Низкомолекулярные ауторегуляторные соединения как триггерные молекулы стресса у бактерий

Маргулис, Анна Борисовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Низкомолекулярные ауторегуляторные соединения как триггерные молекулы стресса у бактерий
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Низкомолекулярные ауторегуляторные соединения как триггерные молекулы стресса у бактерий"

На правах рукописи

МАРГУЛИС АННА БОРИСОВНА

НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ АУТОРЕГУЛЯТОРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ КАК ТРИГГЕРНЫЕ МОЛЕКУЛЫ СТРЕССА У БАКТЕРИЙ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань - 2005

Работа выполнена на кафедре микробиологии Казанского государственного университета им. В.И. Ульянова-Ленина

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Ильинская Ольга Николаевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

с.н.с. Коксин Владимир Петрович

кандидат биологических наук, в.н.с. Давыдова Марина Николаевна

Ведущая организация: Удмуртский государственный университет,

г.Ижевск

Зашита состоится " 8 " декабря 2005г. в 13.00 на заседании диссертационного совета Д.212.081.08 при Казанском государственном университете им. В.И. Ульянова-Ленина (420008, г.Казань, ул. Кремлевская, д.18., главное здание, ауд. 209)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Казанского государственного университета

Автореферат разослан ноября 2005г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент п л я -Лм' А Н. Аскарова

¿ему

Актуальность проблемы. Биологически активные вещества эндогенного и экзогенного происхождения, не вовлекаясь непосредственно в основной метаболизм клеток, могут оказывать разнообразное влияние на функции клеток. В области исследований устойчивости микроорганизмов к стрессовым воздействиям в последние годы наблюдается очевидный интерес к изучению формирования клеточного ответа, которое осуществляется с участием внеклеточных метаболитов популяционного и межпопуляционного действия. Спектр ауторегуляторных молекул, сопрягающих изменение условий окружающей среды с внутриклеточными реакциями, служит важным триггерным элементом адаптивных систем микроорганизмов. Стрессовые условия могут приводить к образованию различных диссоциативных форм микроорганизмов и форм с иным метаболическим статусом (в частности, некультивируемых). В настоящее время хорошо известна способность многих патогенных бактерий существовать и размножаться в объектах внешней среды - почвах, водоемах и др. Феномен перехода в некультивируемое состояние привлекает внимание исследователей, поскольку образование таких форм может обеспечивать сохранение патогенных бактерий в межэпидемические и межэпизоотические периоды [Романова, Гинцбург, 1993; Романова, Гинцбург, 1996; Романова с соавт., 2002]. Способность к переходу в некультивируемое состояние к настоящему времени выявлена у многих патогенных бактерий, но механизмы этого процесса остаются неясными. В клинической практике известно, что устойчивые формы возбудителей плохо поддаются выявлению и элиминации, поэтому актуальным представляется создание теоретической базы для управления процессами перехода микроорганизмов, в том числе патогенных и условно-патогенных, в некультивируемое состояние. Результаты, полученные в ходе выполнения диссертационной работы, позволят обосновать новые технологические подходы к решению этой проблемы.

Цель и задачи исследований. Целью работы является оценка вовлеченности ауторегуляторов физиологического состояния микроорганизмов в процессы неспецифической регуляции физиологической активности бактерий и установление механизмов действия этих веществ как триггерных молекул в адаптивных реакциях бактерий. В связи с поставленной целью решались следующие задачи:

1. Охарактеризовать токсические эффекты регуляторов группы апкилрезорцинов и гомосеринлактона при воздействии их на грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы.

2. Исследовать возможность повреждения генетического материала

клеток про- и эукариот синтетическ

шн я"йлг>гам" аутоиндукторов

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ } БИБЛИОТЕКА I

яфш \

■ I ............-Ф

анабиоза бактерий, алкилрезорцинами, и плотностно-зависимым регулятором - гомосеринлактоном.

3. Охарактеризовать процесс индукции гипометаболического состояния различных штаммов грамположительных и грамотрицательных бактерий экзогенными алкилрезорцинами и гомосеринлактоном.

4. Выяснить возможность модификации токсигенных свойств патогенных бактерий, их фагоустойчивости и антигенных детерминант при воздействии гексилрезорцина. '

5. На основе полученных данных обосновать предполагаемый механизм действия индукторов гипометаболического состояния бактерий. 1

Научная новизна. Значение синтетических аналогов регуляторов физиологического состояния микроорганизмов (алкилрезорцинов) и плотностно-зависимого регулятора у бактерий (гомосеринлактона) впервые охарактеризовано с точки зрения медицинской практики. Впервые показана возможность регуляции физиологического и метаболического статуса патогенных и условно-патогенных бактерий с помощью описанных соединений. Впервые установлена возможность взаимоперехода диссоциативных форм бактерий с участием экзогенных микробных ауторегуляторов. Впервые показано изменение вирулентности, фагоустойчивости и способности к размножению (колониеобразованию) различных штаммов грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов в результате стрессовых воздействий под действием алкилрезорцинов и гомосеринлактона. Впервые выявлены генотоксические эффекты исследуемых соединений в серии тест-систем с использованием микроорганизмов: в тесте Эймса, 808-хромотесте, тесте на прямое повреждение ДНК, а также в тесте на индукцию микроядер в эритроцитах периферической крови мышей. Впервые обнаружена связь между повреждающим действием ауторегуляторов на геном и индукцией морфогенеза. Впервые получены данные, позволяющие оценить участие данных ауторегуляторных молекул как триггерных в системе адаптивных реакций у бактерий.

микробиологической практики, где требуется создание условий для образования устойчивых к внешним воздействиям форм микроорганизмов. Полученные результаты позволят создать более полное представление об универсальном ответе микроорганизмов на стрессовые воздействия и сделать соответствующие выводы о потенциальной возможности направленной регуляции патогенности бактерий.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа в течение 2001-2005гг. проводится в соответствии с планом НИР Казанского государственного университета (№ гос. регистрации 01.2.00.1.15733). Исследования автора по тематике работы были отмечены дипломом Минобразования РФ (2002) и поддержаны грантами НОЦ REC007 (2001-2003), НИОКР АН РТ (20032004). Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора. Автоматическую регистрацию ростовых параметров бактерий осуществляли на базе РЦПБ СПИД эксперименты с животными выполнены в ЛБИ ИОФХ им. А.Е. Арбузова.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на VI международной конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды» (Пермь, 2005), XIII международной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение» (Казань, 2005), 79-й Всероссийской студенческой конференции к 1000-летаю Казани (2005), конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии». (Казань, 2004), на XI Туполевских чтениях (Казань, 2003), международной научной конференции «Новая геометрия природы» (Казань, 2003), IV научно-практической конференции молодых ученых и специалистов РТ (Казань, 2001), V-9-ых Всероссийских конференциях молодых ученых (Пущино, 2003-2005), И, III конференциях НОЦ REC007 «Материалы и технологии XXI века» (Казань, 2001-2002), 39-ой международной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2001), а также на итоговых конференциях КГУ (2001-2005).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 научных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела экспериментальных исследований и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 126 страницах машинописного текста, включает 10 таблиц, 16 рисунков. Библиография содержит 196 наименований российских и зарубежных авторов.

Материалы и методы

Регуляторные факторы микроорганизмов

В работе исследовали соединения класса алкилрезорцинов (AR): химические аналоги ауторегуляторных факторов di бактерий -метилрезорцин (Met) (Sigma, М.м. = 124) и гексилрезорцин (Hex) (Sigma, М.м. = 196). Для сравнения токсических и генотоксических эффектов первоначально работали также с коммерческим препаратом резорцином (R) (Sigma). Для установления возможного неспецифического действия '

ауторегуляторного фактора микромицетов по отношению к бактериям был выбран пара-2-гидроксиэтилфенол (D), идентифицированный как t

регулятор группы d| у дрожжей [Батраков с соавт., 1993]. Также в экспериментах использовали индуктор включения luxI-luxR-оперона -гомосеринлактон (HSL) (Aldrich, М.м. = 182), который является зависимым от плотности культуры регулятором физиологического состояния бактерий [Givskov et al., 1998].

Исходный раствор алкилрезорцинов готовили в диметилсульфоксиде (DMSO) в концентрации 10мг на 1мл DMSO, далее работали с концентрациями от 10 до 1000 мкг на 1мл дистиллированной воды. Гомосеринлактон и пара-2-гидроксиэтилфеиол изначально растворяли в дистиллированной воде.

Химические методы анализа

Количественное определение алкилрезорцинов. Методика обнаружения алкилрезорцинов [Мулюкин с соавт., 1996; Tluscik et al., 1981] основана на их способности взаимодействовать с диазотиевой солью 1,3 - диметоксибензидина с образованием окрашенных в красный цвет комплексов. В работе применяли коммерческий реактив Fast Blue В salt (FBB) (Sigma).

Микробиологические методы анализа

1. Оценка жизнеспособности бактерий при длительном инкубировании и голодании. Объектом исследования служили грамположительные бактерии: мутантный по спорообразованию штамм Bacillus subtilis spoOE (phe AI, spoOE II, trp C2) из коллекции ATCC (IDA) США и штамм Staphylococcus aureus OK, клинический изолят из 1

коллекции Медицинской Академии РТ. Суспензию, полученную смывом с L-агара (107 кл/мл), инкубировали в стационарных условиях при 30°С в колбах на 100мл, содержащих 30 мл дистиллированной воды с каждым из исследуемых веществ (50 мкг/мл, опытный вариант) и без вещества (контрольный вариант). Каждые 2 недели проводили оценку общего числа клеток (ОЧК) и числа колониеобразующих единиц (КОЕ) с описанием морфологии колоний. Параллельно исследовали инкубируемый материал на наличие спор (для штамма В subtilis spoOE) и некультивируемых клеток

(для штамма S aureus OK) с использованием модификации теста Kogure [Kogure et al., 1979]. В тесте критерием для определения живых клеток является увеличение их размеров при добавлении питательного субстрата в присутствии налидиксовой кислоты, блокирующей деление. В окрашенных витальными красителями препаратах определяли число увеличенных (живых), мелких неокрашенных (жизнеспособных, но некультивируемых) и мелких окрашенных (мертвых) клеток.

2. Оценка токсических эффектов гексилрезорцина при краткосрочном культивировании бактерий на богатой питательной среде и в условиях голодания. Объектом исследования служили грамположительные (В. subtilis SKI) и грамотрицательные (Salmonella typhimurium ТА100 и Escherichia coli Kl2) бактерии. 18-часовые культуры микроорганизмов выращивали на питательном бульоне Мюллера-Хинтона (104 кл/мл). Для определения токсических эффектов гексилрезорцина при культивировании бактерий на богатой питательной среде разведения культур делали в бульоне Мюллера-Хинтона. Для аналогичных исследований при голодовом стрессе разведения культур делали в дистиллированной воде. Замеряли рост на приборе «iEMS-Reader» в программе «Микроб-автомат» в течение 18 часов при 37°С.

3. Изменение вирулентности S. aureus под действием теплового шока в присутствии гексилрезорцина. Тепловой шок вызывали выдерживанием 12-часовой культуры S aureus OK при 45°С либо 60°С в течение ¡Омин. Сравнивали последующий рост на свежей жидкой питательной среде при 37°С культуры, обработанной гексилрезорцином в течение 12ч, культуры с непосредственным добавлением гексилрезорцина перед тепловой обработкой, а также необработанной культуры. Параллельно высевали на агаризованную среду для подсчета КОЕ.

4. Индукция морфогенеза S. typhimurium TAI00 Индукцию образования R-форм у бактерий вызывали исследуемыми ауторегуляторными факторами. Для подтверждения статуса R-форм S typhimurium ТА ¡00 проводили биохимический и серологический анализы культуры с помощью посевов на «пестрый ряд» (лаб. микробиологии РЦПБ СПИД, Казань) и набора антисывороток (СЭС, Казань). Помимо этого, проводили определение динамики роста S- и R-форм S typhimurium ТА100 при действии гексилрезорцина и без него на приборе «iEMS-Reader» в программе «Микроб-автомат».

5. Определение изменения устойчивости S- и R-форм S.tvphimurium ТА¡00 к сальмонеллезному бактериофагу. Оценивали изменение устойчивости полученных морфологических форм по отношению к фагу. Фаг получен из Нижегородского государственного

предприятия по производству бактерийных препаратов, "ИмБио", серия 7, 2004г. Тест базируется на выявлении спектра чувствительности культуры к набору стандартных типовых фагов, проявляющейся в лизисе культуры при соответствии фаговара культуры типовому фагу [Пяткин, Кривошеин, 1981].

6. Регистрация наличия плазмиды v S- и R-форм S typhimurium TAI00 при действии гексилрезорцина. Штамм S. typhimurium TAJ00 содержит плазмиду устойчивости к ампициллину ркт 101. Спонтанно полученные R-формы штамма, а также S- и R-формы, обработанные гексилрезорцином, подвергались пересевам на богатые питательные среды, содержащие ампициллин, в течение нескольких пассажей. Если способность к росту на среде с антибиотиком сохранялась в течение 5 пассажей, то считали, что переход штамма в R-форму, а также обработка гексилрезорцином не приводит к потере плазмиды.

Методы биотестирования

1. Оценка токсического действия исследуемых соединений по отношению к тестерным микроорганизмам. Токсичность препаратов определяли по выживаемости тестерных штаммов для исключения возможности получения ложноотрицательных результатов в испытаниях на мутагенность. В тесте использовали мутантные штаммы 5. typhimurium из набора для теста Эймса.

2. Тест Эймса на выявление генных мутаций без метаболической активации. Мутагенное действие ауторегуляторов оценивали в тесте Эймса по регистрации частоты реверсий ауксотрофного по гистидину штамма S.typhimurium ТА 100 к прототрофности. Мутагенную активность учитывали по кратности превышения числа индуцированных ревертантов над спонтанным фоном мутирования [Marón, Ames, 1983].

3. Тест на прямое повреждение бактериальной ДНК. Метод основан на сравнительном анализе выживаемости тестерного штамма бактерий с нормальной активностью репаративных систем и штаммов, дефектных по различным путям репарации в присутствии исследуемого соединения [McCarol et al., 1981].

4. SOS-хромотест. SOS-хромотест позволяет оценить как ДНК-повреждающую активность вещества, так и вклад ошибочной репарации в общий мутагенез. В работе используют штамм Е coli PQ 37 (табл.1) с генотипом - sfiA ■ mud (Ар lac) eis, lac A U169, таГ, uvr A, gai Y, pho C, rfa. В штамме к гену sfi А, входящему в число SOS-генов, "подшит" галактозный оперон. При экспрессии этого гена начинает вырабатываться галактозидаза, дающая при расщеплении субстрата (о - нитрофенил-ß-галактопиранозида) окрашенный продукт [Quillardet et al., 1982].

5. Тест на индукцию микроядер в эритроцитах периферической крови мышей in vivo Суть теста заключается в выявлении и количественной оценке потенциальной цитогенетической активности исследуемого соединения в полихроматофильных эритроцитах периферической крови млекопитающих. Метод основан на микроскопической регистрации клеток с микроядрами. Спонтанная частота таких клеток составляет 0,2-0,3% [Hayashi et al., 1994; Ильинских с соавт., 1991].

Результаты и их обсуждение

Токсические и генотоксические эффекты исследуемых факторов

Показано, что гексилрезорцин обладал выраженным токсическим действием по отношению к S.typhimurium в концентрациях 100 мкг/мл и выше. Метилрезорцин проявил токсический эффект только в самой высокой концентрации - 1000 мкг/мл. Резорцин оказался токсичным в двух наиболее высоких концентрациях. Дрожжевой d-фактор (пара-2-гидроксиэтилфенол) и гомосеринлактон не показали токсических эффектов ни в одной из исследуемых концентраций (табл. 1).

Способность исследуемых регуляторов индуцировать генные мутации в клетках бактерий проверяли в тесте Эймса. Как видно из табл. 1, регуляторы, различающиеся по структуре молекул - метилрезорцин, гексилрезорцин, дрожжевой d-фактор, неалкилированный резорцин и гомосеринлактон, обладали разным мутагенным эффектом в диапазоне исследованных концентраций (10 - ЮООмкг/мл). Для гексилрезорцина мутагенность удалось зафиксировать только в концентрациях 50 и 100 мкг/мл, так как более высокие концентрации проверять в тесте Эймса было некорректным ввиду высокой токсичности препарата. То же самое можно сказать и о резорцине в концентрации 1000 мкг/мл. У последнего мутагенный эффект был выявлен в концентрациях 100 и 500 мкг/мл. Три других регулятора не показали мутагенного действия ни в одной из исследуемых концентраций (табл. 1).

Показано, что только гексилрезорцин обладал слабо выраженным ДНК-повреждающим эффектом в концентрациях 100 и 50мкг/мл. Для исправления повреждений требуется эксцизионная репарация. Остальные препараты не проявили ДНК-повреждающего действия, что доказано по полному отсутствию зоны лизиса, как на диком, так и на мутантных штаммах Е. coli.

Таблица 1.

Токсические и мутагенные эффекты исследуемых регуляторов

регулятор 10 мкг/мл 50 мкг/мл 100 мкг/мл 500 мкг/мл 1000 мкг/мл

Нех 1 0 10±2 30±7 90±5 92±5

2 1±0,1 3,5±0,3 5±0,4 НО НО

Ме( 1 0 0 3±1 5±1 22«

2 0,9±0,1 1,2±0,2 1±0,1 1,5±0,3 1,4±0,2

К 1 0 0 12±4 65±6 93±4

2 1,4±0,3 1,8±0,2 4±0,5 7±0,5 НО

О 1 0 0 0 0 0

2 1±0,1 0,8±0,1 1±0,2 1,1±0,1 1,3±0,2

ть 1 0 0 0 0 3±1

2 1±0,2 1,3±0,2 1,1±0,1 1,4±0,2 1,7±0,2

"Г - Токсичность, % погибших клеток;

"2" - Мутагенность (превышение над контролем, число раз),

"НО" - мутагенность не обнаружена из-за высокой токсичности вещества

Величины факторов индукции ЗОв-ответа (№) для исследованных соединений представлены на рис. 1. Показано, что факторы индукции для метилрезорцина, гомосеринлактона и пара-2-гидроксиэтилфенола в концентрациях от 10 до 100 мкг/мл значительно ниже порогового значения «2», что указывает на отсутствие генотоксических свойств этих препаратов. Для неалкилированного резорцина также не было выявлено индукции БОв-функций, хотя в максимальной из использованных концентраций значение № достигает порогового уровня (рис. 1).

Для гексилрезорцина бьши показаны высокие значения № в концентрациях 100 и 50 мкг/мл, причем даже в концентрации 10 мкг/мл фактор индукции ЗОБ-ответа достигал порогового уровня. Было установлено, что гексилрезорцин в концентрациях 100 и 50 мкг/мл и неалкилированный резорцин в концентрации 100 мкг/мл обладали мутагенным эффектом, регистрируемым по реверсии ауксотрофных по гистидину штаммов 5'. ¡урЫтипит к прототрофности, в то время как метилрезорцин не обладал генотоксичностью в этих концентрациях. Таким образом, данные БОЗ-хромотеста и теста Эймса для этих веществ совпадают, характеризуя гексилрезорцин и резорцин как генотоксичные.

Большинство токсикантов вызывают нарушение генетического материала именно в токсических концентрациях. Истинные генотоксиканты, к каковым можно отнести гексилрезорцин, вызывают мутации в низких концентрациях, не обладающих токсическим действием. Его мутагенный эффект, установленный в тесте Эймса, подтвержден по индукции синтеза ДНК на поврежденной матрице у бактерий (данные 808-хромотеста) и выявлению прямых повреждений ДНК в штаммах,

дефектных по системам репарации. Именно поэтому гексилрезорцин был выбран для изучения процесса перехода бактерий в гипометаболическое состояние, поскольку возможно, что индукция анабиотического состояния микроорганизмов проходит поэтапно и связана не только с изменением функций ДНК, но и с непосредственной модификацией структуры ДНК.

концентрация, мкг/мл

Рис.1 Факторы индукции SOS-ответа при действии различных концентраций регуляторов (Met - метилрезорцин, D - пара-2-гидроксиэтилфенол, R - резорцин, Hex -гексилрезорцин, HSL - гомосеринлактон)

Помимо этого, генотоксические эффекты гексилрезорцина и гомосеринлактона оценивали по превышению числа микроядер в опытном варианте по отношению к контролю в микроядерном тесте. На первые сутки после введения препарата подопытным животным был зарегистрирован мутагенный эффект гексилрезорцина в концентрациях 0,5; 0,05; 0,005 мг/г веса. Превышение числа микроядер по сравнению с контрольным вариантом составило соответственно 6,5; 3,7 и 2,8 раз. На вторые сутки сохранялся высокий мутагенный эффект гексилрезорцина в концентрации 0,5 мг/г веса, что было зарегистрировано по превышению числа микроядер в опыте над контролем в 5,1 раза. В концентрациях же 0,05 и 0,005 мг/г веса генотоксическая активность данного соединения убывала (превышение над контролем соответственно в 2,0 и 2,6 раз). Возможно, это объясняется высокой скоростью метаболизма и обновлением клеток крови мышей. По данным, полученным через 72 часа после введения гексилрезорцина животным, можно говорить о стабильно сохраняющемся мутагенном эффекте исследуемого вещества в концентрации 0,5 мг/г веса (превышение над контролем составило 3,9 раз). В меньших концентрациях генотоксический эффект гексилрезорцина зарегистрирован не был. Гомосеринлактон не индуцировал микроядра в

эритроцитах периферической крови мышей ни в одной из исследуемых концентраций.

Полученные в микроядерном тесте результаты показывают, что гексилрезорцин способен вызывать мутации в геноме не только прокариот, но и эукариот. При этом важно отметить, что метаболическая трансформация гексилрезорцина в организме мышей частично снимает генотоксическое действие вещества.

Изменение физиологической активности бактерий при длительном инкубировании и голодании

Как штамм S. aureus OK, так и дефектный по спорообразованию штамм В subtilis spoOE сохраняли жизнеспособность в течение всего срока инкубации в условиях голодания (28 и 12 недель соответственно) в контрольном варианте и в присутствии регуляторных факторов. Было установлено, что характер динамики числа КОЕ при высеве из суспензий штаммов В. subtilis spoOE (рис.2) и S aureus OK (рис.3), подвергавшихся длительному инкубированию, принципиально различен. Число КОЕ В subtilis spoOE в течение первых 6-и недель резко падало, а затем в течение всего последующего времени инкубации оставалось практически на одном уровне. Вероятно, это связано с поддержанием популяцией роста на лизате погибших клеток. Однако, при сходстве общих тенденций изменения кривых роста В. subtilis spoOE в каждом из вариантов, 'необходимо отметить, что в вариантах с веществами число колоний в каждой временной точке было достоверно меньше, чем в контроле. Наименьшее количество КОЕ регистрировали при высеве бактерий из суспензии с добавлением гомосеринлактона. Также незначительное число КОЕ регистрировали при высеве суспензий с метил- и гексилрезорцином. Кривая роста бактерий в присутствии пара-2-гидроксиэтилфенола имела аналогичный предыдущим кривым характер при несколько большем сохранении числа КОЕ по сравнению с другими опытными вариантами (рис.2). Динамика ОЧК в целом носила характер, аналогичный динамике КОЕ, но значения ОЧК были достоверно выше значений КОЕ в 1,3 - 1,5 раза в каждой временной точке. К 8-ой неделе инкубирования способность бацилл к образованию КОЕ под воздействием исследуемых регуляторов уменьшилась на 1-2 порядка, причем наибольшим эффектом обладал гомосеринлактон. К этому времени в вариантах с гомосеринлактоном и пара-2-гидроксиэтилфенолом были обнаружены споры, то есть, произошла реверсия штамма spoOE к исходному спорообразующему генотипу. К 12-ой неделе инкубирования споры появились во всех вариантах, в том числе и контрольном, и составляли до 80% всех клеток в поле зрения микроскопа. Таким образом, установлено, что в присутствии

гомосеринлактона и пара-2-гидроксиэтилфенола реверсия В. зиЫШз зроОЕ к спорообразующему фенотипу происходит раньше, чем в контроле.

35000000 34500000 -34000000 -33500000 33000000 § 32500000 О 32000000

2 1600

Контроль -♦— Гексиярезорцин -о— Метилрезорцин -о— Пара-2-гидроксиэтилфенол -X— Гомосеринлактон

6 8 Время, недели

Рис.2. Изменение числа колониеобразующих единиц в процессе инкубирования В.зиЬиШ зроОЕ с добавлением 50 мкг/мл исследуемых веществ - возможных индукторов гипометаболического состояния бактерий - и без их добавления (контроль).

61000000-, 6000000059000000 200000100000-

-■— Контроль ^ Гексиярезорцин Метилрезорцин -О— Пара-2-гидроксиэтилфенол -х— Гомосеринлактон

10 15 20 Время, недели

Рис 3 Изменение числа колониеобразующих единиц в процессе инкубирования З.аигеиз ОК с добавлением 50 мкг/мл исследуемых веществ - возможных индукторов гипометаболического состояния бактерий - и без их добавления (контроль)

Динамика изменений числа КОЕ для штамма S. aureus OK отражена на рис.3. К 18-ой неделе инкубации наблюдали пик снижения числа КОЕ. Продолжение инкубации привело к активации вторичного роста штамма S.aureus OK во всех вариантах, кроме варианта с гексилрезорцином, что можно связать с возможной индукцией перехода стафилококков в гипометаболическое состояние под влиянием гексилрезорцина.

Для подтверждения этого предположения был проведен тест Kogure [Kogure et al, 1979] с образцом суспензии клеток S. aureus OK после 28й недель инкубации. Около 90% клеток суспензии в варианте с гексилрезорцином не отвечали на внесение экзогенного питательного субстрата, в то время как в контрольном варианте (без гексилрезорцина) таких клеток было обнаружено лишь 27% (табл.2). Клетки, не реагирующие на внесение питательного субстрата, при этом не окрашивались метиленовым синим, что подтверждает их жизнеспособность.

Таблица 2

Содержание клеток в 28"-недельной суспензии S aureus OK, отвечающих на внесение экзогенного субстрата (тест Kogure), %*

Размер клеток Без гексилрезорцина С гексилрезорцином

Активные клетки, % 73±1,3 10±0,7

Гипометаболические клетки, % 27±1,1 90±0,8

♦За 100% принято общее число клеток

Из серии исследованных ауторегуляторов только гексилрезорцин можно рассматривать как универсальный индуктор гипометаболического состояния штаммов, не способных к спорообразованию, в то время как гомосеринлактон индуцировал переход к этому состоянию только у мутантного штамма бацилл.

Проверка способности штаммов синтезировать АЛ при длительном росте на Ь-бульоне показала, что исследуемые штаммы в данных условиях культивирования не образуют ауторегуляторов этого типа. АИ не были обнаружены ни в клетках, ни в культуральной жидкости. То есть, в отличие от В сегет [Дорошенко с соавт., 2001], мутант В. йиЬиН? яроОЕ не продуцирует АЯ в условиях старения. Тем не менее, результаты работы свидетельствуют, что экзогенный гексилрезорцин функционирует как сигнальная молекула, активирующая переход грамположительных бактерий в гипометаболическое состояние.

Вероятно, описанные ауторегуляторы физиологического состояния бактерий в соответствии с их функциями можно рассматривать как один из компонентов механизма стрессоустойчивости. Исследования в этой области позволят создать более полное представление об универсальном ответе микроорганизмов на стресс и сделать выводы о потенциальной возможности направленной регуляции физиологической активности патогенных бактерий. Клиническая практика нуждается в создании теоретической базы для управления процессами перехода патогенных и сапрофитных микроорганизмов в некультивируемое состояние, поскольку устойчивые формы возбудителей плохо поддаются выявлению и элиминации.

Токсические эффекты гексилрезорцина при краткосрочном культивировании бактерий на богатой питательной среде и в условиях голодания

При 18-часовом росте культур грамположительных (В subtilis SKI) и грамотрицательных (5 typhimurium ТА 100 и Е. coli Kl2) бактерий на богатой питательной среде наибольший токсический эффект гексилрезорцина наблюдали по отношению к грамположительным бактериям (В subtilis SKI) (рис. 4).

120

100

3? 80 п

8 во

á 40

20 0

Е coli

S.typhimurium

B.subtilis

□ к ию oso аюомкг/мл

Рис 4 Токсические эффекты гексилрезорцина по отношению к грамположительным (В subtilis SKI) и грамотрицательным (S typhimurium ТА 100 и £. coli К12) бактериям при кратковременном (18 ч.) культивировании в богатой питательной среде (бульон Мюллера -Хинтона) За 100% принята биомасса в вариантах без гексилрезорцина

При добавлении низкой концентрации вещества (10 мкг/мл) рост культур S. typhimurium ТА 100 и Е. coli Kl 2 незначительно отличался от контроля, в то время как у штамма В. subtilis SKI прирост биомассы составлял менее 40% по сравнению с контролем. В концентрации 50 мкг/мл прирост биомассы у представителей грамотрицательных бактерий составлял около 20% от контроля, в то время как у В. subtilis SKI прироста биомассы практически не наблюдали, как и в концентрации 100 мкг/мл (рис. 4).

При краткосрочном (18-часовом) инкубировании бактерий в дистиллированной воде в присутствии гексилрезорцина у всех трех ¡

штаммов (S. typhimurium TAI00, В, subtilis SKI и Е. coli К12) прирост биомассы при концентрации 10 мкг/мл составил около 80% по сравнению с контролем. В двух других концентрациях (50 и 100 мкг/мл) прирост составил не более 20% от контрольного варианта без вещества (рис. 5).

□ КИЮ Q50 >100

Рис 5. Токсические эффекты гексилрезорцина по отношению к грамположительным (В subtilis SKI) и грамотрицательным (S typhimurium ТА 100 и Е coli К12) бактериям при кратковременном (18 ч) инкубировании в условиях голодания (диет вода). За 100% принята биомасса в вариантах бел гексилрезорцина

Длительность лаг-фазы в среднем составляла 10 часов, что на 5-6 ч. больше, чем при росте культур на богатой питательной среде. Соответственно, к 18-му часу инкубации в дистиллированной воде плотность клеточных суспензий была практически на порядок ниже, чем при росте на бульоне. Этот факт хорошо коррелирует с данными, подтверждающими задержку начала логарифмической фазы роста у

бактерий, растущих на средах, лимитированных по различным элементам (углероду, азоту, фосфору и т.д.) [Милько, Красильникова, 1999].

Изменение вирулентности S. aureus OK под действием теплового шока в присутствии гексилрезорцина

Тепловой шок (Юмин. 60°С) вызывал практически полную остановку роста стафилококков. Культура после этого типа стресса, внесенная в свежую питательную среду, не давала достоверного прироста биомассы, замеренного по оптической плотности, ни в контрольном варианте, ни в вариантах с предварительной обработкой гексилрезорцином. В то же время шок при 45°С не являлся гибельным для культуры, а в случае ее предобработки гексилрезорцином отмечено, что, начиная со второго часа культивирования после шока, оптическая плотность предобработанных культур была выше контрольной. Этот эффект проявился и при подсчете КОЕ, что определенно свидетельствует о протекторном эффекте исследуемого соединения. При этом высевалась стандартная морфологическая форма. Невзирая на минимальную прибавку оптической плотности культур, подвергшихся 60-градусному шоку, часть стафилококков сохранила способность к образованию колоний. Таким образом, в условиях «мягкого» стресса (45°С) стафилококк, растущий в присутствии гексилрезорцина, сохраняет превышающую контроль способность к образованию колоний, и не переходит в гипометаболические формы. «Жесткий» стресс (60°С) приводит к снижению в процессе роста числа КОЕ для культуры, обработанной гексилрезорцином, по сравнению с необработанной, и к значительному усилению образования гипометаболических форм.

С образованием гипометаболических форм связано, по всей видимости, и снижение общей активности гемолизинов в процессе культивирования стафилококков. На рис. 6 представлены колонии S aureus OK, высеянные на кровяной агар на 7-е сутки культивирования из бульона, содержащего 100 мкМ гексилрезорцина (Б), и контрольного варианта (А) без гексилрезорцина.

Очевидно, что гексилрезорцин вызвал значительную потерю способности бактерий продуцировать гемолизины, отвечающие за вирулентность стафилококка. Необходимо отметить, что эта способность ослабевает в процессе культивирования на жидкой среде и без добавления алкилрезорцинов: у бактерий, высеянных на кровяной агар после культивирования в течение суток, гемолиз был гораздо активнее, чем у 7-суточной культуры, однако полного исчезновения зон лизиса, как при действии гексилрезорцина, не наблюдали.

А Б

Рис 6 Колонии S aureus OK на кровяном агаре, высеянные после 7 суток культивирования на жидкой среде А - без гексилрезорцина, Б - в присутствии гексилрезорцина

На основании полученных результатов можно предположить, что гексилрезорцин по мере возрастания силы стрессовых воздействий может сначала стабилизировать нормальные функции клетки, а затем индуцировать переход стафилококков в устойчивые гипометаболические формы. Это согласуется с данными литературы о стабилизирующем и протекторном действии гексилрезорцина на клетки бактерий [Степаненко, 2005; Эль-Регистан с соавт., 2001].

Индукция образования Л-форм у бактерий под действием исследуемых факторов

При концентрациях факторов 10 и 50 мкг/мл частота индукции образования колоний с нетипичными морфотипами не отличалась от спонтанной и составляла не более 0.1-0.2% от общего числа колоний во всех описанных модификациях эксперимента, различающихся по способу обработки исследуемыми ауторегуляторами.

У 5 гурЫтигтт ТА 100 было зарегистрировано 2 морфотипа колоний - доминирующие круглые мелкие гладкие матовые 8-формы, типичные для нормального роста штамма, и крупные шероховатые кратерообразные Я-формы желтоватого цвета. Концентрации ниже 100 мкг/мл не индуцировали образования И-форм. Добавление гексилрезорцина в суспензию оказывало больший токсический эффект, чем в случае выращивания бактерий на агаризованной среде с веществом, а часовая инкубация еще больше усиливала токсичность гексилрезорцина. При токсичных концентрациях гексилрезорцина Я-формы не росли, а количество 11-форм увеличивалось, что говорит об их более высокой

устойчивости к неблагоприятным условиям, в частности, к токсическим воздействиям. Для В. subtilis SKI было показано, что нетипичные морфотипы колоний появляются уже при добавлении гексилрезорцина в концентрации 50 мкг/мл.

Часовая инкубация способствует индукции этих форм при низкой концентрации вещества (50 мкг/мл), однако, с увеличением концентрации j, число колоний с нетипичными морфотипами закономерно снижается.

Отмечено, что в концентрации 100 мкг/мл гексилрезорцин индуцировал образование 3-х различных морфотипов колоний (1 - мелкие гладкие 4 колонии (типичные S-формы), 2 - крупные гладкие колонии и 3 - крупные

колонии с неровными краями). С увеличением концентрации до 500 мкг/мл регистрировали образование только двух морфотипов колоний, а именно типов 1 и 2. При действии гексилрезорцина на Е. coli диссоциации штамма на несколько морфотипов не наблюдали.

Изменение устойчивости S- и R-форм S. typhimurium ТА100 к сальмонеллезному бактериофагу

Была оценена устойчивость S- и R- форм сальмонелл, полученных под воздействием высоких концентраций гексилрезорцина и без него, к действию фага. Показано, что на чашках с S-формами, выделенными на среде в присутствии и отсутствии гексилрезорцина, через сутки инкубирования появились значительные зоны лизиса вокруг диска с фагом (радиус зоны лизиса 4 см), а рост наблюдали только по периметру чашки. R-формы же, изолированные в обоих вариантах, напротив, обладали высокой устойчивостью к фагу, и зоны лизиса вокруг диска обнаружены не были. При этом высокие концентрации гексилрезорцина не влияли на устойчивость S-форм к фагу. v

Сохранение плазмиды ркт 101 у S- и R-форм S. typhimurium ТА 100 при действии гексилрезорцина

R-формы штамма S. typhimurium ТА 100, полученные при спонтанной индукции их образования, а также S- и R-формы, выращенные на среде с гексилрезорцином, подвергались пересевам на богатые питательные ;> среды, содержащие ампициллин, в течение нескольких пассажей. При этом

способность к росту на среде с антибиотиком сохранялась в течение всего времени пересевов (5 пассажей) и R—»S-реверсии не наблюдали. Таким образом, переход штамма в R-форму, а также обработка гексилрезорцином не приводит к потере плазмиды устойчивости к данному антибиотику.

Особенности роста S- и R- форм S. typhimurium в присутствии гексилрезорцина

Гексилрезорцин в концентрации Юмкг/мл незначительно снижал рост S-форм и не влиял на R- формы. Что касается высоких концентраций,

то здесь наблюдаются более выраженные различия между диссоциантами. S-вариант ответил на присутствие гексилрезорцина в концентрации 50мкг/мл задержкой роста на 13 часов по сравнению с контролем, а при добавлении вещества в концентрации 100мкг/мл, рост в течение 18 часов зарегистрирован не был. R-диссоциант иначе реагировал на высокие концентрации гексилрезорцина: под действием концентрации 50мкг/мл задержка начала роста была значительно меньше - 3 часа по сравнению с контролем, а при добавлении аутоиндуктора анабиоза в концентрации 100мкг/мл рост зарегистрирован на 16-й час инкубации. Полученные данные подтверждают тот факт, что R-диссоцианты наряду с другими типами резистентности, обладают селективными преимуществами при действии токсических и субтоксических концентраций веществ.

В заключение мы считаем возможным обобщить полученные результаты как характеризующие исследуемые ауторегуляторы в качестве веществ, индуцирующих гипометаболическое состояние бактерий, а именно те из них, которые прямо или опосредованно влияют на геном бактериальной клетки. При этом спорообразование, как наименее глубокое состояние гилометаболизма, может быть индуцировано и без воздействия экзогенных ауторегуляторов на геном.

Вероятно, триггерное действие ауторегуляторов как индукторов гипометаболизма включает мутационные или регулирующие экспрессию генов механизмы перехода клетки от активной жизнедеятельности к стратегии выживания. Что касается иных эффектов ауторегуляторов, как то взаимодействие с липидами мембран и белками, не участвующими в репликации, поддержании структуры ДНК и регуляции экспрессии генов [Бутова с соавт., 2003; Ильинская с соавт., 2002], то в этих случаях данные ауторегуляторы не рассматриваются нами как триггерные молекулы. Это можно обосновать, исходя из стандартного определения триггера, под которым в биологии подразумевается сигнал, вызывающий метаморфоз у любых живых организмов [Bullock, 1957].

На основе анализа данных литературы и полученных экспериментальных результатов предложена схема, систематизирующая имеющиеся представления о культивируемом и некультивируемом состояниях бактерий в соответствии с их метаболическим статусом (табл.3).

Таблица 3.

Схематическое деление клеток микроорганизмов в соответствии с метаболическим состоянием

Культивируемое состояние Некультивируемое состояние

Клетки с нормальным метаболическим статусом Гипометаболические формы Метаболически неактивные формы

Типичные Нетипичные Анабиотические Покоящиеся Мумифицированные «апоптические» Поврежденные «некротические»

Стандартный доминирующий тип клеток и колоний Диссоциативные формы клеток, дающие нетипичные колонии наряду с доминирующими живы1 Клетки способны к генерации только при возвращении благоприятных условий (споры, цисты, лиофилизированные культуры) ;клетки Клетки ведут различные ферментативные реакции и способны к генерации только при проведении необходимых процедур "пробуждения" (цистоподобные рефрактерные клетки) Клетки практически не проявляют признаков жизни, не способны к генерации в известных условиях, но сохраняют структуру мертвь Клетки без признаков жизни, не способные к генерации, с поврежденной структурой или частично разрушенные ш клетки

ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ как способность к генерации

100% 1 100% 100% 0-100%* 0%** 0%

* - в зависимости от создания условий, оптимальных для пробуждения ** . условия пробуждения неизвестны

Снижение жизнеспособности

Наши результаты позволили детально охарактеризовать исследуемые ауторегуляторы по способности индуцировать гипометаболическое состояние бактерий.

Генотоксичный гексилрезорцин способствовал переходу в гипометаболическое состояние каждой из исследованных микробных культур, что регистрировали, прежде всего, по значительно более низкому числу КОЕ по сравнению с общим числом клеток. Наличие покоящихся форм, индуцированных гексилрезорцином, было также подтверждено с помощью теста Kogure. Кроме того, гексилрезорцин индуцировал появление новых морфотипов колоний у В snhtilis SKI и Styphimurium ТА 100, а также снижал способность к гемолизу у клеток S aureus

Метилрезорцин не проявил себя как генотоксикант и не вызывал индукции новых морфотипов, хотя индуцировал образование покоящихся форм у В subtilis spoOE, что регистрировали по снижению числа КОЕ.

Пара-2-гидроксиэтилфенол не проявил себя как генотоксикант, и в незначительной степени индуцировал образование покоящихся форм у В subtilis spoOE, по сравнению с остальными регуляторами, а также ускорял индукцию спорообразования этого штамма. Новых морфотипов не высевалось.

Гомосеринлактон - единственный ауторегулятор из исследованных, который обладает специфическим действием на макромолекулы микробной клетки, а именно на белки - факторы транскрипции, регулирующие экспрессию генов. Он не является токсикантом или генотоксикантом, не индуцирует морфогенез у бактерий, однако значительно сильнее способствует переходу B.subtilis spoOE в гипометаболическое состояние, чем другие исследованные факторы. Кроме того, как и пара-2-гидроксиэтилфенол, он несколько ускорял индукцию спорообразования у дефектного по спорообразованию штамма бацилл.

Это означает, что из всех изученных нами микробных ауторегуляторов только гексилрезорцин можно назвать универсальным фактором перевода бактерий в состояние гипометаболизма, поскольку он способствовал образованию покоящихся форм у каждой из исследованных нами микробных культур. Именно гексилрезорцин проявил себя как истинный генотоксикант, причем по отношению как к про-, так и к эукариотам. Можно предположить, что неспецифический перевод микробных клеток в состояние покоя связан с воздействием индуктора гипометаболизма на геном и его непосредственным взаимодействием с ДНК бактерий.

Таким образом, генотоксичные ауторегуляторы роста, а именно гексилрезорцин, можно рассматривать как триггерные молекулы,

запускающие процессы морфогенеза и образования устойчивых форм микроорганизмов после первичного повреждения ДНК. Что касается гомосеринлактона, который вызывал индукцию гипометаболизма у штамма бацилл с нарушенным спорообразованием, то, вероятно, механизм его действия связан с изменением экспрессии не только известных генов, подверженных регуляции по типу luxI-luxR оперона, как то система luxl-luxR (биолюминесценция), lasI-lasR (синтез внеклеточных гидролитических ферментов (пектиназ, целлюлаз и др.), система vsml-vsmR, или rhll-rhlR (синтез факторов вирулентности) [Mamson et al., 1998; Revenchon et al., 1998; Losick, Kaiser, 1997], но и генов, ответственных за процессы споруляции.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что токсичность микробных ауторегуляторов по отношению к бактериям возрастает в ряду «пара-2-гидроксиэтилфенол -гомосеринлактон - метилрезорцин - резорцин - гексилрезорцин».

2. Среди исследованных ауторегуляторов только гексилрезорцин является истинным генотоксикантом, проявляющим мутагенность в нетоксичных концентрациях, вызывающим прямое ДНК-повреждающее действие и индукцию синтеза ДНК на поврежденной матрице (SOS-ответ) у бактерий. Гексилрезорцин индуцирует мутации в геноме эукариот.

3. Экзогенный гексилрезорцин, в отличие от метилрезорцина, пара-2-гидроксиэтилфенола и гомосеринлактона, способствует переходу бактерий (5. aureus OK, В. subttlis spoOE, В. subtilis SKI, E. coli K12) в гипометаболическое состояние за счет неспецифических взаимодействий с макромолекулами микробной клетки. Гомосеринлактон способствует переходу в гипометаболическое состояние дефектных по спорообразованию бактерий (В subtilis spoOE) и, как и пара-2-гидроксиэтилфенол, ускоряет индукцию их спорообразования.

4. Гексилрезорцин индуцирует морфогенез штаммов В. subtilis SKI, S. typhimurium TA 100, но не Е coli Kl2, в то время как гомосеринлактон не приводит к индукции морфогенеза бактерий.

5. Гексилрезорцин индуцирует потерю вирулентности S. aureus ОК. У S typhimurium ТА 100 обработка гексилрезорцином не вызывает потери плазмиды ркт 101, не изменяет фагоустойчивости S- и R- форм и не влияет на их антигенные детерминанты.

6. Предложена схема, отражающая механизм индукции гипометаболического состояния бактерий путем взаимодействия с макромолекулами клетки, включая ДНК.

Автор благодарит зав каф. микробиологии КГУ проф. Ильинскую О Н за осуществление научного руководства; проф Куриненко Б М. и сотрудников НИЛ ИЭН, а также зав лаб НИЛ ББФ с н.с Колпакова А.И. за участие в обсуждении результатов, зав лаб микробиологии РЦПБ СПИД Шахбазову Е Н и с н.с ЛБИИОФХим А.Е Арбузова Зобова В.В. за возможность проведения ряда экспериментов на базе лабораторий; проф ИНМИ РАН (г Москва) Эль-Регистан Г И за предоставление регуляторных факторов и обсуждение материалов работы; зав каф. микробиологии КГМА проф Поздеева О К за предоставление клинического изолята Staphylococcus aureus; н с СЭС г Казани Григорьеву И.А за предоставление бактериофага и антисывороток

Работы, опубликованные по теме диссертации

1. Маргулис А.Б. Выживаемость патогенных и условно патогенных бактерий при действии индукторов анабиоза / А.Б.Маргулис, О.Н.Ильинская // IV научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов Республики Татарстан. Тезисы докладов. Естественнонаучное направление, секция Медико-биологические

г проблемы.-Казань.-11-12 декабря 2001 г. -С. 37.

2. Маргулис А.Б. Роль микробных ауторегуляторов группы dl в SOS-индуцируемом мутагенезе / А.Б.Маргулис. О.Н.Ильинская // Республиканский конкурс научных работ среди студентов и аспирантов на соискание премии им. Н.И. Лобачевского. Сборник тезисов итоговой конференции. -Том II.-Казань. -2002. -С. 4-5.

3. Маргулис А.Б. Изменение активности ферментов гемолитического комплекса стафилококков в условиях стресса / А.Б.Маргулис. О.Н.Ильинская, А.И.Колпаков // Тез. докладов III Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов НОЦ КГУ «Материалы и технологии XXI века».- Казань,-14-15 февраля 2003. -С.56.

4. Маргулис А.Б. Гексилрезорцин ускоряет образование гипометаболических форм бактерий в условиях голодания / А.Б.Маргулис. О.Н.Ильинская, А.И.Колпаков, Г.И.Эль-Регистан // Труды Объединенной международной научной конференции «Новая геометрия природы»,- Казань,- Август 25 - сентябрь 5, 2003,- Т.2.- (Биология. Медицина). -С.219-225.

5. Маргулис А.Б. Роль микробных ауторегуляторов группы апкилоксибензолов в образовании гипометаболических форм бактерий / А.Б.Маргулис. О.Н.Ильинская, А.И.Колпаков // Тезисы докладов 7-й Путинской конференции молодых ученых «Биология-наука 21-го века». -Пущино.- 2003. -С.283-284.

6. Маргулис А.Б. Индукция SOS-ответа клетки под действием ауторегуляторных факторов микроорганизмов/ А.Б.Маргулис. О.Н.Ильинская, А.И.Колпаков, Г.И.Эль-Регистан // Генетика. -2003.-Т.39.-№9. -С. 1180-1184.

7. Бушманова О.В. Оценка генотоксических свойств гомосеринлактона/ О В.Бушманова, И.В.Ожиганова, А.Б.Маргулис // XI Туполевские чтения.

t Всероссийская (с международным участием) молодежная научная

конференция. -Тезисы докладов. -8-10 октября, 2003 г. -Т. 1. -С. 154.

8. Ilinskaya Olga. Cytotoxic and genotoxic effects of the ß-' (triphenylphosphonio)ethyl carboxylate and of the N,N'-

bis(dihexylphosphinoylmethyl)-l,4-diaminocyclohexane / Olga Ilinskaya, Pavel Zelenikhin, Alexey Kolpakov, Nazira Karamova, Anna Margulis // Medical Science Monitor. -2004,- Vol.10.- N8.- P. 294-299.

9. Маргулис А.Б. Влияние гексилрезорцина на неспорообразующие грамположительные бактерии / А.Б.Маргулис. О.Н.Ильинская // Сборник

тезисов 8-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых "БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА". -17-21 мая 2004 г. -С.154.

10. Маргулис А.Б. Адаптивный ответ стафилококков на действие микробных факторов индукции анабиоза / А.Б.Маргулис. О.В.Бушманова, И.В.Ожиганова, А.И.Колпаков, О.Н.Ильинская // Вестник ТО РЭА. -Казань. -№ 1. -2004. -С. 41-44.

11. Ожиганова И.В. Влияние бактериального индуктора анабиоза -гексилрезорцина - на геном эукариотической клетки / И.В.Ожиганова, О.В.Бушманова, А.Б.Маргулис. А.И.Колпаков // Материалы Научной конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии». -Казань. -17-18 июня, 2004г. -С.65-66.

12. Ильинская О.Н. Краткосрочные тест-системы для определения генотоксичности / О.Н.Ильинская, А.Б.Маргулис // Методическое руководство. -Казань: изд-во КГУ. -2005. -31с.

13. Бушманова О.В. Изменение биосинтеза и активности протеаз бактерий под действием гомосеринлактона / О.В.Бушманова, И.В.Ожиганова, А.Б.Маргулис. А.И.Колпаков, О.Н Ильинская // Материалы XIII Международной научной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение».- Казань,- 4-8 апреля 2005 г.- С. 15-16.

14. Ожиганова И.В. Участие гомосеринлактона и гексилрезорцина в адаптивных реакциях микроорганизмов / И.В.Ожиганова, О.В.Бушманова, А.Б.Маргулис, А.И.Колпаков II Сборник тезисов 79-й Всероссийской студенческой конференции, посвященной 1000-летию Казани.- КГМУ.- 1214 апреля 2005 г.- С. 102.

15. Маргулис А.Б. Индукция гипометаболического состояния у мутантного штамма Bacillus subtilis spoOE / А.Б.Маргулис. А.И.Колпаков, О.Н.Ильинская // Сборник тезисов 9-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых "БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА". -18-22 апреля 2005 г. -С.202.

16. Маргулис А.Б. Гексилрезорцин как индуктор микроядер в полихроматофильных эритроцитах периферической крови мышей / А.Б.Маргулис. И.В.Ожиганова, О.В.Бушманова, А.И.Колпаков, О.Н.Ильинская // Генетика.- 2005,- Т.41.- №8.- С. 1045-1048.

17. Margulis A.B. Involvement of homoserinelactone and hexylresorcinol in adaptive reactions of microorganisms / A.B.MarguIis. A.I.Kolpakov, O.N.Ilinskaya // Abstracts of the Vl-nd International Conference Environmental pollution // Perm.- 20-25 September, 2005,- P. 193.

18. Маргулис А.Б. Индукция гипометаболических форм у неспорообразующих грамположительных бактерий / А.Б.Маргулис. О.Н.Ильинская, А.И.Колпаков, К.Муфер // Ученые записки Казанского государственного университета,- Т. 147.- Серия Естественные науки.-Кн.2.- 2005.-С. 108-114.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии Издательского центра Казанского государственного университета им.В.И.Ульянова-Ленина Тираж 100 экз. Заказ 10/111

420008, ул. Университетская, 17 тел.: 231-53-59,292-65-60

»2324?

РНБ Русский фонд

2006^4 26204

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Маргулис, Анна Борисовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Ответ микроорганизмов на стрессовые воздействия.

1.1.1. Переход бактерий в гипометаболическое состояние при стрессовых воздействиях.

1.1.2. Соединения группы алкилрезорцинов как аутоиндукторы покоящегося состояния бактерий.

1.1.3. Процесс мутагенеза в покоящихся клетках.

1.1.4. Жизнеспособность бактерий при стрессах.

1.2. Плотностно-зависимые процессы у микроорганизмов и их регуляция.

1.2.1. Регуляторные системы бактерий, чувствительные к изменению плотности популяции (кворум-эффект), и их сигнальные молекулы.

1.2.1.1. Кворум-зависимые системы с участием ацилированных лактонов гомосерина

1.2.1.2. Кворум-зависимые процессы с участием пептидных сигнальных агентов

1.2.1.3. Кворум-зависимые процессы с участием факторов аминокислотной природы

1.2.1.4. Кворум-зависимые процессы с участием иных сигнальных молекул.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Используемые в экспериментальной работе материалы.

2.1.1. Регуляторные факторы микроорганизмов.

2.1.2. Бактериальные штаммы.

2.1.3. Иные материалы, используемые в работе.

2.2. Химические методы анализа.

2.2.1. Количественное определение алкилрезорцинов.

2.3. Микробиологические методы анализа.

2.3.1. Оценка жизнеспособности бактерий при длительном инкубировании и голодании.

2.3.1.1.Тест Kogure для определения числа жизнеспособных, но некультивируемых клеток

2.3.2. Оценка токсических эффектов гексилрезорцина при краткосрочном культивировании бактерий на богатой питательной среде и в условиях голодания

2.3.3. Изменение вирулентности S. aureus под действием теплового шока в присутствии гексилрезорцина.

2.3.4. Индукция образования R-форм у бактерий под действием исследуемых факторов.

2.3.4.1. Тест на определение изменения устойчивости S- и R-форм S. typhimurium ТА100 к сальмонеллезному бактериофагу.

2.3.4.2. Определение сохранения плазмиды у S- и R-форм S. typhimurium ТА 100 при действии гексилрезорцина.

2.3.4.3. Определение динамики роста S- и R-форм S. typhimurium ТА100 при действии гексилрезорцина.

2.4. Методы биотестирования.

2.4.1. Оценка токсического действия исследуемых соединений по отношению к тестерным микроорганизмам.

2.4.2. Тестирование на мутагенность в бактериальных тест-системах.

2.4.2.1. Тест Эймса на выявление генных мутаций без метаболической активации.

2.4.2.2. Тест на прямое повреждение бактериальной ДНК.

2.4.2.3. SOS-хромотест.

2.4.3. Тестирование на генотоксичность in vivo.

2.4.3.1. Тест на индукцию микроядер в эритроцитах периферической крови мышей in vivo

2.5. Статистическая обработка результатов.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Токсические и генотоксические эффекты микробных регуляторов.

3.1.1. Токсические эффекты исследуемых факторов.

3.1.2. Способность микробных регуляторов к индукции мутаций.

3.1.3. ДНК-повреждающая активность микробных регуляторов роста.

3.1.4. SOS-индуцирующая способность исследуемых соединений.

3.1.5. Индукция микроядер в эритроцитах периферической крови мышей.

3.2. Изменение физиологической активности бактерий при длительном инкубировании и голодании.

3.3. Токсические эффекты гексилрезорцина при краткосрочном культивировании бактерий на богатой питательной среде и в условиях голодания.

3.4. Изменение вирулентности S. aureus под действием теплового шока в присутствии гексилрезорцина и без него.

3.5. Индукция образования R-форм у бактерий под действием исследуемых факторов.

3.6. Изменение устойчивости S- и R-форм S. typhimurium ТА100 к сальмонеллезному бактериофагу.

3.7. Сохранение плазмиды у S- и R-форм S. typhimurium ТА100 при действии гексилрезорцина.

3.8. Особенности роста S- и R- форм S. typhimurium в присутствии гексилрезорцина.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Низкомолекулярные ауторегуляторные соединения как триггерные молекулы стресса у бактерий"

1. Охарактеризовать токсические эффекты регуляторов группы алкилрезорцинов и гомосеринлактона при воздействии их на грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы.

2. Исследовать возможность повреждения генетического материала клеток про- и эукариот синтетическими аналогами аутоиндукторов анабиоза бактерий, алкилрезорцинами, и плотностно-зависимым регулятором - гомосеринлактоном.

4. Выяснить возможность модификации токсигенных свойств патогенных бактерий, их фагоустойчивости и антигенных детерминант при воздействии гексилрезорцина.

5. На основе полученных данных обосновать предполагаемый механизм действия индукторов гипометаболического состояния бактерий.

Научная новизна. Значение синтетических аналогов регуляторов физиологического состояния микроорганизмов (алкилрезорцинов) и плотностно-зависимого регулятора у бактерий (гомосеринлактона) впервые охарактеризовано с точки зрения медицинской практики. Впервые показана возможность регуляции физиологического и метаболического статуса патогенных и условно-патогенных бактерий с помощью описанных соединений. Впервые установлена возможность взаимоперехода диссоциативных форм бактерий с участием экзогенных микробных ауторегуляторов. Впервые показано изменение вирулентности, фагоустойчивости и способности к размножению (колониеобразованию) различных штаммов грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов в результате стрессовых воздействий под действием алкилрезорцинов и гомосеринлактона. Впервые выявлены генотоксические эффекты исследуемых соединений в серии тест-систем с использованием микроорганизмов: в тесте Эймса, SOS-хромотесте, тесте на прямое повреждение ДНК, а также в тесте на индукцию микроядер в эритроцитах периферической крови мышей. Впервые обнаружена связь между повреждающим действием ауторегуляторов на геном и индукцией морфогенеза. Впервые получены данные, позволяющие оценить участие данных ауторегуляторных молекул как триггерных в системе адаптивных реакций у бактерий.

Практическая значимость. Регулирование перехода микроорганизмов в состояние покоя имеет огромное значение для биотехнологии и медицины. Прикладной аспект этой проблемы связан с потенциальной возможностью управления такими процессами, как образование некультивируемых форм патогенов, устойчивых к различным стрессовым условиям, в том числе к фармакологическому воздействию, и сохранение целевой активности промышленных штаммов микроорганизмов - продуцентов биологически активных веществ. Использование экзогенных алкилрезорцинов возможно в любой области микробиологической практики, где требуется создание условий для образования устойчивых к внешним воздействиям форм микроорганизмов. Полученные результаты позволят создать более полное представление об универсальном ответе микроорганизмов на стрессовые воздействия и сделать соответствующие выводы о потенциальной возможности направленной регуляции патогенности бактерий.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на VI международной конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды» (Пермь, 2005), XIII международной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение» (Казань, 2005), 79-й Всероссийской студенческой конференции к 1000-летию Казани (2005), конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии». (Казань, 2004), на XI Туполевских чтениях (Казань, 2003), международной научной конференции «Новая геометрия природы» (Казань, 2003), IV научно-практической конференции молодых ученых и специалистов РТ (Казань, 2001), 7-9-ых Всероссийских конференциях молодых ученых (Пущино, 2003-2005), II, III конференциях НОЦ REC007 «Материалы и технологии XXI века» (Казань, 2001-2002), 39-ой международной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2001), а также на итоговых конференциях КГУ (2001-2005).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 научных работ.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Маргулис, Анна Борисовна

выводы

3. Экзогенный гексилрезорцин, в отличие от метилрезорцина, нара-2-гидроксиэтилфенола и гомосеринлактона, способствует переходу бактерий (S. aureus OK, В. subtilis spoOE, В. subtilis SKI, E. coli K12) в гипометаболическое состояние за счет неспецифических взаимодействий с макромолекулами микробной клетки. Гомосеринлактон способствует переходу в гипометаболическое состояние дефектных по спорообразованию бактерий (В. subtilis spoOE) и, как и пара-2-гидроксиэтилфенол, ускоряет индукцию их спорообразования.

4. Гексилрезорцин индуцирует морфогенез штаммов В. subtilis SKI, S. typhimurium ТА 100, но не Е. coli К12, в то время как гомосеринлактон не приводит к индукции морфогенеза бактерий.

5. Гексилрезорцин индуцирует потерю вирулентности S. aureus ОК. У

5. typhimurium ТА 100 обработка гексилрезорцином не вызывает потери плазмиды ркт 101, не изменяет фагоустойчивости S- и R- форм и не влияет на их антигенные детерминанты.

Автор благодарит зав. каф. микробиологии КГУ проф. Ильинскую О.Н. за осуществление научного руководства; проф. Куриненко Б.М. и сотрудников НИЛ ИЭН, а также зав. лаб. НИЛ ББФ с.н.с. Колпакова А.И. за участие в обсуждении результатов; зав. лаб. микробиологии РЦПБ СПИД Шахбазову Е.Н. и с.н.с. ЛБИИОФХим. А.Е. Арбузова Зобова В.В. за возможность проведения ряда экспериментов на базе лабораторий; проф. ИНМИ РАН (г. Москва) Эль-Регистан Г. И. за предоставление регуляторных факторов и обсуждение материалов работы; зав.каф. микробиологии КГМА проф. Поздеева O.K. за предоставление клинического изолята Staphylococcus aureus; н.с. СЭС г.Казани Григорьеву И.А. за предоставление бактериофага и антисывороток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основе анализа данных литературы и полученных экспериментальных результатов была создана схема, систематизирующая имеющиеся представления о культивируемом и некультивируемом состояниях бактерий в соответствии с их метаболическим статусом (табл.10). В таблице представлены различные по физиологическим характеристиками гипометаболические формы, а также клетки с нормальным метаболическим статусом, как доминирующий фенотип, так и диссоциативные формы минорных фенотипов. Все представленные группы микробных клеток отличаются по своей жизнеспособности, которая, в первую очередь, характеризуется способностью клеток к генерации. В нижней строке таблицы в процентах указана способность клеток к генерации, которая проявляется в зависимости от тех или иных условий окружающей среды. Так, например, для восстановления генеративной способности покоящихся клеток необходим подбор оптимальных условий, в то время как для мумифицированных «апоптических» клеток такие условия неизвестны, что снижает вероятность их генерации до 0%. Анабиотические формы легко способны к генерации при возвращении более благоприятных, пусть даже не оптимальных, условий. Эти цифры довольно условны, но помогают правильно оценить известные на сегодняшний день условия, способствующие выводу микроорганизмов из гипометаболического состояния.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Маргулис, Анна Борисовна, Казань

1. Ames B.N. An improved bacterial test system for the detection and classification of mutagens and carcinogens / B.N. Ames, F.D. Lee, W.E. Durston // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1973. - V. 70.- N .3.-P.782.

2. Ames B.N. Mutagenesis and carcinogenesis: endogenous and exogenous factors / B.N. Ames // Environ. Mol. Mutagen.- 1989.- V. 14., Suppl. 16.- P. 6677.

3. Ashby J. Definitive relationships among chemical structure, carcinogenicity and mutagenisity for 301 chemicals tested by the US NTP / J. Ashby, R.W. Tennant// Mut. Res.- 1991.- V.257.- P.229-306.

4. Ashby J. The influence of chemical structure on the extent and sites of cancerogenesis for 522 rodent carcinogens and 55 different human carcinogen exposures / J. Ashby, D. Paton // Mut. Res.- 1993.- V.286.- P.3-74.

5. Baffone W. Retention of virulence in viable but non-culturable halophilic Vibrio spp. / W. Baffone, B. Citterio, E. Vittoria, A. Casaroli, R. Campana, L. Falzano, G. Donelli // International Journal of Food Microbiology.- V.89.-2003.-P. 31-39

6. Baker M.E. Mammalian peripheral-type benzodiazepine receptor is homologous to CrtK protein of Rhodobacter capsidatus, a photosynthetic bacterium / M.E. Baker, D.D. Fanestil // Cell.- 1991.- V. 65.- P. 721-722.

7. Barret J.C. Mechanisms of multistep cancerogenesis and carcinogen risk assessment / J.C. Barret // Environ. Heals Perspect.- 1993.- V.100.- P.9-20.

8. Bassler B.L. How bacteria talk to each other: regulation of gene expression by quorum sensing / B.L. Bassler // Curr. Opin. Microbiol.- 1999.-N2.- P.582-587.

9. Bridges B.A. Mutation in resting cells: the role of endogenous DNA damage / B.A. Bridges // Cancer Surv.- 1996.- N28.- P.155-167.

10. Bridges B.A. DNA turnover and mutation in resting cells / B.A. Bridges // Bioessays.- 1997.- Vol. 19.- N 4.- P. 347-352.

11. Budrene E.O. Dynamics of formation of symmetrical patterns by chemotactic bacteria / E.O. Budrene, H. Berg // Nature.- 1995.- V. 376.- P. 4953.

12. Bullock Т.Н. The trigger concept in biology / Т.Н. Bullock // Physiological triggers and discontinuous rate processes.- Wash.- 1957.

13. Caro A. Viability and Virulence of Experimentally Stressed Nonculturable S. typhimurium / A. Caro, P. Got, J. Lesne, S. Binard, B. Baleux // Applied and environmental microbiology.- 1999.- V. 65.- N 7.- P. 3229-3232.

14. Claxton l.D. Gide for the Salmonella/mammalian microsome test for bacterial mutagenicity / l.D. Claxton, J. Allen, A. Auletta, K. Mortelmans, E. Nestmann, E. Zeiger// Mut.Resrarch. -1987. -V.189. -P.83-91

15. Fuqua W.C. Quorum sensing in bacteria: the LuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators / W.C. Fuqua, S.C. Winans, E.P. Greenberg // J. Bacterid.- 1994.- V. 176.- N 2.- P. 269-275.

16. Graf U. Somatic mutation and Rec-test in Drosojila melanogaster / U. Graf, F.E. Wurgler, A.J. Kats et al. // Environment Mutagenesis. 1984. - V.6. -P.153-188.

17. Gray K.M. Intercellular communication and group behavior in bacteria / K.M. Gray//Trends Microbiol.- 1997.- V.5.- N 5.- P. 184-188.

18. Greenberg E.P. Quorum sensing by bacteria / E.P. Greenberg, S. Winans, C. Fuqua // Ann. Rev. Microbiol.- 1996.- V. 50.- P. 727-751.

19. Grey B.E. The viable but nonculturable state of Ralstonia solanacearum may be involved in long-term survival and plant infection / B.E. Grey, T.R. Steck // Applied and environmental microbiology.- 2001.- V.- 67.- N. 9.- P. 3866-3872.

20. Hamasaki T. The genotoxicity og organotin compounds in SOS chromotest and rec-assay / T. Hamasaki, N. Sato, H. Nagase, H. Kito // Mut. Res.- 1992.- V.280.- P.195-203.

21. Havarstein L.S. An unmodified heptapeptide pheromone induces competence for genetic transformation in Streptococcus pneumoniae / L.S. Havarstein, G. Coomaraswamy, D. Morrison // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1995.- V.92.- N. 24.- P. 11140-11145.

22. Hayashi M. In vivo rodent erythrocyte micronucleus assay / M. Hayashi, R.R. Tice, J.T. MacGregor et. al. // Mut.Res.- 1994.- V.312.- P.293-304.

23. Heddle J.A. Micronucli as an index of citogenetic damage: past, present and future / J.A. Heddle, M.C. Cimino, M. Hayashi // Environ. Mol. Mutagen. -1991 -V. 18 P277-291.

24. Heinemann B. Prophage induction in lysogenic bacteria as a method of detecting potential mutagenic, carcinogenic, carcinostatic and teratogenic agents / B. Heinemann // Chemical mutagens. 1971. - V.l. - P. 235.

25. Hera С. Conditions for the optimal use L-arabinose-resistanct mutagenesis test with Salmonella typhimurium / С. Hera, C. Puevo // Mutagenesis. 1986. - V. 1.- N 4.- P. 267-273.

26. Hladyszowski J. Quantum mechanical and experimental oxidation studies of pentadecylresorcinol, olivetol, orcinol and resorcinol / J. Hladyszowski, L. Zubik, A. Kozubek // Free Radic. Res.- 1998.- Vol. 28.- N 4.- P. 359-368.

27. Hofmann K. Anaerobic formation and degradation of toxic aromatic compounds in agricultural and common sewage deposits / K.Hofmann, E.Hammer//Chemosphere.- N38.- 1999.- P.2561-2568.

28. Ishihama A. Adaptation of gene expression in stationary phase bacteria / A. Ishihama//Curr.Opin.Genet.Develop.- 1997.- V.7.- P.582-588.

29. Joux F. Ecological implications of an improved direct viable count method for aquatic bacteria / F. Joux, Ph. Lebaron // Applied and environmental microbiology.-1997.- V. 63.- N. 9.- P. 3643-3647.

30. Kaiser D. How and why bacteria talk to each other / D. Kaiser, R. Losick // Cell.- 1993.- V. 79.- P. 873-885.

31. Kaplan H.B. Myxococcus xanthus cell density-sensing system required for multicellular development / H.B. Kaplan, L.A Plamann // FEMS Microbiol. Lett.- 1996.- V. 139.-P. 89-95.

32. Kaprelyants A.S. Do bacteria need to communicate with each other for growth? / A.S. Kaprelyants, D.B. Kell // Trends Microbiol.- 1996.- V.4.- P. 237241.

33. Kell D.G. Pheromones, social behavior and the functions of secondary metabolism in bacteria / D.G. Kell, A.S. Kaprelyants, A. Grafen // Tree.- 1995.-V. 10.- P. 126-129.

34. Klaassen C.D. (Eds) Casarett and Doull's toxicolody: the basic science of poisons / C.D. Klaassen, M.O. Admur, J. Doull // 5th ed. McGraw-Hill, Heals Professions Division.- 1996. 111 lp.

35. Kogure K. A tentative direct microscopic method for counting living marine bacteria / K. Kogure, U. Simudu, N. Taga // Can. J. Microbiol.- 1979.-V. 25.- P. 415-420.

36. Kolpakov A.I. Enhancing of enzyme stability using microbial autoinductors of anabiosis / A.I. Kolpakov, O.N. Ilinskaya, G.I. El'-Registan //

37. Abstr. VIII Meeting on Industrial Applications of Enzymes.- 1999.- Barcelona. Nov.30 Dec.01.- P.141 (P-17).

38. Kolter R. The stationary phase of bacterial life cycle / R. Kolter, D. Siegle, A. Torno // Ann.Rev.Microbiol.- 1993.- V.47.- P. 855-874.

39. Kozubek A. Resorcinol lipids, the natural non-isoprenoid phenolic amphiphiles and their biological activity / A. Kozubek // Chemical Reviews.-January, 1999.- V.99.- N1.- P. 1-25.

40. Leitao A. Mutagenic and genotoxic effects of mate (Ilex paraguariensis) in procaryotic organisms / A. Leitao, R. Braga // Braz. J. Med. Biol. Res.- 1994.-V. 27.-N7.- P. 1517-1525.

41. Lenard J. Mammalian hormones in microbial cells / J. Lenard // Trends Biochem. Sci.- 1992.- V. 17.- P. 147-150.

42. Lloyd D. Vigour, vitality and viability of microorganisms / D. Lloyd, A.J. Hayes//FEMS Microbiol. Lett.- 1995.- V.133.- P. 1-7.

43. Losick R. Crisscross regulation of cell-type-specifig gene expression during development in Bacillus subtilis / R. Losick, P. Stragier // Nature (London).- 1992.- V.355.- P.601-604.

44. Losick R. Why and how bacteria communicate / R. Losick, D. Kaiser // Sci. Amer.- 1997.- February.- P. 68-73.

45. Lyte M. The role of microbial endocrinology in infectious disease / M. Lyte//J. Endocrinol.- 1992.- V. 137.- P. 343-345.

46. Mamson M.D Bacterial locomotion and signal transduction / M.D. Mamson, J.D. Armitage, J.A. Hoch, R.M. Macnab // J. Bacterid.- 1998.-V.180.-N5.- P.1009-1022.

47. Maron D.M. Revised methods for the Salmonella mutagenicity test / D.M. Maron, B.N. Ames // Mutat. Res.- N113.- 1983.- P.174-210.

48. McCarol N.E. An Escherichia coli microsuspension assay for the detection of DNA damage induced by direct-acting agents and promutagens / N.E. McCarol, C.E. Piper, B.H. Keech // Environ. Mutagen.- 1981.- V.3.-P.607-616.

49. McDougald D. Non-culturability: adaptation or debilitation? / D. McDougald, S.A. Rice, D. Weichart, S. Kjelleberg // FEMS Microbiol.- 1998.-V.25.- P.1-9.

50. Mersch-Sundermann V. Genotoxicity of nitrated polycyclic aromatic hydrocarbons and related structures on Escherichia coli PQ37 (SOS-chromotest) / V. Mersch-Sundermann, S. Kern, F. Wintermann // Environ. And Molec. Mutagen.- 1991.- V.18.- P.41-50.

51. Montal M. Mitochondria, glutamate neurotoxicity and the death cascade / M. Montal // Biochim. Biophys. Acta.- 1998.- V. 1366.- P. 113-126.

52. Moran Jr.C.P. RNA polymerase and transcription factors / Jr.C.P. Moran //American Society for microbiology. Washington, D.C.- 1993.

53. Morgan J.A.W. Survival of nonculturable Aeromonas salmonicida in lake water / J.A.W. Morgan, G. Rhodes, R.W. Pickup // Applied and environmental microbiology. 1993.- V.- 59.- N. 3.- P. 874-880.

54. Morita R.Y. Bioavailability of energy and its relationship to growth and starvation survival in nature / R.Y. Morita // Can. J. Microbiol.- 1988.- V.34.-N4.- P.436-441.

55. NTP Toxicology and Carcinogenesis Studies of 4-Hexylresorcinol (CAS No. 136-77-6) in F344/N Rats and B6C3F1 Mice (Gavage Studies) // Natl Toxicol Program Tech Rep Ser.- 1988.- May;330.- P.l-166.

56. Nylund 1. Mutagenicity testing of protein-contained and biological samples using Ames/Salmonella plate incorporation test and fluctuation test / 1. Nylund, P. Einisto // Mut. Res.- 1993.- V.272.- P.205-214.

57. Ohlsen K.L. / K.L. Ohlsen, J.K. Grimsley, J.A. Hoch // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1994.-P. 1756-60.

58. Oleskin A.V. Social behavior of microbial populations / A.V. Oleskin // J. Basic Microbiol.- 1994.- V. 34.- N 6.- P. 425-439.

59. Oleskin A.V. Technical bioenergetics and ecosystem biotechnology / A.V. Oleskin, V.D. Samuilov // J. Basic Microbiol.- 1992.- V. 32.- P. 129-149.

60. Otto M. Pheromone cross inhibition between Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis / M. Otto, H. Echner, W. Voelter, F. Gotz // Inf. Immun.- 2001.- N69.- P. 1957-1960.

61. Perego M. A peptide export-import control circuit modulating bacterial development regulates protein phosphatases of the phosphorelay / M. Perego // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1997.- V.94.- N. 16.- P.8612-8617.

62. Poxton I.R. The butanol-soluble proteins of Klebsiella aerogenes. / I.R. Poxton, I.W. Sutherland// Microbios.- 1976.-15(60).- P. 93-103.

63. Quillardet P. SOS-chromotest, a direct assay of a SOS-function in Escherichia coli K12 to measure genotoxity / P. Quillardet, O. Huisman, R. D Ari, M. Hofnung // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1982. -V. 79. -P. 5971-5975.

64. Quillardet P. The screening, diagnosis and evaluation of genotoxic agents with batteries of bacterial tests / P. Quillardet, M. Hofnung // Mutat. Res.-1988.-V. 205.-P. 107-118.

65. Revenchon S. Integration of the quorum-sensing system in the regulatory networks controlling virulence factor synthesis in Erwinia chrysanthemii / S. Revenchon, M.L. Bouillant, G. Salmond, W. Nasser // Mol. Microbiol.- 1998.-V. 29.- P. 1407-1418.

66. Rosemeyer V. luxl- and luxR-homologous genes of Rhizobium etli CNPAF512 contribute to synthesis of autoinducer molecules and nodulation of

67. Phaseolus vulgaris / V. Rosemeyer, J. Michiels, C. Verreth, J. Vanderleyden // J. Bacterid.- 1998.- V.180.- N 4.- P.815-821.

68. Rosenberg S. Mutation for survival / S. Rosenberg // Curr. Opin. Genet. Dev.- 1997.- V. 7.- P. 829-834.

69. Rosenberg S.M. Recomination-dependent mutation in non-dividing cells / S.M. Rosenberg, R.S. Harris, S. Longerich, A.M. Galloway // Mutat. Res.-1996.- Vol.350.- N1.- P.69-76.

70. Roszak D.B. Survival strategies of bacteria in the natural environment / D.B. Roszak, R.R. Colwell // Microbiol. Rev.- 1987.- V.51.- N3.- P.365-379.

71. Salmond G.P.C. The bacterial "enigma": cracking the code of cell-cell communication / G.P.C. Salmond, B.W. Bycroft, C.S.A.B. Stewart, P. Williams // Mol. Microbiol.- 1995.- V. 16.- N 4.- P. 615-624.

72. Sansonetti P.J. Shigella sonnei plasmids: evidence that a large plasmid is necessary for virulence. / P.J. Sansonetti, D.J. Kopecko, S.B. Formal // Infect Immun.- 1981.- October; 34(1).- P. 75-83.

73. Shapiro J.A. The significances of bacterial colony patterns / J.A. Shapiro // BioEssays.- 1995- V. 17, N 7.- P. 597-607.

74. Shapiro J.A. Bacteria as multicellular organisms / J.A. Shapiro, M. Dworkin (eds.) // Oxford Univ. Press.- 1997.

75. Singh U.S. DNA cleavage by Di- and tryhydroxyalkylbenzenes. Characterization of products and the roles of O2, Cu(II) and alkali / U.S. Singh, R.T. Scannel, H.Y. An, B.J. Carter, S.M. Hecht // J. Amer. Chem. Society.-1995.- V. 117.-N51.- P. 12691-12699.

76. Slater E.E. / E.E. Slater, M.D. Anderson, H.S. Rosenkranz // Cancer Res.-1971.- V.31.-N3.- P. 970-973.

77. Smith I. / I. Smith, R. Slepecky, P. Setlow (ed.). // American society for Microbiology, Washington, D.C.- 1989.

78. Steinert M. Resuscitation of viable but nonculturable Legionella pneumophila Philadelphia JR 32 by Acanthamoeba cactellani / M. Steinert, L. Emody, J. Hacker//Appl. Environ. Microbiol.- 1997.- V.63.- N5.- P.2047-2053.

79. Stevenson J.L. Some observations on socalled "cystites" of the genus Arthrobacter / J.L. Stevenson // Can. J. Microbiol.- 1996.- V. 9.- N 4.- P. 467472.

80. Stich H.F. The action of transition metals on the genotoxicity of simple phenols, phenolic acids and cinnamic acids / H.F. Stich, M.P. Rosin, C.H. Wu, W.D. Powrie // Cancer Lett.- 1981.- V.14.- N3.- P.251-60.

81. Stolp H. Bacteriolysis / H. Stolp, M.P. Starr // Annu. Rev. Microbiol.-1965.- V. 19.- P. 79-105.

82. Sundman V. Morphological comparison of some Arthrobacter species / V. Sundman // Can. J. Microbiol.- 1958.- V. 4.- N 3.- P. 221-336.

83. Swan T.M. Stress tolerance in a yeast lipid mutant: membrane lipids influence tolerance to heat and ethanol independently of heat shock proteins and trehalose / T.M. Swan, K. Watson // Canadian J. Microbiol.- 1999.- V.45.- N6.-P.472-479.

84. Tholozan J.L. Physiological characterization of viable-but-nonculturable Campylobacter jejuni cells / J.L. Tholozan, J.M. Cappelier, J.P. Tissier, G. Delattre, M. Federichi // Applied and environmental microbiology.- 1999.- V.-65.- N. 3.- P. 1110-1116.

85. USEPA. Guidelines for mutagenicity risk assessment / USEPA // Fed. Reg. 1986. V.51. - P.340006-34012.

86. Valtonen V. Virulence of Salmonella strains with a reduced amount of O-antigen. / V. Valtonen // J. Gen. Microbiol.- 1969.- Aug; 57(3).- P. 28-9.

87. Vasilieva S. A comparative study of mutagenic and SOS inducing activity of biphenils, phenanthrenequinones and fluorenes / S. Vasilieva, T.

88. Tanirbergenov, S. Abilev, G. Migachev, M.T. Huttune // Mutat. Res.- 1990.- V. 244.- P. 321-329.

89. Vasilieva S. SOS-chromotest methodology for fundamental genetic research / S. Vasilieva // Res. Microbiol.- 2002.- Sep., 153 (7).- P. 435-40.

90. Von der Hude W. Epoxides: comparision of the induction of SOS repair in Escherichia coli and bacterial mutagenicity in the Ames test / W. Von der Hude, A. Seelbach, A. Basler// Ibid.- 1990.- V. 231.- P. 205-218.

91. Wintersberger U. On the origins of genetic variants / U. Wintersberger // FEBS Lett.- 1991.- Vol.285.- N2.- P.160-164.

92. Абилев C.K. Ускоренные методы прогнозирования мутагенных и бластомогенных свойств химических соединений / С.К.Абилев, Г.Г. Порошенко // Итоги науки и техники ВИНИТИ, сер. Токсикология.- 1986.Т. 14.- 175с.

93. Баснакьян И.А. Стресс у бактерий. / И.А. Баснакьян // М. Медицина.-2003.- 136 с.

94. Батраков С.Г. Тирозол ауторегуляторный фактор di Saccharomyces cerevisiae / С.Г. Батраков, Г.И. Эль-Регистан, Н.Н. Придачина, В.А. Ненашева, А.Н. Козлова, М.Н. Грязнова, И.Н. Золотарева // Микробиология.- 1993.- Т. 62.- Вып. 4.- С. 633-638.

95. Белицкий Г.А. Совол как индуктор микросомных ферментов, активирующих проканцерогены / Г.А. Белицкий, JI.M. Фонштейн, В.И. Худолей и др. // Экспер.онкология. 1987. - Т.9. № 3.- С. 20-23.

96. Беспалов М.М. Функции аутоиндукторов анабиоза микроорганизмов при создании метаболического блока в клетке / М.М. Беспалов, А.И. Колпаков, Н.Г. Лойко, Е.В. Дорошенко, А.Л. Мулюкин, А.Н. Козлова, Е.А.

97. Варламова, Б.И. Курганов, Г.И. Эль-Регистан // Микробиология.- 2000.-Т.69.-№2.-С.217-223.

98. Богданова Т.И. Влияние состава среды и условий культивирования на спорообразование хемолитотрофных бактерий / Т.И. Богданова, A.JI. Мулюкин, И.А. Цаплина, Г.И. Эль-Регистан, Г.И. Каравайко // Микробиология.- 2002.- Т.71.- №2.- С. 187-193.

99. Бошнаков Р.Х. Дифференциальная экспрессия генов в культивируемых и некультивируемых формах Salmonella typhimurium / Р.Х. Бошнаков, Ю.М. Романова, И.А. Зигангирова, A.J1. Гинцбург // Вестник РАМН.- 2001.- № . С.8-12.

100. Бутова С.Н. Теоретические основы биотехнологии. Биохимические основы синтеза биологически активных веществ / С.Н. Бутова, И.А. Типисева, Г.И. Эль-Регистан. Под общей редакцией И.М. Грачевой // М.-Элевар.- 2003.- 554с.

101. Вельков В.В. Новые представления о молекулярных механизмах эволюции: стресс повышает генетическое разнообразие /В.В. Вельков // Молекулярная биология.- 2002.- Т. 36.- №2.- С.277-285.

102. Воейков B.JI. Витализм: может ли он служить исследовательской программой? / B.JI. Воейков // Биофилософия.- М., Инст-т философии РАН.- 1997.-С. 183-195.

103. Воробьева Л.И. Стрессоры, стрессы и выживаемость бактерий / Л.И. Воробьева // Прикладная биохимия и микробиология.- 2004.- Т.40.- №3.-С.261-269.

104. Головлев Е.Л. Введение в биологию стационарной фазы бактерий: механизм общего ответа на стрессы / Е.Л. Головлев // Микробиология.-1999.- Т.68.- №5.- С.623-631.

105. Головлев Е.Л. Другое состояние неспорулирующих бактерий / Е.Л. Головлев // Микробиология.- 1998.- Т.67.- №6.- С.725-735.

106. Головлев Е.Л. Метастабильность фенотипа у бактерий / Е.Л. Головлев // Микробиология.- 1998.- Т.59.- №2.- С. 149-155.

107. Грант РФФИ N 97-04-49748. Микробный анабиоз: Индукция и механизм образования покоящихся форм у неспоровых метанотрофных бактерий // Москва. Институт микробиологии РАН.

108. Грузина В.Д. Коммуникативные сигналы бактерий / В.Д. Грузина // Антибиотики и химиотерапия.-2003.-№48 (10).-С. 32-39.

109. Грязнова М.Н. / М.Н. Грязнова, Г.И. Эль-Регистан, А.Н. Козлова и др. // Микроорганизмы, их роль в плодородии почвы и охране окружающей среды. М.: ТСХА им. К.А. Тимирязева. 1985. С. 88-93.

110. Гусев М.В. Регуляторные системы прокариот / М.В. Гусев, Л.А. Минеева // Микробиология. 1985.

111. Демкина Е.В. Репродуктивные покоящиеся формы Arthrobacter globiformis / Е.В. Демкина, B.C. Соина, Г.И. Эль-Регистан, Д.Г. Звягинцев // Микробиология.- 2000.- Т. 69.- N 3.- С. 377-382.

112. Дорошенко Е.В. Биоразнообразие покоящихся форм микроорганизмов / Е.В. Дорошенко // Автореферат дисс. канд. биол. наук. М.: Ин-т микробиологии РАН.- 2002.- 23 с.

113. Дорошенко Е.В. Характеристика диссоциантов Bacillus cereus / Е.В. Дорошенко, Н.Г. Лойко, О.Н. Ильинская, А.И. Колпаков, И.Б. Горнова, Е.В. Климанова, Г.И. Эль-Регистан // Микробиология.- 2001.- Т. 70.- N 6.-С. 811-819.

114. Дуда В.И. Образование покоящихся рефрактильных клеток у Bacillus cereus под влиянием ауторегуляторного фактора / В.И. Дуда, С.В. Пронин, Г.И. Эль-Регистан, А.С. Капрельянц, Л.Л. Митюшина // Микробиология.-1982.- T.51.-N 1.- С. 77-81.

115. Ждан-Пушкина С.М. Реакции клеток грамотрицательных бактерий на тепловой шок (стресс) / С.М. Ждан-Пушкина, Н.Б. Вербицкая // Успехи микробиологии.- 1989.- Т.23.- С. 137-159.

116. Завильгельский Г.Б. "Quorum sensing", или как бактерии "разговаривают" друг с другом / Г.Б. Завильгельский, И.В. Манухов // Молекулярная биология.- 2001.-Т.35.- N 2.- С. 268-277.

117. Ильинская О.Н. Краткосрочные тест-системы для определения генотоксичности / О.Н.Ильинская, А.Б.Маргулис // Методическое руководство. -Казань: изд-во КГУ. -2005. -31с.

118. Ильинских Н.Н. Микроядерный анализ и цитогенетическая нестабильность. Н.Н. Ильинских, В.В. Новицкий, Н.Н. Ванчугова, И.Н. Ильинских. Томск. Изд-во Томского университета.- 1991.- 272 с.

119. Капрельянц А.С. Структурно-функциональные изменения в бактериальных и модельных мембранах под действием фенольных липидов / А.С. Капрельянц, М.К. Сулейменов, А.Д. Сорокина // Биол. Мембраны.- 1987.- Т. 4.- N 3.- С. 254-261.

120. Кожевникова О.В. Типы регуляции. Аллостерический механизм / О.В. Кожевникова // Лекции по энзимологии. 2003.

121. Колпаков А.И. Стабилизация ферментов аутоиндукторами анабиоза как один из механизмов устойчивости покоящихся форм микроорганизмов / А.И. Колпаков, О.Н. Ильинская, М.М. Беспалов, Ф.Г. Куприянова

122. Ашина, В.Ф. Гальченко, Б.И. Курганов, Г.И. Эль-Регистан // Микробиология.- 2000.- Т.69.- №2.- С.224-230.

123. Кулаева О.Н. Белки теплового шока и устойчивость растений к стрессу / О.Н. Кулаева // СОЖ.- 1997.- N2.- С. 5-13.

124. Литвин В.Ю. / В.Ю. Литвин, А.Л. Гинцбург, В.И. Пушкарева и др. // Эпидемиологические аспекты экологии бактерий. М., 1998.

125. Литвин В.Ю. Обратимый переход патогенных бактерий в покоящееся (некультивируемое) состояние: экологические и генетические механизмы / В.Ю. Литвин, А.Л. Гинцбург, В.И. Пушкарева, Ю.М. Романова // Вестник РАМН.- 2000.- №1.- С.7-13.

126. Максимов В.Н. Влияние углеродного, азотного и фосфорного питания на рост R-, S- и М-диссоциантов Pseudomonas aerugenosa / B.H. Максимов, Е.С. Милько, И.А. Ильиных // Микробиология.- 1999.- Т.68.-№2.- С.206-210.

127. МЗ СССР. Оценка мутагенной активности новых лекарственных средств (Методические рекомендации).- М.-1991.- 88с.

128. МЗ СССР. Руководящие методические материалы по экспериментальному и клиническому испытанию новых лекарственных средств.- М.- 1982.- С.21-59

129. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике / Дж. Миллер // М.- Мир.- 1976.- С. 324-327.

130. Милько Е.С. Гетерогенность популяции бактерий и процесс диссоциации / Е.С. Милько, Н.С. Егоров // МГУ.- 1991.- С. 143.

131. Милько Е.С. Особенности углеводного метаболизма R-, S- и М-диссоциантов Pseudomonas aerugenosa / Е.С. Милько, Е.Н. Красильникова // Микробиология.- 1999.-Т. 68.- №2.- С.211-214.

132. Мулюкин А.Л. Образование покоящихся форм Bacillus subtilis и Micrococcus luteus / А.Л. Мулюкин, К.А. Луста, М.Н. Грязнова, А.Н. Козлова, М.В. Дужа, В.И. Дуда, Г.И. Эль-Регистан // Микробиология.-1996.- Т. 65.- Вып. 6.- С. 782-789.

133. Мулюкин А.Л. Образование покоящихся форм у неспорообразующих микроорганизмов / А.Л. Мулюкин // Автореферат дисс. канд. биол. наук. М.: Ин-т микробиологии РАН.- 1998.- 26 с.

134. Ненашев Е.А. Действие ауторегуляторов анабиоза некоторых микроорганизмов на дыхание митохондрий печени крысы / Е.А. Ненашев, Н.Н. Придачина, Г.И. Эль-Регистан, И.Н. Золотарева, С.Г. Батраков // Биохимия.- 1994.-Т. 59.- Вып. 1.- С. 1511-1515.

135. Николаев Ю.А. Адгезивные и ростовые свойства R- и S-диссоциантов Pseudomonas fluorescens / Ю.А. Николаев, Е.С. Милько // Микробиология.- 2000.- Т.69.- №2.- С.293-294.

136. Николаев Ю.А. Два новых внеклеточных адаптогенных фактора Esherichia coli К12 / Ю.А. Николаев // Микробиология.- 1997.- Т. 66.- Вып. 6.- С. 785-789.

137. Николаев Ю.А. Перекрестное действие внеклеточных факторов адаптации к стрессу у микроорганизмов / Ю.А. Николаев, Воронина Н.А. // Микробиология.- 1999.- Т. 68.- N 1.- С. 45-50.

138. Николаев Ю.А. Сравнительное изучение двух новых внеклеточных протекторов, образуемых клетками Escherichia coli при повышенной температуре / Ю.А. Николаев // Микробиология.- 1997.- Т. 66.- Вып. 7.- С. 790-795.

139. Олескин А.В. Действие серотонина (5-окситриптамина) на рост и дифференциацию микроорганизмов / А.В. Олескин, Т.А. Кировская, И.В. Ботвинко, J1.B. Лысак // Микробиология.- 1998.- Т. 67.- N 3.- С. 305-312.

140. Олескин А.В. Микробная эндокринология и биополитика / А.В. Олескин, И.В. Ботвинко, Т.А. Кировская // Вестн. Моск. Ун-та.- Сер. Биология.- 1998.- N 4.- С. 3-10.

141. Олескин А.В. Надорганизменный уровень взаимодействия в микробных популяциях / А.В. Олескин // Микробиология.- 1993.- Т. 62.- N 3.- С. 389-403.

142. Опарина И.А. Внутрипопуляционные взаимодействия в культуре бактерий Pseudomonas aeruginosa / И.А. Опарина // Автореф. дисс. канд.биол.наук. Москва. - 2002. - 22с.

143. Осипов Г.А. О химической природе ауторегуляторного фактора d Pseudomonas carboxydoflava / Г.А. Осипов, Г.И. Эль-Регистан, В.А. Светличный, А.Н. Козлова, В.И. Дуда, А.С. Капрельянц, В.В. Помазанов // Микробиология.- 1985.- Т. 54.- Вып. 2.- С. 186-190.

144. Плохинский Н. Математические методы в биологии. / Н. Плохинский // -М.- Изд-во Московского ун-та. -1978. -С.9-65

145. Покровский В.И. Медицинская микробиология / В.И. Покровский, O.K. Поздеев (Ред.) // ГЕОТАР Медицина.- М.- 1998.

146. Проворов Н.А. Актуальные вопросы популяционной генетики бактерий / Н.А. Проворов // Успехи современной биологии.- 2001.- Т. 121.-№6.- с.537-549.

147. Прозоров А.А. Рекомбинантные перестройки генома бактерий и адаптация к среде обитания / А.А. Прозоров // Микробиология.- 2001.- Т. 70.-№5.-С. 581-594.

148. Пшеничнов Р.А. Каталог химических мутагенов / Р.А. Пшеничное, В.А. Демаков, В.М. Колотов, B.JI. Поносов, Ю.В. Пашин // Свердловск.-УО АН СССР.- 1990.

149. Пяткин К.Д. Микробиология (с вирусологией и иммунологией) / К.Д. Пяткин, Ю.С. Кривошеин // Медицина.- М.- 1981.

150. Романова J1.B. Некультивируемые формы Francisella tularensis / JI.B. Романова, Б.Н. Мишанькин, Н.Л. Пичурина, С.О. Водопьянов, С.Р. Саямов // Журнал микробиологии.- 2000.- №2.- С. 11-15.

151. Романова Ю.М. / Ю.М. Романова, А.Л. Гинцбург // Молекулярная генетика.- 1993.- №6.- С.34-37.

152. Романова Ю.М. Генетический контроль индукции некультивируемого состояния у патогенных бактерий / Ю.М. Романова,

153. A.JI. Гинцбург//Микробиология.- 1996.- N 3.- С. 16-18.

154. Светличный В.А. Изучение содержания мембраноактивных ауторегуляторов при литоавтотрофном росте Pseudomonas carboxydoflava /

155. B.A. Светличный, А.К. Романова, Г.И. Эль-Регистан // Микробиология.-1986.- Т. 55.- Вып. 1.- С. 55-59.

156. Светличный В.А. Характеристики ауторегуляторного фактора d2, вызывающего автолиз клеток Pseudomonas carboxydoflava и Bacillus cereus / В.А. Светличный, Г.И. Эль-Регистан, А.К. Романова, В.И. Дуда // Микробиология.-1983.- Т.52.- N 1.- С. 33-38.

157. Смирнов В.В. Спорообразующие аэробные бактерии продуценты биологически активных веществ / В.В. Смирнов, С.Р. Резник, М.А. Василевская // Киев.- Наукова Думка.- 1982.- 280 с.

158. Соина B.C. Особенности строения клеток почвенных бактерий в условиях лимитированного роста / B.C. Соина, А.Г. Дорофеев, Н.С. Паников // Тез.докл. Всесоюзного совещания "Цитология микроорганизмов".- Пущино.- 1984.- С.62-64.

159. Соколенко А.В. Морфология и ферментативная активность некультивируемых форм холерных вибрионов / А.В. Соколенко, B.C. Каграманов, JI.E. Асеева, О.С. Бурша, С.Р. Саямов // Журнал микробиологии.- 2002.- №5.- С. 15-21.

160. Соленовский В.В. Оценка суммарной мутагенной активности факторов окружающей среды / В.В. Соленовский, B.C. Журков // Сб. НИИ общей и коммунальной гигиены им. Сысина АМН СССР.- М.- 1982.- С.7-11.

161. Солохина JI.B. Образование покоящихся форм и изменчивость Yersinia pseudotuberculosis под воздействием сине-зеленых водорослей (цианобактерий) и их экзометаболитов / Л.В. Солохина, В.И. Пушкарева,

162. B.Ю. Литвин // Журнал микробиологии.- 2001.- №3.- С. 17-22.

163. Степаненко И.Ю. Изучение роли алкилоксибензолов в стрессовом ответе микроорганизмов / И.Ю. Степаненко // Автореферат диссертации к.б.н.- Москва.- 2005.

164. Страховская М.Г. Активация роста дрожжей под действием ультрафиолетового света области 280 380 нм / М.Г. Страховская, Н.С. Беленикина, Г.Я. Фрайкин // Микробиология.- 1991.- Т. 60.- С. 292-297.

165. Страховская М.Г. Стимулирующее влияние серотонина на рост дрожжей Candida guillermondii и бактерий Streptococcus faecalis / М.Г. Страховская, Е.В. Иванова, Г.Я. Фрайкин // Микробиология.- 1993.- Т. 62.1. C. 46-49.

166. Танирбергенов Т. Штаммы Salmonella typhimurium, используемые при изучении мутагенов окружающей среды / Т. Танирбергенов, С. Абилев // Цитология и генетика. -1989. -Т.23.- N 6. -С.47-56.

167. Фонштейн Л.М. Методы первичного выявления генетической активности загрязнителей среды с помощью бактериальных тест-систем / Л.М. Фонштейн, С.К. Абилев, Е.В. Бобринев // Методические указания. М.- 1985.- 34с.

168. Фонштейн Л.М. Микроорганизмы как индикаторы мутагенной активности химических соединений и их метаболитов / Л.М. Фонштейн, А.А. Шапиро, С.К. Абилев // Итоги науки и техники ВИНИТИ, сер. Биология.-1975.- N5.- 690с.

169. Харвуд К. (под ред.). Бациллы. Генетика и биотехнология / К. Харвуд // Москва.- «Мир».- 1992.

170. Хохлов А.С. Низкомолекулярные микробные ауторегуляторы / А.С. Хохлов // М.- Наука.- 1988

171. Шапиро Дж.А. Бактерии как многоклеточные организмы / Дж.А. Шапиро // В мире науки.- 1988.- N 8.- С. 46-54.

172. Шлеева М.О. Образование «некультивируемых» клеток Mycobacterium tuberculosis и их оживление / М.О. Шлеева, Г.В. Мукамолова, М.В. Телков, T.JI. Березинская, А.В. Сыроешкин, С.Ф. Бикетов, А.С. Капрельянц // Микробиология.- 2003.- Т.72.- с. 76-83.

Информация о работе

Маргулис, Анна Борисовна
кандидата биологических наук
Казань, 2005
ВАК 03.00.07

Диссертация

Низкомолекулярные ауторегуляторные соединения как триггерные молекулы стресса у бактерий - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы