Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование, экспрессия и поиск белков-партнеров нового селен-содержащего белка млекопитающих

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Клонирование, экспрессия и поиск белков-партнеров нового селен-содержащего белка млекопитающих"

005009705

На правах рукописи

ВАРЛАМОВА ЕЛЕНА ГЕННАДЬЕВНА

КЛОНИРОВАНИЕ, ЭКСПРЕССИЯ И ПОИСК БЕЛКОВ-ПАРТНЕРОВ НОВОГО СЕЛЕН-СОДЕРЖАЩЕГО БЕЛКА МЛЕКОПИТАЮЩИХ

(ЯЕЬУ)

03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 6 ЯН8 2С12

Пущино-2012

005009705

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биофизики клетки РАН

Научные руководители: доктор биологических наук

Новосёлов Сергей Владимирович

доктор биологических наук, профессор Новосёлов Владимир Иванович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Озолинь Ольга Николаевна

кандидат биологических наук Безлепкин Владимир Георгиевич

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт

биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится «/6» СрС&рХХЛЛ 2012 года в 1]4 часов на заседании совета Д002.038.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Учреждении Российской академии наук Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290, г. Пущино московской области, ИБК РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке ПНЦ РАН

Автореферат разослан « 13ъ 01 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук й ■ Т.И. Смолихина

' /

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Селен- содержащий белок млекопитающих (8с1У) относится к новому семейству редокс (Яёх) белков, функции которых до конца остаются неизученными. Однако, наличие консервативного СХХС/СХХи мотива (где С-цистеин, Х- любая аминокислота, 11-селеноцистеин) в каталитических центрах данных белков и тиоредоксин- подобной укладки свидетельствуют об их участии в окислительно-восстановительных реакциях.

На данный момент известно, что 8е1У млекопитающих (34.6 кЭа) является гомологом известного селен- содержащего белка БеНУ и несет дополнительный Ы- концевой пролин- богатый домен, кроме того, показано, что мРНК 8е1У экспрессируется исключительно в семенниках (сперматоцитах). Одним из основных эффектов селена считается его влияние на мужскую фертильность, что особенно хорошо показано на моделях животных с нарушенным синтезом и/или метаболизмом селен- содержащих белков. Эти данные дают основание предположить, что 8е1У может играть важную роль в сперматогенезе, поэтому выяснение механизмов функционирования данного белка является крайне актуальной проблемой.

Данная работа посвящена исследованиям внутриклеточной локализации, поиску белков- партнеров 8с1У, а также выявлению экспрессии его мРНК в процессе сперматогенеза и онтогенеза млекопитающих. Полученные в ходе нашей работы результаты способствуют установлению роли 8е1У в белковых комплексах или в метаболических путях, что очень важно для накопления фундаментальных знаний.

Цель исследования

Клонирование, экспрессия и поиск белков-партнеров нового селен-содержащего белка млекопитающих (8с1У).

Задачи исследования

1. Клонирование полученных путем сайт- направленного мутагенеза вариантов рекомбинантного SelV мыши {Mus musculus) в составе векторов, предназначенных для экспрессии в прокариотической и эукариотической системах.

2. Определение локализации полноразмерного SelV, а также его N- и С-концевых доменов в клетках млекопитающих линии COS-7.

3. Поиск белков-партнеров SelV методом аффинной хроматографии в тандеме с масс-спектрометрическим анализом.

4. Исследование специфичности белок- белковых взаимодействий SelV и его партнеров методами ко- иммунопреципитации и ко- локализации в клетках млекопитающих линии COS-7.

5. Выявление экспрессии мРНК SelV, полученной на различных стадиях сперматогенеза и онтогенеза крысы (Rattus norvégiens), с помощью ПЦР.

Научная новизна работы

Впервые определена локализация SelV в клетках млекопитающих линии COS-7, методом аффинной хроматографии в тандеме с масс-спектрометрическим анализом идентифицированы возможные белки-партнеры SelV, взаимодействующие с ним путем образования межмолекулярных селенид-сульфидных связей: О- связанная N-ацетилглюкозаминтрансфераза (OGT), а также Asb-9 и Asb-17, относящиеся к семейству ASB (семейство белков, содержащих анкириновые повторы и SOCS-домен-супрессор сигнализации цитокинов). Проверена специфичность данных белок- белковых взаимодействий методам ко- иммунопреципитации потенциальных партнеров на аффинном матриксе, а также путем определения паттерна их совместной локализации в клетках млекопитающих линии COS-7. Установлено наличие экспрессии мРНК SelV на ключевых стадиях онтогенеза и сперматогенеза крысы.

2

Апробация результатов работы

Материалы диссертации были представлены на Международной конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2008), на XII Международной Пущинской конференции молодых ученых «Биология наука XXI века» (Пущино. 2008), на XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2009), на XV Международной Пущинской конференции молодых ученых «Биология наука XXI века» (Пущино, 2011) и на научной конференции по биоорганической химии и биотехнологии «X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова» (Москва-Пущино, 2011).

Публикация научных исследований

По материалам диссертации опубликовано 3 печатных работы в реферируемых журналах.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 112 страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работу иллюстрируют 20 рисунков и 5 таблиц. Библиография включает 215 наименований.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Биоииформационный анализ первичной последовательности SelV

Для анализа первичной структуры SelV из базы данных GenBank' были получены аминокислотные последовательности исследуемого белка всех представленных в ней организмов (Homo sapiens, Pan troglodytes, Pongo abelii, Bos Taurus, Sus scrofa, Rattus norvegicus, Mus musculus), которые были выровнены и сравнены между собой с помощью программы ClustalW2.0. По итогам данного

з

анализа был получен вполне ожидаемый результат: наибольший процент идентичности наблюдался между последовательностями SelV Homo sapiens и Pan troglodytes (99%), Pan troglodytes и Pongo abelii (96%), Homo sapiens и Pongo abelii (95%), Rattus norvégien и Mus musculus (84%), Bos Taurus и Sus scrofa (62%). Кроме того, с помощью программы BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) была обнаружена гомология С-концевого домена во всех семи последовательностях SelV вышеперечисленных организмов с другим селен-содержащим белком SelW. В пределах данного домена располагается каталитический центр, представленный четырьмя аминокислотными остатками (GLUS, где U- селеноцистеин), наличие которого, наряду с тиоредоксин-подобной укладкой и консервативной TGEFEV последовательностью, позволило отнести данный белок к новому Rdx семейству. На рисунке 1 представлены результаты, полученные с помощью программы ClustalW2.0. Рамками обозначено расположение селеноцистеина и консервативной последовательности, характерной для Rdx семейства белков.

Поскольку в настоящей диссертации мы исследовали мышиный (Mus musculus) рекомбинантный SelV, то необходимо было более детально проанализировать его первичную последовательность. Так, с помощью программы ClustalW2.0. было проведено выравнивание и анализ гомологии последовательностей SelV и SelW Mus musculus, на основании которых можно заключить, что процент идентичночти обоих белков составляет 55%. Селеноцистеиновый остаток располагается в 255 положении мышиного SelV (рисунок 2), N-концевой домен характеризуется довольно большим содержанием пролинового аминокислотного остатка, по сравнению с другими аминокислотными остатками в первичной последовательности данного домена (20%).

Homo

Pan

Pongo

Boa

Su»

Rattus Mus

Homo

Pan

Pongo

Bos

Sus

Rattus Mus

Homo

Pan

Pongo

воз

Sus

Rattus Mus

Homo Pan Pongo Bos

Sus

Rattus Mus

Homo

pan

Pongo

Bos

Sus

Rattus Mus

Homo

Pan

Pongo

Sos

Sus

Rattus Mus

Homo

Pan

pongo

Bos

Sus

Rattus Mus

MNNQARTPAPSSARTSTSVR----------ASTPTRTP--------TPLRTPTPVRTRTP <12

MNNQARTPAPSSARTSTSVR----------A3TPTRTP--------TPLRTPTPVRTRTP 4 2

MNNÜARTPAPSSARTSTSVR----------ASTPTRTP--------TPLRTPTPVRTRTP 42

MNNQPRTPAPTPARASTPVRGSTLHRTSIQVRTPTPGPDSGPTRITTLLRTPAI.XRTLTP 60

MNNPARAPAPSPVRPSA3I.R----PLASVRASTPARG--------STLARTSLLVR----4 4

MNNKARNPAPSSVRAHTPSR------------------------------TPTPVR----26

MNNKARVPAPSSVRANTPAR----------------------------------------2 6

* ■ ■ *

IR______TLTPVLTPSPAGTSPX.VLTPAPAQXPTLVPTPALARIPRLVPPPAPAWIPT¡> 96

IR______TLTPVLTPSPAGTPPLVLTPAPAQXPTLVPTPALARIPRLVPPPAPAWXPTP 96

IR------TLTPVLTPSPAGTPPLVtiTPAPAQIPTLVPTPALARTPRLVPPPAPAWIPTP 96

XRTPTPVRTPTPVPPSTPVRSPXPVRTPTPVPPSTPVRTPTPVPLSTPVRPPTPVRPPTP 12 0

________TPHLVPASGPG----PIRTPTPVRTPTPVRTPTPVRTLTPVRTPTPVRTPTP 92

________TATPVRASTPAHNRSPVP.TSXRVRTPA---NPVPXRFPTPAPAPAP--TPTP 73

--------TATPVRAPNPAHNSTPVRTSXRVRAPAQVPNPVPXRFPTPAPVPAP—TLTP 7 6

VPTPVPVRNPTPVPTPARTLTP— PVRVPAPAPA----QLLAGIRAALPVLDSYLAPALP 150

VPTPVPVRNPTPVPTPARTLTP— PVRVPAPAPA----QLLAGIRAALPVLDSYLAPALP .150

VPTPVPVRNPTPVPTPARTLTT— PVRVPAPAPAPPPAQVLAGIRAALPXLDSYI.APA1,P 154

VRPPTPVRPPTPIGTPTLIRSPT-PVQXPIPEPXP----TPI PSRVLXPPl.F.S FPDSALP 17 5

VRTPTPVRTPTPVRTPTPVQVPT-PVRVPTTVGXP----TPTLSQVLVPALESLPNPALP 147

APTPAPVPAAAPVRTPAPVRASIQGRSFPTXSPVR---FLRNLALPAAOPLSSCGAGSLS 130

APTPAPVRHAAPVRTPAPVRAPNLGRVFPKXSPGR---FFPSLASPTAQPLSSRAASALI, 133

.*.**.¡*í**: • ■ * 1 *

L-DPPPEPAPELPLLPEE— DP------EPAPSLKLX PSVSSEAG-PAPGPLFTRTPLAA 200

L-DPPPEPAPELPLLPEE— DP------EPAPSLKbl PSVSSEAG-PAPGPJ.PTRTPLAA 200

L-HPPPEPAPELPLSPEE—DP------EPAPSLKLXPSVSSEAG-PAPGPI.PARTPQAA 204

S-GPPX,ELEPTLTVSPAKNLEPSPAKHLEPSPRVKQVSSAANGFP-PXQEPLPALTPLAT 2 33

SLDPPLEPDPELTLSPDE—DP------APTPRAKHLPLVANGFV-PVQEPLPALSPLAT 1S)S

K-DbTLAOKQKPSIHSLA—EA------IQGPFPVLTPSASSETHGSIPDPAPPTDSLAS 181

K—DPTLAQNQKPSXHSLA — EA------IQGPLPVLTPS-SSKTQGSIPDTASPIDSLAS 183

" . ; . ... - . * :

NSPGPTI.DFTFKADPSAIGLADPPIPSPVPSPH.GTIPSAISX.QKCTETFPSSSENFAI,D 260 NSPGPTLDFTFRADPSATGLADPPIPSPVPSPILGTXPSAISLONSTETFPSSSENFALD 2 60 NSPGPTLDFTFRADLSATGLADPPIPSPVPSPXLGTTSSAISLONSTENFASSSENFALD 264 DLRSPSLGSPLRTDTSTTNLIASSSGHVPGTPXIjG—AIQAXLPVPATAIASISGNLKEE 291 NLLESTPG--AGTDSSTTKLTD3TSGHVPGTPXI,ATIPI,AVALPVSTNA1.ASTSENI0VD 256 TAMASSTLDPXPGPKPTLEFLASPI-KETPDLGKLSTXSPAONFV-STKEVPSTSEDVPTA 24 0 TAMASSTLGPIPGPNPTLEFLASPLKETPGLGKLSTXSPAPSFG—STKEXPSTSEOVPTP 242

KRVLXRVTYCGX KRVLIRVTYCGI KRVLIRVTYCGI NKXMXRWYCGI HKXLXRVVYCGX NRILXRVMYCGX NRXLIRVKYCGI

YSLRYILLKKSX.EOQFPNHLLFE£t>RAAQÍ ' eYSLRYILLKKSLEQQFPNHLLFMDRAAQ) SYSLRYl'LLKKSI.EQQFPNHLLFEEDRAAQJ ' SYSLRYILLRKSLEQOFPNSLIFEEEXSAQ;' SYGLRYXLLKKSLEQQFPNCLVrEBDXSAQ; 5YGLRYILX,KKTLEHQFPNLLEFEEISRATQ\ SYQLRYIXX.KRTLEHC|FPNLLEFEEERATQ\

KRGDGFVWESRLQKIVSVIDEEIKKR----346

KRGDGFVNE3RLQKXVSV1DEEXKKR----346

KRGDGFVNESTLQKIVSVXDEEXKKR----350

KNGDGFVDEVKLOTIVNLLNEEFKKKVAGN 381

KKGDGFVDETKLQKÍVSHXHEEXKKR----342

KKGDGFVDETSLKKLVGAIDEEXKKR----32«

KKGDGFVDESGLKKLVGAXDEEXKKR----328

Рис. 1. Множественное выравнивание первичных последовательностей SelV различных организмов

CLUSTAL 2.1 multiple sequence al

b®raKARVPAP5SVRAHTPART-PAPIRTATPVRAPNPAHNSTPVRTSIRVBAPAQVl?Nf>VP 60

Selv_Mus Selw Mus

SalV^Mus Salw~Mus

selv_Mu3 Selw Mus

SelV_Mu9 selw Mua

selv_Mus Selw Mus

SelV_Mus Selw Mua

IRFPTPAPVPAPTLTPAPTPAPVRHAAPVRTPAPVRAPNI.GRVFPKI5PGRFFPSI.ASPT 120

ÎjASTAMASSTLGPTPGPNPTLEFLASPLKETPGLGKLSTISFAPSFGSTKEIPSTSEDVP 240 255

TPNRILIRVMYCGlIÛbïGLRÏIILKRTLEHQFPNLLEFEEERATQVTGEFEVFVDGKLIH 300 --MAlAVRVVYCGïjupYKPKÏLQLKEKLEKEFPGCLDICGEGTPOVTGFFEVTVAOKLVH 58 : *.* **..***:**. *:: * :.**** *** * +**.*

SKKKGDGFVD-ESGLKKLVGAIDEEIKKR- 328 SKKRGDGYVDTESKFRKLVTAXKAALAQCQ 88

Рис. 2. Выравнивание первичных последовательностей SelV и SelW Mus musculus

Кроме того, с помощью компьютерных программ PSORTII, SignalP, позволяющих предсказывать внутриклеточную локализацию белков по их первичной структуре, а также выявлять наличие и расположение сигнальных последовательностей, обнаружили, что данный белок не является секреторным и с вероятностью 65.2% локализуется в митохондриях. Программа PSORTII использует k-NN алгоритм (k-Nearest Neighbor) для поиска сайтов в первичной последовательности белков, обусловливающих их расположение внутри клетки. Однако данный поиск является не совсем эффективным в случае, когда анализируемый белок не имеет выраженной сигнальной последовательности, что характерно и для SelV. Поэтому результаты предсказания его внутриклеточной локализации, полученные с помощью данной программы, не являются однозначными (с вероятностью 65% данный белок является митохондриальным, 17.4 % -цитоплазматическим, 13% -ядерным и 4.3%- белком цитоскелета клетки) и требуют экспериментальной проверки.

Определение внутрнклеточной локализации SelV и его N- и С-концевых доменов

Для выполнения данной серии экспериментов последовательности открытых рамок считывания полноразмерного SelV и его N- и С-концевых доменов клонировали в составе вектора pEGFP-N2 («Clontech»), предварительно путем сайт-направленного мутагенеза заменив селеноцистеиновый аминокислотный остаток в активном центре данного белка на цистеиновый. Данная замена обусловлена особенностями встраивания селеноцистеина при синтезе селенопротеинов напротив TGA кодона у эукариот.

Описанные химерные конструкции были приготовлены с целью выяснить какой из доменов SelV отвечает за внутриклеточную локализацию, поскольку сигнальная последовательность у разных белков может располагаться как на N-так и на С- концах. Как было отмечено ранее, in silico анализ аминокислотной последовательности SelV выявил гомологию его С- концевого домена с известным селенопротеином W (SelW), который является цитоплазматическим белком, поэтому определить внутриклеточное расположение данного домена SelV представляло особенный интерес.

Полученными конструкциями трансфецировали клетки млекопитающих линии COS-7. Визуализация результатов с помощью конфокальной микроскопии не выявила существенных отличий во внутриклеточной локализации полноразмерного SelV и его доменов (рис. 3. Б).

Наблюдается равномерное распределение белков в цитоплазме клеток и, некоторое их накопление, по сравнению с контролем, в структурах ядра.

т

MPHKSelV 5{

984 п.н.

_\_

"Sic"

пролин-богатый домен

Ч-I-1-

SelW-гомолотчный домен

SECIS-элемент

У ААААА 3'

SetW-гомолотчный домен

Рис. 3. Внутриклеточная локализация SelV и его N- и С-концевых доменов в клетках млекопитающих линии COS-7.

А. Схематическое изображение конструкций, включающих SelV и его домены в составе вектора pEGFP-N2. 1) GFP-Сконтроль); 2) открытая рамка считывания SelV (Sec->Cys) с GFP; 3)пролин- богатый домен SelV с GFP; 4) С- концевой SelW -гомологичный домен с GFP. Б. 1) локализация GFP в клетках,_ трансфецированных вектором pEGFPN2 (контроль); 2) клетки, трансфецированные вектором pEGFPN2, содержащим последовательность SelV; 3) клетки, трансфецированные вектором pEGFPN2, содержащим последовательность N-концевого домена SelV; 4) клетки, трансфецированные вектором pEGFPN2, содержащим последовательность С-концевого домена SelV. Нижний ряд фотографий: ядра клеток, прокрашенные 0.1% этидиум бромидом; средний ряд: локализация рекомбинантных белков совместно с GFP; верхний ряд: совмещение фотографий нижнего и среднего рядов.

Для того чтобы проверить возможность экспрессии исследуемого белка в митохондриях, были проведены эксперименты по его ко- локализации с красителем, специфично окрашивающим эти клеточные органеллы. Представленные на рисунке 4 результаты данной серии экспериментов свидетельствуют об отсутствии их совместной локализации.

Таким образом, поскольку внутриклеточное распределение И- и С-концевых доменов не отличается от такового для 8е1У, можно заключить, что в первичной последовательности 5е1У отсутствует сигнальные пептиды, обеспечивающие посттрансляционный транспорт данного белка, в частности, в митохондрии, что не согласуется с ш яШсо предсказанием, выполненным при помощи программы РБСЖТП. Таким образом, подобно БеМ, селенопротеин V имеет преимущественно цитоплазматическую локализацию, некоторое его накопление наблюдается в структурах ядра.

Идентификация белков-партнеров Бе1У

В настоящей работе поиск белков-партнеров 8е1У осуществлялся с помощью аффинной хроматографии и последующего масс-спектрометрического анализа.

Прежде чем проводить данную серию экспериментов, возникла необходимость понять механизм взаимодействия Бе1У со своими партнерами. Поскольку данный белок обладает тиоредоксин- подобной укладкой и СХХи мотивом в каталитическом центре (где С-цистеин,и- селеноцистеин), мы выдвинули предположение о возможной схожести механизмов каталитического взаимодействия 8е1У и тиоредоксина с их белками-партнерами. Установлено, что в реакциях, катализируемых тиоредоксином, тиол цистеина с низким рКа атакует внутри- или межмолекулярную дисульфидную связь в белке-мишени, после чего вторая тиоловая группа тиоредоксинового каталитического центра

восстанавливает тиол белка- мишени, при этом окисляясь с образованием дисульфидной связи.

Рис. 4. Определение локализации SelV в митохондриях

А. Внутриклеточная локализация GFP (контроль); 1. ядра, прокрашенные красителем Dapi (ЗООнМ); 2. локализация GFP; 3. митохондрии, прокрашенные MitoTracker Deep Red 633 (200нМ); 4. совмещение каналов 1-3; 5-совмещение каналов 1 и 2 (участок ядра); 6- совмещение каналов 2 и 3 (участок цитоплазмы); Б. Внутриклеточная локализация полноразмерного SelV. Обозначения для 1,3-6 соответствуют таковым в рис.4А. 2) локализация SelV, совмещенного с GFP.

Поскольку все описанные процессы происходят очень быстро, для того чтобы стабилизировать межмолекулярное взаимодействие между тиоредоксином и его партнерами, ранее было предложено заменить цистеин в 35 положении тиоредоксина, например, на серин.

В отличие от тиоредоксина, в мутанте SelV (СХХС) мы не знали, какой из цистеинов каталитического центра атакует внутри- или межмолекулярную дисульфидную связь в белке-мишени, а какой из них восстанавливает цистеин белка-мишени, при этом окисляясь с образованием дисульфидной связи. Поэтому нами с помощью сайт- направленного мутагенеза были приготовлены ещё 2 мутантные формы исследуемого белка: CXXS и SXXC (N- и С-концевые цистеины последовательно замутированы на серины), которые затем были клонированы в составе вектора pGEX4T-l («Amersham») таким образом, чтобы на на N-конце рекомбинантных белков находился GST-tag, а на С-конце- His-tag.

На рисунке 5А схематически изображены химерные конструкции, используемые в данной серии экспериментов, на рисунке 5Б представлены результаты ПААГ- электрофореза образцов, взятых на различных стадиях выделения рекомбинантного SelV (GXXC) из бактериальных клеток и последующей очистки путем аффинного связывания с никелевой агарозой. Подобным образом были получены две другие рекомбинантные формы SelV (CXXS и SXXC), которые затем были инкубированы с гомогенатом тканей семенников мыши, поскольку ранее было показано, что SelV локализуется исключительно в этом органе. Идентификацию возможных белков-партнеров, связавшихся с SelV, проводили с помощью масс-спектрометрического анализа, результаты которого свидетельствуют о том, что таковыми являются О-связанная N-ацетилглюкозаминтрансфераза (OGT) и белки, относящиеся к семейству ASB (семейство белков, содержащих анкириновые повторы и SOCS-домен-супрессор сигнализации цитокинов): Asb-17 и Asb-9.

сххс

k-SelV

63kDa

Рис. 5. Получение, выделение и очистка путем аффинной хроматографии рекомбинантных форм SelV (СХХС, CXXS, SXXC)

А. Схематичное изображение химерных конструкций SelV, имеющих мутации в активном сайте (СХХС, CXXS, SXXC, где С- цистеин, S- серин) и несущих GST-tag на N-конце и His-tag на С-конце; Б. ПААГ- электорофорез белковых фракций, полученных на определенных этапах выделения и очистки рекомбинантной формы SelV (СХХС). 1) белковые маркеры молекулярного веса (кДа); 2) экспрессия рекомбинантного SelV до добавления 1мМ ИПТГ; 3) экспрессия рекомбинантного SelV после индукции 1мМ ИПТГ в течение 1 часа; 4) присутствие рекомбинантного SelV среди белков очищенного клеточного лизата (контроль); 5) отсутствие рекомбинантного SelV среди белков, специфически не связавшихся с Ni-NTA- агарозой (контроль); 6) рекомбинантный SelV после аффинной очистки на Ni-NTA- агарозе.

Ра рисунке 6 представлен ПААГ электрофорез элюатов с соответствующих аффинных матриксов.

кДа 1 2 3 4 5

135

95

72

52 домен оет

42 34 „. : А« «-А5Ь-17

26 ^-АзЬ-Э

Рис.6. ПААГ-электрофорез белков семенников мыши, связавшихся с иммобилизованным на №-ЫТА- агарозе 8е1У

1) белковые маркеры молекулярного веса (кДа); 2-4) белки семенников мыши, связавшиеся с рекомбинантным 8е1У, имеющим следующие мутации: СХХС (2), СХХБ (3), БХХС (4). 5) белки семенников мыши, связавшиеся с глутатион-Э-трансферазой (контроль). Стрелками указаны полосы, соответствующие белкам, идентифицированным методом масс-спектрометрии.

Исследование специфичности взаимодействия 8е1У с его потенциальными

партнерами

Для данной цели в настоящей работе был использован широко распространенный метод ко- иммунопреципитации исследуемых партнеров на аффинном матриксе, протокол проведения данной серии экспериментов схематично изображен на рисунке 7.

Поскольку ОСТ имеет консервативный Ы-концевой тетратрикопептидный домен, посредством которого, как было показано ранее, осуществляются белок-белковые взаимодействия, в экспериментах по ко- иммунопреципитации на аффинном матриксе 8е1У и ОйТ нами был выбран именно этот домен.

ИБ-Ыв БЕЛОК-ПАРТНЕР ешае ЫЧ ШЯав

* *

ЭКСПРЕССИЯ РЕКОМБИНАНТНОЕО БЕЛКА В КЛЕТКАХ ЕсоЯ, А ЫеПа (Иотавеп) ЭКСПРЕССИЯ 5еП/ В КЛЕТКАХ £.со11, а. КтНЫ (Моуэвеп)

*

ПОЛУЧЕНИЕ КЛЕТОЧНОЕ ЛИМА, СОДЕРЖАЩЕГО ПРЕИМУЩЕСТВЕННО РЕКОМШШГТНЫЙ 6ЕЛ0К ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА 5е1У НАГЯУТАТИОН-СЕФАГОЗЕ

ИНКУБИРОВАНИЕ БЕЛКА-ПАРТНЕРА С ИММОБИЛИЗОВАННЫМ НА ГЛУТЙТИОЯ-СЕФАРОЗЕ 5е1У

*

АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ КОИММУННОПРЕЦИЛИТАЦИЙ БЕЛКОВ С ПОМОЩЬЮ ВЕСТЕРН-ЕЛ0ТТИНГА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АНТИТЕЛ ПРОТИВ Н&ОДВ КАЧЕСТВЕ ПЕРВИЧНЫХ

Рис. 7. Протокол экспериментов по ко- иммунопреципитации исследуемых

белков

Результаты данной серии экспериментов, полученные с помощью Вестерн-блоттинга свидетельствуют о том, что данным способом специфичность белок-белковых взаимодействий подтверждена лишь для 8е1У и Ы-концевого домена ОСТ, а также для 8е1У и АбЬ-9 (рисунок 8 А и Б соответственно), тогда как АэЬ-17, согласно рисунку 8 В, отсутствует среди белков, связавшихся с иммобилизованным на колонке 8е1У.

Принимая во внимание тот факт, что 8е1У содержит домен, гомологичный другому селенопротеину 8е1Ш, а также имеет подобное распределение внутри клеток млекопитающих, можно предположить, что данные белки вовлечены в регуляцию одних и тех же механизмов и выполняют схожие функции.

Раннее показано, что 8е^ обладает способностью связываться в нативных условиях с семейством так называемых 14-3-3 белков, которые вовлечены в регуляцию множества процессов: апоптоза, контроля клеточного цикла, транскрипции генов, регуляции метаболизма и т.д.

В 1 2 3 4 5

SelV_> ^

— — Asb-17

Рис. 8. Ко-иммунопреципитация SelV, иммобилизованного на глутатион-сефарозе, с его потенциальными белками- партнерами.

A:l) SelV, аффинно-связавшийся с глутатион- сефарозой (контроль); 2) рекомбинантный OGT домен, имеющий His-tag на С-конце (контроль); 3) отсутствие OGT домена на колонке с глутатион-сефарозой без SelV (контроль); 4) OGT домен среди белков, специфично связавшихся с SelV. Б:1) Asb-9 среди белков, специфично связавшихся с SelV; 2) отсутствие Asb-9 на колонке с глутатион-сефарозой без SelV (контроль); 3) SelV, аффинно-связавшийся с глутатион-сефарозой (контроль); 4) небольшое количество Asb-9 среди белков, не связавшихся с SelV (контроль). B:l) SelV, аффинно-связавшийся с глутатион-сефарозой (контроль); 2) отсутствие Asb-17 среди белков, специфично связавшихся; 3) отсутствие Asb-17 на колонке с глутатион-сефарозой без SelV (контроль); 4) рекомбинантный Asb-17, имеющий His-tag на С-конце (контроль); 5) Asb-17 среди белков, не связавшихся с SelV.

Поскольку SelW не имеет канонических последовательностей для связывания с 14-3-3 белками (R(S/X)XpSXP или RXXXpSXP, где Х-любой аминокислотный остаток, pS-фосфорилированный сериновый остаток), следовательно, он взаимодействует с ним по редокс принципу, без участия электростатических сил. Кроме того, установлена третичная структура данного белка, представленная четырьмя (3- складчатыми структурами, двумя

протяженными а- спиралями и короткой З10 - спиралью, причем CXXU- мотив локализован в экспонированной петле, расположенной между al и ßl-структурами (ßl-al-ß2-ß3-p4-310-a2). Аналогичную третичную структуру имеют все остальные белки, относящиеся к семейству Rdx. Скорее всего, SelV не является исключением и имеет подобную ориентацию элементов вторичной структуры и расположение каталитического центра.

Принимая во внимание результаты ко- иммунопреципитации, а также тот факт, что SelV локализуется исключительно в семенниках млекопитающих, можно предположить возможные метаболитические процессы, происходящие в клетке, в которых, скорее всего, принимают участие исследуемые белки-партнеры. Являясь белком семенников, а именно семенных канальцев, SelV вовлечен в процессы, характерные для этого органа, например, в регуляцию сперматогенеза, в синтез тестостерона и других неактивных соединений андрогенного ряда.

В то же время, будучи физиологическим партнером О-связывающей N-ацетилглюкозамин трансферазы (OGT), SelV может быть вовлечен в процессы, контролируемые данным белком, основным из которых является участие в постгрансляционной модификации белков, таких как с-Мус, c-Fos, c-Jun, р53, Spl, tau, РНК-полимераза II, тубулин, вйнкулин и белки теплового шока. Данная регуляция обусловливается переносом N-ацетил глюкозамина к сериновым и треониновым остаткам белков-мишеней.

Два других белка, идентифицированных в качестве возможных партнеров SelV с помощью масс-спектрометрического анализа и относящиеся к семейству ASB, подобно ему экспрессируются преимущественно в семенниках, поэтому рассмотрение этих белков в качестве физиологических партнеров SelV представлялось наиболее интересным. Однако в рамках данной работы подтверждена специфичность взаимодействия только Asb-9 с SelV.

Asb-9 является представителем семейства белков ASB, содержащих анкириновые повторы и SOCS- домен -супрессор сигнализации цитокинов. Последний состоит из двух субдоменов, последовательности которых консервативны, было показано, что посредством данного домена осуществляется взаимодействие с элонгинами В и С и убиквитин лигазой, что говорит об участии белков данного семейства в убиквитин- опосредованной протеолитической деградации белков. Кроме того, известно, что представители ASB семейства имеют домен, содержащий анкириновые повторы (ANK), посредством которых они взаимодействуют с большим количеством физиологических субстратов. С помощью независимых подходов показано, что Asb-9 является партнером креатинкиназы головного мозга и митохондиральной креатинкиназы, в связи с чем было высказано предположение о том, что Asb-9, действуя подобно специфической ЕЗ убиквитин- лигазе, является эффективным регулятором энергетического статуса клеток.

Результаты ко-иммунопреципитации относительно Asb-17, свидетельствующие об отсутствии его среди белков, связавшихся с иммобилизованным на колонке SelV, сложно интерпретировать на данном этапе работы. Для того чтобы сделать достоверные выводы относительно партнерства двух белков, необходимо проводить дополнительные эксперименты с использованием других независимых подходов.

Определение степени ко- локализации SelV и его белков-партеров

• ■ Определение совместной локализации исследуемых партнеров является ещё одним методом, используемым для подтверждения интересующих белок-белковых взаимодействий. С этой целью на первом этапе данной серии экспериментов открытые рамки считывания исследуемых белков-партнеров SelV .были - клонированы в составе вектора pEGFP-N2 («Clontech»), после чего полученными конструкциями были трансфецированы клетки млекопитающих линии COS-7..

1 2 3 4

1 2 3 4

i

Рис 9. Внутриклеточная локализация возможных партнеров SelV в клетках

млекопитающих линии COS-7 i

А. Локализация N- концевого домена OGT. 1) ядра, прокрашенные красителем Dapi (ЗООнМ); 2) локализация домена OGT, совмещенного с GFP; 3) митохондрии, прокрашенные MitoTracker Deep Red 633 (200нМ); 4) совмещение каналов 1-3; 5)-совмещение каналов 1 и 2 (участок ядра); 6)- совмещение каналов 2 и 3 (участок цитоплазмы); Б. Локализация Asb-9. Обозначения для 1,3-6 соответствуют таковым в рис.9А. 2) локализация Asb-9, совмещенного с GFP. В. Локализация Asb-17. Обозначения для 1,3-6 соответствуют таковым в рис.9А. 2) локализация Asb-17, совмещенного с GFP.

Результаты данной серии экспериментов, визуализированные путем конфокальной микроскопии, свидетельствуют о том, что домен СЮТ и АбЬ-9, локализуются, подобно БЫУ, в цитоплазме и ядре клеток млекопитающих линии СОБ-7 и отсутствует в митохондриях, что является косвенным подтверждением специфичности рассматриваемых белок- белковых взаимодействий (рисунок 9).

Экспрессия мРНК 8е1У в семенниках крысы в процессе сперматогенеза

и онтогенеза

На основании ранее полученных данных были определены возрастные интервалы животного, соответствующие ключевым этапам созревания сперматозоидов (7, 14, 18, 23, 25, 31, 36 дни), а также определенным периодам индивидуального развития крысы: периоду молочного кормления и началу периода полового созревания. Помимо этого, для определения наличия экспрессии 8е1У в процессе онтогенеза образцы тотальной РНК были выделены из семенников крысы в возрасте 2, 4 и 15 месяцев, соответствующих середине и завершению периода полового созревания, а также середине репродуктивного периода животного соответственно. После проведения реакции обратной транскрипции с использованием тотальной РНК, выделенной из семенников на вышеуказанных стадиях, полученную кДНК использовали в качестве матрицы при проведении ПЦР с ген- специфичными праймерами. В качестве контроля, свидетельствующего о том, что в реакциях обратной транскрипции на всех интересующих стадиях сперматогенеза и онтогенеза использовалось одинаковое количество тотальной РНК (3 мкг), параллельно были проведены реакции амплификации с использованием праймеров, специфичных для гена Р-актина крысы. При проведении ПЦР с использованием праймеров, комплементарных к 5'- 3'- концам открытой рамки считывания гена р- актина крысы, насыщение продуктом реакции происходило уже на 26 цикле (рисунок 10 Б). По этой причине количество циклов амплификации контрольного образца для всех ранее

установленных стадий сперматогенеза и онтогенеза крысы составило 23.

19

Представленные на рисунке 10 А и В результаты данной серии экспериментов показали, что 8е1У экспрессируется на поздних этапах сперматогенеза (зрелые сперматозоиды), которым соответствуют 31 и 36 дни постнатального развития крысы, а также на протяжении периода полового созревания (2, 4 месяца) и в середине репродуктивного периода (15 месяцев).

д циклы ПЦР

25 30 35

циклы ПЦР

(-1-1

Б 17 20 26 29 30 33 35

|Р-актин

день

В Г

месяц

7 14 18 23 25 31 36 2 4 15

■ 1ИМНПВ

¡Ш-актин

Рис. 10. Экспрессия мРНК 8е1У в семенниках крысы в процессе сперматогенеза и

онтогенеза.

А: результаты амплификация открытой рамки считывания 8е1У после 25, 30 и 35 циклов ПЦР. В качестве матрицы в ПЦР использовались образцы кДНК, полученные на определенных стадиях постнатального развития крысы. Б: результаты амплификации открытой рамки считывания (3-актина крысы после проведения указанных циклов ПЦР. В: Результаты амплификации открытой рамки считывания 8е1У крысы с матрицы, полученной на определенных стадиях сперматогенеза и онтогенеза, после проведения 35 циклов ПЦР.

Аналогичные результаты были получены ранее относительно экспрессии мРНК АзЬ-9 белка с помощью Нозерн блот гибридизации. Было показано, что в значительной степени мРНК данного белка экспрессируется в пубертатный период, соответствующий 4-6 недельному возрасту мыши, а также на протяжении репродуктивного периода животного. Однако мРНК АбЬ-9 не обнаружена в

эмбриональных стволовых клетках и в незначительной степени её экспрессия наблюдается в семенниках мыши в возрасте 2 недель.

Таким образом, мРНК обоих белков присутствуют в семенниках на одних и тех же этапах сперматогенеза и онтогенеза грызунов, что, скорее всего, свидетельствует об одновременном синтезе и функционировании белков SelV и Asb-9, а также об их совместном участии в процессах, происходящих в данном органе.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данная работа направлена на выяснение функциональной значимости нового селен- содержащего белка млекопитающих (SelV) путем идентификации его физиологических партнеров и подтверждения специфичности таких белок-белковых взаимодействий с помощью независимых подходов, а также определение его внутриклеточной локализации и экспрессии мРНК SelV в процессе сперматогенеза и онтогенеза млекопитающих.

Являясь партнером OGT, SelV, скорее всего, подвергается процессу О-гликозилирования, осуществляемого данным ферментом и сопровождающегося переносом N-ацетил глюкозамина к сериновым и треониновым остаткам SelV. Данный вид посттрансляционной модификации белков, оказывающий существенное влияние на их стабильность (обычно усиливаемую гликозилированием), заряженность и нормальное функционирование в организме, характерен для таких ключевых ферментов, как РНК- полимераза II, транскрипционные факторы, различные киназы и фосфотазы, а также для белков цитоскелета, белков теплового шока и др.

Другой предполагаемый партнер SelV -Asb-9 относится к семейству ASB белков, характеризующихся наличием анкириновых повторов и С-концевого SOCS-домена (SOCS- супрессор сигнализации цитокинов). Известно, что белки,

обладающие таким доменом помимо участия в регуляции сигнализации цитокинов, осуществляемой посредством ингибирования Янус киназы (JAK), также вовлечены в убиквитин-опосредованную протеасомную деградацию белков. Так, было показано, что Asb-9, действуя подобно специфической ЕЗ убиквитин-лигазе, участвует в деградации митохондриальной креатинкиназы (uMtCK) и креатинкиназы мозга (СКВ) и, тем самым, является эффективным регулятором энергетического статуса клеток. Кроме того известно, что данная функция Asb-9 аналогична таковой, характерной для другого SOCS- домен содержащего белка- WSB-1 (белки, имеющие WD повторы и SOCS- домен), который осуществляет убиквитин-опосредованную деградацию одного из 25 известных селен-содержащих белков млекопитающих- дейодиназы второго типа (DI2). Таким образом, SelV может служить мишенью для Asb-9 белка, который способствует его убиквитинилированию путем взаимодействия с элонгин В/С комплексом посредством С-концевого SOCS- домена, и тем самым, осуществляет его протеолиз. Однако данные об экспрессии мРНК SelV и Asb-9, свидетельствующие об одновременном синтезе и функционировании этих белков в семенниках млекопитающих, заставляют задуматься о их совместном участии в процессах, происходящих в данном органе, например, в созревании и дифференцировке сперматид, конденсации хроматина сперматозоидов, в антиоксидантную защиту стероидных гормонов в клетках Лейдига и др.

Таким образом, результаты, полученные в рамках настоящей работы, с одной стороны, представляют собой ценную информацию, необходимую для выяснения функциональной роли SelV в организме млекопитающих, а с другой-служат важным дополнением к уже существующим данным о идентифицированных нами физиологических партнерах исследуемого белка: OGT (О-связывающая N ацетилглюкозаминтрансфераза) и Asb-9.

выводы

1. SelV, так же как и его N- и С-концевые домены, характеризуется ядерно-цитоплазматическим распределением в клетках млекопитающих линии COS-7 и отсутствием локализации в митохондриях.

2. Методом« аффинной хроматографии в тандеме с масс-спектрометрическим анализом идентифицированы возможные белки-партнёры SelV: OGT (0-связывающая N ацетилглюкозаминтрансфераза), Asb-9 и Asb-17, относящиеся к семейству ASB (семейство белков, содержащих анкириновые повторы и SOCS-домен-супрессор сигнализации цитокинов).

3. Методом ко- иммунопреципитации SelV с его потенциальными партнерами специфичность белок- белковых взаимодействий подтверждена для SelV и OGT (которое осуществляется посредством N-концевого домена OGT), а также SelV и Asb-9.

4. SelV, N- концевой домен OGT и Asb-9 имеют одинаковый паттерн внутриклеточной локализации, что является косвенным доказательством специфичности их взаимодействий.

5. В семенниках крысы мРНК SelV экспрессируется на поздних стадиях сперматогенеза, а также на протяжении периода полового созревания и репродуктивного периода.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Варламова Е.Г. Внутриклеточная локализация селеновых белков млекопитающих: SelV (Selenoprotein V) и Gpx6 (Glutathion peroxidase 6). // Фундаментальные исследования, 2011, №9 (2), с. 318-321.

2. Варламова Е.Г.. Новосёлов C.B., Новосёлов В.И., Фесенко Е.Е. Новый селен-содержащий белок млекопитающих V: поиск белков-партнеров. // Доклады Академии Наук, 2011, том 441, №3, с. 399-401.

3. Варламова Е.Г.. Новосёлов В.И. Поиск партнеров нового селенового белка млекопитающих (SelV) и экспрессия его мРНК в процессе онтогенеза и сперматогенеза // Молекулярная биология, 2012, том 46, №2, c.Z18~¿86

4. Варламова Е.Г., Новосёлова Т.С., Черенков Д. А., Новосёлов C.B. Биохимическая характеристика селенового белка V (SelV). // Международная конференция «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии». Казань. 2008 г. с. 23.

5. Варламова Е.Г.. Новосёлова Т.С., Черенков Д. А., Новосёлов C.B. Биохимическая характеристика селенового белка V (SelV). // XII Международная Путинская конференция молодых ученых «Биология наука XXI века». Пущино. 2008 г. с. 10.

6. Варламова Е.Г., Новосёлов C.B. Биохимическая характеристика селенового белка V (SelV). // XV Международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов». Москва. 2009 г. с. 4.

7. Варламова Е.Г. Внутриклеточная локализация, поиск белков-партнеров и экспрессия SelV в процессе сперматогенеза и онтогенеза крысы. // XV Международная Пущинская конференция молодых ученых «Биология наука XXI века». Пущино. 2011 г. с. 9.

8. Варламова Е.Г., Новосёлов В.И. Новый селеновый белок млекопитающих V (SelV): поиск белков-партнеров, экспрессия его мРНК в процессе сперматогенеза и онтогенеза крысы. // Научная конференция по биоорганической химии и биотехнологии «X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова». Москва-Пущино. 2011 г. с. 15.

Подписано в печать:

10.01.2012

Заказ № 6470 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Варламова, Елена Геннадьевна, Пущино

61 12-3/504

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОФИЗИКИ КЛЕТКИ

На правах рукописи

ВАРЛАМОВА ЕЛЕНА ГЕННАДЬЕВНА

КЛОНИРОВАНИЕ, ЭКСПРЕССИЯ И ПОИСК БЕЛКОВ-ПАРТНЕРОВ НОВОГО СЕЛЕН- СОДЕРЖАЩЕГО БЕЛКА МЛЕКОПИТАЮЩИХ

(SELV)

03.01.03-Молекулярная биология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор биологических наук, Новосёлов C.B. доктор биологических наук, профессор Новосёлов В.И.

Пущино-2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИИ 4

ВВЕДЕНИЕ 5

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8

1. Селеноцистеин-двадцать первая аминокислота 8

1.1. Химический элемент селен. Преимущества перед серой 8

1.2. Эволюционное происхождение селеноцистеина 10

1.2.1. Идентификация селен- содержащих белков т бШсо 10

1.2.2. Филогенетическое распределение селен- содержащих белков 13

1.3. Биосинтез и механизм встраивания селеноцистеина в синтезируемые полипептидные цепи 18

2. Роль селена в здоровье человека 23

2.1. Участие селена в сперматогенезе 27

2.2. Селен-содержащие белки, экспрессирующиеся в семенниках 28

3. Суперсемейство тиоловых оксидоредуктаз 41

3.1. Яс1х- семейство тиоредоксин подобных белков 43

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 47

1. Материалы 47

2. Методы 49

2.1. Биоинформационный анализ 49

2.2. Выделение нуклеиновых кислот 49

2.3. Методика проведения обратной транскрипции и ГТЦР 50

2.4. Клонирование и сайт- направленный мутагенез 54

2.5. Экспрессия и очистка рекомбинантного белка 56

2.6. Идентификация белков- партнеров методами аффинной хроматографии и ко- иммуннопреципитации 56

2.7. Транзиентная трансфекция, иммунофлюоресценция, конфокальная микроскопия 59

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 60

1. Биоинформационный анализ первичной последовательности 8еГУ 60

2. Определение внутриклеточной локализации 8е1У и его 14- и С-концевых доменов 63

3. Идентификация белков-партнеров БеГУ 68

4. Исследование специфичности взаимодействия 8е1У с его потенциальными партнерами методом ко-иммунопреципитации 72

5. Определение степени ко-локализации 8е1У и его белков-партнеров 79

6. Экспрессия мРНК 8еГУ в семенниках крысы в процессе сперматогенеза и онтогенеза 81

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 84

ВЫВОДЫ 86

СПИСОК ПУБЛИКАЦИИ 87

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 89

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

Se селен

Sec селеноцистеин

SelH селен-содержащий белок H

SelL селен-содержащий белок L

SelM селен-содержащий белок M

SelT селен-содержащий белок Т

SelV селен-содержащий белок V

SelW селен-содержащий белок W

GPX глутатионпероксидаза

OGT О-связанная N- ацетилглюкозаминтрансфераза

д^ семейство белков, содержащих анкириновые повторы и

SOCS-домен-супрессор сигнализации цитокинов

Тгх тиоредоксин

GSH глутатион восстановленный

с„ „тс последовательность, необходимая для встраивания Sec в

oxido

полипептиды

РАСАР пептид, активирующий аденилатциклазу

ОТ-ПЦР обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция

ПЦР полимеразная цепная реакция

ПААГ-электрофорез электрофорез в полиакриламидном геле

dNTP смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов

SDS додецилсульфат натрия

DTT дитиотрейтол

BSA бычий сывороточный альбумин

GFP зеленый флуоресцентный белок

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Селен-содержащий белок V млекопитающих (SelV) относится к новому семейству Rdx белков, функции которых до конца остаются неизученными. Однако, наличие консервативного CXXC/CXXU (где С-цистеин, Х- любая аминокислота, U-селеноцистеин) мотива в каталитических центрах данных белков и тиоредоксин- подобной укладки свидетельствуют о их участии в окислительно-восстановительных реакциях [Dikiy A. et al., 2007].

Из двадцати пяти селен- содержащих белков человека, четыре, включая SelV, являются представителями данного семейства (SelW, SelH, SelT и SelV), среди которых первым был открыт SelW, обладающий способностью связываться в нативных условиях с 14-3-3 белками, составляющими большой класс белков, вовлеченных в ключевые физиологические процессы [Darling D.L. et al., 2005; Pozuelo R.M. et al., 2004; Van Heusden G.P.H.]. Важная роль в сопротивляемости клеток окислительному стрессу, индуцированному перекисью водорода [Novoselov S.V. et al., 2007], а также в ингибировании процесса образования супероксид аниона посредством поддержания уровня глутатиона в клетках [Ben Jilani К.Е. et al., 2007], принадлежит другому представителю Rdx семейства- селеновому белку Н. При изучении SelT впервые было показано вовлечение селен- содержащих белков в

ГЧ 2+

поддержание Са -гомеостаза и контроль секреторной активности, что позволяет лучше понять роль селена в предотвращении человеческих болезней и рака.

Изучение нового белка осуществляется, как правило, по трем направлениям: определяется первичная структура белка, исследуется его локализация на клеточном и тканевом уровнях, осуществляется функциональная характеристика белка.

На данный момент известно, что селен-содержащий белок V млекопитающих (36.7 kDa) является гомологом известного белка SelW и несет дополнительный N- концевой пролин- богатый домен, кроме того, показано, что мРНК SelV экспрессируется исключительно в семенниках (сперматоцитах). Одним из основных эффектов селена считается его влияние на мужскую фертильность, что особенно хорошо показано на моделях животных с нарушенным синтезом и/или метаболизмом селен- содержащих белков. Эти данные дают основание предположить, что SelV может играть важную роль в сперматогенезе [Kryukov G.V. et al., 2003], поэтому выяснение механизмов функционирования данного белка является крайне актуальной проблемой.

Данная работа посвящена исследованиям внутриклеточной локализации, поиску белков- партнеров SelV, а также определению экспрессии его мРНК на ключевых стадиях сперматогенеза и онтогенеза млекопитающих. Полученные в ходе нашей работы результаты способствуют установлению роли SelV в белковых комплексах или в метаболических путях, что очень важно для накопления фундаментальных знаний.

Цель работы

Клонирование, экспрессия и поиск белков-партнеров нового селен-содержащего белка млекопитающих (SelV).

Задачи работы

1. Клонирование полученных путем сайт-направленного мутагенеза вариантов рекомбинантного SelV мыши {Mus mus cuius) в составе векторов, предназначенных для экспрессии в прокариотической и эукариотической системах.

2. Определение локализации полноразмерного SelV, а также его N- и С-концевого доменов в клетках млекопитающих линии COS-7.

3. Поиск белков-партнеров SelV методом аффинной хроматографии в тандеме с масс-спектрометрическим анализом.

4. Исследование специфичности белок-белковых взаимодействий SelV и его партнеров методами коиммунопреципитации и ко-локализации в клетках млекопитающих линии COS-7.

5. Выявление экспрессии мРНК SelV, полученной на различных стадиях сперматогенеза и онтогенеза крысы (Rattus norvegicus), с помощью ПЦР.

Научная новизна работы

Впервые определена локализация SelV в клетках млекопитающих. Методом аффинной хроматографии в тандеме с масс-спектрометрическим анализом идентифицированы возможные белки-партнеры SelV, взаимодействующие с ним путем образования межмолекулярных селенид-сульфидных связей. Ими оказались О- ацетилглюкозаминтрансфераза (OGT), а также Asb-9 и Asb-17, относящиеся к семейству ASB (семейство белков, содержащих анкириновые повторы и SOCS-домен-супрессор сигнализации цитокинов). Проверена специфичность данных белок- белковых взаимодействий методам коиммунопреципитации потенциальных партнеров на аффинном матриксе, а также путем определения степени их совместной локализации в клетках млекопитающих. Определена локализация рассматриваемых белков-партнеров SelV в клетках млекопитающих линии COS-7. Установлено наличие экспрессии мРНК SelV в процессе онтогенеза и сперматогенеза крысы.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Селеноцистеин- двадцать первая аминокислота

Универсальный генетический код предусматривает возможность кодирования только двадцати «канонических» аминокислот, тогда как селеноцистеин (Sec), являющийся двадцать первой аминокислотой, кодируется одним из трех известных стоп-кодонов (UGA). Для того чтобы аппарат синтеза белка интерпретировал данный кодон как селеноцистеиновый, необходимо наличие в З'-нетраслируемой области гена эукариотического селенового белка определенной последовательности нуклеотидов, называемой SECIS (selenocystein insertion sequence). Селеноцистеин является обязательным компонентом нескольких важных ферментов в организме млекопитающих, простейших, бактерий и архей. Белки, содержащие данную аминокислоту, называются селенопротеинами. В геноме человека содержится двадцать пять селенопротеинов, поэтому селен является необходимым компонентом питания, и его недостаток приводит к различным заболеваниям.

1.1. Химический элемент селен. Преимущества перед серой

Селен- химический элемент, открытый И. Я. Берцелиусом в 1817 г.,

обозначается символом Se (лат. Selenium). Наряду с кислородом, серой,

теллуром, полонием селен относится к элементам главной подгруппы VI

группы периодической системы, называемым халькогенами, атомы которых

имеют одинаковое строение внешнего энергетического уровня, что

обусловливает схожесть их физико-химический свойств. В природе селен в

большей степени представлен в качестве селеноцистеиновой аминокислоты,

отличающейся от цистеиновой наличием селена вместо серы. Подобная

замена вполне понятна и объясняется тем фактом, что по своим физико-

химическим свойствам: размеру атомного радиуса, значению

8

электроотрицательности, степени окисления, селен ближе именно к сере, чем к другим вышеперечисленным халькогенам. Несмотря на это, всё же существуют биохимические различия между цистеином и селеноцистеином в белках [Wessjohann L.A. et al., 2007].

В первую очередь, это обусловлено значительной разницей в величине рКа (отрицательный логарифм константы кислотности Ка), которая для селеноцистеина (селенолата) составляет 5.2, а в случае цистеина (тиолата) равна 8.5 [Arner E.S., 2010], следовательно, селен-содержащие белки обладают большей каталитической активностью, что и было экспериментально подтверждено рядом авторов [Jacob С. et al., 2003; Johansson L. Et al., 2005].

Во-вторых, установлено, что нуклеофильность (или нуклеофильная активность), которая определяется величиной рКа, поляризуемостью, электроотрицательностью и атомным радиусом, селеноцистеина выше, чем у цистеина [Wessjohann L.A. et al., 2007; Arner E.S., 2010]. При сравнении химических активностей производных 2,6-диметоксифенила с соединениями серы и селена, последние проявили более высокую нуклеофильность, и тем самым, большую реакционную способность [WadaM. et al., 1999].

Кроме того, с помощью ЯМР-спектроскопии было показано, что благодаря более высокой нуклеофильности селена при физиологических

п

значениях рН реакции селенол/диселенидного обмена протекают в 10 быстрее, чем реакции тиол/дисульфидного обмена [Pleasants J.С. et al., 1989]. Селеноцистеин взаимодействует с электрофильными соединениями, такими как хлоруксусная кислота или хлорацетамид, и тем более с йодоацетатной кислотой или йодацетамидом, намного быстрее, чем цистеин.

Помимо этого, преимущества селеноцистеина перед цистеиновой аминокислотой ранее были выявлены при рассмотрении механизма активации Sec в каталитических реакциях с участием известных селен-

содержащих белков: тиоредоксин редуктазы млекопитающих, формиат дегидрогеназы и глутатион пероксидазы [Flohe et al., 1973; Rotruck et al., 1973; Gladyshev et al., 1996; Tamura and Stadtman, 1996; Gromer et al., 1998; Kryukov G.V. et al., 2003].

1.2. Эволюционное происхождение селеноцистеина

Одним из основных направлений при изучении эволюционного происхождения белков является тщательный анализ геномов организмов, относящихся к различным доменам жизни. Несмотря на некоторые проблемы, возникающие при идентификации селен- содержащих белков, количество селенопротеиновых семейств значительно увеличилось за последние четыре десятилетия, в частности, благодаря биоинформационным подходам, компьютерным программам, специально разработанным алгоритмам.

1.2.1. Идентификация селен- содержащих белков in silico

Идентификация селенопротеиновых генов in silico, как правило, основана на анализе структурных и термодинамических особенностей SECIS-элементов и консервативности их последовательности в селенопротеиновых генах (программы SECISearch 1.0, SECISearch 2.0, SECISblastn), на обнаружении TGA кодонов в открытых рамках считывания этих генов (программа geneid, MSGS критерии) [Kryukov G.V. et al., 1999; Lescure A. et al.,1999; Kryukov G.V. and Gladyshev V.N., 2002; Castellano S. et al., 2003].

Использование указанных компьютерных программ, а также

разработанного для поиска селенопротеинов алгоритма, позволило

идентифицировать в геноме млекопитающих 24 селеновых белка, которые

затем были проанализированы на наличие гомологов. Результатом этого

анализа явилось обнаружение 25-го селен- содержащего белка человека,

названного глутатионпероксидазой 6 (GPx6), который не был

ю

идентифицирован программой SECISearch, поскольку его мышиный и крысиный ортологи не имели SECIS- элементов и содержали цистеин вместо селеноцистеина [Kryukov G.V. et al., 2003].

В настоящее время создана база данных SelenoDB 1.0, содержащая информацию о эукариотических селенопротеиновых генах, структуре SECIS-элементов, что является крайне необходимым для корректного аннотирования постоянно растущего количества селенопротеиновых генов [Castellano S. et al., 2008].

SelenoDB 1.0 позволяет анализировать три типа последовательностей для идентификации селенопротеинов и их гомологов: геномы, транскрипты (кДНК, ESTs), последовательности белков и их фрагментов. В основе поиска новых генов селен- содержащих белков лежит сравнительный анализ неизвестных последовательностей с уже имеющимися в основных базах данных (Ensembl, GenBank, RefSeq) [Pruitt K.D., 2007] последовательностями генов селен-содержащих белков человека или других видов, что осуществляется путем использованием программ BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) [Altschul S.F. et al., 1997] и HMMER (Hidden Markov Models) [Eddy S.R., 1999].

Для предсказания кодирующих и не кодирующих областей генов используют программы Spidey [Wheelan S.J. et al., 2001], Exonerate [Slater G.S. and Birney E., 2005]. Поиск SECIS-элементов в селенопротеиновых генах эукариотических организмов осуществляется с помощью программы SECISearch, в генах прокариот- bSECISearch [Kryukov G.V. et al., 1999].

Совокупность вышеперечисленных биоинформатических методов, компьютерных программ в формате SelenoDB 1.0 позволяет осуществлять последовательный и корректный поиск новых селен- содержащих белков. В настоящий момент SelenoDB 1.0 включает 81 селенопротеиновый ген различных эукариотических видов, в том числе, Homo sapiens, Drosophila

melanogaster, Caenorhabditis elegans, содержит информацию о селенопротеинах 20 различных семейств [Castellano S. et al., 2008].

Таким образом, на данный момент идентифицировано 25 селен-содержащих белков человека, тогда как мышиный и крысиный селенопротеомы представлены 24 белками. Большая часть из них может быть классифицирована на две группы на основании локализации селеноцистеина [Hatfield D.L., 2001]. К первой относятся селенопротеины, характеризующиеся наличием селеноцистеина в С- концевой последовательности этих белков. Так, у тиоредоксинредуктаз млекопитающих, содержащих GCUG мотив, селеноцистеин локализован в подвижном С- концевом положении [Sun Q.A. et al., 1999], что позволяет каталитическому центру осуществлять перенос восстановленных эквивалентов от трудно доступного дисульфид-активного сайта на активный центр белка-субстрата. В случае тиоредоксин редуктазы 2 (TR 2), содержащей N- концевой тиолдисульфидоксидоредуктазный домен, селеноцистеиновый центр данного белка осуществляет перенос электронов к этому домену [Sun Y. et al., 2001].

Вторая селенопротеиновая группа включает белки, содержащие селеноцистеин в N- концевой позиции коротких доменов. Это большая группа а/р белков, у которых, в соответствии со вторичной структурой, селеноцистеин- содержащий каталитический центр локализован между а-спиралью и (3-слоем, подобно расположению СХХС мотива (последовательность, в которой два цистеина разделены двумя другими аминокислотами) оксидоредуктаз, вовлеченных в тиол-дисульфидный обмен. Селеноцистеин в редокс центре может замещать как N- так и С- концевой цистеин с образованием CXXU/UXXC мотивов.

Независимо от локализации селеноцистеина в функционально

охарактеризованных белках, можно заключить, что данная аминокислота в

составе каталитического центра принимает участие в окислительно-

12

восстановительных реакциях, однако функции других селен- содержащих беков остаются неизученными [Hatfield D.L. and Gladyshev V.N., 2002].

При анализе прокариотических геномов на наличие селен- содержащих белков были разработаны подобные подходы, основанные на том, что все селенопротеины имеют ортологи, которые содержат консервативные цистеиновые остатки вместо селеноцистеиновых. Несмотря на то, что данный подход является не совсем достоверным, было показано, что только 20% эубактерий, геномы которых полностью расшифрованы, содержат гены селенопроинов. Кроме того, известно, что встраивание селеноцистеина в белки у прокариот происходит с участием определенных цис- и трансактивных факторов, в частности, селеноцистеин синтетазы