Новое семейство генов иммунной системы млекопитающих, имеющих лизоцим-подобный домен, и их потенциальная применимость для генной терапии рака

Киселев, Сергей Львович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Новое семейство генов иммунной системы млекопитающих, имеющих лизоцим-подобный домен, и их потенциальная применимость для генной терапии рака
ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Новое семейство генов иммунной системы млекопитающих, имеющих лизоцим-подобный домен, и их потенциальная применимость для генной терапии рака"

На правах рукописи УДК 576.315.42

0 Л)1) лаь № /

КИСЕЛЕВ СЕРГЕЙ ЛЬВОВИЧ

НОВОЕ СЕМЕЙСТВО ГЕНОВ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ МЛЕКОПИТАЮЩИХ , ИМЕЮЩИХ ЛИЗОЦИМ-ПОДОБНЫЙ ДОМЕН, И ИХ ПОТЕНЦИАЛЬНАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ ДЛЯ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ

РАКА

Специальность 03.00.26- "молекулярная генетика"

Автореферат диссертации на соискание ученой степени донора биологических наук

Москва-2000

Работа выполнена в Институте биологии гена РАН

Научные консультанты:

академик РАН, доктор биологических наук,

профессор Георгиев Г.П.

чл.-корр. РАН, доктор биологических наук,

профессор Гнучев Н.В.

Официальные оппоненты:

академик РАН, доктор химических наук,

профессор Оводов Ю.С.

доктор биологических наук, профессор Поляновский О.Ю. доктор биологических наук, профессор Деев С.М.

Ведущая организация:

Институт иммунологии Министерства здравоохранения и медицинской промышленности РФ.

Защита состоится " 28 " декабря 2000 года в " 11-00 " часов на заседании Диссертационного совета Д.200.30.01 в Институте биологии гена РАН по адресу: 117334, г. Москва, ул.Вавилова, д.34/5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 117334, г. Москва, ул. Вавилова д. 32

Автореферат разослан " 28" ноября 2000 года

Ученый секретарь Диссертационного сове

канд. фарм. наук

Грабовская Л.С.

АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ

В настоящее время онкологические заболевания занимают одно из первых мест по проценту смертности и достаточно широко распространены во всем мире (Alberts et al., 1994; Bailar III & Gornic, 1997). Особенно важным для диагностики и терапии онкологических заболеваний является исследование механизмов опухолеобразования, противоопухолевого иммунитета и других аспектов данной проблемы. Существенные успехи в изучения этих прооцессов связаны с тем, что современная медицина все в большей мере начинает использовать достижения молекулярной биологии и генетики. Это находит свое выражение в практическом применении так называемой генной терапии в клинической практике. Генная терапия, направленная на лечение или предотвращение заболевания путем переноса гена(ов) в настоящее время признается одним из наиболее перспективных направлений в медицине. Это происходит вследствие того, что генная терапия направлена на лечение или удаление причин заболевания, в то время как большинство лекарств излечивает лишь симптомы заболевания. Применение методов генной терапии отразится на тех типах заболеваний, которые к настоящему моменту признаются неизлечимыми или трудно излечиваемыми. Онкологические заболевания как раз относятся к такому типу заболеваний.

Одной из причин опухолеобразования является толерантность иммунной системы организма к эндогенно возникшим антигенам опухоли. Целый ряд исследований направлен на то, чтобы с помощью методов генной терапии преодолеть существующую толерантность или

активизировать популяцию Т клеток, которая не приобрела толерантность к эндогенным антигенам опухоли. Эти исследования базируются на применении целого ряда молекул, которые тем или иным способом вовлечены во врожденный или приобретенный иммунитет нормального организма. Генеральная стратегия терапии базируется на введение в организм реципиента специфических опухолевых антигенов и так называемых «сигналов опасности», причем в связи с ограниченностью знаний в качестве доноров антигенов выступают сами опухолевые клетки, а роль «сигналов опасности» играет широкий спектр молекул: цитокины, стимуляторные молекулы, паттерн-распознающие белки и т.д.

Наша работа посвящена обнаружению, характеристике и генно-терапевтическому применению нового семейства генов, участвующих как в функционировании как врожденного, так и приобретенного иммунитета.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью данной работы являлась разработка генно-терапевтических подходов к лечению онкологических заболеваний и проверка их на животных моделях. Конкретные задачи исследования сводились к следующему:

1. клонировать ген(ы), которые могут быть применимы для генной терапии онкологических заболеваний;

2. изучить их функцию и роль, которую они играют в нормальном организме;

3. разработать методологию их использования для генно-терапевтического воздействия на опухоль;

4. на животных моделях оценить перспективность генной терапии опухолевых заболеваний;

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ Впервые клонирован ген tag7 млекопитающих. Определена его структура, локализация и экспрессия в органах и типах клеток нормального организма. Показано, что он представляет новый белок, содержащий домен гомологичный фаговому лизоциму. Показано, что белок Тад7 может индуцировать апоптоз в некоторых клеточных линиях и является хемоатрактантом. Характер экспрессии и функциональные особенности белка говорят о его участии как во врожденном, так и в приобретенном иммунном ответе организма.

Впервые показано, что ген tag7 является представителем нового семейства генов млекопитающих, эволюционно консервативных от насекомых до человека. Клонирован ген tagL млекопитающих, который имеет обширную область гомологии с геном tag7 в районе лизоцим-подобного домена. Продемонстрирована его экспрессия клетками иммунной системы организма и показано его возможное участие в иммунном ответе организма.

Разработаны животные модели для генной терапии опухолевых заболеваний. Впервые продемонстрирована возможность использования гена tag7 для индукции противоопухолевого ответа. Противоопухолевый ответ организма приводит к значительному снижению опухолевого роста за счет снижения опухолевой

пролиферации и активации апоптоза опухолевых клеток. На иммунодефицитных животных и иммуногистохимически продемонстрирована роль В клеток и натуральных киллеров в индуцированном противоопухолевом ответе организма. Впервые разработан метод противоопухолевой вакцинации, основанной на модификации опухолевых клеток геном tag7. Показана эффективность вакцинации на животных моделях. На основании полученных данных впервые разработан и утвержден Протокол первой фазы клинических испытаний противоопухолевой вакцины на основе генетически модифицированных клеток.

Полученные результаты имеют большое практическое и теоретическое значение. Определено и изучено новое семейство генов, вовлеченных в иммунный ответ млекопитающих. Продемонстрирована возможность и эффективность практического применения противоопухолевой вакцины на основе генетически модифицированных опухолевых клеток.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Основные результаты работы докладывались на различных отечественных и международных конференциях, рабочих совещаниях, семинарах. В том числе на II съезде Российского Биохимического Общества (Россия 1997), на 3-ей и 4-ой Международной Энгельгардтовской конференции по молекулярной биологии (Россия 1997, 1999), на II российском иммунологическом конгрессе (Россия, 1999), на международном симпозиуме Current problems of molecular genetics and cell biology, (Россия, 2000), на российско-французкой

конференции (Франция, 1998) на международной конференции Gene Therapy and Molecular biology (Греция, 1998, 1999, США, 1999), на II международном съезде всемирной цитокиновой ассоциации (Израиль, 1998), на рабочих совещаниях Boehringer Ingelheim (Австрия, 1998,1999).

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИТССЕРТАЦИИ Диссертация изложена страницах машинописного текста и

состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалов и методов, результатов и обсуждений, выводов и списка литературы. Библиография включает в себя источников. Работа

иллюстрирована ^ .^рисунками и .^"таблицами.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Клонирование и изучение генов tag7 млекопитающих Первой задачей исследования являлась обнаружение и исследование генов, которые могут быт использованы для целей генной терапии. Для этого был выбран подход основанный на сравнении картины экспрессии генов в опухолях с противоположными метастатическими свойствами. Для практического осуществления этой цели существует целый ряд подходов. Одни из них основаны на дифференциальной гибридизации кДНК библиотек с различными меченными мРНК (Epishin et al 1982), другие на методах истощения мРНК и последующего их анализа (Buchman et al, 1993). В дальнейшем был предложен простой и достаточно эффективный метод, получивший название дифференциального дисплея РНК (Liang et al, 1993).

Преимуществом данного метода является то, что он за короткое время и используя небольшие количества первичного материала позволяет идентифицировать фрагменты мРНК, уровень экспрессии которых различается в выбранных образцах. Для исследования были выбраны перевивные опухолевые и соответствующие им клеточные линии ВМР-0 и ВМР-П (Сенин с соавт. 1982). Опухоли являлись перевивной аденокарциномой молочной железы мыши, ВМР-0 являлась низко метастазирующей, а ВМР-П давала обильные метастазы в основном в печень. Для мРНК, выделенных из опухолевой ткани, была применена процедура дифференциального дисплея, которая позволила обнаружить целый ряд диффернциально экспрессирующихся последовательностей мРНК. Из них были выбраны фрагменты, которые имели повышенный уровень экспрессии в опухоли ВМР-П. Часть из них была взята на дальнейший анализ с помощью Нозерн-блот гибридизации. Один из фрагментов при гибридизации с тотальной РНК давал сильный гибридизационный сигнал с РНК из опухоли ВМР-П, но не гибридизовался с РНК опухоли ВМР-0. Ген, соответствующий полученному фрагменту, получил название tag7 (аббревиатура от Tumor Associated Gene) (Кустикова с соавт., 1996). Для клонирования полноразмерного гена была сконструирована библиотека из опухоли ВМР-П. Скрининг библиотеки позволил выделить полноразмерный ген, последовательность которого была помещена в базу данных ( Gene Bank, Х86374). Единственная гомология в структурной части гена обнаруживалась с фаговыми лизоцимами. На рис1. приведено сравнение аминокислотных последовательностей лизоцима фага Т7 и

белка Tag7. Как видно из рисунка гомология наблюдается на протяжении всего белка и составляла 31%. Моделирование третичной структуры подтвердило структурное сходство белков (рис 1Б). Фаговые лизоцимы имеют две функции. Первая- это их амидазная активность. Для проявления амидазной активности необходимо связывание ионоз цинка гистидинами в позиции 17 и 122, тирозином в позиции 46 и цистеином в позиции 130.

Рис1. Сравнение аминокислотных последовательностей генов семейства tag7 мыши, человека, и фагового лизоцима (А). Точками указаны основания, консервативность которых необходима для амидазной активности фагового лизоцима. (Б) Компьютерное моделирование трехмерной структуры белков

Как видно из рисунка, в белке Тад7 эти аминокислоты не консервативны и, таким образом, не способны связывать ионы цинка, что приводит к отсутствию амидазной активности белка. Другой функцией фаговых лизоцимов является ингибирование Т7 РНК полимеразы. Эта функции реализуется через чисто физическое и структурное взаимодействие. Как показало компьютерное моделирование, это условие выполняется и, таким образом, белок Тад7 может ингибировать ТЗ, SP6, Т7 РНК полимеразы прокариот. Однако, необходимо отметить, что РНК полимеразы прокариот имеют высокую степень гомологии с митохондриальными РНК полимеразами млекопитающих. Так,

митохондриальная РНК полимераза человека (U75370) на 27% идентична Т7 РНК полимеразе по всей ее длине. Таким образом, на основании структурной гомологии не исключено, что белок Тад7 может ингибировать транскрипцию с митохондриальной ДНК высших организмов.

Чтобы выявить, присутствует ли в составе генома человека гомолог мышиного гена 1ад7, был проведен Саузерн-блот гибридизационный анализ геномной ДНК человека с пробой кДНК tag7 мыши. Гибридизационный анализ позволил утверждать о наличии человеческого гомолога гена tag7 мыши у человека. Результаты Саузерн-блот-гибридизационного анализа позволили предположить высокую степень гомологии между геном tag7 мыши и его человеческим аналогом. В лаборатории молекулярной генетики рака имелся большой набор праймеров к кодирующей части гена tag7 мыши. Это позволило попытаться осуществить амплификацию человеческого гомолога с помощью реакции обратной транскрипции (ОТ)-ПЦР с гетерологичными праймерами в мягких условиях. В качестве матрицы в реакции ОТ была использована тотальная РНК, выделенная из лейкоцитов пациентов с Т-клеточной лейкемией. Для амплификации было использовано 8 пар праймеров. 5 из праймеров комплементарны кодирующей части гена tag7 мыши. Были использованы различные комбинации праймеров, котрые могли привести к появлению фрагмента ожидаемой величины. Пониженная температура отжига (37°С) позволяла ожидать, что гетерологичные праймера отожгутся на матрицу человеческой кДНК. Для элонгации вместо Тад-полимеразы была использована Pfu

полимераза, высокая 3'- экзонуклеазная активность которой позволяет удалить не спарившиеся нуклеотиды на 3' конце праймера и повысить специфичность полимеразной реакции. Было амплифицировано несколько фрагментов. Гибридизационный анализ с полученных фрагментов с человеческой и мышиной мРНК и геномной ДНК позволил выбрать среди них фрагмент размером 195 п.н., который соответствовал по молекулярной массе аналогичному фрагменту мышиного гена tag7. Этот фрагмент был субклонирован в плазмидный вектор и секвенирован. Сравнение полученной нукпеотидной

последовательности с банком данных выявило высокую степень гомологии (порядка 85%) с мышиным tag7 (рис.2) (Миркина с соавт 1999). Фрагмент фланкирован прямым и обратным праймерами к структурной части гена. На 3' -конце обратного праймера показана замена Т в нукпеотидной последовательности мышиного tag7 на С в последовательности человеческого гена, что является результатом работы Pfu полимеразы. Полученный фрагмент был использован для идентификации полноразмерной кДНК гена tag7. С этой целью была проанализирована коммерческая библиотека кДНК из клеток костного мозга человека, клонированная в векторе Я Zap (Stratagene). Было получено несколько клонов, секвенирование которых позволило установить полную нуклеотидную последовательность гена tag7 человека. С помощью компьютерной программы PCGENE была предсказана аминокислотная последовательность белка Тад7. В составе нуклеотидной последовательности tag7 была обнаружена одна открытая рамка считывания. Анализ нуклеотидной последовательности

позволил выявить два потенциальных старта трансляции (АТС), находящиеся в одной рамке на расстоянии 15 нуклеотидов друг от друга. Первый потенциальный старт трансляции удовлетворяет критерию Козак по нескольким параметрам: наличие цитозина в позиции -4, -5, -8, что характерно для консенсусной последовательности Козак, хотя пурин в позиции -3, в в позиции +4 и С в позиции -1 отсутствуют. Для второго

в CGGCAGCTTCTGCAACAGCCCC-GACTCCTGTGAACAGCAGGCCCGCAA h GGGCAGCTGCTGCAaCACCCCCGCCTCGTGCCAGCAGCAGGCCCGGAA

5 ' ( GGCAGC ГТ< TGCAAC

m TGTGCAGCATTACCACAAGAATGAGCTGGGCTGGTGCGATGTAGCCTAC h

m AACTTCCTTATTGGRGRoGjTCt;GTCA7GTCTATGA.^GGCCGlfiGSCtGGRA h AACTTCCTGATTGGAGAAGAÇGGGCTCGTATACGAGGGCCGTGGCTGGAA

h CTTCACGGGTGCCCACTCAGGTCACTTATGGAACCCCArGTCCATTGGC

~TT4tGU'J.'A(JAGATAA(JL'lï 5'

Ш Ш

Рис.2 Нуклеотидная последовательность фрагмента tag7 человека (h) размером 1Э5 п.н. и гомологичная ей последовательность tag7 мыши (m) того же размера. Стрелками указаны праймера, использованные для амплификации данного фрагмента. Закрашенные прямоугольники соответствуют областям со 100% идентичностью. На 3' -конце обратного праймера чертой обозначена замена Т в последовательности мышиного tag7 на С в последовательности человеческого (ад7.

потенциального старта трансляции критерий Козак не является строгим, поэтому за начало отсчета был принят первый метиониновый кодон. В этом случае открытая рамка считывания Тад7 человека содержит 196 аминокислот. У мышиного Тад7 открытая рамка считывания содержит 182 аминокислоты. Аминокислотная последовательность Тад7 человека проявляет высокую степень гомологии с Тад7 мыши (75% гомологии,

63% идентичных аминокислот) (Kiselev et al 1998) (рис.1А), a также гомологична пептидогликан-распознающему белку (PGRP), участвующему в антибактериальном иммунном ответе у насекомых Trichoplusia ni (43% идентичных аминокислот)(Капд et al 1998). Анализ аминокислотной последовательности Тад7 с помощью программы PCGENE позволил обнаружить потенциальный секреторный сигнал, локализованный с 8 по 22 аминокислоту. Наличие сигнальной последовательности характерно как для Тад7 человека, так и для его гомологов- PGRP насекомых и мышиного Тад7- и указывает на секреторный характер белка Тад7.

Было проведено клонирование геномной копии генов tag7 мыши и человека (Миркина с соавт., 1999). Ген fag 7 человека, как и его мышиный гомолог, состоит из трех зкзонов, разделенных интронами. Было установлено, что координаты экзон-интронных границ человеческого tag7 точно совпадают с мышиным гомологом.

В отличие от tag7 мыши и человека, при анализе геномной структуры PGRP насекомых Bombyx тогу было обнаружено, что этот гомолог tag7 содержит 4 экзона (Ochiai et al. 1999). Подобные различия в экзон-интронной организации гена у различных организмов были показаны, в частности, для лимфотоксина (3, человеческая геномная копия которого содержит 4 экзона по сравнению с 3 экзонами у мыши. К сожалению, отсутствие у Ochiai et al. данных анализа нуклеотидной последовательности в областях сплайсинга для PGRP не позволяет сравнить их расположение с tag7 млекопитающих.

В позиции -37 и -33 от старта трансляции, обозначенного как начало отсчета, у tag7 человека располагаются предсказанные путем компьютерного поиска с помощью программы TRANSFAC два потенциальных старта транскрипции. При этом необходимо отметить, что мышиный tag7 также характеризуется наличием двух стартов транскрипции, подтвержденных экспериментальным путем. Позиции стартов транскрипции у человеческого и мышиного tag7 совпадают.

Путем компьютерного поиска с помощью программы TRANSFAC в позиции -63 был обнаружен неканонический TATA бокс. Его последовательность (GATAAA) идентична мышиному tag7, позиция совпадает с мышиным геном. Наличие неканонического TATA бокса характерно для лимфотоксина ß, и может служить причиной наличия множественных стартов транскрипции. В отличие от tag7 мыши и человека, их гомолог у насекомых в позиции -73 от старта трансляции содержит консенснусную последовательность TATA бокса (ТАТАТА).

Компьютерный анализ нуклеотидной последовательности 5'-промоторной области (около 200 п.н.) с помощью программы TRANSFAC выявил наличие в ней потенциальных участков распознавания рядом известных транскрипционных факторов: Sp1, NF-1, NF-kappaB, TFIID, GATA (Миркина с соавт 1999, 2000) Наличие участка распознавания NF-kappaB характерно для генов первичного иммунного ответа и указывает на участие в регуляции транскрипции этих генов. Потенциальные сайты связывания NF-kappaB и GATA были выявлены Ochiai et al. в промоторной области гена PGRP насекомых Bombyx morí . Присутствие участков распознавания Sp1 и NF-kappaB показано для гена tag7 мыши

(Kiselev et al 1998, Прохорчук с соавт 1998)). Однако, взаиморасположение сайтов Sp1 и NF-kappaB в tag7 мыши и человека разное, в человеческой геномной копии не происходит их перекрывания. Кроме того, по сравнению с мышиным геном, участок распознавания NF-kappaB в человеческом tag7 менее выражен, что теоретически уменьшает вероятность связывания с данным транскрипционным фактором. Можно предположить, что индукция экспрессии человеческого tag7 с помощью таких активаторов транскрипции, как LPS или интерлейкин 2, потребовала бы продолжительного времени.

Следует также отметить, что подобно лимфотоксину р, в промоторной области человеческого и мышиного tag7, но не PGRP, неоднократно повторяется CCCAG-мотив. В то же время, промоторная область PGRP насекомых содержит потенциальные сАМР-индуцибельный элемент и пять интерферон-индуцибельных полуэлементов, характерных для острой фазы иммунного ответа и не обнаруженные в tag7 мыши и человека (Ochiai М., Ashida М.,1999).

Эти данные в сумме отражают тот факт, что в регуляцию транскрипции tag7 мыши, человека и PGRP насекомых могут быть вовлечены различные механизмы.

Результаты анализа нуклеотидной последовательности и рестрикционно-гибридизационного анализа позволили составить физическую карту локуса гена tag7 человека, которая приведена на рис.3.

По сравнению с tag7 мыши и человека, расстояние между первым и вторым экзонами у PGRP еще более сокращено и составляет около 1.4

т.п.н. Расстояние между вторым и третьим экзонами у PGRP идентично человеческому tag7.

Исходя из полученных результатов анализа геномной структуры tag7 можно сделать вывод о том, несмотря на высокую гомологию в аминокислотной последовательности, на уровне физической карты исследуемый ген устроен по-разному у таких организмов, как мышь, человек и насекомые.

В то же время в целом по геномной организации (экзон-интронная структура, координаты участков сплайсинга, старт транскрипции,

R НВ В R X X

Р Р

I I Щ I_\щ\_I

in. 1 11 111

1 kb

Рис.3 Карта локуса гена tag7 человека.

Черными прямоугольниками обозначены экзокы (I, II, III). 3'- нетранслируемая часть обозначена белым цветом. Рестрикционные эндонуклеазы: R- EcoRI, H-Hindlll,B-BamHI, X-Xhol, P-Pvull.

потенциальные регуляторные элементы) tag7 мыши и человека очень близки друг к другу и отличаются от своего гомолога у беспозвоночных. Очевидно, это указывает на консервативность гена tag7 у млекопитающих.

Как было сказано выше, целью исследования являлось обнаружение генов, потенциально связанных с опухолевой прогрессией и пригодных для использования в гено-терапевтических целях. Для этого был проведен гибридизационный анализ РНК, выделенной из 18 мышиных опухолевых линий с различными свойствами с помощью

меченной пробы гена tag7. Оказалось, что экспрессия гена не коррелирует с метастатическим потенциалом опухолей и, более того, транскрипт гена детектировался всего лишь в двух из 18 опухолевых линий. Таким образом, стало ясно, что экспрессия гена не коррелирует непосредственно с манифестацией метастатического фенотипа.

Для более детального анализа экспрессии гена в клетках и органах мыши и человека были получены поликпональные антитела к мышиному белку Тад7. Для получения рекомбинантного белка Тад7 (гТад7) кодирующая часть кДНК tag7 была агиплифицирована на матрице клонированной кДНК tag7 с использованием специфических праймеров, содержащих сайты узнавания рестрикционных эндонуклеаз для клонирования в экспрессионный вектор. Продукт амплификации был клонирован в вектор pQE30 (Qiagen) и была определена его первичная последовательность с использованием внутренних специфических праймеров для того, чтобы убедиться в отсутствии ошибок в первичной структуре. Экспресированный полипептид, кодируемый плазмидой pQE30-tag7, содержал аминокислотную последовательность белка Тад7 с 6 остатками гистидина на N-конце полипептидной цепи, которые были использованы для очистки рекомбинантного белка из лизата клеток Е. coli с помощью металло-хелатной аффинной хроматографии на Ni-агарозе (Qiagen) в качестве носителя. Проведенный анализ локализации белка Тад7 в клетках Е. coli показал, что весь рекомбинантный белок находится в тельцах включения, поэтому очистка гТад7 проводилась в денатурирующих условиях. Очищенный рекомбинантный белок обладал молекулярным весом около 19 кДа, что соответствовало ожидаемому

размеру продукта экспрессии. Поликлональные антитела были получены с использованием в качестве антигена рекомбинантного белка Тад7, экспрессированного в клетках Е. coli. Раствор очищенного гТад7 в мочевине использовался для иммунизации кролика. Полученная поликлональная антисыворотка к белку rTag7 обладала способностью специфически узнавать как рекомбинантный, так и нативный белки Тад7 (Рис. 4А). Нативный белок Тад7 был детектирован в иммунопреципитатах лизатов клеток линии КСМЛ-0 и ВМР-П, в которых присутствует транскрипт гена tag7 и не был детектирован в иммунопреципитатах лизатов клеток линии ВМР-0 и КСМЛ-100, в которых транскрипт tag7 отсутствует.

А. * л Б. л

55 кД 55 *Д

- ' — 39 кД !_ 39 кД

-26 кД 26 кД

T»g7>. «Mfe фщ Tag7 »-й-*» о,

— 14.3 кД -14.3 кД

Рис. 4. Вестерн-блот анализ рекомбинантного и нативного белков Tag7. А -детекция белка Тад7 с использованием голиклональной антисыворотки к рекомбинантному белку Тад7 в разведении 1 5000. Б - детекция белка Тад7 с использованием моноклональных антител к рекомбинантному белку Тад7 в разведении 1:500. Для анализа использовались лизат клеток E.coli, продуцирующих рекомбинантный белок Tag7 (гТад7) и иммунолрецепитаты с анти-гТад7 поликлональной антисывороткой белковых экстрактов клеток указанных линий. Разделение белков проводилось в 15% ДСН-ПААГ.

Полученная антисыворотка к белку Тад7 была использована для очистки поликлональных Тад7-специфических антител. Очистка проводилась методом аффинной хроматографии на CNBr-активированной сефарозе

4В с иммобилизованным белком rTag7. Очищенные поликлональные антитела обладали той же специфичностью, что и первичная антисыворотка. Как было сказано ранее, компьютерный анализ позволил обнаружить секреторный сигнал в аминокислотной последовательности белка Тад7. Иммунопреципитация с использованием поликлональной антисыворотки к белку Тад7 и последующим Вестерн-блот анализом иммунопреципитатоз показала, что в кондиционированных средах клеток линий КСМЛ-0, ВМР-П присутствует белок Тад7 (Рис. 5). Данные результаты позволяют сделать вывод о секреции белка Тад7.

Рис. 5. Детекция секретируемой формы белка Тад7 в кондиционных средах клеток мышиных опухолевых клеточных линий КСМЛ-0 и ВМР-П. Вестерн-блот анализ иммунопрецепитатов с анти-гТад7 антисывороткой белковых лизатсв (Л) и кондицонных сред (К) клеток линий ВМР-П и КСМЛ-0. гТад7 - рекомбинантный белок Тад7.

Чтобы выяснить функциональную роль tag7, необходимо установить, с какими тканями и органами ассоциирована экспрессия этого гена. С этой целью был проведен иммуногистохимический анализ экспрессии tag7 в человеческих тканях и органах. Экспрессию tag7 детектировали с помощью окрашивания криосрезов, приготовленных из нормальных и опухолевых тканей и органов человека, поликлональными антителами к рекомбинантному Тад7 мыши.

ВМР-П КСМЛ-0

J1 К л к

4-Tag7

Нормальные ткани характеризовались позитивным окрашиванием с анти-Тад7 антителами (таблица1).

Таблица! Иммуногистохимический анализ экспрессии Тад7 в нормальных тканях и органах человека.

ткань окрашивание анти-Тад7

мозжечок отдельные клетки +

церебральный кортекс отдельные клетки +

двенадцатиперстная кишка лимфоциты + +

легкое альвеолярный эпителий + + эндотелий + +

лимфатические узлы субпопуляции лимфоцитов + +

селезенка субпопуляции лимфоцитов + +

+ слабое окрашивание , + +• интенсивное окрашивание

Мозжечок и церебральный кортекс отличались слабым окрашиванием, ассоциированным с отдельными клетками (таблица1). Преимущественная экспрессия Тад7 была детектирована в васкулярном эндотелии проанализированных тканей. Локализация Тад7 в эндотелиальных клетках была подтверждена с помощью двойного иммунофлуоресцентного окрашивания тканей поликлональными антителами кТад7 и антителами к маркеру эндотелиальных клеток CD31 (рис.6). Экспрессия Тад7 была ассоциирована с клеточной мембраной и межклеточным пространством. Подобный профиль экспрессии характерен для цитокинов и указывает на секреторный характер Тад7. Высокий уровень экспрессии Тад7 был обнаружен также в лимфоидных клетках двенадцатиперстной кишки, селезенки , лимфоузлов (таблица1). Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание селезенки с анти-Тад7 и антителами к Т-клеточному маркеру CD8+ показало, что экспрессия Тад7 преимущественно ассоциирована с популяцией Т-лимфоцитов (рис.7 а,

Ь).

V - е.- ' tag7 ^ CD31

к - - * - * 'Т л- rF % 1 i, » L-$r * . " ~ < W- - ^ Д * * ' Л. <& — . * { js - г-созя

Рис. 6. Иммуногистохимический анализ срезов ткани антителами к Тад7 и маркеру экдотелиальных клетокС031. Верхняя панель - крупные сосуды, нижняя- мелкие сосуды. Стрелками указана ко-локализация флуоресцентной метки.

В тканях легкого интенсивное окрашивание с анти-Тад7 было детектировано как в альвеолярном эпителии, так и в васкулярного эндотелии (таблица1). Таким образом, экспрессия Тзд7 характерна также и для эпителиальных клеток.

Рис.7. Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание срезов селезенки человека на маркер Т лимфоцитов -CD8+ (а) и антителами к Tag7 (Ь). Стрелками указана ко-локализация окрашивания.

Опухолевые клетки в целом характеризовались отсутствием позитивного окрашивания с анти-Тад7 антителами. Окрашивание было ассоциировано в некоторых случаях со стромой (таблица 2). В

карциноме почки интенсивное окрашивание было детектировано для инфильтрирующих лимфоцитов и васкулярного эндотелия

Таблица 2. Иммуногистохимический анализ экспрессии Тад7 в опухолевых тканях и органах человека.

ткань окрашивание анти-Тад7

аденокарцинома молочной железы строма +

аденокарцинома толстой кишки строма + +

аденокарцинома легкого строма + +

карцинома сквамозного эпителия легкого строма + +

карцинома почки строма ++, лимфоциты/эндотелий + +

+ слабое окрашивание, ++ интенсивное окрашивание

Результаты иммуногистохимического анализа, проведенного на человеческих тканях, подтверждают тот факт, что экспрессия гена tag7 не ассоциирована с опухолевыми клетками и белок секретируется.

Для изучения экспрессии гена tag7 в клетках иммунной системы мыши были получены первичные культуры тимоцитов, спленоцитов и перитонеальных макрофагов мыши. На первом этапе был проведен анализ уровней транскрипции гена tag7 в первичных культурах упомянутых клеток иммунной системы мыши. Транскрипт гена tag7 был обнаружен во всех исследованных типах клеток (Рис. 8). При этом наибольший уровень транскрипции был детектирован в спленоцитах мыши. Белок Тад7 был детектирован в спленоцитах мыши и клеточной линии WEHI-231 (рис.9), которая является культурой клеток пре-В-лимфоцитов мыши. Таким образом, экспрессия Тад7 характерна для В-лимфоцитов как in vitro, так и in vivo. Экспрессия ряда белков, секретируемых различными клетками иммунной системы, например,

¿///Лу

\ <г tag7

<}- бета-актин

^ j

Рис. 8. Нозерн-блот анализ fag7 в препаратах РНК первичных культур клеток иммунной системы мыши. Для анализа использовалось 20 мкг тотальной РНК свежеизолированных перитонеальных макрофагов, тимоцктов и слленоцктов, а также спленоцитов, обработанных липополисахаридом (5 мкг/мл) в течении указанных временных интервалов. В качестве положительного и отрицательного контролен были использованы препараты тотальной РНК опухолей ВМР-П и ВМР-0, соответственно. Ниже приведена гибридизация той же мембраны с пробой бета-актина.

фактора некроза опухоли (ФНО) и лимфотоксинов (ЛТ), может быть индуцирована различными агентами, такими как фитогемаглютеннин (ФГА), липополисахарид (ЛПС), интерлейкин-2 (ИЛ-2) и другими. Так как ген tag7 экспрессируется в клетках иммунной системы мыши и обладает гомологией в промоторной области с некоторыми членами TNF семейства, такими как ЛТ-бета (Прохорчук с соавт, 1998), то было проведено исследование характера изменения уровней РНК tag7 и белка Тад7 в клетках иммунной системы мыши в ответ на обработку различными индукторами. Было обнаружено незначительное увеличение уровня транскрипта гена tag7 в спленоцитах мыши в ответ на обработку ЛПС (Рис. 9). Кроме того, незначительная индукция уровня транскрипта tag7 наблюдалась во всех исследованных типах клеток иммунной системы мыши в ответ на обработку ФГА и ИЛ-2.

Анализ уровня экспрессии белка Тад7 в клеточных лизатах и

кондиционных средах спленоцитов мыши в ответ на обработку ЛПС показал, что липополисахарид вызывает незначительное увеличение уровня внутриклеточного белка Тад7, а также приводит к увеличению

А.

I'V -4- Та87

. > > . . «ч-4 л-4

Tag7

Рис. 9. Вестерн-блот анализ белка Тад7 в клетках лимфоидного происхождения. А -детекция белка Тад7 в клетках линии WEHI-231 (Я) и их кондиционной среде (К). Б -детекция белка Тад7 в слленоцитах (Л), обработанных ЛПС в течение указанных временных интервалов, и их кондиционных средах (К). Для анализа были использованы иммунопрецепитаты с анти-гТад7-аншсывороткой белковых экстрактов клеток и их кондиционных сред.

уровня секреции белка Тад7 (Рис. 9Б) (Коробко с соавт 1998, Kiselev et al 1998).

Детальный анализ экспрессии гена в лимфоидных клетках человека позволил детектировать транскрипцию гена в периферических мононуклеарных клетках, моноцитах, лимфоцитах, нейтрофилах, в Т и В лимфоцитах (рисЮ). В отличие от мышиного гена, в исследованных клетках были обнаружены три транскрипта гена tag7, которые являются продуктами альтернативного сплайсинга. Наличие транскрипции в В и Т

клетках соответствует ранее полученным данным для мышиного и человеческих генов, однако противоречит недавно опубликованной

Рис.10. Нозерн блот анализ экспрессии гена tag7 в различных типах клеток перефирической крови человека.

работе (Liu et al 2000). Расхождения в полученных данных можно объяснить различиями в процедуре выделения клеток, а, следовательно, различной степенью их активации. Например, сочетание ПМА и иономицина приводило к дегрануляции нейтрофилов и освобождению белка в клеточный супернатант.

Т клеточная лимфома человека Jurkat изменяла спектр секретируемых белков в ответ на обработку ФГА, а промиелоцитная клеточная лейкемия HL-60, не секретировала белков, кросс-реактивных с антителами к белку Тад7. Необходимо отметить, что как поликлональные антитела к мышиному белку Тад7, так и монокпоны взаимодействовали с целым спектром белков, секретируемых лимфоцитами и ЛАК клетками (Миркина с соавт. 1999). Причем, антитела к Тад7 эффективно блокировали вызванную этими белками цитотоксичность. Цитотоксическая активность является свойством ряда

I 1 ! J I I

-- l" [J Ш

s » % 2-

О J 8 °

Й f & I

-п ° е Б

белков, секретируемых клетками иммунной системы. Наличие секретируемой формы белка Тад7 и его экспрессия в клетках иммунной системы мыши позволили предположить существование у белка Тад7 цитотоксической активности.

В качестве источника нативного белка Тад7 была использована кондиционная среда клеток линии КСМЛ-0, которая содержит растворимый белок Тад7. В качестве клеток-мишеней были использованы иммортализованные мышиные фибробласты линии L929, стандартный объект для исследования цитотоксичности. Кроме того, для сравнения параллельно наблюдался цитотоксический эффект, вызванный действием хорошо известного цитотоксического агента, ФНО, на те же клетки-мишени. Было обнаружено, что кондиционная среда клеток опухолевой клеточной линии КСМЛ-0 обладает цитотоксическим эффектом по отношению к клеткам-мишеням линии L929 (Рис. 11). Данный цитотоксический эффект обусловлен специфическим действием Тад7, поскольку поликлональная антисыворотка или поликпональные антитела к белку Тад7 полностью блокировали этот эффект. В качестве контроля при блокировании цитотоксической активности была использована сыворотка не иммунизированного кролика. Кинетика цитотоксического действия Тад7 была отлична от кинетики действия рекомбинантного ФНО на клетки-мишени. Максимум значения цитотоксичности, вызванной действием Тад7, наблюдался во временной точке 5 часов, в то время как ФНО оказывал максимальное действие через 48 часов. Рекомбинантный белок Тад7, экспрессированный в эукариотических клетках также обладал цитотоксическим действием.

ФИО h—п

фно+аьфно а

®HO+AbTag7 S3

Tag7 SS2ZZS3S3EI

Tag7+Ab®HO =33=Г2=Е=3 Tag7+AbTag7 1:5000 ñ-,.. ..... ..-.-..i Tag7+AbTag7 1:1000

Tag7+AbTag7 1:500 3

10 20 30

Процент погибших клеток

Рис. 11. Белок Тад7 обладает цитотоксической активностью. Цитотоксическое действие на клетки линии L929 кондиционной среды клеток линии КСМЛ-0, секретирующих белок Тад7 (Тад7). ФНО - цитотоксическое действие фактора некроза опухоли на те же кпетки-миииени. Цитотоксическое действие обоих белков было блокировано специфическими антителами (+АЬФНО и +АЬТад7), причем блокирование цитотоксического эффекта кондиционной среды клеток линии КСМЛ-0, секретирующих белок Тад7, зависело от количества добавленных специфических поликлональных антител (разведения 1:500, 1:1000 и 1:5000). Добавление иммуноглобулинов неиммунизированного животного в тех же разведениях не оказывало влияния. Цитотоксическая активность измерялась через 5 ч по включению трипанового синего и приведена за вычетом спонтанной гибели клеток.

Для экспрессии эукариотического рекомбинантного белка Тад7 в клетках линии ВМР-0, не экспрессирующих натизный белок Тад7, полная кДНК tag7 была клонирована в вектор pM5Gneo. Полученная ппазмида, несущая в качестве селективного маркера ген neo, была использована для получения стабильно трансфецированных клонов клеток линии ВМР-0. Среди полученных клонов был отобран клон 8SX, обладающий максимальным уровнем экспрессии белка Тад7, как внутриклеточного, так и секретируемого (Рис. 12А). Кондиционная среда клона 8SX, содержащая эукариотический рекомбинантный белок Тад7, обладала цитотоксическим действием на клетки-мишени линии L929, в то время как кондиционная среда клеток линии ВМР-0, трансфецированных плазмидой pM5Gneo, не оказывала влияния на клетки (Рис. 12Б).

Рис. 12. Цитотоксическая активность рекомбинантного белка Тад7, экспрессированного к эукариотических клетках. А - Вестерн-блот анализ белка Тад7 в иммунопрецепитатах с анти-гТад7 антисывороткой кондиционных сред клеток клона 8SX (8SX) и клона клеток ВМР-0, стабильно трансфецировакных плазмидой pM5Gneo (pM5Gneo). rTag7 -рекомбинантный белок Тад7. Б -цитотоксическое действие кондиционной среды клеток клона 8SX на клетки L929. Цитотоксическая активность измерялась через 5 ч по включению трипанового синего и приведена за вычетом спонтанной гибели клеток.

и го зо Процент погибших клеток

Полученные результаты по цитотоксическому действию белка Тад7 предполагают изучение механизмов гибели клеток-мишеней. Белки, обладающие цитотоксической активностью, такие как ФНО, ЛТ, FasL и другие вызывают апоптоз в клетках мишенях. Было установлено, что цитотоксическое действие белка Tag? также вызывает апоптоз в клетках линии L929. Цитотоксическое действие нативного белка Тад7 вызывает олигонуклеосомное расщепление геномной ДНК клеток-мишеней (Рис. 13), что является характерным маркером апоптоза. Таким образом, как рекомбинантный, так и нативный белок Тад7 обладает цитотоксической активностью по отношению к клеткам-мишеням линии L929. Более того, белок Тад7 является новым белком, обладающим цитотоксической активностью и вызывающим апоптоз в клетках-мишенях линии L929.

Используя гель-фильтрацию на колонке Superdex 75 HR 10/30 для анализа белков, содержащихся в кондиционной среде ЛПС-

11 kb *■

Л „

& S

индуцированных мышиных

спленоцитов, было обнаружено,

что белок Тад7 существует как в

форме мономера, так и в форме

мультимерного комплекса с

размером около 50 кДа.

Молекулярный вес данного

комплекса соответствует

ожидаемому молекулярному весу

Рис. 13. Белок Тад7 вызываетапоптоз в тримера Тад7. С помощью анализа клетках-мишенях. Олигонуклеосомное расщепление хромосомной ДНК в клетках ,

линии L929, вызванная действием 6e™°B в нередуцирующем ДСН-

кондиционной среды клеток KCMJ1-0 (ТадТ) и

ФНО (ФНО). Контроль - необработанные ПААГ было показано, что клетки.

кипячение в буфере для нанесения на гель, содержащем 2% ДСН и не содержащем редуцирующих

агентов, белок Тад7 детектируется преимущественно в форме мономера, и дисульфидные связи не являются необходимыми для формирования мультимерного комплекса.

Таким образом, ген tag7 млекопитающих экспрессируется в основном клетками иммунной системы, является секретируемым белком, секреция и экспрессия которого регулируется различными стимулами, проявляет цитотоксическую активность, индуцируя апоптоз, и формирует мультимерные комплексы.

Новое семейство генов млекопитающих, имеющих лизоцим-подобный домен.

Для многих генов иммунного ответа организма характерно наличие

семейства генов со сходной структурой и похожими функциями. Это объясняется надежным дублированием всех систем организма с одной стороны и эволюционной консервативностью этих систем с другой. Часто семейства генов организованы в кластеры, находящиеся на одной хромосоме. Из кампании Genome Systems (США) был получен Р1 клон, содержащий примерно 80 тнп района гена tag7, локализованный на 7 мышиной хромосоме в районе A3. Этот район мышиной хромосомы имеет синтению с 19 хромосомой человека. Позже, при анализе базы данных, было показано, что ген tag7 действительно локализуется на 19 хромосоме человека. Район 7АЗ хромосомы мыши имеет цитогенетическую связь с аутоиммунным заболеванием системная красная волчанка на мышиных моделях. Это еще раз указало на важную роль которую ген может играть в иммунной системе млекопитающих. Анализ прилежащего к гену tag7 району (80 тнп) не выявил никаких транскрипционных единиц с помощью Нозерн-гибридизации. Однако, позднее, при помощи компьютерного анализа базы данных на гомологию с геном tag7, был выявлен ряд перекрывающихся EST последовательностей, из которых удалось составить предполагаемый транскрипт размером 2000 н. Используя метод ПЦР и наращивания 3' и 5' концов, был клонирован транскрипт размером 2.0 тн. Определение первичной последовательности показало, что на 3' конце полученного транскрипта присутствует область протяженной аминокислотной

гомологии с белком Тад7 (рис.14, 15). Новый ген -гомолог гена tag7 получил название tagL (Кибардин с соавт.2000).

ОТ ПЦЕ j^OT ПНР

-Л-S

Рис. 14. Стратегия клонирования кДНК гена tagL (слева). Заштихованный прямоугольник обозначает область гомологии с Tag7. Справа сплайс-варианты гена tagL. Прямоугольниками обозначена транслируемая область мРНК. Закраска прямоугольника указывает на изменения в рамке трансляции.

При клонировании полноразмерной кДНК были обнаружен целый ряд различных сплайс-вариантов гена tagL (Кибардин с соавт.2000). Размер белка TagL-a составляет 529 аминокислот. Область гомологии с Тад7 находится на С-конце TagL-a. Сплайс-варианты tagL-a и tagL-a' отличаются только в некодирующей 5' области мРНК, и, вследствие этого, кодируемые белки идентичны. Сплайс-вариант tagL-b' отличается от tagL-a' делецией длиной 87 п.н., не меняющей рамку трансляции. Сплайс-варианты tagL-g и tagL-d отличаются от tagL-a делециями длиной 127 п.н. и 338 п.н. соответственно, сдвигающими рамку трансляции. паКомпьютерный анализ базы данных NCBI выявил EST клоны, относящиеся к дополнительным сплайс-вариантам tagL-e, отличающемуся от tagL-a делецией длиной 295 п.н., и tagL-m отличающемуся от tagL-a делецией длиной 131 п.н.. Таким образом, только TagL-a (TagL-a') и TagL-b' обладали гомологией с белком Тад7.

hTag7 69 f^i^cooçSptyiatÎM^TLG^ SGHL4íi>MS IО 12 9

mTag7 56 115

Ti.Ni. PORP 56 fcAA^IvÂjlfelfo-^JTÏV^ra^ 114

в.morí PGRP 63 121

Molt во фш&хяшафпЪгЯ^-я!^ 118

T7 ЛИЗОЦИМ 30 79

TaeL-ct 460 KIS^j^ceSL^IllJeMTee-SilClfiUM^ 524

hTag7 130 193

mTag7 us 182

Ti.Ni. PGUP 115 тт-^^-^кртпУ^тт.дт.Е-йтГтг^гер^Г^ 71 181

E.morx PGRP 122 188

Molt lis INglSgipœDvfeDitoA^IiKC^ 185

T7 ЛИ50ЦИМ 80 ^I^^mDrGMT^NFTPAOMQSl^StiVl'lÍiAKTZGSVÍ¡BAÍ£KDVAPKA£pS---FDÜKBWS 140

Рис. 16. Сравнение аминокислотных последовательностей TagL-a (AF149837) с человеческим Tag7 (hTag7), мышиным Тад7 (mTag7), Ti.Ni. PGRP (AF076481), Bombyx morí PGRP (AB016249), Molt (AF035445) и лизоцимом фага Т7. Закрашенными участками отмечены идентичные аминокислоты.

Анализ аминокислотной последовательности гена tagL показал наличие

двух трансмембранных участков. Один, расположен на самом N-конце

полипептидной цепи и, вероятно, выполняет роль сигнального пептида,

другой расположен примерно посередине белка, так, что часть

полипептида, в которой находиться область гомологии с белком Тад7

находится во вне клеточном пространстве. Дальнейшие исследования

лимфоидных клеток человека и клеточных линий показали, что белок

TagL может находится как в форме, связанной с клеточными

мембранами, так и в растворимом вне клеточном состоянии (рис. 16),

причем его экспрессия регулируется различными стимулами (рис.17).

Совсем недавно в базе данных удалось обнаружить еще 5 гомологов

гена tagL млекопитающих у дрозофилы. Гомология белковых продуктов

этих генов составляет от 27 до 60 % с белком TagL-a, при полном

отсутствии гомологии по нуклеотидной последовательности.

А ^

¿г /

А 50 ->

30 кДа

Рис 16. Вестерн-блот анализ белка Тад1- в клетках лимфоидного происхождения А. Суперкатант человеческих лимфоцитов, обработанных различными агентами. В Детекция белка Тад!. в гранулах нейтрофилов.

а УУ У У с ^

_ -____;___________ ^ -уУ yy yS> V*

. ! j

3V'

кДа

Рис. 17. Вестерн-блот анализ экспрессии белка TagL в клеточных лизатах и супернатанте лимфоцитов и клеточных линий лимфоидного происхождения. А. Экспрессия белка TagL в клеточных лизатах и супернатанте человеческих лимфоцитов обработанных ФГА Б. Экспрессия белка TagL в клеточных лизатах и супернатанте клеток линии Jurkat обработанных ФГА.

Таким образом, ген tag7 и tagL представляют собой новое семейство генов млекопитающих, которые, по данным различных авторов, участвуют в врожденном и приобретенном иммунном ответе. У дрозофилы, обнаружено уже 6 членов этого семейства.

Учитывая тот факт, что гомологи гена tag7 и tagL у насекомых принимают участие в распознавании пептидогликанов бактериальной стенки, т.е. во врожденном иммунитете, а приобретенного иммунного ответа у насекомых нет, не исключено, что количество гомологичных генов у млекопитающих будет меньше, а скорее всего ограничено двумя обнаруженными.

РАЗРАБОТКА МОДЕЛЕЙ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ ОПУХОЛЕЙ

В многочисленных исследованиях на животных моделях было продемонстрировано, что опухоль ускользает от иммунного надзора организма. Это может происходить по многим причинам. Отсутствие экспрессии молекул класса MHCI, отсутствие экспрессии специфических опухолевых антигенов и ко-стимуляторных молекул, экспрессия ингибиторных молекул, таких как ФНО или FAS, лишь немногие примеры этого. Тут же необходимо отметить, что экспрессия гена tag7 опухолью ВМР-П тоже может оказаться путем ухода от иммунологического надзора организма. В отличие от экзогенного антигена, проникновение которого в организм сопровождается целым каскадом так называемых «сигналов опасности», таких как воспаление или разрушение ткани, эндогенный антиген остается не распознанным, что приводит к возникновению иммунологической толерантности. Большое количество проведенных исследований (DiSanto et al, 1995, Suzuki et al 1997, Mrozek et al, 1996, Jaleco et al, 1997, Williams et al 1997, Duncan et al 1996, Taki et al 1997) продемонстрировали, что повышенная экспрессия цитокинов и стимуляторных молекул позволяет эффективно повысить противоопухолевый иммунитет. Поскольку еще очень мало известно о

специфических опухолевых антигенах, в большинстве исследований целые опухолевые клетки использовались как доноры антигенов при приготовлении вакцин.

Принимая во внимание данные изложенные в первой главе, а именно специфическую и регулируемую экспрессию белка Тад7 в клетках иммунной системы и наличие у него цитотоксической активности, было сделано предположение о возможном использовании белка Тад7 для индукции противоопухолевого иммунного ответа.

В качестве модели были использованы клетки мышиной опухолевой клеточной линии ВМР-0, в норме не экспрессирующей ген tag7. Клетки данной опухолевой клеточной линии вызывают образование опухоли в сингенных мышах линии A/Sn при подкожной инъекции. В результате стабильной трансфекции клеток линии VMR-0 полной «ДНК tag7 под контролем CMV и MPSV промоторов, были получены клоны экспрессирующие разные уровни белка Тад7 (например клон 8SX см рис. 12А ранее). Скорость пролиферации клеток данных клонов не отличалась от скорости пролиферации клеток исходной опухолевой клеточной линии ВМР-0, а также контрольных клеток. Характер роста опухолей, образованных клетками этих клонов, был проанализирован на сингенных мышах линии A/Sn. Было обнаружено значительное замедление скорости роста опухолей, образованных клетками данных клонов (4SX, 8SX, 12SX) по сравнению со скоростью роста опухолей, образованных нетрансфецированными клетками линии VMR-0, или клетками, трансфецированными плазмидой pBK-CMV (рис.18). Было обнаружено, что замедление скорости роста опухолей

коррелирует с уровнем транскрипта tag7, детектированным в данных клонах. Клон 4SX и 8SX, в которых был детектирован наибольший уровень экспрессии

2 4 е 8 ю Недели после введения клеток

Рис.18 Торможение скорости роста модифицированных опухолевых клеток. ПА- не модифицированные или трансфецированные пустым вектором клетки ВМР-0; .А - клон 12БХ, клоны 4БХ и 85Х. » -все жиеотныэ погибли.

гена tag7, обладали наименьшей скоростью образования опухоли. Данный эффект замедления роста опухолей был блокирован на коротких временах инъекцией в сайт образования опухоли поликлональных антител к белку Тад7 (Рис.19), что позволяет сделать вывод о том, что именно экспрессия белка Тад7 ответственна за замедление скорости роста опухолей. Эффект замедления роста опухоли также наблюдался при инъекции сингенным мышам смеси клеток линии VMR-0 и клеток клона 4SX . Этот факт позволяет сделать вывод о влиянии клеток клона-трансфектанта 4SX на не модифицированные опухолевые клетки. Это делает потенциально возможным использование трансфекции кДНК tag7 ex vivo в опухолевые клетки для противоопухолевой терапии.

Так как одним из механизмов действия противоопухолевого иммунитета является направленное уничтожение опухолевых клеток

цитотоксическими Т-лимфоцитами, то для определения роли опухоль специфических CTL в процессе замедления роста опухолей в сингенных мышах, вызванного трансфекцией кДНК tag?, был проведен анализ скорости роста опухолей, образованных клетками данных клонов, в бестимусных мышах.

9 -

8 7 6 5 -4 -3 -

Рис. 19. Влияние поликлональных антител к белку Tag7 на ингибирование роста опухоли у сингенных мышей A/Sn. П-скорость роста контрольных опухолей; скорость роста

опухолей 4SX; О. скорость роста опухолей при введении антител к белку Tag7 с двухдневными интервалами.

5 10 15 20 Дни после введения

Было обнаружено, что характер роста опухолей у мышах, которые лишены тимуса, а как следствие Т лимфоцитарного ответа, соответствует характеру роста опухолей, обнаруженному у сингенных мышей. При этом наблюдалось еще более значительное различие в замедлении скорости роста между опухолями, образованными клетками клонов 4БХ и 12БХ, и опухолями, образованными клетками линии \ZMR-0, трансфецированными пустым вектором (РисД©. Аналогичные данные были получены другими авторами для клеточных вакцин на основе таких цитокинов как ИЛ-2, ФНО, ЛТ-в, ГМ-КСФ.

Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что эффект

замедления скорости роста опухолей, обусловленный трансфекцией

кДНК tag7, не зависит от действия на опухоль специфических Т-

лимфоцитов. Однако, бестимусные мыши имеют В-клеточный иммунный

Рисунок 20.

Скорости роста модифицированных опухолевых клеток на

иммунодефицитных животных. ИЗ скорость роста контрольных опухолей на

бестимусных мышах. Скрость роста контролей на мышах SCID

отличалась на 1015%. Д-скорость роста

модифицированных опухолей (4SX) на мышах линии SCID. • - скорость роста модифицированных опухолей на бестимусных мышах.

ответ и у них есть натуральные киллеры (НК). Чтобы проверить, какая из этих клеточных популяций вовлечена в отторжение опухолевых клеток, полученные клоны были перевиты на иммунодефицитных мышей линии SCID (sever combined immunodeficiency). Считается, что у этих животных отсутствует Т и В клеточный иммунный ответ. У этих животных скорость роста опухолевых клеток была существенным образом замедлена (Рис 20), хотя немного выше чем у бестимусных мышей. Это указывает на то, что В клетки каким-то образом могут быть вовлечены в отторжение опухоли. Тем не менее, очевидно, что НК клетки должны быть в основном вовлечены в отторжение опухолевых клеток. Следует отметить, что перечисленные выше модели имеют ограничение. В

бестимусных мышах функция Т лимфоцитов существенным образом устранена, тимус можно обнаружить только иммуногистохимическими методами. В тоже время, в мышах линии SCID тимус детектируется гистологически и анатомически, а это говорит о том, что в мышах линии SCID могут присутствовать Т клетки и, как следствие, Т клеточный иммунный ответ.

Для точного определения типа клеток, которые могут участвовать в ингибировании опухолевого роста был проведен иммуно-гистохимический анализ опухолей на типы клеток, инфильтрирующих опухоль. Было обнаружено, что в опухолях, образованных клетками клона-трансфектанта 4SX в сингенных мышах, присутствуют обширные инфильтраты, образованные клетками, реагирующими с CD45R+/B220 антителами, в то время как в контрольных опухолях ВМР-0 присутствовали только единичные CD45R+ клетки. Эти инфильтраты детектируются преимущественно на границе опухоли и около кровеносных сосудов (Рис. 21). Иммуногистохимический анализ с использованием антител Ly6 (гранулоциты) показал, что в обоих типах опухолей присутствует незначительное количество Ly6+ клеток (данные не приведены). При иммуноокрашивании срезов опухолей с антителами к маркерам CD4, CD8 и Мас1 иммуноположительные клетки не были обнаружены. Антитела В220 реагируют с эпитопом рецептора CD45 и используются для детекции В клеток. Однако, при более полном изучении свойств этих антител было обнаружено, что они также кросс-реактивны с субпопуляциями НК клеток и некоторыми цитотоксическими Т лимфоцитами. Таким образом, результаты иммуногистохимического

исследования подтвердили данные, полученные на животных моделях. Ингибирование роста опухоли может быть обусловлено НК клеточным ответом, В клеточным ответом и не исключен Т лимфоцитарный ответ.

Рис. 21. Иммуногистохимическое окрашивание С045Н-позитивных клеток на парафиновых срезах опухолей 4SX (А) и ВМР-0 (В). Для анализа использовались моноклональные 3hth-CD45R антитела и вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой. Детекция иммобилизованной пероксидазы (отмечена стрелками) проводилась с использованием SIGMA FAST DAB с металлическим усилителем. Контрольные гибридизации без первичных антител (не приведены) были отрицательными.

Рис. 22. Световая микроскопия срезов опухолей окрашенных гематоксилином/эозином. А - опухоль образованная клетками клона 4БХ. Стрелкам» отмечены апоптозы. Б - опухоль ВМР-0. Стрелкам» отмечены митозы.

Замедление роста опухолей, образованных клетками, трансфецированными кДНК tag7, может быть обусловлено прямым цитотоксическим действием белка Тад7. Однако, так как in vitro клетки линии ВМР-0 не проявляли чувствительности к цитотоксическому действию Тад7, а также клетки клонов-трансфектантов 4SX и 12SX не замедляли скорости роста в культуре по сравнению с клетками линии ВМР-0, то наблюдаемый эффект замедления скорости роста опухолей не обусловлен непосредственным цитотоксическим действием белка Тад7. Световой и электронно-микроскопический анализ срезов опухолей ВМР-0 и 4SX выявил ряд различий между ними. Было обнаружено, что опухоли 4SX являются менее некротизированными по сравнению с опухолями ВМР-0. Однако, в опухолях, образованных клетками клонов-трансфектантов, число апоптозов преобладает над числом митозов, которые достаточно редки по сравнению с опухолями, образованными клетками линии ВМР-0 (Рис. 22, Таблица 3).

Таблица 3. Число апоптозов и митозов в опухолях ВМР-0 и 4БХ. Подсчет апоптозов и митозов проводился с использованием световой микроскопии срезов опухолей, окрашенных гематоксилином/эозином.

Опухоль Митозы Апоптозы

ВМР-0 6-8% 0 5-1%

4SX 2-3% 8-10%

Таким образом суммарная разница в пролиферативной активности клеток модофицированной и не модифицированной опухолей составляла более 50 раз. Необходимо еще раз подчеркнуть, что in vitro модифицированные клетки не изменили скорости пролиферации и не наблюдалось токсических эффектов при введении их животными.

Для того чтобы наиболее полным образом исследовать спектр опухолей на которые секретируемый белок Тад7 может оказывать действие, клеточная линия мышиной аденокарциномы почки С26 и клеточная линия мышиной меланомы B16F10 были стабильно модифицированы 1ад7-экспрессионной конструкцией. Для линии С26 торможение роста опухоли не было значительным, однако продолжительность жизни животных с модифицированными опухолями было в два раза больше, чем контрольных. Для клеток B16F10, модифицированных геном tag7, на большинстве животных опухоль не формировалась совсем, хотя клетки in vitro в обеих случаях не изменили своей пролиферативной активности. Необходимо отметить, что в аналогичных исследованиях Бирнстила с соавт. использование гена ИЛ-2 приводило к значительному ингибированию опухоли С26, но не оказывало существенного влияния на меланому B16F10. Учитывая этот факт можно сделать вывод, что как и ген ИЛ-2, ген tag7 может быть использован для терапии некоторых опухолевых заболеваний.

7 14 21 28 35'

► О

О- ' ™ "" 7 14 21 28 35 40 ю 20 30 40 50 60

Дни после введения клеток Дни после введения клеток Дни после введения клеток.

• Животные инъецированные исходными к

■С2610 cells/mouse

R Животные инъецированные модифицированньи

"" С2Ш1ад7 10 сеИз/тоизе Рис. 23 Торможение роста опухоли и выживаемость животных с имплантированными клетками аденокарциномы почки С26 (А,Б) и меланомы В16 (В).

РАЗРАБОТКА ПРОТИВОПУХОЛЕВОЙ ВАКЦИНЫ НА ОСНОВЕ АУТОЛОГИЧНЫХ КЛЕТОК, МОДИФИЦИРОВАННЫХ ГЕНОМ tag7, НА

Как уже отмечалось ранее, для активации противоопухолевого иммунного ответа чаще всего используются сами опухолевые клетки, как источники антигенов и биологические молекулы, которые тем или иным способом стимулируют специфический иммунный ответ. Большое количество генов, кодирующих такие молекулы, были использованы для проведения экспериментов на животных моделях, некоторые проходят клинические испытания. Для изучения возможности применимости гена tag7 была выбрана модель мышиной меланомы МЗ. Выбор диктовался как расширением спектра модельных опухолей, так и тем что данная клеточная линия, формирующая опухоль на мышах линии DBA2, является общеупотребимой для такого рода исследований. Схема эксперимента приведена на рис, 24 .

МЫШИНЫХ МОДЕЛЯХ

Исходные опухол«

клетки

модифицированные

вакцинация

клетки

измерение сформировавшихся опухолей

Рис 24. Принципиальная схема противоопухолевой вакцинации в модели профилактика.

По этой схеме, клетки in vitro трансфецировались плазмидой, содержащей ген tag7 под контролем CMV промотора с помощью липосомальных комплексов. Уровень трансфекций контролировался как с помощью репортерного гена LacZ в параллельных ко-трансфекциях, так и измерением уровня секретируемого белка методом Вестерн блот анализа. Трансфецированные клетки в разных количествах вводились подкожно животному с одной стороны. Через неделю, 106 не модифицированных, исходных клеток МЗ, вводились подкожно животное с противоположной стороны. Проводились измерения размера опухоли, которая формировалась из не модифицированных клеток. На рис. 25 приведен график скорости роста вторичных опухолей животных, вакцинированных по схеме, указанной на рисунке. Как видно из графика, скорость роста опухоли на животных пре-вакцинированных модифицированными клетками была существенно ниже, чем скорость роста контрольных опухолей.

Рис. 25. Ингибирование скорости роста вторичной опухоли при предварительной вакцинации животных клетками МЗ в количествах, указанных на графике

Если в случае вакцины использовались не модифицированные клетки МЗ, то скорость роста опухоли была меньше, но тем не менее различия

с вакцинацией модифицированными клетками составляли более 5 раз по объему опухоли. Более того, большинство животных, вакцинированных модифицированными клетками выжило и выживаемость составила более 50%. Суммарное количество животных, участвующих в независимых экспериментах в каждой группе составило более 100. Действие клеточной вакцины было специфическим, поскольку вакцинация модифицированными клетками МЗ не приводила к отторжению другой опухоли, например, В16Р10.

Ген гранулоцит-макрофаг колонии стимулирующего фактора (ГМ-КСФ) считается одним из наиболее перспективных для использования при получении противоопухолевой вакцины. Не менее эффективным считается использование аутологичных опухолевых клеток, модифицированных геном ИЛ-2. Однако, для ИЛ-2 существует ярко выраженная дозовая зависимость, при которой превышение уровня секреции ИЛ-2 в некоторых случаях приводило к негативным последствиям.

О МЗ 500.000клеток/животное О M3/GM-CSF 500.000 клеток/животное □ М3/Тад7 500.000 клеток/животное в Ю6 МЗ исходных клеток/животное

Рис.26. Сравнение эффективности противоопухолевой вакцины на основе генов ГМ-КСФ или tag7.

Было решено сравнить эффективность клеточных вакцин, основанных "на модификации клеток геном tag7 и ГМ-КСФ на одной и той же опухолевой модели мышиной меланомы МЗ. На следующем рисунке (рис.26) приведена выживаемость животных, вакцинированных клетками МЗ, модифицированных геном tag7 или ГМ-КСФ.

В обоих случаях для вакцинации использовалось 5х105 модифицированных генами клеток. Через неделю на другую сторону животным прививалось 106 исходных не модифицированных клеток. Приведенные экспериментальные данные это среднее из 5 независимых опытов по 6 животных в каждой группе. Как видно из приведенных данных, действие вакцины на основе tag7- модифицированных клеток немного лучше, чем вакцины на основе ГМ-КСФ. Следует отметить, что выживаемость животных, вакцинированных ГМ-КСФ

модифицированными клетками, в наших экспериментах несколько хуже опубликованных данных. Таким образом, можно сделать вывод, что вакцина на основе модифицированных геном tag7 аутологичных клеток не хуже, чем аналогичная вакцина на основе ГМ-КСФ. По данным различных исследователей, вакцины на основе ГМ-КСФ не требует Т клеточного ответа, но наблюдается повышенное количество клеток, реагирующих с антителами Мас-1. Эти антитела считаются специфическим макрофагальным маркером. Для выяснения участия клеток, несущих антигены к В220 антителам, в противоопухолевом ответе, опухолевые срезы были проанализированы на присутствие этих клеток. Как видно из рис.27, вторичные опухоли, сформировавшиеся на

животных, вакцинированных как ГМ-КСФ, так и tag7 модифицированными клетками, сильно инфильтрированы клетками, имеющими В220+ фенотип. Таким образом, индукция специфического опухолевого ответа в случае модификации опухолевых клеток генами tag7 или ГМ-КСФ происходит за счет клеток имеющих В220 антиген.

M3/tag7 мз M3/GM-CSF

Рис. 27 Иммуногистохимический анализ парафиновых срезов вторичных опухолей животных вакцинированных различными клетками, как указано на фотографиях. Для анализа использовались моноклональные aHTH-CD45R антитела и вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой Детекция иммобилизованной пероксидазы проводилась с использованием SIGMA FAST DAB с металлическим усилителем. Контрольные гибридизации без первичных антител (не приведены) были отрицательными.

Профилактическая модель противоопухолевой вакцины наиболее перспективна в плане ее клинического применения, так как позволяет улучшить результаты хирургического удаления опухоли и уменьшить вероятность возникновения рецидивов. Однако, не менее интересным является попытка применения клеточной вакцины для удаления первичного опухолевого очага или метастаз. Для выяснения этого была выбрана модель клеток аденокарциномы молочной железы мыши КСМЛ100. Эта клеточная линия перевивается на мышах и дает обильные метастазы в легкие. Клетки КСМЛ100 в количестве 106 были введены сингенным мышам линии A/Sn и через 10 дней, когда размер опухоли составил на различных особях 3-5 мм, был начат курс терапии. Клетки КСМЛ100 были трансфецированы in vitro с помощью липосом

генами tag7 и ГМ-КСФ и были введены в животных в количестве 10 в противоположный от первичной опухоли бок животного. На рис. 28 приведен график выживаемости животных при терапии опухоли клеточной вакциной на основе генов tag7 или ГМ-КСФ. В результате терапевтического воздействия продолжительность жизни животных значительно увеличилась, хотя полного излечения добиться не удалось ни для одной из вакцин.

100 90 ¡3 80

§70 ф

S 60 I 50

Ш 40 30 20 10

•Я—В I

10 20 30 40 SO 60 70 80

Дни после введения опухолевых клеток

р выживаемость животных вакцинированных клетками, модифицированными геном GM-CSF в выживаемость животных вакцинированных клетками, модифицированными геном tag7 0 выживаемость животных вакцинированных не модифицированными клетками

Рис. 28 Терапия опухоли КСМЛ100 вакциной на основе аутологичных опухолевых клеток, трансфецированных геном tag7

Необходимо отметить, что клеточная вакцина на основе гена tag7 опять была несколько лучше, чем на основе гена ГМ-КСФ.

Таким образом на основе клонированного нового гена нами разработана и отработана на животных методология создания клеточной противоопухолевой вакцины. На основании полученных данных был составлен Протокол первой фазы клинических испытаний

противоопухолевой вакцины на основе аутологичных опухолевых клеток,

модифицированных генами in vitro.

ВЫВОДЫ

1. Впервые клонирован новый ген мыши tag7. Определена первичная структура, регуляция, локализация. Показано, что ген участвует в функционировании иммунной системы организма. Продемонстрировано, что белок Тад7 является секреторным, индуцибельным, формирует мультимерные комплексы in vivo и может индуцировать апоптоз.

2. Клонирован человеческий гомолог гена tag7, показана высокая гомология и консервативность мышиного и человеческих генов. Показано, что экспрессия гена не ассоциирована с опухолевыми процессами.

3. Обнаружен и клонирован ген млекопитающих, tagL, имеющий гомологию с геном tag7 в районе лизоцим-подобного домена. Определена его структура, показан характер его экспрессии, секреции и индукции клетками иммунной системы.

4. Продемонстрировано, что гены tag7 и tagL млекопитающих являются представителями нового семейства генов эукариот, участвующих в иммунной защите организма.

5. Впервые показано, что модификация опухолевых клеток геном tag7 приводит к значительному ингибированию роста опухоли, за счет опосредованной индукции апоптоза клеток опухоли и не связана с Т клеточным ответом организма.

6. Впервые разработана противоопухолевая клеточная вакцина на основе аутологичных опухолевых клеток, модифицированных геном tag7. Показана ее эффективность в сравнении с клетками модифицированными геном ГМ-КСФ. Разработана методология получения вакцины и Протокол ее клинических испытаний.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Epishin SM., Kiselev SL., Vinetski Yu.P. A colony hybridization study of mRNA in Maturating Soybean Seeds, Plant Cell Reports 1,1982, pp12-15

2. Buchman VL, Ninkina NN, Bogdanov YD, Bortvin, AL, Akopian HN, Kiselev SL, Krylova OYu, Anokhin KV, Georgiev GP. Differentia! splicing creates a diversity of transcripts from a neurospecific developmental^ regulated gene encoding a protein with new zinc-finger motifs. Nucleic Acids Res. 1992, 20, 5579-85.

3. Кустикова ОС., Киселев СЛ., Бородулина OP., Сенин ВМ., Афанасьева АВ., Кабишев АА. Клонирование гена tag7, экспрессирующегося в метастазирующих опухолях мыши, Генетика, 1996, 32, 621-628

4. Коробко ИВ., Кабишев АА., Киселев СЛ., Идентификация новой протеин киназы, транскрибируемый в мышиных опухолях с высоким метастатическим потенциалом, Докл Акад. Наук, 1997, 354, 554-556

5. Kiselev SL, Kustikova OS, Korobko EV, Prokhortchouk EB, Kabishev AA, Lukanidin EM, Georgiev GP. Molecular cloning and characterization of the mouse tag7 gene encoding a novel cytokine. J Biol Chem. 1998, 273:18633-9.

6. Прохорчук ЕБ., Бородулина ОР., Киселев СЛ., Геномная организация и хромосомная локализация нового лиганда из семейства ФИО, Докл. Акад. Наук., 1998, 360: 699-701

7. Коробко ЕВ., Прохорчук ЕБ., Коробко ИВ., Георгиев ГП., Киселев СЛ., Секреция цитотоксического белка Тад7 клетками в ответ на ЛПС, Докл. Акад. Наук 1998, 360:838-40

8. Georgiev GP, Kiselev SL, Lukanidin EM., Tumor progression and metastsis in Genome structure and function, Kluwer Acad. Publ., 1997, 112-153

9. Korobko EV, Saschenko LP, Prockhorchouk EB, Korobko IV, Gnuchev NV,

Kiselev SL. Resistance to tumor necrosis factor induced apoptosis in vitro

correlates with high metastatic capacity of cells in vivo. Immunol Lett. 1999

67:71-6.

10. Миркина ИИ., Киселев»СЛ., Духанини ЕА., Лукьянова ТИ., Шаталов Ю., Сащенко ЛП., Гнучев НВ., Тад7 иммунореактивные цитотоксичесие белки, продуцируемые ЛАК клетками человека. Докл. Акад. Наук, 1999, 366:830-2.

11. Georgiev GP., Kiselev SL., Lukanidin EM., Genes involved in the control of tumor progression and their possible role use for gene therapy, in Gene therapy and molecular biology, 1, 1998, 381-398

12. Миркина ИИ., Киселев СЛ., Саиценко ЛП., Садчикова ЕР., Гнучев НВ. Клонирование человеческого гомолога гена tag7 и изучение его геномной организации Докл. Акад. Наук, 1999, 367:548-52

13. Духанина ЕА., Романова ЕА., Киселев СЛ., Сащенко ЛП. Белок р70 эффекторная молекула для цитокина Тад7. Докл. Акад. Наук, 2000, 371:224-5

14. Кибардин АВ., Миркина ИИ., Корнеева ЕА., Гнучев НВ., Георгиев ГП., Киселев СЛ. Молекулярное клонирование нового гена мыши tagL, содержащего лизоцим-подобный домен. Докл. Акад. Наук 2000, 372:103-5

15. Миркина ИИ, Кибардин АВ., Корнеева ЕА., Гнучев НВ., Георгиев ГП., Киселев СЛ., Клонирование и изучение новых генов млекопитающих, имеющих область структурной гомологии с фаговым лизоцимом. Генетика, 2000, 36:1492-1501

16. Киселев СЛ., Ларин СС., Гнучев НВ., Георгиев ГП., Ген tag7 и генотерапия рака, Генетика 2000, 36:1431-1435

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Киселев, Сергей Львович

выводы

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает свою глубокую признательность и благодарность своим научным консультантам академику Георгиеву Георгию Павловичу и член-корреспонденту Гнучеву Николай Васильевичу за участие, которое они приняли в проведении исследований и подготовке материалов диссертационной работы. Ученому секретарю ИБГ РАН Грабовской Любови Сергеевне и заместителю директора Садчиковой Елене Рубеновне за внимание и помощь. Особую благодарность выражает сотрудникам отдела Молекулярной генетики рака: Коробко Алене, Миркиной Ирине, Кибардину Алексею, Ларину Сергею, Кустиковой Ольге за неоценимый вклад в выполнение представленной работы, Сащенко Лидии Павловне, Коробко Игорю, Захаровой Елене, Ивановой Тамаре за постоянную помощь, советы и поддержку. Отделу снабжения ИБГ РАН, во главе со Светланой Сергеевной Волковской, за прекрасное обеспечение необходимыми материалами. Всем сотрудникам ИБГ РАН за то участие, которое они принимали в представленной работе.

Сотрудникам ИБХ РАН Габибову Александру Габибовичу, Суровому Андрею Юрьевичу и Лагарьковой Марии (МГУ) за помощь, советы и поддержку.

Брызгалову И. (РОНЦ РАМН) за помощь в проведении экспериментов на животных, Райхлину Натан Танфелеевичу (РОНЦ РАМН) за неоценимую помощь в проведении гистологических и электронно-микроскопических исследований. Барышникову А.Ю и Козлову АМ (РОНЦ РАМН) за помощь в составлении Протокола клинических испытаний.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Киселев, Сергей Львович, Москва

1. Alberts WM, Rumbak MJ, Walsh FW. Lung Cancer: Diagnostic Techniques. Cancer Control. 1994, 1(5):446-454.

2. Bailar JC 3rd, Gornik HL. Trends in cancer mortality: perspectives from Italy and the United States.Med Lav. 1997 88(4):274-86.

3. Medzhitov R. and Janeway Ch.A., "An ancient system of host defense", Current Opinion in Immunology, 1998, v.10, 12-15.

4. Medzhitov R. and Janeway Ch.A., "Innate immunity: impact on the adaptive immune response", Current Opinion in Immunology, 1997, v.9, 4-9.

5. Абелев Г.И., "Взаимодействие врожденного и приобретенного иммунитета в защите организма от инфекции", Соросовский образовательный журнал, 1998, п. 2, 52-58.

6. Bendelac A. and Fearon D.T., "Innate Immunity. Innate pathway that control acquired immunity", Current Opinion in Immunology", 1997, v.9, 13.

7. Yanagata M., Merkie, J.P., and Sanes J.R., "Interspecific comparisons reveal conserved features of the Drosophila Toll protein", Gene, 1994, n. 139, 223-228.

8. Medzhitov R., Preston-Hurlburt P. and Janeway Ch. A., "A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity", Nature, 1997, July 24, v.388, 394-397.

9. Mitcham J.M., Parnet P., BonnertT.P., Garka K.E., Gerhart M.J., Slack J.L., Gayle M.A., Dower S.K. , and Sims J.E., "T1/ST2 Signaling Establishes It as a member of an Expanding lnterleukin-1 Receptor Family", JBC, 1996, n.10, v.271, March 8, 5777-5783.

10. Taguchi T., Mitcham J.L., Dower S.K. , Sims J.E., and Testa J.R., "Chromosomal Localization of TIL, a Gene Encoding a Protein Related to the Drosophila Transmembrane Receptor Toll, to Human Chromosome 4p14", Genomics, 1996, n.32, 486-488.

11. Chaudhary P.M., Ferguson C., Nguyen V., Nguyen O., Massa H.F., Eby M., Jasmin A., Trask B.J., Hood L., and Nelson P.S., "Cloning and

12. Characterization of Two Toll/lnterleukin-1 Receptor-Like Genes TIL3 and TIL4: Evidence for a Multi-Gene Receptor Family in Humans", Blood, 1998, n.11, June 1, v.91, 4020-4027.

13. Rock F.L., Hardiman G., Timans J.C., Kastelein R.A., and Bazan J.F., "A family of human receptors structurally related to Drosophila Toll", PNAS, 1998, January, v.95, 588-593.

14. Hultmark D., "Macrophage differentiation marker MyD88 is a member of the Toll/IL-1 receptor family", 1994, February 28, v.199, n. 1, 144-146.

15. Hardiman G., Jenkins N.A., Copeland N.G., Gilbert D.J., Garcia D.K., Naylor S.L., Kastelein R.A., and Bazan J.F., "Genetic Structure and Chromosomal Mapping of MyD88", Genomics , 1997, n.45, 332-339.

16. Kuby AM, 1997, The molecular cell biology of interferon-g and its receptor. Annu. Rev. Immunol., 11: 571 611.

17. Langton BC, Mackewicz CE, Wan AM, Andria ML, Benjamini E. Structural features of an antigen required for cellular interactions and for T cell activation in a MHC-restricted response.J Immunol. 1988, 15;141(2):447-56.

18. Koeppen H, Acena M, Drolet A, Rowley DA, Schreiber H. Tumors with reduced expression of a cytotoxic T lymphocyte recognized antigen lack immunogenicity but retain sensitivity to lysis by cytotoxic T lymphocytes. Eur J Immunol. 1993, 23(11):2770-6.

19. Van den Eynde B, Lethe B, Van Pel A, De Plaen E, Boon T. The gene coding for a major tumor rejection antigen of tumor P815 is identical to the normal gene of syngeneic DBA/2 mice. J Exp Med. 1991, 1; 173(6): 137384.

20. Lethe B, van der Bruggen P, Brasseur F, Boon T. MAGE-1 expression threshold for the lysis of melanoma cell lines by a specific cytotoxic T lymphocyte. Melanoma Res. 1997 2:S83-8.

21. Robbins PF, el-Gamil M, Kawakami Y, Stevens E, Yannelli JR, Rosenberg SA. Recognition of tyrosinase by tumor-infiltrating lymphocytes from a patient responding to immunotherapy. Cancer Res. 1994, 54(12):3124-6.

22. Dosaka-Akita H, Shindoh M, Fujino M, Kinoshita I, Akie K, Katoh M, Kawakami Y. Abnormal p53 expression in human lung cancer is associated with histologic subtypes and patient smoking history. Am J Clin Pathol. 1994;102(5):660-4.

23. Wang RF, Robbins PF, Kawakami Y, Kang XQ, Rosenberg SA. Identification of a gene encoding a melanoma tumor antigen recognized by

24. HLA-A31-restricted tumor-infiltrating lymphocytes. J Exp Med. 1995, 181(2):799-804.

25. Wang RF, Appella E, Kawakami Y, Kang X, Rosenberg SA. Identification of TRP-2 as a human tumor antigen recognized by cytotoxic T lymphocytes. J Exp Med. 1996;184(6):2207-16.

26. Freedman AS, Nadler LM. B cell development in chronic lymphocytic leukemia. Semin Hematol. 1987, 24(4):230-9.

27. Cotran RS, Pober JS. Effects of cytokines on vascular endothelium: their role in vascular and immune injury. Kidney Int. 1989 35(4):969-75.

28. Brown JP, Hellstrom KE, Hellstrom I. Use of monoclonal antibodies for quantitative analysis of antigens in normal and neoplastic tissues. Clin Chem. 1981, 27(9):1592-6.

29. Fisk B, Blevins TL, Wharton JT, loannides CG. Identification of an immunodominant peptide of HER-2/neu protooncogene recognized by ovarian tumor-specific cytotoxic T lymphocyte lines. J Exp Med. 1995, 181(6):2109-17.

30. Magdelenat H. Tumour markers in oncology: past, present and future. J Immunol Methods. 1992, 150(1-2):133-43.

31. Thompson JA, Grunert F, Zimmermann W. Carcinoembryonic antigen gene family: molecular biology and clinical perspectives. J Clin Lab Anal. 1991 ;5(5):344-66.

32. Thompson JA, Grunert F, Zimmermann W. Carcinoembryonic antigen gene family: molecular biology and clinical perspectives. J Clin Lab Anal. 1991;5(5):344-66.

33. Bates SE. Clinical applications of serum tumor markers. Ann Intern Med. 1991, 115(8):623-38.

34. Horie Y, Miura K, Matsui K, Yukimasa A, Ohi S, Hamamoto T, Kawasaki H. Marked elevation of plasma carcinoembryonic antigen and stomach carcinoma. Cancer. 1996, 77(10):1991-7

35. Abelev Gl. Alpha-fetoprotein in ontogenesis and its association with malignant tumors. Adv Cancer Res. 1971;14:295-358.

36. Zhou XD, Tang ZY, Yu YQ, Yang BH, Lin ZY, Lu JZ, Ma ZC, Tang CL. Long-term survivors after resection for primary liver cancer. Clinical analysis of 19 patients surviving more than ten years. Cancer. 1989, 63(11):2201-6.

37. Lampson LA, Levy R. A role for clonal antigens in cancer diagnosis and therapy. J Natl Cancer Inst. 1979, 62(2):217-20.

38. Schreiber H, Leibson P. Suppression of myeloma growth in vitro by antiidiotype antibodies: inhibition of DNA synthesis and colony formation. J Natl Cancer Inst. 1978;60(1):225-33.

39. Beatty PG, Kim BS, Rowley DA, Coppleson LW. Antibody against the antigen receptor of a plasmacytoma prolongs survival of mice bearing the tumor. J Immunol. 1976, 116(5):1391-6.

40. Miller BA, Siedler DE, Dunn CD, Huang AT. Conditions for an in vitro culture of murine mixed hematopoietic colonies and their putative cellular origin. Blood. 1982, 60(1):99-107.

41. Miller BA, Siedler DE, Dunn CD, Huang AT. Conditions for an in vitro culture of murine mixed hematopoietic colonies and their putative cellular origin. Blood. 1982, 60(1):99-107.

42. Wagner SN, Wagner C, Schultewolter T, Goos M. Analysis of Pmel17/gp100 expression in primary human tissue specimens: implications for melanoma immuno- and gene-therapy. Cancer Immunol Immunother.1997;44(4):239-47.

43. Hollstein M, Sidransky D, Vogelstein B, Harris CC. p53 mutations in human cancers. Science. 1991, 253(5015):49-53.

44. Weinberg RA. Tumor suppressor genes. Science. 1991, 254(5035): 113846.

45. Vogelstein B, Kinzler KW. p53 function and dysfunction. Cell. 1992, 70(4):523-6

46. Hollstein M, Sidransky D, Vogelstein B, Harris CC. p53 mutations in human cancers. Science. 1991, 253(5015):49-53.

47. Gannon JV, Greaves R, Iggo R, Lane DP. Activating mutations in p53 produce a common conformational effect. A monoclonal antibody specific for the mutant form. EMBO J. 1990, 9(5): 1595-602.

48. Feramisco JR, Clark R, Wong G, Arnheim N, Milley R, McCormick F. Transient reversion of ras oncogene-induced cell transformation by antibodies specific for amino acid 12 of ras protein. Nature. 1985, 314(6012):639-42.

49. Pullano TG, Sinn E, Carney WP. Characterization of monoclonal antibody R256, specific for activated ras p21 with arginine at 12, and analysis of breast carcinoma of v-Harvey-ras transgenic mouse. Oncogene. 1989 , 4(8): 1003-8.

50. Mandruzzato S, Brasseur F, Andry G, Boon T, van der Bruggen P. A CASP-8 mutation recognized by cytolytic T lymphocytes on a human head and neck carcinoma. J Exp Med. 1997, 186(5):785-93.

51. Robbins PF, El-Gamil M, Li YF, Kawakami Y, Loftus D, Appella E, Rosenberg SA. A mutated beta-catenin gene encodes a melanoma-specific antigen recognized by tumor infiltrating lymphocytes. J Exp Med. 1996 , 183(3):1185-92.

52. Bigner SH, Humphrey PA, Wong AJ, Vogelstein B, Mark J, Friedman HS, Bigner DD. Characterization of the epidermal growth factor receptor in human glioma cell lines and xenografts. Cancer Res. 1990, 50(24):8017-22.

53. Shtivelman E, Lifshitz B, Gale RP, Canaani E. Fused transcript of abl and bcr genes in chronic myelogenous leukaemia. Nature. 1985, 315(6020):550-4.

54. Weiss L, Subjeck JR, Poste G. Some electrical properties of the peripheries of murine 3T3 cells with respect to viral transformation and reversion. Int J Cancer. 1975 16(6):914-21.

55. Subjeck JR, Poste G. Properties of the peripheries of murine cells with respect to viral transformation and reversion. Int J Cancer. 1971 16(6):914-21.

56. Tevethia SS, Tevethia MJ, Lewis AJ, Reddy VB, Weissman SM. Biology of simian virus 40 (SV40) transplantation antigen (TrAg). IX. Analysis of TrAg in mouse cells synthesizing truncated SV40 large T antigen. Virology. 1983 128(2):319-30.

57. Lethe B, van der Bruggen P, Brasseur F, Boon T. MAGE-1 expression threshold for the lysis of melanoma cell lines by a specific cytotoxic T lymphocyte. Melanoma Res. 1997 Suppl 2:S83-8.

58. Teich SA, Halprin SL, Tay S. Horner's syndrome secondary to Swan-Ganz catheterization. Am J Med. 1985 78(1):168-70.

59. Acha-Orbea H, MacDonald HR. Superantigens of mouse mammary tumor virus. Annu Rev Immunol. 1995;13:459-86.

60. Metzgar RS, MohanakumarT, Bolognesi DP. Relationships between membrane antigens of human leukemic cells and oncogenic RNA virus structural components. J Exp Med. 1976 143(1):47-63.

61. Ottonello L, Morone P, Dapino P, Dallegri F. Monoclonal Lym-1 antibody-dependent lysis of B-lymphoblastoid tumor targets by human complement and cytokinine-exposed mononuclear and neutrophilic polymorphonuclearleukocytes. Blood. 1996 87(12):5171-8.

62. Kushner BH, Cheung NK. Absolute requirement of CD11/CD18 adhesion molecules, FcRII and the phosphatidylinositol-linked FcRIII for monoclonal antibody-mediated neutrophil antihuman tumor cytotoxicity. Blood. 1992 , 79(6): 1484-90.

63. Miller RA, Maloney DG, Warnke R, Levy R. Treatment of B-cell lymphoma with monoclonal anti-idiotype antibody. N Engl J Med. 1982; 306(9):517-22

64. Goodman GE, Hellstrom I, Brodzinsky L, Nicaise C, Kulander B, Hummel D, Hellstrom KE. Phase I trial of murine monoclonal antibody L6 in breast, colon, ovarian, and lung cancer. J Clin Oncol. 1990, 8(6): 1083-92.

65. Riethmuller G, Schneider-Gadicke E, Johnson JP. Monoclonal antibodies in cancer therapy. Curr Opin Immunol. 1993, 5(5):732-9

66. Okamoto T, Kaneda Y, Yuzuki D, Huang SK, Chi DD, Hoon DS. Induction of antibody response to human tumor antigens by gene therapy using a fusigenic viral liposome vaccine. Gene Ther. 1997 , 4(9):969-76.

67. Stancovski I, Hurwitz E, Leitner O, Ullrich A, Yarden Y, Sela M. Mechanistic aspects of the opposing effects of monoclonal antibodies to the ERBB2 receptor on tumor growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991, 88(19):8691-5.

68. Bacus SS, Stancovski I, Huberman E, Chin D, Hurwitz E, Mills GB, Ullrich A, Sela M, Yarden Y. Tumor-inhibitory monoclonal antibodies to the HER-2/Neu receptor induce differentiation of human breast cancer cells. Cancer Res. 1992 , 52(9):2580-9.

69. Waldmann TA, Goldman CK. The multichain interleukin-2 receptor: a target for immunotherapy of patients receiving allografts. Am J Kidney Dis. 1989, 14(5 Suppl 2):45-53.

70. Boon T, Old LJ. Cancer Tumor antigens. Curr Opin Immunol. 1997, ;9(5):681-3.;

71. Botti C, Martinetti A, Nerini-Molteni S, Ferrari L. Anti-malignin antibody evaluation: a possible challenge for cancer management. Int J Biol Markers. 1997 , 12(4):141-7

72. Leclerc JC, Senik A, Gomard E, Plata F, Levy JP. Cell-mediated antitumor immune reactions under syngeneic conditions. Transplant Proc. 1973, 5(4):1431-4.

73. Boon T, Coulie PG, Van den Eynde B. Tumor antigens recognized by T cells. Immunol Today. 1997 , 18(6):267-8.

74. Boon T, Old LJ. Cancer Tumor antigens. Curr Opin Immunol. 1997; 9(5):681-3

75. Rosenberg SA. Cancer vaccines based on the identification of genes encoding cancer regression antigens. Immunol Today. 1997 , 18(4):175-82.

76. Fossati G, Anichini A, Parmiani G. Melanoma cell lysis by human CTL clones: differential involvement of T3, T8 and HLA antigens. Int J Cancer. 1987 , 39(6):689-94.

77. Robbins PF, Kawakami Y. Human tumor antigens recognized by T cells. Curr Opin Immunol. 1996 8(5):628-36.

78. Graf LH Jr, Rosenberg CD, Mancino V, Ferrone S. Transfer and co-amplification of a gene encoding a 96-kDa immune IFN-inducible human melanoma-associated antigen. Preferential expression by mouse melanoma host cells. J Immunol. 1988 , 141(3):1054-60.

79. Coveney E, Wheatley GH 3rd, Lyerly HK. Active immunization using dendritic cells mixed with tumor cells inhibits the growth of primary breast cancer. Surgery. 1997 , 122(2):228-34.

80. Gong J, Chen D, Kashiwaba M, Kufe D. Induction of antitumor activity by immunization with fusions of dendritic and carcinoma cells. Nat Med. 1997 , 3(5):558-61.

81. Nair SK, Snyder D, Rouse BT, Gilboa E. Regression of tumors in mice vaccinated with professional antigen-presenting cells pulsed with tumor extracts. Int J Cancer. 1997 , 70(6):706-15.

82. Kern TS, Engerman RL. Microvascular metabolism in diabetes. Metabolism. 1986 , 35(4 Suppl 1):24-7.

83. Ostrand-Rosenberg S, Thakur A, Clements V. Rejection of mouse sarcoma cells after transfection of MHC class II genes. J Immunol. 1990 , 144(10):4068-71.

84. James RF, Edwards S, Hui KM, Bassett PD, Grosveld F. The effect of class II gene transfection on the tumourigenicity of the H-2K-negative mouse leukaemia cell line K36.16. Immunology. 1991 , 72(2):213-8.

85. Chen PW, Ananthaswamy HN. ArticlesRejection of K1735 murine melanoma in syngeneic hosts requires expression of MHC class I antigens and either class II antigens or IL-2. J Immunol. 1993 , 151(1):244-55.

86. Jung S, Schluesener HJ. Human T lymphocytes recognize a peptide of single point-mutated, oncogenic ras proteins. J Exp Med. 1991; 173(1 ):273-6.

87. Peace DJ, Chen W, Nelson H, Cheever MA. T cell recognition of transforming proteins encoded by mutated ras proto-oncogenes. J Immunol. 1991 , 146(6):2059-65.

88. Kiessling R, Petranyi G, Klein G, Wigzel H. Genetic variation of in vitro cytolytic activity and in vivo rejection potential of non-immunized semi-syngeneic mice against a mouse lymphoma line. Int J Cancer. 1975;15(6):933-40.

89. Ljunggren HG, Karre K. In search of the 'missing self: MHC molecules and NK cell recognition. Immunol Today. 1990 , 11(7):237-44.

90. Woodruff MF. The cytolytic and regulatory role of natural killer cells in experimental neoplasia. Biochim Biophys Acta. 1986 , 865(1 ):43-57.

91. Trinchieri G. Biology of natural killer cells. Adv Immunol. 1989;47:187

92. Karre K, Klein GO, Kiessling R, Klein G, Roder JC. In vitro NK-activity and in vivo resistance to leukemia: studies of beige, beige//nude and wildtype hosts on C57BL background. Int J Cancer. 1980 , 26(6):789-97

93. Campanile F, Crino L, Bonmassar E, Houchens D, Goldin A. Radioresistant inhibition of lymphoma growth in congenially athymic (nude) mice. Cancer Res. 1977 , 37(2):394-8.

94. Wiltrout RH, Frost P, Morrison MK, Kerbel RS. Immune-mediated arrest and reversal of established visceral metastases in athymic mice. Cancer Res. 1979 , 39(10):4034-41.

95. Talmadge JE, Meyers KM, Prieur DJ, Starkey JR. Role of natural killer cells in tumor growth and metastasis: C57BL/6 normal and beige mice. J Natl Cancer Inst. 1980 , 65(5):929-35.

96. Hanna N, Burton RC. Definitive evidence that natural killer (NK) cells inhibit experimental tumor metastases in vivo. J Immunol. 1981, 127(5):1754-8.

97. Fleuren GJ, Gorter A, Kuppen PJ, Litvinov S, Warnaar SO. Tumor heterogeneity and immunotherapy of cancer. Immunol Rev. 1995, 145:91122.

98. Naume B, Gately M, Espevik T. A comparative study of IL-12 (cytotoxic lymphocyte maturation factor)-, IL-2-, and IL-7-induced effects on immunomagnetically purified CD56+ NK cells. J Immunol. 1992 , 148(8):2429-36.

99. Naume B, Espevik T. Immunoregulatory effects of cytokines on natural killer cells. Scand J Immunol. 1994 , 40(2): 128-34.

100. Grimm EA, Jacobs SK, Lanza LA, Melin G, Roth JA, Wilson DJ. Interleukin 2-activated cytotoxic lymphocytes in cancer therapy. Symp Fundam Cancer Res. 1986;38:209-19.

101. Basse PH, Nannmark U, Johansson BR, Herberman RB, Goldfarb RH. Establishment of cell-to-cell contact by adoptively transferred adherent lymphokine-activated killer cells with metastatic murine melanoma cells. J Natl Cancer Inst. 1991 , 83(13):944-50.

102. Eberlein TJ, Rosenstein M, Rosenberg SA. Regression of a disseminated syngeneic solid tumor by systemic transfer of lymphoid cellsexpanded in interleukin 2. J Exp Med. 1982;156(2):385-97.

103. Shu SY, Chou T, Rosenberg SA. Generation from tumor-bearing mice of lymphocytes with in vivo therapeutic efficacy. J Immunol. 1987; 139(1 ):295-304.

104. Audran R, Dazord L, Toujas L. Interactions between human macrophages and tumor cells in three-dimensional cultures. Cancer Immunol Immunother. 1994 , 39(5):299-304.

105. Nakabo Y, Pabst MJ. Lysis of leukemic cells by human macrophages: inhibition by 4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride (AEBSF), a serine protease inhibitor. J Leukoc Biol. 1996; 60(3):328-36.

106. Ben-Efraim S, Tak C, Fieren MJ, Romijn JC, Beckmann I, Bonta IL. Activity of human peritoneal macrophages against a human tumor: role of tumor necrosis factor-alpha, PGE2 and nitrite, in vitro studies. Immunol Lett. 1993 , 37(1):27-33.

107. Keller R, Keist R, Wechsler A, Leist TP, van der Meide PH. Mechanisms of macrophage-mediated tumor cell killing: a comparative analysis of the roles ofreactive nitrogen intermediates and tumor necrosis factor. Int J Cancer. 1990;46(4):682-6.

108. Spinner DM, Brandstetter T, Kiechle-Schwarz M, Du Bois A, Angel P, Bauknecht T. c-jun expression and growth stimulation in human ovarian carcinoma cell lines following exposure to cytokines. Int J Cancer. 1995;63(3):423-7.

109. Munn DH, Cheung NK. Phagocytosis of tumor cells by human monocytes cultured in recombinant macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 1990;172(1):231-7

110. Whitworth PW, Pak CC, Esgro J, Kleinerman ES, Fidler IJ. Macrophages and cancer. Cancer Metastasis Rev. 1990;8(4):319-51.

111. Devilee P, Cornelisse CJ. Somatic genetic changes in human breast cancer. Biochim BiophysActa. 1994; 1198(2-3): 113-30.

112. Peace DJ, Chen W, Nelson H, Cheever MA. T cell recognition of transforming proteins encoded by mutated ras proto-oncogenes. J Immunol. 1991 , 146(6):2059-65.

113. Wagner SN, Wagner C, Schultewolter T, Goos M. Analysis of Pmel17/gp100 expression in primary human tissue specimens: implications for melanoma immuno- and gene-therapy. Cancer Immunol Immunother. 1997;44(4):239-47.

114. Marrack P, Kushnir E, Kappler J. A maternally inherited superantigen encoded by a mammary tumour virus. Nature. 1991;349(6309):524-6.

115. Acha-Orbea H, ShakhovAN, Scarpellino L, Kolb E, Muller V, Vessaz-Shaw A, Fuchs R, Blochlinger K, Rollini P, Billotte J, etal. Clonal deletion of V beta 14-bearing T cells in mice transgenic for mammary tumour virus. Nature. 1991 ¡350(6315):207-11.

116. Elliot S, Striker LJ, Doi T, Linehan WM, Striker GE.Hepatoma G2 conditioned medium facilitates early outgrowth of endothelial cells from isolated glomeruli.Kidney Int. 1989;35(5): 1245-8

117. Kaklamanis L, Hill A. MHC loss in colorectal tumours: evidence for immunoselection? Cancer Surv. 1992;13:155-71.

118. Hui K, Grosveld F, Festenstein H. Rejection of transplantable AKR leukaemia cells following MHC DNA-mediated cell transformation. Nature. 1984;311 (5988):750

119. Rickinson AB, Murray RJ, Brooks J, Griffin H, Moss DJ, Masucci MG. T cell recognition of Epstein-Barr virus associated lymphomas. Cancer Surv. 1992;13:53-80. Review.

120. Bernards R, de Leeuw MG, Houweling A, van der Eb AJ. Role of the adenovirus early region 1B tumor antigens in transformation and lytic infection. Virology. 1986; 150(1): 126-39.

121. Melief CJ, Kast WM. T-cell immunotherapy of cancer. Res Immunol. 1991;142(5-6):425-9

122. Lill NL, Tevethia MJ, Hendrickson WG, Tevethia SS. Cytotoxic T lymphocytes (CTL) against a transforming gene product select for transformed cells with point mutations within sequences encoding CTL recognition epitopes. J Exp Med. 1992;176(2):449-57.

123. Hui KM. Induction of tumour-specific immunity by manipulating the expression of major histocompatibility complex molecules on tumour cells. FEMS Microbiol Immunol. 1990;2(4):215-21.

124. Old LJ. Cell surface antigens of human renal cancer defined by mouse monoclonal antibodies: identification of tissue-specific kidney glycoproteins. Proc Natl Acad Sci USA. 1981 78(8):5122-6.

125. Prehn RT. The immune reaction as a stimulator of tumor growth. Science. 1972;176(31):170-1.

126. Hammer D. Immunity in neoplasms. Zentralbl Veterinarmed [B], 1968;15(1):51-5

127. Hellstrom I, Hellstrom KE. Cell-mediated immune reactions to tumor antigens with particular emphasis on immunity to human neoplasms. Cancer. 1974 suppl:1461-8

128. Currie G. Immunological aspects of host resistance to the development and growth of cancer. Biochim Biophys Acta. 1976;458(2): 135-65.

129. Walker P.R., Saas P., and Dietrich P.Y., "Tumor expression of FAS ligand (CD95) and the consequences", Current Opinion in Immunology, 1998, n.10, 564-572.

130. Wagelie-Steffen A.L., Hartmann K., Vliagoftis H., Metcalfe D.D., "Fas ligand (FASL, CD95L, APO-1L) expression in murine mast cells", J. Immunol., 1998, n.94, 569-574.

131. Liu Q.Y., Rubin M.A., Omene C., Lederman S., and Stein C., "Fas Ligand is constitutively secreted by prostate cancer cells in vitro", Clinical Cancer Res., 1998, July, v. 4, 1803-1811.

132. Hahne M., Rimoldi D., Schroter M., Romeo P., Schreier M, French L, Schneider P, Bornand T., Fontana A., Lienard D. et al., "Melanoma cell expression of FAS (APO-1/CD95) ligand: implication for tumor immune escape", Science, 1996, n.274, 1363-1366.

133. Cardi G., Heaney J.A., Schned A.R., and Ernstoff M.S., "Expression of FAS (APO-1/CD95) in tumor-infiltrating and peripheral blood lymphocytes in patients with renal cell carcinoma", Cancer Res., 1998, May, n.58, 20782080.

134. Liu C.C., Raffi S., Granelli-Piperano A., Trapani J.A, Young J.D., "Perforin and serine esterase gene expression in stimulated human T cells: Kinetics, mitogen requirements and effects of cyclosporin A", J. Exp. Med., 1989, v.170, 2105-2118.

135. Henkart P.A., "Mechanisms of lymphokine-mediated cytotoxicity", Annual Rev. Immunol., 1985, v.3, 31-52

136. Jones J., Morgan B.P., "Killing of cells by perforin", Biochem J., 1991, v.280, 199.

137. Kagi D., Ledermann В., Burki K., Seiler O., Odermatt В., Olsen KJ. Podack ER, Zinkerrnagel RM, Hengartner H,: "Cytotoxicity meriated by T cells and natural killer cells is greatly impaired in perforine-deficient mice", Nature, 1994, n.369, 31-36.

138. Masson D., Tschopp J., "A family of serine esterases in lytic granules of cytotoxic T lymphocytes, Cell, 1987, v.49, 679.

139. Сащенко Л.П., Лукьянова Т.И., Миркина И.И., Понгор 111., Гнучев Н.В., "Влияние гранулярных сериновых протеаз и протеинкиназ на цитолитическое действие ЛАК клеток", Доклады РАН, 1998, 360, 305309.

140. Shresta S., Maclor D.M., Heusel J.W., Russell J.H., Ley Т. J., "Cytotoxic lymphocytes require granzyme В for the rapid induction of DNA fragmentation and apoptosis in susceptible target cells", Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1995, 92, 5679-5683.

141. Shresta S., Goda P., Wesselschimdt R., Ley T.J., " Residual cytotoxicity and granzyme К expression in granzyme A-deficient cytotoxic lymphocytes", J. Biol. Chem., 1997, 272, 20236-20244.

142. Shresta S., Pham Ch., Thomas D.A., Graubert T.A. and Ley T.J., "How do cytotoxic lymphocytes kill their targets ?", Current Opinion in Immunology, 1998, n.10, 581-587.

143. Hasegawa Y., Bonavida В., "Calcium-independant pathway of TNFmediated lysis of target cells", J. Immunol., 1989, v.142, 2670.

144. Klefstrom J., Vastrik I., Saksela E„ Valle J., Eilers M. and Alitalo K.,c-Myc induces cellular susceptibility to the cytotoxic avtion of TNF-a",

145. EMBO, 1994, v.13, n. 22, 5442-5450.

146. Wang J. and Lenardo M. J., "Molecules involved on cell death andperipheral tolerance", Current Opinion in Immunology, 1997, n.9, 818-825.

147. Grell M., Wajant H., Zimmermann G. and Scheurich P., "The type 1 receptor (CD120a) is the high-affinity receptor for soluble tumor necrosis factor", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, January, v.95, 570-575.

148. Scott D.W., Grdina T., Shi Y., " T cells commit suicide, but B cells are murdered", J. Immunol., 1996, April 1, v.156, n. 7, 2352-2356.

149. Osborne B.A., "Apoptosis and the maintenance of homeostasis in the immune system", Current Opinion in Immunology, 1996, n.8, 245-254.

150. Gao Y., Herndon J.M., Zhang H., Griffith T. S., and Ferguson T. A., "Antiinflammatory effect of CD95 Ligand (FASL)-induced apoptosis", J. Exp. Med., 1998, September, v.188, n.5, 887-896.

151. Arai H., Gordon D., Nabel G.J., Nabel G.J, "Gene transfer of FAS ligand induces tumor regression in vivo", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, n. 94, 13862-13867.

152. Seino K.I., Kayagaki N., Okumura K., Yagita H., "Antitumor effect of locally produced CD95 ligand", Nat. Med., 1997, n.3, 165-170.

153. Seino K.I., Kayagaki N., Tsukada N., Fukao K., Yagita H., Okumura K., "Transplantation of CD95 ligand-expressing grafts. Influence oftransplantation site and difficulty in protecting alio- and xenografts", Transplantation, 1997, n. 64, 1050-1054.

154. Nagata S., "Apoptosis by Death Factor", Cell, 1997, February 7, v.88, 355-365.

155. Devy O., "Antibiotic proteins of polymorphonuclear leukocytes", Eur. J. Haematol. 1996 May, 56 (5), 263-77

156. Lehrer R.I., Ganz T., "Defensins: endogenous antibiotic peptides from human leukocytes", Ciba Found Symp., 1992, n. 171, 276-293.

157. Lillard J.W., Boyaka P.N., Chertov O., Oppenheim J.J., McGhee J.R., "Mechanisms for induction of acquired host immunity by neutrophil peptide defensins". Proc Natl Acad Sci USA, 1999, January 19, 96 (2), 651-6.

158. Biron C.A. , "Role of early cytokines, including alpha and beta interferons IFN-alpha/beta), in innate and adaptive immune responses to viral infections.", Semin. Immunol., 1998, October, 10 (5), 383-90.

159. Ross E.M. and Caligiuri M.A., "Cytokine-induced apoptosis of human natural killer cells identifies a novel mechanism to regulate the innate immune response", Blood, 1997, February 1, v.89, n. 3, 910-918.

160. Cohen, M.C. and Cohen, S. (1996) Cytokine function: a study in biologic diversity. Am. J. Clin. Pathol., 105: 589 598.

161. Balkwill, F.R. and Burke, F. (1989) The cytokine network. Immunol. Today, 10: 299 304.

162. Isaacs, A. and Lindenmann, J. (1957) Virus interference! The interferon. Proc. Soc. Lond. B., 147: 258 267.

163. Wheelock, E.F. (1965) Interferon-like virus inhibitor induced in human leukocytes by phytohemagglutinin. Science, 149: 310 311.

164. Youngner,J.S. and Salvin, S.B. (1973) Production and properties of migration inhibitory factor and interferon in the circulation of mice with delayed hypersensitivity. J. Immunol., 111: 1914 1922.

165. Farrar, M.A. and Schreiber, R.D. (1993) The molecular cell biology of interferon-g and its receptor. Annu. Rev. Immunol., 11: 571 611.

166. Czarniecki, C.W., Fennie, C.W., Powers, D.B., Estell, D.A. (1984) Synergistic antiviral and antiproliferative activities of Escherichia coli-derived human alpha, beta, and gamma interferons. J. Virol., 49: 490 -496.

167. Sims, J.E. and Dower, S.K. (1994) Interleukin 1 receptor. Eur. Cytokine Netw., 5: 539 - 546.

168. Roitt, I.M. Essential Immunology. 6th Ed., Blackwell Scientific, London: UK.

169. Sunderland, M.C. and Roodmann, G.D. (1991) lnterleukin-3. Its biology and potential uses in pediatric hematology/ oncology. Int. J. Cell Cloning, 9: 5-23.

170. Takatsu, K. and Tominaga, A. (1991) Interleukin 5 and its receptor. Prog. Growth Factor Res., 3: 87 102.

171. Namen, A.E., Williams, D.E., Goodwin, R.G. (1990) lnterleukin-7: a new hematopoietic growth factor. Prog. Clin. Biol. Res., 338: 65 73.

172. Smith, W.B., Gamble, J.R., Clark-Lewis, I., Vadas, M.A. (1991) Interleukin 8 induces neutrophil transendotelial migration. Immunology, 72: 65 - 72.

173. Baggiolini, M., Clark-Lewis, I. (1992) lnterleukin-8, a chemotactic and inflammatory cytokine. FEBS Lett., 307: 97- 101.

174. Renauld, J.C., Druez, C., Kermouni, A., Houssiau, F., Uyttenhove, C., Van Roost, E., Van Snick, J. (1992) Expression cloning of the murine and human interleukin 9 receptor cDNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5690 5694.

175. Mossmann, T.R. (1994) lnterleukin-10. In: The Cytokine Handbook. Thomson, A. ed., Academic Press, London, 223 237.

176. Bogdan, C., Vodovotz, Y. and Nathan, C. (1991) Macrophage deactivation by interleukin-10. J. Exp. Med., 174: 1549 1555 .

177. MacNeil, I.A., Suda, T., Moore, K.W., Mossmann, T.R., Zlotnik, A. (1990) IL-10, a novel growth cofactor for mature and immature T cells. J. Immunol., 145:4167-4173.

178. Schwartz, M.A., Hamilton, L.D., Tardelli, L., Narula, S.K., Sullivan, L.M. (1994) Stimulation of cytotoxic activity by interleukin 10. J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol., 16: 95 - 105.

179. Leng, S.X. and Elias, J.A. (1997) lnterleukin-11. Int. J. Biochem. Cell Biol., 29:1059 1062.

180. McKenzie, A.N. and Zurawski, G. (1995) lnterleukin-13: characterization and biologic properties. Cancer Treat. Res., 80: 367 378.

181. Armitage, R.J. (1994) Tumor necrosis factor receptor superfamily and their ligands. Curr. Opin. Immunol., 6: 407 413.

182. Gruss, H.J. (1996) Molecular, structural, and biological characteristics of the tumor necrosis factor ligand superfamily. Int. J. Clin. Lab. Res., 26: 143 -159.

183. Kriegler, M., Perez, C., De Fay, K„ Albert, I., Lu, S.D. (1988) A novel form of TNF/cachectin is a cell surface cytotoxic transmembrane proteine: ramifications for the complex physiology of TNF. Cell, 53: 45 53.

184. Suda, T., Takahashi, T., Golstein, P., Nagata, S. (1993) Molecular cloning and expression of the Fas ligand, a novel member of the tumor necrosis factor family. Cell, 75: 1169 1178.

185. Jones, E.Y., Stuart, D.I. Walker, N.P. (1990) The structure of tumor necrosis factor implications for biological function. J. Cell. Sci. Suppl., 13: 11 -18.

186. Eck, M.J., Ultsch, M., Rinderknecht, E., de Vos, A.M., Sprang, S.R. (1992) The structure of human lymphotoxin (tumor necrosis factor-beta) at 1.9-A resolution. J. Biol. Chem., 267: 2119 2122.

187. Carswell, E.A., Old, L.J., Kassel, R.L., Green, S„ Fiore, N., Williamson, B. (1975) An endotoxin-induced serum factor that causes necrosis of tumors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72: 3666 3670.

188. Old, L.J. (1985) Tumor necrosis factor (TNF). Science, 230: 630 632.

189. Beutler, B. and Cerami, A. (1989) The biology of cachectin/TNF a primary mediator of the host response. Annu. Rev. Immunol., 7: 625 - 655.

190. Balkwill, F.R. (1989) Cytokines in cancer therapy. Oxford University Press, Oxford.

191. Spriggs, D R. and Yates, S.W. (1992) Cancer chemotherapy: experiences with TNF administration in humans. In: Tumor necrosis factors: the molecules and their emerging role in medicine. Beutler, B., ed., Raven Press, New York, NY, 383 406.

192. Pennica, D. and Goeddel, D.V. (1987) Cloning and characterization of the genes for human and murine tumor necrosis factors. Lymphokines, 13: 163- 198.

193. Aggarwal, B.B. and Natarajan, K. (1996) Tumor necrosis factors: developments during the last decade. Eur Cytokine Netw., 7: 93 -124.

194. Kriegler, M„ Perez, C., De Fay, K., Albert, I., Lu, S.D. (1988) A novel form of TNF/cachectin is a cell surface cytotoxic transmembrane proteine: ramifications for the complex physiology of TNF. Cell, 53: 45 53.

195. Durum, S.K. and Oppenheim, J.J. (1993) Proinflammatory cytokines and immunity. In: Fundamental immunology, Paul, W.E. ed., Raven Press, New York, N.Y., 807-812.

196. Aversa, G., Punnonen, J. and de Vries, J.E. (1993) The 26-kD transmembrane form of tumor necrosis factor a on activated CD4+ T cell clones provides a costimulatory signal for human B cell activation. J. Exp. Med., 177: 1575- 1585.

197. Granger GA, Williams TW. (1968) Lymphocyte cytotoxicity in vitro: activation and release of a cytotoxic factor. Nature. 218(148): 1253-4.

198. Aggarwal, B.B., Henzel, W.J., Moffat, B„ Kohr, W.J., Harkins, R.N. (1985) Primary structure of human lymphotoxin derived from 1788 lymphoblastoid cell line. J. Biol. Chem., 260: 2334 2344.

199. Ware, C.F., Crowe, P.D., Grayson, M.H., Androlewicz, M.J., Browning, J.L. (1992) Expression of surface lymphotoxin and tumor necrosis factor on activated T, B, and natural killer cells. J. Immunol., 149: 3881 3888.

200. Li, C.-B., Gray, P., McGrath, K.M., Ruddle, F.N., Ruddle, N.H. (1987) Cloning and expression of murine lymphotoxin cDNA. J.Immunol., 138: 4496 4501

201. Turetskaya, R.L., Fashena, S.J., Paul, N.L., Ruddle, N.H. (1992) Genomic strukture, induction, and production of TNF-b. Immunol. Ser., 56: 35 60.

202. Jones, E.Y., Stuart, D.I. Walker, N.P. (1990) The structure of tumor necrosis factor implications for biological function. J. Cell. Sei. Suppl., 13: 11-18.

203. Smith, C.A., Farrah, T., Goodwin, R.G. (1994) The TNF receptor superfamily of celluar and viral proteins: activation, costimulation, and death. Cell, 76: 959 962.

204. Espevik, T., Brockhaus, M., Loetscher, H., Nonstad, U., Shalaby, R. (1990) Characterization of binding and biological effects of monoclonal antibodies against a human tumor necrosis factor receptor. J. Exp. Med., 171: 415-426.

205. Wong, G.H., Tartaglia, L.A., Lee, M.S., Goeddel, D.V. (1992) Antiviral activity of tumor necrosis factor is signaled through the 55-kDa type I TNF receptor. J. Immunol., 149: 3350 3353.

206. Tartaglia, L.A., Ayres, T.M., Wong, G.H., Goeddel, D.V. (1993a) A novel domain within the 55 kd TNF receptor signals cell death. Cell, 74: 845 -853.

207. Lawton, P., Nelson, J., Tizard, R., Browning, J.L. (1995) Characterization of the mouse lymphotoxin-beta gene. J. Immunol., 154: 239 246.

208. Crowe, P.D., VanArsdale, T.L., Walter, B.N., Ware, C.F., Hession, C., Ehrenfels, B., Browning, J.L., Din, W.S., Goodwin, R.G., Smith, C.A. (1994) A lymphotoxin-beta-specific receptor. Science, 264: 707 710.

209. Browning, J.L., Miatkowski, K., Sizing, I., Griffiths, D., Zafari, M., Benjamin, C.D., Meier, W., Mackay, F. (1996) Signaling through the lymphotoxin beta receptor induces the death of some adenocarcinoma tumor lines. J. Exp. Med., 183: 867 878.

210. Rennert PD, Browning JL, Mebius R, Mackay F, Hochman PS. 1996 Surface lymphotoxin alpha/beta complex is required for the development of peripheral lymphoid organs. J Exp Med. 184(5): 1999-2006.

211. Koni PA, Sacca R, Lawton P, Browning JL, Ruddle NH, Flavell RA. 1997 Distinct roles in lymphoid organogenesis for lymphotoxins alpha and beta revealed in lymphotoxin beta-deficient mice.Immunity. 6(4):491-500.

212. Trauth, B.C., Klas, C., Peters, A.M., Matzku, S„ Moller, P., Falk, W., Debatin, K.M., Krammer, P.H. (1989) Monoclonal antibody-mediated tumor regression by induction of apoptosis. Science, 245: 301 305.

213. Yonehara, S., Ishii, A., Yonehara, M. (1989) A cell-killing monoclonal antibody (anti-Fas) to a cell surface antigen co-downregulated with the receptor of tumor necrosis factor. J. Exp. Med., 169: 1747 1756.

214. Itoh, N. and Nagata, S. (1993) A novel protein domain required for apoptosis. Mutational analysis of human Fas antigen. J. Biol. Chem., 286: 10932- 10937.

215. Watanabe-Fukunaga, R., Brannan, C.I., Itoh, N., Yonehara, S., Copeland, N.G., Jenkins, N.A., Nagata, S. (1992) The cDNA structure, expression and chromosomal assignment of the mouse Fas antigen. J. Immunol., 148: 1274 1279.

216. Nagata, S. and Golstein, P. (1995) The Fas death factor. Science, 267: 1449 1456.

217. Tanaka, M., Suda, T., Takahashi, T., Nagata, S. (1995) Expression of the functional soluble form of human fas ligand in activated lymphocytes. EMBO J., 14: 1129- 1135.

218. Watanabe-Fukunaga, R., Brannan, C.I., Copeland, N.G., Jenkins, N.A., Nagata, S. (1992) Lymphoprolipheration disorder in mice explained by defects in Fas antigen that mediated apoptosis. Nature, 356: 314 318.

219. Rathmell, J.C., Goodnow, C.C. (1994) Effects of the Ipr mutation on elimination and inactivation of self-reactive B cells. J. Immunol., 153: 2831 2842.

220. Chervonsky, A.V., Wang, Yi., Wong, F.S., Visintin, I., Flavell, R.A., Janeway, C.A., Matis, L.A. (1997) The role of Fas in autoimmune diabets. Cell, 89: 17-24.

221. Rouvier, E., Luciani, M.F., Golstein, P. (1993) Fas involvement in Ca(2+)-independent T cell-mediated cytotoxicity. J. Exp. Med., 177: 195 -200.

222. Alderson, M.R., Tough, T.W., Davis-Smith, T., Braddy, S., Falk, B., Schooley, K.A., Goodwin, R.G., Smith, C.A., Ramsdell, F., Lynch, D.H. (1995) Fas ligand mediates activation-induced cell death in human T lymphocytes. J. Exp. Med., 181: 71 -77.

223. Chinnaiyan, A.M., O'Rourke, K., Yu, G.L., Lyons, R.H., Gard, M., Duan, D.R., Xing, L., Gentz, R., Ni, J., Dixit, V.M. (1996) Signal transduction by DR3, a death domain-containing receptor related to TNFR-1 and CD95. Science, 274: 990 992.

224. Blaese M, Blankenstein T, Brenner M, Cohen-Haguenauer O, Gansbacher B, Sorrentino B,Velu T. 1995 European School of Oncology position paper. Gene therapy for the medical oncologist. Eur J Cancer. 31A(9): 1531-7. Review.

225. Wadman M. US gene-therapy proposals come under fire. Nature. 1998 Sep 24;395(6700):309.

226. Robbins PD, Ghivizzani SC. Viral vectors for gene therapy.Pharmacol Ther. 1998 Oct;80(1):35-47. Review.

227. Beck SE, Jones LA, Chesnut K, Walsh SM, Reynolds TC, Carter BJ, Askin FB, Flotte TR, Guggino WB. Repeated delivery of adeno-associated virus vectors to the rabbit airway. J Virol. 1999 73(11):9446-55.

228. Robinson HL. DNA vaccines: basic mechanism and immune respons Int J Mol Med. 1999: 4(5):549-55. Review.

229. Sanda MG, Smith DC, Charles LG, Hwang C, Pienta KJ, Schlom J, Milenic D, Panicali D, Montie J Recombinant vaccinia-PSA (PROSTVAC) can induce a prostate-specific immune response in androgen-modulated human prostate cancer.Urology. 1999: 53(2):260-6.

230. Weir N., 1999, Non viral vectors for gene therapy. In Biotechnology, V5, 2nd edn pp 427-442, Wiley-VCH

231. Wolff JA Trubetskoy VS 1998, The Cambrinian era of non viral gene delivery. Nat. Biotech. 16, 421-422

232. Updated list of clinical protocols (1999) Hum. Gene Ther. 10, 10431092

233. Boussif O, Zanta MA, Behr JP. Optimized galenics improve in vitro gene transfer with cationic molecules up to 1000-fold. Gene Ther. 1996 Dec;3(12): 1074-80.

234. Swisher SG, Roth JA, Nemunaitis J, Lawrence DD, Kemp BL, Carrasco CH, Connors DG, El-Naggar AK, Fossella F, Glisson BS, Hong WK, Khuri

235. Kirn D, Hermiston T, McCormick F.ONYX-O15: clinical data are encouraging. Nat Med. 1998 Dec;4(12):1341-2.

236. Colombo, M.P., Ferrari, G., Stoppacciaro, A., Parenza, M., Rodolfo, M., Mavilio, F., Parmiani, G. (1991) Granulocyte colony-stimulating factor gene transfer supresses tumorigenicity of a murine adenocarcinoma in vivo. J. Exp. Med., 173: 889 897.

237. Teng, M.N., Park, B.N., Koeppen, K.W., Tracey, K.J., Fendly, B.M., Schreiber, H. (1991) Long-term inhibition of tumor growth by tumornecrosis factor in the absence of cachexia or T-cell immunity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 3535 3539.

238. Golumbek PT, Lazenby AJ, Levitsky HI, Jaffee LM, Karasuyama H, Baker M, Pardoll DM. Treatment of established renal cancer by tumor cells engineered to secrete interleukin-4. Science. 1991;254(5032):713-6.

239. Tepper, R.I., Pattengale, P.K., Leder, P. (1989) Murine interleukin-4 displays potent anti-tumor activity in vivo. Cell, 57: 503 512.

240. Zoller, M„ Douvdevani, A., Segal, S., Apte, R.N. (1992) lnterlukin-1 production by transformed fibroblasts. II. Influence on antigen presentation and T-cell-mediated anti-tumor response. Int. J. Cancer, 50: 450 457.

241. Douvdevani, A., Huleihel, M., Zoller, M., Segal, S., Apte, R.N. (1992) Reduced tumorogenicity of fibrosarcomas which constitutively generate IL-1 alpha either spontaneusly of following IL-1 alpha gene transfer. Int. J. Cancer, 51: 822 830.

242. Bubenik J, Simova J, Jandlova T. Immunotherapy of cancer using local administration of lymphoid cells transformed by IL-2 cDNA and constitutively producing IL-2.Immunol Lett. 1990;23(4):287-92.

243. Lynch, D. and Miller, R. (1994) Interleukin 7 promotes long-term in vitro growth of antitumor cytotoxic T lymphocytes with immunotherapeutic efficay in vivo. J. Exp. Med., 179: 31 42.

244. Liu Z.G., Hsu H., Goeddel D.V., Karin M., "Dissection of TNF receptor 1 effector function: JNK activation is not linked to apoptosis while NF-kappaB activation prevents cell death", Cell, 1996, n. 87, 565-576.

245. Gansbacher B, Bannerji R, Daniels B, Zier K, Cronin K, Gilboa E.Retroviral vector-mediated gamma-interferon gene transfer into tumor cells generates potent and long lasting antitumor immunity.Cancer Res. 1990 50(24):7820-5.

246. Lee, C.T., Wu, S., Ciernik, I.F., Chen, H., Nadaf-Rahrov, S., Gabrilovich, D., Carbone, DP. (1997) Genetic immunotherapy of established tumors with adenovirus-murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Hum. Gene Ther., 8: 187 193.

247. Seino, K-l., Kayagaki, N., Okumura, K., Yagita, H. (1997) Antitumor effect of locally produced CD95 ligand. Nature Medicine, 3: 165 170.

248. Qin, Z. and Blankenstein, T. (1995) Tumor growth inhibition mediated by lymphotoxin: evidence of B lymphocyte involvement in the antitumor response. Cancer Res., 55: 4747 -4751.

249. Colombo, M.P. and Forni, G. (1994) Cytokine gene transfer in tumor inhibition and tumor therapy: were are we now? Immunol. Today, 15: 48 -51.

250. Forni, G., Parmiani, G., Guarini, A., Foa, R. (1994) Gene transfer in tumor therapy. Ann. Oncol., 5: 789 794.

251. Balkwill, F.R. (1989) Cytokines in cancer therapy. Oxford University Press, Oxford.327. 23: Spriggs DR, Deutsch S, Kufe DW. Genomic structure, induction, and production of TNF-alpha. Immunol Ser. 1992;56:3-34.

252. Blankenstein, T., Qin, Z., Ueberla, K., Mueller, W., Rosen, H., Volk, H.D., Diamantstein, T. (1991a) Tumor supression after tumor cell-targeted tumor necrosis factor a gene transfer. J. Exp. Med., 173: 1047 1052.

253. Sarin, A., Conan-Cibotti, M. and Henkart, P.A. (1995) Cytotoxic effect of TNF and lymphotoxin on T lymphoblasts. J. Immunol., 155: 3716 3718.

254. Porras, A., Alvarez, A.M., Valladares, A., Benito, M. (1997) TNF-alpha induces apoptosis in rat fetal brown adipocytes in primary culture. FEBS Lett, 416: 324-328.

255. Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular cloning. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Ann Arbor, Ml.

256. Catty, D. and Raykundalia, C. (1988a) Production and quality control of polyclonal antibodies. In: Antibodies: A practical approach. Vol. 1, Catty, D., ed., IRL Press: Oxford, England. 19-80.

257. Manford, К. and Patterson, Jr. (1979) Measurement of growth and viability of cells in culture. In: Cell Culture, Jakoby, W.B., Pastan, I.H. eds., Academic press, San Diego, CA., 141 -152.

258. Titus D. E., "Promega Protocols and Applications Guide", second edition, March, 1991.

259. Amersham International pic: Membrane transfer and detection methods, Amersham UK, 1991.

260. Epishin SM., Kiselev SL., Vinetski Yu.P. A colony hybridization study of mRNA in Maturating Soybean Seeds, Plant Cell Reports 1, 1982, pp12-15

261. Коробко ИВ., Кабишев AA., Киселев СЛ., Идентификация новой протеин киназы, транскрибируемый в мышиных опухолях с высоким метастатическим потенциалом, Докл Акад. Наук, 1997, 354, 554-556

262. Liang Р, Averboukh L, Pardee АВ. Distribution and cloning of eukaryotic mRNAs by means of differential display: refinements and optimization. Nucleic Acids Res. 1993 21(14):3269-75.

263. Senin, V.M., Ivanov, A.M., Afanasyeva, A.V., Buntsevich A.M. (1984). New organotrophic metastatic mouse tumors and their use for laser induced dissimination prossess. Vestnik USSR Acad. Med. Sci. 5, 85-91.

264. Кустикова ОС., Киселев СЛ., Бородулина OP., Сенин ВМ., Афанасьева АВ., Кабишев АА. Клонирование гена tag7,экспрессирующегося в метастазирующих опухолях мыши, Генетика, 1996, 32, 621-628

265. Миркина ИИ., Киселев СЛ., Сащенко Л П., Садчикова ЕР., Гнучев НВ. Клонирование человеческого гомолога гена tag7 и изучение его геномной организации Докл. Акад. Наук, 1999, 367:548-52

266. Kiselev S. L, Kustikova О. S., Korobko E.V., Prokhortchouk Е.В., Kabishev A. A., Lukanidin E.M., and Georgiev G.P., "Molecular Cloning and Characterization of the mouse tag7 gene encoding a novel cytokine", JBC, 1998, v.273, n.29, 18633-18639.

267. Kang D., Liu G., Lundstrom E. C., and Steiner H., "A peptidoglycan recognition protein in innate immunity conserved from insects to humans", Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 1998, August, v.95, 10078-10082.

268. Ochiai M., Ashida M., "A pattern recognition protein for peptidoglican. Cloning the cDNA and the gene of the silkworm, Bombyx mori", J. Biol. Chem., 1999, April 23, 274 (17), 11854-11858.

269. Lawton P., Nelson J., Tizard R., and Browning J.L., " Characterization of the mouse lymphotoxin-p gene", J. Immunol., 1995, 154, 239-246.

270. Прохорчук ЕВ., Бородулина OP., Киселев СЛ., Геномная организация и хромосомная локализация нового лиганда из семейства ФНО, Докл. Акад. Наук., 1998, 360: 699-701

271. Коробко ЕВ., Прохорчук ЕБ., Коробко ИВ., Георгиев ГП., Киселев СЛ., Секреция цитотоксического белка Тад7 клетками в ответ на ЛПС, Докл. Акад. Наук 1998, 360:838-40

272. Liu С, Gelius Е, Liu G, Steiner Н, Dziarski R. Mammalian peptidoglycan recognition protein binds peptidoglycan with high affinity, is expressedinneutrophils, and inhibits bacterial growth. J Biol Chem. 2000;275(32):24490-9.

273. Миркина ИИ., Киселев СЛ., Духанини ЕА., Лукьянова ТИ., Шаталов Ю., Сащенко ЛП, Гнучев НВ., Тад7 иммунореактивные цитотоксичесие белки, продуцируемые ЛАК клетками человека. Докл. Акад. Наук, 1999, 366:830-2.

274. Кибардин АВ., Миркина ИИ., Корнеева ЕА., Гнучев НВ., Георгиев ГП., Киселев СЛ. Молекулярное клонирование нового гена мыши tagL, содержащего лизоцим-подобный домен. Докл. Акад. Наук 2000, 372:103-5

275. Миркина ИИ, Кибардин АВ., Корнеева ЕА., Гнучев НВ., Георгиев ГП., Киселев СЛ., Клонирование и изучение новых генов млекопитающих, имеющих область структурной гомологии с фаговым лизоцимом. Генетика, 2000, 36:1492-1501

276. LaFace DM, Vestberg М, Yang Y, Srivastava R, DiSanto J, Flomenberg N, Brown S, Sherman LA, Peterson PA. Human CD8 transgene regulation of HLA recognition by murine T cells. Exp Med. 1995; 182(5): 1315-25.

277. Mcintosh, J.K., Mule, J.A., Krosnick, J.A., Rosenberg, S.A. (1989) Combination cytokine therapy with tumor necrosis factor alpha, interleukin 2, and alpha interferon and its synergistic antitumor effect in mice. Cancer Res., 49: 1408 -1414.

278. Naume, B., Gately, M. and Espevik, T. (1992) A comparative study of IL-12 (cytotoxic lymphocyte maturation factor)-, IL-2-, and IL-7-induced effects on immunomagnetically purified CD56+ NK cells. J. Immunol., 148: 2429 -2436.

279. Duncan R, Connors TA, Meada H. Drug targeting in cancer therapy: the magic bullet, what next? J Drug Target. 1996;3(5):317-9.

Информация о работе

Киселев, Сергей Львович
доктора биологических наук
Москва, 2000
ВАК 03.00.26

Диссертация

Новое семейство генов иммунной системы млекопитающих, имеющих лизоцим-подобный домен, и их потенциальная применимость для генной терапии рака - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы