Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение цитотоксических белков и белковых комплексов, ответственных за цитолиз трансформированных клеток
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология
Автореферат диссертации по теме "Изучение цитотоксических белков и белковых комплексов, ответственных за цитолиз трансформированных клеток"
На правах рукописи УДК 612.036:576.314.547.915.5
Шаталов Юрий Викторович
Изучение цитотоксических белков и белковых комплексов, ответственных за цитолиз трансформированных клеток.
специальность 03.00.03- молекулярная биология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва
2004
Работа выполнена в лаборатории молекулярной иммуногенетики рака Института биологии гена РАН.
Научные руководители: чл.-корр. РАН, доктор биологических наук, профессор Н.В. Гнучев
кандидат биологических наук Е.А. Духанина
Официальные оппоненты: чл.-корр. РАН, доктор биологических наук, профессор Л И. Корочкин
доктор биологических наук, профессор С М . Деев Ведущая организация: ГУ НИИ Физико-химической медицины Министерства
диссертационного совета Д 002.037.01 при Институте биологии гена РАН по адресу: 119334, г. Москва, ул. Вавилова д. 34/5.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, г. Москва, ул. Вавилова д. 32.
здравоохранения РФ
Защита диссертации состоится мая 2004 года, в 11 часов на заседании
Автореферат разослан: апреля 2004 года.
Ученый секретарь
Диссертационного совета
Кандидат фармацевтических
;кая Л.С.
Общая характеристика работы.'
Актуальность проблемы.
Актуальной проблемой клеточной и молекулярной биологии является изучение молекулярных механизмов иммунитета
Иммунитет принято разделять на врожденный и приобретенный Приобретенный иммунитет осуществляется в основном действием Т- и В- лимфоцитов, имеющих клонально-распределенные антигенные рецепторы. Во врожденном же иммунитете участвует широкий спектр клеток: NK, миелоидные клетки (нейтрофилы, макрофаги, базофилы, эозинофилы, дендритные клетки) и др, которые распознают характерные структуры патогенов: липополисахариды, тейхоевые кислоты, пептидогликаны, двуспиральную РНК, не метилированную ДНК и др , объединенных общим термином РАМР (патоген-ассоциированный молекулярный паттерн) .
Существуют факторы, которые участвуют, как во врожденном, так и в приобретенном иммунитете, при этом выполняемые ими функции могут сильно различаться. Одним из таких факторов является система пептидогликан-распознающих белков (PGRP) Белки семейства PGRP узнают пептидогликан и липополисахарид, присутствующие на поверхности патогенов, и активируют иммунный ответ. Индукция иммунного ответа происходит путем запуска профенолоксидазного каскада, активации Toll, Imd или TLR рецепторов, однако прямого взаимодействия PGRP белков с рецепторами пока не показано. Некоторые белки семейства PGRP обладают амидазной активностью, те. способны расщеплять пептидогликан, однако значение такого процесса пока остается загадкой Также остается открытым вопрос о цитотоксичности белков семейства PGRP. Ранее было показано, что Tag7/PGRP-S мыши, полученный в системе трансфицированных клеток, обладает цитотоксичностью, однако рекомбинантный PGRP-S в тех же условиях не проявляет цитолитической активности.
Изучение белков, вовлеченных в работу врожденного и приобретенного иммунитета, позволяет глубже понять механизм работы иммунитета в норме и характерные для различных патологий причины сбоев в этом механизме.
Цель работы и задачи исследования.
Целью данной работы было всестороннее исследование условий проявления цитолитической активности Tag7/PGRP-S. В связи с этим, были поставлены следующие задачи: провести поиск белка, взаимодействующего с Tag7 и образующего с ним стабильный комплекс; определить обладает ли такой комплекс цитолитической активностью; выяснить, присутствует ли такой комплекс в системах in vivo.
Научная новизна и практическая ценность работы.
Впервые было показано, что Tag7 образует стабильный комплекс с белком Hsp70. Этот комплекс имеет массу 90 кДа и образуется в эквимолярном соотношении белков. Найденный комплекс обладал цитолитической активностью, тогда как Tag7 и Hsp70, взятые отдельно, не обладали цитотоксичностью. Цитолитическая активность комплекса проявляется при концентрации от Ю-10 М. Были найдены критически важные участки Hsp70 для образования комплекса, однако, для получения оптимальной активности комплекса необходима целая молекула Hsp70. Установлено, что для образования комплекса Tag7-Hsp70 и появления его цитолитической активности необходим гидролиз АТФ. Аналогичные комплексы были найдены в клетках COS-1, трансфицированных геном tag7, и в активированных спленоцитах. Впервые было показано, что Hsp70 может вызывать апоптотическую гибель опухолевых клеток в комплексе с Tag7.
Работа разрешает противоречия относительно цитотоксичности Tag7/PGRP-S. Расширяет представления о функциональности Hsp70. Поскольку комплекс Tag7-Hsp70 секретируется клетками иммунной системы мыши и способствует гибели опухолевых
клеток, то комплекс Tag7-Hsp70 может бьггь использован для лечения онкологических заболеваний.
Апробация работы.
Материалы диссертации были доложены на "3-ем съезде биохимического общества" (Санкт-Петербург, Россия, 26.06.-1.07.2002), на международных конференциях "Apoptosis 2003" (Luxemburg, 29.01.-1.02.2003), "Molecular genetics of eukaryotes" (Москва, 4-7.02.2003).
Структура и объем диссертации.
Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждения, выводы, список литературы. Работа изложена на 108 страницах машинописного текста и содержит 5 таблиц и 30 рисунков. Библиография включает 144 источника.
Результаты и обсуждения.
Материалы, используемые в работе.
В данной работе нами были использованы рекомбинантные белки Hsp70 человека, HspBPl человека, полученные в E.Coli, Tag7 мыши, экспрессированный в дрожжах. Цитолитическая активность определялась на клетках линии L929 через 24 часа совместной инкубации.
Поиск партнера Тад7.
Исследование трехмерной структуры PGRP методом рентгено-структурного анализа продемонстрировало присутствие в молекуле белка, наряду с участками связывания пептидогликана, участка, ответственного за белок-белковое взаимодействие. Существующее в литературе разногласие относительно
цитолитического действия Tag7 (PGRP-S) можно объяснить этими особенностями его структуры. Возможно, что отдельно взятый Tag7 действительно не обладает прямым цитолитическим действием, но способен взаимодействовать с каким-либо другим регуляторным белком, присутствующим в межклеточном пространстве или на мембране одной из клеток, и в комплексе с ним может обладать цитолитической активностью.
Первым шагом в настоящем исследовании был поиск белка, способного связываться с Tag7 и образовывать с ним стабильный комплекс. С этой целью белки, выделенные из мембран клеток L929, подвергались аффинной хроматографии на колонке с белком Tag7 иммобилизованным на Sepharose 4B. Связавшиеся с Tag7 белки элюировали с колонки в виде единственного пика. Последующий SDS электрофорез элюата показал наличие одного гомогенного белка, молекулярная масса которого составляет 70 кДа.
Этот белок р70 был накоплен и применен для иммунизации мыши. Полученные поликлональные антитела были использованы с целью поиска белка р70 в мембранных фракциях некоторых других клеточных линий. Методом иммуноблота было показано его присутствие в мембранных фракциях всех исследованных клеточных линий, однако он отсутствует в нормальных лимфоцитах (Рис. 1).
Для определения природы белка р70 был проведен масс спектрометрический анализ пептидов р70, полученных с помощью триптического гидролиза. Молекулярные массы пептидов анализировались с помощью банка программы MASCOT Peptide Mass Fingerprint (Matrix Science)1 и банка данных NCBInr (Japan). Оказалось, что белок,
1 http //www mamxscience com/cgi/search_form pi
связавшийся с Tag7, является белком теплового шока 70 кДа - Hsp70 (совпадающие пептиды приведены в Таблице 1).
Н J К С L Т
р70
Рис 1. Вестерн блот мембранных фракций клеточных линий НеЬа(Н), Лиг^ (Л), К562 (К), СвМИОО (С), 1.929 (Ь) и лимфоцитов периферической крови человека (Т), проявленный поликлональными антителами к р70.
Таблица 1. Идентифицированные пептиды Hsp70 в спектре молекулярных масс триптических пептидов р70.
Далее нами был клонирован Шр70 человека в п л ар(^Е-м с
6гистидинами на N-конце. Рекомбинантный белок, очищался с помощью ионообменной хроматографии на NTA-агарозе. Затем к нему были получены поликлональные антитела в кролике.
Для подтверждения идентичности р70 и Н$р70 очищенные белки анализировались с помощью вестерн блота с использованием поликлональных антител к р70 и к Шр70. Белки оказались абсолютно кроссреактивными (рис. 2). Эти данные демонстрируют, что обнаруженный нами белок р70 является белком теплового шока Из литературных данных известно, что Нзр70 присутствует на мембране только раковых клеток и отсутствует на здоровых, это соответствует нашим выше приведенным данным о присутствии р70 в мембранных фракциях исследованных клеточных линий (рис. 1).
анти-р70 анти-Н8р70 Л* ^ ^
Рис. 2. Вестерн блот белков р70 и рекомбинантного Н$р70 (гШр70), проявленный антителами к
также как и р70 связывается с Tag7. Рекомбинантный Нзр70 наносился на колонку с иммобилизованным Tag7, а рекомбинантный Tag7 - на колонку с иммобилизованным Нзр70. С колонки с иммобилизованным Tag7 элюировался Нзр70,
№р70.
р70 и №р70.
Нбр70
в свою очередь с колонки с иммобилизованным Нф70 элюировался Tag7, что свидетельствует о взаимодействии этих белков
Для того чтобы показать взаимодействие Tag7 с Нф70 еще одним методом, мы использовали коиммуноприципитацию Рекомбинантные белки Tag7 и Нр70 смешивали, а затем приципитировали антителами к Tag7 или Нр70 После элюции связавшихся белков их анализировали с помощью вестерн блота (рис 3) Здесь также с антителами как к Tag7, так и к Нр70 связываются оба белка.
Рис. 3. Коиммунопреципитация комплекса Tag7-Hsp70 антителами к Tag7 (aнти-Tag7) и Hsp70 (анти-Hsp70). Преципитат анализировался с помощью вестерн блота и проявлялся антителами к Нф70 (1) и Tag7 (2)
Стехиометрия комплекса Tag7-Hsp70.
Для определения стехиометрического соотношения белков, входящих в состав комплекса, рекомбинантные белки Нф70 и Tag7 взятые в отдельности или в смеси, подвергались гельфильтрации на колонке Т8К G2000SW Для предотвращения олигомеризации Нр70 гельфильтрацию проводили в присутствии 5 мкМ АТФ На рисунке 4А можно видеть, что при гельфильтрации Tag7 с нбр70 наряду с пиками соответствующими молекулярным массам 70 кДа и 20 кДа, т е самих нбр70 и Tag7, также появился пик'с мол массой 90кДа Дальнейший анализ аликвот фракций с использованием вестерн блота показал наличие и Tag7, и нбр70 во фракции,
соответствующей 90кДа (Рис. 4В). Эти данные позволяют утверждать, что Hsp70 взаимодействует с Tag7 и образовывает стабильный комплекс в соотношении 1:1 в присутствии 5 мкМ АТФ.
Рис. 4. Гельфильтрация и последующий вестерн блот комплекса Tag7-Hsp70. А. Гельфильтрация комплекса Tag7-Hsp70, Tag7 и Hsp70 на колонке TSK G2000 SW в присутствии 5 мкМ АТФ и коктейля ингибитора протеаз. В. Вестерн блот фракций после разделения Tag7-Hsp70, проявленный антителами к Tag7 и Hsp70.
Стехиометрическое соотношение белков в составе комплекса Tag7-Hsp70 было
также подтверждено использованием химерного белка Tag7-EGFP, БОБР - эта белок с
молекулярной массой 30 кДа, и имеющий при правильной конформации стабильную
флуоресценцию при 507 нм. Tag7-EGFP, имеющий молекулярную массу 50 кДа, был
получен путем трансфекции клеток С08-1 плазмидой tag-EGFP, и обладал ожидаемой
10
флуоресценцией. Гельфильтрация на колонке TSK2000 SW смеси Tag7-EGFP и Hsp70 показала, что наряду с пиком флуоресценции 50кДа, появился пик 120 кДа, соответствующий комплексу Hsp70-Tag7-EGFP (рис. 5) Заметим, что сам EGFP не взаимодействует с Hsp70, и флуоресцирует только при правильной конформации. Таким образом, нами показано, что Tag7 действительно образует комплекс с Hsp70 в соотношении 1:1.
0,025
<5 0,02
0,015
S 0,01
е о,оо5
_ 50kD — Tag7EGFP — Hsp70+Tag7-EGFP
120kD | Л ! V ; ■ i
ю
12
14
16
18
20
Элюция, мл
Рис. 5. Гельфильтрация комплекса Hsp70-Tag7-EGFP и Tag7-EGFP на колонке TSK G2000 SW.
Комплекс Tag7-Hsp70 обладает цитолитической активностью.
Следующим шагом, важно было определить, обладает ли полученный нами комплекс Tag7-Hsp70 цитолитической активностью. На рисунке 6 представлена цитолитическая активность комплекса, анализируемая на клетках линии Ь929. Можно видеть, что 22% клеток гибнут под действием этого комплекса. При этом ни Шр70, ни Tag7, отдельно взятые, не вызывают цитолиза клеток. Активность комплекса Tag7-№р70 подавлялась поликлоиальными антителами к №р70 и к Tag7. Следовательно, для
проявления цитолитической активности Tag7 необходимо его взаимодействие с Hsp70 и образование стабильного комплекса. Именно комплекс Tag7-Hsp70 обладает цитолитической активностью.
25
Рис. 6. Цитолитичсская активность проб, содержащих Tag7 и Hsp70.
Существуют линии опухолевых клеток, которые в нормальных условиях экспрессируют Tag7. Из лизата одной из них - CSML-0, афининно очищенный Tag7, не обладал цитолитической активностью (рис. 6). Однако при добавлении к нему Hsp70 он становился цитотоксичным. Очевидно, что для проявления цитолитической активности природному Tag7, также как и рекомбинантному, необходимо взаимодействие с Hsp70.
Комплекс Tag7-Hsp70 обладает цитолитическим эффектом не только в отношении клеточной линии L929. Мы исследовали цитолитическую активность комплекса на некоторых других клеточных линиях. Из таблицы 2 можно видеть, что
опухолевые клетки 1игка1, МЗ и С8МЬ-0 гибнут под действием Tag7-Hsp70, в то время как лимфоциты, выделенные из периферической крови человека, резистентны к действию этого комплекса.
Таблица 2. Цитолитнческая гибель клеток под действием 100 нМ комплекса Tag7-Hsp70.
Клетки МЗ сямь-о лимфоциты
Цитотоксичность, % 21±2 20±2 30±3 2±1
Для определения оптимальных параметров цитолитической активности комплекса Tag7-Hsp70 была исследована зависимость цитотоксичности комплекса от соотношения составляющих его белков. Максимальная цитолитическая активность достигалась при эквимолярном соотношении Tag7 и Hsp70 (рис.7). Увеличение каждого из компонентов комплекса, по-видимому, приводит к образованию неактивных олигомеров, что и обуславливает падение цитолитической активности при нарушении эквимолярности.
Концентрационная зависимость цитолитического действия комплекса Tag7-Hsp70 при эквимолярном соотношении представлена на рисунке 8. Как можно видеть из графика цитолитическая активность комплекса Tag7-Hsp70 не проявляет пропорциональной зависимости от концентрации комплекса. Кривая достигает пасыщения и выходит на плато уже при концентрации 10-10М. Цитотоксичность при такой низкой концентрации позволяет судить о специфичности взаимодействия этого комплекса с рецепторами на поверхности клеток.
Рис. 7. Зависимость цитолитической активности комплекса Tag7-Hsp70 от соотношения Tag7 и Нвр70.
Рис. 8. Зависимость цитолитической активности комплекса Tag7-Hsp70 от концентрации. Цитотоксичность определялась при эквимолярном соотношении белков.
Для определения механизма гибели клеток под действием комплекса Tag7-Hsp70, мы исследовали фрагментацию ДНК с помощью проточного цитофлуориметра EPICS-V Elite (Coulter). На рисунке 9 представлена зависимость числа клеток с заданной флюоресценцией, отложенной в логарифмической шкале. Флуоресценция пропидиум йодида пропорциональна размеру ДНК внутри клетки. Можно видеть, что в клетках L929 под действием комплекса Tag7-Hsp70 наблюдается существенная фрагментация ДНК (36,9%). В то время как, под действием Tag7 и Hsp70, взятых по отдельности, фрагментация ДНК в клетках ниже контрольной. Следовательно, гибель клеток под действием комплекса Tag7-Hsp70 проходит по пути апоптоза. • •
Рис. 9. Фрагментация ДНК в клетках линии L929 под действием комплекса Tag7-Hsp70. Фрагментация ДНК анализировалась с помощью проточной цитофлуорометрии.
Картирование участков Hsp70 необходимых для образования комплекса.
Молекула Шр70 состоит из 3 доменов: АТФ-связывающего, пептид-связывающего и домена с пока неизвестной функцией. Мы попытались определять минимальные функциональные участки №р70, необходимые для создания
цитотоксического комплекса с Tag7. Так мы исследовали цитолитическую активность совместно инкубируемых с Tag7 фрагментов Hsp70. пептид-связывающего домена, 14-мерного пептида Hsp70 450-463 ак. (TKDNNLLGRFELSG), соответствующего критической области для связывания с белком. Оказалось, что эти фрагменты Hsp70 образуют комплекс с Tag7, и эти комплексы обладают цитолитической активностью (рис 10) В то же время 14-членный пептид Hsc70, соответствующий 14-членному участку Hsp70 с двумя заменами Arg 458 на Lys, Ser 462 на Thr, не образует цитотоксический комплекс. Стоит заметить, что для значительного цитотоксического эффекта комплексов с фрагментами Hsp70 требуется концентрация на 3 порядка больше, чем комплекса с полноразмерным Hsp70. Таким образом, для образования цитотоксического комплекса Tag7-Hsp70 достаточно полученных нами фрагментов Hsp70, но для получения максимальной цитолитической активности необходим и ЛТФ-связывающий домен
Рис. 10. Цитолитическая активность комплексов Tag7 с целой молекулой Hsp70 и с его фрагментами.
Роль АТФ в образовании цитотоксического комплекса Tag7-Hsp70.
Существенный вклад АТФ-связывающего домена в повышение цитотоксичности комплекса Tag-Hsp70 подразумевает участие АТФ в этом процессе. Действительно, как можно видеть из результатов, представленных на рисунке 12, преинкубация комплекса в присутствии 5 мкМ АТФ заметно увеличивает его цитолитическую активность. Эти результаты позволяют предположить, что образование комплекса осуществляется согласно известной схеме шаперонного цикла, когда молекула АТФ связываясь с активным центром №р70, обеспечивает связывание пептида, или белка находящегося в неправильной конформации. Последующий гидролиз АТФ до АДФ приводит изменению конформации №р70 и к запиранию пептида в активном центре пептид-связывающего домена №р70. Замена АДФ на АТФ приводит к диссоциации пептида в правильной конформации. Так завершается шалеронный цикл, и происходит изменение нарушенной конформации белка или (и) доставка его в различные компартменты клетки.
Исходя из этой схемы, в работе исследовалось, соответствует ли реакция образования комплекса Tag7-Hsp70 основным критериям шаперонной активности №р70 и в какой степени.
В первую очередь важно было установить, индуцирует ли посадка Tag7 в
активный центр Шр70 гидролиз АТФ и как АТФазная активность влияет на
цитолитические эффекты комплекса На рисунке 11 представлены результаты,
демонстрирующие АТФазную активность Шр70 и его комплексов с белками Tag7 и
цитохромом С. Цитохром С использовался в качестве стандартного отрицательного
контроля, так как известно, что цитохром С всегда существует в правильной
конформации. Можно заметить, что цитохром С не увеличивает АТФазную активность
№р70. Гидролиз же АТФ при образовании комплекса Tag7-Hsp70 значительно
возрастает, то есть конформация пептид-связывающего участка №р70 изменяется при
взаимодействии с Tag7, что влечет, за собой конформационные изменения АТФ-связывающего участка и гидролиз АТФ
Рис. 11. АТФазная активность Hsp70 в присутствии белковых субстратов Гидролиз АТФ измерялся колориметрически при 350 нм по увеличению неорганического фосфата
Гидролиз АТФ необходим для проявления цитолитической активности комплекса Tag7-Hsp70 Можно видеть (рис 12), что преинкубирование комплекса в присутствии 5 мкМ негидролизуемого аналога АТФ - ЛМР-РМР полностью блокирует цитолитическую активность комплекса. Использование белков-регуляторов АТФазной реакции также убеждает в том, что гидролиз АТФ существенно важен для стабильности цитотоксического комплекса Активатор АТФазной активности,
кошаперон Hsp40, способствует увеличению цитолитической активности комплекса, в то время как добавление ингибитора АТФазной активности, антикошаперона HspBPl, приводит к значительному снижению цитотоксичности Исследование структуры АТФ-связывающего участка Hsp70 с помощью рентгено-структурного анализа показало, что невозможность гидролиза при связывании PMP-PNP с АТФ-связывающим участком приводит к существенному изменению конформации этого участка. Эти изменения, по-видимому, сказываются на конформации пептид-связывающего участка и обуславливают диссоциацию Tag7 из активного центра Hsp70
Рис. 12. Цитолитическая активность комплекса Tag7-Hsp70 в присутствии АТФ, негидролизуемого аналога АТФ - AMP-PNP, кошаперона Нвр40 и антикошаперона Н$рБР1.
Анализируя результаты, представленные на рисунке 12, можно заметить, что комплекс Tag7-Hsp70 проявляет заметную активность даже в отсутствии АТФ, хотя мы доказали необходимость гидролиза АТФ для стабилизации комплекса. Такое несоответствие возможно связано с тем, что цитотоксичность проявляется при
взаимодействии комплекса Tag7-Hsp70 с такой высокоорганизованной системой'как эукариотическая клетка. Известно, что клетки могут секретировать в среду до 1 мкМ АТФ. Этого количества достаточно для стабилизации и проявления* заметной цитолитичсской активности комплекса, поэтому добавление 5 мкМ АТФ, Hsp40 и Hsp40 вместе с АТФ увеличивает цитотоксичность примерно на 30%.
Далее мы показали, что замещение АДФ на АТФ в активном центре Hsp70 действительно приводит к диссоциации комплекса, что постулировано для классической шаперонной активности. Для этого комплекс Tag7-Hsp70 наносился на колонки с aнти-Tag7 и анти-Нр70 сефарозой и затем элюировался высокой концентрацией АТФ (50 мМ). Длительная элюция приводила к диссоциации комплекса Tag7-Hsp70, так как с колонки с aнти-Tag7 частично элюировался Hsp70, а с колонки aнти-Hsp70 элюировался Tag7. Результаты вестерн блота элюированных белков представлены на рисунке 13.
Рис. 13. Вестерн блот белков, элюированных 50 мМ АТФ из комплекса
Та57-Шр70. 1. Белки элюировали с колонки с антителами к Tag7, и проявляли антителами к Hsp70.2. Белки элюировали с колонки с антителами к Hsp70, и проявляли антителами к Tag7.
Прохождение полного шаперонного цикла Hsp70 ставит вопрос: не сводится ли роль Hsp70 к изменению конформации Tag7 и восстановлении его правильного фолдинга. Из результатов, представленных на рисунке 14, можно видеть, что элюированный из комплекса 50 мМ АТФ Tag7 (также как и элюированный Hsp70) не обладал какой-либо цитолитической активностью, что позволяет нам предположить, что только комплекс Tag7-Hsp70 цитотоксичен Для получения цитотоксического комплекса не требуется прохождение полного шаперонного цикла, он тормозится на стадии связывания Tag7 с АДФ формой Hsp70.
л г»
Рис. 14. Цитолитическая активность Tag7 и Hsp70, элюированных 50 мМ АТФ с колонок с антителами к Hsp70 и Tag7.
Суммируя вышеизложенное, следует подчеркнуть, что реакция образования комплекса Tag7-Hsp70 проходит неполный шаперонный цикл. Цитолитической активностью обладает только промежуточный стабильный комплекс Tag7-Hsp70, причем для образования комплекса необходим гидролиз АТФ. Цитолитической активностью обладает АДФ форма Hsp70, содержащая Tag7 в активном центре.
Комплекс Tag7-Hsp70 in vivo.
В супернатанте трансфицированных геном tag7 клеток COS-1 была Определена цитолитическая активность, которая подавляется поликлональными антителами к Tag7 и антителами к Hsp70 (рис. 15) Кроме того, присутствие и Tag7, и Hsp70 в супернатанте COS-l-tag7 было показано с помощью вестерн блота, что заставляет предполагать секрецию не одиночного Tag7, а комплекса Tag7-Hsp70, который и определяет цитотоксичность супернатанта
Рис 15. Цитолитическая активность супернатанта клеток COS-1, трансфицированных геном tag7.
Цитолитическая активность супернатанта COS-l-tag7 также как и в условиях in vitro увеличивалась при добавлении 5 мкМ АТФ, и также блокировалась 5 мкМ AMP-PNP (рис. 15). Также наблюдалась частичная диссоциация Tag7 и Hsp70 из супернатанта трансформированных tag 7 клеток под действием 50 мМ АТФ (рис. 16). Диссоциированные Tag7 и Hsp70 не обладали цитотоксичностью (рис. 15) Это
подтверждает присутствие именно комплекса Tag7-Hsp70 в супернатанте трансформированных клеток, а не отдельных белков.
Рис 16. Вестерн блот белков, элюированных 50 мМ АТФ из супернатанта клеток С08-1-1а%7. 1. Белки элюировали с колонки с антителами к Tag7, и проявляли антителами к Hsp70.2. Белки элюировали с колонки с антителами к Hsp70, и проявляли антителами к Tag7.
Выше приведенные результаты свидетельствуют о том, что цитотоксический комплекс Tag7-Hsp70 способен образовываться не только в растворе, но и в эукариотической клетке. При трансфекции геном tag7 и оверэксирессии белка Tag7 клетки линии C0S-1 (клетки почек Африканской зеленой обезьяны), не являясь цитолитическими клетками, способны выполнять цитолитическую функцию, секретируя в кондиционную среду цитотоксический комплекс Tag7-Hsp70.
В институте биологии гена РАН в лаборатории генетики рака установлено, что введение животным клеток, трансфицированных геном tag7, значительно снижается
рост опухолей. Возможно, один из механизмов защитного действия таких клеток связан . с их способностью секретировать цитотоксический комплекс Та07-Н8р7О.'
Хотя, как видно из литературных данных, функциональная значимость Tag7 охарактеризована недостаточно полно, его экспрессия в клетках иммунной системы и важная роль в системе врожденного иммунитета очевидна. В связи с этим естественно предположить, что и клетки иммунной системы, ответственные за цитолиз патогенных клеток, способны секретировать комплекс Та§7-Н5!р70. Мы получили суточную культуру сплепоцитов мыши и стимулировали секрецию цитолитических белков инкубацией спленоцитов с клетками-мишенями. Кондиционная среда таких клеток обладала заметной цитотоксичностью, ингибируемой антителами как к Tag7, так и к Hsp70 (рис. 17). Эти результаты позволяют предположить, что комплекс Tag7-Hsp70 может образовываться также в активированных спленоцитах и его секреция является одним из многочисленных путей реализации цитотоксичности в иммунном ответе.
Рис 17. Цитолитическая активность супернатанта спленоцитов мыши.
Суммируя вышеизложенное, следует подчеркнуть, что цитотоксический комплекс Tag7-Hsp70 образуется не только при смешивании двух белков в растворе, но и в условиях in vivo.
Выводы.
1. Установлено, что Tag7 образует стабильный комплекс с белком теплового шока -Hsp70. Комплекс Tag7-Hsp70 имеет массу 90 кДа и образуется в эквимолярном соотношении.
2. Показано, что комплекс Tag7-Hsp70 обладает цитолитической активностью, в то время как сами Tag7 и Hsp70 не обладают ею. Цитолитическая активность комплекса проявляется в концентрациях от 10-10 М.
3. Были картированы критически важные участки Hsp70 для образования комплекса. Установлено, что для цитолитической активности Tag7 достаточно 14-членного фрагмента Hsp70 (450-463 а.к.), однако для получения максимальной цитотоксичности необходимо образование комплекса с целой молекулой Hsp70.
4. Определено значение шаперонного цикла Hsp70 для образования комплекса. Установлено, что цитолитической активностью обладает только промежуточный стабильный комплекс причем для образования комплекса необходим гидролиз АТФ. Цитолитической активностью обладает АДФ форма Hsp70, содержащая Tag7 в активном центре.
5. Показано, что in vivo активированные спленоциты и клетки, трансфицированные геном tag7, секретируют комплекс Tag7-Hsp70.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
L.P. Sashchenko, E.A. Dukhanina, D.V. Yashin, Y.V. Shatalov, E.A. Romanova, E.V. Korobko, A.V. Demin, T.I. Lukyanova, O.D. Kabanova, S.V. Khaidukov, S.L. Kiselev, A.G. Gabibov, N.V. Gnuchev, G.P. Georgiev. Peptidoglycan Recognition Protein Tag7 Forms a Cytotoxic Complex with Heat Shock Protein 70 in Solution and in Lymphocytes. JJ Biol. Chem. 2004, Vol. 279, pp. 2117-2124
Шаталов Ю.В., Сащенко Л.П., Духанина Е.А., Демин А.В., Киселев С.Л., Гнучев Н.В. Hsp70 образует стабильный цитотоксический комплекс cTag7/PGRP-S. ДАН 2004, т.395 №2, стр. 270-273.
И.И. Миркина, С.Л. Киселев, Е.А. Духанина, Т.И. Лукьянова, Ю.В. Шаталов, Л.П. Сащенко, Н.В. Гнучев. Tag7 - иммунореактивный цитотоксический белок продуцируется ЛАК клетками человека. ДАН 1999, т. 366, №6, стр.830-832. '
Отпечатано в копицентре Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. www.stprint.ru e-mail: zakaz@stprint.ru тел 939-3338 Заказ № 499, тираж 100 экз. Подписано в печать 19.04.2004 г.
.Р - 8 9 4 5
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шаталов, Юрий Викторович
Оглавление.
Список сокращений.
Введение.
Обзор литературы.
Врожденный и приобретенный иммунитеты.
Пептидогликан-распознающие белки.
Семейство PGRP содержит 4 пептидогликан-распознающих белка человека.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение цитотоксических белков и белковых комплексов, ответственных за цитолиз трансформированных клеток"
Актуальной проблемой современной биологии является изучение молекулярных механизмов иммунитета. Иммунитет - это реакция организма на инородные макромолекулы, микроорганизмы и на видоизмененные клетки собственного организма. Он является основным средством защиты организма от различных патогенных бактерий, вирусов, грибов, а также злокачественных образований.
Иммунитет принято разделять на врожденный и приобретенный. Приобретенный иммунитет осуществляется в основном действием Т- и В- лимфоцитов, имеющих клонально-распределенные антигенные рецепторы. Во врожденном же иммунитете участвует широкий спектр клеток: 1МК, миелоидные клетки (нейтрофилы, макрофаги, базофилы, эозинофилы, дендритные клетки) и др., которые распознают характерные структуры патогенов: липополисахариды, тейхоевые кислоты, пептидогликаны, двуспиральную РНК, не метилированную ДНК и др., объединенные общим термином РАМР (патоген-ассоциированный молекулярный паттерн).
Однако провести однозначное деление на врожденный и приобретенный иммунитет невозможно, поскольку некоторые клетки участвуют как во врожденном так и в приобретенном иммунитетах, например, различные антиген-презентирующие клетки (макрофаги, дендритные клетки), субпопуляции плазматических В-лимфоцитов. Только совместное координированное действие этих видов иммунитета может обеспечить надежную защиту организма.
Существуют факторы, которые участвуют, как во врожденном, так и в приобретенном иммунитете, при этом выполняемые ими функции могут сильно различаться. Одним из таких факторов является система пептидогликан-распознающих белков (РвШ1). Белки семейства РвШ1 узнают пептидогликан и липополисахарид, присутствующие на поверхности патогенов, и активируют иммунный ответ. Индукцияиммунного ответа происходит путем запуска профенолоксидазного каскада, активации Toll, Imd или TLR рецепторов, однако прямого взаимодействия PGRP белков с рецепторами пока не показано. Некоторые белки семейства PGRP обладают амидазной активностью, т.е. способны расщеплять пептидогликан, однако значение такого процесса пока остается загадкой. Также остается открытым вопрос о цитотоксичности белков семейства PGRP. Так одни авторы показали, что Tag7/PGRP-S мыши, полученный в системе трансфицированных клеток, обладает цитотоксичностью, однако другие авторы утверждают, что рекомбинантный PGRP-S не обладает цитолитической активностью.
Изучение белков, вовлеченных в работу врожденного и приобретенного иммунитета, позволяет глубже понять механизм работы иммунитета в норме и причины сбоев в этом механизме, характерные для различных патологий.
Обзор литературы.
Врожденный и приобретенный иммунитеты.
Защита организма от различных патогенных бактерий, вирусов, грибов, а также злокачественных образований осуществляется различными клетками иммунной системы.
Приобретенный иммунный ответ опосредован в основном действием Т- и В-лимфоцитов, имеющих клонально-распределенные антигенные рецепторы, что позволило обозначить данный вид иммунитета как специфический [1-3]. В результате соматической реорганизации генов иммуноглобулинов образуется около 10й клонов В-лимфоцитов, на поверхности которых экспрессируются различные антигенные рецепторы. Клональная селекция Т-лимфоцитов приводит к получению большого количества различных клонов лимфоцитов, специфически узнающих только определенный антиген. Т- и В-лимфоциты распознают антиген в комплексе с МНС II класса, представленный на поверхности антиген-презентирующих клеток (АРС), в результате чего клоны лимфоцитов, имеющие рецептор соответствующей афинности, пролиферируют и развиваются в эффекторные клетки: Т-хелперы, Т-киллеры, плазматические В-клетки. Такой механизм распознавания антигена, известный как клональная селекция, коренным образом отличает приобретенный иммунитет от врожденного (неклонального, неспецифического) иммунитета [1,3].
Врожденный иммунитет реализуется с помощью широкого спектра клетокиммунной системы: макрофагов, нейтрофилов, дендритных клеток, отдельныхсубпопуляций плазматических В-лимфоцитов, естественных киллеров (NK) [1, 3, 4].
Все они характеризуются отсутствием клонально-распределенных рецепторов ираспознают характерные структуры патогенов, в частности, липополисахариды (LPS),тейхоевые кислоты, пептидогликаны (PGN), двуспиральную РНК, не метилированную7ДНК, объединенные общим термином РАМР (патоген-ассоциированный молекулярный паттерн) [1, 2, 4, 5].
Роль таких клеток состоит в индукции первичного иммунного ответа (или воспаления). Этот ответ индуцируется при взаимодействии РАМР с паттерн-распознающими клеточными рецепторами [1, 2, 5].
Пептидогликан-распознающие белки.
Пептидогликан (PGN) - это основной компонент клеточной стенки практически всех бактерий [6] и, следовательно, он является великолепной мишенью для распознавания эукариотической системой врожденного иммунитета. Действительно, пептидогликан вызывает сильный антибактериальный ответ у насекомых и активирует моноциты, макрофаги и B-лимфоциты у млекопитающих. Активация пептидогликаном макрофагов и моноцитов у млекопитающих проводится посредством двух патерн-распознающих рецепторов CD14 [7-10] и TLR2 (Toll-like receptor-2) [11-13], что приводит к производству большого количества индукторов воспаления: цитокинов и хемокинов [7, 10, 14-16]. Эти пептидогликан-индуцированные медиаторы способны воспроизводить большинство основных клинических проявлений бактериальных инфекций, включая жар, воспаление, лейкоцитоз, гипотонию, недомогание, сонливость, снижение аппетита и артрит [14].
Идея существования пептидогликан распознающих факторов существует ужедостаточно давно, но выделить ген, кодирующий белковую последовательность,удалось сравнительно недавно [17]. В 1998 году D.Kang и др. [17] клонировал белокспособный аффинно связываться с пептидогликаном грамположительных бактерий,получивший название пептидогликан распознающий белок - PGRP (peptidoglycanrecognition protein). PGRP был обнаружен у моли Trichplusia ni, а также мыши ичеловека. При этом оказалось, что PGRP мыши полностью идентичен белку Tag7 [17],обнаруженному в 1996 году в Институте Биологии Гена РАН путем вычитания8библиотек из метастазирующей и не метастазирующей опухолевых линий клеток VMR-Liv и VMR-0 [18]. В 1999 году в ИБГ Миркиной И. и др. был клонирован человеческий Tag7 и он также полностью соответствовал человеческому PGRP [19].
В последние 5 лет стало появляться большое количество работ, посвященных клонированию различных пептидогликан связывающих белков, которые были объединены в семейство PGRP. В настоящее время семейство PGRP насчитывает более 30 белков (см. табл. 1).
Таблица 1. Известные белки семейства PGRP.
У моли Trichoplusia ni также известен пока только один ген PGRP. Экспрессия его индуцируется в жировых тельцах и хемоцитах. Максимум экспрессии PGRP наблюдается через 20-40 часов после инфекции, что схоже с экспрессией иммунно-индуцированных генов у этого вида [17, 35]. PGRP из T. ni имеет 50% гомологию (28% идентичных а.к) с лизоцимом бактериофага ТЗ. PGRP способен связываться с пептидогликаном, однако он не обладает амидазной активностью, как лизоцим, являющийся И-ацетилмурамол-Ь-аланин амидазой (N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase). Более того, в PGRP из T. ni утрачены все пять аминокислот в активном сайте, присутствующих в лизоциме бактериофага [17, 36].PGRP из Calpodes ethlius был выделен как белок кутикулы предкуколки пятой стадии гусеничного развития, и не присутствовал ни на каких других стадиях развития, включая и взрослую бабочку. Предполагается, что он может играть роль в расщеплении хитиновых пептидных связей для расщепления кутикулы [30].
У Drosophiîa melanogaster обнаружено 13 генов PGRP, расположенных в 8 хромосомных локусах, в 3 хромосомах. Эти гены сгруппированы в 2 класса: PGRP-SA, SB 1, SB2, SCIA, SC1B, SC2, SD с коротким транскриптом и короткой У-нетранслируемой областью; и LA, !,В, LC, LD, LE, LF - с длинным транскриптом и длинной 5'-нетранслируемой областью. Благодаря альтернативному сплайсингу PGRP-LA, LB, LC, LD могут иметь несколько транскрилтов (рис.1) [20, 21].
67А-х Л? ^Г, vwPGRP-LA PGRP-LC PGRP-LF64F 13F 86ЕPMI PGRP-LD ---PGRP-LE PGRP-LBCRALBPЮС 73C 44 E 66A■ ■■ [^pm^pi Ш 1ЯШPGRP-SA PGRP-SB1 SB2 PGRP-SC1A PGRP-SC1B PGRP-SC2 PGRP-SDРис. I. PGRP гены Drosophita расположены « Я хромосомных локусах Э хромосом. PGRP домены отмечены черным. Транскрипты 6ei PGRP доменов отмечены цветными прямоугольниками меньшего размера. Район имеет гомологичные копии PGRP доменов - х, у, 2, w: PGRP-LCz-w образуют PGRP-LL. PGRP-LD имеет ОРФ с аналогом РМ1 гена человека и в антисенс цепи имеет ОРФ с CRALBJ* (клеточным ретина льде гид-связывающим белком). Направление транскрипции показано стрелками [20,21].
С-копеп всех PGRP белков содержит сильно консервативный участок длиною примерно 160 аминокислот. Этот участок представляет собой три расположенных рядом PGRP домена, с достаточно консервативной последовательностью между ними[20, 22]. PGRP доменам всех коротких PGRP (PGRP-SА до -SD) предшествует типичная сигнальная последовательность, свидетельствующая о возможности секреции клеткой зрелых PGRP белков [20].
Длинные PGRP (PGRP-LA до -LE) гены имеют более сложное строение. Они имеют более длинные транскрипты и во многих случаях несколько сплайс вариантов. Ни один из длинных PGRP не имеет сигнального пептида. PGRP-LA, LC, LD и LF имеют предсказанные трансмембранные участки, что свидетельствует о том, что эти белки являются трансмембранными. PGRP-LE имеет сильно заряженный N-концевой участок рядом с PGRP доменами, но он не имеет ни сигнального пептида, ни трансмембранного участка. PGRP-LB кодирует только PGRP домены. Возможно, PGRP-LB и LE в клетке преимущественно находятся в цитозоли или ассоциируются с мембранными беками [20, 22].
Для PGRP-LA известны альтернативные сплайс варианты, кодирующие различные белки (рис.1). PGRP-LAa содержит длинный N-концевой участок, который имеет низкую гомологию с соответствующим участком PGRP-LC. PGRP-LAb не имеет этого участка. А PGRP-LAc является таким же коротким трансмембранным белком, как PGRP-LAb, но без PGRP доменов [20].
Недавно была опубликована кристаллическая структура белка PGRP-LB, представляющая собой смесь а и ß мотивов. PGRP-LB со стоит из трех а спиралей и одной центральной ß складки образованной шестью ß цепями (рис. 2). Одна сторона ß складки образует платформу для бороздки, стенки которой выстилают спираль al и петли ß3-al, al-ß4, ß5-ß6 и ß7-a3, далее переходящие в центральный лист. Бороздка и общая структура PGRP-LB очень похожа на структуру лизоцима бактериофага Т7, однако PGRP-LB имеет уникальный N-концевой фрагмент PGRP домена (12-33 аминокислоты) полностью отсутствующий у лизоцима. Этот уникальный фрагмент присутствует у всех PGRP белков, и вероятно, вовлечен в выполнение специфическихРис. 2. Структура PGRP и лнзодама бактериофага Т7. Рамкой выделен уникальный участок PGRP. Маленькими цветными рамками показаны аминокислоты, расположенные в стенке бороздки активного сайта. Красным и голубым цветом выделены аминокислоты, соответственно повторяющиеся в 100% или более 80% PGRP [37].для PGRP функций. Также как и лизоцим, PGRP-LB связывается с Zn2+. Zn-связывающий участок PGRP-LB образуется аминокислотными остатками His42, Hisl 52, Cysl60 и карбоксильным кислородом Glu 182 второй симметрично расположенной молекулы PGRP-LB. PGRP-LB имеет один дисульфидный мостик, образованный Cys50 и Cys56, который связывает спираль а] и складку ß3 в рЗ-al петле. Кроме того, PGRP-LB имеет специфическую гидрофобную бороздку, котораявместе с остатками консервативных аминокислот Ьеи15, А^18, ТЪг90, 01и93, РЬе94 и Ьеи133 образует потенциальный сайт белок-белкового узнавания [37].
Локус РОЯР-ЬС содержит 5 гомологичных РОЯР доменов х, у, а, г, лу (рис. 1, 3). РОЯР-ЬСх, РвИР-ЬСу и РОЯР-ЬСа являются альтернативными сплайс вариантами и кодируют одинаковую внутриклеточную часть, но отличаются внеклеточными РОЯР доменами. Ъ и лу домены всегда присутствуют на одном транскрипте, имеющую при этом короткую внутриклеточную часть (23 аминокислоты), поэтому в 2003 году он был выделен в отдельный ген - РОКР-Ы7 (белок 369 а.к.). Второй и третий экзоны РОЯР-и7 кодируют ъ домен, а 4-ый — лу домен. Таким образом, локус РОЯР-ЬС содержит 3 альтернативных сплайс варианта (х, у, а) и дополнительных ген РОЯР-Ы7 [20, 21].LC LFРис. 3. Кластер генов РСИР-ЬС. А. Генетическая структура кластера. Черным обозначены РСЯР домены. В. Предсказанное мембранное распоожение РвЯР-ЬС и РОЯР-Ы\PGRP-LD имеет 2 дополнительные рамки считывания (рис. 1). В 5'-областинаходится ген, продукт которого является гомологом человеческого белка снеизвестной функцией PMI. А З'-нетранслируемая область PGRP-LD перекрывается сгеном гомологом CRALBP (cellular retinaldehyde-binding protein) во второй цепи [20].
Гены PGRP-SC1А и PGRP-SC1B - отличаются только двумя основаниями [20].
Большинство PGRP экспрессируются во всех постэмбриональных стадиях.
Исключением является PGRP-SB2, который экспрессируется исключительно впредкуколке. PGRP-LD и PGRP-LE сильно экспрессированны в эмбрионах в возрасте14до 5 часов и в зрелых самках ИгозоркИа. РОЫР-ЬА, ЬВ, ББ, ЬБ появляются в позднем эмбриональном развитии. РОЯР-8С1 и БС2 постоянно экспрессируются во взрослом организме БгозоркИа [20].
Экспрессии РОЯР-ЬВ, Б А, БЕЛ, 8С2, Б Б сильно индуцируются грамположительными и грамотрицательными бактериями и пептидогликаном. Индуцибильные гены, такие как РОКР-8В1 и ББ, в основном, экспрессируются в жировых телах. РОКР-БА также экспрессируется в жировых телах, причем сильная индукция наблюдается и в каркасе, включая все эпителиальные слои. Возможно, РОШ*-БА играет специфическую роль в эпидерме. РОЯР-БА и ББ экспрессируются также и в не индуцированных хемоцитах. РОКР-ЬВ экспрессируется почти повсеместно, за исключением хемоцитов. Гены РОЯР-БС экспрессируются специфично в пищеварительном тракте [20].
Показано, что почти все белки семейства РОЮ\ функции которых изучались, способны связывать пептидогликан с высокой аффинностью. Так известно, что РОИР-БА, БСШ, ЬВ, ЬСх, ЬЕ связываются с пептидогликаном [20, 21, 37-40]. Причем РОИР-БА связывается с лизин-богатым пептидогликаном, а РОЯР-ЬЕ сильно связывается с пептидогликаном Б АР-типа [38-40].
Само название семейства пептидогликан распознающих белков подразумевает, что белки этого семейства должны связываться с пептидогликаном. Однако оказалось, что некоторые белки из этого семейства способны связываться и с ЬРБ. Так РОЯР-ЬСа и РОЫР-ЬСх при одновременном добавлении связываются с ЬРБ, и активируют иммунный ответ [21, 41].
Иммунитет у насекомых зависит от первичного и вторичного ответов. Первичный гуморальный иммунный ответ обуславливается активацией антимикробных пептидов, таких как Айаст, Б1р1епст, Бговост, Бе£егшп, Сесгорт, Ьуэогуте,Metchnikowin, Drosomycin и каскадов, постоянно присутствующих в гемолимфе белков, таких как профенолокидазный каскад [42, 43].
Последовательность реакций профенолоксидазного каскада до конца не изучена, но известно, что фенолоксидаза протеолитически активируется из неактивной формы -профенолоксидазы - с помощью профенолоксидазного энзима, терминальной сериновой протеазы этого каскада. Далее фенолоксидаза катализирует превращение дофамина в меланин, при этом образуются активные радикалы. Меланин и активные радикалы являются токсичными для бактерий [43].
Вторичный клеточный иммунный ответ требует активации транскрипции белков защиты и антибактериальных пептидов. У Drosophila вторичный иммунный ответ состоит из двух различных внутриклеточных сигнальных путей: Toll/Dif и imd/Relish. Imd сигнальный путь активируется грамотрицательными бактериями и некоторыми грамположительными, а сигнальный путь через Toll рецептор активируется грибами и грамположительными бактериями [40].
Для активации imd/Relish сигнального пути неизвестным посредникам необходимо активировать белок imd. Tmd содержит домен смсрти, димсризующийся с таким же доменом о молекуле BG4 (Рис 4). BG4 в свою очередь образует комплекс с белком Dredd. являющегося членом семейства цистеин-аспарагин овьтх п роте аз семейство caspase. Dredd, являющийся аналогом человеческой Caspase 8, расщепляет Relish на 2 фрагмента: С-концевой REL-49 (аналог I-к'В человека) и N-концевой REL-68 (аналог NF-кВ). Но для расщепления Relish необходим также и другой сигнал от аналога ГКК (I-кВ киназа) человека - ird,5 По-видимому, lrd5 вместе с субъединицей Key активируется "Гак 1 киназой (transforming growth factor activated kinase 1), которая,возможно, через посредников взаимодействует с imd. После расщепления Relish REL-68 транслоцируется в ядро и активирует гены гуморального иммунного ответа, включая антибактериальные пептиды [42].PGRP-SA способен индуцировать иммунный ответ против грамположительных бактерий у Drosophila. Он взаимодействует с лизин-содержащим пептидогликаном из Micrococcus luteus и активирует Toll рецептор. Однако прямого взаимодействия PGRP-SA с Toll или Spätzle не показано [39, 40].PGRP-LE способен активировать и первичный, и вторичный иммунный ответы [42-46]. Так PGRP-LE активирует профенолоксидазный каскад (таблица 2), причем это показано на опытах in vivo. Также он способен активировать imd/Relish сигнальный путь независимо от профенолоксидазного каскада. Предполагается, что PGRP-LE работает upstream от молекулы imd, но прямого взаимодействия PGRP-LE и imd не показано. Активация иммунного ответа PGRP-LE осуществляется с помощью его оверэкспресии и взаимодействием с пептидогликаном DAP-типа [38].
Таблица 2. Известные функции белков семейства PGRP из Drosophila.
Белок Связывает ФункцияPGRP-SA Лизин богатый PGN Активирует TollPGRP-SB1 — Возможно, N-ацетилмурамол-1 -аланин амидазаPGRP-SB2 — Возможно, N-ацетилмурамол-1-аланин амидазаPGRP-SC1A — Возможно, N-ацетилмурамол-1-аланин амидазаPGRP-SC1B PGN N-ацетилмурамол-!-аланин амидазаPGRP-SC2 — Возможно, N-ацетилмурамол-!-аланин амидазаБелок Связывает ФункцияPGRP-LB PGN N-ацетилмурамол-1 -аланин амидазаPGRP-LCx PGN Активирует imdPGRP-LCx вместе с PGRP-LCa LPS Активирует imdPGRP-LE DAP-тип PGN Активирует профенолоксидазный каскад и imdБелок PGRP-LC может также активировать imd/Relish сигнальный путь. Сначала предполагалось, что PGRP-LC взаимодействует только с LPS из клеточной стенки грамотрицательных бактерий и активирует imd [41, 47]. Однако недавно выяснилось, что не все изоформы PGRP-LC взаимодействуют с LPS. Так PGRP-LCx взаимодействует с пептидогликаиом и активирует иммунный ответ от грамположительных бактерий. В то же время, для узнавания LPS и для активации иммунного ответа грамотрицательными бактериями требуются одновременно и PGRP-LCa, и PGRP-LCx. О функциях же PGRP-LCy и PGRP-LF, находящихся в том же локусе PGRP-LC, пока ничего неизвестно [21]. Таким образом, различные изоформы PGRP-LC могут активировать imd/Relish сигнальный путь при взаимодействии с LPS, пептидогликаном, грамположительными и грамотрицательными бактериями. Поэтому ген PGRP-LC можно назвать универсальным для распознавания паттернов патогенных микроорганизмов. Также как и в предыдущих случаях, с PGRP-SA, и, PGRP-LE, пока нет данных о непосредственном взаимодействии PGRP-LC с imd.
Стоит отметить, что все белки семейства PGRP имеют специфическую гидрофобную бороздку, образованную при участии уникального фрагмента PGRP домена (12-33 аминокислоты PGRP-LB, см. рис. 2), которая может иметь функцию белок-белкового взаимодействия [37]. Поэтому все белки PGRP могут участвовать в передаче сигнала для активации защитных мер иммунной системы.
Помимо активации путей передачи сигнала для мембранносвязанного PGRP-LC показано, что он вовлечен в фагоцитоз в макрофаго-подобной клеточной линии S2 из Drosophila, Это свойство PGRP-LC демонстрирует способность PGRP-LC индуцировать и прямой клеточный иммунный ответ в результате микробного заражения [47].PGRP-SC1B и LB, возможно, имеют несколько другую функцию, нежели активация иммунного ответа. Показано, что они обладают энзиматической активностью и способны расщеплять пептидогликан. Они гидролизуют лектиламидную связь между сахарной цепью и связанными пептидами. Поэтому PGRP-SC1B и LB можно отнести к классу Ы-ацетилмурамол-1-аланин амидаз (N-acetylmuramoyl-1 -alanine amidase), которые, считалось, присутствуют только в прокариотах. Также как и N-ацетилмурамол-1 -аланин амид азы PGRP-SC1B и PGRP-LB связывают цинк, необходимый им для энзиматической активности. Интересно, что иммуностимуляторные свойства пептидогликана, гидролизованного PGRP-SC1B, сильно ослабевают, тогда как пептидогликан, расщепленный лизоцимом, сохраняет свои иммунногенные свойства. Таким образом, возможно, функция PGRP-SC1B и PGRP-LB состоит в расщеплении пептидогликана уже убитых бактерий [37, 48].
Существует мнение, что некоторые другие белки семейства PGRP могут обладать амидазной активностью. Это PGRP-SB1, SB2, SCIA и SC2, т.е. все PGRP-SB и SC могут являться амидазами. Это предположение происходит из исследований кристаллической структуры PGRP-LB. Все эти белки сохраняют все необходимые аминокислоты для связывания Zn2+ и активный центр для энзиматической активности [37].
Итого на данный момент у Drosophila melanogaster известно 13 генов, которые кодируют более 13 белков. Известны функции лишь некоторых из них. Секретируемый PGRP-SA узнает лицин-содержащий пептидогликан и активирует Toll зависимыйсигнальный путь. PGRP-LE узнает DAP-подобный пептидогликан и активирует профенолоксидазный каскад и imd сигнальный путь. Трансмембранные белки Р GRP-LCx и PGRP-LCa вместе взаимодействуют с LPS и тоже активируют imd-зависимый путь передачи сигнала. PGRP-LCx также узнает пептидогликан. PGRP-SC1B, LB имеют несколько другую функцию. Они узнают пептидогликан и расщепляет его, при этом пептидогликан теряет свои иммуногенные свойства. Возможно, функция PGRP-SC1B и LB заключается в элиминировании пептидогликана уже убитых бактерий.
У быков Bos Taurus был обнаружен аналог PGRP - олигосахарид-связывающий белок ЬОВР (bovine Oligosaccharide-Binding Protein). Он синтезируется в виде предшественника (190 аминокислот) в костном мозге, а зрелый белок (169 аминокислот) хранится в цитоплазматических гранулах нейтрофилов и эозинофилов, но отсутствует в лимфоцитах, моноцитах и тромбоцитах. ЬОВР обладает антибактериальной активностью относительно грамположительных,грамотрицательных бактерий и дрожжей даже в микромолярных концентрациях. Интересно, что ЬОВР имеет антимикробное действие даже против организмов, которые не имеют пептидогликана (Cryptococcus neoformans) или он не представлен на поверхности (Salmonella typhimurium). Таким образом, рВОР может связываться и активироваться не только пептидогликаном, но и другими микробными компонентами [33].
У крысы найден пока один белок PGRP, который экспрессируется в мозгу. Авторы предполагают, что PGRP у крысы играет роль в гомеостатической регуляции сна, так как у крыс с нарушением сна наблюдается повышенная экспрессия PGRP вIстволе мозга на 43% и в гипоталамусе на 17% [34].
Белок Tag7 мыши, позднее отнесенный к семейству PGRP [17], был впервые клонирован в Институте Биологии гена РАН [18]. В настоящее время у мыши обнаружены 2 белка семейства PGRP: PGRP-S (Tag7) и PGRP-L (Tag7L) [18, 27].
РОЯР-Б расположен в 7 хромосоме мыши в районе АЗ, состоит из 3 экзонов и имеет ТИБ-подобную промоторную область [17, 18, 26, 49]. И РОЯР-Б, и РОЯР-Ь имеют сигнальные последовательности и могут быть секретированы из клетки, однако РОЯР-Ь имеет предсказанные трансмембранные домены и, следовательно, может быть трансмембранным белком [26, 27]. РОЯР-Ь имеет несколько изоформ благодаря альтернативному сплайсингу, причем существует сплайс вариант, не имеющий РОЯР доменов [27]. РОЯР белки мыши имеют гомологию с лизоцимом бактериофага Т [17, 26, 27].
По поводу экспрессии РОЯР-Б в различных тканях и органах в литературе существуют разногласия. Так одни авторы утверждают, что белок РОЯР-Б экспрессируется в нейтрофилах, клетках костного мозга, слабо экспрессируется в клетках селезенки и мононуклеарных клетках, и не экспрессируется в Т и В лимфоцитах, >ТК клетках, тимоцитах, моноцитах и перетониальных макрофагах. Стимуляция Т и В лимфоцитов, макрофагов, пре-В лимфоцитов пептидогликаном, ЬРБ или грамположительными бактериями не приводит к индукции экспрессии РОЯР [50]. Однако другие авторы показывают, что РОЯР-Б экспрессируется в тимоцитах, спленоцитах и других клетках иммунной системы [26].
РвЯР-З и РОЯР-Ь мыши связываются с пептидогликаном с высокой аффинностью [27, 50, 51].
РОЯР-8 связывается с пептидогликаном в наномолярных концентрациях (1-125 нг/мл) с константой связывания Ка=13 пМ. При увеличении концентрации (0.125-1 мкг/мл) наблюдается кооперативное связывание с К<]=70 пМ, что предполагает агрегацию РОЯР-8 при высоких концентрациях в присутствии пептидогликана, или связывание нескольких молекул РОЯР-Б с каждой молекулой пептидогликана. Связывание специфично для полимерного пептидогликана или грамположительныхбактерий с не модифицированным пептидогликаном. РОЯР-Б не связывается с другими компонентами клеточных стенок бактерий или с грамотрицательными бактериями [50].
Все изоформы РОЯР-Ь связываются с грамположительными и грамотрицательными бактериями [27].
Также как и РОЯР-БСШ и ЬВ насекомых РОЯР-Ь мыши обладает амидазной активностью, т.е. является Ы-ацетилмурамол-1-аланин амидазой [51].
РСЯР-Б мыши, полученный в системах, трансфецированных геном Шg7, обладал цитотоксичностью [26], однако Ьш С. и др. показали, что рекомбинантный РОИР-Б не обладает цитотоксичностью (по отношению к бактериям и некоторым раковым клеткам), но обладает бактериостатическим действием на грамположительные бактерии (замедление роста на 50%) [50]. Поэтому вопрос о цитотоксичности РОЯР-Б остается открытым.
Семейство РЭИР содержит 4 пептидогликан-распознающих белка человека.
Семейство РОЯР человека состоит из 4 белков: РОЯР-Ь - с длинным транскриптом (576 а.к.), РОЯР-Б - с длинным транскриптом (196 а.к.), и два белка промежуточной длинны РОЯР-1а (341 а.к.) и РОЯР-1Р (373 а.к.). У насекомых существуют только короткие и длинные РОЯР, и пока только у человека найдены 2 белка средней длинны [17, 22, 23].
Гены белков РОЯР расположены в двух хромосомах. РОЯР-Б и РОЯР-Ь расположены в 19 хромосоме, а РОЯР-1а и РОЯР-1Р расположены в 1 хромосоме. РОЯР-Ь кодируется 5 экзонами, РОЯР-1а - 7, РОичр - 8 и РОЯР-Б - 3. Все экзоны РСЯР-1а и РОЯР-1Р сильно гомологичны, но РОЯР-1р имеет дополнительный экзон (экзон 2), который не экспрессируется в РСЯР-1а (хотя последовательность гомологичная этому экзону присутствует в гене РСЯР-1а, но не экспрессируется). 3экзон PGRP-Iß имеет сайты альтернативного сплайсинга, и, по-видимому, существуют две изоформы PGRP-I/3 [22].
Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Шаталов, Юрий Викторович
Выводы.
1. Установлено, что Tag7 образует стабильный комплекс с белком теплового шока -Hsp70. Комплекс Tag7-Hsp70 имеет массу 90 кДа и образуется в эквимолярном соотношении.
2. Показано, что комплекс Tag7-Hsp70 обладает цитолитической активностью, в то время как сами Tag7 и Hsp70 не обладают ею. Цитолитическая активность комплекса проявляется в концентрациях от Ю"10 М.
3. Были картированы критически важные участки Hsp70 для образования комплекса. Установлено, что для цитолитической активности Tag7 достаточно 14-членного фрагмента Hsp70 (450-463 а.к.), однако для получения максимальной цитотоксичности необходимо образование комплекса с целой молекулой Hsp70.
4. Определено значение шаперонного цикла Hsp70 для образования комплекса. Установлено, что цитолитической активностью обладает только промежуточный стабильный комплекс Tag7-Hsp70, причем для образования комплекса необходим гидролиз АТФ. Цитолитической активностью обладает АДФ форма Hsp70, содержащая Tag7 в активном центре.
5. Показано, что in vivo активированные спленоциты и клетки, трансфицированные геном tag7, секретируют комплекс Tag7-Hsp70.
Благодарности
Автор выражает глубокую признательность Гнучеву Н.В, Духаниной Е.А. и Сащенко Л.П. за постоянное внимание к работе и научное руководство. Автор также благодарит всех сотрудников лаборатории молекулярной иммуногенетики рака Института Биологии Гена РАН за помощь в работе и написании диссертации. Автор благодарен Демину A.B., Коробко Е.В., Решетняк А., , Капелинской Т.В., Курочкину С.Н. и Габибову А.Г. за помощь в процессе работы.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шаталов, Юрий Викторович, Москва
1. Janeway С.A., Travers P., Walport М., Shlomchik М. Immunobiology. 2001, 5th ed. New York and London: Garland Publishing.
2. Fearon T. D. and Locksley R.M. The Instructive Role of Innate Immunity in the Acquired Immune Response. Science, 1996, v. 272, p. 50-53.
3. Medzhitov R. and Janeway Ch.A. Innate immunity: impact on the adaptive immune response. Current Opinion in Immunology, 1997, v.9, p. 4-9.
4. Janeway C.A., Medzhitov Jr. and R. Innate immune recognition. Annual Review of Immunology, 2002, v. 20, p. 197-216.
5. Akira S. Mammalian Toll-like receptors. Current Opinion in Immunology, 2003, v. 15, p. 5-11
6. Schleifer K.H., Kandler O. Peptidoglycan types of bacterial cell walls and their taxonomic implications. Bacteriol. Rev., 1972, v. 36, p. 407-477.
7. Gupta D., Kirkland T. N., Viriyakosol S., and Dziarski R. CD14 is a cell-activating receptor for bacterial peptidoglycan. J. Biol. Chem. 1996, v. 271, p. 23310-23316.
8. Weidemann В., Schletter J., Dziarski R., Kusumoto S., Stelter F., Rietschel E. Т., Flad H. D., Ulmer A. J. Specific binding of soluble peptidoglycan and muramyldipeptide to CD14 on human monocytes. Infect. Immun. 1997, v. 65, № 3, p. 858-864.
9. Dziarski R., Tapping R. I., Tobias P.S. Binding of bacterial peptidoglycan to CD14. J. Biol. Chem. 1998, v. 273, p. 8680-8690.
10. Schwandner R., Dziarski R., Wesche H., Rothe M., Kirschning C.J. Peptidoglycan- and lipoteichoic acid-induced cell activation is mediated by toll-like receptor 2. J. Biol. Chem. 1999, v. 274, p. 17406-17409.
11. Yoshimura A., Lien E., Ingalls R.R., Tuomanen E., Dziarski R., Golenbock D. Cutting edge: recognition of Gram-positive bacterial cell wall components by the innate immune system occurs via Toll-like receptor 2. J. Immunol. 1999, v. 163, p. 1-5.
12. Takeuchi O., Hoshino K., Kawai Т., Sanjo H., Takada H., Ogawa Т., Takeda K., Akira S. Differential roles of TLR2 and TLR4 in recognition of gram-negative and gram-positive bacterial cell wall components. Immunity 1999, v. 11, p. 443-451.
13. Dziarski R., Ulmer A.J., Gupta D. Interactions of CD14 with components of grampositive bacteria. Chem. Immunol. 2000, v. 74, p. 83-107.
14. Gupta D., Jin Y., Dziarski R. Peptidoglycan induces transcription and secretion of TNF-a and activation of lyn, e xtracellular signal-regulated kinase, and rsk signal transduction proteins in mouse macrophages. J. Immunol. 1995, v. 155, p. 2620-2630.
15. Wang Z.-M., Liu C., Dziarski R. Chemokines are the main proinflammatory mediators in human monocytes activated by Staphylococcus aureus, peptidoglycan, and endotoxin. J. Biol. Chem. 2000, v. 275, p. 20260-20267.
16. Kang D., Liu G., Lundstrom A., Gelius E., Steiner H. A peptidoglycan recognition protein in innate immunity conserved from insects to humans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998, v. 95, p. 10078-10082.
17. Кустикова О.С., Киселев C.JI., Бородулина О.Р., Сенин В.М., Афанасьева А.В., Кабишев А.А. Клонирование гена tag7, экспрессирующегося в метастазирующих опухолях мыши. Генетика 1996, т. 32, №5, стр. 621-628.
18. Миркина И.И., Киселев СЛ., Сащенко Л.П., Садчикова Е.Р., Гнучев Н.В. Клонирование гена tag7 человека и изучение его геномной организации. ДАН 1999, т. 367, №4, стр. 548-552.
19. Werner Т., Liu G., Kang D., Ekengren S., Steiner H., Hultmark D. A family of peptidoglycan recognition proteins in the fruit fly Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000, v. 97, p. 13772-13777.
20. Werner Т., Borge-Renberg K., Mellroth P., Steiner H., Hultmark D. Functional diversity of the Drosophila PGRP-LC gene cluster in the response to lipopolysaccharide and peptidoglycan. J. Biol. Chem. 2003, v. 278, p. 26319-26322.
21. Liu C., Xu Z., Gupta D., Dziarski R. Peptidoglycan recognition proteins: a novel family of four human innate immunity pattern r ecognition molecules. J. Biol. Chem. 2001 v. 276, №37, p. 34686-34694.
22. Миркина И.И., Кибардин A.B., Корнеева E.A., Гнучев Н.В., Георгиев Г.П., Киселев C.J1. Клонирование и изучение новых генов млекопитающих, имеющих область структурной гомологии с фаговым лизоцимом. Генетика 2000, т. 36, № 11, стр. 1492-1500.
23. Yoshida Н., Kinoshita К., Ashida М. Purification of a peptidoglycan recognition protein from hemolymph of the silkworm, Bombyx mori. J. Biol. Chem. 1996, v. 271, № 23, p. 13854-13860.
24. Ochiai M., Ashida M. A pattern recognition protein for peptidoglycan. Cloning the cDNA and the gene of the silkworm, Bombyx mori. J. Biol. Chem. 1999, v. 274, № 17, p. 11854-11858.
25. Kiselev S.L., Kustikova O.S., Korobko E.V., Prokhortchouk E.B., Kabishev A.A., Lukanidini E.M., Georgiev G.P. Molecular cloning and characterization of the mouse tag7 gene encoding a novel cytokine. J. Biol. Chem. 1998, v. 273, № 29, p. 1863318639.
26. Rehman A., Teodecki E.E., Krueger J.M. Rattus norvegicus peptidoglycan recognition protein PGRP (Pgrp) mRNA. Unpublished 1999. NP445825 (NCBI).
27. Kappeler S.R., Farah Z., Puhan Z. The peptidoglycan recognition protein is expressed in the lactating mammary gland of camels and binds to lactic acid bacteria. Unpublished 2001. CAC84130 (NCBI).
28. Marcu O., Locke M. Insect Biochem. A cuticular protein from the moulting stages of an insect. Mol. Biol. 1998, v. 28, p. 659-669.
29. Kappeler S.R. The peptidoglycan recognition protein, PGRP, is expressed in the lactating mammary gland of camels. Unpublished 2001. CAC83647 (NCBI).
30. Rehman A., Taishi P., Fang J., Majde J.A., Krueger J.M. The cloning of a rat peptidoglycan recognition protein (PGRP) and its induction in brain by sleep deprivation. Cytokine 2001, v. 13, № 1, p. 8-17.
31. Kang D.W., Lundstrom A., Steiner H. Trichoplusia ni attacin A, a differentially displayed insect gene coding for an antibacterial protein. Gene 1996, v. 174, № 2, p. 245249.
32. Cheng X., Zhang X., Pflugrath J.W., Studier F.W. The structure of bacteriophage T7 lysozyme, a zinc amidase and an inhibitor of T7 RNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, v. 91, № 9, p. 4034-4038.
33. Kim M.-S., Byun M., Oh B.H. Crystal structure of peptidoglycan recognition protein LB from Drosophila melanogaster. Nature Immunol. 2003, v. 4, № 8, p. 787-793.
34. Michel T., Reichhart J.M., Hoffmann J.A., Royet J. Drosophila Toll is activated by Gram-positive bacteria through a circulating peptidoglycan recognition protein. Nature 2001, v. 414, p. 756-759.
35. Gottar M., G obert V., Michel T., B elvin M., D uyk G., H offmann J. A., F errandon D., Royet J. The Drosophila immune response against Gram-negative bacteria is mediated by a peptidoglycan recognition protein. Nature 2002, v. 416, p. 640-644.
36. Choe K.M., Werner T., Stoven S., Hultmark D., Anderson K.V. Requirement for a peptidoglycan recognition protein (PGRP) in Relish activation and antibacterial immune responses in Drosophila. Science 2002, v. 296, p. 359-62.
37. Hultmark D. Drosophila immunity: paths and patterns. Current Opinion in Immunol. 2003, v. 15, p. 12-19.
38. Saderhall K., Cerenius L. Role of the prophenoloxidase-activating system in invertebrate immunity. Current. Opinion in Immunol. 1998, v. 10, p. 23-28.
39. Hultmark D. Immune reactions in Drosophila and other insects: a model for innate immunity. Trends Genet. 1993, v. 9, p. 178-183.
40. Hoffmann J.A., Kafatos F.C., Janeway C.A., Ezekowitz R.A. Phylogenetic perspectives in innate immunity. Science 1999, v. 284, p. 1313-1318.
41. Khush R.S., Leulier F., Lemaitre В. Drosophila immunity: two paths to NF-кВ. Trends Immunol. 2001, v. 22, p. 260-264.
42. Rämet M., Manfruelli P., Pearson A., Mathey-Prevot В., Ezekowitz R.A. Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli. Nature 2002, v. 416, p. 644-648.
43. Mellroth P., Karlsson J., Steiner H. A scavenger function for a Drosophila peptidoglycan recognition protein. J. Biol. Chem. 2003, v. 278, № 9, p. 7059-7064.
44. Прохорчук Е.Б., Бородулина O.P., Киселев C.JI. Геномная организация и хромосомная локализация нового лиганда семейства фактора некроза опухоли. ДАН 1997, т. 357, № 5, стр. 699-701.
45. Liu С., Gelius Е., Liu G., Steiner Н., Dziarski R. Mammalian peptidoglycan recognition protein binds peptidoglycan with high affinity, is expressed in neutrophils, and inhibits bacterial growth. J. Biol. Chem. 2000, v. 275, № 32, p. 24490-24499.
46. Gelius E., Persson C., Karlsson J., Steiner H. A mammalian peptidoglycan recognition protein with N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase activity. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003, v. 306, № 4, p. 988-994.
47. Миркина И.И., Киселев C.J1., Духанина Е.А., Лукьянова Т.И., Шаталов Ю., Сащенко Л.П., Гнучев H.B. Tag7 иммунореактивный цитотоксический белок продуцируется ЛАК клетками человека. ДАН 1999, т. 366, № 6, стр. 830-832.
48. Кибардин A.B., Миркина И.И., Закеева И.Р., Баранова Е.В., Георгиев Г.П., Киселев С.Л. Экспрессионный анализ белков, кодируемых генами семейства tag7/tagL (PGRP-S, L) в клетках периферической крови человека. Генетика 2003, т. 39, № 2, стр. 244-249.
49. Wang Z.-M., Li X., Cocklin R.R., Wang M., Wang M., Fukase К., Inamura S., Kusumoto S., Gupta D., Dziarski R. Human peptidoglycan recognition protein-L
50. PGRP-L) is an N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase. J. Biol. Chem. 2003, v. 278, № 49, p. 49044-49052.
51. Ritossa F. A new puffing pattern induced by heat shock and DNP in Drosophila. Experientia 1962, v. 18, p. 571-573.
52. Tissieres A., Mitchell H.K., Tracy U.M. Protein synthesis in salivary glands of Drosophila melanogaster: relation to chromosome puffs. J. Mol. Biol. 1974, v. 84, № 3, p. 389-398.
53. Маргулис Б.А., Гужова И.В. Белки стресса в эукариотической клетке. Цитология 2000, т. 42, № 4, стр. 323-342.
54. Feige U., Polla B.S. Hsp70 a multi-gene, multi-structure, multi-function family with potential clinical applications. Experientia 1994, v. 50, p. 979-986.
55. Lindquist S. The heat-shock response. Ann. Rev. Biochem. 1986, v. 55, p. 1151-1191.
56. Guzhova I.V., Darieva Z.A., Melo A.R., Margulis B.A. Major stress protein Hsp70 interacts with NF-kB regulatory complex in human T-lymphoma cells. Cell Stress and Chaperones 1997, v. 2, № 2, p. 132-139.
57. Delmas F., Trocheris V., Murat J.-C. Expression of stress proteins in cultured HT29 human cell-line; a model for studying environmental aggression. Int. J. Biochem. Cell Biol. 1995, v. 27, № 4, p. 385-391.
58. Hahn G.M., Shiu E.C., West В., Goldstein L., Li G.C. Mechanistic implications of the induction of thermotolerance in Chinese hamster cells by organic solvents. Cancer Res. 1985, v. 45, №9, p. 4138-4143.
59. Petronini P.G., Tramacere M., Mazzini A., Piedimonte G., Silvotti L., Borghetti A.F. Hyperosmolarity-induced stress proteins in chick embryo fibroblasts. Exp. Cell. Res. 1987, v. 172, №2, p. 450-462.
60. Suzuki К., Watanabe M. Modulation of cell growth and mutation induction by introduction of the expression vector of human hsp70 gene. Exp. Cell. Res. 1994, v. 215, № l,p. 75-81.
61. Bush K.T., Goldberg A.L., Nigam S.K. Proteasome inhibition leads to a heat-shock response, induction of endoplasmic reticulum chaperones, and thermotolerance. J. Biol. Chem. 1997, v. 272, № 14, p. 9086-9092.
62. Chang N.T., Huang L.E., Liu A.Y. Okadaic acid markedly potentiates the heat-induced hsp70 promoter activity. J. Biol. Chem. 1993, v. 268, № 2, p. 1436-1439.
63. Goodman R., Blank M. Magnetic field stress induces expression of hsp70. Cell Stress Chaperones 1998, v. 3, № 2, p. 79-88.
64. Khandjian E.W., Turler H. Simian virus 40 and polyoma virus induce synthesis of heat shock proteins in permissive cells. Mol. Cell. Biol. 1983, v. 3, № 1, p. 1-8.
65. Zhu W.M., Roma P., Pirillo A., Pellegatta F., Catapano A.L. Oxidized LDL induce hsp70 expression in human smooth muscle cells. FEBS Lett. 1995, v. 372, № 1, p. 1-5.
66. Малышев И.Ю., Малышева E.B. Белки теплового шока и защита сердца. Бюл. Эксперим. Биол. Мед. 1998, т. 126, стр. 604-611.
67. Jacquier-Sarlin M.R., Jornot L., Polla B.S. Differential expression and regulation of hsp70 and hsp90 by phorbol esters and heat shock. J. Biol. Chem. 1995, v. 270, № 23, p. 14094-14099.
68. Amici C., Sistonen L., Santoro M.G., Morimoto R.I. Antiproliferative prostaglandins activate heat shock transcription factor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, v. 89, № 14, p. 6227-6231.
69. Ting L.P., Tu C.L., Chou C.K. Insulin-induced expression of human heat-shock protein gene hsp70. J. Biol. Chem. 1989, v. 264, № 6, p. 3404-3408.
70. Horn S., Cohen R., Gertler A. Regulation of heat-shock protein (hsp70) gene expression by hGH and IL2 in rat Nb2 lymphoma cells. Mol. Cell. Endocrinol. 1994, v. 105, № 2, p. 139-146.
71. Ferris D.K., Harel-Bellan A., Morimoto R.I., Welch W.J., Farrar W.L. Mitogen and lymphokine stimulation of heat shock proteins in T lymphocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, v. 85, № 11, p. 3850-3854.
72. Fincato G., Polentarutti N., Sica A., Mantovani A., Colotta F. Expression of a heat-inducible gene of the HSP70 family in human myelomonocytic cells: regulation by bacterial products and cytokines. Blood 1991, v. 77, № 3, p. 579-586.
73. Elia G., Santoro M.G. Regulation of heat shock protein synthesis by quercetin in human erythroleukaemia cells. Biochem. J. 1994, v. 300, p. 201-209.
74. Edington B.V., Whelan S.A., Hightower L.E. Inhibition of heat shock (stress) protein induction by deuterium oxide and glycerol: additional support for the abnormal protein hypothesis of induction. J. Cell. Physiol. 1989, v. 139, № 2, p. 219-228.
75. Pelham H.R. Speculations on the functions of the major heat shock and glucose-regulated proteins. Cell 1986, v. 46, № 7, p. 959-961.
76. Sedger L., Ruby J. Heat shock response to Vaccinia virus infection. J. Virol. 1994, v. 68, № 7, p. 4685-4689.
77. Pelham H.R. A regulatory upstream promoter element in the Drosophila hsp70 heat-shock gene. Cell 1982, v. 30, № 2, p. 517-528.
78. Wu C. Activating protein factor binds in vitro to upstream control sequences in heat shock gene chromatin. Nature 1984, v. 311, p. 81-84.
79. Sorger P.K. Heat shock factor and the heat shock response. Cell 1991, v. 65, № 3, p. 363366.
80. Morimoto R.I., Kline M.P., Bimston D.N., Cotto J.J. The heat-shock response: regulation and function of heat-shock proteins and molecular chaperones. Essays Biochem. 1997, v. 32, p. 17-29.
81. Mathew A., Mathur S.K., Morimoto R.I. Heat shock response and protein degradation: regulation of HSF2 by the ubiquitin-proteasome pathway. Mol. Cell. Biol. 1998, v. 18, №9, p. 5091-5098.
82. Nakai A., Kawazoe Y., Tanabe M., Nagata K., Morimoto R.I. The DNA-binding properties of two heat shock factors, HSF1 and HSF3, are induced in the avian erythroblast cell line HD6. Mol. Cell. Biol. 1995, v. 15, № 10, p. 5268-5278.
83. Nakai A., Tanabe M., Kawazoe Y., Inazawa J., Morimoto R.I., Nagata K. HSF4, a new member of the human heat shock factor family which lacks properties of a transcriptional activator. Mol. Cell. Biol. 1997, v. 17, № 1, p. 469-481.
84. Tanabe M., Kawazoe Y., Takeda S., Morimoto R.I., Nagata K., Nakai A. Disruption of the HSF3 gene results in the severe reduction of heat shock gene expression and loss of thermotolerance. EMBO J. 1998, v. 17, № 6, p. 1750-1758.
85. Ali A., Bharadwaj S., O'Carroll R., Ovsenek N. HSP90 interacts with and regulates the activity of heat shock factor 1 in Xenopus oocytes. Mol. Cell. Biol. 1998, v. 18, № 9, p. 4949-4960.
86. Duina A.A., Kalton H.M., Gaber R.F. Requirement for Hsp90 and a CyP-40-type cyclophilin in negative regulation of the heat shock response. J. Biol. Chem. 1998, v. 273, №30, p. 18974-18978.
87. Mosser D.D., Duchaine J., Massie B. The DNA-binding activity of the human heat shock transcription factor is regulated in vivo by hsp70. Mol. Cell. Biol. 1993, v. 13, № 9, p. 5427-5438.
88. Shi Y., Mosser D.D., Morimoto R.I. Molecular chaperones as HSF1 -specific transcriptional repressors. Genes Dev. 1998, v. 12, № 5, p. 654-666.
89. Satyal S.H., Chen D., Fox S.G., Kramer J.M., Morimoto R.I. Negative regulation of the heat shock transcriptional response by HSBP1. Genes Dev. 1998, v. 12, № 13, p. 19621974.
90. Wu B.J., Williams G.T., Morimoto R.I. Detection of three protein binding sites in the serum-regulated promoter of the human gene encoding the 70-kDa heat shock protein. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1987, v. 84, № 8, p. 2203-2207.
91. Yost H.J., Petersen R.B., Lindquist S. RNA metabolism: strategies for regulation in the heat shock response. Trends Genet. 1990, v. 6, № 7, p. 223-227.
92. Botzler C., Ellwart J., Gunther W., Eissner G., Multhoff G. Synergistic effects of heat and ET-18-OCH3 on membrane expression of hsp70 and lysis of leukemic K562 cells. Exp. Hematol. 1999, v. 27, № 3, p. 470-478.
93. Li Z., Menoret A., Srivastava P. Roles of heat-shock proteins in antigen presentation and cross-presentation. Curr. Opin. Immunol. 2002, v. 14, № 1, p. 45-51.
94. Millar D.G., Garza K.M., Odermatt B., Elford A.R., Ono N., Li Z., Ohashi P.S. Hsp70 promotes antigen-presenting cell function and converts T-cell tolerance to autoimmunity in vivo. Nat. Med. 2003, v. 9, № 12, p. 1469-1476.
95. Tamura Y., Peng P., Liu K., Daou M., Srivastava P.K. Immunotherapy of tumors with autologous tumor-derived heat shock protein preparations. Science 1997, v. 278, p. 117120.
96. Bukau B., Horwich A.L. The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines. Cell 1998, v. 92, № 3, p. 351-366.
97. Ito H., Okamoto K., Kato K. Enhancement of expression of stress proteins by agents that lower levels of gluthatione in cells. Biochem. Biophys. Acta. 1998, v. 1897, p. 223-230.
98. Kato K., Hasegawa K., Goto S., Inaguma Y. Dissociation as a result of phosphorylation of an aggregated form of the small stress protein, hsp27. J. Biol. Chem. 1994, v. 269, № 15, p. 11274-11278.
99. Gunther E., Walter L. Genetic aspects of the hsp70 multigene family in vertebrates. Experientia 1994, v. 50, p. 987-1001.
100. Flajnik M.F., Canel C., Kramer J., Kasahara M. Which came first, MHC class I or class II? Immunogenetics 1991, v. 33, p. 295-300.
101. Young J.C., Schneider C., Hartl F.U. In vitro evidence that hsp90 contains two independent chaperone sites. FEBS Lett. 1997, v. 418, p. 139-143.
102. Prodromou C., Roe S.M., O'Brien R., Ladbury J.E., Piper P.W., Pearl L.H. Identification and structural characterization of the ATP/ADP-binding site in the Hsp90 molecular chaperone. Cell 1997, v. 90, № 1, p. 65-75.
103. Lee-Yoon D., Easton D., Murawski M., Burd R., Subjeck J.R. Identification of a major subfamily of large hsp70-like proteins through the cloning of the mammalian 110-kDa heat shock protein. J. Biol. Chem. 1995, v. 270, № 26, p. 15725-15733.
104. Chen X., Easton D., Oh H.J., Lee-Yoon D.S., Liu X., Subjeck J. The 170 kDa glucose regulated stress protein is a large HSP70-, HSPllO-like protein of the endoplasmic reticulum. FEBS Lett. 1996, v. 380, p. 68-72.
105. Haas I.G. BiP (GRP78), an essential hsp70 resident protein in the endoplasmic reticulum. Experientia 1994, v. 50, p. 1012-1020.
106. Hartl F.U. Molecular chaperones in cellular protein folding. Nature 1996, v. 381, p. 571579.
107. Flaherty K.M., DeLuca-Flaherty C., McKay D.B. Three-dimensional structure of the ATPase fragment of a 70K heat-shock cognate protein. Nature 1990, v. 346, p. 623-628.
108. Sriram M., Osipiuk J., Freeman B., Morimoto R., Joachimiak A. Human Hsp70 molecular chaperone binds two calcium ions within the ATPase domain. Structure 1997, v. 5, №3, p. 403-414.
109. Benaroudj N., Fouchaq B., Ladjimi M.M. The COOH-terminal peptide binding domain is essential for self-association of the molecular chaperone HSC70. J. Biol. Chem. 1997, v. 272, № 13, p. 8744-8751.
110. Greene L.E., Zinner R., Naficy S., Eisenberg E. Effect of nucleotide on the binding of peptides to 70-kDa heat shock protein. J. Biol. Chem. 1995, v. 270, № 7, p. 2967-2973.
111. Takeda S., McKay D.B. Kinetics of peptide binding to the bovine 70 kDa heat shock cognate protein, a molecular chaperone. Biochemistry 1996, v. 35, № 14, p. 4636-4644.
112. Raynes D.A., Guerriero V. Isolation and characterization of isoforms of HspBPl, inhibitors of Hsp70. Biochim. Biophys. Acta 2000, v. 1490, p. 203-207.
113. Raynes D.A., Guerriero V. Inhibition of Hsp70 ATPase activity and protein renaturation by a novel Hsp70-binding protein. J. Biol. Chem. 1998, v. 273, № 49, p. 32883-32888.
114. McLellan C.A., Raynes D.A., Guerriero V. HspBPl, an Hsp70 cochaperone, has two structural domains and is capable of altering the conformation of the Hsp70 ATPase domain. J. Biol. Chem. 2003, v. 278, № 21, p. 19017-19022.
115. McCarty J.S., Walker G.C. DnaK as a thermometer: threonine-199 is site of autophosphorylation and is critical for ATPase activity. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1991, v. 88, №21, p. 9513-9517.
116. Park H.S., Lee J.S., Huh S.H., Seo J.S., Choi E.J. Hsp72 functions as a natural inhibitory protein of c-Jun N-terminal kinase. EMBO J. 2001, v. 20, № 3, p. 446-456.
117. Marshall O.J., Harley V.R. Identification of an interaction between SOX9 and HSP70. FEBS Lett. 2001, v. 496, 75-80.
118. Multhoff G., Pfister K., Gehrmann M., Hantschel M., Gross C., Hafner M., Hiddemann W. A 14-mer Hsp70 peptide stimulates natural killer (NK) cell activity. Cell Stress Chaperones 2001,v. 6, № 4, 337-344.
119. Jaattela M., Wissing D., Bauer P.A., Li G.C. Major heat shock protein hsp70 protects tumor cells from tumor necrosis factor cytotoxicity. EMBO J. 1992, v. 11, p. 3507-3512.
120. Gabai V.L., Meriin A.B., Mosser D.D., Caron A.W., Rits S., Shifrin V.I., Sherman M.Y. Hsp70 prevents activation of stress kinases. A novel pathway of cellular thermotolerance. J. Biol. Chem. 1997, v. 272, № 29, p. 18033-18037.
121. Feinstein D.L., Galea E., Aquino D.A., Li G.C., Xu H., Reis D.J. Heat shock protein 70 suppresses astroglial-inducible nitric-oxide synthase expression by decreasing NF-kB activation. J. Biol. Chem. 1996, v. 271, № 30, p. 17724-17732.
122. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970, 227. p. 680-685.
123. Maniatis T., Fritsch E. F., Sambrook J. J. Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1982.
124. Vanhaesebroeck B., Bladel S.V., Leanarts A., Suffys P., Beyaert R., Lucas R., Roy F.V., Fiers W. Two discrete types of tumor necrosis factor-resistant cells derived from the same cell line. Cancer research 1991, v. 51, p. 2469-2477.
125. Dressel R., Eisner L., Quentin T., Walter L., Gunther E. Heat shock protein 70 is able to prevent heat shock-induced resistance of target cells to CTL. J. Immunol. 2000,v. 164, №5, p. 2362-2371.
126. Hayakawa M., Jayadev S., Tsujimoto M., Hannun Y.A., Ito F. Role of ceramide in stimulation of the transcription of cytosolic phospholipase A2 and cyclooxygenase 2. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996, v. 220, p. 681-686.
127. Wilbanks S.M., Chen L., Tsuruta H., Hodgson K.O., McKay D.B. Solution small-angle
128. X-ray scattering study of the molecular chaperone Hsc70 and its subfragments. Biochemistry 1995, v. 34, 38, 12095-12106.
129. Киселев С.Л., Ларин С.С., Гнучев Н.В., Георгиев Г.П. Ген tag7 и генотерапия рака. Генетика 2000, т. 36, № 11, стр. 1431-1435.
-
Шаталов, Юрий Викторович
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2004
-
ВАК 03.00.03
- Молекулярные механизмы цитолитического действия лимфокин-активированных киллеров
- Молекулярные механизмы цитолитического действия лимфоцитов человека и животных в противоопухолевом иммунитете
- Белки растворимого цитотоксического фактора естественных киллеров и их функциональное значение в цитолитическом процессе
- Сравнительная характеристика цитотоксических белков и апоптотических процессов в клетках лимфоидной и нелимфоидной природы
- Характеристика процессов, регулирующих цитолитическое действие лимфокин-активированных киллеров
