Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Нитроксидергические механизмы в развитии посттравматической дистрофии хряща коленного сустава

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Нитроксидергические механизмы в развитии посттравматической дистрофии хряща коленного сустава"

ЧЕРЕПОВСКИЙ Антон Владиславович

НИТРОКСИДЕРГИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ В РАЗВИТИИ ПОСТТРАВМАТИЧЕСКОЙ ДИСТРОФИИ ХРЯЩА КОЛЕННОГО СУСТАВА

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология 14.00.27 - хирургия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Владивосток - 2005

Работа выполнена во Владивостокском государственном медицинском университете

Научные консультанты:

доктор медицинских наук,

профессор Мотавкин Павел Александрович

доктор медицинских наук,

профессор Шуматов Валентин Борисович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Красников Юрий Александрович

доктор медицинских наук,

профессор Дубинкин Владимир Александрович

доктор медицинских наук Кириллов Олег Иванович

Ведущая организация: Ярославская государственная медицинская академия

Защита состоится « . ¿О&ТУ}^ 2005 года в «/0>' часов на заседа-

нии диссертационного совета Д 208.007.01 при Владивостокском государственном медицинском университете (г. Владивосток, пр. Острякова, 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Владивостокского государственного медицинского университета (г. Владивосток, пр. Острякова, 2).

Автореферат разослан >уфевраля 2005 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Рева Г.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Артроз - наиболее распространенная форма суставной патологии, приносящая значительный экономический ущерб обществу в связи с частым развитием при артрозе временной и стойкой нетрудоспособности [Лучихина Л.В., 2001]. По имеющимся сведениям, заболеванием страдает от 6,4 до 12% населения, причем в последние годы вызванная им нетрудоспособность возросла в 3-5 раз [Насонова В А. и соавт.,1994; Фо-ломеева О.М. и соавт., 1994,1996].

В структуре распространенности дистрофических поражений крупных суставов важное место занимает остеоартроз (ОА) коленного сустава (КС). Остеоартроз КС, наряду с ОА тазобедренного сустава, является наиболее частой причиной нетрудоспособности и инвалидности среди других заболеваний нижних конечностей [Moskowitz R.W. et al., 2001]. Экономические потери в США, вызванные настоящим заболеванием, исчисляются суммой 15,5 миллиардов долларов (в ценах 1994 года) [Yelin E., 1998].

Травматическое повреждение капсулярно-связочного аппарата КС в настоящее время определено как одна из основных причин раннего развития ОА колена [Daniel D. et al., 1994; Lane N.E. et al., 1993]. Существующее увлечение экстремальными видами спорта наряду с увеличивающейся спортивной нагрузкой также значительно повышает риск развития ОА, причем у лиц молодого возраста [Spector Т. et al., 1996].

В структуре травмы колена повреждение передней крестообразной связки (ПКС) с последующим развитием передней нестабильности КС является распространенной формой патологии сустава и встречается в среднем у одного из 3000 человек [Fu F.H. et al., 1999]. При этом частота развития ОА при дефиците ПКС составляет от 30 [McDaniel W.J. et al., 1983] до 70% [Kannus Р. et al., 1989].

Несмотря на успехи диагностики, современные исследователи отмечают значительные трудности в раннем выявлении посттравматического ОА КС. Остается неясным, какого рода молекулярные изменения в хрящевой ткани предшествуют морфологически и клинически позитивным стадиям артроза и, что не менее важно, в какие сроки после травмы эти изменения возникают [Felson D.T. et al., 1997; Messner К. et al., 1996; Rangger C. et al., 1995].

В настоящее время ОА определяется как «... результат действия механических и биологических факторов, дестабилизирующих нормальное соотношение процессов деградации и синтеза в хондроцитах, матриксе суставного хряща, а также в субхондральной кости. <...> В конечном итоге, ОА манифестирует путем развития морфологических, биохимических, молекулярных и биомеханических изменений клеток и матрикса...» [Kuettner K.E. et al., 1995]. Соответственно, для изучения инициальных механизмов хрящевой дистрофии необходимо использование специфических «маркеров», позволяющих обнаружить и оценить изменения на молекулярном и клеточном уровне. В последние годы на роль подобного маркера активно претендует оксид азота (NO) - химическое соединение, выполняющее функции универ-

сального регулятора тканевого и клеточного метаболизма с огромным диапазоном проявлений биологической активности.

Существует большое количество исследований, направленных на изучение роли N0 в метаболизме суставного хряща как в норме, так и при ОА. Однако, несмотря на это, имеющиеся данные характеризуются крайней противоречивостью. Так, не определена норма продукции оксида азота в здоровом хряще, так же, как не существует единого мнения о динамике продукции N0 в хряще при ОА, в первую очередь ввиду разнородности используемых моделей ОА. Клинико-морфологические исследования большей частью не учитывают стадийность ОА как заболевания, что снижает их практическую значимость. Имеющаяся противоречивость информации о влиянии N0 на развитие программированной клеточной смерти - апоптоза - в хряще до сих пор не позволяет концептуально рассматривать этот важный вопрос [Moskowitz R.W. et al, 2001]. Разноречивость имеющихся сведений фундаментального характера, несомненно, затрудняет клиническое применение полученных данных.

Целью работы являлось установление значения нитроксидергических механизмов в развитии посттравматической дистрофии суставного хряща коленного сустава.

Задачи исследования:

1. Изучить динамику нитроксидергической активности в хряще и синовиальной оболочке при экспериментальном посттравматическом ОА КС.

2. Провести иммуногистохимическое картирование и установить действующую в суставном хряще изоформу нитроксидсинтазы.

3. Определить уровень активности нитроксидсинтазы в хряще и синовиальной оболочке КС человека при хронической посттравматической нестабильности.

4. Оценить распространенность апоптотических изменений в клетках хряща и синовиальной оболочки в условиях посттравматической нестабильности КС.

5. Установить характер связи морфологических, гистохимических и им-муноцитохимических изменений хряща и синовиальной оболочки, возникающих при травме КС.

6. Исследовать нитроксидергическую активность хряща и синовиальной оболочки в сопоставлении с распространенностью апоптоза при клинически и морфологически позитивном ОА КС у человека.

7. Оценить степень тождественности морфологических, гистохимических и иммуноцитохимических изменений хряща и синовиальной оболочки, возникающих при травме и О А КС.

8. С учетом полученных данных о характере изменений хряща и синовиальной оболочки при травме КС сравнить отдаленные клинические результаты хирургического лечения острой и хронической посттравматической нестабильности КС.

Научная новизнаработ ы.

Впервые произведена оценка нитроксидергической активности в хряще и синовиальной оболочке КС при индуцированном посттравматическом ОА с этапным исследованием экспериментального материала.

Выполнено иммуногистохимическое картирование действующих изо-форм нитроксидсинтазы в хряще при травме и ОА КС у человека.

Впервые осуществлено комплексное исследование нитроксидергиче-ской активности и распространенности апоптоза в хряще и синовиальной оболочке КС человека в условиях хронической посттравматической нестабильности.

Установлен характер динамики апоптотической и нитроксидергиче-ской активности клеток хряща и синовиальной оболочки при ОА КС у человека.

Доказана роль синовиального воспаления как интегрированного фактора при формировании цепи патологических событий, вызванных травмой сустава и ведущих к разрушению суставного покрова КС.

Впервые определена взаимосвязь морфологических, гистохимических и биологических изменений хряща и синовиальной оболочки как структур, согласованно реагирующих на дисфункцию КС при травме и ОА.

На основании анализа и сопоставления полученных экспериментальных данных и результатов исследования операционного материала концептуально обоснована роль нитроксидергических процессов в развитии ранней дистрофии суставного хряща при травме КС.

Теоретическое ипрактическоезначениеработы.

Приведенные в диссертации систематизированные сведения являются оригинальным вкладом в развитие теории патогенеза дистрофии суставного хряща. Представленные данные свидетельствуют о значимой роли нитро-ксидергических механизмов в реализации патологических эффектов травмы на уровне биохимии и биологии хрящевых клеток. Теоретически обоснована инициирующая роль синовиального воспаления в формировании раннего функционального дефекта хондроцитов как предпосылки для развития структурного дефекта хряща.

Прикладное значение работы заключается в фундаментальном обосновании значительного расширения показаний для оперативного лечения посттравматической нестабильности КС в остром периоде. Анатомический подход к восстановлению поврежденных капсулярно-связочных структур позиционирован как эффективный способ раннего купирования посттравматического синовита и предотвращения прогрессирования хрящевой дистрофии. Материалы исследования могут служить основой для составления методических рекомендаций и использоваться в лекциях и практических занятиях по травматологии и ортопедии.

Положения, выставляем ые назащиту.

1. При экспериментальном посттравматическом О А КС высокая активность NOS в хряще индуцируется воспалением, выявляется в ранние сроки и

служит причиной прогрессирующего угнетения синтетической активности хондроцитов.

2. Активность NOS в хряще КС у человека при травме и ОА обеспечивается исключительно индуцибельной изоформой фермента.

3. Синовиальное воспаление является необходимым и достаточным условием для быстрого развития дистрофии суставного хряща при посттравматической нестабильности коленного сустава. Хрящевая дистрофия возникает вследствие индуцированного воспалением повышения iNOS-активности хондроцитов, вызывающего их апоптоз и угнетение синтетической активности.

4. Существует полная качественная тождественность гистохимических и биологических изменений хряща, возникающих при хронической посттравматической нестабильности и ОА КС. Полученные данные позволяют определить хрящевую дистрофию, возникающую при хирургически позитивной травме, а также существующую в форме ОА, как инициируемый воспалением NO-зависимый процесс, имеющий в своей основе апоптоз хондроцитов.

5. Основанием для выбора метода лечения в остром периоде травмы колена должна служить оценка степени тяжести структурного, а не функционального дефекта сустава. Первичное восстановление ПКС имеет несомненные преимущества в плане раннего устранения структурной (анатомической) и функциональной недостаточности КС.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на Всероссийском конгрессе ревматологов России (Саратов, 2003), IX Международном конгрессе по клинической патологии (Бангкок, 2004), III Международной научно-практической конференции «Динамика научных достижений» (Днепропетровск, 2004), Научной сессии ДВО РАН, СО РАМН и ДЗАПК «Новые технологии в диагностике и лечении заболеваний человека» (Владивосток, 2004), Региональном конгрессе «Человек и лекарство» (Владивосток, 2004), Annual International Congress ofEULAR (Берлин, 2004), XI Национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2004), IX World Congress of OARSI (Чикаго, 2004), заседаниях краевого научно-практического общества травматологов-ортопедов (Владивосток, 2003; 2004).

Публикации. Основные положения диссертации отражены в монографии «Оксид азота и апоптоз в патогенезе посттравматической дистрофии суставного хряща», 12 журнальных статьях, материалах отечественных и зарубежных конгрессов и конференций.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, пяти глав, отражающих результаты собственных исследований, обсуждения, выводов и практических рекомендаций. Диссертация изложена на 189 страницах и включает 9 таблиц и 76 рисунков (диаграммы, схемы, 72 микрофотографии). Список литературы содержит 345 источников, из них 27 отечественных и 318 - иностранных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальную часть работы составили исследования, выполненные на 25 белых нелинейных крысах-самцах массой 180-200 гр., содержавшихся в стандартных условиях вивария. У 20 животных создана модель посттравматической передней нестабильности КС.

Передняя нестабильность коленного сустава создавалась путем пересечения собственной связки надколенника. Операция носила внесуставной характер, что исключало ятрогенное повреждение хряща КС.

Эвтаназию животных осуществляли внутрибрюшинным введением тиопентала. Вывод животных из эксперимента производили на 30 (группа А; п = 5), 60 (группа В; п = 5), 90 (группа С; п = 5) и 150 (группа D; п = 5) сутки. Исследовали хрящ мыщелков бедра и синовиальную оболочку переднего заворота КС. Контрольную группу составили здоровые животные (5). Изучение материала производили в одно и то же время суток.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ У БОЛЬНЫХС ПАТОЛОГИЕЙ КОЛЕННОГО СУСТАВА

В основу работы положены результаты клинического и морфологического исследования материала, полученного при лечении 54 пациентов с патологией КС, находившихся в клинике травматологии, ортопедии и ВМХ в 2001-2004 году.

Согласно поставленным задачам, все больные были ранжированы на группы в соответствии с общими и специальными критериями отбора.

Общие критерии отбора: все пациенты имели клинические признаки острой либо хронической посттравматической передней нестабильности КС и/или рентгенологические признаки ОА КС.

Хронической нестабильностью считали посттравматическую нестабильность КС, существующую более 21 суток с момента травмы, не имеющую признаков острого состояния, характеризовавшуюся технической невозможностью выполнения первичного шва ПКС и требующую замещения (реконструкции) связки.

Степень выраженности рентгенологических изменений оценивали по классификации Косинской Н.С. [Косинская Н.С., 1961].

МОРФОЛОГИЧЕСКОЕИССЛЕДОВАНИЕОПЕРАЦИОННОГОМАТЕРИАЛА

Материалом для исследования послужили биоптаты хряща центральной части медиального мыщелка бедра и синовиальной оболочки передне-нижнего медиального заворота КС, полученные во время операций реконструкции ПКС, мозаичной костно-хрящевой артропластики и высокой остеотомии большеберцовой кости.

Забор материала для морфологического исследования производился у 29 больных, имевших клинические признаки хронической посттравматиче-

ской передней нестабильности КС и/или рентгенологические признаки ОА КС. Сформировано две исследуемых группы.

Группа 1 (п= 18): пациенты с хронической посттравматической передней нестабильностью КС без клинических и рентгенологических признаков ОА. Специальным критерием отбора в данном случае являлось отсутствие клинических признаков ОА до настоящей травмы КС, определенное в соответствии с диагностическими критериями ОА [ЛИшап Я. е! а1., 1986]. Так, у всех больных в периоде до травмы отсутствовали боли, крепитация и утренняя скованность колена.

Возраст пациентов составлял 18-35 лет (средний возраст 26,3±1,1 года), в то время как указанные диагностические критерии ОА предусматривают возраст более 38 лет [ЛИшап Я. е! а1., 1986]. Интерференция полученных морфологических данных с инволютивными изменениями хряща в данной группе также маловероятна - считается доказанным, что возрастные изменения хряща развиваются после 40 лет [Павлова В.Н. и соавт., 1988].

Давность травмы у больных группы 1 составляла 1,5-16 месяцев (в среднем 9,17±0,94 мес).

Таким образом, с учетом отсутствия у всех пациентов рентгенологических признаков ОА, развитие хронической посттравматической передней нестабильности явилось первым патологическим эпизодом в коленных суставах пациентов данной группы.

В качестве возрастного контроля использовали образцы хряща медиального мыщелка бедра и синовиальной оболочки, взятые на секции у лиц соответствующего возраста (22-31 год) без признаков суставной патологии (причина смерти - механическая травма); п = 5.

Группу 2 (п= 11) составили больные с клиническими и рентгенологическими признаками ОА КС. Из них пятеро имели I стадию ОА по Н.С. Ко-синской, четверо - II стадию, двое - III стадию ОА. Все пациенты отмечали боли в колене, как стартового характера, так и в покое, крепитацию, скованность в суставе, периодические либо персистирующие отеки. Возраст пациентов составил 45-69 лет (в среднем 52,46±2,47 года).

В 7 наблюдениях ОА явился следствием длительно (от 8 до 28 лет) существующей посттравматической нестабильности КС. У четырех больных заболевание носило идиопатический характер. Двое пациентов с ОА III стадии имели варусную деформацию КС.

Возрастным контролем для группы 2 явился аутопсийный материал от лиц возраста 50-62 лет, погибших в результате несчастного случая или умерших от заболеваний, не связанных с патологией суставов (п= 5).

Исследование секционного материала производили в течение 6 часов после смерти.

ИССЛЕДОВАНИЕЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГОИОПЕРАЦИОННОГОМАТЕРИАЛА

Гистохимический метод на NADPH-диафоразу. Синтазы азота способны проявлять различные каталитические функции. В основе гистохими-

ческой реакции, выявляющей локализацию NOS, лежит ее диафоразная активность [Hassal C.J.B. et al., 1992; Hope B.Y. et al., 1991]. Существующие исследования [Baussoulett С. et al., 1996; Furukawa K. et al., 1996; Schmidt H.H. et al., 1995] показали, что NADPH-диафораза солокализована со всеми тремя изоформами фермента. Нами использован метод на NADPH- диафоразу (NADPH-d), предложенный Норе, Vincent [Норе V.T, Vincent S.R., 1989]. Метод основан на образовании нерастворимого осадка диформазана в присутствии субстрата - нитросинего тетразолия и косубстрата - NADPH. Преимущество данной реакции заключается в том, что плотность образующегося осадка диформазана считается прямо пропорциональной молекулярному содержанию NOS [Мотавкин П.А. и соавт., 1998; Норе V.T, Vincent S.R., 1989], что дает возможность судить об активности энзима.

Материал погружали в охлажденный, приготовленный на 0,1 M фосфатном буфере (pH 7,4) 4% параформальдегид; два часа фиксировали при температуре 4°С, затем сутки промывали при той же температуре в 15% растворе сахарозы. Из замороженных в криостате образцов изготавливали срезы толщиной 40 мкм (хрящ) и 20 мкм (синовиальная оболочка), наносили на предметные стекла и помещали в среду, состав и конечная концентрация которой были следующими: 50 мМ трис-буфер (pH 8,0), 1 мМ NADPH ("Sigma", США), 0,5 мМ нитросинего тетразолия ("Sigma", США) и 0,2% тритон Х-100 ("ICN", США). Инкубацию проводили в течение 60 мин при температуре 37°С, после чего срезы ополаскивали в дистилляте, обезвоживали и заключали в бальзам.

В качестве контрольных использовали препараты, инкубированные с L-NAME, блокирующим активность NOS. При добавлении в инкубационную среду L-NAME срезы становились прозрачными или приобретали светло-розовый оттенок за счет неспецифической адсорбции формазана.

Исследованы хрящ и синовиальная оболочка экспериментальных животных (группы A-D) и больных групп 1 и 2.

Иммуногистохимическая идентификация изоформ нитроксидсин-тазы. Применялись антитела фирмы "Sigma" (США) и готовые наборы для проведения иммунопероксидазной реакции фирмы "ICN" (США).

Материал погружали в охлажденный, приготовленный на 0,1 M фосфатном буфере (pH 7,4) 4% параформальдегид; два часа фиксировали при температуре 4°С, затем сутки промывали при той же температуре в 15% растворе сахарозы. Из замороженных в криостате образцов изготавливали срезы толщиной 40 мкм (хрящ). Последние промывали в трис-НС1-буфере (pH 7,6) и в течение 20 мин обрабатывали смесью 50% этанола и 0,3% перекиси водорода для блокирования неспецифического фона эндогенной пероксидазы. Инкубацию с первичной антисывороткой (1:500) проводили при комнатной температуре во влажной камере 30 мин. После промывки срезов трис-буфером (5 мин) наносили вторичную антисыворотку (Immuno-Detection Kit) и инкубировали при комнатной температуре во влажной камере в течение 30 мин. Далее препараты повторно промывали трис-буфером и на 10 мин наносили раствор следующего состава: 3 мл трис-НС1-буфера (pH 7,6), 50 мкл 3%

перекиси водорода и 1 мг 3,3'-диаминобешидина тетрагидрохлорида.-Про-мывка, обезвоживание и заключение в бальзам выполнялись по стандартной методике. Для исключения неспецифической реакции часть препаратов вместо первичной антисыворотки обрабатывали забуференным физиологическим раствором.

Исследован хрящ у пациентов групп 1,2.

Исследование апоптоза. Исследование апоптоза в хондроцитах и клетках синовиальной оболочки прозодили с использованием иммуноцито-химического метода TUNEL (TdT-mediated dUTP nick end labeling), основанного на выявлении фрагментации ДНК клеток. Применялся исследовательский набор ApopTag Fluorescein In Situ Apoptosis Detection Kit фирмы "Chemicon" (США). Сущность метода заключается в следующем. Фрагментация ДНК при апоптозе носит характер межнуклеосомалыюй деградации с формированием фрагментов, содержащих 180 пар оснований - «лестницы ДНК» ("DNA ladder" [Arends M.J. et al., 1990]). Подобные фрагменты обна-* руживаются как в ядре, так и в тельцах апоптоза, и содержат большое количество свободных (З'ОН) - концов. При использовании TUNEL - метода свободные (З'ОН) - концы ДНК связываются с дигоксигенин-нуклеотидами, представляющими собой химическую «метку» (первый этап). На втором этапе дигоксигенин-нуклеотиды связываются с анти-дигоксигенин-антителами, конъюгированными с флуоресцеином. Таким образом, фрагментация ДНК становится доступной для визуальной детекции с применением люминесцентного микроскопа. В нашем случае использовался микроскоп "Axioplan" фирмы "Karl Zeiss" с фильтром FITS-типа. Количество апоптоти-ческих клеток представляли в виде отношения числа клеток с флуоресцирующими ядрами к общему числу клеток в поле зрения и выражали в процентах.

Описание метода: материал погружали в охлажденный, приготовленный на 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,4) 4% параформальдегид; два часа фиксировали при температуре 4°С, затем сутки промывали в 0,1 М фосфатном буфере с 7-8-кратной сменой раствора. После этого пропитывали 15% забуференным раствором сахарозы до погружения. Криостатные срезы толщиной 20 мкм монтировали на предметные стекла. Проводили постфиксацию в охлажденном растворе этанол-уксусной кислоты в течение 5 мин при -20°С, после чего промывали дважды по 5 минут в солевом фосфатном буфере. После удаления излишков влаги вокруг среза немедленно добавляли на образец 75 мкл уравнивающего буфера ("Chemicon", США) и инкубировали не менее 10 сек при комнатной температуре. После повторного удаления излишков влаги немедленно добавляли рабочий ТдТ-раствор ("Chemicon", США) из расчета 11 мкл раствора на 1 см2 ткани. Инкубировали во влажной камере один час при 37°С, затем на 10 мин погружали в стоп-буфер ("Chemicon", США). Далее промывали трехкратно по 5 мин солевым фосфатным буфером, после чего проводили аппликацию рабочего раствора флуоресцирующих антител ("Chemicon", США) из расчета 130 мкл на 5 см2 ткани на 1 час при комнатной температуре в темноте. Затем после промыва-

ния солевым фосфатным буфером трехкратно по 5 мин заключали срезы в забуференный раствор глицерина.

Исследован хрящ и синовиальная оболочка больных группы 1,2.

Общегистологические методы исследования. Цитоархитектоника хряща и структура синовиальной оболочки изучалась с применением окраски гематоксилин - эозином. Суммарное содержание гликозаминогликанов (ГАГ) в хрящевом матриксе выявлялось путем окрашивания 1% толуидино-вым синим.

Морфометрия и статистическая обработка данных. Визуализацию изображения всех микропрепаратов на компьютере получали с помощью видеосистемы, смонтированной на микроденситометре "Vickers M-85". Цифровую обработку изображения проводили с помощью программ Adobe Photoshop 6.0 и Microsoft Excel 97. Активность фермента (оптическую плотность гранул) и интенсивность окрашивания матрикса выражали в единицах оптической плотности (ЕОГТ).

Определение толщины зон хряща и учет объемного содержания хонд-роцитов производили на световом микроскопе "Karl Zeiss" с калиброванным полем зрения. Толщину зон хряща выражали в мкм. Объемное содержание хондроцитов высчитывали по зонам как отношение суммы площадей клеток в калиброванном поле зрения к площади калиброванного поля зрения и выражали в процентах.

Толщина зон хряща оценивалась как в экспериментальных препаратах (группы животных A-D), так и в препаратах больных группы 1, 2. Объемное содержание хондроцитов учитывалось в препаратах больных 1 и 2 группы.

Для фотографирования микропрепаратов на микроскопе "Axioplan" фирмы "Karl Zeiss" использовали пленку «Микрат-500», "Kodak C-41" и "Kodak Color-100". Фотографирование препаратов, исследованных на апоп-тоз, производилось на том же микроскопе на цифровые носители. Статистическая обработка полученных результатов проводилась на персональном компьютере IBM Pentium 4 с использованием программы Microsoft Excel 97. Применялись методы статистики для выборок малого объема. Описание данных включало вычисление средней арифметической (М) как меры положения и стандартного отклонения средней величины (т) как меры рассеяния. Оценку достоверности различий величин осуществляли по двухвыборочному t-критерию Student. Различия считали достоверными при р < 0,05.

ОЦЕНКА ОТДАЛЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ ОПЕРАТИВНОГО ЛЕЧЕНИЯ ОСТРОЙ И ХРОНИЧЕСКОЙ НЕСТАБИЛЬНОСТИ КОЛЕННОГО СУСТАВА

В 2001-2003 году в клинике травматологии и ортопедии ВГМУ автором выполнено 13 операций первичного шва ПКС у 13 пациентов с острой передней нестабильностью КС, обусловленной свежим разрывом ПКС. За тот же период произведена 31 реконструкция ПКС у 31 больного с хроническим дефицитом ПКС вследствие застарелого ее повреждения.

Методика операций шов и реконструкция ПКС производились через медиальный артротомный доступ с дистальным и проксимальным расширением [Muller W., 1983]. При ревизии сустава у всех пациентов с острой нестабильностью выявлен гемартроз, а у всех больных с хронической нестабильностью - синовит.

В 11 из 13 случаев свежего разрыва ПКС повреждение локализовалось проксимально, в двух — имело субсиновиальный интерстициальный характер. После прошивания фиксация связки осуществлялась проксимально по методике over-the-top, детально описанной W. Muller [Muller W., 1983]. Кроме восстановления центральной оси, по показаниям производилась менискэкто-мия либо шов мениска и капсулярных структур.

Для замещения ПКС у всех пациентов использовался трансплантат с дистальным основанием, выкроенный из сухожильно-апоневротических тканей передней поверхности коленного сустава и включающий медиальную треть сухожилия собственной связки надколенника, часть апоневротического растяжения надколенника и медиальную треть сухожилия четырехглавой мышцы бедра. После проведения трансплантата в костном канале больше-берцовой кости к межмыщелковому возвышению трансплантат фиксировался чрескостным швом к латеральному мыщелку бедра по методике over-the-top [Muller W., 1983]. Реконструкция медиальных структур включала пластику задней косой связки трансплантатом из передней порции сухожилия полуперепончатой мышцы, а также мобилизацию внутренней боковой связки с последующей проксимальной ее рефиксацией.

Послеоперационное ведение: иммобилизация гипсовой повязкой осуществлялась в течение 6-7 недель после операции. Изометрическая гимнастика назначалась со вторых суток после операции. После прекращения иммобилизации назначались упражнения с открытой кинематической цепью, в том числе с отягощениями. После восстановления объема движений в суставе 0-90°, увеличении объема и силы мышц бедра (обычно через 12 недель после операции) рекомендовались упражнения с закрытой кинематической цепью и плавание. Через 20 недель при условии достаточной силы мышц бедра разрешались упражнения закрытой цепи с отягощениями и легкий бег. Игровые контактные виды спорта, особенно с взрывными нагрузками, разрешались не ранее 10 месяцев после операции при условии хорошего (сопоставимого с контралатеральной конечностью) мышечного тонуса и отсутствии нагрузочных болей и отеков.

Учет результатов: оценка отдаленных результатов оперативного лечения проведена у 9 из 13 пациентов с острой нестабильностью (группа 3) и у 18 из 31 больного с хронической нестабильностью КС (группа 4). В обеих группах преобладали мужчины - 7:2 в группе 1 и 14:4 в группе 2. Средний возраст больных в группе 3 составил 28,8±1,12 года, в группе 4 - 25,6±1,1 (t = 2,04; р > 0,05).

Ни у кого из пациентов не было выявлено признаков суставной патологии травматического или иного генеза, существовавших до настоящей травмы.

В группе 3 все пациенты оперированы в течение 10 суток с момента травмы. В 4 группе 9 пациентам операция произведена в течение 6 месяцев с момента травмы, 5 оперированы в срок от 6 месяцев до года, у 10 больных сроки оперативного лечения составили более года с момента повреждения.

Для комплексной анатомо-функциональной оценки результатов нами использована шкала оценки Revised HSSKS (The Hospital for Special Surgery Knee ligament Rating form, 1988 [Windsor R.E. et al., 1988]). Шкала предусматривает балльную систему учета. Отличный результат характеризуется суммой 90-100 баллов, хороший - 80-89 баллов, удовлетворительный - 70-79 баллов, плохой - менее 70 баллов. Осмотр пациентов производился через 6 месяцев и один год после операции.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Моделирование передней нестабильности коленного сустава у животных вызывало ряд изменений хрящевой ультраструктуры, имевших фазовый характер.

В группе А (30 суток эксперимента) отмечено достоверное увеличение оптической плотности осадка диформазана в хондроцитах всех зон хряща (табл. 1). Наиболее выраженной активность NADPH-диафоразы по сравнению с нормой была в клетках глубокой зоны: 46,3± 1,98 ЕОП против 4,13±3,35 ЕОП в норме. Окраска толуидиновым синим выявила достоверное уменьшение содержания ГАГ в матриксе всех зон хряща приблизительно в равной степени. Выявлено достоверное увеличение толщины глубокой и промежуточной зоны хряща (табл. 1). Обнаружены изменения цитоархитек-тоники промежуточной зоны: преобладали трех- и четырехклеточные лакуны, отмечено появление пятиклеточных лакун.

У животных группы В (60 суток эксперимента) сохранялась достоверно высокая активность NADPH-диафоразы в клетках всех слоев хряща. Отмечены качественные изменения при исследовании на толуидиновый синий -резко снизилась интенсивность окрашивания экстратерриториального мат-рикса, содержание ГАГ в территориальном матриксе оставалось достоверно низким по сравнению с нормой. Выявлено достоверное уменьшение толщины всех зон хряща по сравнению с нормой; также, толщина поверхностной и промежуточной зон была достоверно меньше, чем у животных группы 1 (табл. 1). Радикально изменилась цитоархитектоника: клеточная структура промежуточной и глубокой зон была представлена 10-12-тиклеточными лакунами, имевшими вид колонн.

В препаратах животных группы С (90 суток эксперимента) активность NADPH-диафоразы оставалась достоверно высокой по сравнению с нормой. При окраске толуидиновым синим метахромазия матрикса сохраняла очаговый характер и низкую плотность окрашивания. Клеточная структура хряща характеризовалась выраженным уменьшением количества клеток и исчезновением многоклеточных лакун. Значительно уменьшилась толщина зон хряща - обнаружено статистически достоверное снижение высоты всех зон по сравнению с группой В (табл. 1).

Таблица 1.

Гистохимические и морфометрические характеристики суставного хряща коленного сустава при экспериментальной передней нестабильности

норма 30 дней 60 дней 90 дней 150 дней

Зоны хряща I 11 III I II III I II III I II III I II III

Плотность осадка диформ азана, ЕОП. 53,4+ 3,35 31,9 ± 2,85 4,13 ± 3,35 71,1± 0,37 ** 49,1 ± 0,50 *** 46,3 ± 1,98 *** 65,4± 037 60,8± 1,36 *** 69,6± 2,61 63,4± 2,48 * 70,5± 1,49 ♦«* 69,1± 1,61 *** 83,9± 3,10 *** 82,9± 1,86 *** 89,9± 3,71 ***

Интенсивность окрашивания толуидиновым синим, ЕОП 34,1± 0,99 56,9± 1,24 82,0± 0,45 21,0± 1,24 *** 37,9± 2,11 *** 40,5± 2,73 **» 17,9± 1,49 *** 30,0± 1,74 *** 45,0± 1,74 **# 23,5± 1,61 *** 26,3± 0,62 21,4± 0,87 *** 17,1± 0,74 *** 15,0± 0,74 *** 10,9± 0,74 •**

Толщина зон хряща, мкм. 69,9± 3,97 131,5± 7,69 183,8± 3,60 70,6± 1,49 163,8± 2,48 ** 202,1± 2,98 *« 44,9± 2,48 183,5± 2,11 *»* 207,1± 4,09 31,8± 0,99 *** 77,8± 6,82 ** 146,6± 5,33 *** 22,1± 0,74 72,5± 6,20 *** 137,8± 4,8 **«

* - различия с нормой достоверны при р< 0,05 I - поверхностная зона хряща

* * - различия с нормой достоверны при р< 0,01 II — промежуточная зона хряща

*** - различия с нормой достоверны при р< 0,001 III - глубокая зона хряща

В группе D (150 суток эксперимента) оптическая плотность осадка ди-формазана в хондроцитах достоверно превышала последнюю в группе С по всем зонам хряща. Окраска толуидиновым синим выявила достоверное снижение интенсивности окрашивания матрикса по сравнению с группой С при сохранении очаговой метахромазии. Толщина зон хряща также статистически достоверно уменьшилась по сравнению с группой С (табл. 1). Клеточная структура по-прежнему характеризовалась малым количеством клеток и отсутствием многоклеточных лакун.

В синовиальной оболочке животных группы А (30 суток эксперимента) зарегистрировано достоверное увеличение оптической плотности осадка ди-формазана в синовиоцитах - активность NADPH-диафоразы составила 128±2,1 ЕОП против Ш,6±2,1 ЕОП в норме (табл. 2).

Таблица 2.

Активность нитроксидсинтазы в синовиоцитах при экспериментальной передней нестабильности коленного сустава.

Длительность эксперимента, сутки Плотность осадка диформазана, ЕОП

НОРМА - 113,6 ±2,1

ЭКСПЕРИМЕНТ 30 128 ±2, Г"

60 137,4 ±0,74*"

90 138,8 ±0,5"*

150 153,4 ±0,99*"

*** - различия с нормой достоверны при р<0,001

При гистологическом исследовании выявлен диффузный, умеренно выраженный воспалительный инфильтрат из плазмоцитов, макрофагов и лимфоцитов, локализовавшийся в субсиновиальном слое. Морфологических признаков отека субсиновиального слоя не обнаружено.

У животных группы В сохранялась достоверно высокая активность NADPH-диафоразы в синовиоцитах (табл. 2). Постоянно обнаруживался диффузный плазмоцитарно-макрофагальный инфильтрат, в некоторых участках имевший очаговый периваскулярный характер.

В препаратах животных группы С активность NADPH-диафоразы в синовиоцитах оставалась достоверно высокой по сравнению с нормой (табл. 2). Персистировал субсиновиальный воспалительный инфильтрат, в том числе очагового периваскулярного характера. По-прежнему отсутствовал отек субсиновиальной зоны.

В группе D оптическая плотность осадка диформазана в синовиоцитах достоверно превышала последнюю в группе С (р < 0,001 - табл. 2). Гистоло-

гическая картина характеризовалась фиброзированием субсиновиального слоя, склерозом стенок сосудов, исчезновением периваскулярной инфильтрации и регрессом субсиновиального воспалительного инфильтрата.

Таким образом, можно заключить, что гистохимические изменения хряща выявляются на самых ранних стадиях функционирования коленного сустава в условиях экспериментальной посттравматической нестабильности. Данные изменения характеризуются значительным увеличением активности NOS в клетках хряща за относительно короткий промежуток времени (30 суток) с последующим стойким сохранением высокой активности энзима (табл. 1). Инициализация этого процесса происходит на фоне сохраненной целостности цитоархитектоники и, таким образом, структурно не проявляется. Однако повышение активности нитроксидсинтазы формирует фатальный функциональный дефект хондроцитов, проявляющийся в раннем (30 суток) угнетении синтеза ими структурных компонентов матрикса хряща и создающий тем самым предпосылки для прогрессирующего разрушения хрящевой ультраструктуры.

Изменения хряща в эксперименте развивались на фоне персистирова-ния морфологических признаков хронического пролиферативного синовита. Реактивный характер воспаления, скорее всего, можно исключить - оперативное вмешательство носило внесуставной характер. Почти невероятным является и ирритативный характер синовита, так как последний в полной мере выявлялся уже через 30 суток, в то время как хрящ в эти сроки не имел ни малейших признаков деструкции. Остается констатировать, что воспаление являлось прямым следствием существования нестабильности сустава и си-новит носил характер первичного или, по крайней мере, параллельно развивающегося процесса.

Важно отметить, что воспаление синовиальной оболочки и изменения хрящевого покрова у экспериментальных животных были объединены общностью гистохимических изменений, а именно, высокой активностью нитро-ксидсинтазы, согласованно возрастающей по мере прогрессирования хрящевой дисметаболии и персистирования синовита (рис. 1). Выявленная связь «пролиферативный синовит - оксид азота - дистрофия хряща» может быть объяснена влиянием провоспалительных цитокинов.

Установлено, что активность IL-1 и TNF-a при синовите опосредуется повышением уровня макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF), вызывающего пролиферацию синовиальных клеток и активацию макрофагов [Campbell I.K. et al., 1993]. Последние посредством хемо-аттрактантов привлекают в очаг воспаления лейкоциты и лимфоциты, что приводит к развитию хронической инфильтрации [Alsalameh S. et al., 1992; Cavaillon J. M., 1993,1995; Cavaillon J. M. et al„ 1993; Jorgensen C. et al., 1991]. С другой стороны, имеются прямые доказательства (IL-1)-индуцированного NO-опосредованного ингибирования синтеза протеогли-канов хрящевого матрикса, полученные в опытах in vitro на крысином и

плотность осадка диформазана, ЕОП

153,4

норма

30 60 90

длительность эксперимента, сутки

■ поверхностная зона хряща

□хрящ*

■ синовиальная оболочка

Рис. 1. Динамика активности NOS в хряще и синовиальной оболочке в эксперименте.

бычьем хряще [Attur M.G. et al., 1998; Jouzeau J.Y. et al, 1999]. При этом отмечено восстановление синтеза протеогликанов после добавления как ингибиторов IL-1 (НПВП), так и ингибиторов N0 (аналоги L-аргинина) [Jouzeau J.Y. et al., 1999]. Согласно данным van der Kraan et al. (2000), введение IL-1 в коленный сустав нелинейным лабораторным мышам вызывало резкое угнетение ВМР-2 (bone morphogenetic protein-2) - зависимого синтеза протеогликанов, в то время как инъекции IL-1 в суставы iNOS-дефицитных мышей ин-гибирующего действия на (ВМР-2) - опосредованный синтез протеогликанов не оказывали [van der Kraan et al., 2000]. По сообщению Studer R. et al. (2000), применение ^монометил^-аргинина (L-NMA) - селективного ингибитора iNOS - в изолированной культуре кроличьего и человеческого хряща при ОА приводит не только к восстановлению синтеза компонентов матрик-са, но и существенно увеличивает активность противовоспалительных цито-кинов (IGF-I) [Studer R. et al., 2000]. Таким образом, действие ингибиторов NO может носить перекрестный характер и влиять на компоненты цитоки-нового каскада в хряще. Также, отсутствие угнетения синтеза протеогликанов и дефекта активности IGF-I при экспериментальном ОА у мышей с генетически блокированной активностью iNOS обнаружено van den Berg W.B. et al. (1999).

Логичным является вывод, что для угнетения синтетической активности хондроцитов необходимо согласованное действие провоспалительных цитокинов и NO, при этом первые выступают в роли индуктора, а второй служит эффектором процесса. Другой особенностью NO является поддержание высокой активности провоспалительных цитокинов путем ингибирова-ния таковой у их антагонистов - противовоспалительных цитокинов (рис. 2).

Рис. 2. Возможный NO-зависимый механизм хрящевой дистрофии в эксперименте.

Сопоставляя приведенные данные с собственными результатами, можно заключить, что обнаруженный нами функциональный дефект хондроци-тов, возникающий в ранние сроки экспериментальной посттравматической нестабильности, связан с индуцированной воспалением активацией NOS в клетках хряща.

Существует большой соблазн считать найденные изменения аналогичными процессам, происходящим в суставном хряще при ОА у человека. Однако есть обоснованное мнение, что прямой перенос данных, полученных при исследовании экспериментальных моделей, на человека не вполне правомерен [Павлова В.Н. с соавт., 1988; Moskowitz R.W. et al., 2001].

При исследовании препаратов хряща у человека, как в возрастном контроле, так и в группах 1 и 2, особое внимание уделялось изучению состояния поверхностной и промежуточной зоны хряща. Поверхностная зона в силу своего расположения испытывает нагрузку наибольшей интенсивности при функционировании сустава и рано подвергается патологическим изменениям. Верхний отдел промежуточной зоны служит «центром фокального поражения всех компонентов суставного хряща на начальных этапах развития ос-теоартроза». Этот участок, являясь местом смены направления коллагеновых волокон, испытывает повышенные нагрузки [Павлова В.Н. и соавт., 1988]. Структурно-функциональная значимость данного отдела такова, что в англоязычной литературе он имеет собственное название - "upper-mid zone" (см., например, Moskowitz R.W. et а!., 2001).

Оценка гистологических и морфометрических характеристик хряща в препаратах возрастного контроля (возраст 22-31 год) не выявила каких-либо патологических изменений.

Lamina splendens сохраняла целостность на всем протяжении. Расположение и форма лакун соответствовали зонам их локализации. Так, поверхностная зона содержала преимущественно одно- и двухклеточные тангенциально ориентированные лакуны, в то время как верхняя часть промежуточной зоны имела как горизонтально расположенные, так и вертикальные двухкле-точные и, редко, трехклеточные лакуны. Практически не обнаруживались пустые лакуны.

Толщина поверхностной и промежуточной зоны в среднем равнялась соответственно 280±9,39 мкм и 882±40,2 мкм. Среднее объемное содержание хондроцитов составляло 10,7±0,73% в поверхностной зоне, 9,8±0,36% - в промежуточной и 9,88±0,65% - в базальной зоне.

Насыщенность матрикса ГАГ не обнаруживала дефекта: зональная плотность окрашивания толуидиновым синим сохраняла равномерность, без участков метахромазии. Среднее значение интенсивности окрашивания хрящевого матрикса поверхностной зоны составило 48,1±2,23 ЕОП.

Исследование активности NADPH-диафоразы позволило установить, что во всех препаратах хряща контрольной группы активность фермента отсутствовала - оптическая плотность хондроцитов была ниже фоновых значений.

Иммунопероксидазная реакция, проведенная с целью идентификации изоформ нитроксидсинтазы, дала отрицательный результат - во всех препаратах признаки наличия конституитивной либо индуцибельной NOS отсутствовали.

