Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимические свойства пептигидролаз созревающего зерна озимой мягкой пшеницы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимические свойства пептигидролаз созревающего зерна озимой мягкой пшеницы"

АКАДЕМИЙ НАУК БЕЛАРУСИ

' ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО 31ШЛЗД ИНСТИТУТ ЭКСЕЕЕ'П.ИГГАЛЬНПл .БОТАНИКИ' им. В. О. ЮПРЕЗМА-

На .правах' рукописи

'.В.ОВЧУК ■ .. К р и на Л е -о ни д о в и а /¿(^ ¡£*/

УДК 581.19:577.156

' ВЮШМИЕОКИЕ СВОЙСТВА ПМТИДГИДРОЛАЗ С03РЕВАЮИЩГ0 ЗЕРНА,ОЗИМОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦ

03.00.04 - биохимия

Авт арв ф е р а т

диссертации ка соискание. ученой степей? кандидата биологических на^к

М И Н С К - 1992.

'Работа выполнена-в лаборатории''биохимии растений ■ Свлекдаошю-геиатического института -Украинской' академац' аграрных наук, г. Одесса. ..

НАУЧНЙЙ' РУКОВОдаТЕЛЬ . - доктор -Ыолощчарких наук, ...

'-.- член-корреспондент-Украинской . • шгадешщ аграрных наук, '.'■ '■■;' щзофессои.А.П. ЖВЩА'Й ' ■

ОФЩЦЛЬШШ'ОШЮШПЫ -. '.доктор биологических нарт,

профессор В.И., БАБЕНКО; •

кандидат биологических наук, •' ... В-.И. 'ДОМАШ. -. "' ..

ВЛЩУЩАР ОРГАНИЗАЦИЯ - ' Институт физиологии растений и.'"; 1 ' ■ . генетики ЖУкрааш... '

■ Защита состоится " 2У "¿¿¿c/j^Uf jggg Года в.¿^f часов, на .' заседании• специализированного совета К 006.04,01-'по защита:'

' диосартации'на соискание ученой степени.кандидата биологических .- наук в-Ииошт/те экспериментальной ботаники им. В.Ф.'Купревича ■ ' АЕ Беларуси; 220733, г. .Минск,.ул. 'Ф.Скорины, 27. .'•

'. С диссертацией моящ>'. ознакомиться в Центральной научной библиотеке им.: Я.Коласа АН Беларуси. . . - ■.,'■•'''

• .. . Автореферат разослан " " г. ■ .

Ученый секретарь ' . '■ ..'• ■ спэ'щализировшпюго совета, . / > : . />' кандидат .биологических наук £/. / <- <- J ■ И.В.РОШШЕНКО

ОБЩАЯ ХАРЛШРЮТИКА РАБОШ

Актуальность проблемы. В настоящее время накоплено достаточно, денных, указывающих на важную роль протеолитических ферментов в регуляции многих физиологических процессов. Протеолиз играет ключевую роль в белковом обмене, принимая участие в распаде, так. и в синтезе белковых молекул, в защитных реак-. циях организма, в контроле за процессами клеточной пролифера- ■ • ЦИИ..-И дифференцировки (Мосолов,. 1971, 1588; Левицкий, 1982). Протеолитические ферменты растительного происхождения являются объектом интенсивных, исследований на протяжении многих лет, „При-'этом основное внимание уделяется изучения активности этих ферментов, в прораставших семенах (Белозерский, 1983;-Шутов, 1983; Заиров,- 1987).. ' '.''..' '

• Значительно хуже изучены пептидгидролазы созреввпдей зерновки. Вместе'с тем, при созревании процессы развития и формирования зерновки, клеточной 'дифференциации и накопления пита-.' тельных веществ происходят на фоне изменения активности про-теиназ. В связи с этим исследования данных ферментов на различных этапах, онтогенеза зерновки'необходимы.для более полной характеристики биохимических свойств и изучения физиологичес-. кой роли пептидгидролаз, а также выяснения их участия в формировании многих хозяйственно-полезных свойств сельскохозяйственных растений.

Цель и задачи исследования. Цель диссерчздионной работы состояла в изучении биохимических свойств пептидгидролаз. эндосперма со|£>еванцей зерновки в связи с возможным- участием данных ферментов в формировании некоторых хозяйственно-полезных-признаков озимой мягкой'пшеницы'.

V. В ходе работы решались следующие задачи:

1. Изучить белбк-протёиназный комплекс созревающего зерна ппеницы.

2. Провести сравнительную характеристику пептидгидролаз созревающего и прорастающего зерна пшеницы.'

.3. Разработать метод очистки карбоксипептидэзы из созревающего зерна пшеницы и изучить ее.биохимические свойства.

. 4; Исследовать активность.пептидгидролаз- при поражении зерна фузариозо'м. " '

' Научная новизнаи практическая -значимость работа» Науч-* ная новизна диссертационной работы состоит е следующем; ' '■

- впервые в эндосперме созревающей зерновки озимой мяг~. кой пшеницы обнаружены две системы пептидгидролаз',.Активность ферментов одной из .них увеличивается,- а второй -.снижается в процессе созревания. Увеличение суммарной активности протеи-наз сопровождается преимущественным.увеличением'содержания связанных форм фермента; . ■.'

■- разработан метод и получена в очкцекиоу состоянии кар-боксипептидаза из. созреващей. зерновки 1таею«.цы;' '

- показаны различия по физико-химическим и каталитически).! свойствам пептидгидролаз прораставшего и созревелцего зерна;.- ' '• .'-,'■ '

' -' протеиназы■созревающего зерна пиеницц способны расщеп-' лять белки клейкозинного.' комплекса *Лиричен первую очередь ■ . протеолизу. подвергаются глютеяины и «Д-глйедины;'. . :

- установлено, что прорастание на инфекционном фоне.зер- . на устойчивого к.фузариозу сорта сопровождается снижением ак-' тивности пептидгидролаз и увеличением содёраания шгибитора трипсина. ,.■' • . , ■ -:

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на тео- . ретических семинарах кафедры биохимии ОГУ им.И.И.Мечникова в 1988, 1589 и 1990 годех, на конференциях молодых ученых ОГУ им.И.И.Мечникова в .1989., 1990 .годах, на заседании Одесского .. • отделения общества биохимиков в 1990 году, на Всесоюзной конференции "Физиолого-генетическиб механизмы регуляции- азотного' • питания растений" (Киев, 1991 г.),

Публикации. Основные- результаты диссертации опубликованы в' 4 печатных работах, список--.которых приведен в конце автореферата. . -. ■■'.'". ' ' •

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения', обзора' литературных данных; (2 -главы), описания объектов и методов исследования (I. глава), результатов собственных исследова- ■ ний (3 главы),, заключения, выводов, списка-литературы (210 источников, из них'147.-иностранных 'авторов . Работа изложена на '. •117-страницах машинописного текста, .содержит 17 рисунков и ; ¿2 таблицы. ' ■

• '. з

МАТЕРИАЛЫ-и метода ^СЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования-явилось зерно различной степени зрелости озимой мягкой лиениш, выращенное • на опытных полях института. В работе были использованы различные сорта озимой мягкой пшеницы, отличающиеся по хлебопекари.^ свойствам, урожайности и устойчивости к фуоариозу.. Собранное зерно различной степени зрелости замораживали при -20°С, лиофильно высу-ыивали-и размалывали. Экстракцию прстеолитических ферментов . из' полученной муки проводили дистиллированной водой.1 солевыми или буферными растворами в течение .60 минут при постоянном ' встряхивании 'при +4°С. Экстракты, центрифугировали на холоду . .. npir 10000 об/мин в течение 30 мин. В надосвдочной жидкости определяли активность свободных протеолитических ферментов. •

Активность прогеолитическкк/ ферментов исследовал! 1ри +30°С по гидролизу 2% казеина рН 6,0 (нейтральные протеиназы\ гемоглобина рН 3,5.Скислые протеиназы),■1~2% клейковины и глиадша (рН 4,5). Об активности протекказ судили по приросту-продуктов гидролиза, не ос^хдаемых (для казеина и. гемоглобина) и 20% ТХУ (для запасных белков). Продукты протеолиза исследовали с помощью реактива Фолина по ранее описанной методике (Вов чук С.В., 1979). Активность карбоксипептидаз определяли по гидролизу синтетического.субстрата 2-Phe-Ala ("Serva",. ФРГ) при рН 5,2 (Visurl et. al.-, 1969). ■■ ч

Активность связанных.протеиназ определяли в остатке, полученном после водной экстракции, муки. В данном Случае к осад-.. ку прибавлял:',-раствор субстрата и инкубировали при встряхивании. После инкубации, как и в случае со свободными протеиназа- • ми, реакции останавливали 10 205? .ТХУ. .

■ ' Активность протеолитических.ферментов выражали 'в мили-,. микро- и ненокаталах. За I катал принимали количество фермен- . та,- катализирующее образование I моля тирозина (при'определении активности по гемоглобину, казеину, и запасным' белкам) или X моля продукта конденсации нингидрина (при определенм-л актив- . мости кэрбоксипептидазы) за I с инкубации. Удельную активность ферментов определяли в пересчете на. I кг. белка. Концентрацию 5елка определяли колориметрическим методом Лоури,. а в хромато-графических;фракциях - на спектрофотометре СФ-26. по поглощению при 260 та. Электрофорез белков проводили в 12-15% полиакрила-

миднои геле, содержащем 0,1$ додецйлсульфаг натрия при рН В,3. по методу ЪаешаИ (1970). Электрофорез запасных белков проводили в 8,5% ПААГе в елюминий-лактатном .буфере рН ;3,1 (Исасйик, Ие^зЬ, 1980). Изоэлектрофокусирование белков, проводили в ■градиенте рН, создаваемом с помощью 1% растворов амфолинов. Изоэлектрофокусирование проводили в течение 20 часов при . +10°С, напряжении 1600 В и силе токе 25 А. Гель-фильтрацию белков и продуктов протеолиза проводили при.+4°С с использованием .сефадексов а-Ю, а-25, а-50» 0-100 - и'геля Тойоперл . кд-55-не оборудовании фирмы ЬКЬ (Швеция). . . ..

' ' ' РЕЗУЛЬТАТ .ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОбСуЖДвНИв:

.1. Активность пептидгидролаз созревающей зерновки пшеницы. Для установления общих закономерностей изменения активности • протеолитических ферментов было изучено содержание свободных (легкоэкстрагируемых) и связанные (неэкстрагируемых) форм пептидгидролаз в созревающей зерновке озимой мягкой пшеницы. Данный раздел работы, проведен, на зерне различной степени зрелости 6 сортов озимой мягкой пшеницы (Бригантина, Залив;'. За- . лив улучшенный, Дарице, Альбатрос-, Прокинь), характеризующихся близким;' хозяйственно-полезными признаками.

Полученные результаты показывают; что в процессе созревания для всех шести сортов изменение активности свободных про-теиназ, определяемых по различным субстратам, имеет неодинаковую направленность (табл.I).

Т&блииа I

Активность свободных пептидгидролаз в созревающем

зерне озимой мягкой тщеницы (ь. ± т)

> День после цвете-.ния

Активность

по гемоглобину : ,по казеину ■ по клейковине

т п-кат -мк-кат/ 'тп-кат ;мк-кат/ : т п-кат ;мк-кат/ зерно |кг белка; зерно ;кг белка; зерно -кг белка

.14-й 30,7+3,4 24,3+1,5 9,8+0,7 7,1+и,5. 1,85+0,33 1,52+0,14

,21-й 29,9+1,7 21,0+1,2 7,6+1,6 4,9+0,7 1,51+0,29 0,94^0,15

28-й'.. 42,4+1,6 21,3+1,5. 3,1-0,4 1,5+0,1 0,98+0,14 0,56+0,08

Полная 39,1+1,6 21,8+0,8 4,8+0,6 2,4+0,3 1,01+0,19 О',51+0,06

лость ' ' . . ■

• 5

Содержание ферментов, расщепляющих гемоглобин, увеличивается в зерновке к 28-му дню после цветения и остается на это/-' уровне до периода полной зрелости. При этом удельная активность данных ферментов во все периоды созроь-нил зерновки находится на одном уровне. В то же время' активность свободных протеиназ, гидрод-Нзующих казеин, и клейковину, снижается в процессе созревания в 2 раза, а их удельная активное^ -в 3 раза. Следует, отметить, что существенных сортовых' различий в изменении активности свободных ферментрв обнаружено не . было. •

Эти результаты указывают на то, что в созревающем зерне пшеницы имеются как минимум две. системы пептидгидролаз: актиз-ность кислых протеиназ, определяемых по гемоглобину, увеличивается, а- содержание "птрой группы ферментов, определяемых по гидролизу казеина (неи-1'ралькае..протеиназы) и клейко^чны, снижается в процессе созревания. ■.■',.-■:'

Для пептидгидролаз, расщепляющих гемоглобин, созревание зерновки сопровождается увеличением содержания не только'свобода«, но в значительн большей степени связанных, т.е. не-эястрагируемых форм ферментов (табл.2). . .•

. :, ' Таблица 2

Содержание связанных пептидгидролаз в созревающем зерне озимой'мягкой пшеницы См + т)

День '.■'■' 'Активность

после цветения по гемоглобину : ■ по «азеину

п-кат/1 зерно: % °т общего .*п-кат/1 :■содержания : . зешо •% от общего: содержания . •

7-й 2,7+0,3 18,0 4,5+0,5 31,1

14-й ' 30,4+2,7 .' • 49,8 . 6,4нНЗ,8 ' ■39,7 28-й ' 73, т, I _ 63,3 ' 1,8+0,3 36,8 .

зрелость ^.б+б.О .' ■■ ■ . 76Л 2,3+0,3 _ ■ 32,0 .'

Так, на 7-й день после цветения в зерне всех шести/сортов пшеницы в связанном состоянии находится около. 20% этц ферментов,, к 14-му дню - 50%, а к периоду полной зрелости - 7&-60%. В то ке время протеиназн, расцепляющие казеин, на всем протяжении' созревания представлены нэ 60-70^'в форме свободных (легко-экстрагируемых) ферментов. Аналогичные результаты были полу-

б

чены для протеиназ, гидролкэующих 1глейковкну. Для этих ферментов соотношение мекду свободными и связанными ф^мами оставалось постоянным на всем протяжении.созревания и составляло для свободных форм 40-60% их общего количества.

Таким образом, полученнае результаты показывают, что в .созревающей зерновке пшеницы имеется несколько групп пептид-гидролаз. Особый интерес представляют лротеиназы,. гидролизую-• щие клейковину, т.к. с активностью этих ферментов многие'авторы связывают формирование реологических'свойств муки пшеницу (Коэьмина, 1976; Крето^ич, .Токарева-,.; "1978). Исследование характера действия протеиназ созревающего зерна на клейковинные белки было проведено с помощью методов гель-фильтрации и .. -электрофореза в ШАГе. При этом был использован препарат; пеп-тидгидролаз, полученный из созревающего зерна' (7-й день после цветения);методом гель-фильтрации на. сефадексе 0-50. '.'"••.

Исследование продуктов протеолиза'клейковины с помощью .' гель-фильтрации показало,., что под действием «зптвдрирролва

20 40 50 ■ " . ■ номера фракций

Рйс.1.' Гель-фйльтрация на сефадексч . й-ЮО клейковины

зрелого зерна. (I) и продуктов еегидролиза после-воздействия протеиназой пшеницы в течениер24 ч (2), Колонка 1,6 х 80 см. Скорость - 7,Б т/си /ч. ■ Объем фракции - 2,5 мл. Элюция 0,1 М уксусной .

N «ислотой.

совращающего зерна-пгаеници происходит избирательный гидролиз внсо: змолокуллрньрс.белков,- уровень которых спивается в-наибольшей степени (рисЛ)..Так, если в исходном'рестворз клой-. крвкии на дол» глвтелпнов и «Л -глиадинов' приводится около СО% всех белков, то после <*-зрлента?кЕного гил'.олиза а. пробе их •.содержится около 40%. Па долю л-, и./"-глнгдшов в обб>.х случаях приходится. 40$ всех белков. Па Ьбиов8НКя;этих результатов можно сделать вывод,- что молекулы1 г.тотелянов имент менее кестку» структуру, по сравнении -с' компайтной упаковкой ■ ' л-,/- и ,^-глиадгшоп. ••"

Исследование продуктов протеолиза клейковины покогад-о, . • -что под. действием"' пе.птидечщролаз. созреващего зерна образуется как' пептиды с'молекупярной массой вше, 0,7 кД» тай, и.свободные аминокислоты (рис.2). .... •: '

4Е280 0,12

0,14

-<; о,ю 0.06 О.СЙ

■ 2Q 4.0 60 80 100

■ . . j " " ■ Фракции-

Рис.2. Гель-фильтрация на сефадексе G-10 растворккых ТХУ • продуктов протеолиза клейковины.( I) и растворимых • ТХУ продуктов исходной клейковины (2). р • Колонка "Т,б х 80 см; скорость 9,0 ш/ем -ч; элюция 0,1 М уксусной кислотой. Протеолнз 24-.ч. В исходную клейковину (2) протешэза внесена, в среду после до--.бавления ТХУ, Стрелками отмечены места выхода.

; РНКазы (13,7 кД) .и тирозша "(0,181 кД). • .

Эти результаты свидетельствуют о наличии в созревающей.зерной- . ке пш'ениць: кек протеиназ, так и пепгидаз. . . . ' -

2. Сравнительная характеристика пелтидгицролаз созрева-• кицего и прорастающего зерна пшеницы., В созревающем и прорастающем .зерне пшеницы содержатся сое -основные типы. протекпаэ. ;. Это подтверждаемся-результатами исследования'по действию ингибиторов .на активность протеолитическйх ферментов, выделсн-' нкх из 5-дневного прорастающего и 7-16-дневно.го созревающего , зерна (т^бл.З). '. ' •./'. -."

\ 7 Таблица 3 ;

Влияние ингибиторов на активность нейтральных (Ж) и кислых (КП) пёптидгидролаз созреваицего и прорас-■ тшцего ,зерна пшеницы (% ингибирования)

Пептид-- •Йодецетаь'ид : Фенилу,етил-,:сульфонил-: фторид . ■ ' •Пепстатин А I, Ю-фенан-;тролин. .;

гвд-ро- : (2 мМ) : (I мМ) : (I укг/мл) : (I мМ)'

лазы : НП "':. КП 1 НП : КП : т : КП •га •: КП'

Созре- , . '' ■ . ■ :

вещего - .' . .•

зерна 61,9 40,8 39,8 57,8 61,0 29,4 .37,8 • 11,2

" Прорас- ' . ..

тающего • ' -.

• зерна 82,4' 25,6 53,2 . 66,1 57,2.'. 36,6 0,0 .42,7.

Как видно из представленных данных, нейтральные протеи-наэы пшеничной зерновки представлены'комплексом ферментов,. ■' относящихся преимущественно к тиоловым и карбоксильным пёп- . тидгидролазам. Кислые протеиназы менее чувствительны к дейст-'• вип йодацетамида и.пепстатинй А^ в. то еремя как ингибитор се-

■ родовых пёптидгидролаз фенилметилсульфонилфторвд в значитель- "

■ ной степени тормозит их активность. Изучение влияния ингибиторов на .активность ферментов'показало,. что как в созревающей,' так и в прорастающем зерне значительные количества пептидгид- ■ ролаз представлены тиоловыми протеиназами. Эти ферменты являются наиболее изученными среди всех известных растительных . пёптидгидролаз.

Используя в качестве субстрату природный растительный б^лок - клейковину, нами'было показано, что как в созревающем.

•так'и в прорастающем зерне пшеницы содержатся тиоловые-про-теиназы, способные гидролизовать- запасные' белки (табл.4) . Причем ферменты прорастающего зерна более чувствительны к активирующему действию 2-меркаптоэтшола, чт.о указывает на качественные различия даг.чых пептидгидролаз.

' :' . . .Таблица 4

Влияние 2-меркаптоэтшола на активность, пептидгид'ро-ляз созревающего'и прорастающего зерна пшеницы сорта ' Бригантина (¡¡моль тирозина/мин; субстрат- - клейковина)

Концен ■•———-_Пептидгидролази-

трация : созревающего зерна 2-меркап-:

лаЗТкМ°"' ! ан'ГИБК0СТЬ :%. актйБ'8Ции.

прорастающего зер1.

активность

активации

О 20. 40 . 100

0,050 0,074 0,090 0,131

100, 148,0 180,0 262,0

0,027 0,090 0,424 0,147

1С'0,0 333,3

459.3

544.4

. 'Аналогичный характер'действия йнгибиторов и 2-меркапто-этанола на активность нейтральных н нлейковинорасщепляющнх; протеиназ указывает на' значительные сходства физико-химических свойств данных ферментоз, что позволяет использовать казеин для характеристики обеих групп пептидгидролаз.4 В то же вреда при исследовании на сефадексе 3-25 продуктов протеолиза гемоглобина ферментами прорастающего и созревшего зерна . . пшеницы бггЯ обнаружено увеличение содержания свободных ами- ." нокислот,что позволяет классифицировать кислые протеинаэы как карбоксипептидазы. ' ".■'■'''

В плане сравнительного изучения-физико-химических свойств белков, одним из -.самых информативных методов .является изоэлек-, трофокусирование. Результаты исследования пептидгидролаз созревающего .и прораставшего зерна с помощью изоэлектрофокуси-•рования представлены на рис.3. Было установлено, чт<"> активность кислых протеиназ в обоих случаях локализована ^ зоне- • рН 4,5-4,7. В то же время были обнаружены значительные разли-, ■ чкя в изоэлектриче.ских точках каэеинолигических- ферментов созревающего и прорастающего ззрна. Данная протеиназа.созревающего зерна локализована в.зоне рН.4,74, а для.фермента из

■ ■■••. ' ' 11 прорастающего зерна это значение равно 6,60. Полученные результаты представляют большой теоретический интерес и указывает на'физико-химические различия белковой молекулы нейтраль-• них протеиназ ^что возможно обуславливает и каталитические . ■ особенности данных ферментов. .

Идентичная характеристика'кислых протеиназ по результатам изоэлоктрофокусировения предполагает значительное сходст-. во каро'оксгаептидаз созревающего и прорастающего зерна. Исследование данных пзптидгидролаз показало, что активность. Карбоксипептидаэы.в процессе созревания .зерновки увеличизает-ч ся, достигая.максимальных величин к'периоду полной зрелости , (рис.4). Прячем наиболее выраженное-увеличение ектизности обнаруживается в первые 21 день после цветения. Максимальный уровень удельной активности карбоксипептидазы обнаруживается 'в'первое 7 дней после цветения. По мере созревания зерновки удельная. активность фермента плавно снижается.

При прорастании активность карбоксипептидазы резко воз- • ' растает, однако начинал,- с 4-го дня начинает снижаться. Отмечается также рост удельной активности .фермента, однако увеличение данного показателя происходит более плавно.и по своей Беличиче не достигает уровня, характерного для зерна ранней

. 5- -15 .. . £5- 35 45 I. -3 5 ■ "Г 'ют о о в р в з а'и н ■ ■ • • 1 ' прорбеташ!»

' Рис.4. Активность (I). и• удельная активность (2)- карбокси-пепгидаз созре'всщего и'прорастающего зерна пшеница сорта Бригантина. Активность (А) Еир&тана в. ' - - ик-кат/1 зерновку,, удельная активность (УА) - е " ' ¡.м:ат/г белка. . ,

спелости. .

Таким обрчз.ом, проведенное исследования показыв,апт, что спектр протеолитических ферментов созревающего и^ прорастающего зерна в значительной степени различен.Прежде всего касается тиол'овой эндопептидазк. По сравнению с соэреваххцим : зерном, данный фермент из п'рорас.тащего. зерна характеризуется большей чувствительностью к тиолоёым соединениям, а его изо-электричеекая точка нр?годигоя в более .щелочной ■■зоне*'. ' '

3. Выделение и биохимические свойства карбоксипепткцазы . созревающего зерна озимой мягкой шениаы. -В настоящее время разработан делый ряд. препаративных' методов получения белков •■ (в том числе и ферментов; в очищенном, виде. Каждый из них имеет свои недостатки и преимущества. Нгт о'ыла проведена апробация пекоторых из методов очистки карооксшептидазы из созревающего зерна, пшеницы.. Сопоставительный анализ полученных • данных показывает, что большинство методов Дает очистку кар-боксипептидазы в 2-4 раза с. общим выходом фермента 40-80%. ..

. На основании проведенного анализа, нами била предложена схема препаративного, выделения карбоксипептидазы в очищенном '

%0 " л531 . .:.■'.'.,■'. ;

^ . 1.35", • . ■ ■ ' . . . : ■ ' . : . •'

х.с5" 1« н •••:.■.•■..■;• ii -1 ■ - ■I: ' '

0,75' 2.5

0,45- ' 1.5 ■ '1.. /'1 , 1 \ <\ /-' ' \ /1 • \ 1 v \ ' 1

0,15- с.5 У I ; ■;. V. : ' •

10 20 30 40'- 50.«

Рис.5. Гель-фильтрация на Тойоперле НЯ-55. карбоксипептидазы созреващего зерна пшеница (7-10 дней после . . цветения). ,2

• Колонка 2,9 х 90 см. Скорость*- 10 мл/скг-ч. Элюг

ция 0,1 М фосфатным буфером рН 8,0. Нанесено 62.4 ыг '• белка. I - белок (¿280*' ^ карбоксипептидаза .

виде. Основные о;аш очистки состояли из экстракции предварительно лиофилизировашого и размолотого зерна, полученного на 7-10 день после цветения,-гель-фильтрацки и препаративного изозлектрофокус^овзния. '..'•.

.Экстракции белков проводили 0,1 М фосфатным буфером pH 8,0 в' течение 4.часов при +4°С. Полученный после центрифугирования. экстракт' наноснли на колонку с гелем Тойоперл H'tf-55 (рис.5). Белок выходит в виде б~8 отдельных пиков. Карбокси-пептйдаза.локализуется во втором пике и в значительной степени' отделяется. от'низкомолекуляркшс.примесей.- Фракции с кар<5о-.ксипептидазной активностьи. были собраны и нанесены.на колонку для изоэлектрофокусировения (рис,6). •■'■•,

Пептидгидролаза обнаруживается в зоне pH 4,84, что и соответствует изоэдектричесрой точке фермента.. При изоэлектрофокуси-ров'йнии происходит значительная очистка, карбоксипептидазы от больного количества балластных белков, Содержащие фермент фракции отделяли, от амфолинов гель-фильтрацией на сефедексе G-50. В результате проведенной очистки, был получен фермент с коэффициентом.очистки равным 21,5 и выходом его около 28%. •

■ *280-'-

10 20. 30 40 ■ 50 номера {ражцгА •

Рис.6. Изоэлектрофюкуснровадие карбоксипептидазы созре- . ващего зерна пшеницы. Колонка. ПО мл ( "1К£", Швеция). Амфолины рН 3,5-10,0. I - белок (Асол); 2-активность карбоксипепти-•. дазы (¿57о) » - ' 3 - градиент р'Л,

Б А

. Рис.7. Электрофорез в 12$-ПААГо, '. содержащем ОДО- Я«' • .карбоксипептнцазы созрзва-•' . . . ^ .'¡. I : юцего зерна .пшеницы.

■••'.. А - белки-мзркеры: :1 - фос-й У 2 ., сорилаза Б (94 кД); 2 - бы-

• V чий сывороточный альбумин

"и-.^ (67..1'Л);-3 - овальбумин'

(43 кд);. 4 - карбоангвдраза .(30 кД);. 5 .— 'соевый ингибк-3 . тор трипсжа (20,1 кД);

6 ~ лактольбумик (14,4 кД).

• Б - карбоксипептидаза. •

, . '-"4 Электрофорез карбоксипсптидази

. в ПАДГе, содержащем додецилсульфат " . натрия, показал наличие в препарате одного белкового компонента,(рис.7). м"в> " . Молекулярная масса фермента-по дан-. '"■:■'. ным электрофореза равна 57100 Д.

■.'''. Изучение природы активного ■

■ .-¿¿^ ■ ^ центра карбоксипептидазы было прове-• дено'с помощью специфических шгиби-

.'. торов синтетической природы (табл.5).. При этом было установлено, что активность карбоксилептидаз, выделенных вышеописанным методом из созревающего и прорастаю- ' щего зерна пшеницы, снижается, в присутствии ингибитора сернно-вых протеиназ фенилметилсульфонилф(горида. Активность' карбокси- , пептидазы созревающего зерна пшеницы снижается также в присутствии пепстеиша Л. Однако это действие выражено слабее по •• сравнению с действием фенилметилсульфонилфт'орида. Менее чувст-. витальна к действию пепстагина А карбоксипептидаза прорастающё-. го зерна пшеницы. . ' . '■ • ., /'■.■

Наиболее-сугцественние различая между карбоксипептидазами созревающего и« прорастающего зерна пшеницы бнли обнаружены при действии I, Ю-фенентролина и ионов цинка. При этом было установлено, что. пептидгидролаза созревающего зерна практически не. _ чувствительна к действии этих модификаторов, в то время как активность карбоксипептидазы прорастающего зерна в значительной степени ингибируется в присутствии I, ГО-фснантрэлина и ь.факек-но увеличивается на фоне ионов цинка. :

Таблица.5

Действий- активаторов и ингибиторов на активность .карбоксипептйдаз созревкацего и прорастающего зерна пшеницы

• ' Ингибиторы ■. Активаторы ; : Кон- : Отношение к контролю, %

: ция : созреващее зерно • прорастающее . зерно

Феккдаетилсульфо-нилфторид I мМ ■г.мм . . 41,9 0,0 ■ 7,2 0,0

Пепстатга А Г мкг 2 мкг ' 71,1 • 25,0. 78,4 61,9

ЙОдацетемид . . I мМ 2 мМ 100,0 100,0 100,0 100,0

1,10-фенантролин 1 мМ 2 мМ. 100,0 84,0 ' 5,8 .0,0

Дяти'отреитол ■ I кМ 177,6' 298; 3 гй,1 ■

¿л 1 мМ 2 мМ 107,9 127|0 269,5 ■ 340,1 ' '

Такта образом, изучение действия ингибиторов на активность пептидгидролаз показало, что между физико-химическими свойствами карбоне ил ¡епт ид аз созреващего и прорастающего зерна пшеницу имевтся значительные различия. Карбоксипептидазу созревающего зерна ысяно классифицировать как сериновуа пеп-тэдазу, в то время как карбоксипептидаза прорастающего зерна являемся сериновой металлозависимой пептидазой.

Следует'заметить» что в'каталитической'активности карбо-ксипептндаз созревающего и' прорастающего зерна определенную роль могут.играть тноловг-й?, группы. На это-обстоятельство уна-• зьтаот результаты исследований по. взаимодействию яарбокенпеп-тидэз-с тиол-сефйрозой,' а татке данные по активирующему действию днтиотрентола на активность резанных'ферментов. С другой Стороны, .эти реакции во-многом могут быть несрецифичными, т.к. прямого ингибирущего действия 'йодецетгзмида на активность кар-.боясипепиадаз;обнаружено йе было. '

■ 4. Активность пептидгидролаз в зерне озимой пдениш при . поражении ?иааг1иш охуврбгига. Формирование зерна и накопление пигательных. веществ .'в неблагоприятных условиях з эначительной

степени изменяет биохимический состав семян, что сказывается на их биологической ценности. Одним из таких неблагоприятных факторов являются фитозаболевания, вызванные патогенными грибами-рода Уизагхии. В связи с ¡этим изучение активности протеолитических ферментов.при фузариозе представляет интерес как с точки зрения формирования хозяйственных признаков зерна, так и с точки зрения »^следования иммунных реакций растений.

Созревание зерна в полевых условиях на инфекционном фоне сопровождается увеличением активности пептидгидролаз, что: обуславливает высокое, содержание этих ферментов в-зрелом зерне (табл.6).

Таблица 6

Активность пептздгидролаз в зрелом зерне пшеницы при заражении фузариозом (Ы + щ)

Сорт :. . Нейтральные : : ■ протеиназы : Кислые протеиназы

: н-кат • мк-кгт • н-кат ' мк-кат

•кг зерна | кг белка" кг..зерна ¡кг белка

Юннат

контроль опыт

йедоровка контродь опыт

Альбатрос контроль ' опыт

141+13 169+14 ■

112+12 147+12

104+11 133+12

3,6+0,3 4,4+0,2

2,8+0,3 3,9+0,2

2,5+0,2 3,0+0,3

392+34 451+42

377+35 472+43

403+38 476-й I

10,1+0,8 12,0+1,0

• 9,3+0,9 12,1+1,1

9,9+1,2 12,8+1,4

Увеличение активности и удельной активности в пораженном фузариозом зерне происходит в среднем на 20-30%. При этом изменения активностей нейтральных и кислых протеиназ носят прак-. тически одинаковый характер. Наряду с этим-в инфицированном . зерне происходит изменение фракционного состава белков. . ;

С целью изучения роли протеолитических;ферментов в регуляции иммунных реакций растений была изучена активность пептид-гидролаэ в .эндосперме прорастающего зерна. Установлено, что. при поражении зерна фузариозом.величина активности и удельной активности ферментов значительно ниже по сравнению с соответствующими показателями контрольной группы растений^ Особенно сильное угнетение отмечается для нейтральных протеиназ. Актив-

Г7

1 2 3~ ' 4 5

с^т к и

Рис.8. Удельная активность карбоксипептидазы зерна пиенипы сорта Ольвия (устойчивый к фуэариозу сорт) при проращивании на воде (I) и инфекционном фоне .12).

ность кислых протеиназ в эндосперме зараженного зерна снижается на 20-265?, в то время как для нейтральных протеиназ это снижение достигает'50^. Причем для ус^ейчивого сорта Обрий отмечается более выраженное угнетение активности нейтральных протеиназ (52&) по сравнению с активностью ферментов восприимчивого сорта Лрокофьевка (37%). Для карбоксипептидазы достоверные изменения активности и удельной активности в эндосперме прорастающего зерна' контрольной и опытной групп начинают определяться на 5 сутки прорастания. При этом, как и в случае с кислой и нейтральной протеиназами, активность карбоксипептидазы снижается в. зараженном зерне. В качестве примера на рис.8 представлены денные по -изменению удельной активности карбоксипептидазы в эндосперме прорастающего зерна устойчивого к фуэариозу сорта Ольвия.. ' . ,'■ •

* , Обнаруженные закономерности.указывают на участие протеоли-тическ!пс ферментов в динамике развития болезни и формировании иммунных реакций растений.'Снижение активности пептидгидролвз на инфекционном фоне может быть обусловлено снижением:синтеза этих .ферментов или. индукцией ингибиторов, препятствующих прояв-

140 ■•

100

60

20

. I .2 '

Рис.9. Содержание ингибитора трипсине в эндосперма зерна устойчивых (I) и восприимчивых (2) сортов пшеницы на 2 сутки проращивания на инфекционном фузариозном'фане (% к контролю).

лёнию ферментативной активности. В пользу, предположения об,-индукции ингибиторов являются данные по исследованию содержа-ник ингибитора трипсина в эндосперме зерна пшеницы при фуза-риозе. При этом установлено, что в эндосперме зерна, выращенном в течение 2 суток на инфекционном фоне, происходит увеличение уровня ингибитора трипсина у сортов, устойчивых к фу-заркозу (рис.9). В группу устойчивых евргов вошли: рбрий, Ольвия, Федоровка и Эритроспермун 1458/87. В то же время в ' эндосперме зерна восприимчивых сортов-(Прокофьевка, Е&ная заря, Перёсвет) отмечается снижение данного показателя по сравнению с контрольной группой зерна, выращенного в течение 2-х. ' суток на воде.

Полученные данные позволяют рассматривать протеолитичес-кие ферменты как важную регуляторную систему, активность» которой определяется целый ряд хозяйственно-полезных признаков зерне озимой мягкой пшеницы. Эти результаты являются теоретическим обоснованием возможного.практического использования • показателей системы протеолиза в селекции пшеницы на качество.

Л ' К выводы-

'■>,''■ I. В 'эндосперме йозревагщей.зерновка пшеница'.обнаружены

• два Системы пегяидгидролаз.' Активность, кислых протегшаз и кар-

• боксипептидазы.увеличивается, а содержание протеиназ, опреде-' ляемих по гидролизу клейковины и казеина, снижается в' процессе созревания. Увеличение активно6*н кислых'пептидгидролаз

' сопровождается преимущественным увеличением содержания связан-,'кнх форм ферментов.

2. При .расщеплении клэйковкнного .комплекса пептидгидрола-% эши нз созревающего зерна пшешщы в .первую очередь рзсщеп-; ляются глютелины, а затем отдельные фракции глиадина. ..3-, Процесс созревания зерновки сопровождается количест-. . Ьешплл увеличением .фракций.'высокомолекулярных глютелинов и чД* -глиаданов, что оказывает, решающее значение в ее способности гидроаязрваться протеияазами.

4. С помощью методов гель-фильтрации, и'зоэлектрофокуси-■ '• роваиия и ковалентной хроматографии установлено, что нейтраль-гае протешгезы созревающего зерна отличаются•по своим фазико-. хшкческими .каталитическим свойствам ;от пептидгидролаз яро- ■ растгшщой зерновки.' Нейтральные протеиназы созревавшего зерна .шею? р1 4,74,. а. прорастающего зерна - р1 6,60.

. 5. Разработаны методы.получения кврбокскпептидаз из соз-, ' ревеицего и прорастающего зерна пшеницы. С помощью .методов гель-фильтрации н из о эле кт рофо кусирования из 'созревающего .зерна гиэниш выделена .в очищенном виде сершовая карбокснпепти-даза с р1 4,84, молекулярной массой 57,1 кД. В отличие от выделенного фермента карбоксипептидаза. прорастающего зерна является мзталлозависгшой пептидгидролазой.

; б. Поражение фузар^изои семян пшеницы-при созревании ■ приводит к;, изменению белкового, комплекса зрелого зерна и уве-; личейию активности пептидгидролаз. Прорастание семян на фу-.. ' зариогном.фоне сопрововдаггс'я снижение« активности пептидгидролаз и увеличением-содержания ингибитора трипсина в ендоспер-. ые зерна устойчивого сорта пшеницы. В зерне восприимчивого к фузариоз'у сорта пшеницы отмечается,менее выраженное уменьшение активности пемидгидролаз и снижение уровня ингибитора

• трипсина. ■ ■ "'•■.'

'.■■■''•. 20 • Основнг содержвдие. диссертедии опубликовано в следу-щкх печатных работах: ' . : • . '•; ■'•' ' .

I. Физико-химические свойств клейкошшысоореваяцего ', зерна пшеницы // В сб.:. Проблемы селекции злаковых и бобовых культур на кормовую ценность зерна. Сборник научных трудов. -Одесса,. БСГИ, 1987. -С. 52-58 Св соавторстве).

.. 2. ПротеолГз заггрснк*. бГлкДв злскових культур та його ,регуляц1я. У Укра1нський 61ох1м1чыий э'1эд, Тезн $опов!дей. •.. Ки1в, 1987. - !,« I. - С.236 (в соавторстве).

3, Активность пепт^гидролаэ. е созревающем зеркз .пшеницы // Прикладная биохимия и микробиология. - 1939. - Т.25, № 2'.-С.220-225 (в соавторству).

_ 4. Характеристика протеолигических ферментов созреваще-го зерна ппеницы // В кн.: £>изиолого-генетические механизмы регуляции азотного питания растений. Тезисы докладов конференции. Киев, 199- С.8-9 (в. соавторстве) . ' .

. ■ .и ° г

Подпл печати 13.03.92г. Форма т ГО*84.1/16. , - .

. Об'ем О.Зуч.изд.л. (,25п, л. Заказ № 681. Тираж 100экэ. Горткпография Одесского обттот1графиздата,"ех«£3. .

Ленина 49,'