Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новые методы количественного масс-спектрометрического анализа белковых систем с использованием селективных изотопных меток

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Новые методы количественного масс-спектрометрического анализа белковых систем с использованием селективных изотопных меток"

На правах рукописи

Федяев Михаил Владимирович

НОВЫЕ МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОГО АНАЛИЗА БЕЛКОВЫХ СИСТЕМ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СЕЛЕКТИВНЫХ ИЗОТОПНЫХ МЕТОК

03.00 04 - биохимия 03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2007

003166259

Работа выполнена на Химическом факультете Московского государственного университета имени М В Ломоносова и в Монреальском Университете, Канада

Научные руководители

Доктор химических наук, профессор

Нифантьев Илья Эдуардович

Кандидат химических наук, профессор Монреальского Университета Пшежецкий Алексей Валерьевич

Официальные оппоненты Доктор химических наук, профессор Заикин Владимир Георгиевич Доктор химических наук, профессор Швядас Витаутас-Юозалас Каятоно

Ведущая организация

Российский онкологический научный центр им. H H Блохина РАМН

Защита состоится 13 ноября 2007 года в 16 часов на заседании диссертационного совета Д 501 001 59 по химическим наукам при Московском государственном университете им M В Ломоносова по адресу 119992 Москва, Ленинские Горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ

Автореферат разослан 12 октября 2007 г

Учёный секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук

И К Сакодынская

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Протекание биологических процессов (как то фаза роста, метаболический цикл, патологические изменения или воздействие лекарства) связано с изменением белкового состава клеток или биологических жидкостей В этой связи глобальное исследование различных протеомов (наборов всех белков клетки, ткани и т п) - является первостепенной задачей, как для фундаментального понимания биологических процессов, так и для разработки новых методов лечения или диагностики различных болезней

К решению данной задачи можно подходить путем сравнения различных протеомов для выявления белков, содержание которых значительно меняется в ответ на определенное воздействие, например, какое-либо заболевание и которые представляют наибольший интерес для дальнейшего изучения Данными исследованиями занимается сравнительная протеомика, все более важным требованием к которой становится способность количественной оценки изменений белкового состава клетки, ткани или физиологической жидкости В то же время масс-спектрометрия, которая продолжает играть ключевую роль в протеомических исследованиях, сама по себе не является количественным методом и нуждается в дополнительных аналитических методах Наиболее признанной методологией в настоящее время является дериватизация белков (пептидов) с использованием стабильных изотопов (2Н, 13С, 15М, 180) для создания "изотопных аналогов" (Рис 1)

Можно выделить 3 основные группы методов введения стабильных изотопов метаболические, энзиматические (протеолитические) и химические Метаболические методы заключаются в использовании изотопсодежащих исходных веществ для процессов обмена, например, при росте клеток Энзиматические методы основаны на проведении протеолиза белков в обычной и тяжелой (180) воде Основным преимуществом энзиматических и метаболических методов является отсутствие дополнительных стадий в процессе приготовления образцов, в то же время существует и ряд фундаментальных ограничений Так, например, в случае метаболических методов использование тяжелых изотопов часто приводит к нарушению биологических процессов, кроме того данные методы применимы в основном только для клеточных моделей Для протеолитических методов одной из основных проблем является различная степень введения изотопов, а также обратный изотопный обмен, что может приводить к значительным ошибкам измерений и снижению чувствительности вследствие уменьшения интенсивности сигнала По причине использования только двух (легкого и тяжелого) изотопов анализ также ограничен одновременным

сравнением не более чем двух образцов, а небольшая разница в массе приводит к перекрыванию изотопных кластеров, что затрудняет интерпретацию получаемых данных

тяжелый

Белок А в

образце! введение

протео-лиз

изотопов

легкий

смесь пептидов

Белок А в образце 2

промывка

т/г

Рис. 1. Пример схемы количественного анализа белковых смесей с использованием метода изотопного аналога Светло-серым цветом обозначен легкий изотоп, темно-серым - тяжелый

Химические методы, основанные на селективной ковалентной модификации белков или полученных при протеолизе пептидов реагентами, содержащими стабильные изотопы, включают в себя те, в которых селективно модифицируется определенный аминокислотный остаток (например, цистеин), и методы, основанные на модификации функциональных групп присутствующих практически в любом пептиде, полученном при протеолизе белка, например, концевых аминогрупп Химические методы таким образом являются наиболее универсальными и представляют наибольший интерес

В настоящей работе нами предложены новые химические методы для изотопного мечения пептидов и белков, как определенных аминокислотных остатков, так и всех концевых аминогрупп пептидов На основе данных подходов разработаны и охарактеризованы новые методы количественного протеомического анализа

Цели и задачи исследования. Цель исследования состояла в создании реагентов (изотопных меток) и методов для количественного анализа сложных смесей белков с использованием хроматомасс-спектрометрии

Для ее достижения в диссертационной работе были поставлены следующие задачи

■ Дизайн и синтез изотопных меток для селективной модификации тиольных групп цистеина с возможностью последующего ковалентного выделения модифицированных пептидов на твердофазной матрице

• Разработка методов модификации белков изотопными цистеиновыми метками и последующего выделения меченых пептидов с использованием модельных смесей

■ Разработка реагентов и методов для селективной изотопной модификации концевых аминогрупп пептидов, полученных при протеолизе трипсином

■ Оптимизация условий модификации концевых аминогрупп пептидов изотопными метками с использованием модельных систем

■ Создание комплекса биоинформатических программ для анализа масс-спектрометрических данных

■ Оценка эффективности разработанных подходов путем их использования для количественного протеомического анализа биологических объектов

Научная новизна работы В диссертационной работе разработан и охарактеризован новый метод количественного протеомического анализа на основе изотопного мечения N-концевых аминогрупп, для этого впервые осуществлен способ селективной изотопной модификации концевых аминогрупп пептидов Синтезирован ряд новых изотопных реагентов для осуществления селективной модификации N-концевых аминогрупп или тиольных групп цистеина Предложена цепочка новых селективных ковалентных химических реакций для выделения меченых пептидов с использованием твердофазной матрицы С использованием разработанных методов впервые исследовано изменение белкового состава мембран при дифференциации клеток карциномы кишечника и показано, что дифференциация приводит к селективной экспрессии на клеточной мембране более 150 белков, включая новые ранее неизвестные клеточные каналы

Практическая значимость работы В работе показано, что разработанные нами изотопные реагенты и методы протеомического анализа позволяют эффективно решать задачи количественной протеомики, что было продемонстрировано при анализе биологических объектов Разработан общий подход к оптимизации условий

модификации изотопными реагентами с последующим масс-спектрометрическим анализом Разработан комплекс биоинформатических программ, позволяющий эффективную обработку масс-спектрометрических данных

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на Международных конференциях "HUPO 2nd Annual World Congress" (Монреаль, Канада, 2003), "4th International Conference of the Canadian Proteomics Initiative" (Монреаль, Канада, 2004), "52nd Annual ASMS Conference" (Нешвиль, Теннесси, США, 2004), "HUPO 3rd Annual World Congress" (Пекин, Китай, 2004), "Keystone Symposium on Proteomics and Bioinformatics" (Кейстоун, Колорадо, США, 2005), "54th Annual ASMS Conference" (Сиэтл, Вашингтон, США, 2006) Результаты исследования отражены в отечественной и зарубежной печати, используются в лекционных курсах читаемых на кафедре биохимии Монреальского университета

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 13 печатных работ

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения (4 главы), выводов и списка цитируемой литературы Работа изложена на 140 страницах печатного текста, содержит 8 таблиц и 40 рисунков Список цитированной литературы включает 122 наименования

Результаты работы.

Результатом данной работы стало создание двух методов количественного протеомического анализа, использующих изотопную модификацию пептидов с последующим масс-спектрометрическим определением Первый метод, основанный на модификации тиольных групп белков с использованием N-фенилмалеинимида и ковалентным выделением модифицированных пептидов на твердофазной матрице, описан в главе 1 Описание второго метода, основанного на модификации концевых аминогрупп пептидов пентафторфениловыми эфирами, приводится в главе 2 В главе 3 описаны биоинформатические подходы, разработанные для анализа получаемых данных Глава 4 описывает результаты сравнения белкового состава клеточных мембран пролиферирующих и дифференцированных раковых клеток Сасо-2 и сравнения протеомов эндосом, выделенных из печени крыс после инъекции инсулина или эпидермального фактора роста выполненных с использованием разработанного метода изотопной модификации концевых аминогрупп

1 Метод изотопных аналогов с использованием меток специфичных к тиольным группам.

В разработанном методе белки денатурируются, дисульфидные связи восстанавливаются и алкилируются N-фенилмалеинимидом, содержащим легкие (Н) или тяжелые (D) изотопы водорода После объединения образцов и обработки модифицированных групп гидразином, белки очищаются и обрабатываются трипсином Далее меченые пептиды ковалентно связываются с твердофазной матрицей, промываются и элюирутся избытком гидразина, гидразидные группы защищаются п-нитробедзальдегидом и выполняется масс-спектрометрический анализ (Рис 2)

В настоящей работе для алкилирования тиольных групп в составе белков мы применили малеинимиды, которые обладают более высокой стабильностью и селективностью по сравнению с традиционно используемыми галоацетатами Кроме того, легкие и тяжелые изотопные аналоги N-фенилмалеинимида легко могут быть получены из коммерчески доступных 13С или 2Н анилина В этом случае, при введении дейтерия в относительно полярное по сравнению с алкильным арильное положение нивелируется H/D изотопный эффект при хроматографическом разделении модифицированных пептидов на обращенной фазе

Смесь белков 1

Смесь белков 2

Н н I 1" Восстановление дисульфидных I О о Р

N_/ ▼ связей ▼ II

н I 2. Алкилирование тиольных групп I (1

▼ Аенилмалеинимидом-<10 или -<15 ▼ / V-.-'/

О 0 0

3. Обработка белков гидразином О

цистеин

\ 4 Очистка белков, расщепление белков трипсином 5. Реакция меченных пептидов с твердой фазой, промывка

NN2

^00' ь

6. Элюирование пептидов гидразином, защита бензальдегидом

•НИ

м

кий анализ О

^ "О'

17. Масс-спектрометрический анализ Рис. 2 Схема метода количественного анализа белковых смесей, основанного на модификации тиольных групп белков фенилмалеинимидом с последующим выделением меченых пептидов на твердофазной матрице и их масс-спектрометрическим анализом

Для осуществления специфического и количественного выделения меченых пептидов с использованием твердофазной матрицы в процессе выполнения данной работы был разработан эффективный и оригинальный метод С помощью масс-спектрометрии мы показали, что цистеин-содержащие пептиды, модифицированные фенилмалеинимидом, в водно-органических смесях способны селективно и с высокой скоростью реагировать с гидразином с раскрытием сукцинимидного цикла и

образованием амидгидразидов (Рис 3) Мы также зафиксировали протекание двух побочных реакций раскрытие сукцинимида водой и образование соответствующего пиридазина, однако скорости этих побочных реакций были на 1 - 2 порядка ниже, чем скорость основного процесса При концентрации модифицированного пептида 1 мМ и концентрации гидразина 01 М реакция образования амидгидразина протекает с выходом 99% за 10 минут при комнатной температуре В то же время, замещенные гидразины значительно менее активны в данной реакции по сравнению с незамещенным гидразином (Табл 1), что приводит к тому, что скорость основной реакции становится соизмеримой со скоростью гидролиза Таким образом, применение замещенных гидразинов для связывания пептидов, модифицированных фенилмалеинимидом, не представляется перспективным

Рис. 3. Модификация цистеин-содержащего пептида фенилмалеинимидом и реакция модифицированного пептида с гидразином

Таблица 1 Время полной модификации гидразинами пептидов ЕСв и РЮОС, меченных Ы-фенилмалеинимидом (концентрация пептидов 1 мМ, гидразина 0 1 М)

Гидразин Время реакции

Гидразин гидрат 10 мин (25 °С)

Цианоэтил гидразин 6 ч (37 °С)

Бензилгидразин 5 ч (37 °С)

Фенилгидразин реакции не обнаружено

Гидроксиэтилгидразин 2 ч (37 °С)

Мы показали, что полученные амидгидразиды (Рис 3) способны количественно присоединяться к бензальдегидам с образованием соответствующих гидразонов Последние, в свою очередь, быстро и количественно разрушаются под действием избытка гидразина с образованием исходных амидгидразинов (Рис 4)

пептид1*

R = Н, о-ОСН3, р-СРЗ, р-Ж>2, (пК*,),

К

Рис. 4 Меченый пептид, модифицированный гидразином, при обработке бензальдегидами количественно образует гидразон, который количественно разрушается избытком гидразина в исходный гидразид

Описанные реакции были использованы нами для выделения модифицированных пептидов на матрице путем взаимодействия гидразида с иммобилизованными бензальдегидами (Рис 2) Для выбора наиболее эффективной матрицы было проведено сравнение реакционной способности шести коммерчески доступных твердых фаз с подшитыми бензальдегидами (Рис 5) Сравнение проводили с использованием синтетических пептидов ЕСв и модифицированных фенилмалеинимидом и гидразином Подшивку проводили в среде ДМФА-вода (1 1) при комнатной температуре в течении 2 часов Для учета неспецифического (нековалентного) связывания после подшивки матрицу промывали 1 М ЬС1 в 50% ДМФА Контроль над протеканием реакций осуществлялся с помощью масс-спектрометрии (Табл 2) Матрица № 1 оказалась малоэффективной, матрицы № 4 и № 6 содержали большое количество примесей (ПЭГ и красители соответственно), мешающих масс-спектрометрическому анализу Среди матриц № 2, № 3 и N2 5 последняя показала наилучшую селективность

Таблица 2 Сравнение эффективности связывания пептидов ЕСв и ИвОС, модифицированных М-фенилмалеинимидом и гидразином с твердыми фазами № 1 - 6 (Рис 5) Данные являются полуколичественными

№ Связывание, % Неспецифическое связывание,%

1 70 30

2 90 10

3 95 10

4 100* 10*

5 99 <5

6 95* 5*

* - полученные масс-спектры содержали большое количество примесей

Ш. IT

3<ö> ъ- w - -V"

Рис. 5 Матрицы, использованные для оптимизации выделения меченых пептидов (1) формилполистирол, Sigma, (2) 4-(4-формил-3-метокси-фенокси) бутирил AM полистирол, Sigma, (3) 4-гидрокси-2-метоксибензальдегид АМЕВА полистирол, Sigma, (4) 4-(4-формил-3-метокси-фенокси) бутирил NovaGel HL полистирол, NovaBiochem, (5) 4-гидрокси-2,6-диметоксибензальдегид АМЕВА-26 полистирол, Sigma, (6) 4-гидрокси-2,6-диметоксибензальдегид SynPhase РА Lanterns, Mimotopes PS - полистирол, PA - полиамид

Химическая эффективность данного подхода была подтверждена масс-спектрометрическими экспериментами, однако, при переходе к тандемным хроматомасс-спектрометрическим экспериментам, выяснилось, что меченые пептиды, содержащие гидразидную группу, неэффективно разделяются при обращенно-фазовой хроматографии Кроме того, пептиды с данной модификацией в условиях фрагментации в значительной степени подвержены отрыву анилина и гидразина, что препятствует эффективной интерпретации МС/МС спектров

Для улучшения МС/МС спектров и хроматографического разделения была предложена защита получающихся гидразидов с помощью бензальдегидов, содержащих акцепторные заместители (Рис 4) При подобной модификации исчезает гидразидная группа, что значительно увеличивает эффективность хроматографического разделения, а также улучшает фрагментацию модифицированных пептидов

Лучшие результаты в тандемных хроматомасс-спектрометрических экспериментах показали нитробензальдегид и бис(трифторметил)бензальдегид, однако поскольку последний значительно увеличивал гидрофобность

модифицированных пептидов для проведения дальнейших экспериментов использовался только нитробензальдегид

Проверка эффективности разработанного подхода (Рис 2) была выполнена на основе анализа бычьего сывороточного альбумина (БСА) Из Таблицы 3 видно, что после инкубации смеси протеолитических фрагментов БСА, модифицированных фенилмалеинимидом и гидразином, с матрицей №5 пептиды, содержащие цистеин были полностью связаны из раствора и затем элюированы раствором гидразина Высокая специфичность выделения подтверждается тем, что в элюате найдены только меченые пептиды, в состав которых входит цистеин

Таблица 3 Пептиды, идентифицированные при анализе (Рис 3) бычьего сывороточного альбумина с использованием матрицы №5 Элюат содержит только меченые цистеин-содержащие пептиды

# Пептид Масса, Да Раствор после инкубации с матрицей Элюат

1 АЕРУЕ\/ТК 922 4886 +

2 ОАРЮЭРЬУЕУЭК 1567 7433 +

3 ОА1РЕМ1_РР1_ТАОРАЕОК 1955 9602

4 НШЭЕРСЖиК 1305 7167 +

5 НРЕУА\/5\/|_1-Р? 1283 7112 +

6 НРУРУАРЕИ-УУАМК 1888 9274 +

7 КУРОУЗТРТ^ЕУЗЯ 1639 9383 +

8 1_СУШЕК 1104 5148 +

9 ЮЕУСРОМАиУЯ 1479 7960 +

10 1ЛМЕ1_ТЕРАК 11636312 +

11 1ЛЛ/5ТС!ТА1-А 1002 5835 +

12 ОЫСООРЕК 1349 5221 +

13 QTAl.VEL.LK 1014 6199 +

14 КРСРЭАЬТРОЕРЛ/РК 2086 9544 +

15 5НС1АЕ\/ЕК 1358 6211 +

16 ТЛ/МЕ^УАРЛ/ОК 1399 6932 +

17 УРСЛ/ЗТРПЛ/ЕУЭГ* 1511 8433 +

18 УЮОМООТ^ЭК 1729 7540 +

19 У1УЕ1АР! 927 4940 +

Достоинствами разработанного нами метода протеомического анализа является, прежде всего, введение изотопов на самой первой стадии приготовления образца и далее проведение всех операций над сравниваемыми образцами в одних и тех же условиях, что позволяет обеспечить максимальную точность и

воспроизводимость анализа В качестве тяжелого изотопа используется дейтерий, находящийся в арильном положении, что обеспечивает практически одинаковое поведение изотопных форм меченых пептидов при обращенно-фазовой хроматографии при невысокой стоимости используемых реагентов Дизайн метки также позволяет введение в ее структуру 6 атомов 13С при использовании анилина-13Сб

Описанный метод может быть применен как для сравнительного анализа, так и для абсолютного количественного анализа при использовании в качестве одного из образцов известных количеств синтетических пептидов, идентичных цистеин-содержащим протеолитическим фрагментам белков в анализируемом образце

2 Метод изотопных аналогов с использованием меток специфичных к концевым аминогруппам пептидов

Основным ограничением методов с использованием селективных изотопных меток специфичных к тиольным группам является невозможность количественного анализа пептидов, не содержащих цистеина В связи с тем, что содержание цистеина в составе белков составляет только 1 9%, такие пептиды составляют подавляющее большинство В то же время, практически все образующиеся при протеолизе белков пептиды содержат Ы-концевую аминогруппу и, следовательно, при изотопной модификации данных групп возможен охват пептидов близкий к 100% Главной преградой к реализации данного подхода является близкая реакционная способность концевых аминогрупп и е-аминогрупп лизина В то же время модификация как концевых так и аминогрупп лизина используемая в некоторых методах может существенно подавлять ионизацию пептидов или ухудшать эффективность фрагментации Таким образом, нами была поставлена задача разработки метода селективной изотопной модификации концевых аминогрупп пептидов электронейтральными метками

Так как 1Ч-гидроксисукцинимидиловые эфиры, широко используемые для модификации аминогрупп белков, обладают низкой реакционной способностью при значении рН ~ 5 необходимом для подавления реакции с боковыми аминогруппами лизина нами были синтезированы реагенты на основе более реакционно способных пентафторфениловых эфиров, которые, как мы показали, селективно взаимодействуют с концевыми аминогруппами пептидов в водноорганических средах (диметилформамид - ацетонитрил - вода) при кислых рН (~ 5)

Предложенный метод количественного анализа белковых смесей (Рис 6) с использованием данных реагентов включает в себя (1) денатурирование белка,

Белок А в образце 1

I

Протеопиз трипсином

Белок А в образце 2

I

Пептиды модификация концевых Пептиды белка А в аминогрупп пептидов белка А в образце 1 изотопными метками образце 2

+ МНг-пептид

СОЛ

ЫН-пептид

Легкая метка

Тяжелая метка

Ионная хроматография (30-50 фракций)

Обращеннофазовая хроматография с масс-спектрометрическим детектированием

масс-спектр

фрагментации 1 I

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1,1

Идентификация пептида

Рис. 6. Схема метода количественного анализа белковых смесей, основанного на модификации концевых аминогрупп получающихся при протеолизе пептидов изотопсодержащим пентафторфенолятом с последующим хроматомасс-спектрометрическим анализом

(2) алкилирование тиольных групп цистеина иодоацетамидом, (3) обработку трипсином, (4) модификацию пептидов пентафторфенил-4-анилино-4-оксобутаноатом, содержащим легкие или тяжелые изотопы (Рис 7), объединение образцов и (5) хроматомасс-спектрометрический анализ

Рис 7 Структура изотопной метки на концевые аминогруппы Реакционной Фуппой является пентафторфениловый эфир, присоединенный к группе несущей тяжелые или легкие изотопы, 5 атомов протия или дейтерия в арильном положении или 6 арильных атомов углерода 12С или 13С

Известно, что при использовании в качестве изотопных пар алкильных атомов протия/дейтерия при хроматографии на обращенной фазе происходит разделение изотопных форм, поэтому дизайн метки предусматривает арильное положение атомов дейтерия, что способствует нивелированию изотопного эффекта (Рис 8) Также нами были синтезированы метки содержащие атомы, не проявляющие изотопного эффекта Одна из меток содержит 6 атомов 1ЭС в бензольном кольце, вторая атом 15И и два атома 13С в алкильном положении Использование этих меток наряду с легкой изотопной формой позволяет осуществлять одновременный анализ трех образцов

Хроматограммы ионов Масс-спектр

Рис. 8. Пептиды, модифицированные пентафторфенил-4-анилино-4-оксобутаноатом сЮ и с!5 имеют близкий хроматографический профиль

Оптимизация эффективности условий модификации выполнялась с использованием трипсинового лизата БСА путем сравнительного протеомического анализа аликвот пептидов БСА, меченных в различных условиях легкой и тяжелой метками соответственно В оптимальных условиях ~80% детектированных пептидов были модифицированы исключительно по концевой аминогруппе, менее 5% имели также модифицированный лизин и оставшиеся ~15% были немодифицированными

Для оценки точности метода нами было произведено количественное сравнение двух смесей очищенных белков с заранее известными значениями концентраций (Рис 9) Точность определения составила от 3 до 20% относительной погрешности в

у = О985х R!=0 996

х 2 в '

Название белка Рассчи танное отношение Измеренное отношение Число изото пных пар Покры тие*, %

БСА 0 20 0 24±0 15 12 31

Кональбумин 500 4 82±0 62 19 28

Глюкозоксидаза 400 3 84+0 38 5 11

Яичный альбумин 0 33 0 36±011 10 19

Казеин 3 33 3 49±0 41 2 17

Химотрипсиноген 2 00 2 07±0 39 3 12

0 2 4 6

Ожидаемое отношение

Рис. 9. Корреляция экспериментально измеренных и рассчитанных отношений концентраций для шести белков в двух смесях * - отношение суммы аминокислотных остатков в идентифицированных пептидах к общей длине аминокислотной последовательности белка

Дополнительное преимущество разработанных меток связано с особенностями фрагментации модифицированных пептидов в условиях тандемной масс-спектрометрии Поскольку изотопная метка соединена с пептидом посредством пептидной связи, которая может участвовать во фрагментации, спектры диссоциации содержат характерные Ьо ионы, имеющие структуру 2,5-диоксо-1-фенилпирролидиния, что повышает информативность спектров (Рис 10) Также в спектрах модифицированных пептидов появляются обычно не образующиеся ai и bi ионы В большинстве случаев при модификации наблюдается улучшение МС-МС спектров пептидов, что облегчает их правильную автоматическую интерпретацию компьютерными программами и приводит к определению большего числа пептидов Дальнейшее тестирование эффективности разработанного метода проводилось при анализе биологических объектов (глава 4)

к.

! И! 1.

г-^

llji,.......Ii i JliufcliU

Vfi cnn 700 600 *

1«M4 1««.J

304

2«.P«we**mt J1F2.CI Г1 №0.1« ■«gl E I ' E

Б

I » I « I

° I E I s I s ] ' I 0 I T

Д J,ill

8Ш 87 .

Ml

<»2.4 VI3

U4» 23517844 <rJt:T$4t l 3

Рис. 10. MC-MC спектры пептида AAEEAFVNDIDESSPGTEWER 3+. А. Модификация пентафторфенил-4-анилино-4-оксобутаноатом повышает информативность спектра (верхний спектр). Б. Спектр немодифицированного пептида.

3. Биоинформатика.

Так как при протеомическом анализе сложных белковых смесей генерируется значительное количество экспериментальных данных (10-100 Гб), автоматизированная обработка данных является важным элементом анализа. В этой связи для интерпретации масс-спектрометрических данных нами был разработан комплекс биоинформатических программ на основе пакета SpectrumMill (Agilent Technologies). Для каждого MC-MC спектра вычислялся заряд и масса исходного иона, заряды и массы ионов-продуктов В качестве количественной характеристики исходного иона (пептида) вычислялась площадь пика на ионной хроматограмме (Рис. 7) с заданными допустимыми отклонениями массы и времени.

Идентификация МС-МС спектров осуществлялась путем сопоставления каждого экспериментального спектра с моделированными спектрами фрагментации пептидов, полученными из базы аминокислотных последовательностей белков UniProt (www.ebi.uniprot.org). Каждому пептиду присваивалось значение счета (баллы начислялись за совпавшие пики и вычитались за несовпавшие) и значение суммарной интенсивности совпавших пиков (ИСП). Пептид, получавший наибольший счет использовался для идентификации соответствующего спектра.

Для определения пороговых значений счетов и ИСП, при которых идентификацию пептида можно было считать статистически достоверной, рассчитывалась вероятность случайных совпадений путем вычисления значений счета и ИСП в базе несуществующих (ложных) белковых последовательностей, полученной путем инверсии оригинальных аминокислотных последовательностей белков Все идентификации спектров, полученные с помощью базы обращенных последовательностей принимались ложноположительными (ЯП), а идентификации в истинной базе - суммой ЯП и истинноположительных (ИП) Разработанная нами программа позволяет вычислять значения ЛП и ИП как функции от счета и ИСП и определять пороговые значений этих параметров для ограничения ЛП на уровне менее заданного, например, менее 5% (Рис 11)

Базы аминокислотных последовательностей белков часто содержат повторяющиеся последовательности (дубликаты, гомологичные белки), поэтому вторым важным аспектом биоинформатической обработки данных являлось исключение «тавтологий», т е отнесения пептидов одного белка к разным записям в базе данных Для этого использовался алгоритм, по которому при отнесении одного и того же спектра к нескольким белкам, все данные белки объединялись в одну группу и белок имеющий наибольший счет (сумму значений счетов составляющих его пептидов) выбирался представителем для данной группы

Анализ биологических образцов для получения достоверных результатов, как правило, подразумевает проведение нескольких (трех и более) параллельных протеомических экспериментов Для обработки подобных данных нами была написана программа, осуществляющая нормализацию и усреднение результатов, основанное на средних арифметических и на медианных значениях Медианные значения использовались как более устойчивые к случайным отклонениям, которые ожидаемы на масс-спектрометрах с единичным разрешением Для коррекции ошибок связанных с использованием разного количества образца в параллельных экспериментах из масс-спектрометрических данных индивидуальных экспериментов вычисляли медианы отношений концентраций белков, которые использовали в качестве нормализационных коэффициентов Описанные биоинформатические приемы были применены при анализе биологических объектов, описанном в главе 4

А.

J \ t

\

8

10 11 12

13 14 Счет

15 16 17 18 19

ИП+ЛП, число 70 совпадений

□ 700-875 80 □ 525-700

□ 350-525 90 □ 175-350

□ 0-175

60 ЛП, число совпадений 70 □ 1000-1200

□ 800-1000 80 □ 600-800

□ 400-600 90 □ 200-400

□ 0-200

Рис 11 А. Распределение ЛП идентификаций МС-МС спектров двухзарядных ионов как функции от граничных значений счета и интенсивности совпавших пиков Пунктирной линией обозначен 5 % уровень ЛП Б, В Распределение числа идентификаций в истинной (Б) и ложной (В) базах

4. Протеомический анализ биологических объектов

Для изучения эффективности и воспроизводимости М-концевого мечения при анализе сложных белковых смесей разработанный нами метод был использован для анализа эндосом, выделенных из печени крыс после инъекции инсулина или эпидермального фактора роста или физиологического раствора В каждом случае был выполнен анализ трех независимых образцов Для одного образца в среднем было

получено 20750 MC/MC спектров, что соответствовало ~2700 пептидам (ЛП < 0.05), приведшим к идентификации 1080 белков, для 850 было также определено их количественное соотношение в образцах.

Эффективность изотопной модификации, определенная как отношение числа спектров меченых пептидов к общему числу спектров, составила в среднем 70% и была одинакова для белков с высокой и низкой концентрацией. В то же время, реакционная способность концевых аминогрупп существенно зависела от природы аминокислот, находящихся на первых двух позициях (Рис. 12); корреляций с аминокислотами расположенных на третьей и последующих позициях не обнаружено.

а.к. R Р V Q А I L К Т Y F S N G Е D н С М W все

G Э5 95 87 98 98 86 Ы 97 33 S7 87 97 32 88 86 77 - - 83'

Q 94 эз:: 90 86 30 87 72 71 71 84

Н 81 78 33 85 69 59 51 66 66 - 76 71

А V - 78 70 76 81 78 54 68 75 67 76 77 70 56 68 69 72 60 77 68 52 55 71 47 73 64 40 57 58 46 41 50 81 - - 68 66

К S Е 81 73 83 65 66 70 69 70 73 68 50 81 66 ш 69 56 92 75 70 67 41 69 57 67 57 52 81 59 53 49 63 63 50 46 48 53 52 47 - - - 65 64 63

N - 66 61 56 80 73 68 83 48 - 59 45 50 - 60 48 - - - - 62

Y D 82 78 61 57 68 64 68 74 S2 65 66 67 72 78 43 70 73 61 62 56 64 39 54 38 47 38 52 - 69 61 60

F 81 63 59 - 62 84 78 - 41 - 50 29 29 45 59

Т - 86 69 51 62 52 66 77 48 67 49 53 76 37 42 42 - - - - 58

! 63 80 72 78 59 71 60 60 50 57 38 57 36 50 42 43 34 - - - S7

L 69 66 71 50 60 60 63 55 50 53 54 37 46 44 40 38 28 - - - 55

С М R - 80 ■ 81 - 77 75 - - 74 - - : 51 48 - - 76 74

W - 71

все 78 77 73 72 70 70 70 68 66 62 61 61 60 53 52 60 45 77 71 57 70

Рис. 12. Зависимость эффективности модификации концевых аминогрупп от

аминокислотной последовательности. Представленные данные показывают процент числа спектров меченых пептидов от общего числа спектров пептидов, имеющих на первой позиции аминокислоту из соответствующей строки таблицы и на второй позиции аминокислоту из соответствующего столбца. Для построения корреляции использовался набор из ~25000 пептидов и каждое значение определялось с помощью как минимум 20 различных пептидов.

В случае, например, стерически легкодоступного глицина на Ы-конце достигалась наиболее высокая эффективность модификации, и наоборот, в случае аминокислот с большими гидрофобными заместителями, таких как лейцин, изолейцин

или фенилаланин модификация проходила менее эффективно. Неожиданный эффект был обнаружен для гистидина, который понижал эффективность мечения находясь во втором положении, и глутамина который в первом положении способствовал модификации. Аминокислоты с кислыми заместителями в первом и (в большей степени) во втором положении, как и ожидалось, понижали эффективность модификации вследствие ионных взаимодействий.

800 т- -

704

723

о О 600 -т О

* с

21

0 X

а> з 400

1 ? I ё

§ S 200

I =

~ о

5'i.W

Vi'! г

j П EGF ■ □ INS

394 384

>1 эксперимента >2 экспериментов 3 эксперимента

1400

1050

е; <и ю о с о

S

Т

700

350

I

и пар на бепок □ пар на 50 кДа

ЙП Л.ВП.яП

10 10+

Число изотопных пар

Рис. 13. А. Число белков количественно определенных в одной, двух и трех репликах для эндосом, выделенных из печени крыс после инъекции инсулина (INS) или эпидермального фактора роста (EGF). Б. Распределение белков по числу изотопных пар, приходящихся на один белок (показано темно-серым) или на каждые 50 кДа массы белка (показано светло-серым).

Более глубокое понимание описанных эффектов, возможно, позволит в будущем создать метки с лучшими скоростями и селективностью модификации, тем не менее

даже 70% эффективность модификации позволила дать количественную оценку ~80% идентифицированных белков, ~45% белков были количественно определены в двух репликах и -30% во всех трех экспериментах (Рис 13а) В среднем было определено по 3 изотопных отношения для белка со средним размером 50 кДа (Рис 136)

Также мы использовали разработанный метод для сравнения белкового состава клеточных мембран пролиферирующих и дифференцированных клеток карциномы кишечника Сасо-2 Выполненный анализ позволил идентифицировать 969 уникальных белков, 803 из которых были определены количественно Для 13 белков была выполнена проверка результатов количественного анализа ортогональными биохимическими методами - с помощью измерения ферментативной активности и/или с помощью иммуноблотинга Получена удовлетворительная корреляция между методами (наклон 1 02, г2 0 74), которая представлена на Рис 14

В заключение следует отметить, что описанный метод количественного анализа белков, основанный на изотопной модификации концевых аминогрупп пептидов представляет собой простой, удобный в использовании и точный способ для количественного сравнения сложных белковых смесей В двух независимых экспериментах, выполненных с использованием биологических образцов, содержащих более 1000 белков количественно проанализированы более 70% белков (в среднем по трем изотопным парам для каждого белка) Данный факт подчеркивает преимущество метода с использованием мечения концевых аминогрупп пептидов по сравнению с методами, основанными на модификации только определенных аминокислот, как например цистеина Корреляция отношений белков, полученных с помощью изотопной модификации и масс-спектрометрии с отношениями, полученными биохимическими методами подтверждает точность результатов, получаемых с помощью разработанного метода В сравнении с ранее широко использовавшимся методом протеомического анализа, включающим одномерный гель-электрофорез с последующим хроматомасс-спектрометрическим анализом, метод с изотопной модификацией и двумерной хроматографией позволяет идентифицировать такое же количество белков, используя меньшее количество стартового материала (50 мкг против 200 мкг) и за меньшее время масс-спектрометрического анализа (90 часов против 880 часов)

0 -I-1-1-1-1-r-

0 2 4 6 8 10

Название белка Отношение (биохимич) Отношение (протеомич )

NaVK* - АТПаза (бета 1) 0 52 (блот *) 0 63 ± 0 30 (3")

Клатрин (тяжелая цепь 1) 0 91 (блот) 0 93 ±0 46 (145)

Дипептидилпептидаза 4 1 42 (акт) 1 93 ± 0 68 (75)

Глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа 1 77 (блот ,акт ) 2 46 ± 1 26 (37)

Глкжозо-6-фосфат изомераза 1 85 (акт) 6 45 ± 1 25 (32)

Лакгатдегидрогеназа (цепь В) 1 92 (акт) 2 54 ± 1 58 (56)

Глутатион-Э-трансфераза Р 1 98 (акт) 2 29 ± 1 42 (24)

Изоцитратдегидрогеназа 2 99 (акт) 2 96 ±1 48 (31)

Пируват киназа М1/М2 3 08 (акт) 2 38 ± 1 62 (39)

TIP47 3 12 (блот) 3 04 ± 1 56 (5)

Виллин 1 3 21 (блот) 3 11 ± 1 41 (72)

Альдегиддегидрогеназа 5 05 (акт) 3 58 ± 0 58 (9)

Сукраза/изомальтаза 10 0 (блот) 8 27 ± 2 52 (44)

Рис 14. Проверка результатов масс-спектрометрического протеомического анализа с помощью биохимических методов Незакрашенные точки были исключены из вычисления коэффициента линейной регрессии * - иммуноблотинг (блот ), измерение ферментативной активности (акт) ** - в скобках приведено число изотопных пар

Выводы

1 Разработаны реагенты и метод количественного определения белков с использованием селективной изотопной модификации тиольных групп с последующим ковалентным выделением меченых пептидов на твердофазной матрице

2 Разработаны реагенты и метод количественного анализа сложных белковых смесей, основанный на селективной изотопной модификации концевых аминогрупп пептидов Продемонстрирована эффективность фрагментации меченых пептидов в условиях тандемной масс-спектрометрии

3 Разработан комплекс биоинформатических программ для анализа данных, получаемых при масс-спектрометрическом анализе сложных белковых смесей

4 Метод количественного анализа с использованием N-концевого мечения пептидов применен к исследованию биологических объектов, продемонстрирована его точность и эффективность по сравнению с используемыми ранее методами

5 С использованием разработанных методов впервые исследовано изменение белкового состава мембран при дифференциации клеток карциномы кишечника и показано что дифференциация приводит к селективной экспрессии на клеточной мембране более 150 белков, включая новые ранее неизвестные клеточные каналы

Список публикаций

1 A Pshezhetsky, M Fedjaev, L Ashmarina, A Mazur, L Budman, D Sinnet, D Labuda, JF Beaulieu, D Menard, I Nifant'ev, E Levy, Subcellular proteomics of cell differentiation quantitative analysis of the plasma membrane proteome of Caco-2 cells, Proteomics 2007, 7(13), 2201 -2215

2 M. Fedjaev, S Trudel, N Tjon-A-Pan, I Nifant'ev, A Pshezhetsky, Quantitative Analysis of a Proteome by N-terminal Stable-Isotope Labeling of Peptides, Rapid Commun Mass Spectrom , 2007, 21(16), 2671 - 2679

3 M. Федяев, И Нифантьев, А Пшежецкий, Новый метод количественного масс-спектрометрического анализа белковых смесей с использоваием селективных изотопных меток на цистеин, Масс-спектрометрия, 2007, 4(3), 218-222

4 Fediaev M , Trudel S , Nifantiev I and Pshezhetsky A , SIMPL, Stable Isotope-contaimng Matrix-Purifiable Labels for proteomics, Réseau Protéomique de Montréal - Montreal Proteomics Network Scientific Advisory Board Meeting,

Montreal, Canada, Jun 4-5, 2003

5 S Trudel, M Fedyaev, I Nifantiev and A Pshezhetsky, SIMPL, Stable Isotope-containing Matnx-Purifiable Labels for proteomics, HUPO 2nd Annual & IUBMB XIX World Congress, Montreal, Canada, Oct 8 - 11, 2003

6 S Trudel, M. Fedjaev, I Nifant'ev, AV Pshezhetsky, SIMPL a novel technology for protein quantification based on isotopic labeling, Réseau Protéomique de Montréal -Montreal Proteomics Network Scientific Advisory Board Meeting, Montreal, Canada, May 11 - 12, 2004

7 LI Budman, M Fedjaev, A Mazur, S Trudel, E Levy, and AV Pshezhetsky, Integrated proteomics analysis of cell differentiation, Réseau Protéomique de Montréal - Montreal Proteomics Network Scientific Advisory Board Meeting,

Montreal, Canada, May 11-12, 2004

8 L I Budman, S Trudel, A Mazur, M Fedjaev, M Zoltowska, С Garofalo, E Levy, A Pshezhetsky, Integrated proteomics analysis of cell differentiation, 4th International Conference of the Canadian Proteomics Initiative, Montreal, Canada, May 14 - 16, 2004

9 S Trudel, M. Fedjaev, L Budman, I Nifantiev, A Pshezhetsky, A New Technology for Proteomics SIMPL, Stable Isotope-Containing Matrix Purifiable Labels, 52nd Annual ASMS Conference, Nashville, Tennessee, USA, May 24- 27, 2004

10 I Nifant'ev, S Trudel, M. Fedjaev, A Pshezhetsky, SIMPL A Novel Technology for Protein Quantification Based on Isotopic Labelling, HUPO 3rd Annual World Congress, Beijing, China, Oct 25 - 27, 2004

11 A Pshezhetsky, L Budman, A Mazur, S Trudel, I Nifant'ev, M. Fedjaev, M Zoltowska, С Garofalo, E Levy, Integrated Proteomics Analysis of Cell Differentiation, HUPO 3rd Annual World Congress, Beijing, China, Oct 25 - 27, 2004

12 M Fedjaev, E Kanshin, О Shirobokov, I Nifant'ev, A Pshezhetsky, SIMPL A Novel Technology for Protein Quantification Based on Isotopic Labeling, Keystone Symposium on Proteomics and Bioinformatics, Keystone, Colorado, USA, Apr 8-13, 2005

13 M. Fedjaev, E Kanshin, A Mazur, i Nifant'ev, A Pshezhetsky, Global Isotopic Labeling of Protein Digests Application in Quantitative Proteomics and Phosphoproteomics, 54th Annual ASMS Conference, Seattle, Washington, USA, May 28-31, 2006

Подписано в печать 10 10 2007 Формат 60x88 1/16 Объем 1 пл Тираж 100 экз Заказ № 672 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г Москва, Ленинские горы, д 1 Главное здание МГУ, к А-102

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Федяев, Михаил Владимирович

1. Введение.

2. Литературный обзор.

2.1. Протеомика: задачи и методы.

2.2. Сиквенирование белков и масс-спектрометрия.

2.2.1. Деградация Эдмана.

2.2.2. Бомбардировка быстрыми атомами.

2.2.3. Ионизация в электроспрее.

2.2.4. Ионизация МА1Л)1.

2.2.5. Тандемные масс-спектрометры.

2.2.6. Основы интерпретации тандемных масс-спектров пептидов.

2.2.7. Современные задачи.

2.3. Изотопные метки специфичные к тиольным группам.

2.3.1. Селективная модификация цистеина.

2.3.2. Метки 1САТ.

2.3.3. Другие метки.

2.4. Изотопные метки специфичные к аминогруппам.

2.4.1. Селективная модификация аминогрупп лизина.

2.4.2. Восстановительное диметилирование.

2.4.3. Метки ГГггк!.

2.4.4. Метод 1У1САТ.

2.4.5. Другие метки.

3. Экспериментальная часть.

3.1. Синтез изотопных реагентов.

3.2. Модификация белков и пептидов изотопными метками.

3.3. Гель-электрофорез.

3.4. Хроматомасс-спектрометрический анализ.

3.5. Биоинформатика.

3.6. Биологические эксперименты.

3.7. Протеомический анализ биологических объектов.

3.8. Биохимические эксперименты.

4. Обсуждение результатов.

4.1. Метод изотопных аналогов с использованием меток специфичных к тиольным группам.

4.2. Метод изотопных аналогов с использованием меток специфичных к концевым аминогруппам пептидов.

4.3. Биоинформатика.

4.4. Протеомический анализ биологических объектов.

5. Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Новые методы количественного масс-спектрометрического анализа белковых систем с использованием селективных изотопных меток"

Протекание биологических процессов (как то фаза роста, метаболический цикл, патологические изменения или воздействие лекарства) связано с изменением белкового состава клеток или биологических жидкостей. В этой связи глобальное исследование различных протеомов (наборов всех белков клетки, ткани и т.п.) -является первостепенной задачей, как для фундаментального понимания биологических процессов, так и для разработки новых методов лечения или диагностики различных болезней.

К решению данной задачи можно подходить путем сравнения различных протеомов для выявления белков, содержание которых значительно меняется в ответ на определенное воздействие, например, заболевание, и которые представляют наибольший интерес для дальнейшего изучения. Данными исследованиями занимается сравнительная протеомика, все более важным требованием к которой становится способность количественной оценки изменений белкового состава клетки, ткани или физиологической жидкости. В то же время масс-спектрометрия, которая продолжает играть ключевую роль в протеомических исследованиях, сама по себе не является количественным методом и нуждается в дополнительных аналитических методах. Наиболее признанной методологией в настоящее время является дериватизация белков (пептидов) с

О 13 1 ^ 1Я использованием стабильных изотопов ("Н, С, 10О) для создания "изотопных аналогов" (Рис. 1).

Можно выделить 3 основные группы методов введения стабильных изотопов: метаболические, энзиматические протеолитические) и химические. Метаболические методы заключаются в использовании изотопсодежащих исходных веществ для процессов обмена веществ, например, при росте клеток. Энзиматические методы основаны на проведении протеолиза белков в обычной и тяжелой (,80) воде. Основным преимуществом энзиматических и метаболических методов является отсутствие дополнительных стадий в процессе приготовления образцов, в то же время существует и ряд фундаментальных ограничений. Так, например, в случае метаболических методов использование тяжелых изотопов часто приводит к нарушению биологических процессов, кроме того, данные методы применимы в основном только для клеточных моделей. Для протеолитических методов одной из основных проблем является различная степень введения изотопов, а также обратный изотопный обмен, что может приводить к значительным ошибкам измерений и снижению чувствительности вследствие уменьшения интенсивности сигнала. По причине использования только двух (легкого и тяжелого) изотопов анализ также ограничен одновременным сравнением не более чем двух образцов, а небольшая разница в массе приводит к перекрыванию изотопных кластеров, что затрудняет интерпретацию получаемых данных.

Химические методы, основанные на селективной ковалентной модификации белков или полученных при протеолизе пептидов реагентами, содержащими стабильные изотопы, включают в себя те, в которых селективно модифицируется определенный аминокислотный остаток (например, цистеин), и методы, основанные на модификации функциональных групп присутствующих практически в любом пептиде, полученном при протеолизе белка, например, терминальных аминогрупп. Химические методы, таким образом, являются наиболее универсальными и представляют наибольший интерес.

На данный момент существует ряд изотопных реагентов описанных в печати (см. обзоры [1, 2]) и некоторые из них являются коммерчески доступными. Тем не менее, различные недостатки существующих решений и растущие потребности протеомики указывают на необходимость разработки более совершенных методов.

Белок А в образце 1 введение изотопов протео^ лиз выделение на матрице легкии

Белок А в образце 2 промывка -► жх-мс/мс

Рис. 1. Пример схемы количественного анализа белковых смесей с использованием метода изотопного аналога. Зеленым цветом обозначен легкий изотоп, красным -тяжелый.

Данная работа описывает разработку и использование двух взаимодополняющих методов количественного анализа белковых систем. Первый метод, обеспечивающий увеличение чувствительности анализа за счет упрощения анализируемой смеси, основан на быстрой и селективной изотопной модификации тиольных групп белков с последующим ковалентным выделением меченых пептидов на твердофазной матрице и их масс-спектрометрическим анализом. Второй метод заключается в изотопной модификации терминальных аминогрупп пептидов, полученных при протеолизе белка, что обеспечивает наиболее полную идентификацию аминокислотной последовательности анализируемых белков и, следовательно, более точную количественную информацию, а также позволяет проводить анализ посттрансляционных модификаций.

2. Литературный обзор.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Федяев, Михаил Владимирович

5. Выводы.

1. Разработаны реагенты и метод количественного определения белков с использованием селективной изотопной модификации тиольных групп с последующим ковалентным выделением меченых пептидов на твердофазной матрице.

2. Разработаны реагенты и метод количественного анализа сложных белковых смесей, основанный на селективной изотопной модификации концевых аминогрупп пептидов. Продемонстрирована эффективность фрагментации меченых пептидов в условиях тандемной масс-спектрометрии.

3. Разработан комплекс биоинформатических программ для анализа данных, получаемых при масс-спектрометрическом анализе сложных белковых смесей.

4. Метод количественного анализа с использованием 1Ч-концевого мечения пептидов применен к исследованию биологических объектов, продемонстрирована его точность и эффективность по сравнению с используемыми ранее методами.

5. С использованием разработанных методов впервые исследовано изменение белкового состава мембран при дифференциации клеток карциномы кишечника и показано что дифференциация приводит к селективной экспрессии на клеточной мембране более 150 белков, включая новые' ранее неизвестные клеточные каналы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Федяев, Михаил Владимирович, Москва

1. Leitner A., Lindner W. Chemistry meets proteomics: the use of chemical tagging reactions for MS-based proteomics // Proteomics 2006. - № 6 -C. 5418-5434.

2. Leitner A., Lindner W. Current chemical tagging strategies for proteome analysis by mass spectrometry // J. Chromatogr. B 2004. - № 813 -C. 1 -26.

3. Biemann K., Gapp F., Seibl J. Amino acid sequence in peptides // J. Am. Chem. Soc. 1959. - №81, C. 2274 - 2275.

4. Edman P. Method for determination of the amino acid sequence in peptides // Acta Chem. Scand. 1950. - № 4, C. 283-293.

5. Edman P., Begg G.A. A protein sequenator // Eur. J. Biochem. 1967. -№ 1, C. 80-91.

6. Biemann K. Four decades of structure determination by mass spectrometry: from alkaloids to heparin // J. Am. Soc. Mass Spectrom. -2002. -№ 13, c. 1254-1272.

7. Fast atom bombardment of solids (F.A.B.): a new ion source for mass spectrometry / Barber M., Bordoli R.S., Sedgwick R.D., Tyler A.N. // J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1981. - № 7, C. 325-327.

8. Fast atom bombardment of solids as an ion source in mass spectrometry / Barber M., Bordoli R. S., Sedgwick R. D., Tyler A. N. // Nature 1981. -№ 293, C. 270-295.m

9. Haddon W.F., McLafferty F.W. Metastable Ion Characteristics. VII. Collision-Induced Metastables // J. Am. Chem. Soc. 1968. - № 90, C. 4745-4746

10. Jennings K.R. Collision-induced decompositions of aromatic molecular ions // Int. J. Mass Spectrom. Ion Phys. 1968. - № 1, C. 227-235.

11. Biemann K. The Primary structure of thioredoxin from Chromatium vinosum determined by high-performance tandem mass spectrometry // Anal. Chem. 1986. - № 58, C. 1289A- 1300A.

12. Yamashita M.,. Fenn J.B. Another Variation on the free-jet theme // J. Phys. Chem. 1984. - № 88, C. 4451 - 4459.

13. Yamashita M., Fenn J.B. Negative ion production with the electrosprayion source // J. Phys. Chem. 1984. - № 88, C. 4671 - 4675.t

14. Dole M., Mack L.L., Hines R.L. Molecular Beams of Macroions // J. Chem. Phys. 1968. - Том 49; № 5, С. 2240 - 2249.

15. On the working characteristics of the ion source with electrohydrodinamic introduction of liquids into the mass spectrometer / Alexandrov M.L., Gall L.N., Krasnov N.V. и др. // Int. J. Mass Spectrom. Ion Phys. 1983. -'№46, C. 231-235.

16. Расчет свободной поверхности проводящей жидкости, находящейся в сильном электрическом поле / Александров M.JL, Галль JI.H., Иванов В.Я., Николаев В.И. // Известия АН СССР. Механика жидкости и газа. 1983. - №>6, С. 165 - 167.

17. Экстракция ионов из растворов при атмосферном давлении новый метод масс-спектрометрического анализа / Александров М.Л., Галль Л.Н., Краснов Н.В. и др. // ДАН СССР - 1983. - Том 277; №2, С. 379-383.

18. Прямая стыковка микроколоночного жидкостного хроматографа с масс-спектрометром / Александров M.JI., Галль Л.Н., Краснов Н.В. и др. // Биоорганическая химия 1984. - № 10, С. 710 - 711.

19. О механизме образования ионов при электрогидродинамическом распылении жидкости в вакуум / Александров М.Л., Галль Л.Н., Краснов Н.В. и др. //ЖАХ 1984. - № 39, С. 1596 - 1602.

20. Метод масс-спектрометрического анализа труднолетучих термически нестабильных веществ, основанный на экстракции ионов из растворов при атмосферном давлении / Александров М.Л., Галль Л.Н., Краснов Н.В. и др. // ЖАХ 1985. - Том 40; № 9, С. 1560 -1567.

21. Галль Л.Н., Туркина М.Я. Возможности масс-спектрометрического анализа нелетучих и термически нестабильных биоорганических соединений // Успехи химии 1985. - Том 65; № 5, С. 741 - 745.

22. Новый массспектрометрический метод определения аминокислотной последовательности пептидов / Александров М.Л., Галль Л.Н., Барам Г.И. и др. // Биоорганическая химия 1985. - Том 11, №5, С. 705 -708.'

23. New developments in biochemical mass spectrometry: electrospray ionization // Smitlj R.D., Loo J.A., Edmonds C.G. h Ap- H Anal. Chem. -1990. Tom 62; № 9, C. 882 - 899.

24. Verentchikov A.N., Ens W., Standing K.G. Reflecting time-of-flight mass spectrometer with an electrospray ion source and orthogonal extraction // Anal. Chem. 1994. - Tom 66; № 1, C. 126 - 133.

25. Electrospray interface for liquid chromatographs and mass spectrometers / Whitehouse C.M., Dreyer R.N., Yamashita M., Fenn J.B. // Anal. Chem. 1985. - № 57, C. 675 - 679.

26. Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules / Fenn J.B., Mann M., Meng C.K. h äP- // Science 1989. - № 246, C. 64-71.

27. Mass Spectrometric Sequencing of Proteins from Silver-Stained Polyacrylamide Gels / Shevchenko A., Wilm M., Vorm O., Mann M. // Anal. Chem. 1996. - № 68, C. 850 - 858.

28. Femtomole sequencing of proteins from Polyacrylamide gels by nano-electrospray mass spectrometry / Wilm M., Shevchenko A., Houthaeve T. h «p. // Nature 1996. - № 379, C. 446 - 469.

29. Karas M., Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding lO'OOO daltons // Anal. Chem. 1988. - № 60,vi.1. C. 2299-3201.

30. Design and performance of a mass-analysed ion kinetic energy (MIKE) spectrometer / Beynon J.H., Cooks R.G., Amy J.W. h ^p. // Anal. Chem.1973. № 45, C. 1023A - 1027A.qi

31. High-resolution tandem mass spectrometer (MS/MS) of increased sensitivity and mass range / McLafferty F.W., Todd P.J., McGilvery D.C., Baldwin M.A. //J. Am. Chem. Soc. 1980. - № 102, C. 3360 - 3363.

32. Yost R. A., Enke C. G. Selected ion fragmentation with a tandem quadrupole mass spectrometer // J. Am. Chem. Soc. 1978. - № 100, C. 2274 - 2275.

33. McLuckey S.A., Glish G.L., Cooks R.G. Kinetic energy effects in mass spectrometry: mass spectrometry using a sector-quadrupole tandeminstrument. // Int. J. Mass Spectrom. Ion Phys. 1981. - № 39, C. 219 - 230.li

34. Ion trap mass spectrometry. Using high-pressure ionization. / McLuckey S.A, Van Berkel G.J., Goeringer D.E., Glish G.L. // Anal. Chem. 1994. - № 66, C. 737A - 743A.

35. Jonscher K.R., Yates J.R. The quadrupole ion trap mass spectrometer a small solution to a big challenge // Anal. Biochem. - 1997. - № 244, C. 1 - 15.

36. Wiley M.C., McLaren I.H. Time-of-flight mass spectrometer with improved resolution // Rev. Sci. Instrum. 1955. - № 26, C. 1150 - 1162.

37. Cotter R.J. Time-of-flight mass spectrometry: instrumentation andifapplications in biological research Washington, D.C.: American Chemical Society, 1997. - 121c.

38. Marshall A.G., Hendrickson C.L., Jackson G.S. Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry: a primer // Mass Spectrom. Rev. -1998.-Tom 17;№'l,C. 1-35.

39. Comisarow M.B., Marshall A.G. Fourier transform ion cyclotron resonance spectroscopy I I Chem. Phys. Lett. 1974. - Том 25; № 2, С. 282 -283.

40. Hardman M., Makarov A. A. Interfacing the orbitrap mass analyzer to an electrospray ion source // Anal. Chem. 2003 - Том 75; № 7, С. 1699 - 1705.

41. The Orbitrap: a new mass spectrometer / Hu Q., Noll R.J., Li H. и др. // J. Mass Spectrom. 2005. - Том 40; № 4, С. 430 - 443.

42. Явор М.И., Веренчиков А.Н. Планарный многоотражательный времяпролетный масс-анализатор, работающий без ограничения диапазона масс // Научное приборостроение 2004. - Том 14; № 2, С. 38 -45.м

43. Многоотражательный времяпролетный масс спектрометр с ионной ловушкой на входе / Козлов Б.Н., Труфанов А.С., Явор М.И. и др. // Научное приборостроение 2006. - Том 16; N2 3,С. 40-48.

44. McCormack A.L., Jones J.L., Wysocki V.H. Surface-induced dissociation of multiply protonated peptides // J. Am. Soc. Mass Spectrom. -1992.-№3, C. 859- 862.

45. Fragmentation of protonated peptides: surface-induced dissociation in conjunction with a quantum mechanical approach / McCormack A.L., Somogyi A., Dongre A.R., Wysocki V.H. // Anal. Chem. 1993. - № 65, C. 2859 - 2872. "Tr

46. Klose J. Protein mapping by combined isoelectric focusing and electrophoresis of mouse tissues. A novel approach to testing for induced point mutations in mammals // Humangenetik 1975. - № 26, C. 231 - 243.

47. Reduction and alkylation of proteins in preparation of two-dimensional map analysis: why, when, and how? / Herbert B., Galvani M., Hamdan M. h Ap. //Electrophoresis 2001. - № 22, C. 2040 - 2051.

48. Glazer A.N., DeLange R.J., Sigman D.S. Chemical modifications of proteins. New York: American Elsevier Publishing Co., 1975. - 208c.

49. Grant A. Synthetic peptides: a user's guide (advances in molecularbiology). New York: Gregory Oxford University Press, 2002 - 190c.i. .

50. Ozols J. Amino acid analysis // Meth. Enzymol. 1990 - № 182, C. 587- 601.

51. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags / Gygi S.P., Rist B., Gerber S.A. h «p. // Nat. Biotechnol. -1999.-№ 17, C. 994-999.

52. Abundance ratio-dependent proteomic analysis by mass spectrometry / Griffin T.J., Lock C.M., Li X.-J. h «p. // Anal. Chem. 2003. - Tom 75; № 4, C. 867 - 877.

53. A correlation algorithm for the automated quantitative analysis of shotgun proteomics data / MacCoss M.J., Wu C.C., Liu H. и др. // Anal. Chem. 2003. - Том 75; № 24, С. 6912 - 6921.

54. Moseley M.A.n Current trends in differential expression proteomics: isotopically coded tags // Trends Biotechnol. 2001. - № 19, C. S10 - S16.

55. Fractionation of isotopically labeled peptides in quantitative proteomics / Zhang R., Sioma C.S., Wang S., Regnier F.E. // Anal. Chem. 2001. -Том 73; № 21, C. 5142 -5149.

56. Zhang R., Regnier F.E. Minimizing resolution of isotopically coded peptides in comparative proteomics // J. Proteome Res. 2002 - Том 1; № 2, С. 139- 147.

57. Controlling deuterium isotope effects in comparative proteomics / R. Zhang, Sioma C.S., Thompson R.A. и др. // Anal. Chem. 2002. -Том 74; № 15, C. 3662 - 3669.

58. Li J., Steen H., Gygi S.P. Protein profiling with cleavable isotope-coded affinity tag (cICAT) reagents: the yeast salinity stress response // Mol. Cell. Proteomics 2003^- Том 2; № 11, С. 1198 - 1204.г

59. Low-energy collision-induced dissociation fragmentation analysis of cysteinyl-modified peptides / Borisov O.V., Goshe M.B., Conrads T.P. и др. // Anal. Chem. 2002. - Том 74; № 10, С. 2284 - 2292.

60. Quantitative proteome analysis by solid-phase isotope tagging and mass spectrometry / Zhou H., Ranish J.A., Watts J.D., Aebersold R. // Nat. Biotechnol. 2002. - Том 20; № 5, С. 512 - 515.

61. Quantitative chemical proteomics for identifying candidate drug targets / Oda Y., Owa T., Sato Т. и др. // Anal. Chem. 2003. - Том 75; № 9, С. 2159 -2165.

62. Evaluation of the acid-cleavable isotope-coded affinity tag reagents:application to camptothecin-treated cortical neurons / Yu L.-R.,j

63. Conrads T.P., Uo Т. и др. // J. Proteome Res. 2004. - Том 3; № 3, С. 469 - 477. лгл'

64. Membrane protease proteomics: Isotope-coded affinity tag MS identification of undescribed MT1-matrix metalloproteinase substrates / Tam E.M., Morrison C.J., Wu Y.I. и др. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. -2004. Tom 101; JV« 18, C. 6917 - 6922.

65. Acid-labile isotope-coded extractants: a class of reagents for quantitative mass spectrometric analysis of complex protein mixtures / Qiu Y., Sousa E.A., Hewick R.M., Wang J.H. // Anal. Chem. 2002. - Том 74; № 19, С. 4969-4979.

66. Element-coded affinity tags for peptides and proteins / Whetstone P.A., Butlin N.G., Corneillie T.M., Meares C.F. // Bioconjug. Chem. 2004. -Том15;№1,С. 3-6.

67. Enrichment of cysteine-containing peptides from tryptic digests using a quaternary amine stag / Ren D., Julka S., Inerowicz H.D., Regnier F.E. // Anal. Chem. 2004. - Том 76; № 15, С. 4522 - 4530.

68. Wang S., Zhang X., Fred E. Quantitative proteomics strategy involving the selection of peptides containing both cysteine and histidine from tryptic digests of cell lysates. // J. Chromatogr. A 2002. - Том 949; № 1 - 2, С. 153 - 162.

69. Darbre A. Practical protein chemistry: a handbook. New York: Wiley & Sons, 1986- 356c.

70. Semisynthetic D-His-l,N-epsilon-acetimidoglucagon: structure-functiont •relationships / Mahrenholtz A.M., Flanders K.C., Hoosein N.M. и др. // Arch. Biochem. Biophys. 1987. - Том 257; № 2, С. 379 - 386.

71. Nureddin A., Inagami T. Chemical modification of amino groups and guanidino groups of trypsin. Preparation of stable and soluble derivatives // Biochem. J. 1975. - Том 147; № 1, С. 71 - 81.

72. Chemoselective acylation of fully deprotected hydrazino acetyl peptides. Application to the synthesis of lipopetides / Bonnet D., Ollivier N., GrasMasse H., Melnyk O. // J. Org. Chem. 2001. - Том 66; № 2, С. 443 - 449.Г

73. Stable-isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics / Hsu J.-L., Huang S.-Y., Chow N.-H., Chen S.-H., Anal. Chem. 2003. - Том 75; № 24, С. 6843 - 6852.с,

74. Beyond quantitative proteomics: signal enhancement of the al ion as a mass tag for peptide sequencing using dimethyl labeling / Hsu J.-L., Huang S.-Y., Shiea J.-T. и др. // J. Proteome Res. 2005. - № 4, C. 101-108.

75. Quantitation of protein phosphorylation in pregnant rat uteri using stable isotope dimethyl labeling coupled with IMAC / Yuang S.-Y., Tsai M.-L., Wu C.-J. и др. // Proteomics 2006. - Том 6; № 6, С. 1722 - 1734.

76. Ji С., Li LJ. Quantitative proteome analysis using differential stable isotopic labeling and microbore LC-MALDI MS and MS/MS // J. Proteome Res. 2005. - Томг4; № 3, C. 734 - 742.

77. Ji С., Guo N., Li L. Differential dimethyl labeling of N-termini of peptides after guanidination for proteome analysis // J. Proteome Res. -2005. Tom 4; № 6', C. 2099 - 2108.r" />

78. Fu Q., Li L. De novo sequencing of neuropeptides using reductive isotopic methylation and investigation of ESI QTOF MS/MS fragmentation pattern of neuropeptides with N-terminal dimethylation // Anal. Chem. -2005. Tom 77; № 23, C. 7783-7795.

79. Melanson J.E., Chisholm K.A., Pinto D.M. Targeted comparative proteomics by liquid chromatography/matrix-assisted laser desorption/ionization triple-quadrupole mass spectrometry // Rapid Commun. Mass Spectrom. 2006. - Tom 20; № 5, C. 904 - 910.

80. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents / Ross P.L., Huang, Y.N., Marchese, J.N. h £p. // Mol. Cell. Proteomics 2004. - Tom 3; № 12, C. 1154- 1169.

81. Comparative study of three proteomic quantitative methods, DIGE, cICAT, and iTRAQ, using 2D gel- or LC-MALDI TOF/TOF / Wu W.W., Wang G., Baek S. J., Shen R.-F. // J. Proteome Res. 2006. - Tom 5; № 3, C. 651 -658.

82. A comparison of the consistency of proteome quantitation using two-dimensional electrophoresis and shotgun isobaric tagging in Escherichia coli cells / Choe L.H., Aggarwal K., Franck Z., Lee K.H. // Electrophoresis -2005. № 26, C. 2437 - 2449.

83. Williamson B.L., Marchese J., Morrice N.A. Automated identification and quantification of protein phosphorylation sites by LC/MS on a hybrid triple quadrupole linear ion trap mass spectrometer // Mol. Cell. Proteomics -2006. Tom 5; № 2, C. 337 - 346.

84. Improved peptide detection with matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry by trimethylation of amino groups / Stewart N.A., Pham V.T., Choma C.T. h #p. // Rapid Commu. Mass Spectrom. 2002r-sToM 16; № 15, C. 1448 - 1453.

85. Poon C., Kaplan H., Mayer P.M. Methylating peptides to prevent adduct ion formation also directs cleavage in collision-induced dissociation mass spectrometry // Eur. J. Mass Spectrom. 2004. - Tom 10; № 1, C. 39 - 46.as

86. Laremore T.N., Weber D.M., Chôma С.T. An evaluation of the utility of in vacuo methylation for mass-spectrometry-based analyses of peptides // Rapid Commun. Mass Spectrom. 2005. - № 19, C. 2045 - 2051.

87. Chakraborty A., Regnier F.E. Global internal standard technology for comparative proteomics // J. Chromatogr. A 2002. - Том 949, № 1 - 2, С. 173- 184.

88. Julka S., Regnier F.J. Quantification in proteomics through stable isotope coding: a review // Proteome Res. 2004. - Том 3; № 3, С. 350 -363.

89. Julka S., Regnier F.E. Recent advancements in differential proteomics based on stable isotope coding //Brief. Funct. Genomic. Proteomic. 2005. -Tom 4; № 2, C. 158- 177.

90. In-Gel Stable-Isotope Labeling (ISIL): a strategy for mass spectrometrybased relative quantification / Asara J.M., Zhang X., Zheng В. и др. // J. Proteome Res. 2006. - № 5, C. 155 - 163.

91. Strategy for qualitative and quantitative analysis in proteomics based on signature peptides / Ji J.,. Chakraborty A, Geng M. и др. // J. Chromatogr. В 2000. - Том 745; № 1, С. 197 - 210.

92. Wang S., Regnier F.E. Proteomics based on selecting and quantifying cysteine containing peptides by covalent chromatography // J. Chromatogr. A 2001. - Том 924; № 1 - 2, C. 345 - 353.

93. Geng M., Ji J., Regnier F.E. Signature-peptide approach to detecting1. Л1proteins in complex mixtures // J. Chromatogr. A 2000. - Том 870; №1-2, С. 295- 313.

94. Riggs L., Seeley E.H., Regnier F.E. Quantification of phosphoproteins with global internal standard technology 11 J. Chromatogr. B 2005. -Tom 817; № 1 - 2, C. 89-96.

95. Che F.-Y., Biswas R., Fricker L.D. Relative quantitation of peptides in wild-type and Cpe(fat/fat) mouse pituitary using stable isotopic tags and mass spectrometry // J. Mass Spectrom. 2005. - № 40, C. 227 - 237.

96. Che F.-Y., Fricker L.D. Quantitative peptidomics of mouse pituitary: comparison of different stable isotopic tags // J. Mass Spectrom. 2005. -№40, C. 238-249.

97. Peptidomics of Cpe fat/fat mouse hypothalamus: effect of food deprivation and exercise on peptide levels / Che F.-Y., Yuan Q., Kalinina E., Fricker L.D. // J. Biol. Chem. 2005. - Tom 280; № 6, C. 4451 - 4461.

98. Mason D.E., Liebler D.C. Quantitative analysis of modified proteins by LC-MS/MS of peptides labeled with phenyl isocyanate // J. Proteome Res. -2003,- №2, C. 265 -272.

99. Quantitation and facilitated de novo sequencing of proteins by isotopic•T

100. N-terminal labeling of peptides with a fragmentation-directing moiety / Miinchbach M., Quadroni M., Miotto G. h ap. // Anal. Chem. 2000. -Tom 72; № 17, C. 4047 - 4057.

101. Schmidt A., Kellermann J., Lottspeich F. A novel strategy for quantitative proteomics using isotope-coded protein labels // Proteomics -2005.-Tom 5; № 1, C. 4-15.cii

102. Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS / Thompson A., Schaefer J., Kuhn К. и др. // Anal. Chem. 2003. - № 75, С. 1895 - 1904.

103. Казанский Б.А. Синтезы органических препаратов. Т. 4. М.: Издательство иностранной литературы, 1953. - 453с.

104. Moore R.E., Young М.К., Lee T.D. Qscore: an algorithm for evaluating SEQUEST database search results // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2002. - Том 13; № 4, С. 378 - 386.

105. Evaluation of multidimensional chromatography coupled with tandemmass spectrometry (LC/LC-MS/MS) for large-scale protein analysis: the-лyeast proteome / Peng J., Elias J.E., Thoreen C.C. и др. // J. Proteome Res. -2003. Tom 2; № 1, C. 43 - 50.

106. Purification of the human intestinal brush border membrane / Schmitz J., Preiser H., Maestracci D. и др. // Biochim. Biophys. Acta. -1973. -Tom 323;№ 1, C. 98- 112.

107. Effect of inhibiting vacuolar acidification on insulin signaling in hepatocytes / Balbis A., Baquiran G., Dumas V., Posner B.I. // J. Biol. Chem. 2004. - № 279, C. 12777 - 12785.

108. Borgmann V., Moon T., Laidler K. Molecular kinetics of beef heart lactate dehydrogenase // Biochem. 1974. - № 13, C. 5152 - 5158.

109. Tietz A, Ochoa S. Fluorokinase and pyruvic kinase. // Arch. Biochem. Biophys. 1958. - Tom 78; № 2, C. 477 - 493.

110. Bergmeyer H.U. Methods of Enzymatic Analysis. New York: Academic Press, 1974. - 289c.

111. Pegoraro В., Yuan J.H., Lee C.Y. Purification and structural properties of isozymes of isocitrate dehydrogenase from the mouse // Mol. Cell Biochem. 1979. - Том 23; № 3, С. 177 - 184.

112. Feldman R.I., Weiner H. Horse liver aldehyde dehydrogenase. I. Purification and characterization // J. Biol. Chem. 1972. - Том 247; № 1, С. 260 - 266.

113. Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontologyui

114. Consortium / Ashburner M., Ball C.A., Blake J.A. и др. // Nat. Genet. -2000.-Том 25; № l,C.25-29.