Новые раковые антигены человека

Королёва, Екатерина Павловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Новые раковые антигены человека
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Новые раковые антигены человека"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ имени В.А.ЭНГЕЛЬГАРДГА

На правах рукописи

КОРОЛЁВА ЕКАТЕРИНА ПАВЛОВНА

НОВЫЕ РАКОВЫЕ АНТИГЕНЫ ЧЕЛОВЕКА; СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ И МОЛЕКУЛЯРНЫЙ

АНАЛИЗ

(03.00.03 - молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2005

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной иммунологии Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта Российской академии наук (г. Москва, Россия) и в НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского Московского Государственного Университета им. М.В Ломоносова (г. Москва, Россия).

Научный руководитель:

Кандидат биологических наук Д.В.Купраш.

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук О.Л.Поляновский

(Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН)

Доктор медицинских наук И.Г.Козлов

(Российский государственный медицинский университет)

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится 2005 г. в часов на

заседании диссертационного совета Д 002.2^5.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Д-32

Автореферат разослан ^

2005 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук

15*52.0

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы.

Поиск и молекулярный анализ новых раковых антигенов человека является актуальной задачей молекулярной биологии рака. Предлагаемые в последние годы новые концепции лечения онкологических заболеваний базируются на специфической стимуляции иммунной системы пациента антигенами, экспрессирующимися опухолевой клеткой. Первыми молекулярными раковыми маркерами, обнаруженными в 60 гг. 20в, а позднее и проклонированными, были альфа-фетопротеин, маркер рака печени (Abelev, 1963), и СЕА, характерный для рака толстой кишки и некоторых других эпителиальных раков (Gold and Freeman, 1965). Позднее, в 70 годах, были найдены простат-специфический антиген (PSA), характерный для рака простаты, СА-125 для рака яичников, HER-2/neu для рака молочной железы (обзоры Stenman et al., 1999, Verheijen et al., 1999, Disis and Cheever, 1998). Открытие интерлейкина 2 сделало возможным создание и поддержание стабильных линий цитотоксических Т лимфоцитов, что послужило основой для разработки молекулярных методов поиска раковых антигенов, базирующихся на идентификации Т-клеточных эпитопов (Van der Brüggen, 1991). Применение предложенного в 1995г Sahin и соавторами метода поиска раковых антигенов, основанного на обнаружении антигенспецифичных антител в сыворотке крови, привело к идентификации ряда новых раковых антигенов, характерных для широкого спектра неоплазий человека. Изучение и подробная молекулярно-биологическая характеристика генов, кодирующих раковые антигены, имеет большое научно-медицинское значение. Во-первых, изучение функции генов с опухолеспецифическими свойствами может существенно помочь в понимании молекулярных процессов, лежащих в основе опухолевого роста и метастазирования. Во-вторых, обнаружение и анализ множественных генов, кодирующих раковые антигены, дает возможность создания поливалентных противоопухолевых вакцин. В-третьих, применение группы генов в качестве

молекулярных маркеров дает потенциальную возможность повышения точности ранней диагностики рака.

Цели и задачи исследования.

Данное исследование направлено на изучение репертуара генов человека, продукты которых вызывают спонтанный иммунный ответ у раковых больных, с целью поиска и молекулярной характеризации новых раковых антигенов -потенциальных мишеней противораковых вакцин, или молекулярных маркеров для диагностики и мониторинга заболевания.

Были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Определить репертуар молекулярных маркеров рака толстой кишки и рака почки человека.

2. Разработать модификацию метода серологического скрининга на основе дот-блота рекомбинантных фагов.

3. Охарактеризовать наиболее перспективные из найденных антигенов с точки зрения возможных причин их иммуногенности у раковых больных.

4. Картировать области кДНК идентифицированных раковых антигенов, кодирующие иммуногенные эпитопы.

Научная новизна.

В настоящей работе в рамках международного проекта по характеризации ракового иммунома человека (http://www2.1 icr.org/CancerlmmunomeDBA было идентифицировано 126 генов, продукты которых могут вызывать спонтанный иммунный ответ у раковых больных. Более половины найденных генов были охарактеризованы в таком качестве впервые. Мы показали, что два гена, МО-REN-46/ALS2CR3 и MO-TES-25/GRIF-1, являются новыми раковоассоциированными антигенами человека. Эти антигены были охарактеризованы с точки зрения экспрессии их мРНК в нормальных тканях и в опухолях, а также их иммуногенности у раковых больных. Кроме того, были обнаружены и охарактеризованы новые сплайс-варианты антигена MO-TES-

25ЛЖ1Р-1. Впервые были картированы области кДНК раковых антигенов МО-ТЕ5-25/ОЫР-1, ТУМВ и Ш5АСЗ, кодирующие иммуногенные эпитопы.

Практическая значимость.

Результаты, полученные в данной работе, могут представлять интерес как для понимания механизмов возникновения иммунного ответа на опухоль, так и для практической онкологии. Обнаруженный нами спонтанный иммунный ответ у различных групп больных на новые опухолевые антигены человека \iO-REN-46/АЬ52СЮ и МО-ТеБ-25/КАР80, а также раковый маркер ГОАСЗ, может применяться как дополнительный признак при диагностировании и мониторинге ряда онкологических заболеваний. Нами показано, что тимидилатсинтетаза может служить серологическим маркером для мониторинга заболевания у части пациентов с раком толстой кишки. Разработанная нами модификация метода, позволяющая значительно упростить и ускорить процедуру аллогенного скрининга, может применяться во всех лабораториях, использующих метод серологической диагностики на основе рекомбинантных полипеитидов.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на нескольких международных и отечественных симпозиумах и конференциях, в том числе на Международном симпозиуме по раковым вакцинам (Нью-Йорк, 2-4 октября 2000 г.), на 6-й Энгельгардтовской международной конференции (Москва, 21-26 июня 2001 г.), на 20-й международной конференции по онкогенам (Фредерик, Мериленд, США, 16-20 июня 2004 г.), на отчетной Конференции по программе Президиума РАН "Физико-химическая биология" (Москва, 22-23 апреля 2004

г.).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, полученные результаты и обсуждение, выводы, список литературы. Материалы диссертации изложены на страницах машинописного текста и включают рисунков, таблиц и список литературы из источников.

Основное содержание работы

Поиск новых раковых антигенов человека необходим для создания как поливалентных, так и моновалентных противораковых вакцин, а также для диагностирования и мониторинга заболевания. Применение метода серологического скрининга экспрессионных библиотек (SEREX, от "SERological identification of antigens by EXpressional cloning"), предложенного в 1995 г Sahin и соавторами для поиска новых раковых антигенов, к разным видам неоплазий человека показало, что практически у каждого ракового пациента существует широкий спектр иммунологических реакций на экспрессируемые опухолевыми клетками полипептиды.

В настоящей работе мы провели подробный молекулярно-биологический анализ ранее неохарактеризованных антигенов рака почки и рака толстой кишки человека, идентифицированных при помощи метода SEREX.

1. Серологические скрининги

Для поиска антигенов рака почки были приготовлены экспрессионные библиотеки из двух образцов аденокарциномы почки, которые были проскринированы аутологичными сыворотками. Для поиска антигенов рака толстой кишки был избран другой подход: экспрессионная библиотека была приготовлена из ткани нормальных семенников, амплифицирована, и затем проскринирована двумя наборами сывороток больных раком толстой кишки. Обнаруженные в ходе иммуноскрининга позитивные клоны были идентифицированы путем частичного определения нуклеотидной последовательности. Последовательности кДНК всех антигенов были сравнены

с последовательностями, депонированными в базу данных по раковому иммуному (1Шр.//\у\у\у2 Iicr.org/CancerIminunomeDB/ ). 29 из 66 антигенов рака почки и 19 из 60 антигенов рака толстой кишки были идентифицированы ранее в ЭЕИЕХ анализе различных типов опухолей и депонированы в базу данных по БЕИЕХ-антигенам. Статистика четырех раундов иммуноскрининга представлена в Таблице 1.

Таблица 1. Статистика серологических скринингов

Библиотека Источник мРНК Число проскри-нирован- ных клонов Число позитивных клонов Разных генов Ранее ^охарактеризованных генов Сыворотка Разведение сыворотки

1 Рак почки 300 ООО 69 45 14 Аутологичная 1:200

2 Рак почки 150 000 27 21 4 Аутологичная 1:200

3 Семенники (1) 150 000 37 25 8 Смесь 3 сывороток, рак толстой кишки 1:300

4 Семенники (2) 200 000 48 35 13 Смесь 3 сывороток, рак толстой кишки 1:300

Следующим шагом анализа антигена является проверка его реактивности с сыворотками больных раком и нормальных доноров (аллогенный скрининг). В аллогенном скрининге выявляется несколько групп антигенов. Лишь небольшая доля клонов имеет выраженный раковоспецифический профиль реактивности, т.е. гуморальный ответ на эти антигены обнаруживается у раковых больных, но не у нормальных доноров. Основная часть полученных в каждом скрининге клонов кодирует антигены, не имеющие раковой специфичности или индивидуальные аутоантигены.

2. Аллогенный скрининг в формате дот-блота фаговых лизатов.

