Новые промоторы каулимовирусов и конструирование их химерных форм

Кулуев, Булат Разяпович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Новые промоторы каулимовирусов и конструирование их химерных форм
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Новые промоторы каулимовирусов и конструирование их химерных форм"

На правах рукописи

КУЛУЕВ БУЛАТ РАЗЯПОВИЧ

НОВЫЕ ПРОМОТОРЫ КАУЛИМОВИРУСОВ И КОНСТРУИРОВАНИЕ ИХ ХИМЕРНЫХ ФОРМ

03.00.04 - биохимия 03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ш179 1

Уфа - 2007

003161791

Работа выполнена в Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН и на кафедре биохимии и биотехнологии Башкирского государственного университета.

Научные руководители

Доктор биологических наук, профессор Р И Ибрагимов Доктор биологических наук, профессор А В Чемерис

Официальные оппоненты

Доктор биологических наук, профессор А Ф Топунов Кандидат биологических наук, доцент Т В Маркушева

Ведущая организация: Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН

Защита диссертации состоится 14 ноября 2007 г в 16 часов на заседании Регионального диссертационного совета КМ 002 133 01 при Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу 450054, г Уфа, проспект Октября, 71

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Уфимского научного центра РАН

Автореферат разослан «14» октября 2007 г

Ученый секретарь

Регионального диссертационного совета, к б н

Бикбулатова С М

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы При создании трансгенных растений весьма важным является выбор промотора для обеспечения достаточного уровня экспрессии чужеродного гена В настоящее время одним из наиболее широко используемых для этих целей служит "сильный" конститутивный 35S промотор, выделенный из вируса мозаики цветной капусты (ВМЦК) из группы каулимовирусов (Odell et al, 1985) Этот промотор имеет в 110 раз большую эффективность (Sanders et al, 1987), чем широко применявшийся ранее, промотор нопалинсинтазы из Т-ДНК агробактерий Однако для решения некоторых задач по созданию трансгенных растений и обеспечения достаточного уровня экспрессии белковых продуктов, экспрессионной эффективности 35S промотора оказалось недостаточно (Mitsuhara et al, 1996) При этом во многих бинарных векторах для трансформации растений как селективный, так и маркерный (или целевой) гены находятся под контролем все того же классического 35S промотора, что может отрицательно сказываться на уровне экспрессии, а иногда приводит и к "молчанию" трансгена В этой связи представляет значительный интерес как обнаружение новых, более эффективных промоторов, так и создание их химерных форм И поскольку 35S промотор вируса мозаики цветной капусты оказался во многом универсальным, стали осуществляться поиски аналогичных промоторов дру1 их каулимовирусов Так, были выделены и исследованы промоторы каулимовирусов сои (Glycine max) (Hasegawa et al, 1989), норичника (Scrophularia californica) (Sanger et al, 1990), ночной красавицы (Mirabilis jalapa) (Dey, Maiti, 1999), земляники (F x ananassa) (Pattanaik et al, 2004), маниока (Manihot sp ) (Samac et al, 2004) Все эти промоторы показали "силу", сравнимую, а некоторые - превосходящую "силу" промотора вируса мозаики цветной капусты Из известных ныне промоторов каулимовирусов оставались не исследованными таковые у вирусов мозаики георгина (ВМГ), кольцевой гравировки гвоздики (ВКГТ), желтых листовых завивок цеструма и некоторых других Помимо поиска новых каулимовирусов, были проведены эксперименты по созданию эффективных

промоторных кассет, в состав которых были включены модифицированные и гибридные с другими промоторами формы 35S промотора Некоторые из полученных конструкций уже нашли применение в генной инженерии растений и показали высокий уровень экспрессии белковых продуктов Например, 35S промотор с двумя энхансерными доменами показал увеличение экспрессионной активности почти в два раза (Omirulleh et al, 1993), его гибридная форма с промотором маннопинсинтазы продемонстрировала уровень экспрессии в 3-5 раз больший в листьях и в 10-15 раз больший в корнях различных трансгенных растений (Cornai et al, 1990) Были созданы различные промоторные кассеты на основе промотора и терминатора 35S транскрипта, из которых одна форма показала увеличение уровня экспрессии в 50 раз, по сравнению с 35S промотором (Mitsuhara et al, 1996) Тем не менее, пока нет оснований считать, что самые лучшие промоторы для целей создания трансгенных растений уже найдены или сконструированы

Одним из путей создания новых эффективных промоторов является метод направленной молекулярной эволюции in vitro Представляет особый интерес создание химерных форм промоторов методом ДНК шаффлинга — высокоэффективного метода рекомбинации генетического материала последовательностей гомологичных белков или их доменов (Stemmer, 1994), а также промоторных последовательностей (Remans et al, 2005) В качестве родительских последовательностей ДНК здесь предпочтительно использовать эффективные природные промоторы, каковыми являются промоторы каулимовирусов, все исследованные формы которых показали весьма высокий уровень экспрессии белков в трансгенных растениях При этом могут быть получены конструкции, более эффективные в трансгенных растениях, чем природные формы промоторов каулимовирусов

Цели и задачи исследования. Цель данной работы заключалась в выделении и исследовании новых промоторов каулимовирусов и создании их химерных форм методом ДНК шаффлинга

Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи

1 Выявление филогенетического родства каулимовирусов на основе анализа нуклеотидных последовательностей их геномов, поиск промоторных последовательностей и подбор праймеров для их амплификации,

2 Поиск и отбор инфицированных каулимовирусами растений,

3 Амплификация и клонирование промоторов вируса мозаики георгина (ВМГ) и вируса кольцевой гравировки гвоздики (ВКГТ),

4 Определение нуклеотидной последовательности промоторов ВМГ и ВКГТ и проведение сравнительного анализа с промоторами других каулимовирусов,

5 Клонирование промогоров ВМГ и ВКГТ в бинарных векторах pCambia,

6 Получение химерных форм промоторов каулимовирусов методом ДНК шаффлинга,

7 Анализ экспрессионной активности генов GUS (ß-глюкуронидаза) и GFP (зеленый флюресцентный белок) под контролем природных форм промоторов каулимовирусов в протопластах N tabacum,

8 Количественный анализ экспрессионной активности промоторов ВМГ и ВКГТ в трансгенных растениях N tabacum

Научная новизна. Впервые амплифицирован и секвенирован участок генома вируса мозаики георгина, содержащий часть межгенного спейсера (700 пн), промотор и 7-ю открытую рамку считывания Проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей промоторов ВМГ и ВКГТ с промоторами других каулимовирусов Показано распространение вируса мозаики георгина на территории г Уфы и окрестностей Впервые для получения одноцепочечной ДНК промоторов применена амплификация по типу катящегося кольца с использованием ДНК псшимеразы фага phi 29 Получены химерные последовательности промоторов каулимовирусов методом ДНК шаффлинга Впервые проведен анализ экспрессионной активности промоторов вируса мозаики георгина и вируса кольцевой гравировки гвоздики в протопластах и трансгенных растениях табака. Показано, что для проявления экспрессионной

активности промотора вируса кольцевой гравировки гвоздики достаточно последовательности размером 370 пн

Практическая значимость работы. Промоторы вируса мозаики георгина и вируса кольцевой гравировки гвоздики могут быть применены при создании трансгенных растений в качестве заменителя классического 358 промотора, так как большое количество его копий в геноме могут быть одной из причин так называемого "молчания" трансгена Химерные промоторы каулимовирусов могут оказаться более эффективными, чем их природные аналоги и найдут применение при создании трансгенных растений, продуцирующих различные лекарственные или другие физиологически активные вещества и используемых в промышленных масштабах, так как применяемые для тех же целей клетки бактерий не всегда обеспечивают правильное сворачивание рекомбинантных белков Подобранные праймеры для амплификации промоторов каулимовирусов могут быть использованы для идентификации этих вирусов в инфицированных растениях

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на XIII международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2006), на международной конференции "Генетика в России и мире" (Москва, 2006), на Российской школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва - Пущино-на-Оке, 2006), на Четвертом съезде общества биотехнологов России (Пущино, 2006), на Школе-семинаре молодых ученых «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2007)

Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 10 печатных работах, а также депонированы в международных банках данных ЕМВЬ, СепВапк и 00131

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 152 страницах, содержит 3 таблицы и 42 рисунка Состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), результатов исследования и их обсуждения (глава 3), заключения, выводов и списка литературы, включающего 203 источников

Конкурсная поддержка работы. Исследования были поддержаны грантами РФФИ-Агидель 05-04-97914, грантами Программы поддержки ведущих научных школ РФ НШ-2217 2003 4 и НШ-1003 2006 4

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследований были промоторы вируса мозаики цветной капусты, вируса кольцевой гравировки гвоздики и вируса мозаики георгина В работе использованы следующие методы ДНК из листьев, пораженных каулимовирусами, выделяли фенольно-детергентным методом (Graham, 1978) Плазмидную ДНК выделяли методом мягкого лизиса (Clewel, Hehnski, 1969) с некоторыми модификациями При анализе рекомбинантных клонов для определения размера вставки применяли быстрый метод щелочного лизиса бактериальных колоний (Sambrook et al, 1989) Расщепление ДНК проводили в буферах, рекомендованных фирмами-поставщиками Качество и количество выделенных препаратов определяли аналитическим электрофорезом в 1%-ном агарозном геле А1арозный гель-электрофорез проводили в приборах модели Sub-Cell GT WIDI MINI (Bio-Rad, США) Элюцию фрагментов ДНК из легкоплавкой агарозы проводили по методу (Sealey, Southern, 1982) ПЦР проводили в амплификаторе производства компании "ДНК-технология" с использованием ДНК-полимеразы Thermus aquaticus (McPherson et al, 1995) Для клонирования амплификатов промоторов каулимовирусов использовали вектор pKRX Подготовку и трансформацию компетентных клеток Е coli осуществляли по методу Коэн (Cohen et al, 1972) Секвенирование проводили, на автоматическом секвенаторе «ABI PRISM 310 Genetic Analyzer» (Applied Biosystems, Inc, США) Электрокомпетентные клетки Е coli и A tumefaciens готовили по методу Ausubel et al (1987) и Lm (1995) Протопласты трансформировали методом опосредованного полиэтиленгликолем (PEG 4000) эндоцитоза плазмидной ДНК, затем проводили анализ транзиентной экспрессии (Lyzruk et al, 1989, Locatelli et al, 2003) Трансгенные формы табака получали методом агробактериальной трансформации листовых дисков (Horsch et al, 1985) Промоторы каулимовирусов в одноцепочечной форме были

получены с помощью амплификации по типу катящегося кольца с использованием ДНК полимеразы фага phi 29 ДНК шаффлинг проводили по (Stemmer, 1994) с модификациями (Zhao, Arnold, 1997) и (Kikuchi et al, 2000) Флюориметрическое определение активности GUS в клеточных экстрактах проводили по методу, описанному Jefferson (1987) с модификациями (Зверева, Романов 2000) Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакета компьютерных программ DNASIS (Hitachi Software Engineering Со, Япония) и Lasergene фирмы "DNASTAR, Inc" (США)

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

1. Выяснение филогенетических связей каулимовирусов, поиск промоторных последовательностей, подбор праймеров для их амплификации и поиск инфицированных каулимовирусами растений.

Для проведения экспериментов по направленной молекулярной эволюции in vitro необходимым условием является наличие гомологии между нуклеотидными последовательностями (Stemmer, 1994) Поэтому нами был предварительно осуществлен поиск каулимовирусов, близкородственных к вирусу мозаики цветной капусты Для определения филогенетических связей каулимовирусов был осуществлен анализ 14-ти полностью секвенированных последовательное гей геномов каулимовирусов и частично секвенированной последовательности генома скрытого вируса хрена Для этого использовали данные из международного банка нуклеотидных последовательностей Было выяснено, что по гомологии нуьслеотидной последовательности геномов наиболее близко к вирусу мозаики цветной капусты стоят скрытый вирус хрена и вирус кольцевой гравировки гвоздики (рис 1) Другую близкую группу образуют вирус мозаики норичника (ВМН) и вирус мозаики ночной красавицы (ВМНК) Несколько дальше отстоит вирус, окаймляющий жилки земляники (ВОЖЗ) Еще одну группу каулимовирусов, с меньшей гомологией нуклеотидной последовательности с вирусом мозаики цветной капусты образуют каулимовирусы черешни, цеструма, арахиса, маниока и сои (рис 1)

— CaMV Gardner

— CaMVFranck

— CaMVBalazs

— CaMVOdell

— HRLV г CERV

"L- CERV Indian

— FMV

— MMV

— SVBV

— SbCMV

— CesCaullVir

— PeanutCSV

— BlueberiyRRV

— CsVMV

80 70 60 50 40 30 20 10 0 Nucleotide Substitutions (x100)

Рис 1 Филогенетическое древо сходства основных представителей каулимовирусов, построенное на основе анализа нуклеотидных последовательностей геномов CaMV - ВМЦК, HRLV - скрытый вирус хрена, CERV - ВКГГ, FMV - вирус мозаики норичника (ВМН), MMV - вирус мозаики ночной красавицы (ВМНК), SVBV - вирус, окаймляющий жилки земляники (ВОЖЗ), SbCMV - вирус бледной пятнистости сои, CesCaullVir - вирус желтых листовых завивок цеструма, PeanutCSV — вирус бледной полосатости арахиса, BluebenyRRV — вирус красных кольцевых пятен черешни, CsVMV — вирус мозаики маниока

Для проведения дальнейшего анализа и отбора промоторов для ДНК шаффлинга с 35S промотором, были взяты ВКГТ, ВМН и ВОЖЗ, поскольку эти вирусы оказались филогенетически близки к ВМЦК Нуклеотидные последовательности геномов 4-х штаммов ВМЦК, 2-х штаммов ВКГГ и по одному штамму ВМН, ВОЖЗ, а также ВМНК были выровнены с помощью программы Megalign пакета Lasergene Используя информацию о расположении промоторов ВМЦК, ВМН и ВМНК в геноме, было оценено примерное местоположение промоторов ВКГТ и ВОЖЗ, затем промоторные участки исследуемых каулимовирусов были выровнены для оценки их гомологии Оказалось, что уровень гомологии промоторов каулимовирусов почти совпадает с уровнем гомологии последовательности геномов, и в построенном филогенетическом древе каулимовирусы образовали те же филогенетически связанные группы Вирус мозаики георгина также является одним из

84 8

1"[редставителей каулимо виру сов. По данным ОепВапк геном данного вируса секвенировап лишь частично, тем ас менее но анализу известных последовательностей было выявлено, что этот вирус имеет большее филогенетическое родство с ВМЛ и ВМНК. Исходя из полученных нами данных, были подобраны нраймеры для амплификации промоторов ВМН, ВОЖЗ, ВМГ' и ВК1Т и был осуществлен ПОИСК инфицированных каулимо вирусами растений в Уфимском регионе. В результате из перечисленных вирусов ¡4 г Уфе был обнаружен лишь вирус мозаика георгина (ВМГ).

2. Амплификация и клонирование промотора вируса мозаики георгина. Промотор ВМГ' и его фланкирующие участки но данным ОепВапк не секвенированы, и это не позволяло подобрать удобные праймеры для амплификации полногеномного промотора. Бвтло решено амилифицировать более протяженный участок тгуклеотидной последовательности, включающий промоторнуго область. 11рн подборе Праймеров использовались лишь известные последовательности генома ВМГ и подбирались участки, наиболее близко прилегающие к промотору Наиболее подходящей оказалась следующая пара праймеров

Размер амплифицирусмого участка составил приблизительно 1290 пн (рис. 2).

51£АСТОАСТСАТССТССЛАТА-Зр ЗаЛТЛТСТАСТО АС А ГГГСТТ-3 С

Учзшк генами ОМ Г —размером Щпн шмавдий иршглр

Рис. 2. Одектро фор еграмм а амолификата участка генома ВМГ, размером около 1290 пн, из образцов ДНК инфицированного георгина. Маркером служит ДНК фага А, расщепленная эйдонуклеазой рестрикции Въ/ЕИ.

Проведенный анализ нуклеотидной последовательности позволил оценить расположение и подобрать праймеры для амплификации самого промотора, размер которого, судя по гомологии с родственными каулимовирусами, не должен превышать 400 пн В итоге был амплифицирован промоторный участок генома вируса мозаики георгина размером 442 пн, который был клонирован в фагмидном векторе pKRX

3. Амплификация и клонирование промотора вируса кольцевой гравировки гвоздики. Растения, листья которых по морфологическим признакам инфицированы вирусом кольцевой гравировки гвоздики, были получены из Института вирусологии, микробиологии и биологической безопасности (г Брауншвейг, Германия) В GenBank опубликована последовательность генома вируса кольцевой гравировки гвоздики Для оценки расположения промотора провели выравнивание генома ВКГГ с геномами 4-х штаммов ВМЦК Далее, учитывая выравнивание промоторных последовательностей наиболее близкородственных каулимовирусов, осуществили подбор праймеров для амплификации промотора ВКГТ, при эгом отдавали преимущество более консервативным участкам Было подобрано 3 праймера

CERVHtFl 5'-ArTAAAAGAACAATGGCAAG-3', CERVFltF2 5'-AGAAGATTTAATGGCAATCC-3', CERVFltR 5'-AGGACTTAGGCTCAACACAT-3'

При амплификации с праймерами CERVFltFl и CERVFltR размер ампликона должен составить 651 пн, а с праймерами CERVFUF2 и CERVFltR - 501 пн Из 4-х образцов ДНК, выделенных из листьев гвоздичных, нам удалось амплифицировать ДНК размерами около 500 пн и 650 пн (рис 3), что подтвердило наличие ВКГГ в листьях гвоздичных Далее оба фрагмента ДНК, отличающиеся лишь расположением праймеров, были клонированы в фагмидном векторе pKRX

Рис. Результаты амплификации промотор нош участка генома ВКГТ размером 501 im из различных инфицированных представителей гвоздичных (г. Браунпшейг, Германия). Маркер - pBlnescript II SK+, расщепленная эвдонуклеазой рестрикции f-fpal I ; 1 - Lychnis (смолка обыкновенная или клейкая); 2. 3 - Dianthus catyophyllus (гвоздика садовая); 4 - Dianthus barbatus (гвоздика турецкая); 5 -представитель семейства гвоздичных, видовая принадлежность которого не определена.

4. Се копирование и анализ пукле« гид пой последовательности промотора вируса мозаики георгина. Участок генома ВМГ размером 1290 пн бьш секвенирован о применением "прямого" и "обратного" прайм еров. Сравнительный анализ показал, что была клонирована последовательность, включающая часть гена 6, промотор, большой межгенный спейсер и 7-ю открытую рамку считывания вируса мозаики георгина. Нуклеотидная последовательность большого межтешюго спейсера размером 678 пн был зарегистрирован в GenBank (accession number KF463101). Промотор ВМГ частично оказался гомологичным промоторам других каулимояирусов: гомология с промотором вируса мозаики норичника составила 60%, а с промотором вируса мозаики ночной красавицы — 63%. Сравнительный анализ регулятор ных областей промоторов ВМГ. вирусов мозаики поричвика и ночной красавицы показал следующее: ССАСТ-бокс у вируса норичника имеет каноническую последовательность, у ВМГ она представлена последовательностью ССААТ, у вируса ночной красавицы - GCAAC. У вирусов норичника и ночной красавицы 1-й TGACG мотив представлен последовательностью TGACG, а у BMJ ' тимин заменен на аденин; 2-й TGACG moi ив у всех трех видов представлен последовательностью TGACG. ТЛТА-

бокс у всех трех видов представляет собой консенсусную последовательность ТАТАТАА.

Нуклеотидная последовательность промотора В Ml' размером 442 пн была зарегистрирована в GenBank (accession number EF513491), Кроме часто исследуемых реiyjшторных участков, у промоторов ВМГ, ВМН и ВМНК была выявлена еще одна конеенсуеиая. последовательность. Оказалось, что у вссх этих грех каулимовируеов в сайте инициации транскрипции имеется каноническая последовательност ь G A'i СА(А)ТСGAЛ А (рис. 4).

1ЭМ V f-rotiioter— MMVr pjomoter-

С ТТ AT АТ AA.GGGCСТТС Т CTCCTCAGTTGGAGATC AATCGAAAT

=.3fiO__370 ________36 0___390

С С "Г AT А Т АА GGGC AT ТС Т С С С С Т С A.GT Т G AJJGAT С А - rCGAAA

_ Т[Г AT AT АА GG ААС AC АЛАТ СAGAAGGA?

GASgatca-

AGAjGATCAp

ГСОААА

Рис. 4. Копсенсуспая последовательность ДП1С, расположсная за TATA боксом и совпадающая с 3' концом -18 +1 домена промоторов ВМ.1' и ВМНК.

5. С с кв епир on аи и с и аиалш нуклеотидной по сл с до в arc льносг и промотора вируса кольцевой гравировки гвоздики. Клонированные в pKRX фрагменты генома ВКГТ размером 501 и 651 но были секвестированы и последовательность про моторного участка размером 455 пп была зарегистрирована в GenBank (accession number KF513492), Поиск сходных последовательностей в базе данных генов с помощью программы "Mcgablast" (доступной на вебсайте NCBI) покачал 95%-ную гомологию секвестированного нами промотора с про моторным участком изешята вируса ВКГТ из Нидерландов (accession number NC 003498). Выравнивание секвеиировашгого нами промотора J Ж1 '1 с последовательностью промотора индийского изолята ВКГТ (accession number AJ853858) с помощью программы "Mcgalign." показало уровень гомологии 96%, Уровень гомологии промоторов ВКГГ и ВМЦК составил 48%. Сравнительный анализ последовательностей промоторов вируса мозаики цветной капусты и вируса кольцевой гравировки гвоздики показал, что ССАСТ-бокс у промотора ВКГГ отличается от такового промотора ВМГ.[К и представлен последовательностью С TACT. ТАТА-бокс представлен у ВКГТ последовательностью TATATAAAGG и у ВМЦК последовательностью

TATATAAGGA. 1-й TG AC G мотив - у ВМЦК представлен канонической последовательностью TGACG, у ВКТГ последовательностью AGACG, 2-й TGACG мотив у обоих видов представлен последовательностью TGACG. ССАСТ и TGACG боксы у промотора ВМЦК имеют одни общий нуклеотид Т (Sauger et al., 1990), тгри этом в отличие от ВМГ, до ССАСТ бокса в геноме у ВМЦК не было обнаружено схожих последовательностей. Следует отметить, что после второго TGACG мотива у ВМЦК есть еще одна последовательность ССАСТ, что также совпадает с данными литературы о наличии повторов этих последовательностей (Sanger et аЦ 1990).

6. Конструирование химерных форм промоторов каулимовирусон методом ДНК шаффинн а. Промоторы ВМЦК (510 гш), ВКГТ (501 ни) и BMI" (442 пп) были вырезаны из фагмидпого вектора pKRX по сайту рестрикции ßssffi После этапов самойигпро вании: очистки и осаждения, проводили наработку однодепоч ечных последовательностей при помощи амплификации по типу катящегося кольца с использованием ДНК-полимеразы фага phi29. Для затравки использовали праймеры ТЗ, Т7 и праймеры, подобранные к самим аромоторай. При использований Т7 праймера образуется шнос-цепь, а при использовании ТЗ праймера минус-цепь (рис. 5).

Рис. 5 Общая схема получения одпоцепочечной ДНК при помощи ДП.К-полимеразы фага phi29.

Одноцепочечные формы промоторов ВМЦК, ВКГТ и ВМГ были использованы нами в качестве исходного материала при проведении ДНК шаффлинга Для удобства промоторы в одноцепочечной форме были обозначены нами в соответствии с названием вируса и праймера, с которого данную цепь ДНК нарабатывали (форвард - Р, реверс - II) 358Р, 35811, СЕЯУР, СЕЯVII, ОМУ!7, ОМУЯ Для проведения ДНК шаффлинга, использовали все 6 комбинаций разных цепей ДНК этих промоторов 358Р+СЕЯУ11 (смесь 1), СЕ11УР+358К (смесь 2), 3581'+ОМУЯ (смесь 3), БМУР+358К (смесь 4), СЕКУР+БМУК. (смесь 5), ОМУК+СЕЯУК (смесь 6)

В соответствии с данными по гомологии промоторов каулимовирусов, были смешаны разные цепи ДНК промоторов ВМЦК и ВКГТ, обработаны ДНКазой I, при этом были получены фрагменты ДНК размерами около 50 - 300 пн Далее был проведен первый раунд амплификации без добавления праймеров, при котором происходит постепенное увеличение размеров восстанавливаемых фрагментов и образование их пула В ходе первого раунда ДНК шаффлинга генерируется бибилиотека рекомбинантов, несущих точки состыковки - кроссоверы, где происходит перестановка отдельных частей матрицы с одной родительской последовательности на другую Затем был проведен 2-й раунд амплификации с использованием специально подобранных праймеров, фланкирующих исходные гены В результате при смешивании (+)-цепи промотора ВМЦК с (-)-цепью промотора ВКГТ (1 смесь) и двух раундов ПЦР, получили амплификат размером больше 500 пн (рис 6) С помощью электрофорегического анализа был показан неоднородный состав амплификата, содержащий ДНК различного размера Благодаря тому, что при втором раунде ПЦР использовали "форвард" праймер промотора ВМЦК и "реверс" праймер промотора ВКГТ, в качестве конечных продуктов реакции нарабатываются лишь химерные молекулы ДНК Для контроля использовали смесь промоторов ВМЦК и ВКГТ в двуцепочечной форме и использовали эту матрицу во втором раунде ПЦР, при этом наработка продукта, как и ожидалось, не происходила При смешивании (+)-цепи промотора ВКГТ и (-)-цепи промотора ВМЦК (смесь 2) получили однородный амплификат

размером около 500 пн (рис 6). При использовании форвард праймера промотора ВКГГ и реверс праймера ВМЦК, амплификация смеси промоторов в дву цепочечной форме также не проходит (м ину с - контроль),

Рис. 6. Электрофореграмма амййифлкатов после проведения; двух раундов ) хцр ДНК шаффлинга промоторов ВМЦК и BKI 1'.

1 - результат ДНК шаффлинга смеси 1 ((+) цепь промотора ВМЦК и (-) цепь промотора ВКГГ), 2 - "минус" контроль для смеси 1 (1 НДР анализ смеси промоторов ВМЦК и ВКГТ в диуцепочечной форме при помощи форвард праймера промотора ВМЦК и реверс праймера ВКГГ); 3 - результат ДНК шаффлинга смеси 2 ((+) цепь промотора BKI 1' и (-) цепь промотора BMI Щ 4 - "минус1' контроль для смеси 2 (1II [Р анализ смеси öjpoMoropoii ВМЦК и BKIT' в двуцеибчечноЙ форме при помощи форвард праймера промотора BKIT и реверс праймера BMI ЦС|.

Полученные амнлификаты были клонированы в нлазмиде pKRX, белые колонии пересеяли, выделили плазмиды и провели ГН U' анализ. Как и ожидалось, были получены амплификаты различного размера (рис. 7), все они были приблизительно равны или больше гго размеру, чем промоторы ВМЦК и ВКГГ.

Рис. 7 3лектрофорс!рамма ПЦР анализа клонов, полученных при клонировании амплификата из смеси 1 после ДНК Шаффлинга в фагмидный вектор рККХ. С ] по 7 - номера анализируемых клопов; 8 - амплифшеат промотора ВК1Г размером 501 пп (маркер).

Последовательности промоторов первых двух клопов были ссквенированы. Анализ се квотирован ной последовательности показал, что оба клопа содержат химерные формы промоторов ВМЦК и ВКГГ Размер промотора первого клона составил 905 ira (рис. 8). Fi начале располагается полноразмерный промотор ВМЦК (510 пн), затем 5'-конец промотора ВКГТ размером 253 пн, далее часть фагмидного вектора pKRX размером 75 пн (область полилинкера) и в конце находится 3'-конец промотора ВКГГ размером 67 пн. Размер промотора второго клопа составил 7)5 пп где последовательно расположены 5'-конец промотора 1ШЦК размером 214 пн и полноразмерный промотор ВКГТ' (501 нн) (рис. 8).

ОаУЛ'.М У:!:» . ] . ИЖУ253 Ьр" 67 Ц

1-й клон (905 пн)

" С 1!Н\ 50}

2-й КЛОН (715 ПН)

8. Расположение составных частей в химерных промоторах 1 го и 2 го клонов.

В итоге было получено около 30-ти клопоп, промоторы некоторых из них были секвепированы и оказались химерными, при этом были использованы все возможные комбинации промоторов каулимовпрусов (смеси 1 — 6) (рис. 9)

Рис 9. Элек] рофоре!рамма TU Í,P анализа клонов, полученных при клонировании амплификата из смеси 4 (DMVF+35SR) в фагмидный вектор pKRX после ДНК гааффлингн. 1 — ймшшфикат промотора ВМЦК (маркер -510 пн); 2 - промотор ВМГ (маркер - 442 пн); 3 - 25 - номера анализируемых клонов.

Было выбрано три химерных промотора для клонирования в бинарный вектор pCambia 1304, с целью проведения анализа их экспрессиозшой активности в клетках E.coli и A.tume/aciens.

7. Адажт экенрессиоиной акт милости сепов GUS и GFP иод

управлением химерных и природных форм промотором каул имо в и русо в в клетках E.coli, A.tumefuciens и N.iabacum. Промоторы ВКГГ (501 пн и 370 ни), ВМГ (442 пн) и три химерных промотора были клонированы в вектор pCambia 1304, где они могли управлять экспрессией генов GШ и GFP одновременно. Полученными ДНК-конструкциями трансформировали компетентные клетки E.coli и A.tume/aciens и анализировали экспрессию гена GUS при помощи субстрата x-gluc. Всс анализируемые иромоторные последовательности показали примерно одинаковую, визуально детектируемую, активность как в к детках Е. coli, так и в клетках A.tujmifiiciens.

Конструкции вектора pCambia 1304 с промоторами ВКГГ (5Ü1 и 370 пн) и ВМГ (442 пн) были использованы для трансформации протопластов табака и анализа транзиентпой экспрессии репорт ерных ichor GUS и GFP в растительных клетках. С помощью данного метода мы показали, что амгшифицированные нами промоторыые последовательности 13МГ и ВКГГ являются достаточными для проявления транзиептпой экспрессии генов GUS и GFP в растительных клетках (рис. 10).

Рис. 10. а) Транзиентная экспрессия гена GUS под управлением промотора ВКГГ размером 501 пп в протопластах табака (трансформированный протопласт окрашивается в синий цвет и на рисунке Выглядит более темным); б) Транзиентная экспрессия гена GFP под управлением промотора ВМГ в протопластах табака (трансформированные протопласты светятся ярким зеленым цветом и па рисунке выглядят более светлыми).

Промотор пью последовательности ВКГ'Г размерами 501 и 370 пи показали приблизительно одинаковый уровень экспресс ион пой активности в протопластах табака. Промотор ВКГГ размером 501 пн и промотор ВМГ размером 442 пн были клонированы в векторы pCambia 1281Z и pCambia 1291/. Затем при помощи данных конструкций были получены транс генные растения табака, которые после проведения гистохимического анализа с помощью субстрата x-glitc (рис. 11), были отобраны для количественного определения активности GUS в клеточных экстрактах.

Рис 11 Гистохимический анализ экспрессии гена GUS в транегенном по промотору ВМГ табаке. Экспрессия гена GUS детектируется визуально окрашиванием растительной ткани в синий цвет (на черно-белом изображении выделяется потемнением).

Для каждого промотора были отобраны по четыре разных трансгенных растения, из которых были выделены белки и проверена активность ß-гдюкуронидазы е помощью субстрата 4-MUG (4-м ein л у м б е л л и фери л - ß- D -глюкуронид) и продукта реакции 4-MU (4-метилумбеллиферон), способной к фпоореспенции Измерения флюоресценции проводили на спсктрофлюориметре после 30 мин работы фермента. Концентрацию 4-MIJ определяли по калибровочной кривой, которую построили заранее. Результаты измерения активностей промоторов были выражены в pmol 4-MU мин"!мг_1 белка. Для разных трансгенных растений активность гена GUS различалась, но в среднем для 35S промотора мы получили 482.6 pinol 4-MU мин 'м; ' белка, для

промотора ВМГ 480 1 pmol 4-MU мшГ'мг4 белка, а для промотора ВКГТ 442 1 pmol4-MU мин"1 мг' белка (табл 1)

Таблица

Результаты флюориметрического анализа экепрессионной активности гена GUS под управлением промоторов ВМЦК, ВКГТ и ВМГ в трансгенных растениях табака

Трансгенное растение 35 S промотор Промотор ВМГ Промотор ВКГТ

1 859 0 606 5 367 6

2 151 7 427 3 437 3

3 6120 532 8 453 3

4 307 6 353 7 5100

Ср значение 482 6±106 4 480 1±37 7 442 1±19 8

По данным таблицы можно сделать вывод о том, что 35S промотор и промоторы вирусов мозаики георгина и кольцевой гравировки гвоздики одинаковы по экепрессионной активности Полученные нами результаты в целом совпадают с данными по промоторам уже исследованных каулимовирусов Следует отметить, что один и тот же промотор в разных трансгенных растениях проявляет различный уровень транскрипционной активности Вариабельность экспрессии репортернош гена GUS в различных трансгенных растениях одного вида видимо возникают из-за различного их расположения в геноме и из-за общих физиологических и генетических различий между разными растениями выборки

ВЫВОДЫ

1 Клонированы и секвенированы промоторы вируса мозаики георгина и вируса кольцевой гравировки гвоздики Уровень гомологии этих промоторов с промоторами других каулимовирусов составил приблизительно 50-60% Наиболее близким к промотору вируса мозаики георгина оказался промотор вируса мозаики ночной красавицы, а к промотору вируса кольцевой гравировки гвоздики - 35S промотор вируса мозаики цветной капусты

2 Сравнительный анализ канонических регуляторных последовательностей промоторов каулимовирусов показал, помимо типичных повторяющихся последовательностей ССАСТ, TGACG и TATA, наличие других консервативных участков, функция которых не определена

3 На основе одноцепочечных ДНК-матриц промоторов каулимовирусов методом ДНК шаффлинга созданы химерные формы промоторов вирусов мозаики цветной капусты, кольцевой гравировки гвоздики и мозаики георгина в различных комбинациях

4 Промоторы вируса кольцевой гравировки гвоздики и вируса мозаики георгина проявляют транскрипционную активность в протопластах и трансгенных растениях табака N tabacum Для проявления экспрессионной активности для промотора ВКГГ достаточно последовательности размером 370 пн

5 Количественный анализ активности исследуемых промоторов в трансгенных растениях табака при помощи субстрата 4-MUG показал, что 35S промотор и промоторы вируса мозаики георгина и вируса кольцевой гравировки гвоздики проявляют одинаковый уровень экспрессионной активности

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Кулуев Б Р Растительные параретровирусы // www ofap ru/portal/ejurnal /2006/kupi_08-2006 pdf 2005 (Электронный учебник, зарегистрированный в отраслевом фонде алгоритмов и программ Государственного координационного центра информационных технологий)

2 Кулуев Б Р Поиск новых промоторов каулимовирусов и конструирование их химерных форм // Материалы XIII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов" Том IV -М Изд-во МГУ, 2006 С 22-23

3 Кулуев Б Р, Чемерис А В Промоторы каулимовирусов и конструирование их химерных форм методом ДНК шаффлинга // Материалы международной конференции "Генетика в России и мире", посвященной 4021

летию Института общей генетики им НИ Вавилова РАН Москва, 2006 С 105

4 Кулуев Б Р , Чемерис А В Сравнительный анализ последовательностей полногеномных промоторов вируса мозаики цветной капусты и вируса кольцевой гравировки гвоздики // Материалы Российской школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященная 100-летию со дня рождения С И Алиханяна Москва—Пущино-на-Оке, 2006 С 39

5 Кулуев Б Р , Чемерис А В Секвенирование полногеномного промотора вируса мозаики георгина и анализ регуляторных областей // Материалы Российской школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященная 100—летию со дня рождения СИ Алиханяна Москва-Пущино-на-Оке, 2006 С 5

6 Кулуев Б Р Конструирование химерных форм полногеномных промоторов каулимовирусов методом ДНК шаффлинга // Материалы Четвертого съезда Общества биотехнолог ов России им Ю А Овчинникова Пущино, 2006 С 126-127

7 Кулуев Б Р , Чемерис А В , Ибрагимов Р И Поиск каулимовирусов на территории Республики Башкортостан и исследование их полногеномных промоторов // Вестник Башкирского университета, 2007 №2 С 24-26

8 Кулуев Б Р Создание трансгенных растений с увеличенными и уменьшенными органами // Материалы школы-семинара молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии Уфа, 2007 С 71-73

9 Кулуев Б Р Родственные классическому 35S промотору промоторы других каулимовирусов // Материалы школы-семинара молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии Уфа, 2007 С 73-75

10 Кулуев Б Р, Чемерис А В Амплификация и клонирование промоторов вируса мозаики георгина и вируса кольцевой гравировки гвоздики // Генетика, 2007 Т 43, №11 В печати

Формат 60x84'/]6 Бумага офсетная Гарнитура «Тайме» Печать на ризографе Уел печ л 2,79 Уч -изд л 2,05 Тираж 100 экз Заказ № 36

Отпечатано на оборудовании издательства «Гилем» АН РБ 450077, г Уфа, ул Кирова, 15 Тел 273-05-93,272-36-82 е-тш1 й|1ет@апгЬ га

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кулуев, Булат Разяпович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Каулимовирусы и их полногеномные промоторы.

1.1.1. Классификация растительных параретровирусов.

1.1.2. Растения-хозяева, симптоматика вирусных заболеваний, распространение каулимовирусов.

1.1.3. Способы передачи вирусной инфекции.

1.1.4. Структура и воспроизведение генома каулимовирусов на примере вируса мозаики цветной капусты.

1.1.5. Биосинтез белков и функции белков каулимовирусов.

1.1.6. Строение геномов, открытых рамок считывания и белковые продукты каулимовирусов.

1.1.7. Полногеномные промоторы каулимовирусов.

1.2. Методы направленной искусственной эволюции генов in vitro.

1.2.1. ДНК шаффлинг.

1.2.2. Другие методы, основанные на рекомбинации.

1.2.3. Применение ДНК шаффлинга.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Краткая характеристика объектов исследований.

2.2. Выделение и очистка тотальной ДНК растений и каулимовирусов.

2.3. Выделение и очистка плазмидной ДНК.

2.4. Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами.

2.5. Аналитический гель-электрофорез ДНК в неденатурирующих условиях.

2.6. Препаративный гель-электрофорез ДНК в неденатурирующих условиях.

2.7. Элюция ДНК из агарозных гелей.

2.8. Очистка ДНК хроматографией с ДЭАЭ-целлюлозой.

2.9. Полимеразная цепная реакция.

2.10. Клонирование промоторных участков каулимовирусов.

2.11. Подготовка компетентных клеток.

2.12. Трансформация компетентных клеток E.coli плазмидной ДНК.

2.13. Автоматическое секвенирование ДНК ферментативным методом.

2.14. Подготовка электрокомпетентных клеток E.coli и A.tumefaciens.

2.15. Электропорация компетентных клеток E.coli и A.tumefaciens.

2.16. Приготовление протопластов из листьев табака.

2.17. Трансформация протопластов табака методом химически индуцированного эндоц итоза.

2.18. Агробактериальная трансформация листовых дисков табака.

2.19. Получение одноцепочечной ДНК с помощью ДНК-полимеразы фага phi 29.

2.20. ДНК шаффлинг.

2.21. Выделение тотального белка из растений.

2.22. Флюориметрическое определение активности GUS в клеточных экстрактах.

2.23. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей.

2.24. Бактериальные штаммы и фагмидные вектора.

2.25. Реактивы и материалы.

2.26. Составы использованных стандартных растворов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Анализ нуклеотидных последовательностей геномов каулимовирусов.

3.1.1. Выяснение филогенетических связей каулимовирусов.

3.1.2. Поиск промоторных последовательностей и консервативных участков ДНК, фланкирующих промоторные области.

3.2. Поиск инфицированных каулимовирусами растений на территории Уфы и окрестностей.

3.3. Амплификация и клонирование промотора вируса мозаики георгина.

3.4. Амплификация и клонирование промотора вируса кольцевой гравировки гвоздики.

3.5. Секвенирование промотора вируса мозаики георгина и анализ нуклеотидной последовательности.

3.6. Секвенирование промотора вируса кольцевой гравировки гвоздики и анализ нуклеотидной последовательности.

3.7. Модификация вектора pCambia 1304 и клонирование промоторов ВМГ и ВКГГ в векторы pCambia 1304, pCambia

1281Z, pCambia 1291Z.

3.8. Получение промоторов каулимовирусов в одноцепочечной форме при помощи ДНК-полимеразы фага phi29.

3.9. Конструирование химерных форм промоторов каулимовирусов методом ДНК шаффлинга.

3.10. Анализ экспрессионной активности генов GUS и GFP под управлением химерных и природных форм промоторов каулимовирусов в клетках Е. coli, A. tumefaciens и N. tabacum.

3.11. Сравнительный анализ экспрессионной активности гена GUS под управлением промоторов ВМЦК, ВКГГ и ВМГ в трансгенных растениях табака.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Новые промоторы каулимовирусов и конструирование их химерных форм"

Актуальность проблемы. При создании трансгенных растений весьма важным является выбор промотора для обеспечения достаточного уровня экспрессии чужеродного гена. В настоящее время одним из наиболее широко используемых для этих целей служит "сильный" конститутивный 35S промотор, выделенный из вируса мозаики цветной капусты (ВМЦК) из группы каулимовирусов (Odell et al., 1985). Этот промотор имеет в 110 раз большую эффективность (Sanders et al., 1987), чем широко применявшийся ранее, промотор нопалинсинтазы из Т-ДНК агробактерий. Однако для решения некоторых задач по созданию трансгенных растений и обеспечения достаточного уровня экспрессии белковых продуктов, экспрессионной эффективности 35S промотора оказалось недостаточно (Mitsuhara et al., 1996). При этом во многих бинарных векторах для трансформации растений как селективный, так и маркерный (или целевой) гены находятся под контролем все того же классического 35S промотора, что может отрицательно сказываться на уровне экспрессии, а иногда приводит и к "молчанию" трансгена. В этой связи представляет значительный интерес как обнаружение новых, более эффективных промоторов, так и создание их химерных форм. И поскольку 35S промотор вируса мозаики цветной капусты оказался во многом универсальным, стали осуществляться поиски аналогичных промоторов других каулимовирусов. Так, были выделены и исследованы промоторы каулимовирусов сои (Glycine max) (Hasegawa et al., 1989), норичника (Scrophularia californica) (Sanger et al., 1990), ночной красавицы {Mirabilis jalapa) (Dey, Maiti, 1999), земляники (F. x ananassa) (Pattanaik et al., 2004), маниока {Manihot sp.) (Samac et al., 2004). Все эти промоторы показали "силу", сравнимую, а некоторые - превосходящую "силу" промотора вируса мозаики цветной капусты. Из известных ныне промоторов каулимовирусов оставались не исследованными таковые у вирусов мозаики георгина (ВМГ), кольцевой гравировки гвоздики (ВКГГ), желтых листовых завивок цеструма и некоторых других. Помимо поиска новых каулимовирусов, были проведены эксперименты по созданию эффективных промоторных кассет, в состав которых были включены модифицированные и гибридные с другими промоторами формы 35S промотора. Некоторые из полученных конструкций уже нашли применение в генной инженерии растений и показали высокий уровень экспрессии белковых продуктов. Например, 35S промотор с двумя энхансерными доменами показал увеличение экспрессионной активности почти в два раза (Omirulleh et al., 1993); его гибридная форма с промотором маннопинсинтазы продемонстрировала уровень экспрессии в 3-5 раз больший в листьях и в 10-15 раз больший в корнях различных трансгенных растений (Comai et al., 1990). Были созданы различные промоторные кассеты на основе промотора и терминатора 35S транскрипта, из которых одна форма показала увеличение уровня экспрессии в 50 раз, по сравнению с 35S промотором (Mitsuhara et al., 1996). Тем не менее, пока нет оснований считать, что самые лучшие промоторы для целей создания трансгенных растений уже найдены или сконструированы.

Одним из путей создания новых эффективных промоторов является метод направленной молекулярной эволюции in vitro. Представляет особый интерес создание химерных форм промоторов методом ДНК шаффлинга -высокоэффективного метода рекомбинации генетического материала последовательностей гомологичных белков или их доменов (Stemmer, 1994), а также промоторных последовательностей (Remans et al., 2005). В качестве родительских последовательностей ДНК здесь предпочтительно использовать эффективные природные промоторы, каковыми являются промоторы каулимовирусов, все исследованные формы которых показали весьма высокий уровень экспрессии белков в трансгенных растениях. При этом могут быть получены конструкции, более эффективные в трансгенных растениях, чем природные формы промоторов каулимовирусов.

Цели и задачи исследования. Цель данной работы заключалась в исследовании новых промоторов каулимовирусов и создании их химерных форм методом ДНК шаффлинга.

Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи:

1. Выявление филогенетического родства каулимовирусов на основе анализа нуклеотидных последовательностей их геномов, поиск промоторных последовательностей и подбор праймеров для их амплификации;

2. Поиск и отбор инфицированных каулимовирусами растений;

3. Амплификация и клонирование промоторов вируса мозаики георгина (ВМГ) и вируса кольцевой гравировки гвоздики (ВКГГ);

4. Определение нуклеотидной последовательности промоторов ВМГ и ВКГГ и проведение сравнительного анализа с промоторами других каулимовирусов;

5. Клонирование промоторов ВМГ и ВКГГ в бинарных векторах pCambia;

6. Получение химерных форм промоторов каулимовирусов методом ДНК шаффлинга;

7. Анализ экспрессионной активности генов GUS (Р-глюкуронидаза) и GFP (зеленый флюресцентный белок) под контролем промоторов каулимовирусов в протопластах N.tabacum;

8. Количественный анализ экспрессионной активности промоторов ВМГ и ВКГГ в трансгенных растениях N.tabacum.

Научная новизна. Впервые амплифицирован и секвенирован участок генома вируса мозаики георгина, содержащий часть межгенного спейсера (700 пн), промотор и 7-ю открытую рамку считывания. Проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей промоторов ВМГ и ВКГГ с промоторами других каулимовирусов. Показано распространение вируса мозаики георгина на территории г. Уфы и окрестностей. Впервые для получения одноцепочечной ДНК промоторов применен метод амплификации по типу катящегося кольца при помощи ДНК полимеразы фага phi 29. Получены химерные последовательности промоторов каулимовирусов методом ДНК шаффлинга. Впервые проведен анализ экспрессионной активности промоторов вирусов мозаики георгина и кольцевой гравировки гвоздики в протопластах и трансгенных растениях табака. Показано, что для проявления экспрессионной активности промотора вируса кольцевой гравировки гвоздики достаточно последовательности размером 370 пн.

Практическая значимость работы. Промоторы вируса мозаики георгина и вируса кольцевой гравировки гвоздики могут быть применены при создании трансгенных растений в качестве заменителя классического 35S промотора, так как большое количество его копий в геноме могут быть одной из причин так называемого "молчания" трансгена. Химерные промоторы каулимовирусов могут оказаться более эффективными, чем их природные аналоги и найдут применение при создании трансгенных растений, продуцирующих различные лекарственные или другие физиологически активные вещества и используемых в промышленных масштабах, так как применяемые для тех же целей клетки бактерий не всегда обеспечивают правильное сворачивание рекомбинантных белков. Подобранные праймеры для амплификации промоторов каулимовирусов могут быть использованы для идентификации этих вирусов в инфицированных растениях.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на XIII международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2006); на международной конференции "Генетика в России и мире" (Москва, 2006); на Российской школе-семинаре «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва -Пущино-на-Оке, 2006); на Четвертом съезде общества биотехнологов России (Пущино, 2006), на Школе-семинаре молодых ученых «Биомика -наука XXI века» (Уфа, 2007).

Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 10 печатных работах, а также депонированы в международных банках данных EMBL, GenBank и DDBJ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 152 страницах, содержит 3 таблицы и 42 рисунка. Состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), результатов исследования и их обсуждения (глава 3), заключения, выводов и списка литературы, включающего 203 источника.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Кулуев, Булат Разяпович

Выводы

1. Клонированы и секвенированы промоторы вируса мозаики георгина и вируса кольцевой гравировки гвоздики. Уровень гомологии этих промоторов с промоторами других каулимовирусов составил 50-60%. Наиболее близким к промотору вируса мозаики георгина оказался промотор вируса мозаики ночной красавицы, а к промотору вируса кольцевой гравировки гвоздики - 35S промотор вируса мозаики цветной капусты.

2. Сравнительный анализ канонических регуляторных последовательностей промоторов каулимовирусов показал, помимо типичных повторяющихся последовательностей ССАСТ, TGACG и TATA, наличие других консервативных участков, функция которых не определена.

3. На основе одноцепочечных ДНК-матриц промоторов каулимовирусов методом ДНК шаффлинга созданы химерные формы промоторов вирусов мозаики цветной капусты, кольцевой гравировки гвоздики и мозаики георгина в различных комбинациях.

4. Промоторы вируса кольцевой гравировки гвоздики и вируса мозаики георгина проявляют транскрипционную активность в протопластах и трансгенных растениях табака N.tabacum. Для проявления экспрессионной активности для промотора ВКГГ достаточно последовательности размером 370 пн.

5. Количественный анализ активности исследуемых промоторов в трансгенных растениях табака при помощи субстрата 4-MUG показал, что 35S промотор и промоторы вируса мозаики георгина и вируса кольцевой гравировки гвоздики проявлют одинаковый уровень экспрессионной активности.

132

Заключение

В последнее десятилетие активно создаются трансгенные растения с полезными хозяйственными признаками и разрабатываются методики трансформации и регенерации различных видов двудольных и однодольных, трансгенные формы которых до сих пор не удавалось получить. Видимо трансгенные формы в недалеком будущем будут занимать весьма значительное место среди культивируемых человеком растений. Проводятся эксперименты по созданию транспластомных растений, когда генные конструкции внедряются непосредственно в хлоропласты. Часто при создании трансгенных растений необходим универсальный, не тканеспецифичный и обладающий высокой экспрессионной активностью промотор, с которого может идти конститутивная экспрессия любого белкового продукта. Из исследованных до настоящего времени, наилучшими показателями обладают промоторы каулимовирусов. Промоторы многих известных каулимовирусов уже выделены и все они показали весьма высокий уровень экспрессионной активности репортерных генов во всех тканях трасгенных растений на любой стадии развития. Нами клонированы и секвенированы промоторы вируса мозаики георгина и вируса кольцевой гравировки гвоздики, которые оказались гомологичны промоторам других каулимовирусов. Промоторы ВМГ и ВКГГ оказались наиболее близки к 35S промотору ВМЦК и промоторам ВМН, ВМНК и ВОЖЗ. Были обнаружены и исследованы консервативные регуляторные области промоторов ВМГ и ВКГГ и проведен сравнительный анализ промоторных последовательностей с исследованными до этого промоторами ВМЦК, ВМН, ВМНК и ВОЖЗ. Промоторы ВМЦК, ВКГГ и ВМГ были использованы нами для создания химерных форм методом ДНК шаффлинга. Для этого промоторы данных каулимовирусов были получены в одноцепочечной форме с помощью ДНК полимеразы фага phi29. Методом ДНК шаффлинга было получено не менее 30-ти различных химерных между промоторами ВМЦК, ВКГГ и ВМГ форм, экспрессионная активность некоторых из них была проверена в клетках E.coli и A.tumefaciens. Промоторы ВКГГ и ВМГ были клонированы в векторы pCambia с репортерными генами GUS и GFP. С помощью данных репортерных генов показано, что промоторы ВКГГ и ВМГ проявляют свою активность в клетках E.coli, A.tumefaciens и в протопластах табака. Были получены трансгенные по промоторам ВКГГ и ВМГ растения табака с репортерным геном GUS. Данные промоторы показали сравнимую с 35S промотором активность в листьях и стеблях трансгенного растения и при этом не проявили тканеспецифичности. При использовании флюориметрического метода измерения активности гена GUS было выяснено, что 35S промотор и промоторы ВМГ и ВКГГ проявляют примерно одинаковую активность в трансгенных растениях. Полученные результаты в целом перекрещиваются с данными предыдущих исследований промоторов ВМЦК, ВМН, ВМНК и ВОЖЗ, но должны быть проверены еще многократно на большем количестве трансгенных растений и требуют дополнительных исследований.

Промоторы вируса мозаики георгина и вируса кольцевой гравировки гвоздики могут быть применены при создании трансгенных растений, в качестве заменителя классического 35S промотора, например, когда возникают проблемы по "молчанию" трансгена. Знание и анализ нуклеотидной последователности промоторов каулимовирусов позволяет выяснить, какие участки ДНК являются ответственными для регуляции их активности и помогут при разработке стратегий дальнейших модификаций и создания химерных форм. Химерные промоторы каулимовирусов могут оказаться более эффективными, чем их природные аналоги и найдут применение при создании трансгенных растений, продуцирующих различные лекарственные или другие физиологически активные вещества и используемых в промышленных масштабах, так как применяемые для тех же целей клетки бактерий не всегда обеспечивают правильное сворачивание рекомбинантных белков. В дальнейших исследованиях для отбора наиболее лучших вариантов промоторов предполагается клонирование всего пула амплификата после ДНК шаффлинга в небольшие векторные молекулы с репортерным геном GUS. Далее следует электропорация протопластов табака, культивирование их на среде с добавлением 4-MUG и отбор наиболее интересных форм по интенсивности свечения протопласта под длинноволновым ультрафиолетом. Таким образом, появляется возможность отбора наиболее эффективной промоторной конструкции.

131

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кулуев, Булат Разяпович, Уфа

1. Богунов Ю.В. Идентификация вируса мозаики георгины молекулярно-биологическими методами // Молекулярная биология. 2006. -Т. 40. - № 1.-С. 184-185.

2. Зверева С.Д., Романов Г.А. Репортерные гены для генетической инженерии растений: характеристика и методы тестирования // Физиология растений 2000. - Т. 47. - №3. - С. 479-488.

3. Черкасский Е.С. Адаптация вируса мозаики георгин к циннии и получение антисывороток для серологической диагностики // Доклады Академии наук СССР. 1965. - Т. 165. - № 3. - С. 696 - 698.

4. Assaad F.F., Signer E.R. Cauliflower mosaic virus p35S promoter activity in Escherichia coli // Molecular and General Genetics. 1990. - V. 223, N 3. - P. 517-520.

5. Armour S.L., Melcher U., Pirone T.P., Lyttle D.J., Essenberg R.C. Helper component for aphid transmission by region II of CaMV DNA // Virology. -1983.-V. 129.-P.25-30.

6. Aronen Т., Hontola A., Laukkanen H., Haggman H. Seasonal changes in the transient expression of a 35S CaMV-GUS gene construct introduced into Scots pine buds // Tree Physiology. 1995. - V. 15. - P. 65-70.

7. Ausubel F.M., Brent R., Kingston R.E., Moore D.D., Seidman J.G., Smith J.A., Struhl K. // Current Protocols in Molecular biology, John Wiley & Sons, NY. 1987.

8. Balazs E., Guilley H., Jonard G., Richards K. Nucleotide sequence of DNA from an altered-virulence isolate D/H of the cauliflower mosaic virus // Gene. 1982. - V. 19, N 3. - P. 239-249.

9. Barriault D., Plante M.M., Sylvestre M. Family shuffling of a targeted bhpA region to engineer biphenyl dioxygenase // J. Bacteriol. 2002.-V. 184, N 4.-P. 3794-3800.

10. Benfey P.N., Ren L., Chua N.H. Combinatorial and synergistic properties of CaMV 35S enhancer subdomains // EMBO. 1990. - V. 9, N 3. - P. 16851696.

11. Bergquist P.L., Gibbs M.D. Degenerate oligonucleotide gene shuffling // Methods Mol. Biol. -2007. V. 352. - P. 191-204.

12. Bernal A.J., Pan Q., Pollack J., Rose L., Kozik A., Luo Y., Guittet M., Kothetkova E., Michelmore R.W. Functional analysis of the plant resistance gene Pto using DNA shuffling // J. Biol. Chem. 2005. - V. 280, N 24. - P. 2307323083.

13. Blasco M.A., Bernad A., Blanco L., Salas M. Characterization and mapping of the pyrophosphorolytic activity of the phage phi 29 DNA polymerase //J. Biol. Chem. -1991. V. 266, N 12. - P. 7904 - 7909.

14. Boneville J.M., Sanfacon H., Futterer J., Hohn T. Post-transcriptional /гага-activation in Cauliflower mosaic virus // Cell. 1989. - V. 59. - P. 11351153.

15. Bornscheuer U., Pohl M. Improved biocatalysts by directed evolution and rational protein design // Curr. Opin. Chem. Biol. 2001. - V. 5. - P. 137-143.

16. Bouhida M., Lochart В., Olszewski N.E. An analysis of the complete sequence of a sugarcane bacilliform virus genome infectious to banana and rice // J. Gen. Virol. 1993. - V. 74. - P. 15-22.

17. Chang C., Chen T. Evolution of cytokine using DNA shuffling // Nat. Biotechnol. 1999. - V. 17. - P. 793-797.

18. Chenault K.D., Melcher U. Cauliflower mosaic virus isolate CMV-1 // Plant Physiol. 1993. - V. 101. - P. 1395-1396.

19. Chiang L.C., Chiang W., Chang M.Y., Lin C.C. In vitro cytotoxic, antiviral and immunomodulatory effects of Plantago major and Plantago asiatica // Am J Chin Med. 2003. - V. 31, N 2. - P. 225-234.

20. Chibbar R., Chen H. From gene shuffling to the restoration of riparian ecosystems // Trends Plant Science. 1999. - V. 4, N 9. - P. 337-338.

21. Christinans F., Scapozza L. Directed evolution of thymidine kinase for AZT phosphorylation using DNA family shuffling // Nat. Biotechnol. 1999. -V. 17, N3.-P. 259-264.

22. Citovsky V., Knorr D., Zambryski P. Gene I, a potential cell-to-cell movement locus of CaMV, encodes an RNA-binding protein // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1991. -V. 88. P. 2476-2480.

23. Clewell D.B., Helinski D.R. Supercoiled circular DNA-protein complexin Escherichia coli: purification and induced conversion to an open circular

24. DNA form //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1969. - V. 62, N 4. - P. 1159-1166.

25. Cohen S.N., Chang A.C.Y., Hsu L. Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria Genetic transformation of E. coli by R-factor DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1972. - V. 69. - P. 2110-2114.

26. Comai L., Moran P., Maslyar D. Novel and useful properties of chimeric plant promoter combining CaMV 35S and MAS elements // Plant Mol Biol. -1990.-V. 15, N3.-P. 373-381.

27. Crameri A., Stemmer W.P.C. Combinatorial multiple cassette mutagenesis creates all the permutations of mutant and wildtype sequences // Biotechniques. -1996a.-V. 2.-P. 549-553.

28. Crameri A., Whitehorn E., Tate E. Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling // Nat. Biotechnol. 1996b. - V. 14, N 3.-P. 315-319.

29. Crameri A., Dawes G, Rodriguez E. Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling //Nat. Biotechnol. 1997. - V. 15, N 5. P. 436-438.

30. Crameri A., Raillard S., Bermudez E. DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution // Nature. 1998. - V. 391. -P. 288-291.

31. De Mesa M.C., Santiago-Domenech N., Pliego-Alfago F., Quesada M.A., Mercado J.A. The CaMV 35S promoter is highly active on floral organs and pollen of transgenic strawberry plants // Plant Cell Rep. 2004. - V. 23. - P. 32.

32. De Kochko A., Verdaguer В., Taylor N., Carcamo R., Beachy R.N., Fauquet C. Cassava vein mosaic virus (CsVMV), type species for a new genus of plant double stranded DNA viruses //Arch. Virol. 1998. - V. 143. - P. 945-962.

33. Dey N., Maiti I.B. Structure Structure and promoter/leader deletion analysis of mirabilis mosaic virus (MMV) full-length transcript promoter in transgenic plants // Plant Mol. Biol. 1999. - V. 40, N 5. - P. 771-782.

34. Dominiquez D.I., Ryabova L.A., Pooggin M.M., Schmidt-Puchta W., Futterer W., Hohn T. Ribosome shunting in CaMV, identification of an essential and sufficient structural element // J. Biol. Chem. 1998. - V. 273. - P. 36693678.

35. Donson J., Hull R., Physical mapping and molecular cloning of caulimovirus DNA//J. Gen. Virol. 1983. - V.64. - P. 2281-2288.

36. Espinoza A.M., Medina V., Hull R., Markham P.G. CaMV gene II products forms distinct inclusion bodies in infected plant cells // Virology. -1991.-V. 185.-P. 337-344.

37. Esteban J.A., Salas M., Blanco L. Fidelity of phi 29 polymerase. J. Biol. Chem. 1993. - V. 268, N 4. - P. 2719-2726.

38. Fang R., Wu X., Bu M., Tian Y., Cai F., Mang K. Complete nucleotide sequence of cauliflower mosaic virus (Xinjiang isolate) genomic DNA // Bing Du Xue Bao. 1985. - V. l.-P. 247-256.

39. Fang R.X., Nagy F., Sivasubramaniam S., Chua N.H. Multiple cis regulatory elements for maximal expression of the CaMV 35S promoter in transgenic plants // Plant Cell. 1989. - V. 1. - P. 141-150.

40. Farinas E.T., Bulter Т., Arnold F.H. Directed enzyme evolution // Curr. Opin. Biotech. 2001. - V. 12. - P.545-551.

41. Fauquet M.C., Mayo M. A. Abbreviations for plant virus names // Archives. Virology. 1999. - V. 144, N 6. P. 1249-1273.

42. Fradkov A.F., Chen Y., Ding L. Novel fluorescent protein from Discosoma coral and its mutants possesses a unique far-red fluorescence // FEBS Lett. 2000. - V. 479, N 3. - P.127-130

43. Franck A., Guilley H., Jonard G., Richards K., Hirth L. Nucleotide sequence of CaMV DNA // Cell. 1980. - V. 21. - P. 285-294.

44. Franova-Honetslegrova J., Mraz I., Nebesarova J., Sip M. Preferential banding of secondary veins in strawberry is caused by mixed virus infection // Acta Virol. -1999. V. 43, N 6. - P. 349-355.

45. Futterer J., Gordon K., Pfeiffer P., Sanfacon H., Pisan В., Bonneville J.-M., Hohn T. Differential inhibition of downstream gene expression by the CaMV 35S RNA leader // Virus Genes. 1989. - V. 3. - P. 45-55.

46. Futterer J., Gordon K., Sanfacon H., Bonneville J.-M., Hohn T. Positive and negative control of translation by the leader sequence of cauliflower mosaic virus pregenomic 35S RNA // EMBO J. 1990. - V. 9, N 6. - P. 1697-1707.

47. Futterer J., Hohn T. Translation of a polycistronic mRNA in the presence of the CaMV transactivator protein // EMBO J. 1991. - V. 10, N 12. - P. 38873896.

48. Futterer J., Kiss-Laszlo Z., Hohn T. Nonlinear ribosome migration on CaMV 35S RNA // Cell. 1993. - V. 73. - P. 789-802.

49. Gardner R, C., Howarth A. J., Hahn P., Brown-Luedi M., Shepherd R.J., Messing J. The complete nucleotide sequence of an infectious clone of cauliflower mosaic virus by M13mp7 shotgun sequencing // Nucl. Acids Res. -1981.-V 9.-P. 2871-2888.

50. Garmendia C., Bernad A., Esteban J., Blanco L., Salas M. The bacteriophage phi 29 DNA polymerase, a proofreading enzyme // J. Biol. Chem. 1992.-V. 267.-P. 2594-2599.

51. Gibbs M.D., Nevalainen K.M.H., Bergquist P.L. Degenerate oligonucleotide gene shuffling (DOGS): a method for enhancing the frequency of recombination with family shuffling // Gene. 2001. - V. 271. - P. 13-20.

52. Giver L., Gershenson A., Freskgard P. Directed evolution of a thermostable esterase//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - V. 95. - P. 1280912813.

53. Givord L., Xiong C., Giband M., Koening I., Hohn Т., Lebeurier G., Hirth L. A second CaMV gene product influences the structure of the viral inclusion body // EMBO J. 1984. - V. 3. - P. 1423-1427.

54. Gowda S., Wu F.C., Scholthof H.B., Shepherd R.J. Gene VI of figwort mosaic virus (caulimovirus group) functions in posttranscriptional expression ofgenes on the foil-length RNA transcript // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. -V. 86.-P. 9203-9207.

55. Graham D.E. The isolation of high molecular weight DNA from whole organisms of large tissue masses // Anal. Biochem. 1978. - V. 78. - P. 673-678

56. Haas M., Bureau M., Geldreich A., Yot P., Keller M. Cauliflower mosaic virus: still in the news // Molecular Plant Pathology. 2002. - V. 3, N 6. - P. 419429.

57. Hall B.G. Towards an understanding of evolutionary potential // FEBS Microbiol. Lett. 1999. - V. 178, N 1.- P. 1-6.

58. Hagen L.S., Jacquemond M., Lepingle A., Lot H., Tepfer M. Nucleotide sequence and genomic organization of cacao swollen shoot virus // Virology. -1993.-V. 196.-P. 619-628.

59. Harayama S. Artificial evolution by DNA shuffling // Trends Biotechnol. -1998.-V. 16.-P. 76-82.

60. Hauber L. Nuclear export mediated by the Rev/Rex class of retroviral trans-activator proteins // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2001. - V. 259. - P. 55-76.

61. Hay J.M., Lones M.C., Blakebrough M.L., Dasgupta I., Davies J.W., Hull R. An analysis of the sequence of an infectious clone of rice tungro bacilliform virus, a plant pararetrovirus // Nucl. Acids Res. -1991. V. 19. - P. 2615-2621.

62. Hegedus K., Palcovics L., Toth E.K., Dallmann G., Balazs E. The DNA form of a retroviroid-like element characterized in cultivated carnation species // J. Gen. Virol. 2001. - V. 82. - P. 687-691.

63. Hemmings-Mieszszak M., Steger G., Hohn T. Regulation of CaMV 35S RNA translation is mediated by a stable hairpin in the leader // RNA. 1998. - V. 4. - P. 101-111.

64. Hemmings-Mieszszak M., Hohn Т., Preiss Т. Termination and peptide release at the upstream open reading frame are required for downstream translation on synthetic shunt-competent mRNA leaders // Mol.Cell.Biol. 2000. -V. 20.-P. 6212-6223.

65. Hitchborn J.H., Hills G.J., Hull R. Electron microscopy of viruslike particles found in diseased Plantago lanceolata in Britain // Virology. 1966 - V. 28,N4.-P. 768-772.

66. Hohn Т., Hohn В., Pfeiffer P. Reverse transcription in CaMV // Trends Biol. Sci. 1985. - V. 8. - P. 205-209.

67. Holmberg N., Harker M., Gibbard C.L., Wallace A.D., Clayton J.C., Rawlins S., Hellyer A., Safford R. Sterol C-24 Methyltransferase type 1 controls the flux of carbon into sterol biosynthesis in tobacco seed // Plant Physiol. -2002.-V. 130.-P. 303-311.

68. Horsch R.B., Fry J.E., Hoffmann N.L., Eichholtz D., Rogers S.G., Fraley R.T. A simple and general method for transferring genes into plants // Science. -1985. V. 227, N 4691. - P.1229-1231.

69. Horton R.M. PCR-mediated recombination and mutagenesis. SOEing together tailor-made genes // Mol. Biotechnol. 1995. - V. 3, N 2. - P. 93-99.

70. Hull R., Sadler J., Longstaff M. The sequence of carnation etched ring virus DNA comparison with CaMV and retroviruses // EMBO J. 1986. - V. 5, N 12.-P. 3083-3090.

71. Hull R. Genome organization of retroviruses and retroelements: evolutionary considerations and implications // Semin Virol. 1992. - V. 3. - P. 372-382.

72. Hull R. Molecular biology of rice tungro viruses // Annu. Rev. Phytopatol. 1996. - V. 34.-P. 275-297.

73. Jefferson R.A. Assaying chimeric genes in plants: the GUS gene fusion system // Plant Mol. Biol. Rep. 1987. - V. 5, N 4. - P. 387-405.

74. Jermutus L., Honegger A., Schwesinger F. Tailoring in vitro evolution for protein affinity or stability // Proc. Natl. Acad. Sci USA. 2001. - V. 98, N 1. - P. 75-80.

75. Jobling S.A., Jarman C., Teh M.M., Holmberg N., Blake C., Verhoeyen M.E. Immunomodulation of enzyme function in plants by single-domain antibody fragments // Nature Biotech. 2002. - V. 21. - P. 77-80.

76. Joern J.M., Meinhold P., Arnold F.H. Analysis of shuffled gene libraries // J. Mol. Biol. 2002. - V. 316. - P. 643-656.

77. Jones H., Ooms G., Jones M.G.K. Transient gene expression in electroporated Solanum protoplasts // Plant Mol. Biol. 1989. - V. 13. - P. 503511.

78. Joo H., Lin Z., Arnold F. Laboratory evolution of peroxide-mediated cytochrome P450 hydroxylation //Nature. 1999. - V. 399. - P. 670-673.

79. Jupin I., Chua N.H. Activation of the CaMV as-1 cis-element by salicylic acid: differential DNA-binding of a factor related to TGAla // EMBO J. 1996. -V. 15.-P. 5679-5689.

80. Капо Н., Koizumi М., Noda Н., Hibino Н., Ishikawa К., Omura Т., Cabautan P.Q., Koganazawa Н. Nucleotide sequence of capsid protein of rice tungro baciliform virus//Arch. Virol. 1992. - V. 124. - P. 157-163.

81. Keenan R.J., Siehl D.L., Gorton R., Castle L. DNA shuffling as tool for protein crystallization // Proc. Natl. Acad. Sci. 2005. - V. 102, N 25. - P. 88878892.

82. Kikuchi M., Ohnini K., Harayama S. Novel family shuffling methods for in vitro evolution of enzymes // Gene. 1999. - V. 236. - P. 159-167.

83. Kikuchi M., Ohnini K., Harayama S. An effective shuffling method using single-stranded DNA // Gene. 2000. - V.243. - P.133-137.

84. Kiss-Laszlo., Blanc S., Hohn T. Splicing of cauliflower mosaic virus 35S RNA is essential for viral infectivity // EMBO J. 1995. - V. 14. - P. 3552-3562.

85. Kong X., Liu Y., Gou X. Directed evolution of operon of threhalose-6-phosphate synthase/phosphatase from E. coli II Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. - V. 280, N 1. -P. 396-400.

86. Mahmoudpour A. Infectivity of recombinant strawberry vein banding virus DNA // J. Gen. Virol. 2003. - V. 84. - P. 1377-1381.

87. Matsumura I., Wallingford J.B., Surana N. K., Vise P.D., Ellington A.D. Directed evolution of the surface chemistry of the reporter enzyme beta-glucuronidase. Nature Biotechnol. 1999. - V.l7. - P. 696-701.

88. Matsumura I., Ellington AD. In vitro evolution of beta-galactosidase proceeds through non-specific intermediates // J. Mol. Biol. 2001. - V. 305, N 2. -P. 331-339.

89. Martinez-Izqulerdo J., Futterer J., Hohn T. Protein encoded by ORF I of cauliflower mosaic virus is part of the viral inclusion body // Virology. 1987. -V. 160.-P. 527-530.

90. Medberry S.L., Lochart B.E., Olszewski N.O. Properties of Commelina yellow mottle virus's complete DNA sequence, genome discontinuities and transcript suggest that it is a pararetrovirus // Nucleic Acids Res. 1990. - V. 18. -P. 5505-5513.

91. Menissier J., de Murcia G., Lebeurier G., Hirth L. Electron microscopic studies of the different topological forms of the cauliflower mosaic virus DNA: knotted encapsidated DNA and nuclear minichromosome // EMBO J. 1983. - V. 2,N7.-P. 1067-1071.

92. Minshull J., Stemmer W.P.C. Protein evolution by molecular breeding // Curr. Opin. Chem. Biol. 1999. - V. 3. - P. 284-290.

93. Mitsuhara I., Ugaki M., Hirochika H. Efficient promoter cassettes for enhancer expression of foreign genes in dicotyledonous and monocotyledonous plants // Plant Cell Physiol. 1996. - V. 37, N 1. - P. 49-59.

94. Miyazaki K. Random DNA fragmentation with endonuclease V: application to DNA shuffling // Nucleic Acids Res. 2002. - V. 30, N 24 el39.

95. Moore G.L., Maranas C.D. Modeling DNA mutation and recombination for directed evolution experiments // J. Theor. Biol. 2000. - V. 205. - P. 483503.

96. Moore G., Maranas C. EcodonOpt: a systematic computational framework for optimizing codon usage in directed evolution experiments // Nucl. Acids Research. 2002. - V. 11, N 3. - P. 2407-2416.

97. Mraz I., Franova-Honetslegrova J., Sip M. Diagnosis of strawberry vein banding virus by a non-radioactive probe // Acta Virol. 1996. - V. 40, N 3. - P. 139-141.

98. Mraz I., Petrzik K., Franova-Honetslegrova J., Sip M. Detection of strawberry vein banding virus by polymerase chain reaction and dot blot hybridization // Acta Virol. 1997. - V. 41, N 4. - P. 241-242.

99. Ness J., Welch M. DNA shuffling of subgenomic sequences of subtilisin // Nat. Biotechnol. 1999. - V. 17. - P. 893-896.

100. Nicolaisen M. Partial molecular characterization of dahlia mosaic virus and its detection by PCR // Plant Disease. 2003. - V. 87. - P. 945-948.

101. Nishigaki K., Kinoshita Y., Kyono H. Restriction-enzyme-nondependent recombination and rearrangement of DNA (RRR) // Chemistry Lett. 1995. - V. 2.-P. 131-132.

102. Noad R.J., Turner D.S., Covey S.N. Expression of functional elements inserted into the 35S promoter region of infectious cauliflower mosaic virus replicons // Nucl. Acids Res. 1997. - V. 25, N 6. - P. 1123-1129.

103. Odell J.T., Nagy F., Chua N.H. Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter // Nature. 1985. - V. 313, N6005.-P. 810-812.

104. Ostermeier M., Shim J.H., Benkovic J. A combinatorial approach to hybrid enzymes independent of DNA homology // Nat. Biotechnol. 1999. - V. 17, N 12.-P. 1205-1209.

105. Palacios I., Drucker M., Blanc S., Leite S., Moreno A., Fereres A. Cauliflower mosaic virus is preferentially acquired from the phloem by its aphid vectors // J. Gen. Virol. 2002. - V. 83. - P. 3163-3171.

106. Pappu H.R., Wyatt S.D., Druffel K.L. Dahlia mosaic virus: molecular detection and distribution in Dahlia in the United States // HortScience. 2005. -V. 40, N3.-P. 697-699.

107. Park H.-S., Himmelbach A., Browning K.S., Hohn Т., Ryabova L.A. A plant viral "reinitation" factor interacts with the host translational machinery // Cell. 2001. - V. 106. - P. 723-733.

108. Patten P.A., Howard R.J., Stemmer W.P.C. Application of DNA shuffling to pharmaceuticals and vaccines // Curr. Opin.Biotechnol. 1997. - V. 8. - P. 724-733.

109. Pauli S., Rothnie H.M., Chen G., He X., Hohn T. The cauliflower mosaic virus extends into the transcribed region // Virology. 2004. - V. 78, N 22. - P. 12120-12128.

110. PCR 2. A Practical Approach / Ed. McPherson M.J., Hames B.D., Taylor G.R. New York: Oxford University Press, 1995. 332 p/

111. Perbal M.-C., Thomas C.L., Maule A.J. Cauliflower mosaic virus gene I product (PI) forms tubular structures which extend from the surface of infected protoplasts // Virology. 1993. - V. 195. - P. 281-285.

112. Petrzik K., Benes V., Mraz I., Honetslegrova-Franova J., Ansorge W., Spak J. Strawberry vein banding virus definitive member of the genus caulimovirus // Virus Genes. - 1998a. - V. 16, N 3. - P. 303-305.

113. Petrzik K., Mraz I., Dulic-Marcovic 1. Quarantine strawberry vein banding virus firstly detected in Slovakia and Serbia // Acta Virol. 1998b. - V. 42, N 2. -P. 87-89.

114. Plant A.L., Covey S.N., Grierson D. Detection of a subgenomic mRNA for gene V, the putative reverse transcriptase gene of cauliflower mosaic virus // Nucleic Acids Research. 1985. - V. 13. - P. 8305-8321.

115. Pooggin M.M., Futterer J., Skryabin G., Hohn T. A short open reading terminating in front of a stable hairpin is the feature in pregenomic RNA leaders of plants pararetroviruses // J. Gen. Virol. 1999. - V. 80. - P. 2217-2228.

116. Poogin M., Hohn Т., Futterer J. Role of a short open reading frame in ribosome shunt on the cauliflower mosaic virus RNA leader // J. Biol. Chem. -2000. V. 275. - P. 17288-17296.

117. Powell S.K., Kallos M.A., Pinkstaff A. Breeding of retroviruses for improved stability and processing yields // Nat. Biotechnol. 2000. - V. 18, N 12. -P. 1279-1282.

118. Raikhy G., Hallan V., Kulshrestha S., Lai Sharma M., Ram R., Zaidi A.A. Molecular characterization of carnation etched ring virus isolate from India // Acta Virol. 2003. - V. 47, N 2. - P. 105-111.

119. Raikhy G., Hallan V., Kulshrestha S., Ram R., Zaidi A.A. Complete nucleotide sequence of an Indian isolate of carnation etched ring virus and its homology with other caulimoviruses // Current Science. 2006. - V. 90, N 2. - P. 176-186.

120. Railland S., Krebber A. Novel enzyme activities and functional plsasticity revealed by recombining highly homologous enzymes // Chem. Biol. 2001. -V. 8, N9.-P. 891-898.

121. Reddy D.V.R., Richins R.D., Rajeshwari R., Lizuka N., Manohar S.K., Shepherd R.J. Peanut chlorotic streak virus, a new caul imovirus infecting peanuts (Arachis hypogaea) in India // Phytopathology. 1993. - V. 83. - P. 129-133.

122. Remans Т., Schenk P.M., Manners J.M., Grof C.P.L., Elliott A.R. A protocol for the fluorometric quantification of mGFP5-ER and sGFP(S65T) in transgenic plants // Plant Mol. Biol. Rep. 1999. - V. 17. - P. 385-395.

123. Remans Т., Grof C. P. L., Ebert P. R. Functional promoter analysis using an approach based on an in vitro evolution strategy // Biotecniques. 2005. - V. 38,N2.-P. 209-216.

124. Richert-Poggeler K.R., Noreen F., Schwarzacher Т., et al. Induction of infectious petunia vein clearing (pararetro) virus from endogenous provirus in petunia // EMBO J. 2003. - V. 22, N 18. - P. 4836-4845.

125. Richins R.D., Shepherd R.J. Physical maps of the genomes of Dahlia mosaic virus and Mirabilis mosaic virus two members of the caulimovirus group // Virology. - 1983. - V. 124. - P. 208-214.

126. Richins R D, Shepherd RJ. Horseradish latent virus, a new member of the caulimovirus group //Phytopathology. 1986. - V. 76, N 7. - P. 749-754.

127. Richins R.D., Scholthof H.B., Shepherd R.J. Sequence of figwort mosaic dirus DNA (caulimovirus group) // Nucl. Acids Res. 1987. - V. 15, N 20. - P. 8451-8465.

128. Rosic N.N., Huang W., Johnston W.A., DeVoss J.J., Gillam E.M. Extending the diversity of cytochrome P450 enzymes by DNA family shuffling // Gene. 2007. - V. 395, N 1-2. P. 40-48.

129. Salamone P.R., Kavakli I.H., Slattery С.J. Directed molecular evolution of ADP-glucose pyrophosphorylase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. - V. 99, N2.-P. 1070-1075.

130. Samac D.A., Tesfaye M., Dornbusch M., Saruul P., Temple SJ. A comparison of constitutive promoters for expression of transgenes in alfalfa (.Medicago sativd) II Transgenic Research. 2004. - V. 13. - P. 349-361.

131. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd edn. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, Cold Spring Harbor, 1989. P. 425.

132. Sanders P.R., Winter J.A., Barnason A.R. Rogers S.G., Fraley R.T. Comparison of cauliflower mosaic virus 35S and nopaline synthase promoters in transgenic plants // Nucleic Acids Research. 1987. - V. 14, N 4. - P. 1543-1558.

133. Schenk P.M., Remans Т., Sagi L. Promoters for pregenomic RNA of banana streak badnavirus are active for transgene expression in monocot and dicot plants // Plant Mol. Biol. 2001. - V. 47, N 3. - P.399-412.

134. Schmidt-Dannert C., Umeno D., Arnold F. Molecular breeding of carotenoid biosynthetic pathways // Nat. Biotechnol. 2000. - V. 18. - P. 750753.

135. Scholthof H.B., Gowda S., Wu F.C., Shepherd R.J. The full-length transcript of a caulimovirus is a polycistronic mRNA whose genes are trans activated by the product of gene VI // J. Virol. 1992. - V. 66, N 5. - P. 31313139.

136. Sealey P.G., Southern E.M. Gel electrophoresis of DNA // In: Gel Electrophoresis of Nucleic Acids. A Practical Approach. IRL Press. Oxford, 1982. P.39-76.

137. Shibuya H., Kaneko S., Hayashi K. Enhancement of the thermostability and hydrolytic activity of xylanase by random gene shuffling // Biochem. J.-2000.-V. 349.-P. 651-656.

138. Sieber V., Martinez C.A., Arnold F.H. Libraries of hybrid proteins from distantly related sequences // Nat. Biotechnol. 2001. - V.19, N 5.- P. 456-460.

139. Song J.K., Rhee J.S. Enhancement of stability and activity of phospholipase A(l) in organic solvents by directed evolution // Biochem. Biophys. Acta. 2001. - V. 1547, N2. - P. 370-378.

140. Stavolone L., Ragozzino A., Hohn T. Characterization of Cestrum yellow leaf curling virus: a new member of the family Caulimoviridae // J. Gen. Virol. -2003.-V. 84.-P. 3459-3464.

141. Stemmer W.P.C. Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling // Nature. 1994a. - V. 8. - P. 389-391.

142. Stemmer W.P.C. DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: in vitro recombination for molecular evolution // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994b. - V. 91. - P. 10747-10751.

143. Stephanopoulos G. Metabolic engineering by genome shuffling // Nat. Biotechnol. 2002. - V. 20. - P. 666-668.

144. Sun F. Modeling DNA shuffling // J. Comput. Biol. 1999.- V. 6, N 1. - P.77.90.

145. Sunilkumar G., Mohr L., Lopata-Finch E., Emani C., Rathore K.S. Developmental and tissue-specific expression of CaMV 35S promoter in cotton as revealed by GFP // Plant Mol Biol. 2002. - V. 50, N 3. - P. 463-474.

146. Suenaga H., Watanabe Т., Sato M. Alteration of regiospecificity in biphenyl dioxygenase by active-site engineering // J. Bacteriol. 2002. -V. 184, N13.-P. 3682-3688.

147. Takemoto Y., Hibi T. Genes la, И, III, IV and V of Soybean Chlorotic mottle virus are essential but the gene lb product is non-essential for systemic infection // J. Gen. Virol. 2001. - V. 82. - P. 1481-1489.

148. Tobin M., Gustafsson C. Directed evolution: the "rational basis" for "irrational" design // Curr. Opin. Struct. Biol. 2000. - V. 10. - P. 421-427.

149. Tominaga Т., Hatakeyama Y. Development of innovative pediocin PA-1 by DNA shuffling among class Ila bacteriocins // Appl. Environ. Microbiol. -2007. V. 73, N 16. - P. 5292-5299.

150. Toth R.L., Pogue G.P., Chapman S. Improvement of the movement and host range properties of a plant virus vector through DNA shuffling // Plant J. -2002.-V. 30,N5.-P. 593-600.

151. Triverdi B. "Genome shuffling" may speed production of antibiotics // National Geographic Today.- 2000. V. 2.

152. Turner D.S., McCallum D.G., Covey S.N. Roles of the promoter and multiple overlapping domains in the pathogenicity of the pararetrovirus cauliflower mosaic virus//J. Virol. 1996. - V. 70, N 8. - P. 4514-4521.

153. Van der Fits L., Memelink J. Comparison of the activities of CaMV 35S and FMV 34S promoter derivatives in Catharantus roseus cells transiently and stably transformed by particle bombardment // Plant Mol. Biol. 1997. - V. 33.-P. 943-946.

154. Van Kampen M.D., Egmond M.R. Directed evolution: from staphylococcal lipase to phospholipase // Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2000. - V. 102,N12.-P. 717-726.

155. Verdaguer В., de Kochko A., Beachy R.N., Fauquet C. Isolation and expression in transgenic tobacco and rice plants, of the cassava vein mosaic virus (CVMV) promoter // Plant Mol. Biol. 1996. - V. 31, N 6. - P.l 129-1139.

156. Wackett L.P. Directed evolution of new enzymes and pathways for environmental biocatalysis // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1998. - V. 864. - P. 142152.

157. Wang L.J., Xong X.D., Zhang H.Y. Enhancement of the activity of 1-aspartase from E. coli W by directed evolution // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. - V. 276, N 1. - P. 346-349.

158. Wang P.L. Creating hybrid genes by homologous recombination // Dis. Markers. 2000. - V. 16, N 1,2. - P. 3-13.

159. Wang Y., Gaba V., Wolf D., Xia X.D., Zelcer A., Gal-On A. Identification of a novel plant promoter using a potyvirus infectious clone // Virus Genes. -2000.-V. 20, N1.-P. 11-17.

160. Woodyer R., Chen W., Zhao H. Outrunning Nature: Directed evolution of superior biocatalysts // J. Chem. Educat. 2004. - V. 18, N 1. - P. 126-133.

161. Zhang J., Dawes G., Stemmer W.P.S. Directed evolution of a fucosidase from a galactosidase by DNA-shuffling and screening // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1997. - V. 94. - P. 4504-4509.

162. Zhang H., Kong X., Zhang J. New strategies of protein engineering-directed evolution of enzyme in vitro II Chin. Sci. Bull. 1999. - V. 44, N 18. -P. 328-330.

163. Zhao H., Arnold F.H. Optimization of DNA shuffling for high fidelity recombination // Nucl. Acids Res. 1997. - V. 25, N 6. - P. 1307-1308.

164. Zhao H., Giver L., Shao Z., Affholter J.A., Arnold F.H. Molecular evolution by staggered extension process (StEP) in vitro recombination // Nat. Biotechnol. 1998. - V. 16, N 3. - P. 258-261.

165. Zhao H., Arnold F. Directed evolution converts subtilisin E into functional equivalent of thermitase // Protein Eng. 1999. - V. 12. - P. 47-53.

166. Zhou J.H., Chen H.B. A facile DNA shuffling protocol // Progress Biochem. Bioph. 2000. - V. 27, N 6. - P. 655-657.

167. Yano Т., Kagamiyama H. Directed evolution of ampicillin-resistant from a functionary unrelated DNA fragment: A laboratory model of molecular evolution // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. - V. 98, N 3. - P. 903-907.

Информация о работе

Кулуев, Булат Разяпович
кандидата биологических наук
Уфа, 2007
ВАК 03.00.04

Диссертация

Новые промоторы каулимовирусов и конструирование их химерных форм - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы