Новые подходы к молекулярному моделированию трансмембранных доменов рецепторов, действие которых опосредовано G-белками

Чугунов, Антон Олегович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Новые подходы к молекулярному моделированию трансмембранных доменов рецепторов, действие которых опосредовано G-белками
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Новые подходы к молекулярному моделированию трансмембранных доменов рецепторов, действие которых опосредовано G-белками"

На правах рукописи

003052115

Чугунов Антон Олегович

Новые подходы к молекулярному моделированию трансмембранных доменов рецепторов, действие которых опосредовано С-белками

Специальность 03.00.02 — Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва, 2007 г.

003052115

Работа выполнена на кафедре биоинженерии Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова и в Лаборатории структурной биологии Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Научный руководитель:

Доктор физико-математических наук,

доцент Р.Г. Ефремов

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук A.B. Веселовский

Доктор физико-математических наук,

профессор А.Н. Тихонов

Ведущая организация:

Московский Физико-Технический Институт

Защита диссертации состоится «5» апреля 2007 г. в_ на заседании Диссертационного совета Д 501.001,96 Биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет, кафедра Биофизики, аудитория «Новая».

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан « » марта 2007 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор Т.Е. Кренделева.

1. Общая характеристика работы

1.1. Актуальность проблемы

Мембранные белки (МБ) — объекты исключительной биологической и биомедицинской важности, среди функций которых можно назвать рецепцию сигналов, транспорт веществ, создание и поддержание трансмембранных (ТМ) потенциалов и др. МБ составляют не менее трети всех синтезируемых клеткой белков (Wallin & von Heijne, 1998). Одним из важнейших классов МБ являются так называемые рецепторы, действие которых опосредовано G-белками1, составляющие 1-5% всех кодируемых белков в геномах множества организмов. Об их чрезвычайной фармакологической важности говорит тот факт, что более половины всех выпускаемых в настоящее время лекарственных препаратов действует на эти рецепторы (Klabunde & Hessler, 2002). С их дисфункцией связано большое число заболеваний (Schôneberg étal, 2004), и их терапевтический потенциал, по сути, только начинает осваиваться. Наличие'пространственной структуры рецепторов семейства GPCR является ключом к конструированию нового поколения эффективных и безопасных лекарств, действие которых направлено на эти рецепторы. К сожалению, возможности экспериментальных методов определения пространственной структуры МБ пока крайне ограничены и не могут полностью удовлетворить запросов фармацевтической индустрии. На сегодняшний день только для одного белка из семейства GPCR известна пространственная структура высокого разрешения — фоторецептора родопсина, выделенного из сетчатки быка (Palczewski étal., 2000). В условиях отсутствия структур других GPCR, определенных экспериментальными методами, оправдано использование методов молекулярного моделирования для предсказания структуры этих белков.

Выделяют две группы подходов к молекулярному моделированию GPCR: (1) ab initio (Schueler-Furman et al., 2005; Yarov-Yarovoy et al., 2006) — без использования данных о структуре родственных белков (но, как правило, с учётом семиспиральной ТМ топологии этих рецепторов) и (2) подход моделирования на основании гомологии с родственным белком-«шаб-лоном» (в случае GPCR, в основном, родопсином), структура которого определена экспериментальными методами (Hillisch et al., 2004). Однако в связи с различием функций, выполняемых моделируемым белком и структурным шаблоном, получаемые модели необходимо оптимизировать с учетом

1 Английское название этих рецепторов — G-protein coupled receptors (GPCR] Эта общепринятая аббревиатура в дальнейшем будет использоваться для их обозначения

Список других сокращений, использованных в работе' МБ— мембранный белок; ТМ — трансмембранный; MT, и МТ2— рецепторы мелатонина; ОФ— оценивающая функция; ОФМБ — оценивающая функция для МБ, CKO — среднеквадратичное отклонение; МГП — молекулярный гидрофобный потенциал; PDB — Брукхейвенский банк данных белковых структур (Protein Data Bank).

их биологической специфики. При оптимизации теоретических моделей (в частности, корректировке взаимной ориентации ТМ а-спиралей) необходимо учитывать все возможные экспериментальные данные — такие, как информацию о функционально важных остатках или расстояниях между отдельными группами белка, а также общие принципы упаковки МБ, наблюдаемые в известных структурах.

Для уже построенной модели необходимо иметь возможность оценить качество ее упаковки — согласие с закономерностями строения МБ с известной структурой. Такое знание можно использовать для дополнительной оптимизации моделей и устранения присутствующих в них ошибок. В литературе описаны примеры использования для оптимизации теоретических моделей таких характерных особенностей строения МБ как распределение гидрофобных и вариабельных свойств ТМ сегментов, а также склонностей тех или иных остатков находиться в области контакта с мембраной или образовывать интерфейс с другими спиралями белка. Наличие пространственных структур МБ атомного разрешения позволяет исследовать и более тонкие параметры организации, учитывающие микроскопическое окружение индивидуальных остатков, такие как полярность ближайших групп белка и степень заглубленности остатка в белковую молекулу. До сих пор не предложено методов оценки качества упаковки МБ (аналогичных уже созданным для глобулярных белков (Bowie etal., 1991; Delarue& Koehl, 199BJ), основанных на анализе микроокружений отдельных остатков в структурах высокого разрешения. Необходимость создания методов оценки, оптимизированных специально для МБ, диктуется существенными физико-химическими различиями сред, в которых существуют глобулярные и мембранные белки и, следовательно, серьезными отличиями в их пространственной организации.

Одной из основных областей применения пространственных моделей структуры белка является моделирование связывания лигандов (как правило, низкомолекулярных веществ, при взаимодействии с которыми рецептор запускает определенную биологическую реакцию). Такое моделирование производится с помощью алгоритмов молекулярного докинга. Основными ограничивающими факторами в этой области являются: (1) недостаточный учёт молекулярной подвижности белка-мишени и (2) эмпирический и неточный расчет свободных энергий связывания белок-лиганд. Применение дополнительных критериев при оценке «решений» докинга (предсказанных конформаций комплекса белок-лиганд), таких, как степень гидрофобного/гидрофильного соответствия лиганда и его сайта связывания, может оказаться полезным для улучшения предсказаний, выдаваемых программами докинга.

В данной работе для моделирования выбраны два белка семейства GPCR — рецепторы мелатонина MTt и МТ2 человека. Мелатонин — это важный нейрогормон, принимающий участие во множестве жизненных про-

цессов — от сна и циркадных ритмов до иммунитета, поэтому изучение структуры его рецепторов может ускорить разработку нового поколения лекарств — безопасных регуляторов сна и общей активности организма.

1.2. Цели исследования

■ Построить и оптимизировать для связывания с лигандами модели пространственной структуры рецепторов мелатонина МТ1 и МТ2 человека. С помощью этих моделей объяснить селективность ряда аналогов мелатонина к одному из подтипов рецепторов;

■ Разработать новый метод оценки качества упаковки ТМ а-спиральных сегментов мембранных белков, основанный на анализе доступных экспериментальных структур МБ высокого разрешения;

■ Изучить возможность применения критерия комплементарности молекулярного гидрофобного потенциала (МГП) в сайтах связывания белок-лиганд для улучшения качества предсказания алгоритмов молекулярного допинга.

1.3. Основные результаты, выносимые на защиту

1. Построены и оптимизированы для связывания с лигандом модели пространственной структуры рецепторов мелатонина МТХ и МТ2 человека. Модели позволяют объяснить экспериментальные данные по связыванию и селективности ряда аналогов мелатонина;

2. Анализ пространственной организации набора экспериментальных структур МБ позволил создать метод оценки качества упаковки их ТМ доменов. Метод позволяет идентифицировать в больших наборах теоретических моделей конформации, наиболее близкие к на-тивной структуре;

3. Для ряда исследованных кристаллографических комплексов рецеп-тор-лиганд показано, что подход МГП-комплементарности уверенно разграничивает близкие к нативной структуре комплекса («хорошие») и некорректные («плохие») решения, позволяя значительно улучшить результаты докинга.

1.4. Научное значение и новизна работы

Все представленные в работе результаты получены впервые. Проблема селективности лигандов между несколькими родственными рецепторами очень актуальна в фармакологии, но изучение соответствия гидрофобных характеристик лиганда и его белкового сайта связывания до сих пор почти не использовали для объяснения и предсказания селективности. Хотя предпринимается довольно много попыток улучшить предсказательную силу алгоритмов докинга (например, комбинируя различные оценивающие функции), учёт гидрофобных эффектов, весьма важных для взаимодействия рецептор-лиганд, практически не производится. На ряде примеров

мы показываем, что такой учёт может существенно улучшить результаты стандартных алгоритмов.

Разработанный критерий оценки качества упаковки ТМ а-спиральных доменов также является новым перспективным инструментом при моделировании структуры МБ, в частности, рецепторов семейства GPCR. Мы показываем, что, в отличие от предлагаемого подхода, аналогичные методы, разработанные для глобулярных белков, не позволяют решить важнейшую для подобного оценивающего метода задачу— надёжно идентифицировать нативную (или близкую к ней) структуру среди набора теоретических моделей, в том числе содержащих ошибки.

1.5. Практическое значение работы

Предложенные в работе методы найдут своё применение при построении и оптимизации теоретических моделей рецепторов семейства GPCR, а также других МБ. В частности, применение метода оценки качества упаковки МБ позволит получить модели, находящиеся в лучшем согласии с общими принципами организации МБ, нежели модели, полученные в результате непосредственного моделирования на основании гомологии или из ab initio предсказаний. Метод численной оценки соответствия гидрофобных свойств лиганда и активного сайта белка позволит с большей вероятностью идентифицировать активные соединения и точнее предсказывать структуры комплексов белок-лиганд, чем стандартные алгоритмы докин-га.

Указанные возможности чрезвычайно востребованы в фармацевтической промышленности и сфере направленного дизайна новых лекарственных веществ. Особенно актуальной в последнее время является разработка высокоаффинных и селективных лигандов GPCR рецепторов, для осуществления которой необходимы точные пространственные модели этих белков.

1.6. Публикации и апробация

Основные результаты изложены в 4 статьях, опубликованных в российских и международных журналах. Материалы работы докладывались на 14-й международной конференции «Математика. Компьютер. Образование» (Пущино, 2007), 19-й зимней молодёжной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» [Москва, 2007), 4-й и 5-й международных конференциях «Биоинформатика регуляции и структуры генома» (Новосибирск, 2004, 2006), 1-й международной конференции «Математическая биология и биоинформатика» (Пущино, 2006), 8-х чтениях, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2006), 1-м международном конгрессе по молекулярному моделированию (Касабланка, 2005), 7-й международной конференции по молекулярной биологии (Суздаль, 2004), 5-м международном симпозиуме

аспирантов (Европейская молекулярно-биологическая лаборатория, Гей-дельберг, 2004), Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Москва, 2003) и 17-м Франко-бельгийском конгрессе по фармацевтической химии (Брюссель, 2003).

1.7. Структура и объем диссертации

В Главе 1 (Введение) сформулированы основные задачи исследования, и обоснована его практическая важность. Глава 2 посвящена обзору литературы по современным методам моделирования вРСИ рецепторов и подходам к оценке качества упаковки белков. В Главе 3, состоящей из трех частей, описываются и обсуждаются полученные в работе результаты. Раздел 3.1 посвящен построению и оптимизации для связывания с лигандами моделей рецепторов мелатонина, в разделе 3.11 описывается разработка и тестирование метода оценки качества упаковки ТМ а-спиральных доменов МБ, а в разделе З.Ш исследована возможность применения метода МГП-ком-плементарности для улучшения результатов докинга. В Главе 4 подведены итоги работы, а также обсуждены перспективы применения полученных результатов. Подробное описание использованных в работе методов и алгоритмов дано в Главе 5.

Диссертация изложена на 91 странице машинописного текста, проиллюстрирована 37 рисунками и 9 таблицами. Список литературы включает 196 источников.

2. Основные результаты и их обсуждение

2.1. Моделирование структуры рецепторов мелатонина Л/1Т u МТ человека

Для моделирования были выбраны только ТМ области рецепторов, поскольку надёжное предсказание конформаций «петель» до сих пор остаётся одной из неоднозначных задач молекулярного моделирования. Кроме того, по данным мутагенеза (Conway etal., 1997, 2001}, важные для связывания мелатонина остатки находятся достаточно глубоко в ТМ домене. В качестве шаблона для моделирования был выбран бычий зрительный родопсин, так как он все еще остается единственным белком семейства GPCR, для которого получена экспериментальная пространственная структура (Palczewski etal., 2000). «Стартовые» модели рецепторов были построены с использованием парных выравниваний аминокислотных последовательностей рецепторов и родопсина, демонстрирующих гомологию в ТМ домене —40%, что считается достаточным для построения моделей. Предсказанные положения ТМ участков, а также позиции наиболее консервативных в каждой из семи спиралей остатков в случае каждого рецептора, совпали с таковыми в последовательности родопсина, подтверждая корректность используемых выравниваний. Получаемые «стартовые» модели не учитывают биологической специфики моделируемых белков и поэтому нуждаются в оптимизации с привлечением экспериментальных данных о возможном механизме взаимодействия рецептор-лиганд, о сопряженной с этим процессом «активации» рецептора, а также о гидрофобной и вариабельной организации семиспиральных МБ. В Качестве оптимизационной процедуры, способной удовлетворить набору экспериментальных ограничений, не нарушая при этом общей укладки белка, было предложено вращение ТМ сс-спирали 3 (ТМЗ) вокруг её оси в направлении, указанном на рис. 1. Такое вращение делает возможным одновременное образование трёх водородных связей, посредством которых осуществляется взаимодействие мелатонина с рецепторами. Кроме того, сравнение гидрофобной и вариабель-

Рисунок i. Схема предлагаемой оптимизации моделей рецепторов мелатонина для удовлетворения экспериментальным ограничениям. На рисунке схематично показано расположение ТМ спиралей в моделях рецепторов мелатонина при виде с внеклеточной стороны. В «стартовых» моделях рецепторов ориентация TM3 такова, что два функционально важных для взаимодействия с лигандом остатка (Ser!" и Ser5 '5; номенклатура no Ballesteros & Weinstein, 1995) находятся вне сайта связывания и недоступны для взаимодействия с ним (показаны кругами с темным фоном). Предлагаемое для оптимизации моделей вращение ТМ3 (изображено стрелкой) приведет оба остатка в область, доступную для взаимодействия с лигандом (круги на светлом фоне), ß ТМ5 показан третий остаток, важный для связывания мелатонина (His[,"í').

