе развивающейся зерновки щы.

зходя их этого, одна из задач начального этапа исследований вчалась в установлении наличия в зерновках пшеницы Б-Б-редук-эй и БН-оксидазной активностей и их субстратной специфичности гношению к Б-Б-связи и БН-группам низкомолекулярных тиоловых лнений и Лрпт'он с рссх-ггиой молекулярной массой, в том числе пков клейковины.

табл. I приведены данные по восстановлению ферментным зкст-эи пшеницы сорта Скала Б-Б-связей стандартных белковых субст-з (инсулин и БСА).

з 60 мин инкубации содержание БН-грулп в инкубационной сре-инсулином увеличилось на 58 мкмоль/мл (т.е. на 50 % исход-количества) при средней скорости реакции 0,97 (мкмоль/мл)*

в инкубационной среде с БСА за то же время содержание рупп возрасло на 48,5 мкмоль/мл (39,6 % исходного количества) средней скорости реакции 0,81 (мкмоль/мл)«мин"1. аким образом, дисульфидредуктазная активность зерновок птени-лла способна восстанавливать Б-Б-связи не только пизкомолеку-эго инсулина (мол.масса 5,7 кД, 3 Б-Б-связи в молекуле), но и Ештельно высокомолекулярного бычьего сывороточного альбумина .масса 65 кД, 17 Б-Б-связей), при этом восстанавливающая спо-

собность экстракта в реакционной снеси с различными субстратами оказалась достаточно высокой.

Таблица I

S-S-редуктазная активность ферментного экстракта зерновок пшеницы сорта Скала

Время Содержание SH-групп

инку- Инсулин БСА

бации, мкмоль/мл (мкмоль/мл> мкмоль/мл (мкмоль/мл>

мин мин-1 -I мин

0 115,4 ? 6,0 122,5 + 6,0

100,0 - 100,0 -

30 162,3 ? 4,2 1,56 1 160,5 т 5,2 1,27

1 140,6 1 131,0

60 173,4 ♦ 4,5 0,97 171,0 .+ 4,5 0,81

150,0 139,6

Примечание. Здесь и в табл. 2 в числителе - средние значения дл трёх аналитических повторностей плюс-минус шибка

средней, в знаменателе - процент SH-групп исходного количества. Инкубационная среда содержала ферментны экстракт, субстрат и восстановленный глутатион; в контроле отсутствовал ферментный экстракт.

В предварительных экспериментах было показано, что экстракт, обладающий S-S-редуктазной активностью, при тех же условиях инкубации, но в отсутствие Г5Н, способен окислять SH-группы киз-комолекулярных тиоловых соединений, таких как восстановленный глутатион и дитиотреитол. Обнаруженная ферментативная активность функционально сходна с активностью тиолоксидаз животных объектов (Takamorl et al., 1980; Lash et al., 1984, 1986), способных окис лять SH-группы в присутствии молекулярного кислорода (Janolino е al., 1981).

В табл. 2 приведены данные по окислению SH-оксидазой пшеницы тиоловых групп стандартных низкомолекулярных субстратов.

Таблица 2

SH-оксндазная активность ферментного экстракта зерновок пшеницы сорта Скала

ремя Содержание SH-rpynn

нку- ГБН дтт

ации, ян мкмоль/мл (мкмоль/млу мин-* мкмоль/мл (мкмоль/мл)к мин-1

0 391 i 2,0 451 5 6,0

100,0 - 100,0 -

10 354,5 ♦ 1,0 90,7 1,22 356 ? 2,0 79,0 3,17

;о 319,5 + 6,0 81,7 1,19 265,5 ? 6,0 59,0 3,09

>имечание. Инкубационная среда содержала субстрат и ферментный экстракт, в контрольных вариантах отсутствовал ферментный экстракт.

За 60 мин инкубации содержание SH-rpynn в инкубационной сре-с восстановленным глутатионом снизилось на 71,5 мкмоль/мл, то гь на 18,3 % исходного их количества, при средней скорости ре-щи I.I9 (MKMnib/jiiJ-ticnr1. За а то же время количество SH-гпп в инкубацконной среде с дитиотреитолом уменьшилась ка 185,5 юль/мл (т.е. на 41 %) при средней скорости реакции 3,09 смоль/мл)*мин-1, что более чем в 2 раза вше скорости окисления -групп глутатнона.

Таким образом, тиолоксидаза пшеница проявляла достаточно внсо-i сродство к таоловым группам низкомолекулярных соединений. Далее представляло интерес экспериментально подтвердить спо-5ность этих ферментов осуществлять тиол-дисульфидкые превраще-fi в запасных белках in vitro при совместном присутствии их в акционной смеси. Из данных табл.3 следует, что в отсутствие рментов (контроль) в условиях наших опытов не происходило су-ственного изменения в содержании SH-групп в запасных белках, то время как ври внесении в реакционную среду ферментного зк-ракта (вариант I) за первые 30 мин инкубации окислилось 21,2

мкмоль/мл БН-групп, за последующие 30 мин ещё 32,0 мкмоль/мл. В целом за 60 мин инкубации окислилось 20,8 % БН-групп по отношению к количеству БН-групп в исходном субстрате. Очевидно, что реакции аэробного окисления БН-групп запасных белков катализировались ферментами типа кислород-зависимых тиолоксадаз.

Таблица 3

Изменение содержания БН-групп (мкмоль/мл) в растворимых белках клейковины пшеницы при действии ферментного экстракта из зерновок молочной спелости

Время инкубации, иин Клейковина (контроль) Клейковина + экстракт (вариант I) Клейковина + ГБН (вариант 2) Клейковина + экстракт + ГБН (вариант 3)

0 234,3 * 6,0 256,1 + 5,7 239,5 + 5,0 292,6 ; 1,0

100,0 100,0 100,0 100,0

30 236,4 + 2,0 234,9 + 1,0 254,2 ? 6,3 366,9 ? 4,3

100,9 91,7 106,1 125,4

60 225,9 + 4,6 202,9 + 7,5 258,2 * 2,0 408,5 ? 15,0

96,4 79,2 107,7 139,6

Примечание. В числителе - средние значения из трёх аналитических повторностей 7 ошибка средней, в знаменателе - в процентах к нулевому времени инкубации.

В реакционной среде, содержащей растворимые белки клейковины и ГБН (вариант 2), количество БН-групп за 60 мин инкубации увеличилось всего на 7,7 %. При внесении ферментного экстракта (вариант 3) средняя скорость восстановления Б-Б-связей значительно ( в 6,2 раза) возрастала, при этом количество БН-групп за 60 мин инкубации увеличилось на 39,6 % по отношению к нулевому времени реакции. Результаты позволили предположить, что расщепление Б-Б-связей запасных белков пшеницы носило ферментативный характер и катализировалось глутатион-зависимой Б-Б-редуктазой.

Одновременное присутствие в зерновке ферментов, способных ка-

гализировать in vitro тиол-дисульфидные реакции не только в низкомолекулярных тиоловых субстратах, но к в клейковинных белках, позволяет предположить возможное их участие в формировании белкового комплекса эндосперма in vivo путём регуляции S-S/SH-cootho-яения в запасных белках в постсинтетический период.

Динамика активности ферментов з развивающейся зерновке пшеницы

Изучение динамики активностей дисульфидредуктазы и тиолоксида->ы параллельно с динамикой содержания S-S-связей и SH-rpyim на >азных фазах развития зерновки проводилось с целью сопоставления характера изменений активности ферментов с изменением содержания ¡-S-связей в зерновке.

Таблица 4

[исульфидредуктазная и тиолоксидазная активности (Е/нг) х 10"" : содержание S-S-связей и SH-групп (ыкмоль/мг ) х 10"" в созре-ащих семенах пшеницы сорта Скала

Влажность зерна,%

Показатели 70-75 65-70 50-55 40-45 30-35 15-20

SH-окси-

даза (А) 2,4+0,5 4,2т0,7 2,8+0,4 3,3+0,6 3,1+0,4 2,8;0,3

S-S-редук-

таза (Б) 2,2+0,4 3,2+0,8 5,8+1,2 5,3+1,3 2,1+0,5 1,9+0,3

А/Б 1,09 1,31 0,48 0,62 1,48 1,47

S-S-связи 7,3т0,4 8,3+0,4 8,5+0,6 10,3+0,6 13,0+0,7 13,4+0,6

5Н-группы 9,4+0,8 9,2+0,5 10,2+0,6 7,7+0,5 7,3+0,5 8,2+0,7

3-S/SH 0,78 0,90 0,83 1,34 1,78 1,63

Тримечание. Представлены средние значения из вегетационного и

двух полевых опытов плюс-минус ошибка среднего.

Из представленных в табл.4 данных следует, что в ходе налива и >зревания зерновки БН-оксидаза проявляла два максимума - в фазе >лочной спелости (65-70 % влаги) и позднее при влажности зерно->к 30-45 %, в период интенсивного образования надмолекулярных

белковых структур, характерных для клейковины зрелого зерн, Максимум Б-Б-редуктазной активности наблюдался при влажное1 зерновок 40-55 35.

Аналогичные по характеру закономерности были отмечены п] поставлении динамики активностей у II сортов пшеницы, выра1 в различных эколого-географических зонах (рис I). Независш сортовых особенностей и места произрастания пшениц пpoявляJ два максимума тиолоксидазной активности и один - дисульфид] тазной. В конце налива заметно возрастало отношение БН-окс, Б-Б-ред., а также Б-Б/БН-соотношение. У сортов с различной должительностыо вегетационного периода развития активность ментов и соотношение Б-Б/БН-групп оказались адекватными фи; логическому состоянию зерновок. Синхронность изменений отне БН-оксидаза/Б-Б-редуктаза и Б-Б/БН-соотношения в развивакзце зерновке свидетельствует о взаимообусловленности уровня акт та тиол-дисульфидных ферментов и баланса Б-Б/БН-групп.

Рис.1. Динамика дисульфидредуктазной (I) и тиолоксидазной ( активностей в созревающих семенах мягкой яровой тлен Приведены средние данные для II сортов пшеницы, выра! ных в различных экологических условиях (КНШСХ-ИрНШ

8

/

01-1_I_I-1-1-1-1-'

80 70 60 50 40 30 20 10

Влажность зерна, %

Очистка Б-Б-редуктазы и БН-оксидазы

В опытах по очистке ферментов тиол-дисульфидного обмена испо-ьзсвали экстракты 3-дневных проростков пшеницы сорта Скала. Пре-варительная очистка включала высаливание белков центрифугага ульфатом аммония в интервале концентраций 30-80% насыщения и ге-евую фильтрацию раствора получившегося осадка на сефадексе 0-25.

Таблица 5

Активность дисульфидредуктазы и тиолоксидазы на разных этапах очистки

I Активность ферментов Сте-

Стадия Объем, Белок, Выход, пень

очистки ил мг/мл (Е/млМО 3 (Е/иг)«10-3 % очи-

стки

Экстракция,

центрифугиро- 124 3,85 30,7 8,0 100,0

вание , 22,4 578 100,0

20000 g

(Ш4)2БО4,

30-80%. 49 1,19 г/,з 14,5 22,3 1,8

сефадекс (5-25 10,2 8,6 18,0 1,5

Тиопропил-

сефарозэ 6В: 14,5 18,4 12,6 2,3

-фракция I 33 0,79 8,5 10,8 10,1 Пэ

(без ДТТ)

- фракция 2 21 0,08 6,4 80,0 3,5 10

(2-9 мМ ДТТ) 0,6 7,5 1М5 Т7з

- фракция 3 28 0,02 11,3 565 8,3 71

(17-22 мМ ДТТ

римечание. В числителе - данные для Б-Б-редуктазы, в знаменателе - для БН-оксидазы

На этой стадии очистки удельная активность Б-Б-редуктазн усе-