По результатам применения TUNEL-метода детекции апоптоза количество клеток с признаками апоптотической активности было незначительным и составило 3,78±0,03% в поверхностной зоне и 4,68±0,11% - в промежуточной зоне.

Поверхностная зона синовиальной оболочки у лиц молодого возраста во всех наблюдениях была представлена тремя - четырьмя слоями синовио-цитов. Субсиновиальный слой содержат небольшое количество клеток,

представленных преимущественно макрофагами и плазмоцитами, и единичные сосуды. Инфильтративных и продуктивных изменений, в том числе пе-риваскулярного характера, выявлено не было.

В синовиальной оболочке отмечена положительная реакция на NADPH-диафоразу. Высокая оптическая плотность осадка диформазана (87,2±2,6 ЕОП) выявлена в цитоплазме синовиоцитов, в то время как интенсивность окрашивания клеток субсиновиального слоя имела фоновые значения.

При использовании TUNEL-метода во всех препаратах группы возрастного контроля выявлены признаки апоптотической активности клеток синовиальной оболочки. Положительная реакция на апоптоз проявлялась в виде различной степени интенсивности флуоресценции ядер синовиоцитов. Апоп-тотические клетки локализовались в синовиальном слое; активности апопто-за в клетках субсиновиального слоя не выявлено.

Проведенная оценка гистологических и гистохимических характеристик синовиальной оболочки коленного сустава у молодых субъектов позволяет заключить, что локализация зон активности NADPH-диафоразы синовиальной оболочки в норме связана исключительно со слоем синовиоцитов. Наличие участков апоптотической активности характерно для этого же слоя. Таким образом, выявлена солокализация зон активности фермента и зон апоптоза на фоне отсутствия каких-либо признаков патологических структурных изменений синовии.

В препаратах хряща у лиц старшего возраста (50-62 года) при общей сохранности хрящевой структуры и архитектоники обнаружены качественные и количественные изменения в сравнении с молодыми субъектами.

Отмечено достоверное уменьшение толщины поверхностной и промежуточной зоны - соответственно 243±5,5 и 813,75±17 мкм. Также выявлено статистически значимое снижение объемного содержания хондроцитов по всем зонам хряща. Во всех препаратах имелась диффузная метахромазия матрикса поверхностной зоны при окрашивании толуидиновым синим, при этом интенсивность окрашивания матрикса поверхностной зоны (3 8,57± 1,96 ЕОП) была достоверно ниже, чем у лиц молодого возраста (табл. 3).

Во всех образцах хряща обнаружены признаки активности NADPH-диафоразы, проявлявшиеся в синем окрашивании цитоплазмы хондроцитов поверхностной зоны. Оптическая плотность осадка диформазана составила 56,5±6,57 ЕОП, в то время как в хряще молодых субъектов активности фермента не было выявлено вовсе.

При проведении иммуноцитохимического исследования в хондроцитах поверхностной зоны идентифицирована индуцибельная NOS. Присутствия других изоформ фермента не обнаружено.

Произведенный учет числа хондроцитов с признаками апоптотической активности позволил установить, что количество апоптотических клеток было небольшим и не имело достоверных различий (табл. 3) с количеством таковых в хряще лиц молодого возраста, как в поверхностной, так и в промежуточной зоне.

Таблица 3.

Гистохимические, иммуноцитохимические и морфометрические характеристики суставного хряща коленного сустава (возрастной контроль)

ВК1 ВК2

Объемное содержание хондроцитов, % I 10,7 ±0,73 7,96 ±0,36***

II 9,8 ±0,36 7,45 ±0,43**

III 9,88 ±0,65 7,63 ±0,32**

Толщина зон хряща, мкм I 280 ±9,39 243 ± 5,5**

II 882 ±40,2 813,75 ± 17*

Плотность осадка диформазана, ЕОП I отсутствует 56,5 ± 6,57***

Интенсивность окрашивания толуидиновым синим, ЕОП I 48,1 ± 2,23 38,57 ±1,96***

Содержание апоптотических клеток, % I 3,78 ±0,03 3,9 ±0,05

II 4,68 ±0,11 4,69 ± 0,07

ВК1 - молодой возраст; ВК2 - старший возраст

*- различие достоверно при р < 0,05; I - поверхностная зона хряща; * *- различие достоверно при р < 0,01; II - промежуточная зона хряща; **• - различие достоверно при р < 0,001 III - глубокая зона хряща.

Таким образом, суставной хрящ коленного сустава у лиц старшей возрастной группы обнаруживал морфологические признаки, характерные для возрастной деградации. Подобными признаками, по мнению В. Н. Павловой и соавт. (1988), являются прежде всего уменьшение толщины поверхностной и промежуточной зоны, а также снижение объемного содержания хондроци-тов, особенно в поверхностной зоне. Признаком инволютивной функциональной недостаточности хондроцитов служит уменьшение содержания ГАГ в матриксе поверхностной зоны [Павлова В.Н. с соавт., 1988].

Обнаруженная гистохимическая солокализация NADPH-диафоразы и iNOS свидетельствует о том, что нитроксидергическая активность хряща в описанных условиях обеспечивается индуцибельной изоформой фермента.

Выявленная активность iNOS в хондроцитах поверхностной зоны существует на фоне гистологической картины возрастной деградации хряща (также наиболее выраженной в поверхностной зоне). В отсутствие активности энзима в хряще лиц молодого возраста, высокая активность iNOS расценена нами как признак гистохимической инволюции хряща, существующий наряду со структурными признаками старения последнего.

Гистологическая оценка структурных характеристик синовии у лиц старшей возрастной группы не выявила каких-либо значимых отличий в сравнении с подобными характеристиками у молодых субъектов. В то же

время, при исследовании на КАОРН-диафоразу установлено, что оптическая плотность осадка диформазана в синовиоцитах статистически достоверно превышала подобную плотность в синовиоцитах лиц молодого возраста (103±1,6 против 87,2±2,6 ЕОП; 1 = 5,18; р < 0,001). По-прежнему, зоны высокой активности фермента соответствовали слою синовиоцитов.

Количество апоптотических клеток в слое синовиоцитов было незначительным. Признаков апоптотической активности в клетках субсиновиального слоя не выявлено.

У пациентов с хронической посттравматической передней нестабильностью КС (группа 1) микроскопия хряща дала следующие результаты. Во всех препаратах выявлена сохранность зональной структуры хряща. Бесклеточная пластинка присутствовала во всех образцах. Зональная цитоархитек-тоника (расположение и форма лакун) в целом соответствовала таковой в препаратах возрастного контроля. Пустые лакуны отсутствовали. Оценка объемного содержания хондроцитов по зонам не выявила статистически значимых различий в сравнении с возрастным контролем. Также, соответствие контролю выявлено при учете толщины поверхностной и промежуточной зон хряща (табл. 4).

Таблица 4.

Гистохимические, иммуноцитохимические и морфометрические характеристики суставного хряща коленного сустава при посттравматической передней нестабильности

Возрастной контроль (В К) Исследуемая группа

Объемное содержание хондроцитов, % I 10,7 ±0,73 11,0 ±0,2

II 9,8 ±0,36 10,45 ±0,27

III 9,88 ±0,65 10,53 ± 0,32

Толщина зон хряща, мкм I 280 ±9,39 290 ±4,17

II 882 ± 40,2 884 ± 14,2

Плотность осадка диформазана, ЕОП I отсутствует 60,6 ±4,8***

Интенсивность окрашивания толуидиновым синим, ЕОП (поверхностная зона) I 48,1 ±2,23 8,93 ± 0,6***

Содержание апоптотических клеток, % I 3,78 ± 0,03 22,03 ± 1,4***

II 4,68 ±0,11 21,48 ± 1,7***

*** - различие с ВК достоверно при р < 0,001

I- поверхностная зона хряща;

II- промежуточная зона хряща; III - глубокая зона хряща.

В отличие от морфологических, гистохимические характеристики хряща имели ряд существенных отличий.

Во всех без исключения препаратах группы 1 обнаружена значительная активность NADPH-диафоразы. Оптическая плотность осадка диформазана в клетках хряща составила 60,6±4,8 ЕОП (табл. 4), в то время как в препаратах возрастного контроля, как уже отмечалось, активность фермента отсутствовала. Высокая активность энзима выявлена преимущественно в хондроцитах поверхностной зоны, однако в некоторых образцах окрашиванию подверглись и клетки промежуточной зоны хряща.

Иммуноцитохимический метод выявил, что NADPH-диафоразная активность в клетках хряща у больных группы 1 обусловлена присутствием индуцибельной NOS. Признаков наличия других изоформ фермента не зарегистрировано.

При оценке суммарного содержания гликозаминогликанов во всех препаратах группы 1 обнаружено значительное снижение интенсивности окрашивания хрящевого матрикса толудиновым синим. В поверхностной зоне оптическая плотность осадка была почти в 6 раз ниже, чем в препаратах возрастного контроля (8,93±0,6 против 48,1±2,23 ЕОП), при этом интенсивность окрашивания была низкой как в экстратерриториальном, так и в территориальном матриксе. В ряде наблюдений метахромазия экстратерриториального матрикса выявлена и в промежуточной зоне.

Во всех препаратах группы 1 обнаружена апоптотическая активность клеток поверхностной зоны хряща. В некоторых наблюдениях большое количество апоптотических клеток выявлено и в промежуточной зоне. Положительная реакция на апоптоз проявлялась в виде различной степени интенсивности флуоресценции ядер хондроцитов. Процентное содержание апоп-тотических клеток, как в поверхностной, так и в промежуточной зоне, статистически достоверно превышало таковое в препаратах возрастного контроля (табл. 4). При этом апоптоз идентифицирован как в фазе конденсации хроматина без выраженных морфологических признаков изменений ядра, так и в фазе распада ядра и формирования телец апоптоза.

Также, во всех образцах хряща обнаружено совпадение локализации апоптотических клеток и участков высокой активности NOS. При этом соло-кализация выявлена и в препаратах с высокой активностью нитроксидсинта-зы в промежуточной зоне хряща.

При гистологическом исследовании синовиальной оболочки во всех препаратах группы 1 выявлены морфологические признаки хронического синовита. Картина воспаления характеризовалась ворсинчатой гиперплазией синовиальной оболочки слабой и умеренной степени выраженности. Утолщение слоя синовиоцитов являлось следствием пролиферации клеток до 5-6 слоев. Постоянным признаком был диффузный умеренно выраженный воспалительный инфильтрат, состоявший из лимфоцитов, макрофагов и плаз-моцитов. Локализацией инфильтрата являлся субсиновиальный слой. В глубоких отделах стромы инфильтрат имел очаговый периваскулярный харак-

тер. Постоянно присутствовал субсиновиальный ангиоматоз различной степени выраженности.

Во всех наблюдениях отмечено достоверное увеличение оптической плотности осадка диформазана в синовиоцитах - активность NADPH-диафоразы составила 133,4±2,05 ЕОП против 87,2±2,2 ЕОП в норме (р < 0,001). При этом NADPH-положительные клетки выявлены и в субсиновиальном слое, в отличие от препаратов возрастного контроля.

Во всех препаратах обнаружено большое число клеток с признаками апоптотической активности, располагавшихся в слое синовиоцитов. Количество апоптотических клеток существенно превышало таковое в препаратах контрольной группы. Отмечено появление апоптотических клеток и в с>бси-новиальном слое.

Как следует из представленных данных, морфологические и гистохимические изменения хряща и синовиальной оболочки у больных с посттравматической нестабильностью КС полностью соответствуют таковым изменениям, обнаруженным в ранние (30 суток) сроки эксперимента. И в опыте, и при исследовании человеческого материала состояние хряща характеризуется высокой активностью NOS хондроцитов на фоне сохранной хрящевой цитоархитектоники, в то время как зоны высокой нитроксидергической активности клеток синовиальной оболочки соответствуют очагам инфильтра-тивного воспаления. Можно отметить, что синовиальное воспаление вновь выступает в роли необходимого условия для возникновения дистрофии хряща, проявляющейся прежде всего снижением содержания ГАГ хрящевого матрикса.

Другим патологическим проявлением активности NOS в хряще и синовиальной оболочке при травме КС можно считать апоптоз. Данное утверждение основывается на выявленной солокализации зон высокой нитроксидер-гической и апоптотической активности, существующей как в хряще, так и в синовиальной оболочке.

Дальнейшая оценка результатов проводилась в рамках анализа связи воспаления, активности NOS и апоптоза. Существенное препятствие заключалось в совершенном отсутствии литературных сведений о возможной роли NO-ергической активности и апоптоза в развитии хрящевой дистрофии у человека при посттравматической нестабильности. Однако известно, что длительно существующая выраженная нестабильность КС при дефиците ПКС приводит к разрушению суставного покрова сустава и, как следствие, к развитию остеоартроза [Casscells S.W., 1985; Muller W., 1983; Segal P. et al., 1980; Noyes F.R. et al, 1983; Zamber R.W. et al., 1989]. Соответственно, необходимо было выяснить, специфичны ли обнаруженные нами изменения для посттравматической нестабильности КС либо они являются ранней стадией единого, непрерывно развивающегося процесса - посттравматического ОА. Для этого следовало оценить с тех же позиций состояние хряща и синовиальной оболочки у больных с верифицированным остеоартрозом КС.

У больных с I стадией ОА при гистологическом исследовании биопта-тов обнаруживалась сохранность зональной структуры хряща, за исключени-

ем lamina splendens, в двух наблюдениях имевшей участки повреждения. Основным отличительным признаком структурных изменений хряща, выявленным при морфометрии, являлось достоверное снижение объемного содержания хондроцитов в поверхностной зоне, составившее 6,17±0,32% против 7,96± 0,36% в возрастном контроле (табл. 5).

Таблица 5.

Гистохимические, иммуноцитохимические и морфометрические характеристики суставного хряща коленного сустава при остеоартрозе

Возрастной контроль (ВК) Группа 2

Объемное содержание хондроцитов1, % I 7,96 ±0,36 6,17 ±0,32**

II 7,45 ± 0,43 6,46 ±0,22

III 7,63 ± 0,32 7,46 ±0,18

Толщина зон хряща1, мкм I 243 ± 5,5 197 ±2,48***

II 813,75 ± 17 786 ±9,91

Плотность осадка диформазана, ЕОП I 56,5 ± 6,57 94,4 ± 1,4***

Интенсивность окрашивания толуидиновым синим, ЕОП I 38,57 ± 1,96 9,5 ± 0,46***

Содержание апоптотических клеток, % I 3,9 ± 0,05 36,18 ±2,05***

II 4,69 ± 0,07 38,4 ±3,36***

1 - в группе 2 оценивалось у больных с ОА1 стадии I - поверхностная зона хряща; **- различие с ВК достоверно при р < 0,01 II - промежуточная зона хряща;

** • - различие с ВК достоверно при р < 0,001 III - глубокая зона хряща.

Помимо обеднения клетками, в поверхностной зоне обнаружены пустые лакуны. Лакунарное строение промежуточной зоны характеризовалось примерно равным содержанием одно-, двух- и трехклеточных лакун. Статистически значимых отличий объемного содержания клеток в промежуточной зоне в сравнении с возрастным контролем не выявлено (табл. 5).

Существенно уменьшилась толщина поверхностной зоны, в то время как толщина промежуточной зоны изменилась незначительно (табл. 5).

При окраске толуидиновым синим отмечено весьма значительное - четырехкратное - снижение интенсивности окрашивания матрикса поверхностной зоны по сравнению с возрастным контролем (табл. 5). При этом мета-хромазия имела не очаговый, а сплошной характер - в пределах поверхностной зоны окрашивание отсутствовало как в экстратерриториальном, так и в территориальном матриксе.

Гистологическое исследование у больных, страдавших ОА II и III стадии, выявило различные фазы разрушения хряща.

В препаратах пациентов со II стадией заболевания определялось деструкция поверхностной зоны хряща с формированием узур и очагов разволок-нения. Немногочисленные хондроциты располагались в одноклеточных и, редко, двухклеточных лакунах по периметру участков повреждения хряща.

При окраске толуидиновым синим окрашиванию подверглась только глубокая часть промежуточной зоны. Метахромазия матрикса была очаговой - экстратерриториальный матрикс имел низкую плотность окрашивания.

Гистологическая картина III стадии ОА характеризовалась признаками полного разрушения хряща. Отсутствовали поверхностная и промежуточная зоны. Глубокая зона была представлена узурами, окруженными многоклеточными лакунами, содержащими 8 и более клеток.

Во всех стадиях ОА в хряще отмечена высокая диафоразная активность. Окрашиванию диформазаном подверглись клетки всех зон хряща. Высокая активность фермента отличала хондроциты, находившиеся в непосредственной близости к очагам деструкции. Средняя оптическая плотность осадка диформазана в клетках поверхностной зоны составила 94,4±1,4 ЕОП и, соответственно, достоверно превышала таковую в препаратах возрастного контроля (табл. 5).

С помощью иммуноцитохимического метода во всех наблюдениях установлена гистохимическая солокализация NADPH-диафоразы и индуци-бельной NOS в хряще при ОА. Как и ранее (в группе 1), наличия других изо-форм фермента не обнаружено.

Использование TUNEL-метода позволило выявить высокую апоптоти-ческую активность в клетках поверхностной и промежуточной зоны хряща при ОА. Количество апоптотических клеток составляло в среднем 36±2,05% в поверхностной и 38,4±3,36% в промежуточной зоне, что достоверно превышало аналогичные показатели в препаратах возрастного контроля (табл.

5).

При гистологическом исследовании синовиальной оболочки у пациентов с ОА во всех препаратах отмечена морфологическая картина хронического синовита. Последняя характеризовалась ворсинчатой гиперплазией с гипертрофией слоя синовиоцитов, выраженной субсиновиальной плазмоци-тарно-макрофагальной инфильтрацией. Всегда присутствовал субсиновиальный ангиоматоз с периваскулярным инфильтратом. В целом, гистологическая картина хронического пролиферативного воспаления синовиальной оболочки соответствовала таковой у больных группы 1.

Активность NADPH-диафоразы в синовиоцитах была весьма высокой и составила 165,5±2,3 ЕОП против 103±0,6 ЕОП в препаратах возрастного контроля (t = 22,3; р < 0,001). Так же, как и в биоптатах группы 1, активность фермента выявлена и в субсиновиальном слое, в то время как в препаратах контрольной группы NADPH-активности в субсиновиальном слое обнаружено не было.

Высокую активность апоптоза демонстрировали клетки слоя синовио-цитов. Апоптотические клетки выявлены и в субсиновиальном слое, причем,

как и в группе 1, локализация их соответствовала субсиновиальному инфильтрату.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что разрушение хряща при ОА сопровождается высокой активностью iNOS хондроцитов. При этом зоны активности фермента соответствуют очагам деструкции суставного покрова во всех стадиях процесса. Обнаруженные изменения совпадают с данными, полученными при исследовании хряща КС в поздних стадиях экспериментальной посттравматической нестабильности. Так, через 90 и 150 суток после травмы хрящ экспериментальных животных характеризовался в первую очередь дезорганизацией цитоархитектоники, выражавшейся в уменьшении количества хондроцитов, исчезновении многоклеточных лакун и, как следствие, резком уменьшении толщины всех зон хряща. Описанные изменения происходили на фоне высокой активности NOS в хондроцитах. Прогрессировало падение синтетической активности хондроцитов - количество ГАГ в матриксе было низким. Резкое обеднение матрикса ГАГ отмечено и при ОА у человека.

У животных в этих сроках эксперимента персистировал хронический пролиферативный синовит с высокой активностью NOS в очагах инфильтрации. Подобная картина наличествовала и у пациентов с О А.

Учитывая результаты, полученные при исследовании хряща и синовиальной оболочки у больных с хронической посттравматической нестабильностью КС, можно констатировать следующее. Морфологические и гистохимические изменения хряща и синовиальной оболочки при травме и ОА КС у человека соответствуют фазовому характеру данных изменений при индуцированном посттравматическом ОА у животных. Соответственно, в патомор-фологическом и гистохимическом плане состояние хряща при посттравматический нестабильности КС у человека является артрозом, несмотря на сохраненную структурную целостность суставного покрова.

Изменения биологии хондроцитов также являются общими для травмы и ОА КС и характеризуются распространенным апоптозом, существующим наряду с высокой активностью iNOS в клетках хряща. Эти процессы протекают на фоне хронического синовиального воспаления с высокой апоптоти-ческой и нитроксидергической активностью в зонах воспалительной инфильтрации.

Таким образом, обсуждение связи воспаления, активности iNOS и апоптоза в хряще весьма актуально как для посттравматических состояний, так идля ОАКС.

Имеется множество публикаций, посвященных различным аспектам влияния оксида азота на формирование деградации хряща у человека при ОА. Общей их особенностью является противоречивость представленных сведений, что делает весьма затруднительным сравнительный анализ данных. Не в последнюю очередь это объясняется отсутствием единого мнения исследователей относительно присутствия оксида азота в нормальном человеческом хряще. Распространено мнение [Amin A.R. et al., 1995, Das P. et al., 1997, Fink C. et al., 2001], что в здоровой хрящевой ткани синтез N0 практи-

чески не определяется, а непременным условием появления N0 должен быть патологический процесс или стимуляция культуры хондроцитов цитокина-ми. Имеются противоположные утверждения [Min B.H. et al., 2001] о наличии базового уровня продукции оксида азота в нормальном хряще у человека. Авторы также считают, что содержание N0 увеличивается с возрастом в значительной степени - количество оксида азота в старом хряще в 7 раз больше, чем в юном [Min B.H. et al., 2001].

По нашим данным, в норме признаки нитроксидергической активности совершенно отсутствовали в хряще молодых субъектов, в то время как у людей старшего возраста выявлена отчетливая активность NOS, причем фермент локализовался в хондроцитах поверхностной зоны. Обнаруженная локализация нитроксидсинтазы вполне согласуется с данными Hayashi Т. et al. (1997), полученными при исследовании эксплантов нормального человеческого хряща - установлено, что базовый уровень продукции оксида азота в поверхностной зоне хряща достоверно выше, чем в глубоких слоях [Hayashi Т. et al., 1997]. В отсутствие активности энзима в хряще лиц молодого возраста, высокая активность NOS расценена нами как признак гистохимической инволюции хряща, существующий наряду с отмеченными признаками структурной инволюции последнего.

Большинство авторов отмечают, что хондроциты не экспрессируют конститутивные формы NOS, в отличие от индуцибельной формы [Jouzeau J.Y. et al., 1999, Hayashi T. et al., 1997, Palmer R.M.J. et al., 1993]. Впрочем, разночтения существуют и здесь. Так, Amin A.R. et al. в 1995 году представили данные о необычной форме NOS, выделенной из хондроцитов суставов, пораженных ОА. Исследователи предположили, что это могла быть аномальная форма NOS или же совершенно новая форма, так называемая остеоарт-розная NOS (OA-NOS) [Amin A.R. et al., 1995]. Также, описан феномен исчезновения экспрессии N0S-1 хондроцитами после инкубации с IL-1 [Mendes A.F. et al., 2002]. В то же время в других лабораториях не смогли воспроизвести эти результаты. Группа Grabowski идентифицировала только индуци-бельную форму NOS в культуре человеческих хондроцитов после стимуляции цитокинами [Grabowski P.S. et al., 1996]. Интересно, что в образцах здорового хряща и синовиальной оболочки, взятых у больных с переломом шейки бедра, признаков экспрессии NOS-2 вовсе не было выявлено [Grabowski Р. S.etal.,1997].

Результаты проведенного нами иммуногистохимического исследования выявили гистохимическую солокализацию NADPH-диафоразы и iNOS во всех препаратах хряща, где имелась диафоразная активность. Данная солока-лизация обнаружена как в нормальном хряще у лиц старшего возраста, так и у больных с посттравматической нестабильностью и остеоартрозом КС. Присутствия других изоформ фермента не было выявлено ни в одном случае. Приведенные сведения дают основания утверждать, что нитроксидергиче-ская активность в хряще при всех исследованных состояниях обеспечивалась индуцибельной изоформой NOS.

В синовиальной оболочке КС здоровых субъектов произведенная оценка активности NOS выявила устойчивый базовый уровень энзима в синовио-цитах как у молодых людей, так и у лиц старшего возраста, причем у последних активность фермента была достоверно выше. Апоптоз клеток синовиальной оболочки в норме зарегистрирован исключительно в слое синовио-цитов. Данные клетки наиболее активны в функциональном отношении [Павлова В.Н. с соавт., 1988; Moskowitz R.W. et al., 2001], поэтому наличие в них интенсивных биохимических и биологических процессов является ожидаемым фактом.

Изучение морфологических, гистохимических и иммуноцитохимиче-ских характеристик суставного покрова КС у пациентов с хронической посттравматической передней нестабильностью колена (группа 1) позволило констатировать, что хрящ у данной категории больных имел полностью сохранную структуру - достоверные различия с возрастным контролем отсутствовали как в части морфометрических показателей, так и в отношении зональной цитоархитектоники.

Основные отличия в характеристиках обнаружены на уровне гистохимического статуса и биологии хондроцитов. Определен высокий уровень активности iNOS в клетках наиболее значимых в функциональном отношении отделов хряща - поверхностной и верхней части промежуточной зоны. С другой стороны, локализация большого количества апоптотических клеток, зарегистрированных в хряще у больных группы 1, также соответствовала поверхностной и промежуточной зоне. Отмеченные признаки функциональной недостаточности хондроцитов выражались в существенном уменьшении содержания ГАГ хрящевого матрикса. При этом минимальный уровень насыщенности ГАГ имела поверхностная и промежуточная зона.

Совпадение локализации описанных изменений дает основания полагать, что причиной функциональной недостаточности клеток хряща, возникающей в ранней стадии хронической посттравматической нестабильности сустава, является высокий уровень апоптоза хондроцитов, который, в свою очередь, связан с активацией индуцибельной изоформы нитроксидсинтазы.

Исследование синовиальной оболочки у больных группы 1 выявило, что статистически значимое увеличение активности нитроксидсинтазы в клетках синовиальной оболочки определялось в самые ранние (1,5 мес.) сроки функционирования сустава, подвергшегося травме. В те же сроки регистрировалось и появление большого количества апоптотических клеток в зонах высокой активности NOS - синовиальном и субсиновиальном слое. Описанные изменения происходили на фоне персистирующего хронического сино-вита с морфологической картиной пролиферативного воспаления. При этом зоны высокой нитроксидергической и апоптотической активности соответствовали участкам наибольших пролиферативных изменений - слою синовио-цитов и субсиновиальному слою.

Таким образом, наличие ранних посттравматических изменений хряща представляется несомненным. Несомненен и факт существования данных изменений на фоне хронического пролиферативного синовита с высокой

нитроксидергической и апоптотической активностью в зонах пролиферации. Проанализировать полученные данные, опираясь на имеющиеся литературные источники, оказалось чрезвычайно сложно ввиду совершенного отсутствия в литературе сведений о ранних ультраструктурных изменениях хряща при посттравматической нестабильности КС у человека. Основным вопросом, требующим ответа, был следующий: являются ли описанные процессы «артрозом in situ» или же они специфичны только для нестабильности сустава как таковой? Для ответа на этот вопрос мы сочли необходимым исследовать с тех же позиций состояние хряща и синовии у больных с верифицированным, в том числе рентгенологически, диагнозом остеоартроза.

Основным морфологическим признаком ОА у больных группы 2 являлось разрушение хряща, имевшее малозаметный (на уровне изменения мор-фометрических показателей) характер в I стадии и выраженное во II и III стадии заболевания. Функциональная недостаточность хондроцитов (снижение суммарного содержания ГАГ) сопутствовала деструкции хряща и нарастала по мере прогрессирования заболевания.

Указанные изменения развивались на фоне статистически достоверно высокой активности iNOS, существовавшей как в участках хряща с признаками разрушения, так и в глубжележащих слоях. Высокая активность фермента была сопряжена с наличием большого количества апоптотических клеток в поверхностной и промежуточной зоне хряща.

При исследовании синовиальной оболочки у пациентов группы 2 обнаружено, что гистологические, гистохимические и иммуноцитохимические характеристики синовии имели качественное соответствие таковым в группе 1 и представляли собой картину хронического пролиферативного синовита с участками высокой нитроксидергической и апоптотической активности, со-локализованными с зонами пролиферативного воспаления. При совпадении качественных характеристик количественная разница сводилась к более высокой активности энзима в синовиоцитах у больных с ОА.

Сравнение результатов исследования у пациентов группы 1 и 2 свидетельствует о том, что изменения, происходящие в хряще при хронической посттравматической нестабильности КС и при ОА КС, с точки зрения гистохимии и биологии процесса имеют качественную тождественность и различаются лишь количественно (табл. 6). И в том, и в другом случае функциональная недостаточность хондроцитов развивается на фоне высокой нитро-ксидергической и апоптотической их активности, формируя условия для разрушения структуры хрящевого покрова сустава. Собственно деструкция хряща в данных условиях представляется лишь вопросом времени.

Таблица 6.

Гистохимические и иммуноцитохимические характеристики суставного хряща коленного сустава в группах 1 и 2.

Группа 1 Группа 2

Плотность осадка диформазана, ЕОП I 60,6 ±4,8 94,4 ±1,4***

Интенсивность окрашивания толуидиновым синим, ЕОП (поверхностная зона) I 48,1 ±2,23 9,5 ± 0,46***

Содержание апоптотических клеток, % I 22,03 ± 1,4 36,18 ±2,05***

II 21,48 ± 1,7 38,4 ±3,36**

¡N08 + +

сКОЭ - -

** - различие с ВК достоверно при р < 0,01 I - поверхностная зона хряща,

*** - различие с ВК достоверно при р < 0,001 II - промежуточная зона хряща;

III - глубокая зона хряща.

Большой интерес представляет тот факт, что указанным изменениям хряща всегда сопутствует хронический пролиферативный синовит, причем пролиферативная реакция, так же, как и хрящевая структурно-функциональная деградация, демонстрирует отчетливую связь с высокой активностью NOS и апоптозом.

В настоящее время считается, что при ОА деградация хряща первична, а синовит носит вторичный, ирритативный, характер [Павлова В.Н. с соавт., 1988; Moskowitz R.W. et al., 2001; Pelletier J.P. et al, 1991]. Но в ранней фазе хронической нестабильности у человека, как показывают наши наблюдения, не выявляется ни малейших признаков хрящевой деструкции. Аналогичное отсутствие признаков деградации демонстрирует и хрящ в раннем периоде экспериментальной посттравматической нестабильности. В то же время явления пролиферативного воспаления синовиальной оболочки, как выяснилось, присутствуют всегда - и при нестабильности сустава, когда хрящ сохраняет структурную целостность, и при ОА с отчетливыми морфологическими признаками разрушения суставного покрова. При этом с гистохимической и биологической точки зрения процессы в хряще и синовии при данных патологических состояниях имеют жесткую связь: повышение активности NOS - апоптоз. Активацию NOS в синовиальной оболочке при травме КС, между тем, некоторые исследователи объясняют действием провоспалитель-ных цитокинов как медиаторов воспаления [Melchiorri С. et al., 1998]. С другой стороны, как показало изучение материала, взятого у больных ОА, высокий уровень NO индуцирует апоптоз синовиоцитов [Borderie D. et al. 1999]. Приведенные данные вполне согласуются с нашими результатами, свидетельствующими о солокализации зон пролиферативного воспаления, актив-

ности NOS и апоптоза в синовиальной оболочке как при ОА, так и при посттравматической нестабильности колена.

С точки зрения существования патологической цепи «провоспалитель-ные цитокины - активация NOS - апоптоз» могут быть объяснены и обнаруженные изменения хряща КС.

Одним из первых сообщений, посвященных нитроксидергической активности хондроцитов человека при действии на них провоспалительных ци-токиков, было исследование Rediske J.J. et al. (1994). Выяснилось, что хрящевые клетки продуцируют большое количество N0 в ответ на действие TNF-a и, особенно, IL-1 [Rediske J.J. et al., 1994].

Публикации последних лет подтверждают эти сведения. Так, данные, представленные Vuolteenamo К. et al., прямо свидетельствуют об активации iNOS в хондроцитах человека в присутствии IL-1 и TNF-a [Vuolteenamo К. et al., 2001]. Позже те же авторы сообщили, что аналогичное действие, наряду с указанными цитокинами, оказывает также IL-17 [Vuolteenamo К. et al., 2002]. Отмечено, что паракринное/аутокринное действие IL-1 в хряще при ОА индуцирует экспрессию iNOS и вызывает прогрессирование хрящевой деструкции. При этом сочетанное действие IL-1 и NO считается основной причиной апоптоза хондроцитов при О А у человека [Abramson S.B. et al., 2001]. Существует мнение, что оксидантный стресс, развивающийся вследствие (IL-1)-индуцированной активации iNOS и повышенной продукции NO и супероксид-аниона, провоцирует активность JN-киназы (stress-activated protein kinase), что является одним из факторов, вызывающих апоптоз хрящевых клеток [Clancy R. et al., 2001].

Анализ результатов исследования экспериментального и клинического материала в сопоставлении с литературными данными позволяет констатировать, что синовит является необходимым и достаточным условием для быстрого развития дистрофии суставного хряща вследствие раннего угнетения синтетической активности хондроцитов и формирования их функционального дефекта. При этом собственно хрящевая дистрофия, как возникающая in situ, так и существующая в форме ОА может быть определена как цитокин-индуцируемый NO-зависимый процесс, имеющий в своей основе апоптоз (рис. 3).

Представленные выше данные касаются морфологических аспектов влияния синовита на развитие хрящевой дистрофии при травме колена. Для оценки клинического значения синовиального воспаления при хирургически позитивной патологии коленного сустава нами исследованы отдаленные результаты оперативного лечения посттравматической нестабильности КС.

Автором выполнено 13 операций первичного шва ПКС у 13 пациентов с острой передней нестабильностью КС, обусловленной свежим разрывом ПКС. В то же время произведена 31 реконструкция ПКС у 31 больного с хроническим дефицитом ПКС вследствие застарелого ее повреждения.

Рис. 3. Нитроксидергические механизмы хрящевой дистрофии при травме сустава.

Оценка отдаленных результатов оперативного лечения проведена у 9 из 13 пациентов с острой нестабильностью (группа 3)иу18из31 больного с хронической нестабильностью КС (группа 4).

При осмотре пациентов группы 3 в сроки 6 месяцев после операции средний оценочный балл составил 88,3±2,24. Таким образом, средний балл соответствовал хорошему результату. Средний балл оценки у больных группы 4, через 6 месяцев после операции равнялся 70,6±2,6 (в сравнении с гр.З р < 0,001) и соответствовал удовлетворительному результату по шкале Revised HSSKS.

При осмотре пациентов через год после вмешательства выявлена значительная динамика результатов. В группе 3 средний балл составил 95,3±0,9 и характеризовал отдаленный результат лечения как отличный. В то же время у больных группы 4 средний балл равнялся 80,6±3,6 (р < 0,001) и соответствовал хорошему результату по Revised HSSKS (рис. 4). В группе 4 у троих пациентов зарегистрирован плохой результат, что потребовало проведения повторной операции. В группе 3 плохих результатов не было выявлено.

6 иве. 1 год

Рис. 4. Отдаленные результаты оперативного лечения передней нестабильности коленного сустава (баллы по шкале Revised HSSKS).

Относительно низкий оценочный балл в группе 4, отмеченный через 6 месяцев после операции, в большой степени определялся сравнительно низкой степенью двигательной активности больных. Сами пациенты объясняли низкую моторную активность прежде всего сохраняющимися отеком и скованностью сустава (выявлены у всех пациентов группы 4), а также болью, возникающей после значительной физической нагрузки (выявлена у 16 из 18 пациентов группы 4). В группе 3 указанные симптомы в сроки 6 месяцев обнаружены у несравнимо меньшего числа больных (табл. 7).

Через год после операции количество пациентов группы 4, имевших отек и скованность сустава, стало сопоставимым с количеством таковых в группе 3, в то время как посленагрузочные боли по-прежнему отмечались больными группы 4 значительно чаще (табл. 7).

Таблица 7.

Основные патологические симптомы в отдаленном послеоперационном периоде лечения передней нестабильности коленного сустава

осмотр 6 месяцев 1 год

симптом Группа 3 п = 9 Группа 4 п = 18 Группа 3 п = 9 Группа 4 п = 18

отек 2 18 1 3

скованность 1 18 1 4

боли при нагрузке* 2 16 1 10

* - учитывались боли, возникающие после занятий спортом и повседневной активности.

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что отдаленные результаты оперативного лечения острой передней нестабильности КС, а именно, применения шва ПКС, достоверно лучше, чем исходы реконструкции ПКС, предпринятые для лечения хронической передней нестабильности колена. Статистически значимое превалирование выявлено как в сроки 6 месяцев, так и через год после операции. Худший результат лечения у пациентов с хронической передней нестабильностью (группа 4), особенно в сроки 6 месяцев наблюдения, в нашем случае объясняется преимущественно существенным функциональным дефектом оперированной конечности, что влечет за собой снижение двигательной активности. Данный факт особенно очевиден, учитывая, что ограничение двигательной активности изначально задано условиями программы реабилитации в периоде 6 месяцев после операции. Детальный анализ симптомов, ограничивающих моторную активность в указанные сроки, позволил установить, что основными патологическими проявлениями являются скованность, отек колена и боли после нагрузки. Однако эти симптомы являются основными клиническими признаками хронического синови-та КС, существовавшего у всех пациентов группы 4 и до операции. В свою очередь, явления синовита у пациентов группы 3, выявленного до операции, имели в подавляющем большинстве случаев клинически негативный характер через 6 месяцев после операции (табл. 7). Соответственно, уровень двигательной активности и общие результаты у больных с острой нестабильностью колена в указанные сроки были достоверно выше. В пользу первично существующего синовита как причины перечисленных симптомов свидетельствует молодой возраст пациентов обеих групп (межгрупповые различия недостоверны: t = 2,04; р > 0,05), априори исключающий, в отсутствие соответствующего анамнеза, наличие хрящевой патологии и, соответственно, ирритатив-ный характер синовита.

Через год после операции, несмотря на улучшение результатов, высокая частота посленагрузочных болей у пациентов группы 4 сохранялась, по-прежнему ограничивая двигательную активность, что обусловило сравнительно низкий средний оценочный балл.

Таким образом, проведенное нами исследование отдаленных результатов оперативного лечения дает основание предполагать, что шов ПКС, предпринятый в остром периоде посттравматической нестабильности КС, создает предпосылки не только к функциональной реституции, но и, в первую очередь, к восстановлению структуры колена in situ, обеспечивающему физиологическую адекватность сустава в биомеханическом аспекте. В этом случае целью операции является одновременное устранение структурного (восстановление анатомии связки) и функционального дефекта. Следует учесть, что, согласно нашим данным, персистирование синовита в послеоперационном периоде у пациентов с хронической нестабильностью является фактором риска развития ОА в большей степени, чем собственно хроническая нестабильность.

В этом смысле первичное восстановление ПКС может рассматриваться как весьма эффективное средство предупреждения развития синовита и последующих изменений хрящевого покрова, индуцированных хроническим воспалением синовиальной оболочки.

Принимая во внимание структурную целостность колена, обеспечивающую единство его как функциональной единицы, оценка степени тяжести именно структурного дефекта должна служить основанием для выбора метода лечения в остром периоде травмы колена. Первичное восстановление ПКС, предпринятое в этих условиях, имеет несомненные преимущества в плане раннего устранения структурной (анатомической) и функциональной недостаточности КС.

ВЫВОДЫ

1. Дистрофия хряща при экспериментальной передней нестабильности индуцируется воспалением и опосредуетсявЫСОКОЙ активностью NOS хондро-цитов. Повышение активности фермента сопровождается прогрессирующим угнетением синтеза протеогликанов хрящевого матрикса.

2. Нитроксидергическая активность клеток суставного хряща у человека обеспечивается исключительно индуцибельной изоформой нитроксидсинтазы.

3. В норме у молодых субъектов активность iNOS в хряще отсутствует, в то время как у лиц пожилого возраста существует базовый уровень активности фермента, являющийся инволютивным признаком.

4. Синовит является необходимым и достаточным условием для быстрого развития дистрофии суставного хряща при посттравматической нестабильности коленного сустава. Хрящевая дистрофия возникает вследствие индуцированного воспалением повышения iNOS-активности хондроцитов, вызывающего их апоптоз и, соответственно, угнетение синтетической активности.

5. При ОА супрессорные эффекты воспаления также опосредуются повышением активности iNOS, что влечет за собой апоптоз хондроцитов и усугубление их функциональной недостаточности.

6. Существует полная качественная тождественность гистохимических и биологических изменений хряща, возникающих при хронической посттравматической нестабильности и ОА КС. Разница в этих изменениях носит только количественный характер.

7. Полученные данные позволяют определить хрящевую дистрофию, возникающую in situ (при хирургически позитивной травме), а также существующую в форме ОА, как индуцируемый воспалением NO-зависимый процесс, имеющий в своей основе апоптоз хондроцитов.

8. Основанием для выбора метода лечения в остром периоде травмы колена должна служить оценка степени тяжести структурного, а не функционального дефекта сустава. Первичное восстановление ПКС имеет несомненные

преимущества в плане раннего устранения структурной (анатомической) и функциональной недостаточности КС.

9. Первичное восстановление ПКС может рассматриваться как весьма эффективное средство предупреждения развития синовита и последующих изменений хрящевого покрова, индуцированных хроническим воспалением синовиальной оболочки.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При повреждении связок колена, сопровождающемся развитием клинически позитивной нестабильности сустава, главным средством профилактики деградации хряща следует считать возможно более раннее оперативное лечение, направленное на восстановление анатомии поврежденных структур. При этом хирургическое лечение отнюдь не исключает применение комплексной терапии синовита в пред- и послеоперационном периоде.

2. Показаниями для назначения полноценной противовоспалительной терапии являются все острые посттравматические состояния коленного сустава.

3. Лечение больных с хроническим посттравматическим синовитом, даже при отсутствии у них признаков хрящевой патологии, должно соответствовать принципам терапии остеоартроза.

4. Особенность оксида азота как специфического маркера ранних стадий хрящевой дистрофии может быть использована в клинико-экспериментальных исследованиях, посвященных оценке эффективности лечения травматической патологии коленного сустава, а также в изучении действия НПВП и хондро-протекторов на гистохимическом уровне.

5. Полученные результаты создают предпосылки для исследования возможности применения блокаторов iNOS в клинической практике с целью предотвращения развития дистрофии хряща в раннем посттравматическом периоде.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Череповский A.B. Оксид азота и апоптоз в патогенезе посттравматической дистрофии суставного хряща. - Владивосток: Медицина ДВ, 2004. - 146 с. - (В соавторстве).

2. Череповский A.B. Активность нитроксидсинтазы как маркер ранних стадий дисметаболии хряща в эксперименте // Бюлл. эксп. биол. мед. - 2004. -Том 137.'- №5. - С.589-593. - (В соавторстве).

3. Череповский A.B. Активность нитроксидсинтазы синовиальной оболочки в условиях индуцированного остеоартроза // Int. J. Immunorehabilitation. -2004. - Том 6. - №1. - С. 78-79. - (В соавторстве).

4. Череповский A.B. Активность нитроксидсинтазы и дисметаболия хряща в эксперименте // Int. J. Immunorehabilitation. - 2004. - Том 6. - №1. - С. 79. -(В соавторстве).

5. Череповский A.B. Оксид азота как маркер хронического посттравматического синовита в эксперименте // Травматология и ортопедия России. -2004. - №3. - С. 23-25. - (В соавторстве).

6. Череповский A.B. Постгравматическая передняя нестабильность коленного сустава: активность нитроксидсинтазы и ранняя дисметаболия суставного хряща // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2004. - №4. - С. 51-54. - (В соавторстве).

7. Череповский A.B. Биологические эффекты оксида азота в патогенезе ос-теоартроза: современные представления // Травматология и ортопедия России.

- 2004. - №3. - С. 62-66. - (В соавторстве).

8. Череповский A.B. Ранняя дистрофия суставного хряща при посттравматической нестабильности коленного сустава: нитроксидергическая активность и апоптоз // Морфология. - 2004. - №5. - С. 65-68. - (В соавторстве).

9. Череповский A.B. Современные представления о патогенезе остеоартро-за: роль оксида азота // Сибирский мед. журнал. - 2004. - Т.19. - №3. - С. 62-66.-(В соавторстве).

10. Череповский A.B. Шов и реконструкция передней крестообразной связки: отдаленные результаты // Тихоокеанский мед. журнал. - 2004. - №2. -С. 31-34. - (В соавторстве).

11. Cherepovsky A.V. Chronic posttraumatic knee synovitis: nitric oxide synthase activity and apoptosis // IX World Congress of the Osteoarthritis Research Society International.: Osteoarthritis Cartilage. - 2004. - Vol. 12. -N 1002. - P. 38.

- (В соавторстве).

12. Череповский A.B. Нитроксидергические механизмы патологии опорно-двигательного аппарата (Часть I) - Владивосток, 2004. - 25 с. - Деп. в ВИНИТИ 20.05.2004, № 865-В2004. - (В соавторстве).

13. Череповский A.B. Нитроксидергические механизмы патологии опорно-двигательного аппарата (Часть II) - Владивосток, 2004. - 25 с. - Деп. в ВИНИТИ 20.05.2004, № 866-В2004. - (В соавторстве).

14. Череповский A.B. Роль оксида азота в патологии опорно-двигательного аппарата (Часть I) // Научно-практическая ревматология. -2004. - №3. - С. 78-82. - (В соавторстве).

15. Череповский A.B. Роль оксида азота в патологии опорно-двигательного аппарата (Часть II) // Научно-практическая ревматология. -2004. - №4. - С. 53-56. - (В соавторстве).

16. Cherepovsky A.V. Effects ofthe anti-TFN-antibody Infliximab on nitric oxide (NO) synthesis by synovial membrane and cartilage in adjuvant arthritis // Ann. Rheum. Dis. - 2004. - Vol. 63 (Suppl. 1). - P. 163. - (В соавторстве).

17. Череповский A.B. NO-опосредованный путь апоптоза как причина ранней дистрофии хряща // Материли III М1жнародно1 науково-пракгично1 конференцп «Динамка наукових дослщжень'2004», Том 59. - Дшпропет-ровськ: Наука i осв1та, 2004. - С. 31-35. - (В соавторстве).

18. Череповский A.B. Состояние нитроксидсинтазы и апоптотическая активность синовиоцитов при посттравматической нестабильности коленного сустава // Матерiали III Мiжнародноi науково-практичноi конференцп «Динамка наукових дослщжень'2004», Том 59. - Дншропетровськ: Наука i освита, 2004. - С. 35-38. - (В соавторстве).

19. Череповский A.B. Апоптотические механизмы патологии суставов. -Владивосток, 2004. - 25 с. - Деп. в ВИНИТИ 20.05.2004, № 868-В2004. - (В соавторстве).

20. Череповский A.B. Влияние селективных и неселективных ингибиторов циклооксигеназ на нитроксидсинтазную активность хряща и синовии при аутоиммунном артрите // XI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство»: Тезисы докладов. - М., 2004. - С. 783. - (В соавторстве).

21. Череповский A.B. Влияние инфликсимаба на продукцию оксида азота клетками хряща и синовиальной оболочки суставов при адьювантном артрите // XI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство»: Тезисы докладов. - М, 2004. - С. 783. - (В соавторстве).

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ОА - остеоартроз

КС - коленный сустав

ПКС - передняя крестообразная связка

НПВП - нестероидные противовоспалительные препараты

NO - оксид азота

ГАГ - гликозаминогликаны

NOS - нитроксидсинтаза

NOS-1 - нейрональная изоформа нитроксидсинтазы

NOS-2 - макрофагальная изоформа нитроксидсинтазы

NOS-3 - эндотелиальная изоформа нитроксидсинтазы

cNOS - конституитивная изоформа нитроксидсинтазы

iNOS - индуцибельная изоформа нитроксидсинтазы

L-NAME - ^нитро-Ь-аргининметилэстер

L-NMA - ^монометил-Ь-агринин

IL - интерлейкины

TNF - фактор некроза опухоли

TGF - трансформирующий фактор роста

IGF - инсулиноподобный фактор роста

ММР - матричные металлопротеиназы

Череповский Антон Владиславович

Нитроксидергические механизмы в развитии посттравматической дистрофии хряща коленного сустава

Автореферат

Подписано в печать 20.01.2005 Усл. печ. л. 2,0. Тираж 100 экз.

Отпечатано ООО «Владкопи». Владивосток, ул.Суханова, 3.

)h'

1 ö (ptu /ÜÖ5

J\

/

1512

Содержание диссертации, доктора медицинских наук, Череповский, Антон Владиславович

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

I. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ ОБ УЛЬТРАСТРУКТУРНЫХ МЕХАНИЗМАХ ХРЯЩЕВОЙ ДИСТРОФИИ.

1.1. ОБЩИЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ПАТОГЕНЕЗЕ АРТРОЗА.

1.2. РОЛЬ ЦИТОКИНОВВ ФУНКЦИОНИРОВАНИИ И ДЕГРАДАЦИИ ХРЯЩА.

1.3. ОКСИД АЗОТА И ЕГО БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА.

1.4. ОКСИД АЗОТА И ХРЯЩ ПРИ ОСТЕОАРТРОЗЕ.

1.5. ОКСИД АЗОТА И БИОМЕХАНИЧЕСКИЕ НАРУШЕНИЯ (МЕХАНИЧЕСКИЙ СТРЕСС).

1.6. ОКСИД АЗОТА ИАПОПТОЗ В ХРЯЩЕ.

II. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ У БОЛЬНЫХ С ПАТОЛОГИЕЙ КОЛЕННОГО СУСТАВА.

2.1. МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ОПЕРАЦИОННОГО МАТЕРИАЛА.

2.2. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО И ОПЕРАЦИОННОГО МАТЕРИАЛА.

2.2.1. Гистохимический метод на КАЕ)РН-диафоразу.

2.2.2. Иммуногистохимическая идентификация изоформ нитроксидсинтазы.

2.2.3. Исследование апоптоза.

2.2.4. Общегистологические методы исследования.

2.2.5. Морфометрия.

3. ОЦЕНКА ОТДАЛЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ ОПЕРАТИВНОГО ЛЕЧЕНИЯ ОСТРОЙ И ХРОНИЧЕСКОЙ НЕСТАБИЛЬНОСТИ КОЛЕННОГО СУСТАВА.

4. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА ДАННЫХ.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3. НИТРОКСИДСИНТАЗА ХРЯЩА И СИНОВИАЛЬНОЙ ОБОЛОЧКИ КОЛЕННОГО СУСТАВА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ПЕРЕДНЕЙ НЕСТАБИЛЬНОСТИ.

3.1. НИТРОКСИДСИНТАЗА ХРЯЩА.

3.2. НИТРОКСИДСИНТАЗА СИНОВИАЛЬНОЙ ОБОЛОЧКИ.

3.3. ОКСИД АЗОТА СУСТАВНОГО ХРЯЩА И СИНОВИАЛЬНОЕ ВОСПАЛЕНИЕ: ВОЗМОЖНОСТИ ИНТЕРПРЕТАЦИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ДАННЫХ.

4. СУСТАВНОЙ ХРЯЩ И СИНОВИАЛЬНАЯ ОБОЛОЧКА КОЛЕННОГО СУСТАВА ЧЕЛОВЕКА В НОРМЕ.

4.1. СУСТАВНОЙ ХРЯЩ КОЛЕННОГО СУСТАВА У ЛИЦ МОЛОДОГО ВОЗРАСТА.

4.2. СИНОВИАЛЬНАЯ ОБОЛОЧКА КОЛЕННОГО СУСТАВА У МОЛОДЫХ СУБЪЕКТОВ.

4.3. СУСТАВНОЙ ХРЯЩ КОЛЕННОГО СУСТАВА У ЛИЦ СТАРШЕГО ВОЗРАСТА.

4.4. СИНОВИАЛЬНАЯ ОБОЛОЧКА КОЛЕННОГО СУСТАВА УЛИЦ СТАРШЕГО ВОЗРАСТА.

4.5. НЕКОТОРЫЕ БИОМЕХАНИЧЕСКИЕ И ГИСТОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ВОЗРАСТНОЙ ИНВОЛЮЦИИ ХРЯЩА.

5. СУСТАВНОЙ ХРЯЩ И СИНОВИАЛЬНАЯ ОБОЛОЧКА КОЛЕННОГО СУСТАВА ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ПЕРЕДНЕЙ НЕСТАБИЛЬНОСТИ.

5.1. СУСТАВНОЙ ХРЯЩ ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ПЕРЕДНЕЙ НЕСТАБИЛЬНОСТИ КОЛЕНА.

5.2. СИНОВИАЛЬНАЯ ОБОЛОЧКА ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ПОСТТРАВМАТИЧЕСКОЙ НЕСТАБИЛЬНОСТИ КОЛЕННОГО СУСТАВА.

5.3. РАННЯЯ ДИСТРОФИЯ ХРЯЩА ПРИ ТРАВМЕ КОЛЕННОГО СУСТАВА: СИНОВИТ И ВОЗМОЖНАЯ РОЛЬ ОКСИДА АЗОТА.

6. ХРЯЩ И СИНОВИАЛЬНАЯ ОБОЛОЧКА КОЛЕННОГО СУСТАВА ПРИ ОСТЕОАРТРОЗЕ.

6.1. ХРЯЩ ПРИ ОСТЕОАРТРОЗЕ КОЛЕННОГО СУСТАВА.

6.2. СИНОВИТ ПРИ ОСТЕОАРТРОЗЕ.

6.3. ТРАВМА И ОСТЕОАРТРОЗ КОЛЕННОГО СУСТАВА: НЕКОТОРЫЕ МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И ГИСТОХИМИЧЕСКИЕ ПАРАЛЛЕЛИ.

7. ШОВ И РЕКОНСТРУКЦИЯ ПЕРЕДНЕЙ КРЕСТООБРАЗНОЙ СВЯЗКИ: АНАЛИЗ ОТДАЛЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ.

IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

V. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Нитроксидергические механизмы в развитии посттравматической дистрофии хряща коленного сустава"

Актуальность проблемы. Артроз - наиболее распространенная форма суставной патологии, приносящая значительный экономический ущерб обществу в связи с частым развитием при артрозе временной и стойкой нетрудоспособности [Лучихина Л.В., 2001]. По имеющимся сведениям, заболеванием страдает от 6,4 до 12% населения, причем в последние годы вызванная им нетрудоспособность возросла в 3-5 раз [Насонова В.А. и соавт.,1994; Фоломеева О.М. и соавт., 1994,1996].

В структуре распространенности дистрофических поражений крупных суставов важное место занимает остеоартроз (ОА) коленного сустава (КС). Остеоартроз КС, наряду с ОА тазобедренного сустава, является наиболее частой причиной нетрудоспособности и инвалидности среди других заболеваний нижних конечностей [Moskowitz R.W. et al., 2001]. Экономические потери в США, вызванные настоящим заболеванием, исчисляются суммой 15,5 миллиардов долларов (в ценах 1994 года) [Yelin Е., 1998].

Травматическое повреждение капсулярно-связочного аппарата КС в настоящее время определено как одна из основных причин раннего развития ОА колена [Daniel D. et al., 1994; Lañe N.E. et al., 1993]. Существующее увлечение экстремальными видами спорта наряду с увеличивающейся спортивной нагрузкой также значительно повышает риск развития ОА, причем у лиц молодого возраста [Spector T. et al., 1996].

В структуре травмы колена повреждение передней крестообразной связки (ПКС) с последующим развитием передней нестабильности КС является распространенной формой патологии сустава и встречается в среднем у одного из 3000 человек [Fu F.H. et al., 1999]. При этом частота развития ОА при дефиците ПКС составляет от 30 [McDaniel WJ. et al., 1983] до 70% [Kannus Retal., 1989].

Несмотря на успехи диагностики, современные исследователи отмечают значительные трудности в раннем выявлении посттравматического ОА КС. Остается неясным, какого рода молекулярные изменения в хрящевой ткани предшествуют морфологически и клинически позитивным стадиям артроза и, что не менее важно, в какие сроки после травмы эти изменения возникают [ТеЬоп В.Т. ег а1., 1997; МеББпег К. е1 а1., 1996; Ыаг^ег С. е1 а1., 1995].

В настоящее время ОА определяется как ". результат действия механических и биологических факторов, дестабилизирующих нормальное соотношение процессов деградации и синтеза в хондроцитах, матриксе суставного хряща, а также в субхондральной кости. <. .> В конечном итоге, ОА манифестирует путем развития морфологических, биохимических, молекулярных и биомеханических изменений клеток и матрикса." [Киейпег К.Е. е1 а1., 1995]. Соответственно, для изучения инициальных механизмов хрящевой дистрофии необходимо использование специфических "маркеров", позволяющих обнаружить и оценить изменения на молекулярном и клеточном уровне. В последние годы на роль подобного маркера активно претендует оксид азота (N0) - химическое соединение, выполняющее функции универсального регулятора тканевого и клеточного метаболизма с огромным диапазоном проявлений биологической активности.

Существует большое количество исследований, направленных на изучение роли N0 в метаболизме суставного хряща как в норме, так и при ОА. Однако, несмотря на это, имеющиеся данные характеризуются крайней противоречивостью. Так, не определена норма продукции оксида азота в здоровом хряще, так же, как не существует единого мнения о динамике продукции N0 в хряще при ОА, в первую очередь ввиду разнородности используемых моделей ОА. Клинико-морфологические исследования большей частью не учитывают стадийность ОА как заболевания, что снижает их практическую значимость. Имеющаяся противоречивость информации о влиянии N0 на развитие программированной клеточной смерти - апоптоза -в хряще до сих пор не позволяет концептуально рассматривать этот важный вопрос [Мозкош^ ЯЖ е! а1., 2001]. Разноречивость имеющихся сведений фундаментального характера, несомненно, затрудняет клиническое применение полученных данных.

Целью работы являлось установление значения нитроксидергических механизмов в развитии посттравматической дистрофии хряща коленного сустава.

Задачи исследования:

1. Изучить динамику нитроксидергической активности в хряще и синовиальной оболочке при экспериментальном посттравматическом ОА КС.

2. Провести иммуногистохимическое картирование и установить действующую в суставном хряще изоформу нитроксидсинтазы.

3. Определить уровень активности нитроксидсинтазы в хряще и синовиальной оболочке КС человека при хронической посттравматической нестабильности.

4. Оценить распространенность апоптотических изменений в клетках хряща и синовиальной оболочки в условиях посттравматической нестабильности КС.

5. Установить характер связи морфологических, гистохимических и иммуноцитохимических изменений хряща и синовиальной оболочки, возникающих при травме КС.

6. Исследовать нитроксидергическую активность хряща и синовиальной оболочки в сопоставлении с распространенностью апоптоза при клинически и морфологически позитивном ОА КС у человека.

7. Оценить степень тождественности морфологических, гистохимических и иммуноцитохимических изменений хряща и синовиальной оболочки, возникающих при травме и ОА КС.

8. С учетом полученных данных о характере изменений хряща и синовиальной оболочки при травме КС сравнить отдаленные клинические результаты хирургического лечения острой и хронической посттравматической нестабильности КС.

Научная новизна работы.

Впервые произведена оценка нитроксидергической активности в хряще и синовиальной оболочке КС при индуцированном посттравматическом ОА с этапным исследованием экспериментального материала.

Выполнено иммуногистохимическое картирование действующих изоформ нитроксидсинтазы в хряще при травме и ОА КС у человека.

Впервые осуществлено комплексное исследование нитроксидергической активности и распространенности апоптоза в хряще и синовиальной оболочке КС человека в условиях хронической посттравматической нестабильности.

Установлен характер динамики апоптотической и нитроксидергической активности клеток хряща и синовиальной оболочки при ОА КС у человека.

Доказана роль синовиального воспаления как интегрированного фактора при формировании цепи патологических событий, вызванных травмой сустава и ведущих к разрушению суставного покрова КС.

Впервые определена взаимосвязь морфологических, гистохимических и биологических изменений хряща и синовиальной оболочки как структур, согласованно реагирующих на дисфункцию КС при травме и ОА.

На основании анализа и сопоставления полученных экспериментальных данных и результатов исследования операционного материала концептуально обоснована роль нитроксидергических процессов в развитии ранней дистрофии суставного хряща при травме КС.

Теоретическое и практическое значение работы.

Приведенные в диссертации систематизированные сведения являются оригинальным вкладом в развитие теории патогенеза дистрофии суставного хряща. Представленные данные свидетельствуют о значимой роли нитроксидергических механизмов в реализации патологических эффектов травмы на уровне биохимии и биологии хрящевых клеток. Теоретически обоснована инициирующая роль синовиального воспаления в формировании раннего функционального дефекта хондроцитов как предпосылки для развития структурного дефекта хряща.

Прикладное значение работы заключается в фундаментальном обосновании значительного расширения показаний для оперативного лечения посттравматической нестабильности КС в остром периоде. Анатомический подход к восстановлению поврежденных капсулярно-связочных структур позиционирован как эффективный способ раннего купирования постгравматического синовита и предотвращения прогрессирования хрящевой дистрофии. Материалы исследования могут служить основой для составления методических рекомендаций и использоваться в лекциях и практических занятиях по травматологии и ортопедии.

Положения, выставляемые на защиту.

1. При экспериментальном посттравматическом ОА КС высокая активность NOS в хряще индуцируется воспалением, выявляется в ранние сроки и служит причиной прогрессирующего угнетения синтетической активности хондроцитов.

2. Активность NOS в хряще КС у человека при травме и ОА обеспечивается исключительно индуцибельной изоформой фермента.

3. Синовиальное воспаление является необходимым и достаточным условием для быстрого развития дистрофии суставного хряща при постгравматической нестабильности коленного сустава. Хрящевая дистрофия возникает вследствие индуцированного воспалением повышения iNOS-активности хондроцитов, вызывающего их апоптоз и угнетение синтетической активности.

4. Существует полная качественная тождественность гистохимических и биологических изменений хряща, возникающих при хронической посттравматической нестабильности и ОА КС. Полученные данные позволяют определить хрящевую дистрофию, возникающую при хирургически позитивной травме, а также существующую в форме ОА, как инициируемый воспалением NO-зависимый процесс, имеющий в своей основе апоптоз хондроцитов.

5. Основанием для выбора метода лечения в остром периоде травмы колена должна служить оценка степени тяжести структурного, а не функционального дефекта сустава. Первичное восстановление ПКС имеет несомненные преимущества в плане раннего устранения структурной (анатомической) и функциональной недостаточности КС.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на Всероссийском конгрессе ревматологов России (Саратов, 2003), IX Международном конгрессе по клинической патологии (Бангкок, 2004), III Международной научно-практической конференции "Динамика научных достижений" (Днепропетровск, 2004), Научной сессии ДВО РАН, СО РАМН и ДЗАПК "Новые технологии в диагностике и лечении заболеваний человека" (Владивосток, 2004), Региональном конгрессе "Человек и лекарство" (Владивосток, 2004), Annual International Congress of EULAR (Берлин, 2004), XI Национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2004), IX World Congress of OARSI (Чикаго, 2004), заседаниях краевого научно-практического общества травматологов-ортопедов (Владивосток, 2003, 2004).

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ ОБ УЛЬТРАСТРУКТУРНЫХ МЕХАНИЗМАХ ХРЯЩЕВОЙ ДИСТРОФИИ

Важное медицинское и социально-экономическое значение проблемы лечения больных с дегенеративно-дистрофическими заболеваниями крупных суставов обусловлено значительной частотой данной патологии и высокой степенью инвалидизации пациентов, в связи с чем чрезвычайно актуальным является постоянное совершенствование методов её ранней диагностики и лечения [Астапенко с соавт., 1987; Adams М.Е. et al., 1982; Lohmander L.S., 1988]. Вследствие этого сохраняется большой интерес к дальнейшему изучению патогенеза механизмов дегенерации гиалинового хряща, который в настоящее время рассматривается в качестве инициального и основного субстрата остеоартроза как патологического процесса [Павлова В.Н. с соавт., 1988; Шумада И.В. с соавт., 1991].

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Череповский, Антон Владиславович

V. выводы

1. Дистрофия хряща при экспериментальной передней нестабильности индуцируется воспалением и опосредуется высокой активностью NOS хондроцитов. Повышение активности фермента сопровождается прогрессирующим угнетением синтеза протеогликанов хрящевого матрикса.

2. Нитроксидергическая активность клеток суставного хряща у человека обеспечивается исключительно индуцибельной изоформой нитроксидсинтазы.

3. В норме у молодых субъектов активность iNOS в хряще отсутствует, в то время как у лиц пожилого возраста существует базовый уровень активности фермента, являющийся инволютивным признаком.

4. Синовит является необходимым и достаточным условием для быстрого развития дистрофии суставного хряща при посттравматической нестабильности коленного сустава. Хрящевая дистрофия возникает вследствие индуцированного воспалением повышения iNOS-активности хондроцитов, вызывающего их апоптоз и, соответственно, угнетение синтетической активности.

5. При ОА супрессорные эффекты воспаления также опосредуются повышением активности iNOS, что влечет за собой апоптоз хондроцитов и усугубление их функциональной недостаточности.

6. Существует полная качественная тождественность гистохимических и биологических изменений хряща, возникающих при хронической посттравматической нестабильности и ОА КС. Разница в этих изменениях носит только количественный характер.

7. Полученные данные позволяют определить хрящевую дистрофию, возникающую in situ (при хирургически позитивной травме), а также существующую в форме ОА, как индуцируемый воспалением NO-зависимый процесс, имеющий в своей основе апоптоз хондроцитов.

8. Основанием для выбора метода лечения в остром периоде травмы колена должна служить оценка степени тяжести структурного, а не функционального дефекта сустава. Первичное восстановление ПКС имеет несомненные преимущества в плане раннего устранения структурной (анатомической) и функциональной недостаточности КС.

9. Первичное восстановление ПКС может рассматриваться как весьма эффективное средство предупреждения развития синовита и последующих изменений хрящевого покрова, индуцированных хроническим воспалением синовиальной оболочки.

VI. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При повреждении связок колена, сопровождающемся развитием клинически позитивной нестабильности сустава, главным средством профилактики деградации хряща следует считать возможно более раннее оперативное лечение, направленное на восстановление анатомии поврежденных структур. При этом хирургическое лечение отнюдь не исключает применение комплексной терапии синовита в пред- и послеоперационном периоде.

2. Показаниями для назначения полноценной противовоспалительной терапии являются все острые посттравматические состояния коленного сустава.

3. Лечение больных с хроническим синовитом, даже при отсутствии у них признаков хрящевой патологии, должно соответствовать принципам терапии остеоартроза.

4. Особенность оксида азота как специфического маркера ранних стадий хрящевой дистрофии может быть использована в клинико-экспериментальных исследованиях, посвященных оценке эффективности лечения травматической патологии коленного сустава, а также в изучении действия НПВП и хондропротекторов на гистохимическом уровне.

5. Полученные результаты создают предпосылки для исследования возможности применения блокаторов iNOS в клинической практике с целью предотвращения развития дистрофии хряща в раннем посттравматическом периоде.

Библиография Диссертация по биологии, доктора медицинских наук, Череповский, Антон Владиславович, Владивосток

1. Астапенко М. Г., Копьева Т.Н., Мазнна Н.М. О механизме деструкции суставного хряща при остеоартрозе // Деструкция суставов. Т.5.: Севастополь, 1987. С. 15.

2. Бабаева А. Р. Клиническое и патогенетическое значение исследования сывороточных гликозаминогликанов и антител к ним при заболеваниях внесуставных мягких тканей: Автореф. дисс. . д-ра мед. наук -Волгоград, 1997. 45 с.

3. Брюне Б., Сандау К., фон Кветен А. Апоптотическая гибель клеток и оксид азота: механизмы активации и антагонистические сигнальные пути//Биохимия. 1998. Т.63. Вып.7. С.966-975.

4. Вреден P.P. Практическое руководство по ортопедии. Киев, 1936. С.486-487.

5. Диагностика и лечение дегенеративно-дистрофических заболеваний суставов / Шумада И.В., Суслова О.Я., Стецула В.И. и др.; Под общ. ред. И.В. Шумада. Киев: Здоровья, 1990. 200 с.

6. Елисеева Е.В. Нитроксидергическая регуляция легких. Владивосток, 2001. 176 с.

7. Корнилов H.H., Новоселов К.А., Корнилов Н.В. Современные взгляды на этиопатогенез, принципы диагностики и консервативную терапию дегенеративно-дистрофических заболеваний коленного сустава // Травматология и ортопедия России. 2002. №2. С.47-59.

8. Косинская Н.С. Дегенеративно-дистрофические поражения костно-суставного аппарата. JL: Медгиз, 1961. 196 с.

9. Косягин Д. В. Аминокислотный состав белка протеотиканов суставного хряща человека в норме и при патологии // Укр. биохим. журн. 1984. №5. С.549-551.

10. Купчинов Б. И., Ермаков С. Ф., Белоенко Е. Д. Биотрибология синовиальных суставов. Минск: Веды, 1997. 272 с.

11. Лисицын М.П., Андреева Т.М. Проприоцептивная функция крестообразного комплекса коленного сустава // Вестник травмат. ортоп. им. H.H. Приорова. 2001. №3. С.69-74.

12. Лучихина Л.В. Артроз, ранняя диагностика и патогенетическая терапия. М.: Медицинская энциклопедия, 2001. 168 с.

13. Матвеева Н.Ю. Апоптоз: морфологические особенности и молекулярные механизмы // Тихоокеанский мед. журнал. 2003. №4. С.12-16.

14. Миронова З.С. Повреждения коленного сустава при занятиях спортом. М.: Медгиз, 1962. 138 с.

15. Мотавкин П.А., Гельцер Б.И. Клиническая и экспериментальная патофизиология легких. М.: Наука, 1998. 366 с.

16. Мотавкин П. А. и др. Нитроксидсинтаза поврежденного чувствительного нейрона//Бюлл. эксп. биол. мед. 1999. Т.128. №10. С.463-465.

17. Насонова В.А., Фоломеева О.М. Ревматические заболевания в России в свете статистики 1992 года // Клин, ревматол. 1994. №2. С.2-4.

18. ПавловаВ.Н. Синовиальная среда суставов. М.: Медицина, 1980.296 с.

19. Пляцко В.В. и др. К вопросу о патогенезе деформирующего артроза коленного сустава // Ортопед., травматол. 1990. №3. С.45-48.

20. Реутов В.П., Сорокина Е.Г., Охотин В.Е., Косицын Н.С. Циклические превращения оксида азота в организме млекопитающих. М.: Наука, 1997. 159 с.

21. Реутов В.П., Сорокина Е.Г. NO-синтазная и нитроредуктазная компоненты цикла оксида азота //Биохимия. 1998. Т.63. Вып.7. С. 10291040.

22. Северина И.С. Растворимая гуанилатциклаза в молекулярном механизме физиологических эффектов оксида азота // Биохимия. 1998. Т.63. Вып.7. С.939-947.

23. Фоломеева О.М., Амирджанова В.Н., Юрятина H.A. Структура первичной инвалидности, обусловленной ревматическимизаболеваниями, по данным специализированных ВТЭК г. Москвы // Клин, ревматол. 1994. №3. С.39-43.

24. Фоломеева О.М., Амирджанова В.Н., Якушева Е.О. Ревматические болезни и ревматологическая служба в Российской Федерации // Клин, ревматол. 1996. №4. С.29-34.

25. Фрейдлин И.С. Иммунная система и её дефекты. СПб., 1998. 113 с.

26. Хрящ / Павлова В. Н., Копьева Т.Н., Слуцкий JI. И., Павлов Г. Г. М.: Медицина, 1988. 320 с.

27. Череповский А.В. и др. Активность нитроксидсинтазы как маркер ранних стадий дисметаболии хряща в эксперименте //Бюлл. эксп. биол. мед. 2004. Т. 137. №5. С.589-593.

28. Abramson S.B., et al. Nitric oxide and inflammatory mediators in the perpetuation of osteoarthritis // Curr. Rheumatol. Rep. 2001. Vol.3. No6. P.535-541.

29. Abu-Soud H.M., Stuehr D.J. Nitric oxide synthases reveal a role for calmodulin in controlling electron transfer // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. Vol.90. P. 10769-10772.

30. The ACL deficient knee / Anderson A.F., Arnoczky S.P., Bach B.R., et al.; Ed. by E.M. Wojtys: AAOS, 1994. 150 p.

31. Adam M., Deyl Z. Altered expression of collagen phenotype in osteoarthritis //Clin. Chim. Acta. 1983. Vol.133.No 1.P.25-32.

32. Adams M.E., Billingham M.E.J. Animal models of degenerative joint disease // Curr. Top. Pathol. 1982. Vol.71. P. 265-297.

33. Adams M.E., Brandt K.D. Hypertrophic repair of canine articular cartilage in osteoarthritis after anterior cruciate ligament transection // J. Rheumatol. 1991. Vol.18. P.428-435.

34. Aigner Т., Gluckert K., Von der Mark K. Activation of fibrillar collagen synthesis and phenotypic modulation of chondrocytes in early human osteoarthritic cartilage lesions // Osteoarthritis Cartilage. 1997. Vol.5. No3. P.183-189.

35. Albina J.E., et al. Nitric oxide-mediated apoptosis in murine peritoneal macrophages // J. Immunol. 1993. Vol.150. P.5080-5085.

36. Alsalameh S., Kalden J. R., Burmester G. R. Die Rolle von Zytokinen und Wachstumsfaktoren bei der rheumatoiden Gelenkdestruktion // Z. Rheumatol. 1991. Bd.50. H6. S.347-359.

37. Alsalameh S., et al. Papel de las citocinas y factores de crecimiento en los procesos de destrucción articular // Rev. Med. Chil. 1992. Vol.120. Nol2. P.1400-1410.

38. Alsopp R.C., et al. Telomere shortening is assotiated with cell division in vitro and in vivo II Exp. Cell Res. 1995. Vol.220. P. 194-200.

39. Altman R.D., Dean D. D. Osteoarthritis research: animal models // Semin. Arthritis Rheum. 1990. Vol.19. P.21-25.

40. Altman R., et al. Development of criteria for the classification and reporting of osteoarthritis. Classification of osteoarthritis of the knee // Arthritis Rheum. 1996. Vol.29. P.1039-1049.

41. Amin A.R., et al. The expression and regulation of nitric oxide synthase in human osteoarthritis-affected chondrocytes: evidence for up-regulated neuronal nitric oxide synthase II J. Exp. Med. 1995. Vol.182. No6. P.2097-2102.

42. Amin A.R., Abramson S.B. The role of nitric oxide in articular cartilage breakdown in osteoarthritis // Cur. Op. Rheum. 1998. Vol.10. No3. P.263-268.

43. Amin A.R., et al. COX-2, NO, and cartilage damage and repair // Cur. Rheum. Rep. 2000. Vol.2. No6. P.447-453.

44. Ankarcrona M., et al. Interleukin-1 beta-induced nitric oxide production activates apoptosis in pancreatic RINm5F cells // Exp. Cell Res. 1994. Vol.213. P.172-177.

45. Arend W.P. Growth factors and cytokines in the rheumatic diseases // Arend W.P. Primer on the rheumatic diseases. Atlanta, 1993. P.46-50.

46. Arend W.P., Dayer J.M. Cytokines and cytokine inhibitors or antagonists in rheumatoid arthritis //Arthritis Rheum. 1990. Vol. 33. P.305-315.

47. Arends M.J., Morris R.G., Wyllie A.H. Apoptosis: the role of endonuclease //Am. J. Pathol. 1990. Vol.136. P.593-608.

48. Arnold J.A., Coker T.P., Heaton L.M., Park J.P., Harris W.D. Natural history of anterior cruciate ligament tears //Am. J. Sports Med. 1979. Vol.7. P.305.

49. Ayache N., et al. Expression of TGF-betas and their receptors is differentially modulated by reactive oxygen species and nitric oxide in human articular chondrocyte // Osteoarthritis Cartilage. 2002. Vol.10. No5. P.344-352

50. Baussoulett C., Lonchampt M., Canet E. Differential immunolocalisation of type I, II, III nitric oxide synthase isoform in murine lung epithelium // Eur. Resp. J. 1996. Vol.9. P. 123-124.

51. Bealle D., Johnson D.L. Technical pitfalls of anterior cruciate ligament surgery//Clin. Sports Med. 1999. Vol.18. No4. P.831-845.

52. Beard D.J., et al. Proprioception after rupture of the anterior cruciate ligament //J. Bone Joint Surg. 1993. Vol.75-B. No2. P.311-316.

53. Beckman J.S., et al. Apparent hydroxyl radical production by peroxynitrite: implications for endothelial injury from nitric oxide and superoxide // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. Vol.87. P.1620-1624.

54. Bird J.L, May S., Bayliss M.T. Nitric oxide inhibits aggrecan degradation in explant cultures of equine articular cartilage // Equine Vet. J. 2000. Vol.32. No2. P. 133-139.

55. Blackburn E.H. Structure and function oftelomeres. Nature. 1991. Vol.350. P.569-572.

56. Blanco F.J., et al. Chondrocyte apoptosis induced by nitric oxide // Am. J. Pathol. 1995. Vol.146. P.75-85.

57. Bodnar A.G., et al. Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells // Science. 1998. Vol.279. P.349-352.

58. Boise L.H., Gonzales-Garzia M., Postema C.E. Bel-x, and Bcl-2 related gene that functions as dominant regulator of apoptotic cell death // Cell. 1993. Vol.74. P.597-608.

59. Borderie D., et al. Apoptosis induced by nitric oxide is associated with nuclear p53 protein expression in cultured osteoarthritic synoviocytes // Osteoarthritis Cartilage. 1999. Vol.7. No2. P.203-213.

60. Brandt K.D., et al. Anterior (cranial) cruciate ligament transection in the dog: a bona fide model of canine osteoarthritis, not merely of cartilage injury and repair // J. Rheumatol. 1991. Vol. 18. P.436-446.

61. Bredt D.S., Hwang P.M., Glatt C.E. Cloned and expressed nitric oxide synthase structurally resembles cytochrome P-450 reductase //Nature. 1991. Vol.351. P.714-718.

62. Bredt D.S. Endogenous nitric oxide synthesis: biological functions and pathophysiology // Free Radic. Res. 1999. Vol.31. No6. P.577-596.

63. Brunner T., Mogll R. J., La Face D. Cell autonomius Fas(CD95)/Fas-ligandinteraction mediates activation induced apoptosis in T-cell hybridomas // Nature. 1995. Vol.373. P.441-444.

64. Buckwalter J. A., Mankin H. J. Articular Cartilage // J. Bone Joint Surg. 1997. Vol.79-A. No4. P.600-632.

65. Busse R, Mulsch A. Calcium-dependent nitric oxide synthesis in endothelial cytosol is mediated by calmodulin // FEBS Lett. 1990. Vol.265. P.133-136.

66. Campbell's Operative Orthopedics, 7-th edition / Ed. by A.H. Crenshaw. The C.V. Mosby, 1987. Vol.3.

67. Cao M., et al. Generation of nitric oxide by lapine meniscal cells and its effects on collagen biosynthesis: stimulation of collagen production by arginine//J. Orthop. Res. 1998. Vol.16. P. 104-111.

68. Cao M., Westerhausen-Larson A., Niyibizii C. Nitric oxide inhibits the synthesis of type II collagen without altering Col2Al mRNA abundance; prolyl hydroxilase as a possible target // Biochem. J. 1997. Vol.324. P.305-310.

69. Carney S.L., et al. Demonstration of increased proteoglycan turnover in cartilage explants from dogs with experimental osteoarthritis // J. Orthop. Res. 1984. Vol.2. P.201-206.

70. Caron J.-P., et al. Chondroprotective effect of intraarticular injections of interleukin-1 receptor antagonist in experimental osteoarthritis // Arthritis Rheum. 1996. Vol.39. P.1535-1544.

71. Casscells S.W. The thorn meniscus, the thorn anterior cruciate ligament andtheir relationship to degenerative joint disease // Arthroscopy. 1985. Nol. P.28.

72. Castro L., Rodriguez M., Radi R. Aconitase is readily inactivated by peroxynitrite but not by its precursor nitric oxide // J. Biol. Chem. 1994. Vol.269. P.29409-29415.

73. Caul'n C., Salvensen G.S., OshimaR.G. Caspase cleavage of keratin 18 and reorganization of intermediate filaments during epithelial cell apoptosis // J. Cell Biol. 1997. Vol.138. P.1379-1394.

74. Cavaillon J.M. La participation des cytokines au cours des mécanismes inflammatoires // Pathof. Biol. 1993. T.41. No8. P.799-811.

75. Cavaillon J. M. Les cytokines de l'inflammation // C.R. Seances Soc. Biol. Fil. 1995. T. 189. No4. P.531-544.

76. Cavaillon J.M., Haefmer-Cavaillon N. Cytokines et inflammation // Rev. Prat. 1993. T.43. No5. P.547-552.

77. Chambers T. J., et al. The role of prostaglandins and nitric oxide in the response of bone to mechanical forces // Osteoarthritis Cartilage. 1999. Vol.7. No4. P.422-423.

78. Charles I.G., et al. Cloning, characterization and expression of a cDNA encoding an inducible nitric oxide synthase from the human chondrocyte // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. Vol.90. P.11419-11423.

79. Chartrain N.A., et al. Molecular cloning, structure, and chromosomal localization of the human inducible nitric oxide synthase gene // J. Biol. Chem. 1994. Vol.269. P.6765-6772.

80. Clancy R.M. Nitric oxide alters chondrocyte function by disruption cytoskeletal signaling complexes // Osteoarthritis Cartilage. 1999. Vol.7. No4. P.399-400.

81. Clancy R.M., et al. Outside-in signaling in the chondrocytes. Nitric oxide disrupts fibronectin-induced assembly of a subplasmalemmal actin/rho Af focal adhesion kinase signaling complex // J. Clin. Invest. 1997. Vol.100. P. 1789-1796.

82. Clancy R.M., et al. Activation of stress-activated protein kinase in osteoarthritic cartilage: evidence for nitric oxide dependence // Osteoarthritis Cartilage. 2001. Vol.9. No4. P.294-299.

83. Cohen J.J. Apoptosis // Immunol. Today. 1994. Vol.14. P.126-130.

84. Cosman D.A family of ligands for the TNF receptor superfamily // Cells. Dayt. 1994. Vol.12. No5. P.440-455.

85. Counter C.M., et al. Telomere shortening assotiated with chromosome instability is arrested in immortal cells which express telomerase activity // EMBO J. 1992. Vol. 11. P.1921-1929.

86. Dandy D. J., Jackson R.W. Meniscectomy and chondromalacia of the femoral condyle // J. Bone Joint Surg. 1975. Vol.57-A. P.l 116.

87. Daniel D., Stone M., Dobson B. Fate of the ACL-injuried patient. A prospective outcome study //Am. J. Sports Med. 1994. Vol.22. P.63 2-634.

88. Das P., Schurman D.J., Lane S.R. Nitric oxide and G proteins mediate the response of bovine articular chondrocytes to fluid -induced shear// J. Orthop. Res. 1997. Vol.15. P.87-93.

89. Dawson T., Snyder S. Gases as biological messengers: nitric oxide and carbon monoxide in the brain // J. Neurosci. 1994. Vol.14. P.5147-5159.

90. Debatin K.-M., et al. APO-1 induced apoptosis of leukemia cells from patients with adult T-cell leukemia // Blood. 1993. Vol.81. P.2972-2977.

91. Decary S., et al. Shorter telomeres in dystrophic muscle consistent with extensive regeneration in young children // Neuromuscul. Disorders. 2000. Vol.10. P. 113-120.

92. Dhein J., Waiczac H., Baumier C. Autocrine T-cell suicide mediated by APO-l/(Fas/CD95) //Nature. 1995. Vol.373. P.438-441.

93. Dingle J.T., Tyler J.A. Role of intercellular messengers in the control of cartilage matrix dynamics // Dingle J.T., Tyler J.A. Articular cartilage biochemistry. N.Y., 1986. P. 181-210.

94. Ellsasser J.S., Reynolds F.C., Omohundro J.R. The non-operative treatment of collateral ligament injuries of the knee in professional football players //

95. J. Bone Joint Surg. 1974. Vol.56-A. P.l 185-1190.

96. Ekcholm R., Norback B. On the relationship between articular cartilage changes and function//Acta Orthop. Scand. 1951. Vol.21. P.81.

97. Evants E.B., et al. Experimental immobilization and remobilization of rat knee joints // J. Bone Joint Surg. I960. Vol.42. A. P.737-758.

98. Eyre D.R., et al. Biosynthesis of collagen and other matrix proteins by articular cartilage in experimental osteoarthrosis // Biochem J. 1980. Vol.188. No3. P.823-837.

99. Fairbank T.J. Knee joint changes after meniscectomy // J. Bone Joint Surg. 1948. Vol.30-B.P.664 -670.

100. Feagin J. A., Abbott H. J., Rocous J.R. The isolated tear of the anterior cruciate ligament// J. Bone Joint Surg. 1972. Vol.54-A. P.1340.

101. Fehsel K., et al. Nitric oxide induces apoptosis in mouse thymocytes // J. Immunol. 1995. Vol.155. P.2858-2865.

102. Felson D.T., Zhang Y., Hannan M.T. Risk factors for incident radiographic knee osteoarthritis in the erderly //Arthritis Rheumat. 1997. Vol.40. P.728-733.

103. Fermor B., et al. The effects of static and intermittent compression on nitric oxide production in articular cartilage expiants // J. Orthop. Res. 2001. Vol. 19. No4. P.729-737.

104. Fermor B., et al. Induction of cyclooxygenase-2 by mechanical stress through a nitric oxide-regulated pathway // Osteoarthritis Cartilage. 2002. Vol.10. NolO. P.792.

105. Fink C., et al. The effects of dynamic mechanical compression on nitric oxide production in the meniscus // Osteoarthritis Cartilage. 2001. Vol.9. No5. P.481-487.

106. Forstermann U., et al. Nitric oxide synthase isozymes, characterization, purification, molecular cloning and function //Hypertension. 1994. Vol.23. P. 1121-1131.

107. Frankel V.H. Burstein A.N., Brooks D.B. Biomecanics of internalderangement of the knee // J. Bone Joint Surg. 1971. Vol.53-A. P.945.

108. Frenkel S.R., et al. Effects of nitric oxide on chondrocyte migration, adhesion and cytoskeletal assembly //Arthritis Rheum. 1996. Vol.39. P.1905-1912.

109. Fu F.H., et al. Current trends in anterior cruciate ligament reconstruction. Part I: Biology and biomechanics of reconstruction // Am. J. Sports Med. 1999. Vol.27. No6. P.821-830.

110. Fukuda K., et al. Zonal differences in nitric oxide synthesis by bovine chondrocytes exposed to interleukin-1 //Inflamm. Res. 1995. Vol.44. P.434-437.

111. FurukawaK., et al. Expression ofnitric oxide synthase in human nasal mucosa //Am. J. Res. Crit. Care Med. 1996. Vol.153. No2. P.847-850.

112. Gajewski T.F., Thompson C.B. Apoptosis meets signal transduction: elimination of a BAD influence // Cell. 1996. Vol.87. P.589-592.

113. Giancotti F.G. Complexity and specifity of integrin signalling // Nat. Cell. Biol. 2000. Vol.2. E13-E14.

114. GoldringM.B., Goldring S. R. Skeletal tissue response to cytokines // Clin. Orthop. 1990. No258. P.245-278.

115. Goldwasser M., et al. Analysis of the type of collagen present in osteoartritic human cartilage // Clin. Ortop. 1982. Nol67. P.296-302.

116. Good L., et al. Joint position sense is not changed after acute disruption of the anterior cruciate ligament // Acta Orthop. Scand. 1999. Vol.70. No2. P. 194-198.

117. Grabowski P.S., Macpherson H., Ralston S.H. Nitric oxide production in cells derived from the human joint // Br. J. Rheumatol. 1996. Vol.35. P.207-212.

118. Grabowski P.S., et al. Immunolocalization of inducible nitric oxide synthase in synovium and cartilage in rheumatoid arthritis and osteoarthritis // Br. J. Rheumatol. 1997. Vol.36. P.651-655.

119. Graves J.D., Gotoh Y., Draves K.E. Caspase-mediated activation and induction of apoptosis by the mammalian Ste20-like kinase Mst 1 // EMBO

120. J. 1998. Vol.17. P.2224-2234.

121. Gruss H.J., Duyster J., Herrmann F. Structural and biological features of the TNF receptor and TNF ligand superfamilies: interactive signals in the pathobiology ofHodgkiris disease //Ann. Oncol. 1996. Vol.7(Suppl.4). P.19-26.

122. Gumbiner B.M. Cell adhesion: the molecular basis of tissue architecture and morphogenesis // Cell. 1996. Vol.84. P.345-357.

123. Haklar U., et al. Oxygen radicals and nitric oxide levels in chondral or meniscal lesions or both//Clin. Orthop. Rel. Res. 2002. Vol.403. P. 135-142.

124. Hardingham T.E., Fitton-Jackson S., Muir H. Replacement of proteoglycans in chick embryonic cartilage organ culture after treatment with testicular hyaluronidase // Biochem. J. 1972. Vol. 129. P.101-112.

125. Harley C.B., Futcher A.B., Greider C.W. Telomeres shorten in aging ofhuman fibroblasts //Nature. 1990. Vol.345. P.458-460.

126. Hascall V.C., et al. Biosynthesis and turnover of proteoglycans in organ culture of bovine articular cartilage // J. Rheum. 1983. Vol.10. P.45-52.

127. Hassal C.J.B., et al. Nitric oxide synthase immunoreactivity and NADPH-diaphorase activity in a subpopulation of intrinsic neurons of the guinea-pig heart//Neurosci. Lett. 1992. Vol.83. P.65-68.

128. Hauflick L., Moorehead P.S. The serial cultivation ofhuman diploid cell strains //Exp. Cell Res. 1961. Vol.25. P.585-621.

129. Hauselmann H. J., et al. Nitric oxide and proteoglycan biosynthesis by human articular chondrocytes in alginate culture // FEBS Lett. 1994. Vol.352. P.361-364.

130. Hauselmann H.J., et al. Differences in nitric oxide production by superficial and deep human articular chondrocytes: implications for proteoglycan turnover in inflammatory joint diseases // J. Immunology. 1998. Vol.160. P. 1444-1448.

131. Hausladen A., Fridovich I. S uperoxide and peroxynitrite inactivateaconitases, but nitric oxide does not // J. Biol. Chem. 1994. Vol.269. P.29405-29408

132. Hayashi T., et al. Nitric oxide production by superficial and deep articular chondrocytes //Arthritis Rheumat. 1997. Vol.40. No2. R261-269.

133. Hibbs J.B., et al. Nitric oxide: a cytotoxic activated macrophage effector molecule // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1988. Vol.157. R87-94.

134. Hibbs J.B., et al. Evidence for cytokine-inducible nitric oxide syntesis from L-arginine in patients receiving interleukin-2 therapy // J. Clin. Investig. 1992. Vol.89. P.867-877.

135. Hill A.V. Production and absorption of work by muscle // Science. 1960. Vol.131. P.897-903.

136. Hiran T.S., Moulton P. J., Hancock J.T. Detection of superoxide and NADPH-oxidase in porcine articular chondrocytes // Free Radic. Med. Biol. 1997. Vol.23. P.736-743.

137. Hope V.T., Vincent S.R. Histochemical characterization of neuronal NADPH-diaphorase // Histochem. Cytochem. 1989. Vol.37. P.653-661.

138. Hope B.Y., et al. Neuronal NADPH-diaphorase is a nitric oxide synthase // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1991. Vol.88. P.2811-2814.

139. Hynes R.O. Integrins: versatility, modulation and signaling in cell adhesion //Cell. 1992. Vol.69. P.l 1-25.

140. Inoue S., Kawanishi S. Oxidative DNA damage induced by simultaneous generation of nitric oxide and superoxide // FEBS Lett. 1995. Vol.371. P.86-88.

141. Ischiropoulos H., Al-Mehdi A.B, Fisher A.B. Reactive species in rat lung injury: contribution ofperoxynitrite //Am. J. Physiol. 1995. Vol.269. L158-L164.

142. Itoh N., Yonehara S., Ishii A. The polypeptide encoded by the cDNA for human cell surface antigen Fas can mediate apoptosis // Cell. 1989. Vol.66.1. P.233.

143. Iyengar R., Stuehr D. J., Marietta M.A. Macrophage synthesis of nitrite and nitrate: precursors and role of the respiratory burst // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. Vol.84. P.6369-6373.

144. Jang D., Murrell G.A.C. Nitric oxide in arthritis // Free Rad. Biol. Med. 1998. Vol.24. P. 1511-1519.

145. Jarvinen T. A.H., et al. Nitric oxide mediates interleukin-1 induced inhibition of glycosaminglycan synthesis in rat articular cartilage // Med. Inflamm. 1995. Vol.4. P. 107-111.

146. Jefferson R J., et al. The role of the quadriceps in controlling impulsive forces around heel strike // Proc. Inst. Mech. Eng. 1990. Vol.204. P.21-28.

147. Jorgensen C., Angel J., Fournier C. Regulation of synovial cell proliferation and prostaglandin E2 production by combined action of cytokines// Eur. Cytokine Netw. 1991. Vol.2. No3. P.207-215.

148. Jouzeau J.-Y., et al. Modulation of IL-effects on cartilage by NO-synthase inhibitors: pharmacological studies in rats // Osteoarthritis Cartilage. 1999. Vol.7. No4.P.382-385.

149. Jouzeau J.-Y., et al. Nitric oxide and cartilage metabolism: NO effects are modulated by superoxide in response to IL-1 // Biorheology. 2002. Vol.39. P.201-214.

150. Ju S.T., Panka D., Cui H. Fas(CD95)/FasL interactions required for programmed cell death after T-cell activation // Nature. 1995. Vol.373. P.444-448.

151. Kang J.D., Georgesku H.I., Mclntyre-Larkin L. Herniated cervical intervertebral discs spontaneously produce matrix metalloproteinases, nitric oxide, interleukin-6, and prostaglandin E2 // Spine. 1995. Vol.20. P.2373-2378.

152. Kannus P., Jarvinen M. Posttraumatic anterior cruciate ligament insufficiency as a cause of osteoarthritis in a knee joint // Clin Rheumatol. 1989. Vol.8. P.251-260.

153. Kassem M., et al. Demonstration of aging and senescence in serially passaged long-term cultures of human trabecular osteoblasts // Osteoporosis Int. 1997. Vol.7. P.514-524.

154. Kaufmann S .H. Proteolytic cleavage during chemotherapy-induced apoptosis //Mol. Med. Today. 1996. Vol.2. P.269.

155. Kennedy J.C., Alexander I. J., Hayes, K. C. Nerve supply of the human knee and its functional importance //Am J. Sports Med. 1982. Vol.10. P.329-335.

156. Kerr J.F., WyllieA.H., CurrieA.R. Apoptosis: abasic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics //Br. J. Cancer. 1972. Vol.26. P.239-257.

157. Kettlekamp D.B., Jacobs A. W. Tibiofemoral contact area-determination and implications // J. Bone Joint Surg. 1972. V61.54-A. P.349.

158. Klingelhutz A.J. Telomerase activation and cancer // J. Mol. Med. 1997. Vol.75. P.45-49.

159. Klippel J. H., Dieppe P. D. Rheumatology. London: C.V. Mosby, 1994. 600 p.

160. Knowles R.G., et al. Formation of nitric oxide from L-arginine in the central nervous system: a transduction mechanisms for stimulation of the soluble guanylate cyclase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. Vol.86. P.5159-5162.

161. Kobayashi K., et al. Chondrocyte apoptosis and differential expression of nitric oxide in the medial meniscus following partial meniscectomy // J. Orthop. Res. 2001. Vol.19. No5. P.802-808.

162. Kondo S., et al. The effects of nitric oxide on chondrocytes and lymphocytes //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. Vol.197. P. 1431-1437.

163. Krause W.R., et al. Mechanical changes in the knee after arthroscopy // J. Bone Joint Surg. 1976. Vol.58-A. P.599.

164. Kubes P., et al. Nitric oxide synthesis inhibition induced leucocyte adhesion via superoxide and mast cells // FASEB J. 1994. No7. P. 1293-1299.

165. Kuettner K.E., Goldberg V.M. Introduction // Kuettner K.E., Goldberg V.M. Osteoarthritis disorders.: AAOS, 1995. P.XXI-XXV.

166. Lane N.E., Buckwater J.A. Exercise: a cause of osteoarthritis? // Rheum. Dis. Clin. North Am. 1993. Vol.19. P.617-633.

167. Langrehr J.M., et al. Nitric oxide synthesis in the in vivo allograft response: a possible regulatory mechanism // Surgery. 1991. Vol. 110. P.335-342.

168. Lattanzio P., et al. In-vitro assessment of nitroxide contrasting agent in early-OA proteoglycan depletion of articular cartilage: 46-th Annual Meeting, Orthopedic Society, March 12-15, 2000, Orlando, Florida. P. 1024.

169. Lazebnik Y.A., Kaufmann S.H., Desnoyers S. Cleavage of poly(ADP-ribose)polymerase by a proteinase with properties like ICE // Nature. 1994. Vol.371. P.346-347.

170. Lee D.A., Bentley G., Archer C.W. The control of cell division in articular chondrocytes // Osteoarthritis Cartilage. 1993. Vol.1. No2. P.137-146.

171. Lee N., MacDonald H., Reinhard C. Activation of hPAK65 by caspase cleavage induces some of the morphological and biochemical changes of apoptosis//Procl. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. Vol.94. P. 13642-13647.

172. Levkau B., Herren B., Koyama H. Caspase-mediated cleavage of focal adhesion kinase ppl25 and disassembly of focal adhesions in human endothelial cell apoptosis // J. Exp. Med. 1998. Vol.187. P.579-587.

173. Loeser R.F. Integrins and cell signaling in chondrocytes // Biorheology. 2002. Vol.39. P.l 19-124.

174. Lohmander L. S. Proteoglycans of joint cartilage // Bailliere's Clin. Rheum. 1988. Vol.2. Nol.P.37-61.

175. Lorente J.A., et al. L-arginine pathway in the sepsis syndrome // Crit. Care. Med. 1993. Vol.21. No9. P. 1287-1295.

176. Lotz M., et al. IL-17 promotes cartilage degradation (abstract) // Arthritis Rheumatism. 1996. Vol.39(suppl). P. 120.

177. Lowenstein C.J., et al. Cloned and expressed macrophage nitric oxide synthase contrasts with the brain enzyme // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. Vol.89. P.6711-6715.

178. Lynch D.H., Ramsdell F., Alderson M.R. Fas and FasL in the homeostatic regulation of immune responses // Immunol. Today. 1995. Vol.16. No 12. P.569-574.

179. Maciero-Coelho A. Markers of cell senescence // Mech. Aging Dev. 1998. Vol.103. P. 105-109.

180. Maier R., et al. Inducible nitric oxide synthase from human articular chondrocytes: cDNA cloning and analysis of mRNA expression // Biochem. Biophys. Acta. 1994. Vol.1208. P.145-150.

181. Martin J.A., Buckwater J.A. Human chondrocytes senescence and osteoarthritis //Biorheology. 2002. Vol.39. P.145-153.

182. Martin S J., Green D.R. Protease activation during apoptosis // Cell. 1995. Vol.82. P.349-352.

183. Mankin H.J. Speculations regarding the biochemical pathogenesis of generalized osteoarthritis // J. Rheum. 1983. Vol.10 (suppl.9). P.7-8.

184. Maguet P.G., van de Berg A.J., Simonet J.C. Femorotibial weight-bearing areas // J. Bone Joint Surg. 1975. V61.57-A. P.766.

185. Margerie D., Flechtenmacher J., Buttner F.H. Complexity of 1L-1 beta induced gene expression pattern in human articular chondrocytes // Osteoarthritis Cartilage. 1997. Vol.5. No2. P.129-138.

186. Maroudas A. Physicochemical properties and functional behavior of normal and osteoarthritic human cartilage //Articular Cartilage Biochemistry. N. Y., 1986. P.311-329.

187. Marshall J.L., Ollson S.E. Instability of the knee. A long-term experimental study in dogs // J. Bone Joint Surg. 1971. Vol.53-A. P.1561-1570.

188. Marshall J.L., et al. The anterior cruciate ligament. The diagnosis and treatment of its injuries and their serious prognostic implications // Orthop. Rev. 1978. Vol.7. P.3 5.

189. Mathy-Hartert M., et al. Regulation by reactive oxygen species of interleukin-lbeta, nitric oxide and prostaglandin E(2) production by human chondrocytes // Osteoarthritis Cartilage. 2002. Vol.10. No7. P.547-550.

190. Mazzetti I., et al. Differentials role of nitric oxide and oxygen radicals in chondrocytes affected by osteoarthritis and rheumatoid arthritis // Clinical Science. 2001. Vol.101. P.593-599.

191. McDaniel W.J., Dameron T.B. Untreated ruptures of the anterior cruciate ligament. // Clin Orthop. 1983. Vol.172. P.158-163.

192. McDevitt C.A., Muir H. Biochemical changes in the cartilage of the knee in experimental and natural osteoarthritis in the dog // J. Bone Joint Surg. 1976. V61.58-B. P.94.

193. McDevitt C.A., Gilbertson E.M., Muir H. An experimental model of osteoarthritis: early morphological and biochemical changes // J. Bone Joint Surg. 1977. Vol. 59-B. P.24.

194. Melchiorri C., et al. Enchanced and coordinated in vivo expression of inflammatory cytokines and nitric oxide synthase by chondrocytes from patients with osteoarthritis //Arthritis Rheumat. 1998. Vol.41. No 12. P.21562174.

195. Melk A., et al. Telomere shortening in kidneys with age // J. Am. Soc. Nephrol. 2000. Vol.11. P.444-453.

196. Mendes A.F., et al. Role of nitric oxide in the activation of NF-kappaB, AP-1 and NOS II expression in articular chondrocytes // Inflamm. Res. 2002. Vol.51. No7. P. 369-375.

197. Messner K., Maletus W. The long-term prognosis for severe damage to weight-bearing cartilage of the knee //Acta Orthop. Scand. 1996. Vol.67. P. 165-168.

198. Messmer U.K., et al. p53 expression in nitric oxide-induced apoptosis // FEBS Lett. 1994. Vol.355. P.23-26

199. Messmer U.K., Lapetina E.G., Brune B. Nitric oxide-induced apoptosis in RAW 264.7 macrophages is antagonized by protein kinase C- and protein kinase A-activating compounds // Mol. Pharmacol. 1995. Vol.47. P.757-765.

200. Messmer U.K., Brune B. Nitric oxide-induced apoptosis: p53-dependent andp53-independent signalling pathways //Biochem. J. 1996. Vol.319. P.299-305.

201. Messner K., Gao J. The menisci of the knee joint. Anatomical and functional characteristics, and a rationale for clinical treatment // J. Anat. 1998. Vol. 193. P.161-178.

202. Min B.H., et al. Effects of agening and arthritis disease on nitric oxide productions by human articular chondrocytes // Exp. Mol. Med. 2001. Vol.33. No4. P.299-302.

203. Mitchell N., Shepard N. Pericellular proteoglycan concentration in early degenerative arthritis //Arthr. Rheum. 1981. Vol.24. No7. P.95 8-964.

204. Moreno J.J., Prior W.A. Inactivation of alpha 1-proteinase inhibitor by peroxinitrite // Chem. Res. Toxicol. 1992. Vol.5. P.425-431.

205. Moncada S., Palmer R.M. J., Higgs E. A. Biosynthesis of nitric oxide from L-arginine. A pathway for the regulation of cell function and communication / /Biochem. Pharmacol. 1989. Vol.38. P. 1709-1715.

206. Moncada S., Palmer R.M.J., Higgs E.A. Nitric oxide: physiology, pathophysiology and pharmacology // Pharmacol. Rev. 1991. Vol.43. P. 109142.

207. Moreno J.J., Prior W.A. Inactivation of alpha 1-proteinase inhibitor by peroxinitrite // Chem. Res. Toxicol. 1992. Vol.5. P.425-431.

208. Moskowitz R.W., Howell D.S., Goldberg V.M. Cartilage proteoglicans alterations in experimentally induced model of rabbit osteoarthritis // Arthr. Rheum. 1979. Vol.22. Nol. P.155-163.

209. MoultonP.J., et al. Detection ofprotein and mRNAofvarious component of NADPH-oxidase complex in an immortalized human chondrocytes line // Br. J. Rheumatol. 1997. Vol.36. P.522-529.

210. Muller W. The Knee. Berlin: Springer-Verlag, 1983.314p.

211. Murrell G.A.C., Jang D., Williams R.J. Nitric oxide activates metalloprotease enzymes in articular cartilage // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. Vol.206. P. 15-21.

212. Murrell G.A.C., et al. Nitric oxide: an important frticular free radical // J. Bone Joint Surg. 1996-A. Vol. 78. P.265-74.

213. Myers S.L., et al. Synovitis and osteoarthritic changes in canine articular cartilage after anterior cruciate ligament transection effect of surgical hemostasis //Arthritis Rheum. 1990. Vol.33. P. 1406.

214. Nagai H., et al. Inducible nitric oxide synthase and apoptotic related factors in the synovial tissues of temporomandibular joints with internal derangement and osteoarthritis // J. Oral Maxillofac. Surg. 2003. Vol.61. No7. P.801-807.

215. Nakane M., et al. Cloned human brain nitric oxide synthase is highly expressed in skeletal muscle // FEBS Lett. 1993. Vol.316. P. 175-180.

216. Nathan C. Nitric oxide as a secretory product of mammalian cells // FASEB J. 1992. Vol.6. P.3051-3064.

217. Nathan C., Xie Q.-w. Nitric oxide synthase: roles, tolls, and controls // Cell. 1994. Vol.78. P.915-918.

218. Ni J., et al. Change in nitric oxide contents of knee joint fluid in patientswith degenerative osteoarthritis // Bulletin of Hunan Med. Univ. 1997. Vol.22. No7. P.333-334.

219. Nijkamp F.P., Folkerts G. Nitric oxide and bronchial reactivity // Clin. Exp. Allergy. 1994. Vol.24. No 10. P.905-914.

220. Nishida K., et al. Involvement of nitric oxide in chondrocyte cell death in chondro-osteophyte formation // Osteoarthritis Cartilage. 2001. Vol.9. No3. P.232-237.

221. Noble J., et al. The functional capasity of disordered menisci // J. R. Coll. Surg. Edinb. 1982. Vol.27. P. 13.

222. Noyes F.R., Butler D.L., Paulos L.E. Intra-articular cruciate reconstruction: I. Perspectives on graft strength, vasculatization, and immediate motion after replacement // Clin. Orthop. 1983. Vol.172. P.71-77.

223. Noyes F.R., et al. The symptomatic anterior cruciate deficient knee (part I) / / J. Bone Joint Surg. 1983. Vol. 65-A. P. 154.

224. Noyes F.R., et al. The symptomatic anterior cruciate deficient knee (part II) // J. Bone Joint Surg. 1983. Vol. 65-A. P. 163.

225. Nunez G., et al. Bcl-2 and Bcl-x regulatory switches for lymphoid death and survival // Immunol. Today. 1994. Vol. 15. P.582-587.

226. Ochoa J.B., et al. Nitrogen oxide levels in patients after trauma and during sepsis//Ann. Surg. 1991. Vol.214. P.621-626.

227. O'Donoghue D.N. An analysis of end results of surgical treatment of major injuries to the ligaments of the knee // J. Bone Joint Surg. 1955. V61.37-A. P.l.

228. Oh M., Fukuda K., Asada S., Yasuda Y., Tanaka S. Concurrent degeneration of nitric oxide and superoxide inhibits proteoglycan synthesis in bovine articular cartilage: involvement of peroxynitrite // J. Rheumatol. 1998. Vol.25.1. P.2169-2174.

229. Okamoto T., et al. Activation of human neutrophile procollagenase by nitrogen dioxide and peroxynitrite: a novel mechanism for procollagenase activation involving nitric oxide // Arch. Biochem. Biophys. 1997. Vol.342. P.261-274.

230. Okamoto T., et al. Activation of human matrix metalloproteinases by various bacterial proteinases // J. Biol. Chem. 1997. Vol.272. No9. P.6059-6066.

231. Oltwai Z., Millman C.L., Korsmeyer S.J. Bcl-2 heterodimerises in vivo with a conserved homolog, Bax, that accelerated programmed cell death // Cell. Vol.74. P.609-619.

232. Osteoarthritis: diagnosis and medical/surgical management / Moskowitz R.W., Howell D.S., Altman R.D., et al.; Ed. by R.W. Moskowitz: W.B. Saunders, 2001. 674 p.

233. Owen-Schaub L.B., et al. Soluble Fas/APO-1 in tumor cells: a potential regulator of apoptosis? // Cancer Lett. 1995. Vol.94. No 1. P. 1-8.

234. Palmer R.M. J., et al. Induction of nitric oxide synthase in human chondrocytes //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. Vol.193. P.398-405.

235. Panasyuk A., et al. Effect of reactive oxygen species on the biosynthesis and structure of newly synthesized proteoglycans // Free Radie. Biol. Med. 1994. Vol.16. P. 157-167.

236. Papadopulos J. S. Gonarthrose: Wird der Einfluss der pathologischen Statik überbewertet? // Z. Orthop. 1991. Bd.129. Hl. S.65-71.

237. Peitsch M.C., Tschopp J. Comparative molecular modeling of the Fas-ligand and other members of the TNF-family // Int. Immunol. 1995. Vol.32. No 10. P.761-772.

238. Pelletier J.P., Roughley P. Are cytokines involved in osteoarthritis patophysiology? // Semin. Arthritis Rheumat. 1991. Vol.20. P.12-25.

239. Pelletier J.-R, et al. Cytokines and inflammation in cartilage degradation // Rheum. Dis. Clin. North America. 1993. Vol.19. P.545-568.

240. Pelletier J.-R, et al. Reduced progression of experimental osteoarthritis invivo by selective inhibition of nitric oxide synthase //Arthritis Rheum. 1998. Vol.41. P.1275-1286.

241. Pelletier J.-P., et al. Chondrocyte death in experimental osteoarthritis is mediated by MEK 1/2 and p38 pathways: role of cyclooxygenase-2 and inducible nitric oxide synthase //J. Rheumatol. 2001. Vol.28. Nol 1. P.2509-2519.

242. Presle N., et al. Cartilage protection by nitric oxide synthase inhibitors after intraarticular injection of interleukin-ß in rat //Arthritis Rheum. 1999. Vol.42. P.2094-2102.

243. Price J.S., et al. Degradation of cartilage type II collagen precedes the onset of osteoarthritis following anterior cruciate ligament rupture // Arthritis Rheumat. 1999. Vol.42. Nol 1. P.2390-2398.

244. Pujol J.P., et al. Transforming growth factor-beta (tgf-beta) and articular chondrocytes //Ann. Endocrinol. 1994. Vol.55. No2. P.109-120.

245. Radi R., et al. Peroxynitrite oxidation of sulfhydryls: the cytotoxic potential of superoxide and nitric oxide // J. Biol. Chem. 1996. Vol.266. P.4244-4250.

246. Radi R., et al. Inhibition of mitochondrial electron transport by peroxynitrite //Arch. Biochem. Biophys. 1994. Vol.308. P.89-95.

247. Radin E.L., et al. Mechanical factors influencing cartilage damage / Osteoarthritis: current clinical and fundamental problems. Ed. by J.G.Peyron. Paris: Geigy, 1985. P.90-99.

248. Rangger C., Klestil T., Gloetzer W. Osteoarthritis after arthroscopic partial meniscectomy //Am. J. Sports Med. 1995. Vol.23. P.240-244.

249. Rathakrishnan C., Tiky M.L. Lucigenin-dependent chemiluminescence in articular chondrocytes //Free Radie. Biol. Med. 1993. Vol.15. P.143-149.

250. Reddel R.R. A reassessment of the telomere hypothesis of senescence // Bioessays. 1998. Vol.20. P.977-984.

251. Rediske J.J., et al. The inducible production of nitric oxide by articular cell types // Osteoarthritis Cartilage. 1994. Vol.2. No3. P. 199-206.

252. Reed J.C. Bcl-2 and the regulation of programmed cell death // J. Cell Biol.1994. Vol.124. P. 1-6.

253. Reginato A. M., et al. Transcriptional modulation of cartilage-specific collagen gene expression by interferon gamma and tumour necrosis factor alpha in cultured human chondrocytes // Biochem. J. 1993. Vol.15. No294. P.761-769.

254. Rheaume C., Cohen L. Y., Uhlmann F. The large subunit of replication factor C is a substrate for caspase-3 in vitro and is cleaved by a caspase 3-like protease during Fas-mediated apoptosis // EMBO J. 1997. Vol.16. P.6346-6354.

255. Rubbo H., Darleyusmar V., Freeman B.A. Nitric oxide regulation of tissue free radical injury // Chem. Res. Toxicol. 1996. Vol.9. P.809-820.

256. Ryu J., Treadwell B.V., Mankin H.J. Biochemical and metabolic abnormalities in normal and osteoarthritic human articular cartilage // Arthr. Rheum. 1984. Vol.27. Nol.P.49-57.

257. Salter D.M., et al. Integrin expression by human articular chondrocytes // Br. J. Rheumatol. 1992. Vol.31. P.231-234.

258. Salter D.M., et al. Differential responses of chondrocytes from normal and osteoarthritic human articular cartilage to mechanical stimulation // Biorheology. 2002. Vol.39. P.97-108.

259. Salter R.B., McNeil R. Pathological changes in articular cartilage secondary to persistent joint deformity // J. Bone Joint Surg. 1965. VÓ1.47-B. P.185.

260. Salvatierra J., et al. Cartilage and serum levels of nitric oxide in patients with hip osteoarthritis // J. Rheum. 1999. Vol.26. No9. P.2015-2017.

261. Satake K., Matsuyama Y., Kamiya M. Nitric oxide via macrophage iNOSinduced apoptosis following traumatic spinal cord injury // Mol. Brain. Res. 2000. Vol.85. No 1-2. P.114 -122.

262. Satsuma H., et al. Alpha and explosion isozymes of protein kinase C in the chondrocytes in normal and early osteoarthritis articular cartilage // Calcif. Tissue Int. 1996. Vol.58. P. 192.

263. Scharstuhl A., et al. Loss of transforming growth factor counteraction on interleukin -1 mediated effects in cartilage of old mice // Ann. Rheum. Dis. 2002. Vol.61. Nol2.P.1095-1098

264. Schuman E. M., Madison D. V. Nitric oxide and synaptic function // Ann. Rev. Neurosci. 1994. Vol.17. P. 153-183.

265. Schmidt H.H., et al. Ca2+/calmodulin-regulated nitric oxide synthases // Cell Calcium. 1992. Vol.13. P.427-434.

266. Segal P., et al. Les lesions osteo cartilagineuses de la laxite antero - interne du genou // Rev. Chir. Orthop. 1980. Vol.66. P.357-365.

267. Seti S., Dikshit M. Modulation of polymorphonuclear leucocytes functionby nitric oxide // Thromb. Res. 2000. Vol. 100. No3. P.223-247.

268. Shanahan C.M., Wessberg P.L. Smooth muscle cell phenotypes in atherosclerotic lesions // Curr. Opin. Lipidol. 1999. Vol.10. P.162-171.

269. Shyy J.Y.-J., Chien S. Role of integrins in cellular responses to mechanical stress and adgesion // Curr. Opin. Cell Biol. 1997. P. 707-713.

270. Skinner H.B., Wyatt M.P., Stone M.L. Exercise-related knee joint laxity // Am. J. Sports Med. 1986. Vol.14. Nol. P.30-34.

271. Slowman S.D., Brandt K. Composition and glycosaminoglican metabolism of articular cartilage from habitually loaded and habitually unloaded sites // Arthritis Rheum. 1986. Vol.29. Nol. P.88-94.

272. Smith M.L., Fornace A.J., Jr. The two faces of tumor suppressor p53 // Am. J. Pathol. 1996. Vol.148. P. 1019-1022.

273. Southan G .J., Szabo C. Selective pharmacological inhibition of distinct nitric oxide synthase isoform // Biochem. Pharmacol. 1996. Vol.51. P.3 83-394.

274. Spector T., Harris P., Hart D. Risk of osteoarthritis associated with long-term weight-bearing sports: a radiologic survey of the hips and knees in female ex-athletes and population controls //Arthritis Rheumat. 1996. Vol.39. P.988-995.

275. Spreng D., et al. Nitric oxide metabolite production in the cranial cruciate ligament, synovial membrane, and articular cartilage of dogs with cranial crucial ligament rupture //Am. J. Vet. Res. 2000. Vol.61. No5. P.530-536.

276. Stabellini G., et al. Effects of interleukin-lbeta on chondroblast viability and extracellular matrix changes in bovine articular cartilage explants // Biomed. Pharmacother. 2003. Vol.57. No7. P.314-319

277. Stadler J., Stefanovic-Racic M., Billiar T.R. Articular chondrocytes synthesize nitric oxide in response to cytokines and lipopolysaccharide // J. Immunol. 1991. Vol.147. P.3915-3920.

278. Stamler J.S., Singel D.J., Loscalzo J. Biochemistry of nitric oxide and its redox-activated forms // Science. 1992. Vol.258. P. 1898-1902.

279. Stefanovic-Racic M., et al. The role of nitric oxide in proteoglycan turnover by bovine articular cartilage organ cultures // J. Immunology. 1996. Vol. 156. P.1213 1220.

280. Stefanovic-Racic M., et al. Nitric oxide and proteoglycan turnover in rabbit articular cartilage // J. Orthop. Res. 1997. Vol.15. P.422 -429.

281. Stefanovic-Racic M., et al. Nitric oxide inhibits synthesis of aggrecan core protein without altering RNA abundance // Trans. Orthop. Res. Soc. 1998. Vol.23. P.300.

282. Stefanovic-Racic M., et al. Nitric oxide and energy production in articular chondrocytes // J. Cell Physiol. 1994. Vol.159. P.274-280.

283. Steinberg J.J., Sledge C. B. Chondrocyte mediated cartilage degradation:regulation by prostaglandin E2, cyclic AMP and interferon alpha // J. Rheum. 1991. Vol.27(suppl.). P.63-65.

284. Steller H. Mechanisms and genes of cellular suicide // Science. 1995. Vol.267. P.1445-1449.

285. Stone J.R., Marietta M.A. Soluble guanylate cyclase from bovine lung: activation with nitric oxide and carbon monoxide and spectral characterization of the ferrous and ferric states// Biochemistry 1994. Vol.33. P.5636-5640.

286. Studer R., et al. Nitric oxide inhibits tyrosine phosphorilation of the IGF-1 receptor: 46-th Annual Meeting, Orthopedic Research Society, March 1215, 2000, Orlando, Florida. P. 1046.

287. Studer R., et al. Nitric oxide in osteoarthritis // Osteoarthritis Cartilage. 1999. Vol.7. No4. P.377-379.

288. Stuehr D.J., Marietta M.A. Induction of nitrite/nitrate synthesis in murine macrophages by BCG infection. Lymphokines of interferon-y // J. Immunol. 1987. Vol.139. P.518-525.

289. Stuehr D. J., et al. Purification and characterization of the cytokine-induced macrophage nitric oxide synthase: An FAD- and FMN-containing flavoprotein // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. Vol.88. P.7773-7777.

290. Suda T., et al. Molecular cloning and expression of the Fas-ligand, a novel member of the tumor necrosis factor family // Cell. 1993. Vol.75. P. 11691178.

291. Surgery of the Knee / Ed. by Insall J.N., Scott W.N. Philadelphia: Churchill Livingstone, 2001. Vol. 1,2. 2028 p.

292. Takahashi K., et al. Hialuronan suppressed nitric oxide production in the meniscus and synovium of rabbit osteoarthritis model // J. Orthop. Res. 2001. Vol.19. No3.P.500-503.

293. Tan X., Wang YJ. The caspase RB-connection in cell death // Trends Cell Biol. 1998. Vol.8. P.116-120.

294. Tasker T., Waugh W. Articular changes associated with internal derangement of the knee // J. Bone Joint Surg. 1982. Vol.64-B. P.486.

295. Taskiran D., et al. Nitric oxide mediates suppression of cartilage proteoglycan synthesis by interleukin-1 // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. Vol.200. P.142-148.

296. Thomas L. Reversible collapse of rabbit ears after intravenous papain and prevention of recovery by cortisone // J. Biol. Chem. 1956. Vol.261. P.2467-2474.

297. Thornberry N.A., Rano T.A., Peterson E.P. A combination approach defines specificities of members of the caspase family and granzyme B. Function relationship established for the key of apoptosis // J. Biol. Chem. 1997. Vol.272. P. 17907-17911.

298. Tiku M.L., Yan Y.P., Chen K.Y. Hydroxyl radical formation in chondrocytes and cartilage as detected by electron paramagnetic resonance spectroscopy using spin trapping reagents // Free Radie. Res. 1998. Vol.29. P. 177-187.

299. Trauth B.C., Klass C., Peters A.M.J. Monoclonal antibody-mediated tumor regression by induction of apoptosis // Science. 1989. Vol.245. P.301-305.

300. Troy C.M., et al. Down-regulation of SOD1 leads to cell death by the NO-peroxynitrite pathway // J. Neurosci. 1996. Vol.16. P.253-261.

301. Tsujimoto Y., et al. Involvement of the bcl-2 gene in human follicular lymphoma// Science. 1985. Vol.228. P.1440-1443.

302. Ubeda M., Habener J.F. The large subunit of the DNA-replication complex C (DSEB/RF-C140) cleaved and inactivated by caspase-3 (CPP32/YAMA) during Fas-Induced apoptosis//J. Biol. Chem. 1997. Vol.272. P.19562-19568.

303. Vedi V., et al. Meniscal movement. An in-vivo study using dynamic MR! // J. Bone Joint Surg. 1999. V0I.8I-B. P.37-41.

304. Vidinov N., et al. Changes in the distribution of protein-polysaccharide complexes within the articular cartilage in experimental osteoarthrosis // Z. Mikrosk. Anat. Forsch. 1990. Bdl04. Hl. S. 140-146.

305. Vuolteenamo K., et al. Effects of TNFalpha-antagonists on nitric oxide production in human cartilage // Osteoarthritis Cartilage. 2002. Vol. 10. No4. P.327-332.

306. Vuolteenaho K., et al. Regulation of nitric oxide production in osteoarthritic and rheumatoid cartilage. Role of endogenous IL-1 inhibitors // Scand. J. Rheumatol. 2003. Vol.32. Nol. P.19-24

307. Vuolteenamo K., et al. Regulation of the nitric oxide production resulting from the glucocorticoid-intensitive expression of iNOS in human osteoarthritic cartilage // Osteoarthritis Cartilage. 2001. Vol.9. No7. P.597-605.

308. Walker P.S., Erkmann M.J. The role of the menisci in force transmission across the knee // Clin. Orthop. Rel. Res. 1975. Vol.109. P. 184.

309. WangN., Butler J.P., IngberD.E. Mechanotransduction across the cell surface and throw the cytoskeleton // Science. 1993. Vol.260. P.l 124-1127.

310. Wang Y., Newton D.C., Marsden P.A. Neuronal NOS: gene structure, mRNA diversity, and functional relevance // Crit. Rev. Neurobiol. 1999. Vol.13. Nol. P.21-43.

311. Warren R.F., Marshall J.L. Injuries of the anterior cruciate and medial collateral ligaments of the knee. A retrospective analysis of records part I / /Clin. Orthop. Rel. Res. 1978. Vol.136. P.191.

312. Warren R.F., Marshall J.L. Injuries of the anterior cruciate and medial collateral ligaments of the knee. A retrospective analysis of records part II // Clin. Orthop. Rel. Res. 1978. Vol.136. P.198.

313. Waugh W., Newton G., Tew M. Articular changes associated with a flexion deformity in rheumatoid and osteoarthritis knees // J. Bone Joint Surg. 1980. V61.62-B. P.752.

314. Webb G.R., Westacott C. 1Elson C. J. Chondrocyte tumor necrosis factor receptors and focal loss of cartilage in osteoarthritis // Osteoarthritis Cartilage. 1997. Vol.5. No6. P.427-437.

315. Wen L.P., Fahrni J. A., Troie S. Cleavage of focal adhesion kinase by caspases during apoptosis // J. Biol. Chem. 1997. Vol.272. P.26056-26061.

316. White E. Tumor biology. p53, guardian of Rb // Nature. 1994. Vol.371. P.21-22.

317. Whiteman M., Tritschler H., Halliwell B. Protection against peroxynitrite-dependent tyrosine nitration and alpha 1-antiproteinase inactivation by oxidized and reduced lipoic acid//FEBS Lett. 1996. Vol.379. Nol. P.74-76.

318. Widmann C., Gibson S., Johnson G.L. Caspase-dependent cleavage of signaling proteins during apoptosis. A turn-off mechanism for anti-apoptotic signals //J. Biol. Chem. 1998. Vol.273. P.7141-7147.

319. Windsor R.E., Insall J.N., Warren R.F. The Hospital for Special Surgery Knee ligament Rating form //Am. J. Knee Surg. 1988. Vol.1. P. 140.

320. Witte M.B., et al. Enhancement of fibroblast collagen synthesis by nitric oxide //Nitric Oxide. 2000. Vol.4. P.572-582.

321. Yaron L., et al. Some recombinant human cytokines stimulate glycosaminoglycan synthesis in human synovial fibroblast cultures and inhibit it in human articular cartilage cultures // Arthr. Rheum. 1989. Vol.32. -No2. P. 173-180.

322. Yelin E. Economic of osteoarthritis // Osteoarthritis. Ed. by Brandt K., Doherty M., Lohmander S. N.Y.: Oxford Press, 1998. P.23-30.

323. Yocum D.E., Esparza L., Dubryetal. S. Characteristics of tumor necrosis factor production in rheumatoid arthritis // Cell Immunol. 1989. Vol.122. Nol. P.131-140.

324. Yonehara S., Ishii A., Yonehara M. A cell killing monoclonal antibody (anti-FAS) to a cell surface antigen co-downregulated with the receptor of tumor necrosis factor // J. Exp. Med. 1989. Vol. 164. P. 1

325. Yuan J., Horvitz H.R. The Caenorhabditis elegans genes ced-3 and ced-4 act cell autonomously to cause programmed cell death // Dev. Biol. 1990. Vol.138. P.33-41.

326. Zamber R.W., et al. Articular lesions of the knee // Arthroscopy. 1989. Vol.5. No4.P.25 8-268.

327. Zhivotovsky B., et al. Involvement of cellular proteolytic machinery in apoptosis //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. Vol.230. P.481- 488.