Рисунок 2. Структура сайта связывания мелатонина н модели МТ (слева) и МТ, (справа). Остовы ближайших к сайту связывания ТМ спиралей изображены трубками. Выведены боковые цепи остатков, участвующих а образовании активных сайтов. Молекула мелатонина, а также остатки, с которыми он образует водородные связи, показаны толстым» линиями.

ной организации ТМ доменов полученных моделей и структуры родопсина показывает, что предлагаемое вращение приведет эти характеристики рецепторов в лучшее согласие с наблюдаемыми и экспериментальной структуре.

Оптимальный угол поворота ТМЗ для каждой модели был выбран, основываясь на совместном использовании следующих критериев: (1) минимального нарушения геометрии трех водородных связей, посредством которых мелатонин взаимодействует с рецепторами; [2] максимального значения оценивающей функции (ОФ) GOLD Score при допинге мелатонина в активные сайты и [3] наилучшего «качества» упаковки спиралей в моделях рецепторов, согласно гак называемой 3D4D функции (Bowie etal., 1991). Эти углы оказались равными 35° и 15" дли моделей рецепторов MTt и МТ.„ соответственно. В дальнейшем эти модели (рис. 2] использовали для объяснения селективности некоторых аналогов мелатонина к одному из подтипов рецепторов, основываясь на различиях пространственного распределения гидрофобных/гидрофильных свойств в сайтах связывания лигандов.

Численная характеристика гидрофобных свойств основывалась на концепции «комплементарности» молекулярного гидрофобного потенциала (МГП; Furet et al., 1988; Fauchère etal., 1988), рассчитываемого на молекулярной поверхности лиганда. «Комплементарность» определили как долю точек поверхности лиганда, в которых гидрофобные характеристики, создаваемые лигандрм и белком, совпадали (по принципу «полярное — к полярному, неполярное — к неполярному»]. На рис. 3 приведена поверхность мелатонина, раСКрашенная в соответствии с разницей гидрофобное™ ок-

Рисунок з. Различий гидрофобных характеристик сайтов связывания в рецепторах МТ и МТ,.

А. Молекулярная поверхность мелатонина, окрашенная в соответствии с величиной разности МГП в данной точке (0} в комплексе с МТ и МТ. Области поверхности с 0<о (где окружение мелатонина в комплексе с МТ более гидрофобно, чем в комплексе с МТ), окрашены черным, а с 0>о — серым. 5. Структура мелатонина (в той же конфирмации, что и в случае А). Символы "о", "о" и "■" около позиций 1,2, 6 и 7 индольного кольца изображают потенциальные заместители, придающие производному лиганду селективность к МТ, (показано кругом) или МТ (показано квадратом) рецепторам в случае гидрофобной (белый цвет) или гидрофильной (черный цвет) природы заместителя.

Таблица 1. Экспериментальные данные по селективности и расчётные значения комплементарнос-ти МГП для некоторых аналогов мелатонина по отношению к рецепторам МТ, и МТ.

н ч-с3н7

MIT, R = H

1, R1 =Bertzyl, R2-H

2. R1 = CI, R2 = H

3, 8M-PD0T

H,GÖ

Соединение Селективность Комплементарность МГП н комплексе Ссылка

сМТ, с МТг

МЛТ- Не селективен 0.52 0.52 Мог et al., 2001

1 МТ, 0.S5 0.60 Dubocovich et al 1997

2 мт; 0.52 0.S4 DuhocoviclU'tiji., 1997

3 МТ, 0.4В 0.S0 Dubocovich et al., 1997

4 МТ, 0.54 0.57 Faustet а/., 2.000

5 МТ, 0.56 0.57 Yoiisecai., 2003

6 МТ, 0.60 0.41 Sun et «/.,2004

а M/IT — мела тони н

ружения мелатонина в комплексах с МТг и МТ2. Эти отличия использовали для объяснения селективности аналогов мелатонина, содержащих заместители в некоторых позициях индольного кольца. Предложенная модель селективности (см. подпись к рис. 3) и подход комплементарности МГП позволили для ряда соединений, селективных к одному из рецепторов мелатонина, объяснить эти свойства (см. табл. 1).

Выводы (!)

1. Построены и оптимизированы для связывания с лигандом модели ТМ доменов рецепторов мелатонина МТг и МТ2 человека. Модели позволяют объяснить экспериментальные данные по связыванию и селективности ряда аналогов мелатонина;

2. Дальнейшее уточнение моделей требует разработки метода оценки качества упаковки белковой цепи (см. раздел 2.II], оптимизированного для мембранных белков;

3. Наблюдаемые закономерности гидрофобного/гидрофильного соответствия в сайтах белок-лиганд могут оказаться универсальными и перспективными для улучшения результатов докинга (см. раздел 2.III).

2.11. Метод оценки качества упаковки ТМ доменов а-спиральных мембранных белков

Разработка эмпирической Оценочной Функции для Мембранных Белков (ОФМБ) основывалась на анализе структурных особенностей белков «обучающего» набора, в который вошли 26 кристаллографических структур неродственных а-спиральных МБ, полученных с высоким разрешением2. Границы ТМ области вычисляли путем «сканирования» модели пространственной структуры белка, ориентированной вдоль нормали к мембране, «виртуальным гидрофобным слоем» (Efremov eta/., 1999, 2001) переменной толщины, имитирующим гидрофобное окружение, характерное для МБ. В случае каждого белка был идентифицирован единственный минимум энергии взаимодействия с «мембраной», соответствующий оп-

2 В «обучающий» набор вошли структуры ТМ доменов бактериородопсина (код РОВ. 1СЗ\У), га-лородопсина (1Е12), сенсорного родопсина I и II (1Н68 и 1ХЮ, соответственно), зрительного родопсина (1Ш9), рН-зависимого К* канала (1К4С), механочувствительного канала (1М5Ь), ионо-обменника Н*/СГ (1КРЦ, аквапорина-1 (114Ы), аквапорина Ъ (1ЯС2), акваглицеропорина (1РХ8), аммониевого канала (1Х(^Е), белка системы выброса ксенобиотиков АсгВ (ИМ/б), переносчика глицерол-3-фосфата (1Р\№Ц, переносчика витамина В12 (1Ь7У), кальциевой АТФазы [1Би4), роторов №*-АТФаз V- и Р-типа [2ВЬ2 и 1УСЕ, соответственно), комплекса фумарат редуктазы (1(2ЬА), сукцинатдегидрогеназы [ШЕК), цитохром С оксидазы (1ЕНК), комплексов цитохромов Ьс1 (1Е2У и 1ВСС), формат дегидрогеназы (1К(}Р), нитрат редуктазы А (Щ16) и митохондри-ального АДФ/АТФ антипортера (10КС). Структуры фотосинтетических белков не вошли в этот список по причине наличия большого числа молекул пигментов в ТМ домене, видимо, изменяющих характер межспирального взаимодействия, характерного для других МБ.

О 0.4 0.8 0 0.4 0.8 0 Ь=0.05 а=0.7 1

р1 р1 р'

1 р ' р р

Рисунок 4. Классы белок-мембранного окружения для аминокислотных остатков в МБ. А. Распределения параметров, характеризующих окружение остатков аргинина и лейцина из обучающего набора. Каждая точка на графике соответствует одному остатку. Черная точка соответствует положению остатка вблизи центра мембраны, серая — в области границы мембран а-вода толщиной 5 А. 6. Предлагаемая схема классов белок-мембранного окружения, основанная на распределении параметров из А. Класс 1 соответствует остаткам, экспонированным в мембрану (близость к нулю обоих параметров Рр' и £ 1 означает, что почти вся площадь поверхности остатка доступна мембране), классы 2 и з ■— частично заглубленным, а 4 и 5 — полностью заглубленным в белок остаткам. Классы 2 и 4 заселены остатками с неполярным, а з и5 — с полярным окружением. Точные значения параметров а, Ь и tgа определяли из условия максимума значения ОФМБ для всего обучающего набора.

тимальным положению белка относительно центра мембраны и толщине мембраны. В случае применения (г глобулярным белкам эта процедура давала профиль энергии взаимодействия с максимумом вблизи центра слоя, что свидетельствует об их несовместимости с мембраной. Б обучающий набор вошли остатки а-спиралей, расположенные в области «гидрофобного слоя» (4991 остаток в 217 ТМ спиралях).

Предлагаемый метод оценки качества упаковки основывается на характеристике окружения каждого остатка в структуре и вычислении эмпирических вероятностей нахождения того или иного остатка в определенном окружении, основываясь на анализе организации МБ обучающего набора. Для характеристики окружений остатков выбрали параметры Р 1 и Рг]р1, которые равны долям площади поверхности остатка, находящейся в контакте с полярными или неполярными атомами других остатков, расположенных в смежных ТМ а-спиралях, соответственно. Примеры распределения Р 1 х Ргф! для остатков лейцина и аргинина из обучающего набора, а также графическое определение классов белок-мембранного окружения, основанное на значениях Р 1 и Р ^ приведены на рис. 4.

Распределения на рис. 4А позволяют заметить, что остатки аргинина реже встречаются в ТМ доменах, чем остатки лейцина, а если и встречаются, то в основном на границе с водой. Остатки лейцина, Напротив, тяготеют к центральной области мембраны и предпочитают либо экспони-

остатки: 1 2 3 4 5

ALA 0.09 -0.33 -0.10 0. ,29 0.64

ARC -0.04 -0.94 0.51 -1, ,20 0.82

ASN 0.21 -1.05 0.56 -1. ,13 0.60

ASP -0.04 -1.12 0.86 -1. ,67 -0.09

CYS -0.42 -0.23 0.25 0. ,71 -0.41

GLN -0.22 -1.02 0.66 -0. ,18 0.38

GLU -0.56 -0.77 0.57 -0. ,34 0.63

GLY -0.16 -0.32 -0.15 0. .36 0.79

HIS -0.72 -0.55 0.90 -0. .97 -1.87

ILE 0.27 0.40 -0.65 -0. ,19 -2.29

LEU 0.10 0.34 -0.53 0, ,01 -0.97

LYS 0.48 -0.78 0.64 -2. ,02 -0.15

MET -0.21 0.44 -0.74 0. ,19 -1.27

PHE -0.20 0.25 -0.28 0, ,26 -0.64

PRO -0.36 -0.38 0.50 -0, ,87 0.35

SER -0.25 -0.51 0.54 -0, ,37 0.23

THR -0.19 -0.19 0.22 -0, .11 0.30

TRP -0.31 0.11 0.10 -0, .11 -0.32

TYR -0.58 -0.40 0.44 -0. .21 0.46

VAL 0.28 0.10 -0.12 0, .03 -0.81

рованные ПОЗИЦИИ (класс 1; СМ. Таблица 2. Предпочтения остатков к классам бе-

ПОДПИСЬ К рис. 4Б), либо частично лок-мембранного окружения_

заглубленные, неполярные ПОЗИ- 0статки__Классы окружения:

ции (класс 2). Остатки аргинина, если все же оказываются в центральной области мембраны, находятся в полярном окружении заглубленных классов (3 и 5), свидетельствуя о невыгодности взаимодействия полярного заряженного остатка с неполярным окружением. Чтобы численно охарактеризовать эти предпочтения, мы ввели «оценивающую функцию для мембранных белков» (ОФМБ), описывающую частоту встречаемости того или иного типа остатка в определенном окружении в обучающем наборе: ОФМБу = 1п(рурр, где Ptj — вероятность найти остаток типа / в классе у, a Pt — вероятность того, что остаток любого типа попадет в класс j («заселенность» класса). Положительные значения ОФМБ говорят о склонности данного остатка занимать этот класс в экспериментальных структурах, а отрицательные — о том, что данный остаток встречается в этом классе крайне редко, реже других типов остатков (см. табл. 2).

Предложенный метод концептуально схож с известным методом профилей трехмерного окружения Айзенберга (Bowie étal., 1991), однако между ними есть важные отличия. Во-первых, в отличие от метода 3D профилей, параметризованного с использованием 16 структур глобулярных белков, алгоритм оценки качества упаковки МБ разработан специально для ТМ а-спиральных доменов и учитывает их структурные особенности. Во-вторых, он рассматривает остатки только в одном типе вторичной структуры — а-спирали, т.к. в настоящей работе исследовали именно этот класс МБ (всего известно 2 суперсемейства МБ — а-спиральные и (3-структурные белки, а неупорядоченная структура крайне невыгодна в неполярном мембранном окружении). И, наконец, предложенная схема классов окружения существенно отличается от таковой в методе Боуи и Айзенберга.

Для белков обучающего набора показана линейная зависимость значения ОФМБ (равного сумме значений по всем остаткам) от длины последовательности ТМ домена (L), что даёт возможность сравнивать «качество» упаковки теоретических моделей с таковым для белков с экспериментально определенной структурой и обладающих близким значением L (рис. 5). Кросс-валидация метода и использование альтернативных наборов обуча-

ложение кристаллографической структуры родопсина (PDBId: 1U19) отмечено стрелкой. На врезке: зависимость ОФМБ для набора теоретических моделей родопсина от среднеквадратичного отклонения (СКО) от кристаллографической структуры (отмечена белым кругом).

ющих и тестовых данных подтверждают, что метод ОФМБ является весьма устойчивым и надежным, а используемый набор данных— представительным и не приводит к переопределению метода.

На рис. 5 также приведены данные о собранных из открытых источников теоретических моделях родопсина, предложенных до выхода его кристаллографической структуры, а также построенных с помощью общедоступных средств моделирования специально для целей тестирования метода ОФМБ. Метод оценки качества упаковки МБ позволяет однозначно идентифицировать кристаллическую («корректную») структуру родопсина —для нее значение оценивающей функции значительно больше, чем для остальных моделей. Кроме того, имеется четкая связь между близостью модели к нативной структуре (в терминах величины среднеквадратичного отклонения (СКО), см. врезку на рис. 5) и значением ОФМБ. Как правило, лучше оцениваются те модели, которые при построении были тщательно оптимизированы авторами и уже post factum (после публикации кристаллографической структуры родопсина) демонстрируют меньшее значение СКО, чем те, которые были построены в полностью автоматическом режиме на общедоступных веб-серверах и часто содержат грубые ошибки, допущенные при выравнивании последовательностей или на других стадиях моделирования.

36<r

30 40

3D-1D функция

т-ЙЩ.

ОФМБ

Рисунок 6. Распределения значений оценивающих функций для ансамбля «ротамерных» конфор-маций зрительного родопсина. A. 3D-1D функция Боуи и Айзенберга (Bowie et a/., ig91)- Б. Функция оценки качества для мембранных белков (ОФМБ). Положение кристаллографической структуры («нулевого» ротамера) отмечено стрелкой.

Задача идентификации правильной (или близкой к правильной) структуры среди сколь угодно большого набора теоретических моделей является одной из ключевых в молекулярном моделировании. Метод 3D профиля, разработанный для глобулярных белков (Bowie étal, 1991), гораздо хуже справляется с этой задачей в случае МБ, чем предлагаемый нами метод. Например, не позволяет отличить кристаллическую структуру родопсина от компьютерных моделей — значение 3D-1D ОФ в первом случае либо не самое высокое, либо разрыв со следующей по порядку моделью крайне невелик. Что еще более важно, при использовании этого метода, не предназначенного для работы с МБ, теряется корреляция между значениями оценочной функции и СКО от нативной структуры.

Чтобы более подробно сравнить возможности этого «классического» метода оценки качества и подхода, разработанного специально для МБ, был предложен следующий тест. В кристаллическую структуру родопсина вносили изменения, которые, учитывая тонкую организацию МБ, должны почти наверняка соответствовать нестабильным конформациям белка. Эти изменения заключались в систематическом повороте всех ТМ ос-спиралей вокруг своих осей как твердых тел и оптимизации получаемых моделей-«ротамеров» для устранения грубых атомных наталкиваний. С учетом независимого вращения всех семи спиралей и выбора шага вращения 90°, мы получили более 16000 конформаций, среди которых только одна («нулевой ротамер») соответствовала кристаллической структуре. Результаты применения обоих методов оценки к этому набору конформаций приведены на рис. 6.

Метод трехмерных профилей оказался неспособным идентифицировать «корректную» структуру среди сгенерированного ансамбля ошибочных моделей, поместив ее вблизи математического ожидания распределения, приведенного на рис. 6А. Метод оценки качества упаковки МБ оказался значительно более чувствительным (рис. 6Б), поместив «нулевой» ро-тамер в самый верх списка, за пределы За диапазона от математического ожидания распределения значений ОФМБ. Более того, лишь ~4% структур получили положительное значение ОФМБ, что фактически исключает необходимость рассмотрения большей части полученных конформаций.

Возможность метода оценки качества упаковки МБ идентифицировать близкую к нативной конформацию (т.е., демонстрировать корреляцию значения ОФМБ и СКО модели от нативной структуры) была показана еще на нескольких примерах. Так, при построении моделей бычьего акваропори-на-1 (чья экспериментальная структура известна) по гомологии с шаблонами с различной степенью эволюционного родства и разным разрешением экспериментального метода, использовавшегося для получения структуры шаблона, было показано, что наиболее близкие к нативной структуре модели получают самые высокие значения ОФМБ. Напротив, модели, при построении которых были допущены ошибки, и которые вследствие этого оказываются достаточно далеки от нативной структуры (в терминах СКО), получают очень низкие (отрицательные) значения ОФМБ (рис. 7). Такие ошибки моделирования как сдвиги на аминокислотном выравнивании чрезвычайно чётко идентифицируются методом ОФМБ, поскольку подобный сбой характерен тем, что сразу большое число остатков оказывается в неестественном окружении и, следовательно, характеризуется низким «качеством» упаковки.

Корреляция ОФМБ и СКО от нативной структуры сохраняется и в диапазоне «высоких разрешений» (СК0<2 А). Для двух МБ с известной структурой, родопсина и цитохром С оксидазы, построили серию моделей с идентичной конформацией основной цепи и отличающейся упаковкой боковых цепей, причём эти модели соответствуют промежуточным состояниям непрерывного перехода из модели с квазислучайными конформациями боковых цепей «обратно» к нативной структуре (рис. 8). Высокий уровень антикорреляции ОФМБ и СКО от нативной структуры (коэффициент -0.8ч—0.9) позволяет практически однозначно выбрать близкие к нативной структуре модели только по значению оценивающей функции.

♦

• 1г ♦ *

□

0 ь о дд> л

ОФМБ /Л

1 _ Кристаллическая структура (1U19)

♦ ♦ ♦ ♦

♦

♦ ♦ ♦ «Реконструированная»

структура ♦♦ 1

1 ско, А

Рисунок 7. Зависимость значений ОФМБ для моделей бычьего аквапорина-1 от СКО от нативной структуры (изображена белым кругом). Шесть серий из десяти моделей бычьего аквапорина-1 в каждой построены на основании гомологии с несколькими шаблонами с различной степенью родства. Одному из шаблонов — акваглицеропорину (код РОВ: 1РХ8) — соответствуют две серии моделей, основанных на корректном (белые треугольники) и ошибочном (черные треугольники) выравниваниях.

ОФМБ

Кристаллическая

структура (1ЕНК)

♦ ♦

«Реконструированная) структура

ско, А

0 05 1 15 20 05 д 15 2

Рисунок 8. «Движение в направлении нативной структуры» в оценке методом ОФМБ. Приведена зависимость значений ОФМБ от СКО от нативной структуры для моделей родопсина (А) и ци-тохром С оксидазы (Б) с альтернативной упаковкой боковых цепей (во всех приведенных моделях конформация основной цепи идентична таковой в соответствующей кристаллической структуре). Кристаллические структуры обозначены черными кольцами, черные круги соответствуют моделям с квазислучайными конформациями боковых цепей, ромбы — промежуточным этапам перехода к нативной структуре.

Выводы (II)

1. На основе анализа структур МБ высокого разрешения разработан новый метод оценки «качества» упаковки а-спиральных ТМ доменов;

2. Для белков обучающего набора и других экспериментальных структур показана корреляция значения ОФМБ и длины ТМ домена, что дает возможность оценивать качество отдельно взятой теоретической модели;

3. На ряде примеров показано, что функция оценки качества упаковки МБ способна идентифицировать близкие к нативной структуре теоретические модели;

4. Предложенный метод может использоваться при оптимизации упаковки ТМ доменов в теоретических моделях МБ, в частности, рецепторов семейства СРСЯ.

2.III. Новый подход к улучшению результатов допинга

В первой части работы (см. 2.1) было показано, что гидрофобные/гидрофильные взаимодействия играют важную роль в связывании лиганда с мишенью, и изучение их распределений может помочь объяснить селективность ряда лигандов к одному из подтипов рецепторов мелатонина. Кроме того, было сделано предположение, что «комплементарность» гидрофобных свойств в сайтах связывания лигандов может являться одной из важных характеристик комплексов рецептор-лиганд, и что учёт этой комплементарности может быть использован для увеличения предсказательной силы современных алгоритмов докинга, не рассматривающих гидрофобные взаимодействия при оценке решений. Целью данной, заключительной, части работы является проверка применимости предложенного подхода комплементарности молекулярного гидрофобного потенциала (МГП) для улучшения предсказательной способности докинга (то есть, идентификации решений, близких по СКО к кристаллическим структурам комплексов). При этом использовали набор из 132 кристаллографических структур комплексов белков с лигандами, для которых проводили докинг «изъятых» лигандов обратно в их сайты связывания и сравнивали результаты, получаемые как с использованием стандартной функции GOLD Score, так и при ранжировании получаемых решений с помощью подхода МГП-комплементарности (в каждом случае сохраняли по 100 решений).

Свойства гидрофобного соответствия рассчитывали на молекулярной поверхности лиганда, выступающей в качестве сайта связывания. Комплементарность (Сотр!) определяли как долю точек поверхности, в которых гидрофобные характеристики, создаваемые лигандом и белком, совпадают. Для этого использовали независимые для белка и лиганда «пороговые» значения МГП, разграничивающие «полярный» и «неполярный» диапазоны. Так, считали, что лиганд создает в точке / поверхности полярные свойства, если Mrn/'^scut, («пороговое» значение для лиганда, "ligand"), и неполярные — если MrnillEand>cwt(. Аналогично, для белка использовали «пороговое» значение cutp ("protein").

Расчёт комплементарности для полного набора кристаллографических комплексов3 показал, что в большинстве случаев гидрофобное/гидрофильное соответствие довольно высоко (Сотр1> 0.5). Особенно это верно для достаточно больших лигандов, поскольку величина эффекта гидрофобных взаимодействий пропорциональна площади контакта белка с лигандом.

Основное внимание было уделено тем комплексам, для которых удалось показать существенное различие комплементарности МГП между «хорошими» (СКО<3.5 А от структуры нативного комплекса) и «плохими» решениями докинга. Оптимальные параметры расчёта комплементарнос-

3 В этом случае использовали «естественную» границу полярного и неполярного диапазона значений МГП cut, = cutp - 0.

Таблица 3. Комплексы, для которых удаётся достигнуть высокой (0м<*>0.25) разницы комплемен-тэрности МГП между «хорошими» (СНО^З-5 А от структуры нативного комплекса) и «плохими» решениями докинга.

Код 2PLV 2АКЗ 1ЕАР 1CTR IGLQ 1IVE ICHS IHR! 1ETR 1ALC 1ТШ

РОВ

cue* -0.30 -1.00 -0,15 0.55 -0.80 -0.15 0.25 0.35 -0.60 0.15 -0.20

cut р 0.25 -0.85 -0.30 0,05 -0.20 -1.00 -0.10 0.50 -0.55 -0.65 -0.60

D mate 0.65 0.47 0.37 0.32 0.32 0.31 0.30 0.29 0.29 0.28 0.27

* cut, и cutp— параметры, разграничивающие полярный и неполярный диапазоны значений МГП для лиганда и белка, соответственно. Приведенные значения соответствуют «оптимальным» параметрам границ, при которых достигается максимальное значение 0(0^). DrBiti — максимальная разница средней ком племен тар ноет и между «хорошими» и «плохими» решениями докинга в каждом из комплексов, соответствующая приведенным значениям cut, и cut .

2PLV

# решений

2АКЗ

# решений

□ «Плохие» решения (СКО > 3.5 А)

■ «Хорошие» решения

nit

1ЕАР

# решений

Comp!.

0,1 0.4 0-6 0.& 1 0.4 9

Compl

Рисунок д. Распределения комплементарное™ МГП для «хороших» (черный цвет) и «плохих» (серый цвет) решений докинга в трех комплексах. По осям абсцисс и ординат отложены значения комплементарности и число решений докинга, соответственно. «Оптимальные» параметры, использовавшиеся в случае каждого комплекса для вычисления комплементарности (cut, и cutn), и соответствующие им значения разницы средней комплементарности «хороших» и «плохих» комплексов (0пщ>) приведены а табл. 3.

ти и значения разности комплементарности между «хорошими» и «плохими» решениями для некоторых из этих комплексов приведены в табл. 3. На рис. 9 в качестве примера приведены распределения комплементарности гидрофобных свойств для решений докинга в трех комплексах. Для приведенных комплексов эти распределения практически не перекрываются, давая возможность по величине комплементарности идентифицировать корректную структуру комплекса белок-лиганд.

Ранжирование решений докинга по значению комплементарности в ряде случаев дает улучшение по сравнению со стандартными результатами докинга, отсортированными по значению ОФ GOLD Score. На рис. 10 приведены результаты ранжирования решений но значению МГП-комп-лементарности и GOLD Score для тех же трёх комплексов, что и на рис. 9. «Лучшим» считается тот результат, для которого верхняя часть отсортированного списка решений обогащена «правильными» структурами ком-

2PLV

4 ещА

Шли.

J COU) Sore

I I

ill

2AK3

1EAP

CKD.Â

# n списке # п списке tt списке

Рисунок ю. Применение метода МГП-комплементарности для улучшения результатов докинга.

Для трёх комплексов приведено сравнение результатов, получаемых при ранжировании решений докинга по критерию МГП-комплементарности (чёрный цвет) и по стандартной ОФ COLD Score (белый цвет). По оси абсцисс дан номер решения в соответствующем отсортированном списке (первые Ю позиций), по оси ординат — СКО решения от кристаллической структуры. Комплементарность рассчитывали с «индивидуальными» параметрами (табл. 3).

Таблица 4. Рзнжировзние результатов докинга с использованием стандартной ОФ GOLD Score и критерия МГП-комплементарности

код PDB 2PLV 2ЛКЗ 1EAI> 1CTR 1GLQ tlVE 1CBS 1HKI 1ETR 1AEC 1TDB

^fj'xkî s 35 90 3 8 98 19 84 5 99 4

N 'cold 1 0 10 0 2 9 8 10 3 10 0

5 10 10 3 7 10 10 10 5 10 4

* — общее число «хороших» решений докинга для данного комплекса; N,U[D — число «хороших» решений а первой десятке при сортировке списка по значению стандартной ОФ COLD Score; NMH|, — число «хороших» решений в первой десятке списка, отсортированного по значению комплементарное™ МГП с «оптимальными» для каждого комплекса параметрами (см. табл. 3).

плексов (с СКО от кристаллической структуры, не превышающим 3.5 А). В случае комплекса 2PLV программа GOLD помещает только одно «правильное» решение в первую десятку списка, но не на первую позицию. СКО остальных девяти решений превышают 6 Â. При использовании метода МГП-комплементарности «в десятке» уже все пять «правильных» решений из сотни, причём они занимают позиции с первой по пятую. Для комплекса 2АКЗ все 10 решений G0LD оказываются «некорректными», а все 10 решений, отобранных по комплемеитарности МГП— корректными. Наконец, в случае комплекса 1ЕАР все 10 решений по обоим методам оказываются «корректными», что также является важным результатом, поскольку ни одно из «неправильных» решений (которые также присутствовали среди 100 решений докинга) не попало в верхнюю часть списка. Более подробно результаты докинга с применением ранжирования по МГП-комплементар-ности даны в табл. 4.

Как видно из табл. 4, применение критерия МГП-комплементарности с «оптимальными» параметрами позволило во всех случаях получить лучший результат, чем использование стандартной функции GOLD Score. Однако определение «оптимальных» параметров подразумевает использование структуры нативного комплекса, что в большинстве практических приложений может быть невозможно. Кроме того, не все исследованные

комплексы (из 132 исходных) продемонстрировали существенное различие комплементарности МГП между «хорошими» и «плохими» решениями. Таким образом, максимальный эффект от метода МГП-комплементарности применительно к ранжированию решений докинга стоит ожидать на определенном классе близкородственных мишеней и/или лигандов, хотя бы для одного из которых есть возможность оптимизировать параметры расчёта комплементарности.

Выводы (III)

1. Для ряда исследованных кристаллографических комплексов рецеп-тор-лиганд показано, что подход МГП-комплементарности уверенно разграничивает «хорошие» и «плохие» решения, позволяя значительно улучшить результаты докинга;

2. Хотя на данный момент этот подход не является универсальным, он может использоваться для практически важных задач, если его параметризация проведена на ограниченном классе мишеней и/или лигандов.

3. Основные выводы

Предложен ряд новых подходов к молекулярному моделированию ТМ доменов рецепторов, действие которых опосредовано G-белками:

1. Разработан новый метод оценки качества упаковки ТМ а-спиралей в молекулах белков. Подход основан на анализе 26 кристаллографических структур неродственных МБ и позволяет идентифицировать модели, близкие к нативной структуре. Кроме того, значение разработанной оценивающей функции (ОФМБ) коррелирует с длиной ТМ домена для структур белков обучающего и тестового наборов;

2. Предложен метод улучшения предсказательной силы докинга. Метод основан на анализе гидрофобного/гидрофильного соответствия в сайтах связывания 132 комплексов рецептор-лиганд. Во многих случаях удается получить лучший результат, чем при использовании стандартной оценивающей функции GOLD Score-,

3. Построены и оптимизированы для связывания с лигандом модели пространственной структуры ТМ доменов рецепторов мелатонина МТг и МТ2 человека. Модели позволяют объяснить ряд экспериментальных данных по селективности некоторых аналогов мелатонина к одному из рецепторов;

Эффективное совместное использование предложенных методик позволит оптимизировать процесс дизайна лекарственных препаратов, действие которых направлено на рецепторы семейства GPCR и другие мемб-

ранные белки.

4. Публикации по теме диссертации

1. Chugunov. А.О.. Farce, A., Chavatte, P., Efremov, R.G. (2006). Differences in binding sites of two melatonin receptors help to explain their selectivity to some melatonin analogs: a molecular modeling study./ Biomol Struct Dyn. 24, pp. 91-108.

2. Efremov, R.G., Chugunov. A.O.. Pyrkov, T.V, Priestle, J.P, Arseniev, A.S., Jacoby, E. (2007). Molecular lipophilicity in protein modeling and drug design Curr. Med. Chem. 14(4), pp. 393-415.

3. Чугунов A.O.. Новоселецкий В.H., Арсеньев A.C., Ефремов Р.Г. (2007). Новый метод оценки качества упаковки трансмембранных a-спиральных доменов в белках. Биохимия Т. 72(3), стр. 358-367. Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте "Biochemistry (Moscow)", Papers in Press, BM 06-279.

4. Chugunov. A.. Chavatte, P., Efremov, R. (2005). Molecular Modeling of Human MTt and MT2 Melatonin Receptors. In: Bioinformatics of Genome Regulation and Structure II. (Eds. N. Kolchanov and R. Hofestaedt) Springer Science+Business Media, Inc. 2005, pp. 259-270.

5. Новоселецкий В H., Чугунов А.О.. Ефремов Р.Г. (2007). Метод оптимизации моделей мембранных белков низкого разрешения. Тезисы 14-й международной конференции «Математика. Компьютер. Образование», Пущино, 22-27 января, стр. 176.

6. Chugunov. А.О.. Novoseletsky, V.N., Efremov, R.G. (2006). A method to assess correct/ misfolded structures of transmembrane domains of membrane proteins. Proceedings of 5th International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure, Novosibirsk, Russia, july 16-22, pp. 247-251.

7. Новоселецкий В.H., Чугунов Д.О., Ефремов Р.Г. (2006). Метод оценки упаковки трансмембранных a-спиралей в моделях мембранных белков VIII чтения, посвященные памяти академика Ю.А Овчинникова, Москва, 25-27 октября, стр. 85.

8. Novoseletsky, V.N., Chugunov А,p.. Efremov, R.G. (2006). Assessment of the packing quality of a-helical transmembrane domains. Proceedings of the 1st International Conference on Mathematical Biology and Bioinformatics, Pushchino, Russia, october 9-15, pp. 14-15.

9. Farce A., Chugunov A.O.. Loge С., Yous, S., Vergoten, G, Efremov, R.G , Berthelot, P., Chavatte, P. (2005). Modélisation des Récepteurs Mélatoninergiques. 1er Congrès International de Modélisation Moléculaire, Casablanca, Maroc, november 23-25, p. 25.

10. Chugunov. A.O.. Chavatte, P., Efremov, R.G. (2004). Molecular Modeling of Human MT, and MT2 melatonin receptors. Proceedings of the 4th International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure 1, Novosibirsk, Russia, july 25-30, pp. 372373.

11. Chugunov. A.O.. Chavatte, P., Efremov, R.G. (2004). Molecular Modeling of Human MTj and MT2 melatonin receptors. 7th International Conference on Molecular Biology, Suzdal, Russia, november 27-30

12. Chugunov. A.O., Efremov, R.G. (2004). Molecular Modeling of Human MTt and MT2 melatonin receptors 5th EMBL PhD Student International Symposium "Design of life — Learning from Nature", Heidelberg, Germany, december 2-4, p. 39.

13. Chavatte, P., Log, C., Chugunov. A.O.. Farce, A., Efremov, R.G., Vergoten, G., Lesieur, D. (2003). Modeles tridimensionnels des récepteurs melatoninergiques. 17™« Journées Franco-Belges de Pharmacochimie, Bruxelles, Belgium, may 22-23.

14. Чугунов A.P.. Loge С., Chavatte P., Ефремов Р.Г. (2003). Молекулярное моделирование рецепторов мелатонина MTt и МТ2. Российский симпозиум по химии и биологии

пептидов, Москва, 17-19 ноября, стр. 49.

5. Список цитируемой литературы

1. Ballesteros, J.A., Weinstein, H. (1995). Integrated Methods for the Construction of Three-Diraensional Models and Computational Probing of Structure-Function Relations in G-Protein-Coupled Receptors. Methods Neurosci. 25, 366-428.

2. Bowie, J.U., Luthy, R., Eisenberg, D (1991). A method to identify protein sequences that fold into a known three-dimensional structure. Science 253,164-170.

3. Conway, S„ Canning, S.J., Barrett, P., Guardiola-Lemaitre, B., Delagrange, P., Morgan, P.J. (1997). The roles of valine 208 and histidine 211 in ligand binding and receptor function of the ovine Mella beta melatonin receptor. Biochem. Biophys. Res. Commun. 239, 418-423

4. Conway, S., Mowat, E S., Drew, J.E., Barrett, P., Delagrange, P., Morgan, P.J. (2001). Serine residues 110 and 114 are required for agonist binding but not antagonist binding to the melatonin MTt receptor. Biochem. Biophys. Res. Commun. 282,1229-1236.

5. Delarue, M., Koehl, P. (1995). Atomic environment energies in proteins defined from statistics of accessible and contact surface areas./ Mol. Biol 249, 675-690.

6. Efremov, R.G., Nolde, D.E., Vergoten, G., Arseniev, A.S. (1999). Peptides in membranes: assessment of the effects of environment via simulations with implicit solvation model Theor. Chem Acc 101,170-174

7. Efremov, R.G., Volynsky, P.E., Nolde, D.E., Arseniev, A.S. (2001). Implicit two-phase solvation model as a tool to assess conformation and energetics of proteins in membrane-mimic media. Theor. Chem. Acc. 106,48-54.

8. Fauchere, J.-L., Quarendon, P., Kaettere, L. (1988). Estimating and representing hydro-phobicity potential./. Mol Graph. 6, 203-206.

9. Furet, P., Sele, A., Cohen, N.C. (1988). 3D molecular lipophilicity potential profiles: a new tool in molecular modeling./ Mol. Graph. 6,182-189.

10. Hillisch, A., Pineda, L.F., Hilgenfeld, R. (2004). Utility of Homology Models in the Drug Discovery Process. Drug Discov. Today 9, 659-669.

11. Klabunde, T., Hessler, G. (2002) Drug Design Strategies for Targeting G-Protein-Coupled Receptors. Chembiochem 10,928-944.

12. Palczewski, K, Kumasaka, T„ Hon, T„ Behnke, C.A., Motoshima, H., Fox, B.A., Le Trong, I, Teller, D.C., Okada, T„ Stenkamp, R.E., Yamamoto, M„ Miyano, M. (2000). Crystal Structure of Rhodopsin: A G-Protein-Coupled Receptor. Science 289, 739-745.

13. Schoneberg, T., Schulza, A., Biebermannb, H., Hermsdorf, T., Romplera, H„ Sangkuhl, K. (2004). Mutant G-protein-Coupled Receptors as a Cause of Human Diseases Pharmacol Ther. 104,173-206.

14. Schueler-Furman, 0., Wang, C., Bradley, P., Misura, K., Baker, D. (2005). Progress in Modeling of Protein Structures and Interactions. Science 310, 638-642.

15. Wallin, E., von Heijne, G. (1998). Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms. Protein Set. 7,1029-1038.

16. Yarov-Yarovoy, V., Schonbrun, J, Baker, D. (2006). Multipass Membrane Protein Structure Prediction Using Rosetta. Proteins 62,1010-1025.

Заказ № 83/02/07 Подписано в печать 15.02 2007 Тираж 100 экз Уел п л 1,5

ООО"Цифровичок",тел. (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 1 л.' www.cfr.ru; е-тай:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Чугунов, Антон Олегович

Список сокращений

Глава 1. Введение

Глава 2. Методы предсказания структуры G-белоксопряжённых рецепторов, оценки качества упаковки белковых цепей и моделирования взаимодействий белок-ли-ганд (обзор литературы)

2.1. Применение пространственных моделей белков на практике

2.II. Распространенные методы моделирования GPCR-рецепторов

2.11.1. Общая информация о GPCR-рецепторах

2.11.2. Методы моделирования ab initio

2.11.3. Методы моделирования на основании гомологии с родопсином

2.11.4. Возможные пути оптимизации моделей GPCR 19 . 2.III. Существующие методы оценки качества упаковки белков

2.IV. Моделирование белок-лигандных взаимодействий

2.V. Методы количественной оценки гидрофобных взаимодействий

2.VI. Объект исследования: рецепторы мелатонина MTj и МТ

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1. Молекулярное моделирование рецепторов мелатонина MTj и МТ

3.1.1. Построение «стартовых» моделей рецепторов

3.1.2. Анализ и оптимизация «стартовых» моделей

3.1.3. Выбор оптимального угла вращения а-спирали ТМЗ

3.1.4. Структурные различия сайтов МТХ и МТ2, модель селективности

3.1.5. Выводы (I) 40 3.II. Разработка нового метода оценки качества упаковки трансмембранных а-спиральных доменов белков

3.11.1. Подготовка и характеристика набора структурных данных

3.11.2. «Оценивающая функция для мембранных белков»

3.11.3. Тестирование метода

3.11.4. Выводы (II) 57 3.III. Новый подход к улучшению результатов докинга

3.III.1. Комплементарность гидрофобных свойств в кристаллографических комплексах белок-лиганд

3.HI.2. Применение численной оценки гидрофобного соответствия для улучшения результатов докинга

3.III.3. Выводы (III)

Введение Диссертация по биологии, на тему "Новые подходы к молекулярному моделированию трансмембранных доменов рецепторов, действие которых опосредовано G-белками"

Двадцать первый век часто называют «веком биологии» и предрекают, что многие проблемы; веками отягощавшие жизнь человечества (неизлечимые болезни, порог продолжительности жизни и другие), будут разрешены именно в XXI столетии. «Золотой» юбилей открытия структуры ДНК, отмечавшийся всего несколько лет назад, и практически законченные работы по секвенированию человеческого генома, равно как и геномов многих других организмов, знаменуют наступление новой, «постгеномной», эры в биологии. Интерес исследователей во многом сместился с того, как наследственная информация кодируется в молекулах ДНК, на выяснение роли и функций других макромолекул, содержащихся в клетках живых организмов, РНК и белков. Особенно важным представляется понимание механизмов взаимодействия белковых молекул с другими макромолекулами и низкомолекулярными соединениями в том числе, с лекарствами. Человечество уже довольно давно использует лекарственные препараты как естественного, так и искусственного происхождения. Новые подходы современной молекулярной биофизики привносят совершенно новые возможности в области создания новых лекарств, основываясь, как правило, на изучении молекулярных механизмов заболевания и структурных особенностей взаимодействия лекарства со своей биологической мишенью. Наличие пространственных структур белков-мишеней для терапии определенного заболевания является одним из ключевых аспектов в данной области. Однако по сравнению со многими современными молекулярно-биологическими методами, поставленными «на поток», определение пространственной структуры белков до сих пор является очень сложной и трудоёмкой задачей, не имеющей универсального решения. Эта проблема стоит особенно остро для большинства мембранных белков, в большинстве случаев слишком крупных для определения их структуры методом спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и находящихся в клетке в слишком малом количестве, чтобы можно было получить белковый кристалл, пригодный для исследования методом рентгеноструктурного анализа (РСА). Мембранные белки (МБ) объекты исключительной биологической и биомедицинской важности, среди функций которых можно назвать рецепцию сигналов, транспорт веществ, создание и поддержание трансмембранных (ТМ) потенциалов и др. МБ составляют не менее трети всех синтезируемых клеткой белков (Wallin von Heijne, 1998), и без них невозможно существование ни многоклеточных, ни одноклеточных существ. Одним из важнейших классов МБ являются так называемые G-белоксопряжённые рецепторы\ составляющие 1-5% всех кодируемых белков в геномах множества организмов. Об их чрезвычайной фармакологической важности говорит тот факт, что более половины всех выпускаемых в настоящее время лекарственных препаратов действует на эти рецепторы (Klabunde Hessler, 2002). С их дисфункцией связано большое число заболеваний (Schoneberg etal, 2004), и их терапевтический потенциал, по сути, только начинает осваиваться. К сожалению, как уже было сказано, возможности экспериментальных методов определения пространственной структуры МБ пока крайне ограничены и не могут полностью удовлетворить запросов Английское название этих рецепторов (которые также называют рецепторами, чьё действие опосредовано G-белками} G-protein coupled receptors (GPCR). Эта общепринятая аббревиатура в дальнейшем будет использоваться для их обозначения. Полный список сокращений и аббревиатур дан в начале работы.фармацевтической индустрии. На сегодняшний день только для одного белка из семейства GPCR известна пространственная структура высокого разрешения фоторецептора родопсина, выделенного из сетчатки быка (Palczewski etal, 2000; Palczewski, 2006). В условиях отсутствия структур других GPCR молекулярное моделирование может помочь найти выход из сложившейся ситуации. К настоящему моменту известно всего два типа укладки ТМ сегментов в МБ: «пучки» а-спиралей и «бочонки» р-структур (Cowan Rosenbusch, 1994). С фармакологической точки зрения наибольший интерес представляют белки первой группы, так как МБ эукариот принадлежат исключительно к ней. Рецепторы GPCR также относятся к этому классу: их ТМ область представлена консервативным структурным мотивом, состоящим из семи ТМ а-спиралей, плотно упакованных приблизительно ортогонально плоскости мембраны (Lefkowitz, 2004; Pierce etal, 2002). Предложенная гипотеза двухстадийного сворачивания МБ в мембране (Popot Engelman, 1990) с участием транслокационного комплекса (Hessa etal, 2005) подразумевает поочередное сворачивание в мембране индивидуальных ТМ а-спиралей (самих по себе довольно устойчивых с термодинамической точки зрения) и их последующую ассоциацию в нативный «пучок». Согласно этой гипотезе, построение теоретических моделей а-спиральных МБ может сводиться к аналогичному двухстадийному процессу: конструированию отдельных ТМ спиралей и их «сборке», что на первый взгляд выглядит существенным облегчением процесса предсказания их пространственной структуры. Однако методы так называемого аЬ initio моделирования (т.е., не использующие при построении моделей структур родственных белков) еще не достигли той степени зрелости, чтобы предсказывать многочисленные функциональные особенности этих объектов, даже основываясь на априорных знаниях об их топологии. В случае если доступна трехмерная структура родственного белка, она может использоваться в качестве «шаблона» при моделировании по гомологии. Основным предположением этого подхода является то, что пространственная структура белка более консервативна, чем его последовательность (Lesk Chothia, 1986). В случае GPCR-рецепторов единственным шаблоном является родопсин, гомология которого с другими членами семейства может быть невелика, однако высокая консервативность пространственной организации ТМ домена все же позволяет получать модели GPCR, пригодные для практических применений, например, для изучения взаимодействия с лигандами (Archer et al, 2003). В то же время, «качественные» модели во многих случаях позволяет получить лишь интуиция ученого, учитывающего множество факторов при оптимизации моделей, полученных при непосредственном применении методов молекулярного моделирования (например, моделирования по гомологии). Очевидно, что требуются независимые способы оценки качества получаемых моделей, указывающие также возможные пути их оптимизации. Причем необходимо, чтобы эти методы были разработаны с учетом особенностей строения МБ, т.к. серьезные различия в физико-химических свойствах сред, в которых локализованы растворимые глобулярные и мембранные белки, несомненно, приводят к существенным различиям в их организации. Отдельной, не менее сложной задачей является моделирование взаимодействия МБ Недавно получена структура нового МБ транслокатора молекул гликокаликса внешней мембраны Е. соИ (Dong etal., 2006), для которого постулируется новый тип ТМ укладки: а-«бочонок».с лигандами. Фундаментальным ограничением современных алгоритмов докинга, предназначенных для этой цели, является корректный учёт конформационной подвижности белка и оценка свободной энергии связывания лиганда со своей мишенью. Основной целью данной работы является разработка ряда новых подходов для моделирования структуры ТМ домена GPCR-рецепторов и взаимодействия с лигандами, связывающимися в ТМ области. Эти подходы призваны улучшить качество моделей, получаемых на основании гомологии, и увеличить предсказательную способность алгоритмов докинга в задачах идентификации корректных структур комплексов рецептор-лиганд. В процессе работы был разработан новый метод оценки качества упаковки полипептидных цепей в ТМ доменах мембранных белков. Предложенный метод базируется на описании белок-мембранного окружения отдельных аминокислотных остатков в терминах классов окружения, основанных на степени экспонированностн остатка в мембрану и на полярности его ближайшего белкового окружения. Анализ представительного набора кристаллографических структур МБ высокого разрешения позволил численно определить предпочтения каждого типа остатков к тому или иному классу окружения, открывая возможность оценки «качества» трехмерных структур МБ. Кроме того, предложен метод численной оценки гидрофобного/гидрофильного соответствия в сайтах связывания рецептор-лиганд, на основании которого предложена методика улучшения предсказательной силы одного из популярных алгоритмов докинга. Согласованное использование разработанных методов позволит конструировать реалистичные модели пространственной структуры МБ (в частности, GPCR-рецепторов) и изучать связывание этих белков с лигандами. Основные результаты проделанной работы: 1) Построены модели рецепторов мелатонина МТ и МТ человека. Модели оптимизированы с учётом ряда экспериментальных данных о функционально важных для связывания лигандов остатках и возможного механизма активации рецепторов, а также с использованием критерия оценки качества получаемых моделей. Исходя из анализа комплементарности гидрофобных/гидрофильных свойств лиганда и его сайта связывания, была предложена оптимальная геометрия комплекса рецептор-лиганд; 2) С использованием концепции комплементарности молекулярного гидрофобного потенциала (МГП) объяснен механизм селективности ряда аналогов мелатонина к определенным подтипам рецепторов; 3) Разработан метод оценки «качества» упаковки белковой цепи в ТМ домене мембранных белков. Показано, что существует прямая зависимость между длиной ТМ домена белков с экспериментально определенной пространственной структурой и значением предложенной «оценивающей функции для мембранных белков» (ОФМБ). Эта закономерность даёт возможность оценивать качество теоретических моделей МБ (в частности, GPCR) и делать выводы о близости модели к «нативной» структуре; 4) На ряде практических и синтетических тестов показано, что ОФМБ может однозначно идентифицировать «правильную» структуру (полученную методом РСА) среди набора некорректных теоретических моделей, как содержащих определенные ошибки при построении, так и специально сгенерированных для проверки этой способности. Кроме того, продемонстрирована связь между значением ОФМБ и близостью модели к «нативной» структуре (в терминах среднеквадратичного отклонения (СКО) от кристаллографической структуры). Эта связь позволяет среди набора моделей выбрать наиболее близкую к нативной, что особенно полезно при отсутствии экспериментально определенной структуры; 5) Анализ набора фотосинтетических МБ показал для них отличающуюся зависимость значения ОФМБ от длины ТМ домена, свидетельствуя об отличиях в их пространственной организации. Эти отличия могут быть обусловлены, например, тем, что эти белки содержат очень большое количество фотопигментов в ТМ домене, взаимодействия с которыми могут в значительной мере заменять собой белок-белковые взаимодействия, характерные для других групп МБ; 6) Сравнение результатов докинга на наборе 132 кристаллографических структур комплексов белок-лиганд, ртсортированных по значению «стандартной» оценивающей функции GoIdScore и по критерию, учитывающему комплементарность гидрофобных/гидрофильных свойств в сайте связывания показало, что последний подход может быть очень перспективным для увеличения предсказательной способности докинга— особенно, если «настройка» и применение метода МГПкомплементарности будет производиться на ограниченном наборе мишеней и/ илилигандов. Диссертационная работа организована следующим образом. Во Введении

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Чугунов, Антон Олегович

4.2. Выводы

1. Предложен способ удовлетворения экспериментальных ограничений с помощью вращения одной или нескольких ТМ а-спиралей в мембранном домене рецепторов мелатонина МТг и МТ2. Эта операция позволяет учесть информацию о функционально важных остатках и сохранить неизменным общий тип укладки ТМ домена в указанных рецепторах;

2. Разработан новый метод оценки качества упаковки белковой молекулы в ТМ а-спиральном домене. Подход основан на анализе доступных кристаллографических структур МБ и позволяет идентифицировать модели, близкие к нативной структуре;

3. Предложен метод улучшения предсказательной силы докинга. Метод основан на анализе гидрофобного/гидрофильного соответствия в сайтах связывания ре-цептор-лиганд. Во многих случаях удается получить лучший результат, чем при использовании стандартного алгоритма программы докинга GOLD.

4.3. Перспективы

Изучение структуры и функций МБ и, в частности, мембранных рецепторов — задача, чрезвычайно важная как для фундаментальных биологических исследований, так и для биомедицинских приложений. В ближайшие годы роль молекулярного моделирования в изучении МБ будет только возрастать, и поэтому новые методики предсказания и оптимизации пространственных структур этих объектов будут весьма востребованы.

Предложенный нами эмпирический метод оценки качества упаковки ТМ-доменов — несомненно, лишь первый шаг к интегрированным высокоэффективным методикам моделирования структур МБ, пригодных для задач дизайна новых лекарственных соединений. Предстоит еще многое сделать, чтобы подход ОФМБ начал приносить практически важные результаты. Это и изучение новых классов МБ (например, p-структурных), и разграничение аминокислотных остатков, экспонированных в мембрану, от канал-образующих остатков, и учёт при параметризации метода распределения остатков вдоль нормали к мембране, и увеличение обучающего набора по мере роста числа доступных структур МБ. Кроме того, для практического применения этого подхода необходима тесная интеграция с методами моделирования конформационной подвижности боковых цепей и белкового остова теоретических моделей. Предложенный здесь «ротамерный тест» является лишь первым примером такого совместного использования, однако сфера дальнейшего улучшения предложенного подхода еще крайне широка.

Мы продемонстрировали, что критерий комплементарности МГП может оказаться существенным подспорьем для улучшения результатов докинга, проведенного с помощью одной из самых популярных программ. Однако наибольшей эффективности этого подхода можно достичь лишь при совместном использовании «стандартных» оценивающих функций докинга и подхода, основанного на МГП. В перспективе комплементарность гидрофобных свойств в комплексе белок-лиганд может быть интегрирована в одну из существующий ОФ докинга, что, несомненно, во многих случаях позволит идентифицировать «корректные» решения среди неудовлетворяющих физико-химическим критериям (таким как комплементарность гидрофобных свойств). Еще одно перспективное направление — создание лиганд-специфичных ОФ, позволяющих достичь очень хороших результатов на определенных (возможно, довольно узких) классах комплексов мишень-лиганд.

Совместное использование технологий, позволяющих точно предсказать пространственную структуру МБ, и новых подходов к изучению взаимодействия с лигандами, а также применение моделей явно заданных бислоёв и метода молекулярной динамики, позволит еще больше приблизиться к пониманию такого важного биологического процесса, как рецепция. Кроме того, учитывая сложность предсказания пространственной структуры МБ, наиболее перспективными представляются комплексные подходы, использующие как данные теоретических предсказаний, так и информацию, полученную в прямом эксперименте.

Таким образом, основным стратегическим направлением молекулярного моделирования МБ применительно к практически важным задачам, является совмещение предсказаний пространственной структуры МБ с технологиями докинга лигандов в единую технологию дизайна лекарств, действующих на мембранные белки.

Глава 5. Методы и алгоритмы

5.1. Молекулярное моделирование рецепторов мелатонина МТ и МТ человека

5.1.1. Построение и оптимизация «стартовых» моделей рецепторов

ТМ домены рецепторов МТ, и МТ, были определены, используя комбинацию предсказаний, сделанных с помощью методов HMMTOP (Tusnady & Simon, 1998), ТМНММ (Moller etal., 2001), TMPRED (Hofmann & Stoffel, 1993) и T0PPRED2 (Cserzo etal., 1997). Выравнивания аминокислотных последовательностей родопсина (код Swiss-Prot opsdbovin или Р02699) с МТ, (код Swiss-Prot mtrlahuman или Р48039) и МТ, (код Swiss-Prot mtrlbhuman или Р49286) были построены с помощью программы GCG (Genetics Computer Group, 1991) с использованием следующих параметров: матрица сравнения blosum62, штрафы на инициацию и пролонгацию разрыва в выравнивании 8 и 2, соответственно. Итоговое выравнивание (рис. 5.1) было подкорректировано вручную, чтобы свести к минимуму число разрывов в ТМ домене. Модели МТ, и МТ2 были построены с помощью программы MODELLER (Marti-Renom etal, 2000) с использованием этого выравнивания на основании гомологии со структурой зрительного родопсина (код PDB: U9h (Teller etal., 2001)). Для моделирования консервативного дясульфидного мостика Cysl00-Cysl77 (Cysll3-Cysl90 в случае МТ2) использовали опциюSPECIALPATCHES программы MODELLER. Для каждой рецептора было получено по пять слегка различающихся моделей, из которых для дальнейшего изучения была выбрана «лучшая» на основании анализа пространственных нарушений. К моделям были добавлены атомы водорода; зарядовые состояния ионизируемых групп выбирали, согласно значению рН 7.0.

Модели подвергали постадийной минимизации потенциальной энергии в программе DISCOVER (Insightll, 2000) с использованием силового поля CVFF (Insightll, 2000). При расчете дальних взаимодействий использовали значение функции отсечки (cut-off) 20.0 А. Электростатические взаимодействия рассчитывали с использованием константы диэлектрической проницаемости, зависящей от расстояния по закону £=4хг. Потенциальную энергию минимизировали в несколько этапов:

1) 2хЮ2 шагов методом наискорейшего спуска с фиксированными тяжёлыми атомами системы;

2) 2*Ю2 шагов методом наискорейшего спуска и затем 2х103 шагов методом сопряжённых градиентов

TMl: opsd Mtl МТ2

ТМ2: opsd МТ! MT2

ТМЗ: opsd MT1 MT2

TM4: opsd MT1 MT2

TM5: opsd MT1 MT2

TM6: opsd MT1 MT2

TM7: opsd MT1 MT2

35 25 38

71 61 74

WQFSMLAAYMFLLIMLGFPINFLTLYVTVQ WLASALACVLI FT IVVDILGNLLVILS VYR WVAPALSAVLIVTTAVDWGNLLVILSVLR

PLNYILLNLAVADLFMVFGGFTTTLYTSLH AGNIFVVS LAVADLWAIY PY PLVLMSI FN AGNL FLVS LALADLWAF Y PYPLILVAIFY

64 54

100

103

107 PTGCNLEGFFATLGGEIALWSLVVLAIERYVVV 139 97 YLHCQVSGFLMGLSVIGSIFNITGIAINRYCYI 129 110 EEHCKASAFVMGLfiVIGfiVFNITAIAINRYCYI 142

151 NHAIMGVAFTWVMALACAAP-PLVG 174

142 KNSLCYVLLIWLLTLAAVLPNLRAG 166

155 WHTPLHICLIWLLTWALLPNFFVG 179

199 NESFVIYMFVVHFIIPLIVIFFCYGQLVFT 229

184 SSAYTIAVVVFHFLVPMIIVIFCYLRIWIL 213

197 STQYTAAVWIHFLLPIAVVSFCYLRIWVL' 226

24 7 EKEVTRMVIIMVIAFLICWLPYAGVAFYIFT 277

234 FRNFVTMFWFVL-FAICWAPLNFI£LAVAS 263

247 LRSFLTMFWFVI-FAICWAPLNCIfiLAVAI 276

286 IFMTIPAFFAKTSAVYNPVIYIMMN 310

275 WLFVASYYMAYFNSCLNAIIYGLLN 299

288 GLFVTSYLLAYFNSCLNAIVYGLLN 312

Рисунок 5.1. Выравнивание аминокислотных последовательностей ТМ сегментов зрительного родопсина (opsd) и рецепторов мелатонина МТ и МТ. Наиболее консервативные остатки во всем семействе рецепторов CPCR выделены жирным, остатки, важные для связывания мелатонина (см. §2.VI.) — подчеркнуты. с фиксированными атомами основной цепи белка; (3) 2х104 шагов методом сопряженных градиентов без фиксирования каких-либо частей системы. По окончании стадий (2) и (3) минимизации СКО от стартовых моделей составило -0.7 А и ~3.0 А, соответственно. После минимизации энергии внемембранные петли были удалены из моделей, и N- и С-концы ТМ сегментов были модифицированы ацетильными и N-метильными группами, соответственно. Вторичную структуру моделей рассчитывали с помощью программы DSSP (Kabsch & Sander, 1983), а качество белкового окружения — с помощью программы Profiles3D (Bowie etal, 1991).

5.1.2. Анализ распределения гидрофобных и вариабельных свойств

Моменты вариабельности и гидрофобности для ТМ а-спиралей рассчитывали по методам, предложенным Ду и Алькорта (Du & Alkorta, 1994) и Донелли с соавт. (Donelly etal, 1993), соответственно. Значения гидрофобности, приписываемые отдельным остаткам в методе моментов гидрофобности, были предложены Рисом с соавт. (Rees etal, 1989). Пространственное распределение гидрофобных и гидрофильных свойств ТМ сегментов было получено в приближении молекулярного гидрофобного потенциала (МГП) (Furet etal., 1988; Fauchere etal, 1988), с использованием системы атомных гидрофобных констант из работы Viswanadhan etal, 1989. Для целей изучения гидрофобной/гидрофильной организации ТМ доменов распределения МГП на поверхностях а-спиралей визуализовали в виде одномерных графиков МГП(а) в полярных координатах (Efremov & Veroten, 1996).

5.1.3. Построение и оценка качества моделей с повернутой ТМЗ

Построение моделей. В стартовых моделях МТг и МТ2 спираль ТМЗ поворачивали на заданный угол вокруг ее оси по часовой стрелке, при виде с внеклеточной стороны (рис. 3.2). Получаемую конформацию релаксировали в два этапа: (1) с фиксированным белковым остовом ТМЗ и фиксированными тяжелыми атомами других спиралей; (2) с фиксированными Са атомами ТМЗ и фиксированным белковым остовом других спиралей. На следующем этапе мелатонин вручную помещали в сайт связывания, определенный из данных мутагенеза, в предположительно биологически активной конформации — с боковой цепью, ортогональной плоскости индольного кольца молекулы (Tarzia etal, 2000). Вписывание молекулы мелатонина в сайт связывания проводили таким образом, чтобы расстояния между атомами рецептора и лиганда, образующими водородные связи, было по возможности минимальным. Минимизацию энергии получаемых комплексов с ограничениями на расстояния между упомянутыми атомами (2.5 А, силовая постоянная 10.0 ккал/А2) проводили в два этапа: (1) с фиксированными Ся атомами ТМЗ, атомами основной цепи других спиралей и тяжёлыми атомами лиганда; (2) без фиксированных атомов, но с дополнительными ограничениями на расстояния между NH- и СО-группами основной цепи, образующими водородные связи в гомологичных положениях молекулы родопсина. Упомянутые ограничения на расстояния между атомами рецептора и лигандов также учитывались. Данный протокол применяли для предотвращения нарушения вторичной структуры ТМ спиралей рецепторов в процессе оптимизации комплекса с лигандом в вакууме. В процессе оптимизации в моделях рецепторов мелатонина формировалась полость, соответствующая по форме и объему молекуле мелатонина. В «стартовых» моделях такая полость отсутство

Глава 4* Заключение, выводы и перспективы

4.1. Научно-практическое значение работы и новизна результатов

Разработанный критерий оценки качества упаковки ТМ а-спиральных доменов также является новым перспективным инструментом моделирования структуры МБ, в частности, рецепторов семейства GPCR. Мы показываем, что, в отличие от предлагаемого подхода, аналогичные методы, разработанные для глобулярных белков, не позволяют решить важнейшую Для подобного оценивающего метода задачу — надёжно идентифицировать нативную (или близкую к ней) структуру среди набора теоретических моделей, в том числе содержащих ошибки.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Чугунов, Антон Олегович, Москва

1. Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W., Lipman, D.J. (1990). Basic local alignment search tool./. Mol. Biol. 215,403-10.

2. Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W„ Lipman, D.J. (1997). Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25,3389-3402.

3. Archer, E., Maigret, В., Escrieut, C„ Pradayrol, L., Fourmy, D. (2003). Rhodopsin crystal: new template yielding realistic models of G-protein-coupled receptors? Trends Pharmacol Sci. 24, 36-40.

4. Audry, E., Dubost, J.P., Colleter, J.C., Dallet, P. (1986). A new approach to structure-activity relations: the "molecular lipophilicity potential". Eur. J. Med. Chem. 21,71-72.

5. Bajorath, J. (2002). Virtual screening in drug discovery: methods, expectations and reality. Curr. Drug Disc. 3, 24-28.

6. Baker, D., Sali, A. (2001). Protein structure prediction and structural genomics. Science 294, 93-96.

7. Baldwin, J.M., Schertler, G.F., Unger, V.M. (1997). An a-carbon template for the transmembrane helices in the rhodopsin family of G-protein-coupled receptors./. Mol. Biol. 272,144164.

8. Ballesteros, J.A., Weinstein, H. (1995). Integrated Methods for the Construction of Three-Dimensional Models and Computational Probing of Structure-Function Relations in G Protein-Coupled Receptors. Methods Neurosci. 25,366-428.

9. Basyn, F., Spies, В., Bouffioux, 0., Thomas, A., Brasseur, R. (2003). Insertion of X-ray structures of proteins in membranes./. Mol. Graph. Model. 22,11-21.

10. Becker, O.M., Marantz, Y., Shacham, S., Inbal, В., Heifetz, A., Kalid, 0., Bar-Haim, S., Warshaviak, D., Fichman, M., Noiman, S. (2004). G-protein-coupled receptors: in silico drug discovery in 3D. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101,11304-11309.

11. Berman, H.M., Westbrook, J., Feng, Z., Gilliland, G., Bhat, T. N., Weissig, H., Shindyalov, I.N., Bourne, P.E. (2000). The Protein Data Bank. Nucleic Acids Res. 28,235-242.

12. Beuming, Т., Weinstein, H. (2004), A knowledge-based scale for the analysis and prediction of buried and exposed faces of transmembrane domain proteins. Bioinformatics 20, 18221835.

13. Beuming, Т., Weinstein, H. (2005). Modeling membrane proteins based on low-resolution electron microscopy maps: a template for the TM domains of the oxalate transporter OxlT. Protein Eng. Des. Sel. 18,119-125.

14. Bissantz, C., Bernard, P., Hibert, M„ Rognan, D. (2003). Protein-Based Virtual Screening of Chemical Databases. II. Are Homology Models of G-Protein Coupled Receptors Suitable Targets? Proteins 50,5-25.

15. Bohm, H.-J. (1992). LUDI: rule-based automatic design of new substituents for enzyme inhibitor leads./. Comput. Aided Mol Des. 6,593-606.

16. Bowie, J.U. (2005). Solving the membrane protein folding problem. Nature 438, 581-589.

17. Bowie, J.U,, Luthy, R„ Eisenberg, D. (1991). A method to identify protein sequences that fold into a known three-dimensional structure. Science 253,164-170.

18. Brooijmans, N„ Kuntz, I.D. (2003). Molecular Recognition and Docking Algorithms. Annu. Rev. ■ Biophys. Biomol Struct. 32,335-373.

19. Brown, W.M., Faulon, J.-L., Sale, K. (2005). A Deterministic Algorithm for Constrained Enumeration of Transmembrane Protein Folds. Сотр. Biol. Chem. 29,143-150.

20. Bujnicki, J.M., Elofsson, A., Fischer, D., Rychlewski, L. (2001). Structure prediction meta server. Bioinformatics 17,750-751.

21. Buysse, D., Bate, G., Kirkpatrick, P. (2005). Fresh from the pipeline: Ramelteon. Nat. Rev. Drug Discov. 4,881-882.

22. Byeon, I.J., Louis, J.M., Gronenborn, A.M. (2003). A protein contortionist: core mutations of GB1 that induce dimerization and domain swapping./ Mol. Biol 333,141-152.

23. Carlson, H.A., McCammon, J.A. (2000). Accommodating protein flexibility in computational drug design. Mol Pharmacol 57,213-218.

24. Caron, G., Ermondi, G. (2003). A comparison of calculated and experimental parameters as sources of structural information: the case of lipophilicity-related descriptors. Mini Rev. Med. Chem. 3,821-830.

25. Charifson, P.S., Corkery, J.J., Murcko, M.A., Walters, W.P. (1999). Consensus scoring: A method for obtaining improved hit rates from docking databases of three-dimensional structures into proteins./. Med. Chem. 42,5100-5109.

26. Chen, C.P., Kernytsky, A., Rost, B. (2002). Transmembrane helix predictions revisited. Protein Sci. 11, 2774-2791.

27. Chothia, C. (1976). The nature of the accessible and buried surfaces in proteins./. Mol Biol 105,1-12.

28. Chou, K.-C. (2005). Prediction of G-protein Receptor Classes./. Proteome Res. 4,1413-1418.

29. Chugunov. A.O. Farce. A.f Chavatte, P., Efremov, R.G. (2006). Differences in binding sites of two melatonin receptors help to explain their selectivity to some melatonin analogs: a molecular modeling study./. Biomol Struct. Dyn. 24,91-108.

30. Connolly, M.L. (1983). Solvent-accessible surfaces of proteins and nucleic acids. Science 221, 709-713.

31. Contreras-Moreira, В., Ezkurdia, I., Tress, M.L., Valencia, A. (2005). Empirical limits for template-based protein structure prediction: the CASP5 example. FEBS Lett. 579,1203-1207.

32. Conway, S., Mowat, E.S., Drew, J.E., Barrett, P., Delagrange, P., Morgan, P.J. (2001). Serine residues 110 and 114 are required for agonist binding but not antagonist binding to the melatonin MTj receptor. Biochem. Biophys. Res. Commun. 282,1229-1236.

33. Cowan, S.W., Rosenbusch, J.P. (1994). Folding pattern diversity of integral membrane proteins. Science 264,914-916.

34. Cozzini, P., Fornabaio, M., Marabotti, A., Abraham, D.J., Kellogg, G.E., Mozzarelli, A. (2004). Free energy of ligand binding to protein: evaluation of the contribution of water molecules by computational methods. Curr. Med. Chem. 11,3093-3118.

35. Cserzo, M„ Wallin, E., Simon, I., von Heijne, G., Elofsson, A. (1997). Prediction of transmembrane a-helices in prokaryotic membrane proteins: the dense alignment surface method. Protein Eng. 10,673-676.

36. Delarue, M., Koehl, P. (1995), Atomic environment energies in proteins defined from statistics of accessible and contact surface areas./ Mol. Biol. 249,675-690.

37. Desmet, J., Maeyer, M.D., Hazes, В., Lasters, I. (1992). The dead end elimination theorem and its use in protein side-chain positioning. Nature 356,539-542.

38. Dixon, J.S., Oshiro, C.M. (1995). Flexible ligand docking using a genetic algorithm./. Comput. Aided Mol. Des. 9,113-130.

39. Dobson, C.M. (2004). Chemical Space and Biology. Nature 432,924-929.

40. Dong, C., Beis, K., Nesper, J„ Brunkan-Lamontagne, A.L., Clarke, B.R., Whitfield, C., Naismith, J. H. (2006). Wza the translocon for E. coli capsular polysaccharides defines a new class of membrane protein. Nature 444,226-229.

41. Donnelly, D., Findlay, J. В., Blundell, T. L. (1994). The evolution and structure of aminergic G protein-coupled receptors. Receptors Channels 2,61-78.

42. Donnelly, D., OveringtOn, J.P., Ruffle, S.V., Nugent, J.H., Blundell, T.L. (1993). Modeling a-helical transmembrane domains: the calculation and use of substitution tables for lipid-facing residues. Protein Sci. 2,55-70.

43. Drews, J. (2000). Drug Discovery: A Historical Perspective. Science 287,1960-1964.

44. Du, P., Alkorta, I. (1994). Sequence divergence analysis for the prediction of seven-helix membrane protein structures: 1. Comparison with bacteriorhodopsin. Protein Eng. 10,12211229.

45. Efremov, R.G., Chugunov. A.O. Pyrkov, T.V., Priestle, J.P., Arseniev, A.S., Jacoby, E. (2007). Molecular lipophilicity in protein modeling and drug design. Curr. Med. Chem. 14,393-415.

46. Efremov, R.G., Nolde, D.E., Vergoten, G., Arseniev, A.S. (1999). Peptides in membranes: assessment of the effects of environment via simulations with implicit solvation model. Theor. Chem. Acc. 101,170-174.

47. Efremov, R.G., Nolde, D.E., Volynsky, P.E., Arseniev, A.S. (2000). Modeling of peptides in implicit membrane-mimetic media .Molecular Simulation 24,275-291.

48. Efremov, R.G., Vergoten, G., Arseniev, A.S. (1999). A new "hydrophobic template" method detects segments forming transmembrane a-helical bundles in ion channels. Theor. Chem. Acc. 101,73-76.

49. Efremov, R.G., Volynsky, P.E., Nolde, D.E., Arseniev, A.S. (2001). Implicit two-phase solvation model as a tool to assess conformation and energetics of proteins in membrane-mimic media. Theor. Chem. Acc. 106,48-54.

50. Eilers, M., Shekar, S.C., Shieh, Т., Smith, S.O., Fleming, P.J. (2000). Internal packing of helical membrane proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97,5796-5801.

51. Eisenberg, D., Weiss, R.M., Terwilliger, T.C. (1982). The helical hydrophobic moment: a measure of the amphiphilicity of a helix. Nature 299,371-374.

52. Eisenberg, D., Wesson, M., Yamashita, M. (1989). Interpretation of protein folding and binding with atomic solvation parameters. Chem. Scr. 29A, 217-221.

53. Eyre, T. A., Partridge, L„ Thornton, J.M. (2004). Computational analysis of a-helical membrane protein structure: implications for the prediction of 3D structural models. Protein Eng. Des. Sel. 17,613-624.

54. Fauchere, J.-L., Quarendon, P., Kaettere, L. (1988). Estimating and representing hydrophobicity potential./ Mol. Graph. 6,203-206.

55. Fiser, A., §ali, A. (2003). Modeller: generation and refinement of homology-based protein structure models. Methods Enzymol. 374,461-491.

56. Fleishman, S.J., Ben-Tal, N. (2002). A novel scoring function for predicting the conformations of tightly packed pairs of transmembrane a-helicesj. Mol. Biol. 321,363-378.

57. Fleishman, S.J., Ben-Tal, N. (2006). Progress in structure prediction of a-helical membrane proteins. Curr. Opiri. Struct. Biol. 16,496-504.

58. Fleishman, S.J., Harrington, S., Friesner, R.A., Honig, В., Ben-Tal, N. (2004). An automatic method for predicting transmembrane protein structures using cryo-EM and evolutionary data. Biophys.J. 87,3448-3459.

59. Fleishman, S.J., Unger, V.M., Ben-Tal, N.(2006). Transmembrane protein structures without X-rays. Trends Biochem. Sci. 31,106-113.

60. Foord, F.M. (2002). Receptor Classification: Post Genome. Curr. Opin. Pharm. 2,561-566.

61. Furet, P., Sele, A., Cohen, N.C. (1988). 3D molecular lipophilicity potential profiles: a new tool in molecular modeling./. Mol. Graph. 6,182-189.

62. Gaillard, P., Carrupt, P.A., Testa, В., Boudon, A. (1994). Molecular lipophilicity potential, a tool in 3D QSAR: method and applications./. Comput. Aided Mol. Des. 8,83-96.

63. Genetics Computer Group (1991). Program Manual for the GCG Package, Version 7, April 1991, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711.

64. Gerdin, M.J., Mseeh, F., Dubocovich, M.L. (2003). Mutagenesis studies of the human MT2 melatonin receptor. Biochem. Pharmacol. 66,315-320.

65. Gether, U., Kobilka, B.K. (1998). G-protein-coupled receptors. II. Mechanism of agonist activation./. Biol. Chem. 273,17979-17982.

66. Ghanouni, P., Steenhuis, J.J., Farrens, D.L., Kobilka, B.K. (2001). Agonist-induced conformational changes in the G-protein-coupling domain of the (^-adrenergic receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98,5997-6002.

67. Ghose, A.K., Viswanadhan, V.N., Wendoloski, J.J. (1998). Prediction of Hydrophobic (Lipophilic) Properties of Small Organic Molecules Using Fragmental Methods: An Analysis of ALOGP and CLOGP Methods./. Phys. Chem. A102, 3762-3772.

68. Ginalski, K. (2006). Comparative modeling for protein structure prediction. Curr. Opin. Struct. Biol 16,172-177.

69. Goodman, L.S. et al. (1996). Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics. McGraw-Hill, New York, ed. 9,1996.

70. Grol, C.J., Jansen, J.M. (1996). The high affinity melatonin binding site probed with confor-mationally restricted ligands. II. Homology modeling of the receptor. Bioorg. Med. Chem. 4, 1333-1339.

71. Guex, N., Peitsch, M.C. (1997). SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: An environment for comparative protein modeling. Electrophoresis 18,2714-2723.

72. Hansh, C., Fujita, T. (1964). r-s-p Analysis. A Method for Correlation of Biological Activity and Chemical Structure. Am. Chem. Soc. 86,1616-1626.

73. Heiden, W., Moeckel, G„ Brickmann, J. (1993), A new approach to analysis and display of local lipophilicity/hydrophilicity mapped on molecular surfaces. /. Comput. Aided Mol. Des. 7, 503-514.

74. Henderson, R., Baldwin, J. M., Ceska, T. A., Zemlin, F., Beckmann, E., Downing, К. H. (1990). Model for the Structure of Bacteriorhodopsin Based on High-Resolution Electron Cryo-Mi-croscopy./. Mol. Biol. 212,899-929.

75. Herzyk, P., Hubbard, R. E. (1998). Combined biophysical and biochemical information confirms arrangement of transmembrane helices visible from the three-dimensional map of frog rhodopsin./. Mol. Biol. 281,741-754.

76. Hessa, Т., Kim, H., Bihlmaier, K., Lundin, C., Boekel, J., Andersson, H., Nilsson, I., White, S. H., von Heijne G. (2005). Recognition of transmembrane helices by the endoplasmic reticulum translocon. Nature 433,377-381.

77. Hillisch, A., Pineda, L.F., Hilgenfeld, R. (2004). Utility of Homology Models in the Drug Discovery Process. Drug Discov. Today 9,659-669.

78. Hofmann, K., Stoffel, W. (1993). TMBASE — A database of membrane spanning protein segments. Biol. Chem. Hoppe-Seyler 374,166.

79. Horn, F.,Weare, J.,Beukers, M.W.,Horsch, S.,Bairoch, A., Chen, W., Edvardsen, 0.,Campagne, F., Vriend, G. (1998). GPCRDB: an information system for G-protein-coupled receptors. Nucleic Acids Res. 26, 277-281.

80. InsightH, Release 2000, Accelrys, San Diego, CA, 2002.

81. Ivanov, A.A., Voronkov, A.E., Baskin, I.I., Palyulin, V.A., Zefirov. N.S. (2004). The Study of the Mechanism of Binding of Human ML1A Melatonin Receptor Ligands Using Molecular Modeling. Dokl Biochem. Biophys. 394,49-52.

82. Jayasinghe, S., Hristova, K., White, S.H. (2001). Energetics, stability, and prediction of transmembrane helices./. Mol. Biol. 312,927-934.

83. Ji, Т.Н., Grossmann M„ Ji, I. (1998). G-Protein-Coupled Receptors. I. Diversity of Receptor-Li-gand Interactions./. Biol. Chem. 273,17299-17302.

84. Joseph, M.P., Maigret, В., Bonnafous, J.C., Marie, J., Scheraga, H.A. (1995). J. Protein Chem. 14, 381-398.

85. Kabsch, W., Sander, C. (1983). Dictionary of protein secondary structure: pattern recognition of hydrogen-bonded and geometrical features. Biopolymers 22,2577-2637.

86. Karplus, M. (2003). Molecular dynamics of biological macromolecules: a brief history and perspective. Biopolymers 68,350-358.

87. Kellogg, G.E., Abraham, D.J. (2000). Hydrophobicity: is LogP(o/w) more than the sum of its parts? Eur. J. Med. Chem. 35,651-661.

88. Kenakin, T. (2002). Efficacy at G-Protein-Coupled Receptors. Nat. Rev. Drug Disc. 1,103-110.

89. Kenakin, T. (2004). Principles: receptor theory in pharmacology. TYends Pharmacol. Sci. 25, 186-192.

90. Kim, D.E., Chivian, D„ Baker, D. (2004). Protein structure prediction and analysis using the Robetta server. Nucleic Acids Res. 32, W526-W531.

91. Kitchen, D.B., Decornez, H., Furr, J.R., Bajorath, J. (2004). Docking and scoring in virtual screening for drug discovery: methods and applications. Nat. Rev. Drug Discov. 11,935-949.

92. Klabunde, Т., Hessler, G. (2002). Drug Design Strategies for Targeting G-Protein-Coupled Receptors. Chembiochem 10, 928-944.

93. Knegtel, R.M.A., Kuntz, I.D., Oshiro, C.M. (1997). Molecular docking to ensembles of protein structures./ Mol. Biol. 266, 242-440.

94. Kokkola, Т., Foord, S.M., Watson, M.A., Vakkuri, 0., Laitinen, J.T. (2003). Important amino acids for the function of the human MT, melatonin receptor. Biochem. Pharmacol. 65, 14631471.

95. Kopp, J., Schwede, T. (2006). The SWISS-MODEL Repository: new features and functionalities. Nucleic Acids Res. 34, D315-D318.

96. Leach, A.R. (1994). Ligand docking to proteins with discrete sidechain flexibility./ Mol. Biol. 235, 245-356.

97. Lee, T.W., Cotecchia, S., Milligan, G. (1997). Up-regulation of the levels of expression and function of a constitutively active mutant of the hamster alb-adrenoreceptor by ligands that act as inverse agonists. Biochem.. 325,733-739.

98. Lefkowitz, R.J. (2004). Historical Review: A Brief History and Personal Retrospective of Sev-en-Transmembrane Receptors. Trends Pharmacol. Sci. 25,413-422.

99. Lengauer, Т., Lemmen, C., Rarey, M., Zimmermann, M. (2004). Novel technologies for virtual screening. Drug Discov. Today 9,27-34.

100. Lesk, A.M., Chothia, C. (1986). The Response of Protein Structures to Amino-Acid Sequence Changes. Philos. Trans. R. Soc. Lond. Biol. Sci. 317, 345-356.

101. Lin, S.W., Imamoto, Y., Fukada,Y., Shichida,Y., Yoshizawa, Т., Mathies,R.A. (1994). What makes red visual pigments red? A resonance Raman microprobe study of retinal chromo-phore structure in iodopsin. Biochemistry 33,2151-2160.

102. Lindahl, E., Hess, В., van der Spoel, D. (2001). GROMACS 3.0: A package for molecular simulation and trajectory analysis./. Mol. Mod. 7,306-317.

103. Lipinski, C., Hopkins, A. (2004). Navigating Chemical Space for Biology and Medicine. Nature 432, 955-961.

104. Lomize, M.A., Lomize, A.L., Pogozheva, I.D., Mosberg, H.I. (2006). OPM: orientations of proteins in membranes database. Bioinformatics 22,623-625.

105. Lundstrom, K. (2005). Structural genomics of GPCRs. Trends Biotechnol. 2,103-108.

106. Ltithy, R., Bowie, J.U., Eisenberg, D. (1992). Assessment of protein models with three-dimensional profiles. Nature 356,83-85.

107. Marie J., Richard E., PruneauD., PaquetJ., SiatkaC., LarguierR., Ponce C., VassaultP., Gro-blewski Т., Maigret В., Bonnafous, J. (2001). Control of Conformational Equilibria in the Human B2 Bradykinin Receptor./. Biol. Chem., 276,41100-41111.

108. Marti-Renom, M.A., Stuart, A.C., Fiser, A., Sanchez, R., Melo, F., Sali, A. (2000). Comparative protein structure modeling of genes and genomes. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 29,291325.

109. Miller, M.A. (2002). Chemical Database Techniques in Drug Discovery. Nat. Rev. Drug Disc. 1, 223-227.

110. Moller, S., Croning, M.D., Apweiler, R. (2001). Evaluation of methods for the prediction of membrane spanning regions. Bioinformatics 17,646-653.

111. Мог, М., Plazzi, P.V., Spadoni, G., Tarzia, G. (1999). Melatonin. Curr. Med. Chem. 6,501-518.

112. Mseeh, F., Gerdin, M.J., Dubocovich, M.I. (2002). Identification of cysteines involved in ligand binding to the human melatonin MT2 receptor. Eur. J. Pharmacol. 449,29-38.

113. Murzin, A.G; (2001). Progress in Protein Structure Determination. Nat. Struct. Biol. 8,110112.

114. Navajas, C., Kokkola, Т., Poso, A., Honka, N., Gynther, J., Laitinen, J.T. (1996). A rhodopsin-based model for melatonin recognition at its G-protein-coupled receptor. Eur. J. Pharmacol. 304,173-183.

115. Nikiforovich, G.V., Marshall, G.R. (2003). Three-dimensional model for meta-II rhodopsin, an activated G-protein-coupled receptor. Biochemistry 42,9110-9120.

116. Nissink, J.W., Murray, C., Hartshorn, M., Verdonk, M.L., Cole, J.C., Taylor, R. (2002). A new test set for validating predictions of protein-ligand interaction. Proteins 49,457-471.

117. Norberg,J., Nilsson, L. (2003). Advances in biomolecular simulations: methodology and recent applications. Q. Rev. Biophys. 36,257-306.

118. Nosjean, 0., Ferro, M., Coge, F., Beauverger, P., Henlin, J.M., Lefoulon, F., Fauchere, J.-L., Delagrange, P., Canet, E., Boutin, J.A. (2000). Identification of the melatonin-binding site MT3 as the quinone reductase 2./. Biol. Chem. 275,31311-31317.

119. Ohlson, T„ Wallner, В., Elofsson, A. (2004). Profile-profile methods provide improved fold-recognition: a study of different profile-profile alignment methods. Proteins 57,188-197.

120. Okada, Т., Sugihara, M„ Bondar, A.N., Elstner, M„ Entel, P., Buss, V. (2004). The retinal conformation and its environment in rhodopsin in light of a new 2.2 A crystal structure./. Mol. Biol. 342,571-583.

121. Palczewski, K. (2006). G-Protein-Coupled Receptor Rhodopsin. Annu. Rev. Biochem. 75, 743767.

122. Palczewski, K., Kumasaka,T., Hori, Т., Behnke, C.A., Motoshima, H., Fox, B.A., Le Trong, I., Teller, D.C., Okada, Т., Stenkamp, R.E., Yamamoto, M„ Miyano, M. (2000). Crystal Structure of Rhodopsin: A G-Protein-Coupled Receptor. Science 289,739-745.

123. Pappu, R.V., Marshall, G.R., Ponder, J.W. (1999). A Potential Smoothing Algorithm Accurately Predicts Transmembrane Helix Packing. Nat. Struct. Biol. 6, 50-55.

124. Pearson, W.R. (1990). Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA. Methods Enzymol. 183,63-98.

125. Pierce, K.L., Premont, R.T., Lefkowitz, R.J. (2002). Seven-Transmembrane Receptors. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 3,639-650.

126. Pilpel, Y., Ben-Tal, N., Lancet, D. (1999). kPROT: a knowledge-based scale for the propensity of residue orientation in transmembrane segments. Application to membrane protein structure prediction./. Mol Biol 294,921-935.

127. Pogozheva, I.D., Lomize, A.L., Mosberg, H.I. (1997). The Transmembrane 7-a-Bundle of Rho-dopsin: Distance Geometry Calculations with Hydrogen Bonding Constraints. Biophys.J. 72, 1963-1985.

128. Pogozheva, I.D., Przydzial, M.J., Mosberg, H.I. (2005). Homology modeling of opioid recep-tor-ligand complexes using experimental constraints. AAPSJ. 7, E434-E448.

129. Popot, J.L., Engelman, D.M. (1990). Membrane protein folding and oligomerization: the two-stage model. Biochemistry 29,4031-4037.

130. Pratt, L.R., Pohorille, A. (2002). Hydrophobic effects and modeling of biophysical aqueous solution interfaces. Chem Rev. 102,2671-2692.

131. Pyrkov, T.V., Kosinsky, Yu.A., Arseniev, A.S., Priestle, J.P., Jacoby,E„ Efremov, R.G. (2007). Complementarity of hydrophobic properties in ATP-protein binding: a new criterion to rank docking solutions. Proteins 66,388-398.

132. Read, R.J., Hart, T.N. (1992)! A multiple-start Monte Carlo docking method. Proteins 13, 206222.

133. Rees, D.C., DeAntonio, L., Eisenberg, D. (1989). Hydrophobic organization of membrane proteins. Science 245,510-513.

134. Reppert, S.M., Weaver, D.R., Ebisawa, T. (1994). Cloning and characterization of a mammalian melatonin receptor that mediates reproductive and circadian responses. Neuron 13, 1167-1176.

135. Rivara, S„ Lorenzi, S., Мог, M„ Plazzi, P.V., Spadoni, G., Bedini, A., Tarzia, G. (2005). Analysis of structure-activity relationships for MT2 selective antagonists by melatonin MTX and MT2 receptor models./. Med. Chem. 48,4049-4060.

136. Rohl, C.A., Strauss, C.E., Misura, K.M., Baker, D. (2004). Protein structure prediction using Rosetta. Methods Enzymol. 383,66-93.

137. Sal-Man, N., Gerber, D., Shai, Y. (2004). Hetero-assembly between all-L- and all-D-amino acid transmembrane domains: forces involved and implication for inactivation of membrane proteins./. Mol Biol 344,855-864.

138. Samatey, F.A., Xu, C., Popot, J.L. (1995). On the distribution of amino acid residues in transmembrane a-helix bundles. Proc. Natl Acad. Sci. U. S. A. 92,4577-4581.

139. Schertler, G.F., Hargrave, P.A. (1995). Projection structure of frog rhodopsin in two crystal forms. Proc. Natl Acad. Sci. U. S. A. 92,11578-11582.

140. Schneider, G., Fechner, U. (2005). Computer-Based De Novo Design of Drug-Like Molecules. Nat. Rev. Drug Disc. 4,640-663.

141. Schoneberg, Т., Schulza, A., Biebermannb, H., Hermsdorf, Т., Romplera, H., Sangkuhl, K. (2004). Mutant G-protein-Coupled Receptors as a Cause of Human Diseases. Pharmacol Ther. 104,173-206.

142. Shieh, Т., Han, M., Sakmar, T.P., Smith, S.O. (1997). The steric trigger in rhodopsin activation. /. Mol. Biol. 269,373-384.

143. Shoichet, B.K. (2004). Virtual Screening of Chemical Libraries. Nature 432,962-965.

144. Simonson, Т., Archontis, G., Karplus, M. (2002). Free energy simulations come of age: pro-tein-ligand recognition. Лее. Chem. Res. 35,430-437.

145. Sorgen, P.L., Hu, Y., Guan, L., Kaback, H.R., Girvin, M.E. (2002). An approach to membrane protein structure without crystals. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99,14037-14040.

146. Stevens, T.J., Arkin, l.T. (1999). Are membrane proteins "inside-out" proteins? Proteins 36, 135-143.

147. Stevens, T.J., Arkin, l.T. (2001). Substitution rates in a-helical transmembrane proteins. Protein Sci. 10,2507-2517.

148. Sugden, D., Chong, N.W., Lewis, D.F. (1995). Structural requirements at the melatonin receptor. Br. J. Pharmacol. 114,618-623.

149. Sugden, D., Pickering, H., Teh, M.T., Garratt, P.J. (1997). Melatonin receptor pharmacology: toward subtype specificity. Biol. Cell 89,531-537.

150. Takeda, S„ Kadowaki, S., Haga, Т., Takaesu, H., Mitaku, S. (2002). Identification of G-protein-coupled receptor genes from the human genome sequence. FEBS Lett. 520,97-101.

151. Tarzia, G., Diamantini, G., Мог, M., Spadoni, G. (2000). Design and synthesis of melatonin receptors agonists and antagonists. Farmaco 55,184-187.

152. Teller, D.C.,. Okada, Т., Behnke, C.A., Palczewski, K., Stenkamp, R.E. (2001). Advances in determination of a high-resolution three-dimensional structure of rhodopsin, a model of G-pro-tein-coupled receptors (GPCRs). Biochemistry 40,7761-7772.

153. Hisnady, G.E., Simon, I. (1998). Principles governing amino acid composition of integral membrane proteins: application to topology prediction./. Mol. Biol. 283,489-506.

154. Ubarretxena-Belandia, I., Engelman, D. M. (2001). Helical membrane proteins: diversity offunctions in the context of simple architecture. Curr. Opin. Struct. Biol. 11, 370-376.

155. Ulmschneider, M.B., Sansom, M.S., Di Nola, A. (2005). Properties of integral membrane protein structures: derivation of an implicit membrane potential. Proteins 59,252-265.

156. Ulmschneider, M.B., Sansom, M.S., Di Nola, A. (2006). Evaluating tilt angles of membrane-associated helices: comparison of computational and NMR techniques. BiophysJ. 90,16501660.

157. Vaidehi,T., Floriano,W.B., Trabanino,R., Hall,S.E., Freddolino,P., Choi,E.J., Zamanakos,G., Goddard III, W.A. (2002). Prediction of Structure and Function of G-Protein-Coupled Receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99,12622-12627.

158. Vereshaga, Y.A., Volynsky, P.E., Nolde, D.E., Arseniev, A.S., Efremov, R.G. (2005). Helix interactions in membranes: lessons from unrestrained Monte Carlo simulations./. Chem. Theory & Comput. 1,1252-1264.

159. Wallin, E., Tsukihara, Т., Yoshikawa, S., von Heijne, G., Elofsson, A. (1997). Architecture of helix bundle membrane proteins: an analysis of cytochrome с oxidase from bovine mitochondria. Protein Sci. 6,808-815.

160. Wallin, E., von Heijne, G. (1998). Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms. Protein Sci. 7,1029-1038.

161. Wimley, W. C., White, S. H. (1996). Experimentally determined hydrophobicity scale for proteins at membrane interfaces. Nat. Struct. Biol. 10,842-848.

162. Yarov-Yarovoy, V., Schonbrun, J„ Baker, D. (2006). Multipass Membrane Protein Structure Prediction Using Rosetta. Proteins 62,1010-1025.

163. Zhang, Y„ Devries, M.E., Skolnick, J. (2006). Structure modeling of all identified G-protein-coupled receptors in the human genome. PLoS Comput. Biol. 2, el3.

164. Zhang, Y., Skolnick, J. (2004). Automated structure prediction of weakly homologous proteins on a genomic scale. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101,7594-7599.

165. Zhdanov, V.P., Kasemo, B. (2001). Folding of bundles of a-helices in solution, membranes, and adsorbed overlayers. Proteins 42,481-494.

166. ZIotos, D.P. (2005). Recent advances in melatonin receptor ligands. Arch. Pharm. (Weinheim) 338,229-247.

167. Публикации по теме диссертации (научные статьи)

168. Efremov, R.G., Chugunov, A.O., Pyrkov, T.V., Priestle, J.P., Arseniev, A.S., Jacoby, E. (2007). Molecular lipophilicity in protein modeling and drug design. Curr. Med. Chem. 14(4), 393-415.

169. Чугунов A.O., Новоселецкий B.E, Арсеньев A.C., Ефремов Р.Г. (2007). Интегральные мембранные белки: подход к созданию реалистичных моделей in silico. Критические технологии. Мембраны. — принято в печать.

170. Chugunov, А.О., Farce, A., Chavatte, P., Efremov, R.G. (2006). Differences in binding sites of two melatonin receptors help to explain their selectivity to some melatonin analogs: a molecular modeling study./ Biomol. Struct. Dyn. 24,91-108.

171. Я бесконечно признателен своей семье и близким за понимание, поддержку и заботу. Без их помощи эта работа была бы невозможна.

Информация о работе

Чугунов, Антон Олегович
кандидата физико-математических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.02

Диссертация

Новые подходы к молекулярному моделированию трансмембранных доменов рецепторов, действие которых опосредовано G-белками - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Новые подходы к молекулярному моделированию трансмембранных доменов рецепторов, действие которых опосредовано G-белками - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы