Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новая многоспоровая анаэробная бактерия ANAEROBACTER POLYENDOSPORUS gen. et spec. nov.

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Новая многоспоровая анаэробная бактерия ANAEROBACTER POLYENDOSPORUS gen. et spec. nov."

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи УДК 579. 23+579. 24. 4

МУШЕГЯН Марианна Саркисовна

НОВАЯ ШОГОСПОРОВАЯ АНАЭРОБНАЯ БАКТЕРИЯ- ANAEROBACTER POLYENDOSPORUS gen. et spec. rrav.

Специальность 03. 00.07. - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1991

Работа выполнена в лаборатории цитологии микроорганизмов Института микробиологии АН СССР.

Научный руководитель: доктор биологических наук Е Я Дуда

Официальные оппоненты: чл.-корр. АН СССР Л. В. Калакуцкий,

доктор биологических наук Е Т. Емцев

Ведущая организация: Московский государственный универси-

тет, кафедра микробиологии.

Защита состоится " г. - в /^час.^¿Ът.

на заседании Специализированного совета Д. 002.64.01 при Институте Микробиологии АН СССР по адресу 117811, г.Москва, проспект 60-летия Октября, 7, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии АН СССР

Автореферат разослан "/ff" оЗ^ёхц.991 г.

Ученый секретарь

Специализированного совета, л- /

кандидат биологических наук/^^-г^^-^Л^. Никитин

Актуальность теш. Спорообразующие бактерии широко используются в настоящее время в интенсивных исследованиях по выяснению закономерностей клеточной дифференцировки и онтогенеза у микроорганизмов. Комплексное изучение эндогенного епоро-I образования с помощью методов цитологии, физиологии, биохимии, молекулярной генетики показало, что этот процесс является сложным и уникальным типом клеточной дифференцировки прокариот (Калакуцкий,Агре,1977; Дуда,i979;Gould,Dring,1979). Его регуляция осуществляется на уровне транскрипции, трансляции и посттрансляционной модификации. Специфической характеристикой эндогенного спорообразования как особого типа клеточной дифференцировки, является процесс "поглощения" одной клетки (дочерней) другой (материнской), в результате чего образуется проспора.

.До настоящего времени общепринятым является положение о том, что бактерии способны образовывать только по одной споре в клетке. Однако, имеются сообщения, что у некоторых видов }шэстридий часть клеток способна формировать по две споры( Дуда, 1982;Horn,1987). Принципиально важным с точки зрения биологии прокариотной клетки представляется выяснение вопроса о возможности образования в одной клетке более двух эндоспор.

В связи с этим ЦЕЛЬ работы заключалась в комплексной характеристике цитологических и физиолого-биохимических свойств новой анаэробной бактерии, образующей до пяти спор в клетке и получение доказательств того, что споры этой бактерии можно отнести к типичным бактериальным эндоспорам.

Конкретно ЗАДАЧИ исследования состояли в следующем:

1. Получить чистую культуру многоспоровой бактерии.

2. Выяснить возможность и условия образования нескольких эндоспор в одной клеткб.

3. Охарактеризовать цитологические и физиолого-биохимические свойства новой епорообразующей бактерии.

4.. Изучить цитологию спорообразования и выяснить характерные свойства эндоспор новой бактерии.

5. Определить систематическое положение многоспоровой бактерии.

Научная ценность и новизна Впервые выявлена способность образования нескольких (более 2-х) спор в одной бактериальной клетке, что позволяет пересмотреть имеющееся в микробиологии положение о том, что эндогенное спорообразование не может

рассматриваться как процесс размножения у бактерий.

Установлено, что кромё способности образовывать по несколько эндоспор в клетке (до 5-7-ми) (полиспорогенеза), который связан с образованием в культурах крупных многоядерных клеток, бактерия отличается от известных хемоорганотрофных анаэробных бактерий рода Clostridium следующими существенными свойствами: 1)крупными размерами кдеток(до 3-4 мкм по толщине и 4-8 мкм в длину) 2)модификацией в последовательности нуклеотидов 5 Sp РНК; 3) отсутствием потребности в витаминах для роста

На основании полученных данных бактерия выделена в новый род и вид- Anaerobacter polyendosporus gen. end sp. nov.

Результаты выполненных исследований расширяют представление о разнообразии спорообразующих бактерий и особенностях биологии прокариотной клетки.

Практическая ценность исследования. Полученные данные могут быть использованы с целью поиска и выделения новых форм . микроорганизмов, в частности-но?ых видов многоспоровых бактерий, а также в лекциях по микробиологии для студентов ВУЗ'ов.Выделенная культура- А. polyendosporus (PS-1) может слу- , нить объектом в исследованиях по регуляции спорообразования, биологии и эволюции анаэробных бактерий.

Апробация работы. Материалы диссертации были изложены на Всесоюзной конференции "Пути совершенствования микробиологической борьбы с вредными насекомыми и болезнями расте-ний'Чг. Велегож,1986), на Международном микробиологическом конгрессе (г. Манчестер,1986), на Всесоюзной конференции "Структурно-функциональная организации клеток микроорганиз-мов'Ч г. Пущино, 1987). Материалы работы получили 1-ую премию на конкурсе научных работ Института микробиологии АН СССР (г. Шсква,1986).

Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в четырех публикациях.

ООьем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов и списка литературы. Натериалы из-, долены на 102 страницах машинописного текста, включая 6 таблиц и 21 рисунок. Список литературы содержит 34 отечественных и 112 иностранных наименований работ. '•'■

- з -

Место проведения работы. Работа проводилась в Институте микробологии АН СССР в лаборатории цитологии микроорганизмов (заведующий-доктор биологических наук В.И. Дуда). Часть работы проводилась совместно с к. б. н. Лебединским А. В., научным сотрудником Митюшиной Л. JL , к. б. н. Поглазовой М. Н., к. б. н. Машков-цевой А. В., д. б. н. Чумаковым К. М.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Объекты и методы исследования. В настоящей работе главным объектом исследования являлся штамм PS-1, выделенный из лугово-глеевой почвы под рисом (Бирма) и отнесенный к новому роду и виду- Anaerobacter polyendosporus.

.Бактерию культивировали на картофельном агаре и на синтетической плотной или жидкой среде (Pfennig,1965), содержащей следующие компоненты (г/л дистиллированной воды): КН^РО^-О.ЗЗ; NH^Cl-0,33: KfeClax 2Нг0-0,33; СаС^хбНцр-О.ЗЗ; KCl-0,33; NaKCOj -1,5; раствор микроэлементов ( Pfennig, Lippert,1966) - 1 мл, и для плотных сред, агар - 20 г. Органические субстраты (1-4г/л) добавляли или перед автоклавированием. или в виде стерилизованных фильтрованием растворов.

■ Культивирование проводили в чашках или пробирках с ватными пробками (объем среды 5 мл), помещенными в анаэроста-ты, из которых вакуумным насосом откачивали воздух ( и иногда заполняли чистым N^).

Посев на плотные и жидкие среды проводили на воздухе. В случае, если инокулят состоял из спор,анаэробные условия не были необходимы. Пересев вегетативными клетками на воздухе возможен при добавлении в с^еду, ■ используемую для культивирования, 0,04% тиогликоляга Na или 0,2% Na^SxSHgO.

Среду автоклавировали как под атмосферой СО^, так и в аэробных условиях. Но в аэробном варианте происходило разложение бикарбоната и выпадение его в осадок. Для того, чтобы этого избежать, бикарбонат автоклавировали отдельно в виде сконцентрированного в 100 раз раствора в герметично закрытом флаконе. •После откачки воздуха из анаэростатов, растворенная углекислота улетучивалась из среды, и рН становился равным 7,2- 7,4. Для

оценки роста при различных значениях рН среду готовили без бикарбоната, а затем в пробирки с 5 мл среды добавляли по 0,5 мл 0.5М стерильного буферного раствора. В качестве буферов использовали: Na^POij-KH^PO^; трис-HCl-лимонная кислота- Na^HPOi, или З-(Н-морфолино)- пропансульфоновая кислота-NaQH с различными значениями рН. В ряде случаев, бактерии выращивали в пробирках Хангейта с герметично завинчивающимися колпачками ("Bélico", США) в атмосфере N^. Для определения образования СО^ готовили среду с Na^HPO^ вместо NaHCOj.

Проточное культивирование осуществляли в ферментере "Bíutec" (Швеция). Скорость перемешивания среды 100 об/мин, анаэробные условия создавали добавлением к «основной среде Щеннига, содержащей 0.1Z глюкозы, Na^xgHgO (200 мг/мл) и ре-зазурина (5 мг/л). Атмосферой в ферментере и в колбе с -питательной средой был чистый Na.

Культивирование обычно вели при 28?С. Споры хранили при 4? С на среде роста(в жидкой или плотной) в анаэробных условиях.

Биохимические тесты выполняли, используя методы, описанные Герхардом с соавт. (1984). В ряде случаев, когда на средах, рекомендуемых для определения тех или иных реакций, не было роста, добавляли углеводы (1г/л) или модифицировали предложенные среды, чтобы обеспечить рост и определить реакцию.

Так, состав сред и методика определения были строго соблюдены при постановке тестов на образование индола и сероводорода А в случаях определения липазной и лецитиназной активности вместо предложенного желточного агара (Герхард с соавт., 1984) использовали картофельный агар' или исходную (базовую) агаризованную среду Пфеннига с О,IX глюкозы, 10% пептона и яичного желтка.

Нитрат и нитрит определяли по Николасу и Насону (Nicholas, Nason, 1957).

NHj¡" определяли с реактивом Несслера (Хомченко, 1961). Нами было установлено, что редуцирующие сахара мешают определению по этому методу ( в их присутствии образовывались кир-пично-красные хлопья). В связи с этим в опытах, где необходимо было определять NHij, в качестве субстратов роста использовали

маннит и сахарозу, у которых отсутствуют свободные редуцирующие группы.

Определение азотфиксирующей активности культуры проводили при помощи ацетиленового метода (Калининская с соавт., 1973).

Определение содержания дипиколиновой кислоты в спорах проводили колориметрическим методом (Janssen et al., 1958).

Летучие жирные кислоты, и спирты определяли, используя газовый хроматограф JIXM-8 МД-б (СССР) с пламенно-ионизационным детектором. Стеклянную колонку длиной 2 м и внутренним диаметром 3 мм набивали хромосорбом 101 (100-120 меш). N^ использовали в качестве газа-носителя со скоростью протока 43мл/мин. Перед введением в хроматограф образцы подкисляли HCl до pH 1-2. Температура колонок детектора - 200'С, а испарителя - 240ГС. Лактат определяли энзиматически с лактат-дегидрогеназой и НАД (Bergmeyer, 1965).

Для анализа газообразных продуктов обмена (метаболизма) использовали газовый хроматограф с катарометром.как детектором. Для определения Н^ использовали колонку длиной 1,5 м и внутренним диаметром 3 мм, набитую молекулярным ситом 13х, газ-носитель-аргон, скорость протока которого - 50 мл/мин.

При определении С0Л использовали колонку той же длины и диаметра, набитую Пропаком Q, в качестве газа-носителя служил водород со скоростью протока 40 мл/мин.

Цитохромы в клетках восстанавливали дитионитом и исследовались с помощью дифференциального спектрофотометра. В кюветах сравнения содержались клеточные суспензии с цитохромамл, окисленными феррицианидами.

Шрфологию и ультраструктурную организацию клеток, прорастание спор бактерии "исследовали с помощью фазово-контрастной, люминесцентной микроскопии и электронной микроскопии (ультратонкие срезы).

Для люминесцентного микроскопирования применяли прижизненную окраску акридиновым оранжевым (1:20 ООО - 1:50 ООО) и окраску фиксированных препаратов реактивом Дапи (Otto, Tson, 1985; Stokke, Steen, 1986)', являющегося специфическим.красителем для ДНК. Хроматиновое вещество в препаратах для световой микроскопии окрашивали также по методу Гимза.'

Для электронного микроскопирования образцы фиксировали по методу Ритер с соавторами (Ryter et al. , 1958) и ■ заливали в аралдит. Ультратонкие срезы контрастировали цитратом свинца по Рейнольдсу (Reynolds, 1963). Полисахариды окрашивали рутениевым красным (Luft, 1986). Удьтратонкие срезы просматривали в электронном микроскопе JEM - 100С при ускоряющем напряжении 80 КВ.

Хромосомную ДНК выделяли и очищали по методу Ыармура (Мапшг, 1961). Нуклеотидный состав ДНК определяли методом термоденатурации (Marrnur, Doty, 1962). размер генома рассчитывали по кинетике 'оптической реасеоциации (Gillis et al., 1970).

Определение последовательности нуклеотидов 5S рРНК после предварительной экстракции (Чумаков, 1979), нанесения 'метки (England, Uhlenbeck, 1978) и фракционирования (Ыаниатис и др., 1984) проводили по методу Петиса (Pettis, 1979).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ .

1. Выделение бактерии

При рассеве суспензий лугово-глеевой почвы на картофельную среду для анаэробов была обнаружена бактерия, клетки которой отличались крупными размерами овальной или шаровидной формы. Шсле пересева на картофельный агар без добавления глхкоэы и других необходимых факторов роста, у этой культуры (штамм PS-1), обнаружилась способность образовывать несколько спор в одной клетке.

С целью получения чистой культуры и определения оптимальной среды для роста и развития были 'испытаны среды разного состава и различные условия культивирования. Установлено, что исследованная бактерия хорошо развивается на среде Пфеннига без добавления факторов роста при pH - 7,2 и на картофельном агаре, также без всяких добавок. Шсле многократных рассевов (культура была загрязнена плектридиальными формами), была получена на подобранных средах чистая культура штамма PS-1. Чистые культуры получены также при высеве в среды суспензии спор, прогретых при 75fC в течении 15-20 мин.

2. Культуральные признаки штамма PS-1

На поверхности плотной среды бактерия образует крупные (до 5 мм в диаметре) круглые, непрозрачные, коричневато-белые, слизистые, слегка выпуклые колонии с ровными краями. При длительном инкубировании культуры на колониях наблюдается вторичный рост с образованием мелких беловато-бежевых колоний.

Рост на жидкой среде, содержащей галактозу, происходит в виде пленки на дне пробирки.. В жидкой среде с другими углеводами бактерия РБ-1 образует суспензию с гомогенной мутностью. После наступления стационарной фазы клетки оседают, культураль-ная жидкость становится прозрачной, образуется легко взмучиваемый белый осадок.

3. Морфология вегетативных и спорулирующих клеток штамма РЗ-1

Форма клеток изменчива и зависит от условий роста. Выделяются два основных морфологических типа: 1) толстые палочки (1,5-2,Ох 4-8 мкм) с закругленными концами, которые на ранней стадии развития соединены в цепочки. При споруляции такие клетки образуют одну или две субтерминальные споры на противоположных полюсах. Перед споруляцией эти палочки незначительно утолщаются , особенно в середине (2-3 мкм), но овальными не становятся; 2) овальные, лимоновидные (3-4 х 4-8 мкм) или сферические (<3=4-6 мкм) клетки. При споруляции они образуют от одной до пяти-шести спор.

Первый морфотип характерен для роста на жидкой среде, содержащей углеводы иные, чем галактоза.

Второй морфотип характерен для роста на плотных средах или на жидкой минеральной среде с галактозой.

При росте в неоптималъных условиях, например при температуре 40-45?С, характерно ' формирование длинных палочек (1,5-2,0x10-20 мкм), часто изогнутых или неравномерно раздутых. Эти клетки редко образуют споры, и причем, не больше одной споры в клетке.

Вегетативные клетки неподвижны на всех стадиях роста культур. При микроскопировании в обычном световом и фазо-во-контрастном микроскопе различима рефрактильная капсула, в цитоплазме отсутствуют включения. Из-за диф$узно распределенного иодофильного полисахарида цитоплазма равномерно окрашивается

йодом.

4. Ультраструктурная организация

клеток штамма PS-1

Анализ ультратонких срезов свидетельствует о прокариотной природе клеток штамма PS-1. Их ядерное вещество организовано в виде нуклеоплазмы, не ограниченной ядерной мембраной. На ультратонких срезах можно различить нукдеоид, имеющий вид "хрома-тиновой" сеточки. В проспорах четко различима типичная ядерная зона, заполненная фибриллярными и гранулярными структурами.

В цитоплазме отсутствуют включения, кроме рибосом и мел-• ких мезосомоподобных структур.

По строению клеточной стенки бактерия относится к Оирми-кутным. Положительно окрашивается по Граму. .Клеточная стенка чувствительна к действию лизоцима и на срезах имеет вид одного электронноплотного слоя, толщина которого варьирует от 30 до 50 нм. Рост бактерии ингибируется пенициллином при концентрации 1 иг/л.

Цитоплазма вегетативных клеток PS-1 слабо контрастируется электронно-микроскопическими "красителями". Очевидно, это объясняется диффузно-распределенным по всей цитоплазме полисахаридом, плохо контрастирующимся. красителями. У клостридий,как известно, запасный полисахарид концентрируется в цитоплазме в виде электронно-прозрачных гранул (Дуда, Ыакарьева, 1977).

Вблизи формирующихся клеточных перегородок иногда наблюдаются мезосомоподобные структуры пластинчатой формы. В других же случаях, мезосомальные структуры, имели вид клубочков, локализованных по периферии цитоплазмы.

5. Цитология спорообразования и тонкого строения

спор бактерии PS-1

Под фазово-контрастным микроскопом в клетках бактерии PS-1 перед споруляцией отчетливо различаются нуклеоиды в виде прозрачных светлых телец, количество которых на этой стадии может достигать до 6-7 на клетку и более. Они относительно легко выявляются, так как под люминесцентным микроскопом после прижизненной окраски акридиновым оранжевым светятся зеленым светом.

В клетках из культур, выращенных на глюкозосодержшцэй сре-' де, и приступающих к спорообразованию на 4 сутки роста, при ок-

раске фиксированных препаратов реактивом Дали, нуклеоиды имеют гантелеобразную, овальную, полусферическую форму и располагаются, в основном, вдоль мембраны. Их количество достигает 3-4 на клетку. В клетках, выращенных на галактозосодержа-щей среде, нуклеоиды.чечевицеобразной или палочковидной формы, до 5-6 и более на клетку.

У этой бактерии отсутствуют включения в цитоплазме, помимо полисахарида; кроме того, на стадии спорообразования, цитоплазма оптически-менее плотная, чем у неспорулирующих вегетативных клеток. .

Массовое спорообразование у бактерии РЗ-1 наступает на четвертые сутки при культивировании на жидкой среде Пфеннига в непроточных культурах, в условиях лимитации бактерии источником углерода и энергии (содержание углеводов О,1-0,22). Спорулирует 90-100% клеток. Та же картина наблюдается при росте на агаризо-ванной среде Пфеннига с добавлением 0,1-0,2% углеводов. При культивировании на картофельном агаре массовое спорообразование наступает на б-? сутки роста бактерии, что, очевидно, связано со слабой способностью штамма усваивать крахмал. Подробное электронно-микроскопическое изучение показало, что процесс спорообразования у бактерии РЗ-1 осуществляется тем же клеточным механизмом, который свойственен бациллам и клостридиям (Дуда, 1982). Однако, образование осевого хроматинового тяжа нами не наблюдалось.

В клетках, формирующих по 5-6 спор,' перед споруляцией происходит образование многочисленных мембранных септ - явление, не наблюдавшееся при размножении неспорулирующих клеток бактерии. Множественные септы, закладываются одновременно, локализуясь в различных участках клетки. Никогда не наблюдалось последовательного формирования септ и предспор на одном и том же полюсе либо боковом участке клетки.

Таким образом, на клеточных полюсах и аполярно начинается формирование темных (в фазово-контрастном микросколе) преспор. После завершения процесса епка1Гтеп1 они отходят от мембраны вглубь клетки и образуется проспора, кортеж, покровы и экзос-пориум. Закладка покровов и кортекса происходит почти одновременно. Кортекс на срезах имеет вид массивного электронно-проз-

рачного слоя толщиной около 200 нм. Над кортексом располагаются покровы, состоящие из чередующихся электронно-плотных и электронно-прозрачных слоев. На срезах у зрелой споры выявляются три основных слоя: внешний, средний и внутренний. Толщина покровов у бактерии PS-1 составляет от 50 до 90 нм.

После закладки кортекса и покровов в моно- и диспоровых вариантах происходит формирование экзоспориума. Экзоспориум имеет вид прерывистой многослойной, пластинчатой структуры. Спора свободно располагается внутри экзоспориума, соединяясь с ним в некоторых участках. Толщина экзоспориума - 100-130 нм. Величина нуклеоида в спорах около 1000 нм. Прорастание спор у бактерии PS-1 происходит по иному типу, чем у Clostridium. Здесь, в отличии от клостридий, клетка не не выходит через ростовое отверстие, а происходит, разрушение споровых покровов по всей периферии. Последовательность цитологических изменений при спорообразовании схематически показана на рис.1.

Споры штамма PS-1 по своему строению являются типичными бактериальными эндоспорами. Под фазово-контрастным микроскопом они представляют собой рефрактерные тельца сферической (d=l или 1,2 мкм) или овальной (1,5x2,0 мкм)формы, содержат дипико-линовую кислоту (30 мг на грамм сухого веса), термоустойчивы. После 10-ти минутного прогревания при 80.*С число жизнеспособных клеток не изменялось, но при прогревании в течении 15 мин. при 90?С число жизнеспособных спор уменьшалось на четыре порядка.

Как было упомянуто выше, форма и число спор связаны с величиной и формой материнских клеток, которые, соответственно, изменяются в зависимости от условий ' культивирования. Так как рост в жидкой галактоэо-содержащей среде происходит в виде пленки - сгустка клеток на дне пробирок, можно сделать вывод, что многоспоровость, в данном случае, может быть связана с усилением взаимодействия между клетками.

Данные гю процентному соотношению клеток (спорангиев) с различным количеством спор, выращенных на используемых для культивирования средах, представлены на табл.1.

Рис. 1

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ СПОРООБРАЗОВАНИЯ У БАЦИЛЛ, КЛОСТРИДИЙ СI И А. Р01УЕЮ05Р0Я1Е ( III ); ( стадии спорообразования

тнЗран

3

1-7).

Карте ке

1 и

ж щ

Ъкьосяо-

'/■"У

)

' /г

II

III

ТнОмица 1.

Процент клеток с различным числом спор в культурах,выращенных на различных средах (время культивации 5 суток)

Число спор! __% клеток_>.

_Х клеток содержащих.

35-50 9-38

н

клетках ! неспорули-! 1 спору ! 2 споры ! 3 споры I 4 споры ! 5 спор ! 6 спор Использу-\^ ! рующих ? * I I I *

емая среда ^_!_(_?_!_ ? !

синтетическая

среда Пфеннига 1,0-3,0 ■ 24-40 +0.1Х глюкозы

н

ГО I

синтетическая среда Пфеннига +0, IX' галактозы

0,7-3,0

7,1-17

24-67

15-55 0,2-10

0,5 0,5

Картофельный агар

1,0-2,0

10-30

29-50

28-40

6. Дизиолого-биохимические свойства ' бактерии РЭ-1

Бактерия Р5-1 является хемоорганотрофным облигатным анаэробом, обладающим некоторой степенью аэротолерантности. Растет без редукгонов на плотных средах в анаэробных условиях или при р0г-0,005 атм. После роста при р0л-0,005 атм. иногда обнаруживается слабая каталазная активность. Нэ растет при р0а«0,01 атм. Споры, высеянные на поверхность плотной среды, в этих условиях не прорастают, но'остаются жизнеспособными.

Бактерия РЭ-1 является нейтрофилом и мезофилом. Рост возможен в пределах рН-5,5-8,5 (оптимум рН-6,5-7,5) и в температурном диапазоне от 15 до.4бГс при ортимуме 25-35."С.

Максимальная оптическая плотность при росте на среде Щеннига, содержащей 0,1 и О, АХ глюкозы, соответственно равна 0,42 и 0,69. А в среде с 0,1 и О,4Х галактозы- 0,30 и 0,60, при длине волны £ - 600 нм.

Субстратами, поддерживающими рост, являются лактат Ма и ряд углеводов. При росте бактерии на картофельном агаре наблюдается слабое разложение крахмала. На средах Пфеннига, содержащих спирты, органические кислоты, казеиновый гидролизат, роста не происходит! Не было роста и в минеральной среде в атмосфере Н,+С01 (80:20)1

Время удвоения клеток в жидкой синтетической'среде, содержащей глюкозу, составляет около двух часов.

Продукты брожения глюкозы включают этанол, ацетат, лактат, бутират, бутанол, Н^ и СОд.

Бактерия РБ-1 не разжижает желатин, не образует 1^55 из пептона и тиосульфата, и индол из триптофана. Не продуцирует липазу, лецитиназу и уреазу.

Бактерия способна к азотфиксации, хорошо пересевается на безазотистой среде. За время роста фиксируется 1 мкг азота на 1 мл культуры ( 0,5 мкг на 1 мг потребленной глюкозы). .

Нитрат и нитрит используются как единственные источники азота При росте с НаШл(0,7 г/л) большая часть восстановленного нитрита накапливается в среде в виде Таким образом, нитрит не только ассимилируется, но таюяе служит акцептором

электронов. Однако, в наших опытах не наблюдалось стимуляции роста нитритом. Причина этого, очевидно, в токсическом влиянии нитрита в концентрациях, применяемых в опытах с непроточными культурами (O'Leary, Solberg, 1976; Rake, Eagon, 1980).

Во время роста на среде с KNOj (2г/л) ни нитрит, ни аммоний не накапливаются в ростовой среде. Весь восстановленный нитрат ассимилируется клетками. Таким образом, нитрат толькс ассимилируется,'но не используется как акцептор электронов.

Недавно было установлено, что многие организмы, осушест-вмяшя диссимлляционное восстановление NO3 до Nвключат клостридии, способны к дальнейшему диссимиляционному восстановлению нитрита (Cole,Brown, 1980; Keith et al., 1982). Бактерия РЗ-1 способна к диссимиляционному восстановлению нитрита, но не нитрата до NhJ и к ассимиляционному восстановлению нитрита i нитрата. Такое своеобразное сочетание свойств никогда раньше не было описано у других организмов. Очевидно, нитрат-редуктазг штамма РЗ-1 регулируется таким образом, что не может образовывать нитрит в количествах, превышающих ассимиляторные потребности.

Можно было ■ бы предположить, что бактерия РЗ-1 в присутствии акцептора электронов (нитрита) будет ■ способна использовать более широкий спектр субстратов, чем в его отсутствие (такое явление хорошо известно для сульфатредуциру-ших бактерий). Но наши исследования показали, что спектр субстратов, поддерживающих рост штамма PS-1, не меняются в присутствии нитрита.

Цитохромы не участвуют в транспорте электронов к нитриту. Они не обнаруживаются в клетках, выращенных с нитритом и без н-.то.

Данные по морфологическим и физиолого-биохимическим свойс 7ßим бактерии РЗ-1 представлены в таблице 2.

В. Генотиническая характеристика бактерии PS-1

Нукяеотидный состав ДНК, изученный методом термоденатура-

составляет £9 мол!.

F;t-3MOjg?_гвномз равен 2,9x10? дальтен и сопоставим с клост-риди&тьным.

Таблица 2.

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И ФИЗИОЛОГО- БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИИ РЗ-1

1. Окраска по Граму

2. Форма и раамер вегетативных

3. Споры: форма размер

4. Включение запасных веществ в клетках

5. Отношение к кислороду

6. Образование: каталазы цитохромов

7. Редукция нитритов

8. Усвоение углеводов с образованием кислоты:

Аыигдалин

Положительная Толстые палочки (1,5-2x4-8 мкм) или овальные и сферические (с1-4-8 мкм) клетки в зависимости от условий роста, овальные или круглые («1-1,5-1,2 мкм), (1,5х2,0мкм)

гранулеза

Облигатный анаэроб, умеренно аэротолерантный, растет на плотной среде при рОд^З.ООбатм.

Арабиноза

Целлобиоза

Дульцит

Эскулин

Зруктоза

Галактоза

Глюкоза

но

но +

+ +

Манноза + Мелицитоза но Мелибиоза но Рафиноаа + Рамноза — Рибоза — Салицин * Сорбит +

Продолжение табл. 2

Гликоген — Сорбоза —

Инозит — Крахмал —

Инулин + Сахароза +

Лактоза — Трегалоза +

Мальтоза + Ксилоза +

Ыаннит + Целлюлоза —•

9, Использование органических кислот, спиртов, кетонов

Лактат +

Казеиновый гидролизат —

Метанол —

Этанол —

Вутанол —

Ацетон —

Формиат —

Ацетат .—

Бутират —

Цитрат . —

Сукцинат ~

10. Цродукты брожения углеводов

Ацетат ' +

Лактат +

Бутират +

Этанол *

Бутанол +

11.Гидролиз Еелатина

Казеина ~ Крахмала

Гликогена ~

Целлюлозы ~

Пектина ~

12, Образование:

Индола (из триптофана) ' ~

Сероводорода (на среде с пептоном) —

Продолжение табд.2

Липазы

Лецитиназы

13. Температура роста

оптимум

14. Диапазон рН

15. ГЦ в ДНК

16. Размер генома

25-35?С 6,5-7,5 29 мол* 2,9x10;*

дальтон

9. Систематическое положение многоспоровой бактерии

Сравнение штамма PS-1 со свойствами представителей родов спорообразуюцих бактерий;, описанных,в литературе, показывает, что бактерия PS-1 значительно отличается от них по морфологии и циклу развития. Уокно отметить некоторое внешнее сходство между вторым морфотипом клеток PS-1 и наблюдавшимися в кишечнике морских свинок бактериоподобным организмом Metabactertum.

Однако сделать .какие-либо выводы из этого невозможно из-за отсутствия данных по физиолого-биохимической и более подробной цитологической характеристике Metabacterium. Физиологические свойства штамма PS-1 близки к таковым сахаролити-ческих клостридий (см. табл. 2).

Бактерия PS-1 отличается от клостридий способностью давать крупные клетки почти сферической формы, образующие' по несколько эндоспор в одном спорангии. - Кроме того, она обладает такими необычными для клостридий свойствами, как отсутствие потребности в факторах роста и наличие в клетках диффузно распределенного полисахарида Необычными являются также свойства клеточной стенки штамма PS-1, которая на срезах имеет волнистую поверхность' и может образовывать вместе с цитоплазмой простековидные выросты. Одновременное образование этанола, бутирата и бутано-ла, характерные для штамма PS-1, является редким свойством для протеолнтических клостридий, никогда не отмечавшимися, у их са-харолитических представителей ( Holdeman, Moore, 1973;Smith, Hobbs,1974).

Виды рода Clostridium весьма существенно различаются иеяду собой фенотипически, а модекудярно-биохимические критерии сви-

детельствуюг о давности их расхождения друг от друга. Таким образом, род Clostridium является обширным и гетерогенным и, по-видимому, должен быть разделен на несколько более компактных родов. Однако провести такое разделение пока невозможно, так как система, построенная на основе традиционно принятых в систематике этого рода признаков не коррелирует с разделением клостридиев по молекулярно-биологическим критериям (Johnson, Francis, 1975). Даже, группа сахаролитических клостридий является искусственной с филогенетической точки зрения.

Отсутствие фенотилических признаков, пригодных для выяснения филогенетических отношений клостридий, &атрудняет сравнение степени филогенетической близости бактерии PS-1 с теми или иными видами рода Clostridium.

Методом секвенирования 5S рРКК было показано, что бактерия PS-1 является отдаленным родственником филогенетической ветви клостридий,. включающей С. butyrlcum и С. pasterlanurn.

Несмотря на то, что бактерия PS-1, судя по молекулярно-биологическим критериям близка к клостридиям, а также по фенотипу формально соответствует определению рода Clostridium (анаэробные спорообразующие бактерии, нэ способйые к диссимиляционной сульфатредукции), мы сочли возможным выделить ее в новый род и вид Anaerobacter polyendosporus gen nov. sp. nov. по следующим соображениям: 1) бактерия PS-1 филогенетически достаточно далека от типового вида рода Clostridium - С. butyricum и других клостридиев, исследованных методом секвенирования 5S рРНК; 2) бактерия PS-1 обладает рядом уникальных фенотилических свойств, наиболее важным из ' которых является способность образовывать несколько эндоспор в одной клетке, полиспорогенез никогда не наблюдался у "обычных" спорообразующих бактерий и их мутантов, и,по-видимому, отражает значительное своеобразие генома или его регуляции. Более того, образование несколько эндоспор в одной клетке может иметь важный экологический смысл. Так как у бактерии PS-1 сиоруляция происходит при исчерпании энергетического субстрата в среде, этот процесс можно рассматривать как своеобразную экологическую стратегию - размножение в неблагоприятных условиях. Мы сочли обоснованным включение в описание рода AmiCTobacter такие свойства, как отсутствие потребности в фак-

- 19 -

торах роста (ауксотрофность) и способность к азотфиксацим.

Типовой штамм РЗ-1 передан во Всесоюзную коллекцию микроорганизмов/ где он получил обозначение ВКМ В-1724 и в Американскую коллекцию типовых культур (АТСС), под номером АТСС-49043.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, впервые удалось выделить из почвы, поддерживать на лабораторных средах и получить чистую культуру бактерий,• способных как правило образовывать от двух до пяти (редко - 7) эндоспор в одной клетке. Принципиально важным является доказательство формирования более двух эндоспор в одном спорангии, так как двуспоровый вариант развития, встречающийся у клостридиев, можно было бы рассматривать, как некоторое исключение из нормы, обусловленное "сбоем" в делении предшествующей спорогенной клетки, потенциально способной поделиться и сформировать по одной споре в двух дочерних клетках. В случае формирования трех-пяти спор у А. ро1уепсЭозрогиз происходит переход от двуполярной системы (Стрешинский, 1955, НИсЫпз, 1975) к многополярной.

При этом палочковидные клетки превращаются в крупные шаровидные. форш с многими полюсами - центрами формирования спорогенных зон и проспор. В' этих участках клетки ( по периферии в области ЦШ) локализуются множественные "споровые" нукле-оиды. Крайне интересным является факт стадийной синхронности полиспорогенеза- все споры одновременно закладываются и практически одновременно проходят последующие этапы формирования -стадии: "поглощения", образования кортекса, покровов, экзоспориума, созревания и лизиса цитоплазмы материнской клетки. Такие споры'дифференцируется на однополюсных и разнополюсных "близнецов". Однополюсные "близнецы" более сходны между собой ( но не полностью идентичны) по морфологии, размерам и тонкому строению клеточных структур. Таким образом, А. ро1уепсЗозрогиз «окно использовать как ¡.сдельный организм для изучения индивидуальной биологической разнокачестзенности спор-"близнецов".

По-видимому, асинхронность формирования нескольких спор в одной клетке исключается в связи с кеизОзнкостью разрегулирования метаболических и формообразующих процессов в спорангиальноЯ

цитоплазме. В этом случае, в частности, неизбежно преждевременное включение автолитических процессов, результатом которых должно быть прерывание созревания "отстающих" в развитии прос-пор. Вероятно следует допустить также синхронность функционирования нуклеоида.

ВЫВОДЫ

1. Выделена и подучена в чистой культуре новая анаэробная хемоорганотрофная епорообразующая бактерия - штамм PS-1 . способная образовывать несколько эндоспор в одной клетке.

2. Показано, что процесс спорообразования протекает по тому же механизму, что и у видов Clostridium и Bacillus, а споры бактерии PS-1 является типичными бактериальными эндоспорами.

3. Установлены факторы и условия, влияющие на явление по-лшспорогенеза (тип и уровень углевода, характер роста культуры).

4. Изучены цитологические и физиолого-биохимические свойства штамма PS-1, что позволило выявить сходство и различия с сахаролитическими клостридиями, а также другими спорообразую-щими бактериями. •

5. Проведено изучение геносистематических характеристик бактерии (нуклеотидного состава ДНК, размера генома, нуклеотид-ных последовательностей 5S рРНК). Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что бактерия родственна филогенетической ветви сахаролитическкх клостридий, .вюшчаюшэй С. butyrlcum к С. pasterlanum.

6. На основании существенных фенотипических отличий (способность образовывать несколько эндоспор в одной клетке, крупные шаровидные формы, отсутствие потребности в витаминах, своеобразия в нуклеотидной последовательности 5SpPHK) бактерия выделена в новые род и вид - Anaerobacter polyendosporus gen. et spec. nov.

• СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

• 1. Мушегян М. С. , Лебединский А. Е , Ыитюшина Л. JL Новая анаэробная бактерия // Пути совершенствования микробиологи-

ческой борьбы с вредными насекомыми' и болезнями растений. Tea. докл. -г. Велегож. -1986. -С. 24.

2. ДуДа В. И., Мушегян М. С., Лебединский A. R , Ыитшина Л. Л. Образование четырех-пяти эндоспор в одной клетке у новой анаэробной бактерии // ДАН СССР. -1985. -Т. 285. -N1. -С. 241.

3. Duda V. I. . Lebedinsky A.V., Musheglan MS., Mityushina L. L. A new anaerobic bacterium, forming up to five endospores per cell Anaerobacter polyendosporus gen. et spec. nov.//Arch. Microbiol: -1987. -148. -P. 12i-127.

4. Кутомкина E. a , Мушегян M. С., Кару Т. Я , Дуда Е И. Активация прорастания эндоспор бактерии Anaerobacter polyendosporus излучением He-Ne лазера // Микробиол.-1991.

ШЖГЯН МАРИАННА САРКИСОША

: НОВАЯ МНОГОСПОРОВАЯ АНАЗРОШАЯ ЕШЕРШ AHAEROBACTER •fOLYE/fOOSPORUS gen.' et opeo.nov.

(Автореферат)

Подлизано к печати.04.07.91 Формат éfbtíO ^16^1,3 п.д. Уч.иад.д. 1,3 Тираа 100 Заказ 557

Ротапринт ЫАСИ(ВГУЗ-ЗШ), 109280, Москва, Автозаводская, 16