Большинство клонов, полученных при первичном анализе библиотеки, отсеивается при последующем аллогенном скрининге, т.е. при скрининге представительными коллекциями сывороток здоровых доноров и раковьгх больных. Лишь небольшая часть клонов, белковые продукты которых узнаются

преимущественно сыворотками раковых больных, могут представлять интерес как потенциальные опухолевые маркеры или возможные мишени противоопухолевых вакцин. Таким образом, стандартная процедура аллогенного скрининга является весьма трудоемкой и требует больших затрат сыворотки пациентов. Нами была разработана процедура SMARTA (Serological Mini-Arrays of Recombinant Tumor Antigens) (Lagarkova et al., 2003), позволяющая значительно облегчить и ускорить процедуру аллогенного скрининга за счет одновременного нанесения большого количества клонов на мембрану в виде дот-блота фаговых лизатов. Этот подход может также служить основой для создания диагностических панелей, несущих набор антигенов, на которые формируется иммунный ответ у разных групп пациентов.

Рисунок 1. Сравнение стандартного аллогенного скрининга (А) и аллогенного скрининга в формате SMARTA (В). 1. МО-ВС-1004, 2. отрицательный контроль lambda ZAP фаг, 3. MO-REN-81, 4. МО-ВС-1140, 5. MO-OVA-42. Неоднородное окрашивание фаговых бляшек является характеристикой отдельных рекомбинантных фагов, и возможно связано с коротким временем жизни экспрессированного белка в фаговом лизате.

Преимуществами разработанного метода перед стандартным методом аллогенного скрининга являются высокая производительность, воспроизводимость, возможность количественной оценки результата, возможность изменения формата (Рисунки 1-2). Кроме того, данный метод более устойчив к условиям и длительности хранения суспензий используемых рекомбинантных бактериофагов.

3. Антигены рака почки.

Раковые антигены и аутоантигены рака почки, полученные в серологических скринингах, представлены в Таблице 2.

3 ФШ

^ I »шА—»» ■<—* птлЛт,

Mil'

Щ/гЩШ

ф 5

В.Й.Ижйэ.Й.В!

1 1 3 4 5 6 7

Рисунок 2. Количественный обсчет результатов. А - мембрана в формате SMARTA, В - Количественный обсчет интенсивности сигнала на мембране А. 1 - МО-ВС-1140, 2 - MO-REN-ЮЗ, 3 - МО-ВС-1004, 4 - негативный контроль, 5 -MO-REN-81, 6 - MO-OVA-42, 7 MO-REN-2. Мембрана была отсканирована при помощи цветного планшетного сканера. Изображение было обсчитано при помощи программы OptiQuant версии 3.0 (Packard Instrument Со). Фоновая оптическая плотность определялась на участках мембраны между фаговыми бляшками.

Раковоассоциированный антиген MO-REN-46.

Клон MO-REN-46 кодирует кДНК гена ALS2CR3 (RefSeq NM 015049). ALS2CR3 был картирован в участке хромосомы 2q33-q34, ассоциированном с амиотропическим латеральным склерозом, однако было показано, что ALS2CR3 не является критическим геном для развития заболевания (Hadano et al., 2001). Частота встречаемости иммунного ответа на MO-REN-46 в сыворотках раковых больных представлена в таблице 3.

Hadano и соавт. обнаружили аллельный полиморфизм в 13 экзоне гена ALS2CR3 (вариации в кодоне АСА-АТА приводили к замене Thr на 11с). Поскольку такого рода аминокислотная вариабельность могла приводить к вариабельности иммуногенных свойств белка, мы проверили нуклеотидные последовательности в тринадцатом экзоне гена MO-REN-46/ALS2CR3 в опухолевом материале пациентов как серопозитивных, так и серонегативных по MO-REN-46. Результаты, полученные с помощью метода PCR-RFLP представлены на Рисунке 3. Мы не обнаружили корреляции между наличием треонина или изолейцина в этом участке MO-REN-46 в опухоли и возникновением иммунного ответа на MO-REN-46 у пациента.

MOREN клон Ген/белок Unigene кластер Гомологи в базе данных SEREX* Реактивность

Здоровые доноры Рак почки

12 4 Субъединица 26S протеосомы Hs.5648 0/13 1/12

26 1 ASPSCR1 Hs.298351 0/10 1/20

36 1 БТШбОШ Hs.79037 NGO-St-116 0/20 1/11

46 1 ALS2CR3 Hs. 154248 0/24 5/45

47 2 Митохондриальный белок NGO-Pr-125 0/16 1/12

48 1 HDCMA18Р белок Hs.278635 NGO-Br-36 0/10 1/20

52 1 Белок, ассоциированный с микротрубочками 1В Hs. 103042 MOBr-111, NGO-Pr-23 0/24 1/40

54 2 Disrupter of silencing 10 Hs.322901 0/24 4/45

55 1 KIAA0752 Hs. 126779 NY-REN-7 0/10 1/18

58 4 Signal recognition particle 72ГО Hs.237825 HOM-TS-GLI-79-R 0/14 1/20

63 1 Неизвестный Hs. 183362 0/21 1/24

67 1 Solute carrier family 25, member 6 Hs. 164280 0/10 1/12

68 1 EIF4G2 Hs.183684 0/10 2/21

73 1 Неизвестный Hs.135259 0/10 1/20

81 1 KIAA0390 Hs. 108884 0/21 1/18

87 1 Неизвестный Hs.293097 0/15 1/12

89 1 KIAA1359 Hs.69321 0/10 1/12

103 1 Серологический антиген рака толстой кишки 16 Hs.271926 NY-CO-16 0/25 3/40

205 1 RGS19IP1 Hs.6454 NGO-Br-55 0/24 2/24

220 1 Циклин I Hs.79933 NGO-Pr-18 0/10 1/12

232 2 Субъединица 26S протеосомы, non-ATPase 7 Hs. 155543 0/32 2/25

237 1 Lyn субстрат 1 Hs. 14601 0/20 1/24

242 1 Рибосомальный белок L27a Hs.76064 MO-BC-205 0/32 1/24

251 1 RAC1 Hs.l 73737 0/26 1/24

255 1 ТСР1, субъединица 8 Hs. 15071 NY-REN-15 0/24 1/24

256 1 Рибосомальный белок S12 Hs.33969 5-56.1/T3 0/24 1/24

257 1 Неизвестный 0/32 1/24

267 1 Фосфатаза двойной специфичности 12 Hs.44229 0/18 1/24

270 5 Неизвестный Hs.331328 NGO-Pr-51, P2B-41c 0/34 1/24

279 1 Динамин-1 подобный белок Hs.l 80628 NY-BR-47 0/45 1/24

# - Общее количество клонов, происходящих из одного гена, найденное в библиотеке.

* - http://www2.licr.orp/CancerImmunomeDB/

Таблица 3. Частота встречаемости ответа на МО-1ШЧ-4б в сыворотках раковых больных.

Рак почки Рак молочной железы Рак яичника Рак толстой кишки

5/45(11%)* 10/160 (6,3%) 6/89 (6,7%) 46/675(6.8%)*

*- р<0.05 (в сравнении с нормальными донорами, 3/141 (2%))

Крысиный ортолог АЬ82СЮ, ОКИЧ имеет 88% идентичности с белковым продуктом АЬБ2СКЗ. Делеция, найденная в ОКПМ, соответствует делеции 15 экзона АЬЭ2СЯЗ (Веек, 2002). Мы проверили наличие соответствующего альтернативного сплайс-варианта у человека. С помощью ЯТ-РСЯ с соответствующими праймерами, было показано, что у человека альтернативных транскриптов с делетированным экзоном 15 не детектируется.

385Т M 682N MZT 741N 741Т

Mo-Ren-48

747N 747Т 767N 767Т M plasmid

Рисунок 3. Аллельный полиморфизм в кодоне 528 клона MO-REN-46 не влияет на иммуногенные свойства белка. PCR-продукты (1) были подвергнуты рестрикции Sali (2). Т -образец опухоли толстой кишки, N -образец нормальной ткани кишечника того же пациента. Пациенты 257, 385, 682 - серопозитивны по MO-REN-46.

£ fc

ZHZI-ZI-ZI-ZH- с.«

®ONNNÇI>tJS5»; СО

о>о>сососяо>оосослсп

<OCO(Û(Û(O<Or^h-<OC0

■о

1 <о а

MO-REN-4E

actin

Рисунок 4. Экспрессия МО-ИЕ1Ч-46 в нормальных тканях и опухолевых образцах человека. Т - образец опухоли толстой кишки, N - нормальная ткань кишечника. Пациенты 117,682, 784 серопозитивны по МО-КЕЬМб.

СИПМ экспрессируется во всех тканях на уровне мРНК, однако экспрессия белка была показана только в возбудимых тканях - сердце, головном мозге и скелетных мышцах (Веек, 2002). Мы проверили экспрессию мРНК МО-1ШЧ-46 в некоторых нормальных тканях и образцах опухоли толстой кишки человека (Рисунок 4). МО-ПЕКМб экспрессируется во всех тканях, не было найдено отличий в уровне экспрессии между образцами опухоли и нормальной тканью кишечника того же пациента. Однако для ответа на вопрос, не является ли причиной иммуногенности МО-КЕЪМб у раковых больных его свехэкспрессия в опухоли, необходимо получение реагентов для детекции экспрессии на уровне белка. Таким образом, МО-1ШЯ-46/АЬ82СКЗ является раково-ассоциированным антигеном, гуморальный иммунный ответ на который обнаруживается у 6-11% раковых больных. Причины иммуногенности МО-1ШЧ-46, а также перспективы его применения для диагностики и мониторинга онкологических заболеваний, требуют дальнейшего изучения.

4. Антигены рака толстой кишки.

Раковые антигены и аутоантигены рака толстой кишки, полученные в серологических скринингах, представлены в Таблице 4. Только два клона, МО-ТЕБ-25, кодирующий репрессор транскрипции 11АР80 и МО-Тез-187, кодирующий тимидилатсинтетазу, имели раковоспецифический профиль иммунореактивности.

МО-Теэ-25 как раковый антиген.

Анализ нуклеотидной последовательности клона МО-Тез-25 показал, что клон кодирует часть кДНК человеческого репрессора транскрипции ]1АР80 (ЛеКец №М_016290). Предполагаемая аминокислотная последовательность МО-Тев-25 соответствует аминокислотным остаткам 53-719 ЯАР80. Иммунореактивность МО-Тез-25/КАР80 в сыворотках раковых больных приведена в таблице 5. От 5 до 10% пациентов с раком легкого, яичника, молочной железы, толстой кишки, шеи и головы развивают спонтанный иммунный ответ на МО-Тев-25, тогда как в сыворотках больных меланомой (49 случаев), раком почки (51), раком шейки матки (23) антител на МО-Тея-25 обнаружено не было.

мо- Tes клон No* Ген/белок Unigene кластер Гомологи в базе данных SEREX* Реактивность

Здоровые доноры Рак толстой кишки

1 1 SbRPINFl Hs.173594 0/47 1/42

5 1 Аполипопротеин Е Hs. 169401 GBU-TesLu3-1 0/60 1/42

20 1 Гипотетический белок FLJ40365 Hs 375985 0/35 1/42

25 1 RAP80 Hs.7889 0/35 2/42

50 1 Стеароил-СоА десатураза 4 Hs.247474 0/63 1/42

51 2 Неизвестный Hs.428901 0/63 1/42

66 1 Неизвестный Hs.350401 0/57 1/35

71 8 ORF 14 хромосомы 1 Hs.112017 0/53 1/42

74 1 FBXL5 Hs.55480 0/36 1/58

77 1 CREB3, луман Hs.287921 0/63 1/30

104 1 DDHD1 Hs.7076 0/30 1/50

105 1 Лимкаин бета 2 Hs.288909 0/30 1/50

107 1 KIAA2015 Hs.200916 0/30 1/50

111 2 Гипотетический белок FLJ20825 Hs.454227 0/30 1/65

118 1 SMARCC02 Hs.236030 0/30 1/50

119 4 SIN3A Hs.22583 0/30 1/50

122 1 Гипотетический белок FU35785 Hs.375441 0/30 1/60

131 1 Альфа-тубулин изотип Ш-альфа Hs.455781 151.7 contigF 0/40 1/50

139 1 Эндогенный ретровирус HERV-K109 HOM-Mel2-1.14 0/40 1/38

159 1 PDZ domain containing 3 Hs.173035 0/30 1/58

166 1 Zinc finger белок 9 Hs.2110 0/30 1/58

181 1 RBM3 Hs.301404 0/40 1/38

187 3 Тимидилатсинтетаза Hs.29475 0/58 6/103

219 1 Неизвестный Hs.434753 NGO-Lu-8 0/40 1/60

222 1 ALS2CR11 Hs. 144605 0/40 1/50

228 1 Протамин 2 Hs.2324 0/23 1/52

# - Общее количество клонов, происходящих из одного гена, найденное в библиотеке

* - http://www2 licr.oraCancciimmunomeDB/

Поскольку ранее была показана преимущественная экспрессия ЛАР80 в семенниках (Уап й а1., 2002), клон МО-Тез-25 привлек наше внимание как возможный СТ антиген. Для дальнейшего изучения профиля экспрессии МО-Тез-25Л1ар80 мы проверили экспрессию мРНК в образцах рака толстой кишки в

сравнении с нормальной тканью кишечника (Рисунок 5А), а также на коллекции нормальных тканей (Рисунок 5В). Высокий уровень экспрессии мРНК МО-Тев-25Л1ар80 был подтвержден в семенниках, средний уровень экспрессии наблюдался в яичниках, молочной железе и фетальном мозге, тогда как в нормальном толстом кишечнике, также как и в образцах опухолей толстой кишки наблюдался низкий уровень экспрессии мРНК. Мы не обнаружили различий в уровне экспрессии в опухолях толстой кишки в сравнении с нормальной тканью кишечника того же пациента как у серопозитивных по МО-Тев-25, так и у серонегативных пациентов. Таким образом мы показали, что МО-Тез-25/Кар80 не является антигеном СТ семейства.

Таблица 5. Частота встречаемости ответа на МО-Те8-25 в сыворотках раковых больных.

Плоскоклеточный рак шеи и головы Рак легкого Рак яичника Рак молочной железы Рак толстой кишки

3/31 (10%)* 2/35 (5.7%) 9/89 (10%)** 10/160 (6.3%)* 46/845 (5.4%)*

*- р<0.05, ** - р<0.01, в сравнении с нормальными донорами (3/194).

Компьютерный анализ баз данных по экспрессии генов показал наличие нескольких сплайс-вариантов, транскрибируемых с локуса Rap80 (Рисунок 6). Мы детектировали сплайс-варианты без 6 экзона (В), без экзонов 5 и 6 (С), с дополнительным экзоном 10А между 10 и 11 экзонами Rap80 (D), а также комбинированный вариант без экзона 6, но содержащий экзон 10А, в различных тканях человека (Рисунок 6). Делеция 6-го экзона (сплайс-варианты В и Е) приводит к образованию нового стоп-кодона и обрыву полипептидной цепи в позиции 160 аминокислотных остатков. Делеция 5-го и 6-го экзонов (вариант С) приводит к потере 281 аминокислоты в центральной части Rap80. Трансляция дополнительного экзона 10А приводит к образованию нового стоп-кодона и образованию укороченного до 572 аминокислотных остатка бежа (вариант D). Мы не нашли достоверных различий в картине экспрессии мРНК сплайс-вариантов между различными тканями человека, кроме семенников, где были детектированы дополнительные неохарактеризованные сплайс-варианты

(Рисунок 6А) Мы не детектировали различий в экспрессии на уровне мРНК между нормальными и опухолевыми тканями, однако для однозначного ответа на вопрос, не может ли сверхэкспрессия МО-Тез-25 или одного из сплайс-вариантов служить причиной его иммуногенности у раковых пациентов, в дальнейшем представляется необходимым исследовать экспрессию на уровне белка.

Рисунок 5. Экспрессия МО-Тез-25 в нормальных и опухолевых тканях. А -

Нозерн-блот анализ экспрессии в образцах рака толстой кишки. Т - образец опухоли толстой кишки, N - нормальная ткань кишечника. * - пациенты серопозитивные по МО-Тез-25. В - ЛТ-РСЯ анализ тотальной мРНК из нормальных тканей после 28 (МО-Тез-25) или 24 (актин) циклов амплификации. В контрольном образце 100 пикограмм плазмиды, содержащей кДНК МО-Тев-25 было использовано в качестве позитивного контроля.

Для того, чтобы определить, какие из идентифицированных сплайс-вариантов МО-Тез-25Л1ар80 содержат В-клеточные эпитопы, распознаваемые сыворотками больных, мы определили области высокой иммуногенности МО-Тез-25/Яар80. Для этого мы клонировали набор фрагментов кДНК 11ар80 и экспрессировали их в виде полипептидов, содержащих гистидиновый тэг, необходимый для очистки рекомбинантных белков с помощью №-КГА агарозы. Очищенные белки были нанесены на нитроцеллюлозную мембрану и протестированы на реактивность с сыворотками больных, серопозитивных по МО-Тез-25 (Рисунок 6Е).

tt ; i

?i i

I ( T if it

II i M I

MIIINI

fO CO

852

heart

$k muscle sp cord brain

fetal brain liver

fetal liver

colon

testis

ovary

breast

placenta

control

Рисунок 6. Идентификация кДНК-вариантов M0-Tes-2S/RAP80 с использованием RT-PCR. Структура сплайс-вариантов RAP80 и определение иммуногениых эпитопов. А. PCR-продукты с использованием праймеров Т25 4,8F и Т25 4,8R. Полосы 1071, 334 и 228 обозначают транскрипты А и D, В и Е, и С, соответственно. В. PCR-продукты с использованием праймеров T25-7F и Т-25 lOaltR (левая часть) и T25-7F и Т-25 10,11R (правая часть). Полосы 117 и 341 обозначают транскрипты D и Е, полоса 259 соответствует сплайс-вариантам А, В и С. С. Схематическое изображение кДНК RAP80, клона MO-Tes25 и сплайс-вариантов cDNA. Вероятные ORF окрашены серым цветом . Структура фрагментов кДНК, использованных для определения возможных областей иммуногенности. D. Нукпеотидная и аминокислотная последовательности экзона 10А сплайс-варианта D. Е. Определение областей иммуногенности RAP80.1. BSA, 2. бактериальный лизат, 100 нг, 3. rabbit anti-human IgG, 10 нг., 4. human IgG, 10 нг, 5. MO-Tes-25, 6. Полноразмерный RAP80, 7. фрагмент I, 8. фрагмент II, 9. фрагмент III, 10. фрагмент IV.

Оказалось, что В-клеточные эпитопы распределены по всей последовательности RAP80. За исключением всегда негативного фрагмента IV, содержащего экзон 10А, все фрагменты реагируют с положительными сыворотками с разной частотой. Наиболее иммуногенным является эпитоп, содержащийся во фрагменте П (6-ой экзон RAP80). Таким образом, наличие (варианты С и D) или отсутствие (В, Е) экзона 10А не влияет на иммуногенность сплайс-варианта у раковых больных. Наиболее иммуногенным является сплайс-вариант D, так как в нем сосредоточено наибольшее количество B-клеточных эпитопов.

RAP80 имеет сигнал ядерной локализации на N - конце и два структурных мотива типа ZF (цинковый палец) на С-конце. Ядерная локализация и наличие доменов, осуществляющих белок-ДНК взаимодействия позволяют предположить, что RAP80 функционирует как транскрипционный фактор. Yan и соавт. было продемонстрировано, что функция репрессии транскрипции ассоциирована с N - концом RAP80 (Yan et al., 2002). Детектированные нами сплайс-варианты В, С, D, Е не несут изменений на N -конце, таким образом внутриклеточная локализация и репрессорная функция белков не должны нарушаться. Транскрипты В и Е теряют оба ZF домена, а транскрипт D теряет домен ZF2, что может приводить к потере возможности взаимодействия с ДНК и другими транскрипционными факторами. Для понимания функции MO-Tes-25/Rap80 в нормальных и раковых клетках требуется дальнейшее изучение физиологической роли всех сплайс-вариантов.

Тимидилатсинтетаза как раковый антиген.

Клон, кодирующий тимидилатсинтетазу (MO-Tes-187) был найден при скрининге библиотеки нормальных семенников смесью из 3-х сывороток больных раком толстой кишки и параллельно при скрининге библиотеки, приготовленной из клеточной линии рака толстой кишки LoVo теми же сыворотками (МО-СО-1055). Оба клона показывали серологический ответ в одних и тех же сыворотках, но сигнал клона МО-СО-1055 был более ярким и легче детектируемым, поэтому для дальнейших экспериментов использовался клон МО-СО-1055 (Рисунок 7).

Клон МО-СО-1055 содержит неполный транскрипт человеческого гена TYMS (RefSeqNM_001071), лишенный 182 п.н. с 5' конца полноразмерной кДНК. Предполагаемая аминокислотная последовательность МО-СО-Ю55 соответствует аминокислотным остаткам 26-313 TYMS, и не содержит мутаций.

PI Р2 N1 N2 АВ АВ АВ АВ

Рисунок 7. Гуморальный иммунный ответ на TYMS в сыворотках раковых больных. А1 - негативный контроль (вектор без вставки), В1 - позитивный контроль (клон, кодирующий SWAP-70), А2 - клон MO-Tes-187, В2 - клон МО-СО-Ю55. PI, Р2 - серологически позитивные пациенты с раком толстой кишки, N1, N2 - серологически негативные пациенты с раком толстой кишки.

Тимидилатсинтетаза - один из необходимых ферментов синтеза и репарации ДНК. Уровень мРНК и белка TYMS часто повышен в опухолях, а ингибирование тимидилатсинтетазы ведет к подавлению клеточного роста или к смерти клетки. Ингибитор тимидилатсинтетазы, 5-FU (5-фторурацил) в течение продолжительного времени используется для терапии опухолей, особенного опухолей гастроинтестинального тракта. Основным ограничением использования 5-FU-0CH0BaHH0fl химиотерапии является приобретенная

устойчивость опухоли к химиотерапии, возможно связанная с повышенной экспрессией TYMS в опухоли.

Серологический ответ на тимидилатсинтазу был обнаружен нами только в сыворотках больных раком толстой кишки. Среди здоровых доноров (360 сывороток), а также среди больных раком молочной железы (150), раком яичника (90), раком почки (55), меланомой (23), плоскоклеточным раком шеи и головы (25), случаев спонтанного иммунного ответа на тимидиласинтазу зафиксировано не было, что свидетельствует о специфичности ответа на тимидилатсинтетазу для рака толстой кишки. Среди пациентов с раком толстой кишки иммунный ответ на TYMS встречался в основном среди пациентов, получавших терапию, включавшую 5-FU, тогда как среди первичных пациентов спонтанный иммунный ответ на тимидилатсинтетазу был крайне редок (Таблица 6).

Таблица 6. Частота встречаемости антител на TYMS в сыворотках больных.

Нормальные доноры Пациенты с раком толстой кишки

Получавшие 5-FU терапию Первичные

0/360 7/108* 1/300

* - р<0.00005 (к нормальным донорам)

р<0.0005 (к первичным пациентам)

Для определения иммуногенных областей тимидилатсинтетазы человека мы использовали тот же подход, что и для определения областей иммуногенности МО-Тез-25Я1ар80. Мы обнаружили, что М-концевая область белка ТУМБ (аминокислотные остатки 26-93) распознается сыворотками больных, серопозитивных по МО-СО-Ю55 (Рисунок 8).

Наличие антител на тимидилатсинтетазу коррелирует со сверхэкспрессией ТУМБ в опухоли. Так, из 8 серопозитивных по тимидилатсинтетазе пациентов сверхэкспрессия ТУМБ в опухоли была подтверждена иммуногистохимически в ходе стандартного медицинского исследования у двух пациентов. Однако, поскольку сверхэкспрессия ТУМБ

наблюдается в 50% опухолей толстой кишки, а гуморальный иммунный ответ на тимидилатсинтетазу встречается лишь в небольшой части неселектированных больных раком толстой кишки, наличие у пациента сверхэкспрессии ТУМБ в опухоли может быть необходимым, но недостаточным условием развития спонтанного иммунного ответа на тимидилатсинтетазу.

ТУМБ мРНК, 1536 и.о.

Экзои #

' Ы а I 4 I 5 к I

ТУМБ СИв

МО-СО-Ю55 Фрагмент) Фрагмент 2 Фрагмент 3 Фрагмент 4

нммуногенная область

ШЯ Серопозитивные фрагменты I I Серонегатнвные фрагменты

Р1

Р2

• •

•

ТУМв О о ВвА

Фрагмент 1 о о Фрагмент 2

Фрагмент 3 о о Фрагмент 4

Рисунок 8. Определение областей иммуногенности ТУМв. Фрагменты 1 -4 были протестированы в формате белкового дот-блота с сыворотками серопозитивных (Р1, Р2) и серонегативных (N1) пациентов.

Мы проводили мониторинг наличия антител на тимидилатсинтетазу в сыворотке больного раком толстой кишки (совместно с Онкологическим центром РАМН) в течение продолжительного времени. Оказалось, что у этого пациента поддержание высокого титра антител на ТУМ8 коррелировало с наличием минимальной остаточной болезни (Рисунок 9). Таким образом, наличие антител на ТУМБ в некоторых случаях может служить маркером для мониторинга заболевания. Следует отметить, что мы не проводили исследований гуморального ответа на тимидилатсинтетазу у пациентов с другими типами опухолей желудочно-кишечного тракта, также сверхэкспрессирующими ТУМЭ в опухоли и получавших терапию 5-ГО.

Потенциально ТУМБ может служить серологическим маркером для мониторинга заболевания и у этой группы пациентов.

Пациент СС224

Операция

Химиотерапия

Стадия заболевания

геннколэкхошго, ХОЛЕЦЯСТНСТОНИЯ

гемигепатэктомнн

лобэктомня

ленковорни, элоксахнк, 5-Р1) ленковорни,

5-Ри

Множественные Частотная метастиы ремиссия в печень

5Ри

Отсутствие Метастаз в Отсутствие симптомов левое легкое симптомов заболевании заболевания

антитела к

ТУМБ

1 > . 11. • 1,1, . 1 . .

Т" а о см О о Л1 о а (М о 141 о я <N1 о а см о о о о о гм гм РО о о сд

о сё о V 0 1 <*■> о 1Г> 0 1 о$ 0 1 см ® о т

- контроль МО-СО-Ю55

Титр антител к 30 ТУМБ

.1.

01 .2002 ОС 2002 08.2002 04 2003

Рисунок 9. Клиническая картина пациента СС224. Возможная корреляция наличия антител на ТУМв с присутствием опухоли. Сверху вниз - лечение, течение заболевания, серологические данные и количественный обсчет антител к ТУМБ.

Гистоновая деацетилаза 3 как антиген рака толстой кишки.

Клон MO-OVA-91, кодирующий гистоновую деацетилазу 3 (HDAC3), был идентифицирован в скрининге библиотеки из образна рака яичника сывороткой аутологичного пациента. Клон MO-OVA-91 содержит неполный транскрипт человеческого гена TYMS (RefSeqNM_003883), лишенный 448 п.н. с 5' конца полноразмерной кДНК Предполагаемая аминокислотная последовательность MO-OVA-91 соответствует аминокислотным остаткам 132428 HDAC3, и не содержит мутаций. Гистоновые деацетилазы представляют собой семейство белков, участвующих в динамической регуляции структуры хроматина во время транскрипции. Гистоновые деацетилазы также играют значительную роль в канцерогенезе. Так, гистоновые деацетилазы I класса (HDACI, П, Ш) регулируют экспрессию опухолевых супрессоров р53 и VHL (Kim et al., 2001; Juan et al., 2000; Ito et al., 2002), ингибируют экспрессию и транскрипционную активность эстрогенового рецептора а (ER-a) (Kawai et al., 2003), участвуют в регуляции пролиферации и выживаемости опухолевых клеток (Glazer, 2003).

Серологический ответ на гистоновую деацетилазу 3 был обнаружен у 5% больных раком толстой кишки и в единичных случаях у больных раком яичника и раком почки, но не у здоровых доноров и больных другими видами рака (р=0,02), таким образом, HDAC3 является антигеном, специфичным для рака толстой кишки. Интересно, что мы не обнаружили иммунного ответа у раковых пациентов на близкородственные гистоновые деацетилазы I класса HDAC1 и HDAC2, имеющие высокий процент гомологии по белковой последовательности с HDAC3. Для картирования В-клеточного эпитопа HDAC3, распознаваемого сыворотками больных раком толстой кишки, была приготовлена суббиблиотека, содержащая перекрывающиеся фрагменты к ДНК HDAC3. Фрагменты, полученные путем расщепления ДНКазой I, были заклонированы в вектор lambda ZAP express; полученная библиотека была проскринирована сыворотками пациентов, серопозитивных по MO-OVA-91. Анализ позитивных клонов показал, что В-клеточные эпитопы HDAC3, распознаваемые сыворотками больных, расположены в С-концевой части HDAC3, где не

наблюдается высокой гомологии между НОАСЗ и ШЭАС1 и ШЗАС2 (Рисунок 10).

1 50

Щ»С1 MAQTQGT-RRCTCTfV'yDCPVtaCYYTGQgBMCgiraiRHTHNLLX^YCbTR ШПС2 MAYSOGGGKKKVCYYroCTIOTYYTGQGHMtgHRlRMraMLLLHTtOLTR

ю*сз МАи^тггогоУбигтеомнаташаАьтазьуьнтсик

si 100

И>ЛС1 KMEIYRWKMSEEMTKYSKPPTlKirLRSIRPDIWSEYSKCHQRWIWED HDXC2 KMEIYB№KATAESM?KYH8PETXKJl.R3IR?01ft*3EVSKQMQRBMVCED НМСЭ КМГУ FKPYQXSQH LWCRFHSE DYI РИД RVS УГ1ЧЗОРТК5 ШАПГУРОТ

101 150

1ШАС1 CPVyDQLFErCQL£TqGgVA3AVKmKQQTPIAVWWfcQgLHHAKKSEMO HDAC2 стугидд1то1^тюауд(ау!ато0сгш«у|ппцюми1дв»*»а ШЯСЭ CPVgPGIJgrC3RYTGfiaLQGATQIJIHKrCTtfcTHtaaOtJOtAKKFgAa<3

151 200

HQACi Tü«vi«jiHAiiJBijjmiC!i^TiPioimaixmzAyrrTUKV)<rvaiH щ>лс2 гс1УНРгтал11Д1Д^1Ю1т.1Г1Р1Р1внзраУЕх*тгг1РКУМГУ8Т«

ШМСЭ FCTV№IVlCIIilIJUtTHPHVI.YIDIDiaH<a)CT0e*rTLIDKV>gV3rH

201 2S0

1ГОЛС1 KT8CTr-waCDt.BDrglt0mKTTftVWYPUa>eiPDE»tEaiFKPVMSK7 HDAC2 iai^g-paTmLRDiiaei<5CTTAVHt?Himsn«ESTG0iífia'iiSKv ЕОАСЭ KTCHYyFTOTCDHYCVOXESQfíTYCI^VPLKDglODQgTKHLKyVIHW

251 300

Htwcl MEMFQPSAVVbQC05DaLSGDRbQCFWLTrKCHAKCVKirVKSrrLPHIjq. KDXC2 MEMYQPSAWLQCCADSLSGDRbGCFMbTVKGHftKCVEWICrgglJlXMb HDAC3 VDFYQPTC rVXaC<^gLGCDIll<»anibSIBBaGECVKYVKSnrrPU.Vb

301 350

KDÍÜCI GgSOmRBWMtCWPTETAVALDTElPNgLgyWDTWBfTGMalfKLIIISPe ¡вас! aKareimviatcHTreTAVALDCEietacLrrNDxnzretDrKLKisps ЮЖЗ CCCgYTVRHVAaCWTYETSLLVEEAJSqiUTSETrBarftgOgTLHPDV8

351 400

ШЯС1 W-mTiainHCTliEKIKaRLTHnilafliPII>PGVgH0MFEDaIfEE3aPlD HDJUC2 H-HTHQHTPETMEKIKQRLrPniRHLPBfcPGVQMQAIPEDAVHEDSGCMD BDXC3 TRIEMQ4SRQTl.DQIRgTI»xraK>g.HH*J5V0I HP<T«PLLTYDRTP«-

401 450

HDAC1 EDOPDKRISICSSDMIIACESErSOSEEEGEQGRKIISSIirKK-AKRVKTE ШМС2 GEJrPKRISIRASDKRlÜCDBEt'SDSEDEGEGGRRMVAOHKKGAKKARIE -ДОЛЕЕ RGPEENYSRPE»PI

шжсз

451 4»0

HSAC1 DBtEKDPEEKKEVTEBEK7KE---EKPEAKGVKEEVKLA

ИСЛС2 EDKKETEDKKTDVKEEDKSKONSGEKTBTKGTKSEQbSHP

Рисунок Ю.Сравнение аминокислотных последовательностей гистоновых деацетнлаз I, II, я III и положение В-клеточного эпитопа ЕГОАСЗ (выделено серым).

Таким образом, гистоновая деацетилаза 3 может служить новым биомаркером рака толстой кишки и является единственным представителем гистоновых деацети-лаз первого класса, иммуно-генным у раковых больных.

Заключение.

В данной работе проведен молекулярный анализ репертуара антигенов рака почки и рака толстой кишки человека, обнаружены и охарактеризованы новые раковоассоциированные антигены, изучены молекулярные характеристики некоторых из найденных антигенов, необходимые для их дальнейшего использования с целью диагностики и мониторинга раковых заболеваний.

Выводы.

1. Проведен анализ репертуара антигенов рака почки и рака толстой кишки. Обнаружено и частично охарактеризовано 166 разных генов, на белковые продукты которых формируется иммунный ответ у раковых больных.

2. Разработана новая модификация метода аллогенного скрининга (SMARTА), основанная на дот-блоте рекомбинантных фагов, позволяющая значительно ускорить и унифицировать процедуру анализа раковых антигенов.

3. Найдены новые раковоассоциированные антигены человека, вызывающие гуморальный иммунный ответ у больных различными видами рака МО-REN-46/ALS2CR3 и MO-Tes-25/RAP80. Охарактеризована их экспрессия и иммуногенность у раковых больных. Найдены и охарактеризованы новые сплайс-варианты кДНК MO-Tes-25/RAP80.

4. Установлено, что раковые маркеры тимидилатсинтетаза и гистоновая деацетилаза 3 являются антигенами рака толстой кишки. Показано, что иммунный ответ на тимидилатсинтетазу может использоваться для мониторинга заболевания части больных раком толстой кишки.

5. Картированы области кДНК раковых антигенов MO-Tes-25/RAP80, МО-OVA-91/HDAC3 и МО-СО-1055ATMS, кодирующие В-клеточные эпитопы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Е.П. Королева. М.А. Лагарькова, A.A. Мещеряков, М. Сканлан, Л. Олд, С.А. Недоспасов, Д.В. Купраш. Серологическая идентификация антигенов, ассоциированных с раком почки. Российский журнал иммунологии, 2002,7,229-238.

2. М.А. Lagarkova, Е.Р. Koroleva. D.V. Kuprash, V.E. Boitchenko, U.A. Kashkarova, S.A. Nedospasov, Y. V. Shebzukhov. Evaluation of humoral response to tumor antigens using recombinant expression-based serological mini-arrays (SMARTA). Immunol Lett., 2003, 85, 71-74.

3 Е.П. Королева. M.A. Лагарькова, C.B. Хлгатян, Ю.В. Шебзухов, A.A. Мещеряков, М.Р. Личиницер, С.А. Недоспасов, Д.В. Купраш. Серологические исследования репертуара раковых антигенов и аутоантигенов человека. Молекулярная биология, 2004,38, 233238.

4. Shebzukhov YV, Koroleva EP. Khlgatian SV, Lagarkova MA, Meshcheryakov AA, Lichinitser MR, Karbach J, Jager E, Kuprash DV, Nedospasov SA. Humoral immune response to thymidylate synthase in colon cancer patients after 5-FU chemotherapy Immunol Lett, 2005, 100, 88-93.

5. Shebzukhov YV, Koroleva EP. Khlgatian SV, Belousov PV, Kuz'mina KE, Radko BV, Longpre F, Lagarkova MA, Kadachigova TS, Gurova OV, Meshcheryakov AA, Lichinitser MR, Knuth A, Jager E, Kuprash DV, Nedospasov SA. Antibody response to a non-conserved C-terminal part of human histone deacetylase 3 in colon cancer patients. Int J Cancer, 2005. опубликовано online 24.06.05, http://www3.interscience.wilev.com/cgi-bin/abstract/110548102/ABSTRACT

Тезисы конференций:

1. E.P.Koroleva. M.A.Lagarkova, A.N.Kuimov, S.A.Nedospasov, A.V. Tumanov, I.G.Lyakhov, R.L.Turetskaya, A.A.Mescheryakov, Candidate tumor antigens in renal cancer, Абстракт конференции Cancer vaccine week, New York, October, 1998.

2. Лагарькова M.A., Королева Е.П.. Куимов A.H., Бойченко В.Е., Мещеряков A.A., Кашкарова У.А., Рубцов A.B., Вдовиченко К.К., Петров В.Н, Исаченко Н.В., Турецкая Р.Л., Недоспасов С.А, Поиск антигенов методом серологического анализа экспрессионных клонотек. Абстракт конференции 2 съезд иммунологов России, Сочи, сентябрь, 1999.

Отпечатано в копицентре « СТ ПРИНТ » Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. www.stprint.ru e-mail: zakaz@stprint.ru тел: 939-33-38 Тираж 100 экз. Подписано в печать 10. 10. 2005 г.

Hs i ер б 9

РНБ Русский фонд

2006-4 15520

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Королёва, Екатерина Павловна

Введение.б

Обзор литературы. Молекулярные мишени иммунотерапии и диагностики опухолей.

1. Новые молекулярные подходы к иммунотерапии опухоли.

1.1. Стимулирование врожденного иммунитета.

1.2. Стимулирование В-клеточного ответа.

1.3. Усиление Т-клеточного ответа.

2. Методы поиска опухолевых антигенов человека.

2.1. Методы, основанные на культивировании цитотоксических

Т-лимфоцитов пациента.

2.2. Серологические методы.

2.3. Методы, основанные на дифференциальной геномике и протеомике.

3. Применение метода серологического скрининга рекомбинантных экспрессионных библиотек для клонирования кДНК, кодирующих раковые антигены человека.

3.1. Классификация раковых антигенов, идентифицируемых методом SEREX.

3.1.1. Антигены дифференцировки.

3.1.2. Антигены, возникающие в результате мутаций.

3.1.3. Антигены, появляющиеся в результате альтернативного сплайсинга.

3.1.4. Сверхэкспрессированные антигены.

3.1.5. Вирусные антигены.

3.1.6. СТ антигены.

3.1.7. Раковоассоциированные аутоантигены.

4. Молекулярные механизмы иммуногенности раковых антигенов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Новые раковые антигены человека"

Поиск и молекулярная характеризация новых раковых антигенов человека является актуальной задачей молекулярной биологии рака. Предлагаемые в последние годы новые концепции лечения онкологических заболеваний базируются на специфической стимуляции иммунной системы пациента антигенами, экспрессирующимися опухолевой клеткой. Несмотря на то, что долгое время считалось, что за редчайшим исключением опухоль вообще не может быть иммуногенной, появление инбредных линий мышей и возможность индукции у них опухолей с помощью химических канцерогенов и опухолеродных вирусов позволили обнаружить в опухолях трансплантационные опухолевые антигены, ответственные за специфический противоопухолевый иммунитет. В 50 гг. 20в. впервые удалось показать, что опухоли мышей, индуцированные метилхолантреном, иммунизуют мышей той же линии, а также донора первичной опухоли против клеток данной опухоли, но не иммунизуют против клеток другой опухоли и нормальных клеток мышей той же линии (Gross, 1943; Foley, 1953; Baldwin, 1955; Prehn and Main, 1957). Тогда же были разработаны критерии доказательства обнаружения специфических трансплантационных опухолевых антигенов в экспериментальных опухолях с помощью трансплантационного теста in vivo, включающего в себя иммунизацию исследуемой опухолью, прививку клеток исследуемой опухоли и исследование подавления роста опухоли иммунизованными животными, а также пересадку кожных лоскутов для подтверждения сингенности системы. Однако по понятным причинам такого рода тесты не могли применяться для идентификации антигенов человека, и долгое время вопрос об опухолевых антигенах человека оставался открытым. Первыми молекулярными раковыми маркерами, обнаруженными в 60 гг. 20в, а позднее и проклонированными, были альфа-фетопротеин, маркер рака печени (Abelev et al., 1963), и СЕА, характерный для рака толстой кишки и некоторых других эпителиальных раков (Gold and Freeman, 1965). Позднее, в 70 годах, были найдены простат-специфический антиген (PSA), характерный для рака простаты, СА-125 для рака яичников, HER-2/neu для рака молочной железы (обзоры Stenman et al., 1999, Verheijen et al., 1999, Disis and Cheever, 1998). Все эти маркеры в настоящее время активно используются в клинике для дифференциальной диагностики и мониторинга эффективности лечения опухолевых заболеваний. В последние годы произошел значительный прогресс в иммунотерапии рака, связанный, в том числе, и с разработкой новых эффективных методов поиска раковых антигенов. Так, открытие интерлейкина 2 сделало возможным создание и поддержание стабильных линий цитотоксических Т лимфоцитов (Knuth et al., 1984), что послужило основой для разработки молекулярных методов поиска раковых антигенов, базирующихся на идентификации Т-клеточных эпитопов (Van der Bruggen et al., 1991). Применение предложенного в 1995г Sahin и соавторами метода поиска раковых антигенов, базирующегося на обнаружении антигенспецифичных антител в сыворотке крови, привело к идентификации ряда раковых антигенов, характерных для широкого спектра неоплазий человека. Изучение и подробная молекулярно-биологическая характеристика генов, кодирующих раковые антигены, имеет большое научно-медицинское значение. Во-первых, изучение функции генов с опухолеспецифическими свойствами может существенно помочь в понимании молекулярных процессов, лежащих в основе опухолевого роста и метастазирования. Во-вторых, обнаружение и анализ множественных генов, кодирующих раковые антигены, дает возможность создания поливалентных противоопухолевых вакцин. В-третьих, применение группы генов в качестве молекулярных маркеров дает потенциальную возможность повышения точности ранней диагностики рака.

Обзор литературы.

Молекулярные мишени иммунотерапии и диагностики опухолей.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Королёва, Екатерина Павловна

Выводы.

2. Разработана новая модификация метода аллогенного скрининга (SMARTA), основанная на дот-блоте рекомбинантных фагов, позволяющая значительно ускорить и унифицировать процедуру анализа раковых антигенов.

3. Найдены новые раковоассоциированные антигены человека, вызывающие гуморальный иммунный ответ у больных различными видами рака MO-REN-46/ALS2CR3 и MO-Tes-25/RAP80. Охарактеризована их экспрессия и иммуногенность у раковых больных. Найдены и охарактеризованы новые сплайс-варианты кДНК MO-Tes-25/RAP80.

5. Определены области, содержащие В-клеточные эпитопы раковых антигенов МО-Tes-25/RAP80, MO-OVA-91/HDAC3 и МО-СО-Ю55ЯУМ8.

Заключение.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Королёва, Екатерина Павловна, Москва

1. Барышников АЛО. (2004). Принципы и практика вакцинотерапии рака. Вестн. росс, акад. мед. наук. 12, 6-10.

2. Вартанян О. А. (1991). Выявление в сыворотках больных аутоиммунными заболеваниями аутоантител против фенилаланил-, тирозил и триптофанил- тРНК - синтетаз и антиидиотипических антител к ним. Молекуляр. биология. 25, 1033-1039.

3. Е.П. Королева, М.А. Лагарькова, С.В. Хлгатян, Ю.В. Шебзухов, А.А. Мещеряков, М.Р. Личиницер, С.А. Недоспасов, Д.В. Купраш. (2004). Серологические исследования репертуара раковых антигенов и аутоантигенов человека. Молекуляр. биология, 38,233-238.

4. Abelev GI, Perova SD, KhramkovaNI, Postnikova ZA, Irlin IS. (1963). Production of embryonal alpha-globulin by transplantable mouse hepatomas. Transplantat 1,174-180.

5. Baldwin RW (1955). Immunity to metylcholantrene-induced tumors-inbred rats following atrothy and regression of implanted tumors. Br. J. Cancer 9, 652-665.

6. Beck M, Brickley K, Wilkinson HL, Sharma S, Smith M, Chazot PL, Pollard S, Stephenson FA. (2002). Identification, molecular cloning, and characterization of a novel GABAA receptor-associated protein, GRIF-1. J Biol Chem. 277,30079-30090.

7. Blattman IN, Greenberg PD. (2004). Cancer immunotherapy: a treatment for the masses. Science. 305, 200-205.

8. Brass N, Heckel D, Sahin U, Pfreundschuh M, Sybrecht GW, Meese E. (1997). Translation initiation factor eIF-4gamma is encoded by an amplified gene and induces an immune response in squamous cell lung carcinoma. Hum. Mol. Genet. 6, 33-39.

9. Brichard V, Van Pel A, Wolfel T, Wolfel C, De Plaen E, Lethe B, Coulie P, Boon T (1993). The tyrosinase gene codes for an antigen recognized by autologous cytolytic T lymphocytes on HLA-A2 melanomas. J Exp Med. 78, 489-495.

10. Carter P, Smith L, Ryan M. (2004). Identification and validation of cell surface antigens for antibody targeting in oncology. Endocr Relat Cancer. 11, 659-687.

11. Casciola-Rosen L, Andrade F, Ulanet D, Wong WB, Rosen A. (1999). Cleavage by granzyme В is strongly predictive of autoantigen status: implications for initiation of autoimmunity. J Exp Med. 190, 815-826.

12. Cheever M, Disis M, Bernhard H, Gralow J, Hand S, Huseby E, Qin H, Takahashi M, Chen W(1995). Immunity to oncogenic proteins. Immunol. Rev. 145, 33-59.

13. Chen YT, Gure AO, Tsang S, Stockert E, Jager E, Knuth A, Old LJ (1998). Identification of multiple cancer/testis antigens by allogeneic antibody screening of a melanoma cell line library. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95,6919-6923.

14. Chen YT, Venditti CA, Theiler G, Stevenson BJ, Iseli C, Gure AO, Jongeneel CV, Old LJ, Simpson A J. (2005b). Identification of CT46/HORMAD1, an immunogenic cancer/testis antigen encoding a putative meiosis-related protein. Cancer Immun. 5, 9-14.

15. Chu E, Koeller DM, Casey JL, Drake JC, Chabner BA, Elwood PC, Zinn S, Allegra CJ. (1991). Autoregulation of human thymidylate synthase messenger RNA translation by thymidylate synthase. Proc Natl Acad Sci USA. 88, 8977-8981.

16. Cooper ТА, Mattox W. (1997). The regulation of splice-site selection, and its role in human disease. Am. J. Hum. Genet. 61,259-266.

17. Copur S, Aiba K, Drake JC, Allegra С J, Chu E. (1995). Thymidylate synthase gene amplification in human colon cancer cell lines resistant to 5-fluorouracil. Biochem Pharmacol. 4, 1419-1426.

18. Coronella-Wood JA, Hersh EM. (2003). Naturally occurring B-cell responses to breast cancer. Cancer Immunol Immunother. 52, 715-738.

19. Cox A, Skipper J, Cehn Y, Henderson R, Darrow T, Shabanowitz J, Engelhardt V, Hunt D, Slingluff C. (1994). Identification of a peptide recognized by five melanoma-specific human cytotoxic T cell lines. Science 264,716-719.

20. Darnell RB, Posner JB. (2003). Paraneoplastic syndromes involving the nervous system. N Engl J Med. 349,1543-1554.

21. Disis ML, Chreever MA. (1996). Oncogenic proteins as tumor antigens. Curr. Opin. Immun. 8,637-642.

22. Doyle HA, Mamula MJ. (2002). Posttranslational protein modifications: new flavors in the menu of autoantigens. Curr Opin Rheumatol. 14, 244-249.

23. Dunn GP, Old LJ, Schreiber RD. (2004). The three Es of cancer immunoediting. Annu Rev Immunol. 22, 329-360.

24. Fellenberg F, Hartmann ТВ, Dummer R, Usener D, Schadendorf D, Eichmuller S. (2004). GBP-5 splicing variants: New guanylate-binding proteins with tumor-associated expression and antigenicity. J Invest Dermatol. 122, 1510-1517.

25. Fisk B, Blevins T, Wharton J, Ioannides С (1995). Identification of an immunodiminant peptide of HER2/neu protooncogene recognized by ovarian tumor-specific cytotoxic lymphocyte lines. J. Exp. Med. 181,2109-2117.

26. Foley EJ (1953). Antigenic properties of metylcholantrene-induced tumors in mice of the strain of origin. Cancer Res. 13, 835-837.

27. Gabrilovich DI, Chen HL, Girgis KR, Cunningham HT, Meny GM, Nadaf S, Kavanaugh D, Carbone DP. (1996). Production of vascular endothelial growth factor by human tumors inhibits the functional maturation of dendritic cells. Nat Med. 2,1096-1103.

28. Glaser KB, Li J, Staver MJ, Wei RQ, Albert DH, Davidsen SK. (2003). Role of class I and class II histone deacetylases in carcinoma cells using siRNA. Biochem Biophys Res Commun. 310, 529-536.

29. Gold P, Freedman SO (1965). Specific carcinoembryonic antigens of the human digestive system J. Exp. Med. 122,467-468.

30. Gorelik L, Flavell RA. (2001). Immune-mediated eradication of tumors through the blockade of transforming growth factor-beta signaling in T cells. Nat Med. 7,1118-1122.

31. Groh V, Wu J, Yee C, Spies T. (2002). Tumour-derived soluble MIC ligands impair expression of NKG2D and T-cell activation. Nature. 419, 734-738.

32. Gross L. (1943). Intradermal immunisation of C3H mice against a sarcoma that originated in an animal of the same line. Cancer Res. 3, 326-333.

33. Gure AO, Altorki NK, Stockert E, Scanlan MJ, Old LJ, Chen YT. (1998). Human lung cancer antigens recognized by autologous antibodies: definition of a novel cDNA derived from the tumor suppressor gene locus on chromosome 3p21.3. Cancer Res. 58,1034-1041.

34. Gure AO, Stockert E, Arden КС, Boyer AD, Viars CS, Scanlan MJ, Old LJ, Chen YT. (2000). CT10: a new cancer-testis (CT) antigen homologous to CT7 and the MAGE family, identified by representational-difference analysis. Int. J. Cancer. 2000, 85, 726-732.

35. Haneji N., Nakamura Т., Takio K., Yanagi K., Higashiyama H., Saito I., Noji S., Sugino H., Hayashi Y. (1997). Identification of alpha-fodrin as a candidate autoantigen in primary Sjogren's syndrome. Science. 276, 604-607.

36. Jager D, Taverna C, Zippelius A, Knuth A. (2004). Identification of tumor antigens as potential target antigens for immunotherapy by serological expression cloning. Cancer Immunol. Immunother. 53, 44-47.

37. Jeoung DI, Bong Lee E, Lee S, Lim Y, Lee DY, Kim J, Kim HY, Wook Song Y. (2002). Autoantibody to DNA binding protein В as a novel serologic marker in systemic sclerosis. Biochem Biophys Res Commun. 299, 549-554.

38. Juan LJ, Shia WJ, Chen MH, Yang WM, Seto E, Lin YS, Wu CW. (2000). Histone deacetylases specifically down-regulate p53-dependent gene activation. J Biol Chem. 275, 2043620443.

39. Kawakami Y, Fujita T, Matsuzaki Y, Sakurai T, Tsukamoto M, Toda M, Sumimoto H. (2004). Identification of human tumor antigens and its implications for diagnosis and treatment of cancer. Cancer Sci. 95, 784-791.

40. Kawai H, Li H, Avraham S, Jiang S, Avraham HK. (2003). Overexpression of histone deacetylase HDAC1 modulates breast cancer progression by negative regulation of estrogen receptor alpha. Int J Cancer. 107, 353-358.

41. Kim MS, Kwon HJ, Lee YM, Baek JH, Jang JE, Lee SW, Moon EJ, Kim HS, Lee SK, Chung HY, Kim CW, Kim KW. (2001). Histone deacetylases induce angiogenesis by negative regulation of tumor suppressor genes. Nat Med. 7,437-443.

42. Kitchens ME, Forsthoefel AM, Barbour KW, Spencer HT, Berger FG.(1999). Mechanisms of acquired resistance to thymidylate synthase inhibitors: the role of enzyme stability. Mol Pharmacol. 56,1063-1070.

43. Knuth A, Danowski B, Oettgen HF, Old LJ. (1984). T-cell-mediated cytotoxicity against autologous malignant melanoma: analysis with interleukin 2-dependent T-cell cultures. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81, 3511-3515.

44. Krebs P, Kurrer M, Sahin U, Tureci O, Ludewig B. (2003). Autoimmunity seen through the SEREX-scope. Autoimmun Rev. 2,339-345.

45. Mahnke YD, Speiser D, Luescher IF, Cerottini JC, Romero P. (2005). Recent advances in tumour antigen-specific therapy: in vivo Veritas. Int J Cancer. 113, 173-178.

46. Mandelboim O, Berke G, Fridkin M, Feldman M, Eisenstein M, Eisenbach L (1994). CTL induction by a tumor-associated antigen octapeptide derived from a murine lung carcinoma. Nature, 369,67-71.

47. Marincola FM, Jafiee EM, Hicklin DJ, Ferrone S. (2000). Escape of human solid tumors from T-cell recognition: molecular mechanisms and functional significance. Adv Immunol. 74, 181-273.

48. Masson,P., Palsson,B-, Andren-Sandberg,A. (1990). Cancer-associated tumour markers CA 19-9 and CA-50 in patients with pancreatic cancer with special reference to the Lewis blood cell status. Br J Cancer 62, 118-121.

49. Matzinger P. (2002). The danger model: a renewed sense of self. Science. 296,301-305.

50. Nakken B, Davis KE, Pan ZJ, Bachmann M, Farris AD. (2003). T-helper cell tolerance to ubiquitous nuclear antigens. Scand J Immunol. 58,478-92.

51. Nencioni A, Gruenbach F, Patrone F, Brossart P. (2004). Anticancer vaccination strategies. Ann Oncol. 15,153-160.

52. Nishikawa H, Kato T, Tawara I, Saito K, Ikeda H, Kuribayashi K, Allen PM, Schreiber RD, Sakaguchi S, Old LJ, Shiku H. (2005a). Definition of target antigens for naturally occurring CD4(+) CD25(+) regulatory T cells. J Exp Med. 201,681-686.

53. Ochsenbein AF, Sierro S, Odermatt B, Pericin M, Karrer U, Hermans J, Hemmi S, Hengartner H, Zinkernagel RM. (2001). Roles of tumour localization, second signals and cross priming in cytotoxic T-cell induction. Nature. 411,1058-1064.

54. Pardoll DM. (1998). Cancer vaccines. Nat Med. 4, 525-531.

55. Popat S, Matakidou A, Houlston RS. (2004). Thymidylate synthase expression and prognosis in colorectal cancer: a systematic review and meta-analysis. J Clin Oncol. 22, 529-536.

56. Prehn RT, Main JM. (1957). Immunity to metylcholantrene-induced sarcomas. J. Natl. Cancer Inst. 18, 769-778.

57. Preiss S, Kammertoens T, Lampert C, Willimsky G, Blankenstein T. (2005). Tumor-induced antibodies resemble the response to tissue damage. Int J Cancer. 115,456-462.

58. Robbins PF, el-Gamil M, Kawakami Y, Stevens E, Yannelli JR, Rosenberg SA. (1994). Recognition of tyrosinase by tumor-infiltrating lymphocytes from a patient responding to immunotherapy. Cancer Res. 54, 3124-3126.

59. Rosen A, Casciola-Rosen L. (1999). Autoantigens as substrates for apoptotic proteases: implications for the pathogenesis of systemic autoimmune disease. Cell Death Differ. 6,6-12.

60. Rosen A, Casciola-Rosen L.(2001). Clearing the way to mechanisms of autoimmunity. Nat Med. 7, 664-665.

61. Rosenberg SA. (2001). Progress in human tumour immunology and immunotherapy. Nature. 411,380-384.

62. Sahin U, Tureci 0, Schmitt H, Cochlovius B, Johannes T, Schmits R, StennerF, Luo G, Schobert I and Pfreunschuh M.(1995). Human neoplasms elicit multiple specific immune responces in the autologous host. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92,11810-11813.

63. Sahin U, Tureci O, Chen YT, Seitz G, Villena-Heinsen C, Old LJ, Pfreundschuh M. (1998). Expression of multiple cancer/testis (CT) antigens in breast cancer and melanoma: basis for polyvalent CT vaccine strategies. Int J Cancer. 78, 387-389.

64. Scanlan MJ, Chen YT, Williamson B, Gure AO, Stockert E, Gordan JD, Tureci O, Sahin U, Pfreundschuh M, Old LJ (1998). Characterization of human colon cancer antigens recognized by autologous antibodies. Int. J. Cancer. 76, 652-658.

65. Scanlan MJ, Gordan JD, Williamson B, Stockert E, Bander NH, Jongeneel V, Gure AO, Jager D, Jager E, Knuth A, Chen YT, Old LJ. (1999a). Antigens recognized by autologous antibody in patients with renal-cell carcinoma. Int. J. Cancer. 83,456-464.

66. Scanlan MJ, Williamson B, Jungbluth A, Stockert E, Arden КС, Viars CS, Gure AO, Gordan JD, Chen YT, Old LJ. (1999b). Isoforms of the human PDZ-73 protein exhibit differential tissue expression. Biochim. Biophys. Acta. 1445, 39-52.

67. Scanlan MJ, Altorki NK, Gure AO, Williamson B, Jungbluth A, Chen YT, Old LJ. (2000). Expression of cancer-testis antigens in lung cancer: definition of bromodomain testis-specific gene (BRDT) as a new CT gene, CT9. Cancer Lett. 150,155-164.

68. Scanlan MJ, Gure AO, Jungbluth AA, Old LJ, Chen YT. (2002). Cancer/testis antigens: an expanding family of targets for cancer immunotherapy. Immunol Rev. 188,22-32.

69. Scanlan MJ, Simpson AJ, Old LJ. (2004). The cancer/testis genes: review, standardization, and commentary. Cancer Immun. 4, 1-10.

70. Schultze J, Vonderheide R. (2001). From cancer genomics to cancer immunotherapy: toward second generation tumor antigens. Trends in Immunology, 22, 516-523.

71. Schmits R, Kubuschok B, Schuster S, Preuss KD, Pfreundschuh M. (2002). Analysis of the В cell repertoire against autoantigens in patients with giant cell arteritis and polymyalgia rheumatica. Clin Exp Immunol. 127, 379-385.

72. Shankaran V, Ikeda H, Bruce AT, White JM, Swanson PE, Old LJ, Schreiber RD. (2001). IFNgamma and lymphocytes prevent primary tumour development and shape tumour immunogenicity. Nature. 410,1107-1111.

73. Simpson,A.J., Caballero,O.L., Jungbluth,A., Chen,Y.T., Old,L.J. (2005). Cancer/testis antigens, gametogenesis and cancer. Nat. Rev. Cancer 5, 615-625.

74. Staveley-O'Carroll K, Sotomayor E, Montgomery J, Borrello I, Hwang L, Fein S, Pardoll D, Levitsky H. (1998). Induction of antigen-specific T cell anergy: An early event in the course of tumor progression. Proc Natl Acad Sci USA, 95, 1178-1183.

75. Stenman UH, Leinonen J, Zhang WM, Finn P (1999). Prostate-specific antigen. Semin Cancer Biol. 9, 83-93.

76. Stockert E, Jager E, Chen YT, Scanlan MJ, Gout I, Karbach J, Arand M, Knuth A, Old LJ. (1998). A survey of the humoral immune response of cancer patients to a panel of human tumor antigens. J. Exp. Med. 187,1349-1354.

77. Takeda K, Kaisho T, Akira S. (2003). Toll-like receptors. Annu Rev Immunol. 21, 335-376.

78. Tureci O, Sahin U, Pfreundschuh M. (1997). Serological analysis of human tumor antigens: molecular definition and implications. Mol Med Today. 3,342-349.

79. Tureci O, Sahin U, Zwick C, Koslowski M, Seitz G, Pfreundschuh M. (1998). Identification of a meiosis-specific protein as a member of the class of cancer/testis antigens. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 5211-5216.

80. Ulanet DB, Torbenson M, Dang CV, Casciola-Rosen L, Rosen A. (2003). Unique conformation of cancer autoantigen B23 in hepatoma: a mechanism for specificity in the autoimmune response. Proc Natl Acad Sci USA. 100,12361-12366.

81. Van der Bruggen P, Traversari C, Chomez P, Lurquin C, De Plaen E, Van der EyndeB, Knuth A, Boon T (1991). A gene encoding an antigen recognized by cytolytic T-lymphocytes on a human melanoma, Science. 254,1643-1647.

82. Verheijen RI IM, von Mensdorff-Pouilly S, van Kamp GI, Kenemans P (1999). CA 125: fundamental and clinical aspects. Semin Cancer Biol. 9, 117-124.

83. Wang RF, Robbins PF, Kawakami Y, Kang XQ, Rosenberg SA. (1995). Identification of a gene encoding a melanoma tumor antigen recognized by HLA-A31-restricted tumor-infiltrating lymphocytes. J. Exp. Med. 181,799-804.

84. Wilhelm M, Kunzmann V, Eckstein S, Reimer P, Weissinger F, Ruediger T, Tony HP. (2003). Gammadelta T cells for immune therapy of patients with lymphoid malignancies. Blood. 102,200-206.

85. Yamada К., Senju S., Nakatsura Т., Murata Y., Ishihara M., Nakamura S., Ohno S., Negi A., Nishimura Y. (2001). Identification of a novel autoantigen UACA in patients with panuveitis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 280,1169-1176.

86. Yan Z., Kim Y.S., Jetten A.M. (2002). RAP80, a novel nuclear protein that interacts with the retinoid-related testis-associated receptor. J. Biol. Chem. 277,32379-32388.1. Благодарности.

87. Юрию Владимировичу Шебзухову за выполнение некоторых экспериментов и обсуждение полученных данных,

88. Светлане Вагинаковне Хлгатян за помощь в выполнении некоторых экспериментов и ценные обсуждения,

89. Хотелось бы почтить память Матта Сканлана из Людвиговского института раковых исследований (Нью Йорк, США), человека, который научил меня тонкостям метода SEREX, послужившего основой для данной работы.

90. Отдельное спасибо Рафаелу Шаэновичу Казаряну за организационную помощь.

91. Спасибо моей семье и моему мужу, Алексею Туманову, без поддержки и понимания которых эта работа не могла бы состояться.

Информация о работе

Королёва, Екатерина Павловна
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.03

Диссертация

Новые раковые антигены человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы